Embed Size (px)
Citation preview
1
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Bùi Thị Việt Hà –
Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong
suốt thời gian học tâp và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa
Sinh học, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã góp ý và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành Luận văn .
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn va cac em Phòng Hóa
sinh và Vi sinh môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
Luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo
mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi hoan thanh tôt Luân văn nay.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2011
Học viên
Nguyễn Thị Quynh Trang
2
MỤC LỤC
MƠ ĐÂU ..............................................................................................................................9
Chƣơng 1: TÔNG QUAN TAI LIÊU ..........................................................................11
1.1. Tinh hinh nuôi trông thuy san trên thế giơi : ....................................................... ..111
1.3. Nhưng kho khăn thach thưc nghê ............................................................................ 12
1.4. Anh hương cua môt sô điêu kiên môi trương lên qua trinh nuôi trông thuy san :14
1.4.1. Nhiêt đô ....................................................................................................................15
1.4.2. Đô pH .......................................................................................................................15
1.4.3. Đô măn .....................................................................................................................16
1.4.4. Oxy hoa tan (DO) ...................................................................................................16
1.4.5. COD, BOD ..............................................................................................................17
1.4.6. Mât đô vi tao Vibrio spp. va vi khuân tông sô ....................................................17
1.4.7. Nitơ tông sô .............................................................................................................18
1.4.8. Photphat (PO43-
) .....................................................................................................20
1.4.9. Sulphuahydro ..........................................................................................................20
1.5. Tinh hinh nghiên cưu va ưng dung biên phap sinh hoc trong xư ly môi trương
nươc nuôi trông thuy san . ................................................................................................. 21
1.5.1. Vai trò cua các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nươc nuôi tôm, ca ..........21
1.5.2. Biên pháp sư dung các chế phâm sinh hoc (probiotic) và vai trò cua nó trong
viêc cai tạo nươc đầm nuôi trông thuy san .....................................................................24
1.5.3. Ưu điêm va nhươc điêm cua biên phâp sư dung vi sinh vât trong xư ly nươc
nuôi trông thuy san …………………………………………………….………….. 31
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 322
2.1. Đôi tương .................................................................................................................... 32
2.1.1 Chung giông .............................................................................................................32
2.1.2. Hóa chất – thiêt bi ...................................................................................................32
2.1.3. Môi trương ...............................................................................................................32
2.2. Phương phap nghiên c ưu ......................................................................................... 35
2.2.1. Phương phap phân lập vi khuân............................................................................35
3
2.2.2. Phương phap bao quan giông ................................................................................35
2.2.3. Phương phap xac định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuân ..................35
2.2.4. Xac định sinh khôi bằng phương phap đo mật đô quang hoc ...........................36
2.2.5. Phương phap định lương axit lactic......................................................................36
2.2.6. Phương phap nghiên cưu kha năng chuyển hóa các hơp chất chưa nitơ cua tế
bào .......................................................................................................................................36
2.2.7. Nghiên cưu anh hương cua môt sô điêu kiên nuôi cấy đến kha năng sinh
trương cua vi sinh vật........................................................................................................38
2.2.8. Phương phap xac định môt sô đăc điểm sinh hoc cua chung lựa chon............39
2.3. Phương phap tao chê phâm ....................................................................................... 43
2.3.1. Nghiên cưu cac điêu kiên thich hơp cho lên men xôp .......................................43
2.3.2. Trôn hôn hơp giông ................................................................................................41
2.3.3. Bao quan chế phâm : ...............................................................................................41
2.3.4. Thư nghiêm chê phâm trong xư ly nươc nuôi trông thuy san ...........................41
2.4. Phân loại vi sinh vật ................................................................................................... 42
Chương 3: KÊT QUA VA THAO LUÂN ......................................................................45
3.1. Tuyên chon cac chung vi sinh vât ............................................................................ 45
3.1.1. Bacillus.....................................................................................................................45
3.1.1.1. Phân lâp va tuyên chon .......................................................................................45
3.1.1.2. Nghiên cưu cac điêu kiên nuôi cấy thích hơp lên kha năng sinh trương và
hoạt tính enzym cua chung vi Bacillus TL1...................................................................46
3.1.1.3. Môt sô đăc điểm sinh hoc cua chung nghiên cưu............................................51
3.1.2. Vi khuân Lactic .......................................................................................................53
3.1.2.1. Phân lập và tuyển chon .......................................................................................53
3.1.2.2. Phân loại ...............................................................................................................53
3.1.2.3. Anh hương cua môt sô yếu tô anh hương đến sự sinh trương và tông hơp
chất kháng khuân cua L. plantarum L5 ..........................................................................56
3.1.3. Vi khuân nitrat hoa ................................................................................................60
3.1.3.1. Phân lập và tuyển chon vi khuân nitrat hóa .....................................................60
3.1.3.2. Đăc điểm hình thái, sinh hóa cua 2 chung vi khuân nitrat hóa lựa chon ......62
4
3.2. Tạo chế phâm ............................................................................................................. 63
3.2.1. Thư tinh đôi khang lân nhau cua cac chung vi khuân ........................................63
3.2.2. Nghiên cưu cac điêu kiên lên men xôp thich hơp ...............................................64
3.2.2.1. Lưa chon môi trương lên men xôp thich hơp ...................................................64
3.2.2.2. Anh hương cua ti lê cam : trâu lên qua trinh lên men xôp ..............................66
3.2.2.3. Anh hương cua thơi gian lên qua trinh lên men xôp .......................................67
3.2.2.4. Anh hương cua cac nhiêt đô khac nhau ............................................................68
3.2.2.5. Anh hương cua đô âm .........................................................................................69
3.2.3. San xuất chế phâm ..................................................................................................70
3.2.4. Đanh gia kha năng lam sach nươc đâm nuôi thuy san cua chê phâm vưa tao
đươc .....................................................................................................................................72
3.2.4.1. Gia trị pH ..............................................................................................................72
3.2.4.2. Nitơ tông sô ..........................................................................................................73
3.2.4.3. Amôni ...................................................................................................................74
3.2.4.4. Nitrit ......................................................................................................................75
3.2.4.5. COD va BOD .......................................................................................................76
KẾT LUẬN ........................................................................................................................79
KIÊN NGHI .......................................................................................................................79
TAI LIÊU THAM KHAO ................................................................................................80
PHU LUC ...........................................................................................................................87
5
DANH MUC KY HIÊU VA CHƢ VIÊT TĂT
BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu câu oxy sinh hoa
CMC Cacboxymetyl Cenlluloze Cacboxymetyl xenlulozo
COD Chemical Oxygen Demand Nhu câu oxy hoa hoa hoc
DO Dessolved Oxygen Oxy hoa tan
OD Optical Density Mât đô quang hoc
QCVN Quy chuân Viêt Nam
WHO World Heath Organi zation Tô chƣc Y tê thê giơi
6
DANH MUC CAC BANG
Bang 1.1. Anh hương cua pH đến sinh trương cua tôm , ca .........................................15
Bang 1.2. Tiêu chuân chât lương nươc nuôi trông thuy san .........................................21
Bang 3.1: Hoạt tính enzym cua 5 chung lựa chon.........................................................45
Bang 3.2: Hoạt tính phân giai cơ chất cua chung TL1 trên 4 loại môi trương ..........46
Bang 3.3: Anh hương cua pH lên kha năng sinh trương va sinh tông hơp enzym cua
chung TL1 ..........................................................................................................................47
Bang 3.4: Anh hương cua thơi gian đến kha năng sinh trương va sinh tông hơp .....48
Bang 3.5: Anh hương cua nguôn cacbon lên kha năng sinh trương va sinh tông hơp
enzym cua chung TL1 .......................................................................................................49
Bang 3.6: Anh hương cua nguôn nitơ đến sinh trương va hoạt tính enzym cua chung TL1 ...............50
Bang 3.7: Đăc điểm hinh thai, sinh lí, sinh hóa cua chung nghiên cưu ......................51
Bang 3.8: Hoạt tính ưc chế cac vi sinh vật kiểm định cua chung L5 ..........................53
Bang 3.9: Đăc điểm hinh thai, sinh ly, sinh hóa cua chung L5 ...................................53
Bang 3.10: Anh hương cua pH đến sự sinh trương va kha năng tông hơp chất khang
khuân cua L. plantarum L5 ..............................................................................................57
Bang 3.11: Anh hương cua thơi gian nuôi cấy đến sự sinh trương va kha năng tông
hơp chất khang khuân cua L. plantarum L5...................................................................58
Bang 3.12: Anh hương cua nông đô muôi tơi kha năng sinh trương va tông hơp chất
khang khuân cua L. plantarum L5...................................................................................59
Bang 3.13: Đăc điểm hinh thai cua cac chung oxy hóa amôni phân lập đươc ..........60
Bang 3.14: Đăc điểm hinh thai cua 10 chung oxy hóa nitrit phân lập đươc ..............61
Bang 3.15: Ham lương nitrit tạo thanh va sự sinh trương cua 13 chung oxy hóa
amôni phân lập đươc .........................................................................................................61
Bang 3.16: Ham lương nitrat tạo thanh va sự sinh trương cua 10 chung oxy hóa
nitrit .....................................................................................................................................62
Bang 3.17: Môt sô đăc điểm hinh thai, sinh hóa cua chung NA7 va NT2 .................62
Bang 3.18: Thư tinh đôi khang lân nhau cua cac chung vi khuân ...............................64
Bang 3.19: Anh hương cua môi trương lên men xôp lên Bacillus ..............................65
Bang 3.20 : Anh hương cua môi trương lên me n xôp lên L. plantarum L5: .............65
7
Bang 3.21: Anh hương cua ti lê cam : trâu lên Bacillus TL1 .......................................66
Bang 3.22: Anh hương cua ti lê cam : trâu lên L. plantarum L5..................................67
Bang 3.23: Anh hương cua thơi gian lên men xôp lên Bacillus TL1 .........................67
Bang 3.24: Anh hương cua thơi gian lên men xôp lên L. plantarum L5....................67
Bang 3.25: Anh hươ ng cua nhiêt đô lên Bacillus TL1 .................................................68
Bang 3.26: Anh hương cua nhiêt đô lên L. plantarum L5............................................69
Bang 3.27: anh hương cua đô âm lên Bacillus TL1 ......................................................69
Bang 3.28: Anh hương cua đô âm lên L. plantarum L5 ...............................................70
Bang 3.29: Kêt qua gia tri pH sau cac ngay thí nghiêm ...............................................72
Bang 3.30: Kêt qua gia tri Nitơ tông sô sau cac ngay thí nghiêm ...............................73
Bang 3.31: Kêt qua gia tri NH 3 sau cac ngay thí nghiêm .............................................74
Bang 3.32: Kêt qua gia tri nitrit sau cac ngay thí nghiêm ............................................75
Bang 3.33: Kêt qua gia tri COD va BOD sau cac ngay thí nghiêm ............................76
Bang 3.34: Kêt qua xư ly nươc đâm nu ôi thuy san cua chê phâm ..............................77
8
DANH MUC CAC HINH
Hinh 3.1: Hoạt tính phân giai cơ chất cua chung TL1 trên 5 loại môi trương ...........46
Hinh 3.2: Anh hương cua pH lên kha năng sinh trương va sinh tông hơp enzym cua
chung TL1 ..........................................................................................................................48
Hinh 3.3: Anh hương cua thơi gian đến kha năng sinh trương va sinh tông hơp
enzym ngoại bao cua chung TL1 .....................................................................................49
Hinh 3.4: Anh hương cua nguôn cacbon lên kha năng sinh trương va sinh tông hơp
enzym cua chung TL1 .......................................................................................................50
Hinh 3.5: Anh hương cua nguôn nitơ lên kha năng sinh trương va sinh tông hơp
enzym cua chung TL1 .......................................................................................................50
Hình 3.6: Trinh tự nucleotit cua rARN 16S cua chung L 5...........................................50
Hinh 3.7: Vị trí phân loại cua chung L5 va cac loai có quan hê ho hang gần…..56
Hình 3.8: Anh hương cua pH đến sự sinh trương va kha năng sinh tông hơp chất
khang khuân cua L. plantarum L5...................................................................................57
Hình 3.9: Anh hương cua thơi gian nuôi cấy đến sự sinh trương va sinh chất khang
khuân cua L. plantarum L5 ..............................................................................................58
Hình 3.10: Anh hương cua nông đô muôi tơi kha năng sinh trương va tông hơp chất
khang khuân cua L. plantarum L5...................................................................................59
Hinh 3.11: Sơ đô quy trinh san xuât chê phâm dang răn ..............................................71
Hinh 3.12: Gia trị pH sau cac ngay thí nghiêm .............................................................73
Hinh 3.13: Gia trị nitơ tông sau cac ngay thí nghiêm ...................................................73
Hinh 3.14: Gia trị amôni sau cac ngay thí nghiêm ........................................................75
Hinh 3.15. Gia trị nitrit sau cac ngay thí nghiêm ..........................................................76
Hinh 3.16. Gia trị COD sau cac ngay thí nghiêm..........................................................77
Hinh 3.17: Gia trị BOD sau cac ngay thí nghiêm..........................................................77
9
MƠ ĐÂU
Vơi đương bơ biên dai tơi 3260 km cung vơi rât nhiêu hon đao lơn nho ,
nhiêu đâm pha , eo vinh , đăc biêt co tơi 250.000 ha rưng ngâp măn va 290.000 ha
bai triêu, Viêt Nam co tiêm năng lơn vê diên tich nuôi trông thuy san nươc lơ .
Nhưng năm gân đây , cơ câu chuyên dich kinh tê cung vơi cac chinh sach cua
khuyên khich cua chinh p hu, phong trao nuôi trông thuy san ven biên ơ nươc ta
ngay cang phat triển mạnh .
Tuy nhiên, trong những năm gần đây nganh nuôi trông đang phai đôi măt vơi
nhưng kho khăn co thê dẫn đến nguy cơ thất bại ơ nhiêu cơ sơ nuôi trông. Nguyên
nhân chính là do ô nhiễm môi trương nươc đâm nuôi , dịch bênh và hê thông sinh
thái bị phá huy. Cac đầm nuôi trông thuy san , đăc biêt la cac đâm quang canh không
có hê thông cấp , thoat nươc va xư lí nươc thai nên trong qua trinh n uôi, phân sinh
vât , thưc ăn thưa , xac đông vật thuy sinh , xac rong , tao, cac loại hóa chất sư dung
trong qua trinh nuôi , cac loại vi khuân gây bênh… lam cho nươc trong đầm bị ô
nhiêm. Cac chất hữu cơ tích tu lại ơ đay đầm bị phân huy kị khí sinh ra cac san
phâm như : NH3, H2S, NO3… lam cho tôm ca bi sôc hoăc gây hai cho tôm ca va cac
sinh vât khac sông trong đâm . Khi đâm nuôi bị ô nhiễm thi những nhóm vi sinh vật
có hại có cơ hôi phát triển mạnh mẽ, không kiểm soat đươc và hậu qua là vật nuôi
bị bênh. Trươc đây, ngươi nuôi thương sư dung hóa chất, khang sinh để xư lý môi
trương ao nuôi và phòng bênh. Nhưng dùng nhiêu hóa chất và kháng sinh gây anh
hương lơn đến môi trương va con ngươi. Ngoài ra, viêc lạm dung thuôc kháng sinh
còn gây ra vấn đê vê dư lương kháng sinh trong vật nuôi và vi phạm vấn đê vê sinh
an toàn thực phâm. Do đó, cần chon môt giai pháp thích hơp để giai quyết vấn đê
nay. Trươc thực trạng đó, xư ly môi trương trong quá trình nuôi nhằm cai thiên môi
trương nươc, phòng bênh cho tôm ca và an toàn vơi ngươi sư dung là vấn đê cấp
thiết. Tại môt sô nươc có ngành nuôi trông thuy san phát triển vơi quy mô công
nghiêp như Mĩ, Nhật, Trung Quôc, Thai Lan,…cac biên pháp sinh hoc đươc sư
dung thay thế cho cách dùng hóa chất đa khẳng định đươc tính an toàn và hiêu qua
trong nuôi trông.
Các loài vi sinh vật đươc dùng ngày càng nhiêu trong xư ly môi trương nươc
nuôi trông thuy san đa đem lại nhiêu lơi ích cho con ngươi va môi trương sông mà
cac phương phap khac không có đươc như: an toan vơi ngươi va đông vật, đăc hiêu
đôi vơi vật chu, thích hơp vơi cac phương phap phong trừ khác, thơi gian bán huy
10
ngắn nên không tôn đong lâu để gây ô nhiễm môi trương sông, có kha năng tự nhân
lên và ưc chế các vi sinh vật gây bênh cho tôm ca.
Vơi mong muôn tìm ra những chung vi sinh vật có kha năng lam sạch môi
trương nươc nuôi tôm, chúng tôi đa tiến hành thực hiên đê tài “Tuyển chọn các
chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản”.
Muc đich cua đê tai : tạo ra đươc chế phâm có chưa môt sô chung vi sinh vât
hữu ích nhằm xư ly nươc nuôi tôm va bươc đâu đưa ra những kết qua thư nghiêm
xư ly nươc nuôi trông thuy san bi ô nhiêm ơ quy mô phong thi nghiêm .
11
Chƣơng 1: TÔNG QUAN TAI LIÊU
1.1. Tinh hinh nuôi trông thuy san trên thê giơi
Nuôi trông thuy san la môt nganh san xuât đông thưc vât thuy sinh trong
điêu kiên kiêm soat hoăc ban kiêm soat , hoăc như ngươi ta vân thương noi , nuôi
trông thuy san la san xuât nông nghiêp trong môi trương nươ c [8].
Trong thơi gian qua, nganh thuỷ san ngay cang phat triển va dần trơ thanh
nganh kinh tế mũi nhon cua nhiêu quôc gia va la nguôn cung cấp thực phâm quan
trong cho công đông cac dân cư trên toan thế giơi. Không những phat triển vê sô
lương va gia trị, nganh thuỷ san con có những bươc thay đôi cơ ban vê cơ cấu san
xuất. Từ môt nganh thuỷ san công nghiêp vơi khai thac thuỷ san đóng vai tro chu
đạo va những quôc gia có san lương lơn nhất la cac nươc phat triển có những đôi
tau khai thac xa bơ va môt nên công nghiêp chế biến hiên đại trong những năm
trươc thập kỷ 90, trong giai đoạn từ hơn mươi năm trơ lại đây, nganh thuỷ san đa
phat triển theo hương nông nghiêp, nghĩa la nuôi trông thuỷ san (N TTS) đa tăng
nhanh tỷ lê đóng góp cua minh va cac nươc nông nghiêp chính la những nươc có
san lương đưng đầu thế giơi. Chi tính trong giai đoạn 10 năm từ 1993 -2003, trong
khi san lương khai thac hầu như đưng yên, chi tăng 1,2%, thi san lương NTTS tăng
mỗi năm tơi 9,4%. Năm 2003, tỷ lê cua NTTS trong tông san lương thuỷ san thế
giơi đa tăng lên 31,7% [8].
Theo thông kê cua FAO, năm 2003, tông san lương thuy san cua thế giơi đạt
gần 132 triêu tấn, lĩnh vực khai thac đạt 90 triêu tấn va nuôi đạt gần 42 triêu t ấn.
Trong đó, lương thuỷ san (TS) dùng lam thực phâm khoang 101 triêu tấn, chiếm
hơn 76,5 % [8].
Nếu phân theo môi trương nuôi, san lương cac loai thuỷ san nươc ngot chiếm
tỷ lê cao hơn (năm 2003, nuôi nươc ngot đạt 25,2 triêu tấn, chiếm 60,14% san lương
va 48,7% gia trị). Thuỷ san nuôi nươc măn chiếm 36,5% san lương va 35,7% gia trị.
Măc dù san lương nuôi nươc lơ chi chiếm 5,8% (năm 2002), nhưng lại chiếm tơi
15,9% gia trị vi phần lơn la những san phâm gia trị cao.
1.2. Tinh hinh nuôi trông thuy san ơ Viêt Nam
Vơi đương bơ biên dai hơn 3200km; Viêt Nam co vung đăc quyên kinh tê
trên biên rông hơn 1 triêu km2. Viêt Nam cung co vung măt nươc nôi đia lơn rông
hơn 1,4 triêu ha nhơ hê thông sông ngoi , đâm pha day đăc . Vị trí địa ly va điêu kiên
12
tư nhiên thuân lơi giup Viêt Nam co nhiêu thê manh nôi trôi đê phat triên nganh
thuy san . Tư lâu Viêt Nam đa trơ thanh quôc gia san xuât va xuât khâu thuy san
hang đầu khu vực cùng vơi Indon esia va Thai Lan . Xuât khâu thuy san trơ thanh
môt trong nhưng linh vưc quan trong cua nên kinh tê [6].
Theo sô liêu thông kê , 11 thang đầu năm 2009, kim ngach xuât khâu thuy
san đạt 3.928 triêu đôla, băng 93,8% so vơi cung k y năm ngoai ; chiêm 7,6% tông
kim ngach xuât khâu ca nươc [6].
Viêt Nam co hơn 1 triêu km đương bơ biên va 1,4 triêu hecta măt nươc nôi
đia vi vây nguôn cung thuy hai san rât dôi dao va ôn đinh . Trư lương hai san ơ Viê t
Nam ươc tinh co khoang 4,2 triêu tân va nguôn tai tai la khoang 1,73 triêu tân . Mơ
rông diên tich nuôi trông thuy san va cai thiên kha năng khai thac đanh ca xa bơ đa
giúp san lương thuy hai san Viêt Nam không ngừng tăng trong nhưng năm qua .
Mưc tăng trương trung binh tư năm 2006 - 2008 la khoang 11%. Đên hêt thang 11
năm 2009, san lương thuy sa n đa đat hơn 4,4 triêu tân [6].
Trong nhưng năm gân đây , cac san phâm măt hang thuy san cua Viêt Nam
ngay cang đươc đa dạng hóa . Cac san phâm như tôm ,ca tra, ca ngừ , hang khô , mưc ,
bạch tuôc chiếm ti trong lơn nhất trong kim ngạch xuất khâu thuy san . Trong đo ,
tôm đưng đâu vê kim ngach xuât khâu , chiêm 38,4 %.
1.3. Nhƣng kho khăn thach thƣc nghê
Theo đanh gia cua FAO , thuy san va cac san phâm la cac san phâm đươc
phat triển nhanh nhât trong cac măt hang thưc phâm hiên nay noi chung . Lơi thê cua
nuôi trông thuy san la co thê thưc hiên đươc kê hoach phat triên san xuât thuy san ,
gia tăng san lương nhăm đap ưng nhu câu cua thi trương tiêu thu , không bi phu
thuôc vao mua vu khai thac như nguôn lơi tư nhiên .
Tuy nhiên , ngoai những thuận lơi đó , nuôi trông thuy san ơ Viêt Nam cung
đa va đang phai đôi măt vơi nhiêu kho khăn như điêu kiên môi trương , khí hậu ,
nguôn nươc , ô nhiêm nươc thai , nguôn giông , thưc ăn , dịch bênh , thơi tiêt… Han
chê trong nuôi trông thuy san ơ Viêt Nam la tinh rui ro con cao do nhưng nguyên
nhân chu quan va khach quan . Vê măt chu quan , con có nhiêu vấn đê kĩ thuật va phi
kĩ thuật ma chúng ta chưa lam chu đươc . Trong điêu kiên nuôi trông thuy san hiên
nay, cac đầm nuôi thương bị phú dương . Nguyên nhân la do chung ta đưa vao đâm
nuôi lương thưc ăn tông hơp rât lơn ma chi co phân rât nho (khoang 17%) lương
thưc ăn đươc tôm sư dung , con lại la hoa tan trong nươc hoăc bai tiết ra ng oai môi
13
trương. Lương thưc ăn thưa , phê thai hưu cơ va cac phế thai khac la những yếu tô
lam cho đầm nuôi tôm nhiễm bân . Có thể nói cac đầm nuôi trông thuy san hiên nay
bị thất bại la do đầm nuôi bị nhiễm bân . Do chưa có kinh nghiêm trong phong
chông bênh cho tôm nên sư dung thuôc chưa bênh không hơp li đa lam tăng kha
năng hinh thanh dich bênh vung nuôi . Kha năng theo doi , canh bao môi trương đê
phong dịch bênh con hạn chế cũng la nguy ên nhân gây tôn thât không nho . Bên
cạnh đó , sư ô nhiêm con do tac đông qua lai giưa cac nganh san xuât khac nhau ,
chăng han sư ô nhiêm cac vưc nươc tư nhiên tư nguôn phân bon , thuôc trư sâu , chât
thai công nghiêp cũng la m anh hương đên ca c vung nuôi trông thuy san [12], [18],
[21].
Trong nuôi trông thuy san thương phai sư dung cac loai hoa chât , khang sinh ,
thuôc diêt nâm đê tri bênh . Tuy nhiên , chúng phai đươc dùng vơi liêu lương thích
hơp va theo quy định hơp lí . Nêu không , viêc sư dung thuôc khang sinh bưa bai se
gây hiên tương khang thuôc va gây cho ngươi sư dung nhưng rui ro tiêm ân như
tăng mân cam vơi dư lương thuôc hoăc xuât hiên hê vi khuân đươ ng ruôt khang lai
cac chất khang khuân . Rât nhiêu nươc trên thê giơi đa co nhưng thay đôi hoăc thăt
chăt cac quy đinh cua quôc gia vê viêc sư dung thuôc tri bênh trong nuôi trông , đăc
biêt la khang sinh , đây cung la yêu câu nghiêm ngăt cua nhiêu nươc trong đo có ca
cac nươc nhập khâu [7], [26].
Môt kho khăn nưa đôi vơi nganh nuôi trông thuy san đo la dich bênh , đăc
biêt la đôi vơi tôm . Cùng vơi viêc tăng san lương tôm thi bênh tôm nga y cang phat
triên nhiêu va xuât hiên nhiêu bênh la ma chưa co giai phap điêu tri . Gân 30 bênh
va hôi chưng bênh cua tôm nuôi vơi 2 nguyên nhân nhiêm trung va không nhiêm
trùng đa đươc môt sô tai liêu gần đây nhắc đến nhưng sư hiêu biêt vê chung con rât
ít. Môt sô tac nhân gây bênh quan trong nhât cho tôm ca, cũng như cac thuy hai san
khac la vi sinh vật (vi khuân , vi rut , nâm va nguyên sinh đông vâ t) hay do môi
trương, đôc tô [30].
Cac vi sinh vât gây bênh gây ra cac bênh nghiêm trong cho thuy hai san . Ví
du đôi vơi tôm , chúng gây bênh đôm trắng , bênh đâu vang , bênh phat sang… Nêu
môi trương tiêp tuc xâu đi hay sô lương vi khuân gây bênh tăng manh , tôm se chêt
nhiêu trong môt thơi gian ngăn hoăc bênh se chuyên thanh dang nhiêm khuân man
tính va rất khó chữa . Nhưng bênh nay chi mang tinh chât cơ hôi khi nươc bi ô
nhiêm, đăc biêt la nươc bi ô nhiêm hưu cơ hoăc tôm ca chi u tinh trang sôc do môt
14
trong cac điêu kiên gây ra như sư thay đôi nhiêt đô , pH, mât đô tha qua day , sư thay
đôi vê đô măn cua nươc .
Vi khuân Vibrio gây bênh cho tôm
Các vi sinh vật gây bênh luôn tôn tại trong môi trương sinh sông cua tôm
(đất, nươc, không khí, thưc ăn…) va tôn tại ngay trong cơ thể vật chu. Môt trong sô
các vi khuân gây bênh nguy hại phô biến cho tôm là Vibrio spp. Đây la chung vi
khuân Gram âm, có kha năng chuyển đông, có hoạt tính oxidaza, hình que hoăc
hình dấu phây, kị khí không bắt buôc, không hình thành bào tư, có thể cư trú trong
nươc vơi cac đô măn khác nhau. Nhóm vi khuân này tôn tại trong môi trương nươc
nuôi như môt thành phần cua quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng
khi găp điêu kiên bất lơi cho tôm, chúng trơ thành vi khuân có kha năng gây bênh,
vì vậy chúng đươc xếp vào loại vi khuân gây bênh cơ hôi trên tôm) [49]. Vibrio spp.
rất phô biến trong nươc măn, môt sô loài có kha năng gây bênh cho tôm (V.
cholera, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. urnissii…). Chúng
thương gây ra các bênh nghiêm trong cho tôm như bênh đôm trắng, bênh đầu vàng,
bênh phat sang…. Khi bị nhiễm vi khuân nay, lúc đầu, môt sô nơi trên cơ thể tôm sẽ
bị tiêu huy như phần đuôi hoăc phần lưng rôi dần dần làm bế tắc hê thông lưu thông
cua máu [38]. Tôm thay đôi tập tính như bơi ven bơ hay gần măt nươc, lơ đơ, bỏ ăn,
đôi mau đỏ hoăc xanh. Nếu môi trương tiếp tuc xấu đi hay sô lương vi khuân gây
bênh tăng mạnh, tôm sẽ chết nhiêu trong môt thơi gian ngắn hoăc bênh sẽ chuyển
thành dạng nhiễm khuân mãn tính. Những bênh này chi mang tính chất cơ hôi khi
nươc bị ô nhiễm, đăc biêt la nươc bị ô nhiễm hữu cơ hoăc tôm cá chịu tình trạng sôc
do môt trong cac điêu kiên gây ra như sự thay đôi nhiêt đô, pH, mật đô tha quá dày,
sự thay đôi vê đô măn cua nươc.
Vi khuân Vibrio spp. trong cac đầm nuôi tôm rất phong phú va có xu hương
tăng dần theo thơi gian nuôi, sô lương đạt cực đại vào cuôi vu. Kết qua nghiên cưu
cua Nguyễn Trong Nho và ctv (1996) [21] đầm tôm ơ các tinh Nam Trung Bô bị
bênh có sô lương vi khuân Vibrio tông sô từ 110-1500 tế bào/ml. Theo Phan Lương
Tâm và ctv (1998) [29], Nguyễn Viêt Thắng (1998) [33] khao sát các nguyên nhân
gây chết tôm ơ các tinh phía Nam cho rằng trong cac đầm nuôi tôm bị chết, sô
lương vi khuân Vibrio spp. tông sô cũng rất cao. Sự xuất hiên, phân bô cua các
chung Vibrio là theo mùa và phu thuôc vào chế đô dinh dương cua nươc. Hiên
tương bùng nô Vibrio xay ra trong cac trương hơp nươc bị phú dương. Viêc định
15
lương vi khuân Vibrio spp. rất quan trong để chu đông kiểm tra chất lương nươc,
xac định kha năng bênh lí có thể xay ra trong đầm nuôi tôm.
1.4. Anh hƣơng cua môt số điêu kiên môi trƣơng lên qua trinh nuôi trông thuy san
Dạng thưc ăn sư dung nuôi tôm anh hương rấ t lơn đên môi trương đâm nuôi .
Trong thơi gian đâu , đa sô cac loai nuôi đêu cho năng suât cao nhưng chi sau môt
thơi gian sư dung thưc ăn , đăc biêt la thưc ăn tu ơi thi chât lương nươc suy giam môt
cach nhanh chóng . Khi ham lươ ng cac chât hưu cơ va cac chât chưa ni tơ tăng lên
thi ham lương oxy hoa tan giam . Sư nh iêm bân môi trương nươc nuô i trông thuy
san đươc bắt đầu bằng sự tích tu cac san phâm thưc ăn dư thừa va cac chất thai cua
tôm ca. Khi đo , qua trinh sinh trương va phat triển cua cac loai thuy san bị đinh trê ,
môt trong sô trương hơp co thê dân đên hiên tương tôm ca bi chêt hang loat , gây
thiêt hai lơn cho san xuât .
1.4.1. Nhiêt đô
Nhiêt đô la điêu kiên xac đinh đăc điêm cac qua trinh sinh hoc , lí hoc , hóa
hoc… diễn ra trong nươc . Tôm ca la cac đông vât biên nhiêt . Nhiêt đô la yêu tô sinh
thai quan trong anh hương tơi nhiêu phương diên trong đơi sông cua tô m ca như : hô
hâp, tiêu thu thưc ăn , đông hoa thưc ăn , tăng cương miên dich đôi vơi bênh tât , sư
tăng trương… nhiêt đô thay đôi theo mua nên ơ miên Nam Viêt Nam co thê nuôi
tôm ca quanh năm trong khi ơ miên Băc chi khai thac đ ươc chu yếu vao mùa có
nhiêt đô âm ap . Ơ Viêt Nam , nhiêt đô thich hơp cho tôm ca la 28-36oC [27].
1.4.2. Đô pH
Đô pH đăc trưng cho hoạt tính phan ưng cua môi trương , gia trị pH đươc tính
băng : pH = ln [H+].
Đô pH cua môi t rương đâm nuôi anh hương kha lơn đên sư sinh trương cua
tôm ca . pH thâp co thê lam tôn thương p hân phu , mang, qua trinh lôt xac va đô
cưng cua vỏ tôm. Đô pH thấp lam tăng tính đôc cua khí H 2S, gây ngô đôc cho tôm
ca, khi pH cao lai lam tăng đôc tinh cua NH 3. Đô pH trong khoang 7,2 – 8,8 đươc
coi la thich hơp [37].
Bang 1.1. Anh hƣơng cua pH đên sinh trƣơng cua tôm , ca
(Lƣơng Đƣc Phâm , 2002) [24]
Đăc điêm môi trƣơng pH Giơi han thi ch nghi cua tôm, ca
16
axit manh 4 điêm chêt đôi vơi tôm, ca
axit yêu 5-6 tôm ca không sinh san hoăc kho sinh san
trung ti nh 7-8 môi trương thich hơp cho tôm ca
kiêm yêu 9 giơi han cuôi cung cho tôm ca
kiêm 10 tôm ca không lơn
kiêm manh > 10 điêm chêt đôi vơi tôm ca
1.4.3. Đô măn
Đô măn đươc tính dựa trên tông nông đô cac ion hoa tan trong nươc , có quan
hê mât thiêt vơi đơi sông cua thuy sinh vât . Nhu câu vê đô măn thay đôi tuy theo
tưng loai tôm ca va thơi điểm trong chu trinh sông cua mỗi loại . Đôi vơi tôm sú , đô
măn thich hơp la 15-35‰ NaCl, đô măn tôi ưu la 29 -30‰ NaCl. Tôm su sinh
trương châm va năng suât thâp khi nuôi ơ đô măn cao hơn 35‰ [21].
1.4.4. Oxy hoa tan (DO)
Oxy hoa tan trong nươc co y nghia rât lơn t rong viêc đanh gia trang thai cua
nươc va đô giam cua no cho thây sư thay đôi manh me cua cac qua trinh sinh hoc ,
qua trinh tự lam sạch , sư nhiêm bân cua nguôn nươc . Nông đô oxy hoa tan phu
thuôc vao môt loat cac yêu tô tư nhiên như : ap suất , nhiêt đô nươc , nông đô cac
muôi hoa tan trong nươc . Khi nuôi tôm , ca, giưa mât đô tôm , ca vơi ham lương oxy
hoa tan có môi quan hê qua lại vơi nhau. Oxy đươc tôm, ca sư dung vao qua trinh
hô hâp , đông thơi oxy đươc tiêu thu lam phân huy môt lương chât thai va thưc ăn dư
thưa cua tôm , ca. Do đo , oxy la yếu tô quan trong trong nươc nuôi , hô trơ cho tôm ,
ca phat tri ển. Nươc nuôi đu tiêu chuân đê nuôi tôm ca co nông đô oxy hoa tan la : 5-
8mg/l . Trong đâm nuôi , lương oxy hoa tan thấp sẽ lam tôm chậm lơn , có thể chết
hang loạt . Mưc gây hai tuy thuôc vao lương oxy hoa tan có trong đầm va giơi gian
tôm, ca phai chịu đựng . Chanratchakool P. (1995) [44] cho răng ham lương oxy hoa
tan trong nươc < 4mg/l lam cho tôm , ca sư dung thưc ăn kem , dê nhiêm bênh . Chiu
Liao P. (1992) [45] nhân thây răng lương oxy hoa tan nhỏ hơ n 3,5 mg/l se gây chêt
tôm, ca. Lương oxy hoa tan con liên quan đến đô măn va nhiêt đô nươc cua đầm
nuôi. Khi nhiêt đô , đô măn tăng thi kha năng hoa tan oxy trong nươc giam
(Gaudiosa, 1975) [50].
17
1.4.5. COD, BOD
COD la nhu câu oxy hóa hoc cần thiết cho qua trinh oxy hóa toan bô c ac chât
hưu cơ trong nươc thanh CO 2 va H 2O. BOD la nhu câu oxy sinh hoc cân thiêt cho vi
sinh vât tiêu thu đê oxy hóa cac chất hữu cơ có trong nươc .
Trong môi trương đâm nuôi tôm ca, hai chi tiêu nghiên cưu chât lương nươc
COD va BOD đươc dung đê đanh gia mưc đô nhiêm bân , phú dương hóa đông thơi
con cho biết sự phat triển c ua sinh vật trong thuy vực [15]. COD phan anh lương
tiêu hao oxy do qua trinh biến đôi cac chất hữu cơ (biên đôi hoa hoc), do đo gia trị
COD phan anh mưc đô gia tăng chât hưu cơ co trong đâm như thưc ăn thưa , san
phâm bai tiêt cua tôm va xac sinh vât chêt . Sư biên đôi COD trong đâm nuôi tôm
tăng dân tư đâu vu tơi cuôi vu , thương đâu vu ham lương COD thâp tư 0,5 –
1,2mg/l, cuôi vu nuôi co thê lên tơi 10 - 12 mg/l [23]. Trong đâm nuôi , COD thương
biên đôi tư 1,9 - 6,5 mg/l tuy gia tri ơ mưc trung binh cao nhưng phu hơp cho tôm
ca phat triển [23]. BOD phan anh lương cac chât hưu cơ dê bi phân huy sinh hoc co
trong nươc . Gia trị BOD cang lơn nghĩa la mưc đô ô nhiễm hữu cơ cang cao . Tiêu
chuân nươc thuy san cua FAO quy đinh gia tinh BOD < 10 mg/l, giơi han thich hơp
cua BOD từ 4 -8 mg/l [23].
Trong đâm nuôi trông thuy san , cac thông sô BOD , COD cang giam cang tôt
vi điêu đó chưng tỏ rằng trong đầm không phai tiêu thu môt lương lơn oxy hoa tan
(DO) trong nươc để oxy hóa cac chất căn ba ơ đay đầm . Khi COD , BOD giam thi
DO trong nươc tăng lên , lam cho nươc đầm nuôi trông thuy san trong lanh va sạch
sẽ hơn. Ca hai thông sô BOD va COD đêu xac định lương chất hữu cơ có kha năng
bị oxy hóa có trong nươc nhưng chúng khac nhau vê y nghĩa . BOD chi đê thê hiên
lương chât hưu cơ dê bi phân huy sinh hoc nghia la cac chât hưu cơ bi oxy hóa nhơ
vi sinh vât . COD thê hiên toan bô cac chât hưu co co thê bị oxy hóa bằng cac tac
nhân hoa hoc . Do vây , ti sô BOD / COD luôn nho hơn 1, chi sô nay cao chưng tỏ
môi trương đâm nuôi bi ô nhiêm bơi cac chât hưu cơ sinh hoc dê tan , dê phân huy
(thưc ăn thưa , chât thai cua tôm , ca, xac thuy sinh vât ch ết) [37].
1.4.6. Mât đô vi tao , Vibrio spp. va vi khuẩn tông sô
Vi khuân lam va cac loai vi tao la nhom sinh vât đơn gian nhât co kha năng
quang hơp . Chúng sư dung cacbonic hoăc cacbonat la nguôn cabon va sư dung cac
muôi photpho va nitơ vô cơ để phat triển theo sơ đô [37]:
CO2 + PO4 +nNH3 phat triển tế bao m ơi +n O2 Năng lương anh sang
18
Cac kết qua phân tích cac mẫu thực vật nôi vùng nươc cưa sông ven biển đa
xac định đươc 72 loai thuôc cac nganh Tao silic , vi khuân lam , tao luc va tao mắt .
Sô lương cac loai kể trên con thấp hơn nhiêu so vơi sô thực có trong măt nươc tự
nhiên. Trong sô thanh phân loai đa xac đinh đươc , tao silic co 62 loai, chiêm ưu thê
vê sô lương loai (86,1% tông sô loai ). Hâu hêt cac loai trong nganh tao silic la
nhưng loai nhiêt đơi trong nhom sinh thai xa bơ , thích nghi vơi đô muôi rông . Ơ
nhưng thuy vưc co đô muôi cao, tao silic chiếm ưu thế gần như tuyêt đôi . Tao silic
la thưc ăn quan trong cho đông vật phù du (zooplankton) va tôm . Ơ vùng nươc nằm
sâu trong sông co đô măn thâp hoăc ngot hoan toan thi nganh tao lam chiếm ưu thế
[11]. Mât đô tao la cơ sơ cho chuôi thưc ăn ơ nươc . Giưa năng suât tôm va mât đô
tạo có sự liên hê vô cùng quan trong . Măt nươc co mât đô tao thâp la măt nươc chêt
vê phương diên san xuât . Tuy nhiên , đâm nuôi co mât đô ta o qua lơn cung gây
nhiêu bât lương cho năng suât va môi trương [37], [38]. Mât đô tao cũng la chi thị ô
nhiêm nươc do phu dương hoa trong đâm nuôi thuy san .
Vi khuân Vibrio spp. trong cac đâm nuôi rât phong phu , có xu hương t ăng
dân theo thơi gian nuôi , đat gia tri cưc đai vao cuôi mua vu . Kêt qua nghiên cưu cua
Nguyên Trong Nho va ctv (1996) [23] ơ cac tinh Nam Trung Bô , đâm nuôi bi bênh
có sô lương vi khuân Vibrio spp. tông sô từ 110 – 1500 tê bao/ml. Viêc đinh lương
vi khuân Vibrio sp. rất quan trong để chu đông kiểm tra chất lương nươc cũng như
xac định kha năng bênh lí có thể xay ra trong đầm nuôi tôm .
Lương vi khuân tông sô la chi tiêu xac đinh điêu kiên v ê sinh cũng như mưc
đô nhiêm bân do cac hơp chât hưu cơ , chât thai cua tôm ca, thưc ăn thưa , xac thuy
sinh vât chêt đông thơi dư bao tinh hinh dich bênh trong đâm nuôi va nguôn nươc
cung câp cho đâm nuôi . Lương vi khuân tông sô co chiêu hương tăng dân theo thơi
gian nuôi , đăc biêt vao thơi gian co lương mưa lơn , nguôn nươc bi ô nhiêm tư cac
con sông đô ra . Lương vi khuân tông sô ơ nguôn nươc cung câp cho đâm nuôi tôm
cao hơn nhiêu so vơi tr ong đâm nuôi . Môi trương nươc co mât đô vi khuân cao hơn
107 tê bao/ ml co dâu hiêu bi ô nhiêm nhe , dịch bênh có thể phat sinh [2].
1.4.7. Nitơ tông sô
Trong nươc , ammon thương tôn tai ơ dang NH 3 va NH 4+. Ammon la san
phâm k hoang hóa đầu tiên cua cac chất hữu cơ , có thể đươc thực vật phù du hấp thu
trong qua trinh quang hơp hoăc bi oxy hóa tạo thanh muôi nitrit va nitrat dươi tac
dung cua vi sinh vật , qua trinh nay đươc goi la qua trinh n itrat hoa . Amôni ơ dạng
19
NH4+
không gây đôc cho cac loai thuy sinh vât trư khi ham lương qua cao . NH3 la
chât gây đôc cho cac l oai thuy sinh vật , tuy nhiên NH3 chịu anh hương cua pH ,
nhiêt đô va đô măn . Kha năng gây đôc cua N H3 đôi vơi tôm su cung co sư khac
nhau theo nhiêt đô va đô măn cua đâm nuôi . Trong đâm nuôi tôm su , nêu ơ nhiêt đô
thâp va đô măn cao thi kha năng chiu đưng cua tôm su vơi NH 3 kem hơn va ngươc
lại, khi ơ nhiêt đô cao v a đô măn thấp thi kha năng chịu đựng đôi vơi NH 3 tôt hơn .
Nitrit (NO2-
) rât cân thiêt cho hoat đông cua thưc vât phu du NO2-
thương
tôn tai ơ dang trung gian va ham lương trong nươc rât thâp . Ngoai ra , NO2-
con la
chi t iêu vê si nh, yêu tô chi thi cua qua trinh tư lam sach nươc trong tư nhiên [1].
Dạng nitrit thương vô hại nhưng trong môi trương nươc ma ham lương chlorinity
(chlorinity la khôi lương cua clo tinh băng gram chưa trong 1 kg nươc biên sau khi
bromua va iod đươc thay thê băng cloride . Chlorinity đươc xac đinh băng phương
phap chuân đô , đây la môt trong nhưng phương phap xac đinh nông đô muôi cua
nươc biên ) thâp thi nitrit se gây đôc cho tôm ca . Nitrit gây đôc cho tôm , ca la vi
chúng tạo thanh chất methemoglobin lam giam qua trinh vận chuyển oxy tơi tê bao .
Nitrit cung co thê kêt hơp vơi hơp chât mang gôc CN- va giai phóng gôc nay ra khỏi
phưc chât xianua gây đôc manh ch o đâm nuôi .
Nitrat (NO3- ) la san phâm cua sự khoang hóa cac chất hưu cơ chưa nitơ, cân
thiêt cho sư p hat triển cua thực vật phù du. Tuy nhiên , nêu ham lương nitrat trong
đâm tôm ca vươt qua 7 mg/l thi môi trương bi phu dươ ng va bi nhiêm bân [2].
Trong môi trương nươc , môi quan hê giưa NH 4+, NH3, NO2
-, NO3
-, có tính
liên tuc va liên quan chăt che vơi nhau .
NH3 + 1,5 O2 NO2- + H2O + H
+
NO2 + 0,5 O2 NO3-
Trong qua trinh oxy hóa ammon thanh NO 2-, NO3
-, mưc đô tiêu tôn lương
oxy trong nươc kha lơn , để oxy hóa 1 mg amôni ơ giai đoạn tạo NO 2- cân đên 3,43
mg O2 , con ơ giai đoạn tạo NO 3- la 4,5 mg O2 . Qua trinh nitrat hóa quan trong trong
nông nghiê p vi no chuyên hoa muôi amô ni thanh nitrat la nguôn thưc ăn tôt cho cây
trông. Trong nuôi trông thuy san , amôni, nitrit, nitrat đêu la chât đôc . Do đo , qua
trinh nitrat hó a giai đôc cho môi trương nuôi trông thuy san .
Nitrosomonas bacteria
Nitrobacter bacteria
20
1.4.8. Photphat (PO43-
)
Photphat la chât dinh dương cân thiêt cho sư phat triên cua rong , tao, trong
nươc, photphat tôn tai ơ 3 dạng la : orthophotphat (PO43-
), orthophotphat monohydro
(HPO42-
) va orthophotphat dihydro (H2PO43-
). Trong phân tich mâu nươc thương chi
xac định PO 43-
[14]. Ham lương PO43-
thương thâp , ít khi vươt qua 1 mg/l, đa phân
ham lương PO43-
đươc bun đay hâp thu va trơ lại môi trương . Trong ca c đâm nuôi
có chất đay phen chua nhiêu ion nhỏ va sắt thi lương PO43-
bị kết tua nhiêu . Vi vậy ,
cac đầm nuôi có đay chua phen cần đươc bón nhiêu phân lân. Ham lương PO43-
thích
hơp cho đâm nuôi la 0,5 mg/l [38].
Trong nươc , tao sư dung CO 2, nitơ vô cơ , orthophotphat va cac chât dinh
dương khac đê phat tri ển. Tuy nhiên , khi nông đô amônia va photphat cao , rong tao
phat triển mạnh tạo sinh khôi tơi mưc đông vật phù du va tôm ca trong đầm không
thê tiêu thu hêt se dân đên tinh trang bung nô cac loai rong , tao . Tinh trạng nay keo
dai sẽ lam cho đầm , hô bi phu dương hoa , nươc đuc va co căn lăng , có mùi khó chịu
do tao bi phân huy , gây giam oxy trong nươc . Trong điêu kiên đo thi tôm , ca sẽ sinh
trương châm va dê măc bênh [37].
1.4.9. Sulphuahydro
Sulphuahydro trong thuy vưc đươc hinh thanh do hoat đông phân huy chât
hưu cơ cua vi khuân trong điêu kiên yêm khi va vi khuân lưu huynh kh ư sulphat
trong nươc nơi co nhiêu sulphat [31]. Trong môi trương nươc cac đâm nuôi trông
thuy san , sulphuahydro thương tôn tai ơ môt sô dang như : H2S, HS-, S
2-. Tuy nhiên ,
trong cac dang trên chi co dang H 2S la gây đôc cho cac thu y sinh vât , mưc đô gây
đôc co liên quan đên nhiêt đô va pH cua đâm nuôi . pH va nhiêt đô thâp (nhiêt đô
200C va pH = 5) tôn tai tơi 99% la H 2S gây đôc [48]. Cac giai đoạn biến đôi tạo ra
H2S như sau:
SO42-
+ 8H+ S
2- + 4 H2O
S2-
+ H+ HS
-
HS- + H
+ H2S
Phương trinh tông qua cua qua trinh khư sunphat :
SO42-
+ 2(CH2O) + 2 H+ H2S + 2 CO2 + 2 H2O
Vi vậy , môi trương axit cung câp nhiêu ion H+ phan ưng phân huy chất hữu
cơ trong nươc luôn t ạo ra H 2S gây đôc cho tôm ca va cac thuy sinh vât khac . Theo
21
Nguyên Trong Nho (1994) [21], trong đâm nuôi tôm ca , ham lương H 2S không
đươc qua 0,1 mg/l.
Bang 1.2. Tiêu chuân chât lƣơng nƣơc nuôi trông thuy san
(Khoa thuy san , trương đai hoc Cân Thơ , 2000) [16]
chi tiêu giơi han
nhiêt đô nươc (0C) 23-30
mau nươc xanh non chuôi
đô pH 6,5 – 8,5
O2 (mg/l) 5-8
CO2 3-10
NH4+ 1,0
PO4 3-
0,5
Fe tông sô <0,3
COD (mg O2/ l) 10 – 20
H2S 0,0
Đô măn (%0) 18 - 30
1.5. Tinh hinh nghiên cưu va ưng dụng biên phap sinh hoc trong xư ly môi
trƣơng nƣơc nuôi trông thuy san .
1.5.1. Vai tro của các vi sinh vật trong quá trình lam sạch nước nuôi tôm, cá
Đầm nuôi tôm, ca là những hê sinh thai nươc không đăc trưng do chịu nhiêu
tac đông cua con ngươi. Tuy vậy, cũng giông như khu hê sinh thai nươc tự nhiên
khác, hê sinh thai đầm nuôi tôm, ca đươc cấu thành bơi nươc, khoáng chất, các hơp
chất hữu cơ hoa tan va hê thuy sinh vật. Vi sinh vật là môt thành phần quan trong
cua hê thuy vi sinh vật ơ đây bơi chúng không những đóng vai tro chu đạo trong các
chu trình chuyển hóa các nguyên tô cơ ban cấu tạo nên hơp chất hữu cơ ma tac
đông trực tiếp hoăc gián tiếp lên nguôn lơi thuy san cua ngươi nuôi trông [13], [35].
Vi sinh vật hữu ích trong nươc nuôi tôm bao gôm các nhóm có kha năng phân giai
22
va tai vô cơ hóa cac hơp chất hữu cơ, chuyển hóa các hơp chất vô cơ, đông thơi ban
thân chúng cũng không gây hại vơi tôm (không sinh ra san phâm đôc hại, không
gây bênh). Hoạt đông sông cua chúng sẽ giúp ích cho viêc cai thiên chất lương môi
trương nươc, ôn định pH, tạo điêu kiên môi trương không thuận lơi đôi vơi các vi
sinh vật gây hại, cạnh tranh và ưc chế sự phát triển cua nhóm vi sinh vật gây bênh ơ
tôm ca, qua đó giúp tôm, ca tăng trương nhanh, khỏe mạnh va môi trương sinh thái
trong đầm đươc cân bằng [28].
Trong môi trương nươc nuôi tôm, ca luôn tôn tại các hơp chất hữu cơ từ
nhiêu nguôn khac nhau như: lương thưc ăn dư thừa, phân tôm ca, chất tiết ra từ moi
quá trình trao đôi chất cua thuy sinh vật, xac đông vật, thực vật phù du…[4]. Do đó,
nếu nông đô cua chúng trong nươc quá cao sẽ gây ô nhiễm nguôn nươc và dẫn tơi
các hôi chưng sôc ơ tôm, ca. Hoạt đông tích cực cua các vi sinh vật phân giai các
hơp chất hữu cơ sẽ giúp giai phóng những tôn tại hữu cơ gây ô nhiễm nguôn nươc,
đông thơi bô sung trực tiếp hoăc gián tiếp vào nguôn dinh dương cần thiết cho đông
vật nuôi trông [43]. Cơ chế các hoạt đông phân giai chất hữu cơ ơ vi sinh vật hữu
ích chính la cơ chế cua các quá trinh trao đôi chất va trao đôi năng lương trong cơ
thể chúng. Nấm, đông vật nguyên sinh va đa sô vi khuân là vi sinh vật dị dương nên
chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoai môi trương để làm thưc ăn. Chúng sư dung
những chất nay để thu nhận các tiên chất cho viêc xây dựng nên tế bào cua mình và
thu nhận năng lương cho các quá trình sông. Khi đó vật chất hữu cơ đươc vi sinh
vật biến đôi thành các chất ngheo năng lương và cuôi cùng trong những điêu kiên
phù hơp thì chuyển hóa ngươc lại thành những chất vô cơ ban đầu. Trong môi
trương nươc nuôi tôm, ca các loại chất hữu cơ thương chiếm tỷ lê lơn là: protein,
cacbonhidrat, kitin,… Sự phân huy protein trươc hết là nhơ nhiêu loại vi khuân như
Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và ho vi khuân Enterobacteriaceae [34]. Đại
diên cho nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hơp chất cacbonhidrat bao gôm
các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter… Cac
nghiên cưu cu thể hơn con cho thấy bên cạnh kha năng phân giai chất hữu cơ, nhóm
vi khuân này còn có kha năng cạnh tranh sinh hoc, ưc chế sự phát triển cua các vi
khuân gây bênh ơ tôm là Vibrio và Aeromonas [35], [39], [61].
Môi trương nươc nuôi tôm, ca vôn là môt môi trương giau dinh dương, thưc
ăn giau đạm luôn đươc con ngươi cung cấp dư thừa, ngoài ra còn từ phân tôm, ca và
xac đông vật thuy sinh. Măt khác, môt sô hơp chất nitơ vô cơ như NH3 là môt khí
23
đôc vơi tôm và NO3- la tac nhân gây ung thư đôi vơi nhiêu đông vật. Do đó, vai tro
phân giai hơp chất nitơ hữu cơ cua nhóm vi khuân amôn hóa, nhóm vi khuân nitrat
hóa và nhóm vi khuân phan nitrat hóa đăc biêt đươc quan tâm. Tuy nhiên, chi môt
sô ít vi sinh vật (vi khuân sông tự do trong đất va nươc, vi khuân sông công sinh vơi
thực vật, vi khuân quang hơp,…) có kha năng cô định nitơ phân tư thành dạng nitơ
hơp chất mà các vi sinh vật khác có thể sư dung đươc. Dạng amôniac (NH3) và
nitrat (NO3-) đươc tao và nhiêu vi sinh vật hấp thu tạo nên nguôn nitơ hữu cơ, sau
đó có thể chúng lại trơ thành nguôn thưc ăn cho đông vật thuy sinh.
- Nhóm vi khuẩn amôn hóa: Nhóm này phân giai protein và các hơp chất
hữu cơ chưa nitơ tạo thành amôniac, hoạt đông cua nhóm vi khuân amôn hóa giúp
loại bỏ các hơp chất hữu cơ gây ô nhiếm nguôn nươc nuôi tôm, ca góp phần tạo nên
môt môi trương trong sạch cho tôm ca phát triển.
- Nhóm vi khuẩn nitrat hóa: vi khuân amôn hóa là vi khuân hữu ích, song
san phâm mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nươc nông đô NH4+ qua cao vươt
mưc cho phép sẽ gây hại cho đông vật nuôi trông [1]. Nhóm vi khuân nitrat hóa đó
là các chi Nitrosomonas, Nitrococus, Nitrobacter, Nitrospira,… đươc xếp vào
nhóm vi khuân hữu ích trong môi trương nươc nuôi tôm ca vì chúng có kha năng
chuyển hóa NH4+ thành NO3
- (dạng không đôc vơi môi trương và các sinh vật khác
trong đầm). Măt khác, NO3- do hoạt đông cua chúng sinh ra lại có thể đươc đông
hóa trong tông hơp protein cua nhiêu sinh vật và tao. Như vậy, nhóm vi khuân nitrat
hóa không chi làm giam đô đôc cua nươc mà còn góp phần làm mơi nguôn nươc,
mang lại các chất dễ hấp thu cho đông vật thuy sinh [51], [55].
Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus… la cac vi khuân có kha năng khư NO3-
thành N2 khí quyển, giúp khép kín vòng tuần hoan nitơ trong thuy vực, đông thơi
hạn chế môt tác nhân gây hại cho đông vật nuôi trông. Trong nươc nuôi tôm ca
cũng như tại các nhà máy xư lý nươc thai, sô lương và hoạt đông sinh lý cua nhóm
vi khuân nitrat hóa và vi khuân phan nitrat hóa đươc xem như cac thông sô giơi hạn
tôc đô quá trình chuyển hóa sinh hoc cua nitơ trong nươc [26].
Vi sinh vật dị dương sinh trương và thu nhận năng lương bằng nhiêu phan
ưng xúc tác enzym. Các enzym có tính đăc hiêu cơ chất cũng như có hiêu qua xúc
tác chuyển hóa cao. Môt sô enzym cũng tham gia vao chuỗi các phan ưng sinh hóa
để hiêp đông chuyển hóa môt sô cơ chất khó phân huy. Có 2 loại enzym là enzym
nôi bào vào enzym ngoại bào. Enzym ngoại bào phân huy cac cơ chất cao phân tư
24
thành các phân tư nhỏ hơn để có thể di chuyển vào tế bào qua màng sinh chất.
Enzym nôi bào xúc tác các phan ưng oxy hóa cơ chất thu năng lương và sinh tông
hơp trong tế bào. Trong quá trình phân huy cơ chất hữu cơ, vai tro hang đầu thuôc
vê các vi sinh vật có kha năng sinh tông hơp các enzym thuy phân ngoại bào.
1.5.2. Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) va vai tro của nó
trong việc cải tạo nước đầm nuôi t rông thuy san
Định nghĩa vê Probiotic
Theo định nghĩa cua tô chưc y tế thế giơi WHO, probiotic là “những vi sinh
vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của cơ
thể” [48]. Probiotic co nguôn gôc tư tiêng Hy Lap , ghep từ chữ pro l a vi va biotic la
sư sông , nên tiêng Viêt thương goi la trơ sinh . Thuât ngư probiotic đươc dung đê
mô ta nhưng chât sinh ra tư vi sinh vât co tac dung tăng trương vi sinh vât hoăc sinh
vât khac . Năm 1959, Rl Fuller đinh nghi a ro hơn . Probiotics hay vi sinh vât
probiotic la nhưng vi sinh vât sông , bô sung vao thưc ăn co tac dung cân băng hê vi
khuân đương ruôt va co tac dung hưu ich cho đông vât chu [54]. Gân đây , đinh
nghĩa nay đươc mơ rông hơ n. Probiotic la chê phâm bao gôm vi sinh vât sông co tac
dung hữu ích cho đông vật va ngươi sư dung . Tac dung hữu ích bao gôm tac dung
lam cân bằng hê vi sinh đương ruôt hay sinh chất đôi khang lam giam sô lương ca
thê hay tăng lương khang thê kich thich hê thông miên dich hoăc la cung câp enzym
trong qua trinh trao đôi chât cua vi khuân . Probiotic la giam cac vi sinh vât co hai
(cac vi sinh vật cạnh tranh th ưc ăn va tiêt cac chât đôc an h hương xâu tơi hoat đông
sông cua vât chu ), lam tăng cac vi sinh v ật có lơi (đo la cac sinh vât canh tranh th ưc
ăn va vi tri bam vao cac mô vơi vi sinh vât co hai , chún g tiêt ra cac chât diêt khuân
va vitamin K cho cơ thê ).
Ngày nay, khái niêm probiotic con đươc mơ rông sang lĩnh vực môi trương.
Đưa probiotic vao môi trương nươc để tạo sự cân bằng giữa các vi sinh vật trong
môi trương. Ơ nươc ta, viêc sư dung các chế phâm sinh hoc trong nuôi trông thuy
san và san xuất giông chi mơi ưng dung nhiêu từ năm 2000 trơ lại đây, qua thực tế
sư dung đa cho thấy kết qua tôt. Hiên nay ơ Viêt Nam, hầu hết cac cơ sơ nuôi tôm
ca đêu sư dung chế phâm vi sinh vật probiotic. Vơi muc tiêu tăng nhanh san lương,
ngươi ta tha tôm, ca vơi mật đô quá dày trong khi không có biên pháp xư lý môi
trương thích hơp, dẫn đến hiên tương thôi đầm, làm giam oxy hòa tan khiến tôm, ca
ngạt thơ. Ham lương các NH3, NH4+, NO2
-, NO3
-, H2S… tăng cao sẽ khiến tôm ca
25
giam sự chông đơ vơi môi trương bất lơi và tác nhân gây bênh, nếu vươt quá
ngương sẽ chết.
Probiotic trong nuôi trông thuỷ san
Probiotic la chê phâm cua công nghê sinh hoc ưng dung vi sinh vât trong
cac vấn đê thực tiễn . Trong nuôi trông thuy san , probiotic hiên đang đươ c coi la môt
liêu phap an toan va hiêu qua nhăm thay thê cho cac loai thuôc khang sinh va hoa
chât đa đươc sư dung trươc đây [26].
Probiotic co thanh phân la môt chung đơn hoăc môt h ỗn hơp cac chung vi
sinh vât hưu ich . Nhóm vi sinh vật hữu ích ấy tham gia tích cực vao cac qua trinh
phân huy sinh hoc bun va chât thai hưu cơ , chúng có kha năng cạnh tranh ưc chế
cac vi sinh vật gây bênh cho đông vật huy sinh , chúng rất an toan vơi môi trươ ng va
cũng không gây đôc hại đôi vơi ngươi va vật nuôi . Đôi vơi cac hinh thưc nuôi trông
khac nhau , viêc sư dung chê phâm sinh hoc đươc nhin nhân như biên phâp tich cưc
nhât bơi vi chê phâm sinh hoc co tac dung giam đôc tô trong đâm , chu yếu la NH 3
va H 2S, giam mùi hôi , cai thiên mau nươc , ôn định pH va cân bằng hê sinh thai
trong đâm. Chê phâm sinh hoc cung co tac dung phong bênh , giam thiểu hiên tương
gây bênh cho tôm . Ngoai ra , viêc ap dung chế phâm sinh hoc trong nuôi trông thuy
san con giúp đôi tương nuôi hấp thu thưc ăn dễ hơn , giam hê sô tiêu thu thưc ăn ,
tăng năng suât thu hoach tư 20 – 30% [60]. Bên canh đo , viêc sư dung chê phâm
sinh hoc tron g nuôi trông thuy san se han chê viêc sư dung hoa chât va chât khang
sinh, yêu tôt gây ra hâu qua cua viêc nuôi trông thuy san kem bên vưng . Thưc tê
cho thây , nhưng cơ sơ sư dung chê phâm sinh hoc đa đat năng suât thuy san kha
cao, giam thiểu nguy cơ mắc bênh .
Sư dung chê phâm probiotic cho kêt qua ưu viêt hơn hăn sư dung hoa chât
cũng như thuôc khang sinh vi hóa chất chi lam sạch nươc tạm thơi va chúng giết
chêt hang loat tao tro ng đâm . Hơn nưa , thay vi cân phai lam sach chât hưu cơ va
lăng căn bun thi hoa chât lai gop phân hinh thanh nên lơp bun day hơn ơ đay đâm ,
tạo điêu kiên cho cac vi sinh vật gây hại phat triển . Bên canh đo , nhiêu loai tôm, ca
va đông vật thuy sinh khac cũng có thể bị giết chêt bơi hoa chât . Hâu qua cua viêc
dùng thuôc khang sinh cũng không kem phần nghiêm trong . Chât khang sinh cung
giêt chêt nhiêu loai vi khuân , kê ca vi khuân gây ha i lân vi khuân co ich , do đo lam
giam tôc đô cac qua trinh cac qua trinh chuyển hóa sinh hoc trong nươc , đông thơi ,
giam kha năng tạo miễn dịch tự nhiên cua chúng . Hơn nưa , sư dung thuôc khang
26
sinh lâu dai se dân đên xuât hiên cac chung vi khuân gây bênh khang thuôc . Hiên
tương khang thuôc cung co thê xuât hiên ơ ngươi thông qua chuôi thưc ăn khi con
ngươi sư dung cac san phâm thuy san nuôi trông . Vi thế , hiên nay cac loai thuôc
khang sinh đêu bi câm sư dung trong nuôi trông thuy san . Măt khac , tôm ca la
nhưng sinh vât rât nhay cam vơi bênh tât , dê bi tôn thương va bi tân công bơi nhiêu
tac đông, đôi khi viêc sư dung chât khang sinh liên tuc đa la m mât đi san lương tôm
ca không lô , ví du vơ nhiêu nơi trên thế giơi đa từng bị mất đến 80% san lương thuy
san. Như vây , ro rang cần phai có môt sự kiểm soat khac thay thế thuôc khang sinh ,
hóa chất va probiotic đa t hê hiên đươc vai tro ây .
Hiên nay các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuân quang
dương, hóa dương… đươc sư dung chu yếu để san xuất các chế phâm sinh hoc.
Những nghiên cưu cho thấy rằng các loài vi khuân nay đêu không đôc hại, dễ nuôi
cấy, dễ tôn tại trong môi trương nươc va đất ngheo dinh dương. Chúng có kha năng
phân huỷ thưc ăn thừa, chất thai hữu cơ va lam sạch môi trương nhơ enzym do
chúng tông hơp đươc. Ngoài ra chúng còn có kha năng sinh cac chất kháng khuân
như bacteriocin, môt chất có hoạt tính khang sinh đươc dùng nhiêu trong chăn nuôi,
bao quan thực phâm để nâng cao hiêu suất tăng trương, hiêu suất sư dung thưc ăn
cua vật nuôi, làm giam sự phát triển cua những vi sinh vật có hại. Chính nhơ những
đăc điểm nay ma chúng đươc dùng để san xuất các chế phâm nhằm cai thiên môi
trương nươc, nâng cao hiêu suất kinh tế, hạn chế dịch bênh cho tôm ca.
Mục đích cua viêc sư dụng chê phẩm probiotic
Trong nuôi trông thuy san sư dung chế phâm probiotic nhằm các muc đích:
- Giam đôc tô trong ao ơ mưc thấp nhất, giam mùi hôi thôi cua nươc.
- Cai thiên mau nươc, ôn định pH, cân bằng hê sinh thái trong ao.
- Phân huy các chất hữu cơ, phong tao nơ hoa, hấp thu nguôn tao chết trong
ao, giam đô nhơt cua nươc.
- Cạnh tranh thưc ăn lam giam lương vi khuân có hại, phòng bênh.
- Tăng sự hòa tan oxy.
- Kích thích hê miễn dịch trong tôm để kháng bênh, giam sôc khi môi trương
thay đôi đôt ngôt.
- Giúp tôm ca hấp thu thưc ăn tôt, giam hê sô tiêu tôn thưc ăn.
- Hạn chế đươc sư dung thuôc kháng sinh và hóa chất.
27
- Giam sô lần thay nươc trong quá trình nuôi.
Môt số nhóm vi khuẩn thƣơng đƣợc sư dụng trong san xuất
probiotic cho tôm cá
Nhóm Bacillus
Vi khuân thuôc chi Bacillus phân bô rất rông trong tự nhiên, trong rất nhiêu
môi trương (đất, nươc, không khí, thực phâm…) va gôm nhiêu nhóm sinh lí sinh
thai khac nhau (ưa ấm, ưa nhiêt, ưa lạnh…), vơi gần khoang gần 500 loai va dươi
loài. Do sự đa dạng sinh thai va đa dạng loai như vậy các hoạt chất sinh hoc cua
chúng cũng vô cùng phong phú: cac enzym ngoại bào, các chất kháng khuân và
kháng nấm, các chất kích thích sinh trương thực vật, các chất hoạt đông bê
măt…[32]
Bacillus là những vi khuân Gram dương, hinh que, có bao tư, sinh trương
trong điêu kiên hiếu khí hoăc kỵ khí không bắt buôc, thuôc nhóm vi khuân dị dương
hoại sinh. Vê dinh dương va sinh trương nhìn chung Bacillus là những vi khuân hóa
tự dương hữu cơ tùy tiên có kha năng sư dung nhiêu các hơp chất hữu cơ đơn gian
như la cac đương, axit amin, các axit hữu cơ. Trong môt sô trương hơp chúng lên
men cacbonhydrat thông qua chuỗi các phan ưng phưc tạp tạo ra glycerol và
butanediol. Môt sô ít loai như Bacillus megaterium lại không cần đến các yếu tô
sinh trương hữu cơ, môt sô khac sinh trương lại cần có vitamin B hoăc các axit
amin. Phần lơn Bacillus là các vi khuân ưa ấm vơi nhiêt đô sinh trương tôi ưu từ
30 - 45oC môt sô loài có thể sinh trương ơ nhiêt đô 65
oC. Môt sô loai ưa lạnh có thể
sinh trương và hình thành nôi bào tư ơ 0oC. pH sinh trương rất khác nhau từ 2 -11.
Đa sô Bacillus sinh trương tôt ơ pH = 7, môt sô phù hơp vơi pH = 9 như Bacillus
alcalophillus, hay có loài phù hơp vơi pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius [32].
Trừ Bacillus anthracis gây bênh than cho ngươi, tất ca các Bacillus khác
đươc coi la không đôc hại cho ngươi. Bacillus làm sạch môi trương nươc nhơ kha
năng sinh enzym phân huy chất hữu cơ nguôn gôc từ thưc ăn thừa, chất thai từ tôm
ca: proteaza phân huy protein, amylaza phân huy tinh bôt, xenlulaza phân huy
xenlulozơ, kitinaza phân giai kitin. Ngoài chưc năng phân giai các hơp chất hữu cơ
làm sạch môi trương thì chúng còn có tác dung kiểm soát sự phát triển quá mưc vi
sinh vật gây bênh do cơ chế cạnh tranh nguôn dinh dương, giữ cho môi trương luôn
ơ trạng thái cân bằng sinh hoc. Đăc điểm quan trong nhất cua chi Bacillus là có kha
năng tạo nôi bào tư, nhất là trong những điêu kiên bất lơi như cạn kiêt nguôn dinh
28
dương hay điêu kiên bất lơi vê nhiêt đô cao, tia bưc xạ hóa chất… Bao tư Bacillus
có thể tôn tại rất lâu thậm chí trong nhiêu năm, khi găp điêu kiên thuận lơi có thể
nay mầm, phát triển thành tế bao dinh dương. Trong quá trình hình thành bào tư,
Bacillus thương san sinh ra các hơp chất có hoạt tính sinh hoc, ưng dung trong
nhiêu lĩnh vực. Môt trong những đăc tính đó la sinh enzym phân huy hữu cơ như
proteaza, amylaza, xenlulaza. Proteaza là enzym xúc tác sự thuy phân liên kết peptit
(CO-NH) trong phân tư protein và các chất tương tự. San phâm thuy phân là các
axit amin, san phâm trung gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau. Enzym
amylaza có tác dung thuy phân tinh bôt. Quá trình trai qua giai đoạn dextrin hóa,
khi đó chi môt sô liên kết trong phân tư cơ chất bị thuy phân tạo thành môt lương
dextrin va giai đoạn đương hóa. Trong giai đoạn này các dextrin vừa đươc tạo thành
bị phân huy tiếp thành các phân tư thấp hơn như maltozơ, isomaltozơ, glucozơ.
Enzym xenlulaza xúc tác sự thuy phân xenlulozơ thanh san phâm trung gian
xenlubiozơ va san phâm cuôi cùng la glucozơ. Cac san phâm cuôi cùng cua sự phân
huy chất hữu cơ nhơ hê enzym proteaza, amylaza, xenlulaza là các axit amin và
glucozơ. Đó la nguôn dinh dương cho nhiêu loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng
phát triển mạnh và làm cai thiên chất lương nươc [32].
Nhóm vi khuẩn lactic
Môt trong những nhóm vi khuân điển hinh có ích đôi vơi môi trương đâm
nuôi tôm ca là nhóm vi khuân lactic. Các vi khuân lactic đươc xếp chung vào ho
Lactobacteriacae. Chúng không đông nhất vê măt hình thái, các giông khác nhau có
hình dạng va kích thươc khac nhau. Nhưng nhin chung chúng đươc chia thành hai
loại hình cầu và hình que. Ngoài ra hình dạng va kích thươc tế bào vi khuân lactic
còn phu thuôc vao môi trương, điêu kiên nuôi cấy, sự có măt cua oxy và tuôi tế bào.
Streptococcus có tế bào hình cầu hoăc hinh ovan, đương kính khoang
0,5 -1,0 µm, sắp xếp riêng biêt, căp đôi hoăc thành chuỗi dài. Tuy nhiên, môt sô
chung thuôc loài này có thể có dạng hơi giông trực khuân vi có kích thươc chiêu dài
lơn hơn chiêu rông, chẳng hạn như Streptococus lactic [9].
Leuconostoc có hình dạng hơi dai hoăc hinh ovan, đương kính từ 0,5 - 0,8µm
và chiêu dài khoang 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tron, chiêu dài khoang
1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thanh đam [9 ].
Lactobacillus có hinh que. Đây la loại vi khuân phô biến nhất. Hình dạng
cua chúng thay đôi từ hình cầu cho đến hình que dài. Chẳng hạn L. plantatum có
29
dạng hinh que kích thươc từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, sắp xếp thành chuỗi hoăc đưng
riêng lẻ, trong khi L. casei có dạng hình que ngắn hoăc hình que dài, tế bào hình
que manh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành căp hay chuỗi [9].
Vê hình thái, vi khuân lactic có hình dạnh không đông nhất. Nhưng vê măt
sinh lý chúng lại có những điểm tương đôi đông nhất. Chúng đêu là những vi khuân
Gram (+), không có kha năng tạo bào tư, không di đông, sinh axit lactic trong quá
trình phát triển, catalase, oxydase và khư nitrat âm tính, không chưa các xitocrom,
hô hấp kỵ khí hoăc vi hiếu khí [10].
Mỗi loài vi khuân khác nhau có nhu cầu vê dinh dương cũng khac nhau.
Chúng không những cần cung cấp đu các chất dinh dương: cacbon, nitơ, muôi
khoang… ma con cần các chất kích thích sinh trương.
Nhóm vi khuân lactic có kha năng kiểm soát vi sinh vật gây bênh trong môi
trương nhơ sinh chất đôi khang như axit lactic, bacteriocin. Ngoai vai tro kiểm soát
vi sinh vật gây bênh trong môi trương thi chúng cũng có tac dung làm giam mùi hôi
cua đầm nuôi. Quan trong hơn ca, sư dung nhóm vi khuân này còn có tác dung hạn
chế viêc sư dung khang sinh, đam bao tiêu chuân vê sinh thực phâm cho san phâm
thuy san. Khi sư dung nhóm vi khuân lactic để bô sung vào thưc ăn tôm ca, ngoài
muc đích lam cân bằng khu hê vi sinh vật đương ruôt, ngăn can sự xâm nhập cua vi
sinh vật có hại, tăng kha năng phong ngừa môt sô bênh đương ruôt thì chúng còn có
tác dung tăng kha năng tiêu hóa va hấp thu thưc ăn, giúp cho tôm ca nuôi phát triển
khỏe mạnh, tăng trương nhanh [5].
Nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dƣỡng
Trươc đây, theo phân loại truyên thông đa xếp các chung vi khuân nitrat hóa
chung vào cùng môt nhóm thuôc ho Nitrobacteriaceae sau đó, dựa vào kha năng
oxy hóa cac cơ chất vô cơ cua vi khuân nitrat hóa ma ngươi ta đa chia chúng thanh
2 nhóm, đó la nhóm vi khuân oxy hóa amôni và nhóm vi khuân oxy hóa nitrit [53].
Vi khuân oxy hóa amôni hay còn goi là vi khuân nitroso là nhóm vi
khuân Gram âm, hóa tự dương và hiếu khí bắt buôc. Vi khuân này lấy năng
lương từ quá trình oxy hóa amôni thành nitrit. Quá trình oxy hóa amôni xay
ra theo phương trinh sau:
30
Vi khuân oxy hóa amôni tự dương lấy năng lương và lực khư từ quá trình
oxy hóa amôni để sinh trương. Nguôn cacbon chính mà các tế bào vi khuân sư dung
là CO2 trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson. Các tế bào vi khuân
sinh trương rất chậm, thơi gian nhân đôi tế bào cua vi khuân ít nhất là 7 - 8 giơ,
thậm chí cũng có thể kéo dài thêm vài ngày [42].
Trong hê thông phân loại hiên nay, ngươi ta chia nhóm vi khuân amôni hóa
thành 3 chi, dựa vào sự khác biêt vê hình dạng tế bào, kiểu hình và tô chưc nôi bào.
Đó la cac chi Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira . Tế bào vi khuân thuôc
chi Nitrosomonas có hình que thẳng, chi này là phô biến nhất trong nhóm vi khuân
amôni hóa, có vùng phân bô rông, chúng sông trong đất, nươc ngot, bùn, nươc lơ,
biển. Chi Nitrosococcus tế bào có hình cầu đăc trưng, tế bào có roi nên có kha năng
di chuyển. Tế bào vi khuân thuôc chi Nitrosospira có hình xoắn ôc[62].
Nhóm vi khuân oxy hóa nitrit tự dương đươc biết đến như la vi khuân tự
dương hóa năng (chemoautotroph), Gram âm và hiếu khí. Giông như vi
khuân oxy hóa amôni, vi khuân oxy hóa nitrit sư dung nguôn cacbon là CO2
thông qua chu trình Calvin-Benson [41]. Quá trình oxy hóa nitrit xay ra như
sau:
Tôc đô sinh trương cua vi khuân oxy hóa nitrit phu thuôc vào nông đô cơ
chất, nhiêt đô, pH, ánh sáng và nông đô oxy hòa tan. Các chung vi khuân nitrit hóa
tự dương sinh trương tôt ơ nông đô nitrit từ 2 - 30 mM, nông đô nitrit quá cao có
thể gây ưc chế sinh trương cua tế bào. Vi khuân oxy hóa nitrit có thể sinh trương
binh thương trong môi trương tự nhiên ơ dai pH = 6 - 8. Điêu kiên tôi ưu cho sinh
trương là pH = 7 - 8. Nhiêt đô ly tương cho sinh trương cua chúng là 25 - 30oC
trong môi trương không khí [62].
Tôc đô cua giai đoạn (1) xay ra nhanh gấp 3 lần so vơi giai đoạn (2). Bằng
thực nghiêm ngươi ta đa chưng minh rằng lương oxy tiêu hao để oxy hóa 1mg nitơ
cua muôi amôni ơ giai đoạn tạo nitrit là 343 mg O2, còn ơ giai đoạn tạo nitrat là 4,5
mg O2. Sự có măt cua nitrat trong nươc thai phan ánh mưc đô khoáng hóa hoàn
thành các chất bân hữu cơ. Năng lương sinh ra từ phan ưng nitrat hóa đươc vi khuân
sư dung trong quá trình tông hơp tế bào [5].
31
Ngày nay, vi khuân oxy hóa nitrit đươc phân loại thành 4 chi: Nitrobacter,
Nitrococcus, Nitrospina và Nitrospira. Tế bào vi khuân thuôc chi Nitrobacter có
hình que ngắn, màng trong tế bào chưa mũ phân cực. Tế bào vi khuân thuôc chi
Nitrococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ông. Tế bào vi khuân thuôc chi
Nitrospina có hình que, màng trong tế bào dạng túi. Tế bào vi khuân thuôc chi
Nitrospira có hình xoắn và không xuất hiên màng trong tế bào [62].
Các vi khuân oxy hóa nitrit có kha năng thích nghi cao vơi cac điêu kiên môi
trương khác nhau va chúng thương tôn tại cùng vơi vi khuân oxy hóa amôni do các
vi khuân nay đa cung cấp nitrit cho chúng trong môi trương hiếu khí [41].
Trong các chế phâm dùng cho ao, đầm nuôi tôm ca hiên nay ngươi ta thương
bô sung nhóm vi khuân nitrat hóa tự dương cu thể là chi Nitrosomonas và chi
Nitrobacter. Vi khuân thuôc hai chi này đóng vai tro quan trong trong viêc giam các
đôc tô trong môi trương nươc, chuyển hóa các chất đôc như amôni và hơp chất nitơ,
do đó sẽ làm giam mùi hôi trong nươc, giúp tôm ca nuôi phát triển tôt [7] .
1.5.3. Ƣu điêm va nhƣơc điêm cua biên phâp sƣ dung vi sinh vât trong xƣ ly
nƣơc nuôi trông thuy san
- Ưu điêm: cac loai vi sinh vật đươc dùng ngay cang nhiêu trong xư ly môi
trương nươc nuôi trông thuy san va đem lại nhiêu lơi ích cho con ngươi va môi
trương sông ma cac phương phap khac không co đươc như : an toan đôi vơi ngươi
va đông vật , đăc hiêu đôi vơi vât chu , thích hơp vơi cac phương phap phong trừ
khac , thơi gian ban huy ngắn nên không tôn đong lâu để gây ô nhiễm môi trương
sông, có kha năng tự nhân lên (tư sinh san ), có kha năng ưc chế cac vi sinh vật đa
khang thuôc hóa hoc .
- Nhươc điêm : thơi gian phat huy tac dung châm , tac đông không triêt đê ,
hiêu qua phương phap chiu anh hương lơn vao điêu kiên ngoai canh , kêt qua thu
đươc thương không ôn đinh .
Đê han chê cac nhươc điêm nay , chúng ta cần phai tuyển chon cac chung vi
sinh vât co tinh đôi kh ang tôt nhất , nghiên cưu sư dung kêt hơp nhiêu chung .
32
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng
2.1.1. Chủng giông
- Các chung VSV dùng trong nghiên cưu đươc tuyển chon từ các chung vi
khuân phân lập từ các mẫu đất, nươc tại địa bàn Hà Nôi.
- Các chung Vi sinh vật kiểm định lấy từ bao tàng giông chuân VSV, Viên
VSV và Công Nghê Sinh hoc- ĐH Quôc gia Hà Nôi, bao gôm các chung E. coli
ATCC 25922; Salmonella typhi ATCC 14028; Proteus mirabilis; Staphylococcus
aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus; Shigella flexneri ATCC 29903D;
Fusarium oxysporum.
2.1.2. Hóa chất – thiêt bi
Hóa chất:
Các hóa chất lam môi trương: peptone, nươc nắm, cao nấm men, cao thịt,
CMC, tinh bôt tan, kitin, cazein, glucoza,… va nhiêu hóa chất thông thương khác.
Dụng cụ:
- Buông cây vô trung (Phap)
- May lắc Inforsagch – 4103 (Phap).
- Tu sấy , tu ấm (Trung Quôc )
- Cân phân tich (Nhât )
- Nôi khư trung Tomy SS 325 (Nhât )
- May đo DO meter Hanna HI 8043 (Han Quôc ).
- May đo pH Hanna 8733 (Han Quôc ).
- Tu cấy (Trung Quôc )
- Tu ôn nhiêt (Nhât )
- Tu lạnh (Nhât )
- Kính hiển vi quang hoc OLYMPUS (Nhật Ban)
- May li tâm
2.1.3. Môi trương
2.1.3.1. Môi trương phân lâp va nuôi cây vi sinh vât
- Môi trương thach thương cai t iên (g/l):
33
Peptone: 10g Thạch : 14 -15 g
Nươc măm : 10ml Nươc cât: 1 lít
- Môi trương MRS (g/l)
Glucose
Peptone
Cao thit
Cao nâm men
Aminoxitrat
Tween 80
Nươc cât
20g
10g
5g
5g
2g
1ml
1 lít
K2HPO4
CH3COONa.2H2O
MgSO4
MnSO4.4H2O
CaCO3
Thạch
2g
5g
0,58g
0,28g
5g
14-15g
- Môi trương ISP 4 (g/l) pH = 7
MgSO4.7H2O
NaCl
KH2PO4
Dịch vi lương
(g/ml)
Nươc
1g
1g
1g
1ml
1 lít
CaCO3
(NH4)SO4
Tinh bôt tan
Thạch
2g
2g
10g
14 - 15 g
Dịch vi lương : 0,1g FeSO4.7H2O + 0,1g MnCl + 0,1g ZnSO4
Môi trương giư giông thêm 5g peptone.
- Môi trương NA (g/l): pH = 6,8-7,0
Cao thit 3g (thay băng 20ml nươc măm )
Peptone 5g
NaCl 50g
Thạch 14-15g
Nươc cât 1 lít
Đun sôi môi trương sau đo đô vao binh tam giac va ông nghiêm đa khư
trùng. Khư trung môi trương ơ 1210C/ 30 phút , lam nghiêng măt thạch . Đê 37
0C
trong 48h trươc khi dung hoăc giư ơ 40C.
- Môi trương nuôi Nitrosomonas:
34
K2HPO4 1g
MgSO4 0,2g
CaCl2.2H2O 20mg
FeSO4.7H2O 50mg
MnCl2.4H2O 2,0mg
Na2MoO4.2H2O 1mg
Nươc cất 1 lít
pH 8,5
- Môi trương nuôi Nitrobacter:
K2HPO4 1g
MgSO4 0,2g
CaCl2. 2H2O 20mg
FeSO4.7H2O 50mg
MnCl2.4H2O 2,0 mg
Na2MoO4.2H2O 1mg
Nươc cât 1 lít
2.1.3.2. Môi trương lên men dich thê (g/l):
- Môi trương 1:
Băp cai 300g
Nươc mắm 15ml
Nươc cât 1 lít
- Môi trương 2:
Ca chua 300g
Nươc măm 15ml
Nươc cât 1 lít
- Môi trương 3:
Gia đỗ 300g
Nươc măm 15ml
Nươc cât 1 lít
- Môi trương 4:
Khoai tây 300g
Nươc măm 15ml
Nươc cât 1 lít
Đun sôi môi trương sau đo đô 40ml vao binh tam giac 100ml đa đươc khư
trùng, đem khư trung ơ 121oC trong 30 phút , để nguôi môi trương trong 24h giư ơ
4oC.
35
2.2. Phƣơng phap nghiên cƣu
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩ n
- Lấy 1ml mẫu đưa vao ông nghiêm chưa 9ml nươc cất đa đươc khư trùng để
đươc đô pha loãng 10-1
. Vontex đêu sau đó lấy 1ml dung dịch ơ đô pha loãng 10-1
cho vào ông nghiêm chưa 9ml nươc cất vô trùng ta đươc đô pha loãng 10-2
. Tiếp tuc
như vậy đến nông đô 10-6
.
- Lấy 50µl dung dịch pha loãng mẫu ơ các nông đô thích hơp trai đêu lên đĩa
peptri chưa môi trương nuôi cấy.
- Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chung để thu nhận chung thuần khiết, sau đó
giữ giông trong ông nghiêm môi trương thạch nghiêng.
2.2.2. Phân loại vi sinh vật
Phân loại theo phương pháp truyền thống
Phương phap phân loại cô điển la phương phap phân loại cac chung vi khuân
dựa vao cac đăc điểm vê hinh thai, đăc điểm sinh lí, sinh hóa. Dựa vao đó, ngươi ta
phân loại chúng vao cac chi.
Phân lọai theo phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp tách ADN vi khuẩn
- Lấy 2 vòng que cấy vi khuân hoà vào 200 l TE trong ông Eppendoff.
- Thêm lyzozym vào, trôn đêu, sau đó u ơ 37oC trong 30 phút.
- Thêm 100 l SDS 10%, u ơ 37oC trong 30 phút.
- Thêm 300 l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trôn đêu
trong đa lạnh, sau đó ly tâm vơi vận tôc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên.
- (Bươc nay đươc lăp lại 2 lần)
- Dùng etanol lạnh vơi thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tua ADN.
- Rưa tua bằng etanol 70%.
- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không.
- Thêm 30-50 l nươc, bao quan để dùng dần.
Điện di trên gel agaroza
36
- Đây la kỹ thuật quan trong vi đó la cach chu yếu lam cho cac đoạn axit
nucleic hiển thị trực tiếp. Phương phap nay dựa trên môt đăc tính cua axit nucleic là
ơ pH trung tính mang điên tích âm nhơ các nhóm photphat nằm trên khung
photphodieste cua các sơi axit nucleic. Điêu đó có nghĩa la cac phân tư sẽ chạy vê
cực dương khi đăt trong điên trương. Kỹ thuật nay đươc tiến hành trên môt đêm gel
có tác dung phân tach cac axit nucleic theo kích thươc.
- Tiến hanh: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đêm TAE 1x đô vào
khuôn, đơi cho nguôi va đăt tấm gel vao trong may điên di, ngập trong 300ml dung
dịch 1X TAE. Trôn đêu 2l dung dịch loading buffer 6x vơi 5l mẫu, nhỏ vào
giếng. Chạy điên di bằng dong điên môt chiêu vơi điên thế 100V, cương đô dòng
điên 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nông đô 0,5 l/ml) 20
phút vơt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel.
Thanh phần Thê tích (%)
10 X buffer 10
dNTP 1,25 mM 16
Môi xuôi 1 (10 pmol/l)
Môi ngươc 1 (10 pmol/l)
Taq polymeraza 1,2
Mẫu 2
Nươc đu 100
Môi cho phan ưng PCR
Môi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ưng vơi vị trí
nucleotit 27 đến 47
Môi ngươc: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ưng vơi vị trí
nucleotit 1525 đến 1507
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣơc tiên hanh Nhiêt đô (0C) Thơi gian
1 94 1 phút
37
2 lăp lại 30 lần chu ky sau
94 30 giây
55 45 giây
72 2 phút 30 giây
3 72 7 phút
4 4 -
Kiểm tra cac san phâm cua PCR bằng điên di: Tiến hanh tương tự như đôi
vơi điên di genome.
Phan ưng khuếch đại ADN cho giai trình tự
Terminator Ready Reaction Mix 8 l Môi 1 l
Mẫu 1l Nươc cất đu đến 20l
Sư dung bô kít Cycle sequencing vơi hỗn hơp phan ưng như sau :
- Chu trinh nhiêt
Bươc tiến hanh Nhiêt đô (oC) Thơi gian
1 96 1 phút
2 lăp lại 25 lần chu ky sau
96 10 giây
50 5 giây
60 4 phút
3 4 -
Xác định ham lượng axit nucleic
Do trong thực tế thương phai sư dung những lương axit nucleic rất nhỏ (thương
là micro-, nano- hoăc picogram) khi tiến hanh cac thí nghiêm tach dong. Không thể xac
định sô lương nay môt cach trực tiếp ma nông đô cua dung dịch axit nucleic đươc xac
định bằng cach đo đô hấp thu tại bươc sóng 260 nm (A260) trong may đo quang phô kế.
Môt đơn vị (1,0) gia trị hấp thu bươc sóng 260 nm tương đương vơi nông đô 50g/ml
cua ADN sơi kep, hoăc tương đương vơi nông đô 40g/ml cua ADN hoăc ARN mạch
38
đơn. Ti sô A260/A280 la chi sô cho thấy đô nhiễm cac chất như phenol hoăc protein. Tỷ sô
A260/A280 la 1,8 đôi vơi mẫu ADN sạch.
Đọc trình tự ADN
Trinh tự cua rADN 16S cua cac chung vi khuân đươc đoc trực tiếp trên
may đoc trinh tự tự đông ABI 3100 Avant. Sau đó kết qua trinh tự đươc so sanh vơi
cac trật tự cua cac loai đa có trong ngân hang gen quôc tế để xac định đến tên loài.
2.2.3. Phương pháp bảo quản giông
Vi khuân đươc nuôi trong ông thạch nghiêng thạch thương, nuôi ơ nhiêt đô
phòng. Sau khoang 10 - 14 ngày khi vi khuân đa moc tôt cất vào tu mát ơ nhiêt đô
4-6oC. Sau 1 - 2 tháng cấy truyên lại môt lần.
Nhằm bao quan đươc giông lâu hơn, để giông trong ông cát, trong paraffin
lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoăc đông khô, bao quan đươc từ 6 tháng
đến 2 năm.
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym va hoạt tính kháng khuẩn
Xác định hoạt tính enzym
Xác định kha năng sinh enzyme ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza,
amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương phap khuyếch tán trên thạch chưa 1% cơ
chất tương ưng (cazein, kitin, CMC, tinh bôt tan).
Môi trương gôm cơ chất và thạch đươc khư trùng ơ 1atm trong 30 phút, sau
đó đươc đô vao cac đĩa peptri đa đươc vô trùng, vơi đô dày thạch khoang 3mm, đơi
nguôi, dùng khoan nút chai để đuc các lỗ thạch trên môi trương. Nhỏ 200µl dịch
nuôi cấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rôi để vào tu lạnh 4 - 5 giơ cho enzym
khuyếch tán vào thạch, sau đó chuyển vào tu ấm 30 - 32oC. Sau 24 giơ đem ra hiên
vòng phân giai bằng cách nhuôm mau cac đĩa bằng dung dịch Lugol (vơi cơ chất là
CMC, kitin, tinh bôt) và bằng axit triclo axetic vơi cơ chất là cazein.
Hoạt tính enzym đươc xác định qua kích thươc vòng phân giai theo công
thưc: Hoạt tính enzym = D - d (mm).
Trong đó: D la đương kính vòng phân giai, d la đương kính lỗ khoan
Xác định hoạt tính kháng khuẩn
* Phương phap đuc lỗ thạch
39
Dùng khoan nút chai đuc các lỗ trên môi trương thạch đa cấy VSV kiểm định
trong đĩa peptri. Dịch nuôi vi khuân 2 ngày ơ nhiêt đô thích hơp đươc ly tâm vơi tôc
đô 6000 vòng/phút, ơ 4oC trong 15 phút sau đó đươc nhỏ vơi lương 0,1 ml vào mỗi
lỗ thạch. Đoc kết qua sau 3 ngày hoạt tính khang sinh xac định dựa vao kích thươc
vòng vô khuân (D - d, mm). Trong đó, D la kích thươc vòng vô khuân, d là kích
thươc thỏi thạch.
* Phương phap đăt thỏi thạch
Vi sinh vật đươc nuôi trong môi trương ơ nhiêt đô thích hơp trong cac đĩa
petri. Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đăt vao môi trương đa cấy VSV
kiểm định. Để trong tu lạnh từ 4 - 8 giơ cho chât khang sinh khuếch tan vao môi
trương, rôi đăt vao tu ấm (30oC). Đoc kết qua sau môt ngay đôi vơi vi sinh vật kiểm
định la vi khuân.
Hoạt tính enzym/hoạt tính khang sinh (HTE/HTKS) xac định theo công thưc:
HTE/HTKS = D – d (mm).
D: Đương kính vong phân giai/vong vô khuân + đương kính thỏi thạch.
2.2.5. Xác định sinh khôi bằng phương pháp đo mật đô quang học
Sô lương tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xac định gián tiếp bằng cach đo
mật đô quang hoc OD. Dịch nuôi đươc pha loãng 5 lần, đo OD ơ bươc sóng 660nm.
2.2.6. Phương pháp định lượng axit lactic
Nuôi vi khuân trong môi trương lỏng. Lấy 10ml dịch mẫu vào ông nghiêm
chưa 20ml nươc cất, thêm 3 giot chi thị phenolphtalein 1%. Chuân đô bằng dung
dịch NaOH 0,1% cho đến khi xuất hiên màu hông không đôi trong 1 phút.
Lấy sô ml NaOH tiêu tôn khi chuân đô nhân vơi 10 ta đươc sô đô Therner
(oT). 10
o tương đương vơi 9mg axit lactic.
2.2.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ
của tế bao
Định lượng NO2- theo phương pháp Griss [49]
Ham lương NO2- đươc xac định dựa trên phan ưng tạo màu hông cua NO2
-
vơi thuôc thư Griss.
Thuôc thư:
+ Griss 1: Hòa tan 0,5g axit sunfaninic vào 150ml axit acetic 5N.
40
+ Griss 2: Hòa tan 0,5g α- Naphtylamin vao 50ml nươc cất, bô xung 150 axit
acetic 5N. Bao quan trong tu lạnh.
Tiến hành: Thêm 0,05ml Griss 1 và 0,05ml Griss 2 vào 5ml dung dịch mẫu
nghiên cưu, sau 10 phút phan ưng kết thúc đo đô hấp thu ơ bươc sóng A520 mm.
Cương đô mầu tỷ lê thuận vơi nông đô nitrit. Lương nitrit có trong mẫu nghiên cưu
đươc dựa vao đô thị chuân sư dung dung dịch N-NO2- 5mg/l.
Lập đương chuân: Lấy 6 ông nghiêm cho lần lươt dung dịch nitrit chuân
nông đô từ 0,1 đến 5 mg/l và môt mẫu trắng. Làm tuần tự cac thao tac đa trinh bay ơ
trên. Sau đó mang đi đo mật đô quang hoc, vẽ đương chuân va xac định phương
trình hôi quy cua đương chuân trên. Kết qua thu đươc trình bày ơ bang và biểu diễn
trên đô thị.
Nông đô NO2- (mg/l) 0 0,1 0,5 1 2 3 5
Đô hấp thụ mau 0 0,0058 0,346 0,395 0,098 0,171 0,247
Đường chuẩn
y = 0.0506x + 0.0013
R2 = 0.9882
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 1 2 3 4 5 6
Hàm lượng NO2- (mg/l)
Độ hấp thụ màu
Linear (Độ hấp thụ màu)
Định lượng NO3- theo phương pháp Brucine [49]
Phương phap dựa trên nguyên tắc giữa phan ưng cua nitrat và hơp chất
brucine tạo thành phưc hơp màu nâu vàng có kha năng hấp thu ánh sáng ơ bươc
sóng 410 mm.
Hóa chất: Dung dịch nitrat chưa 100mg N/l; Natri asenit: Hòa tan 0,5g
NaAsO2 trong 100 ml nươc cất; thuôc thư brucine: hòa tan 1g brucine-sulfate và
0,1g axit sulfanilic trong 70ml nươc cất nóng, thêm 3ml axit HCl , làm lạnh và bô
sung nươc cất đến thể tích cuôi cùng là 100ml; dung dịch axit sunfuric: bô sung cân
41
thận 500ml axit H2SO4 trong 125ml nươc cất, làm lạnh ơ nhiêt đô phòng; dung dịch
NaCl: hoa tan 300g NaCl trong 1000ml nươc cất
Tiến hành: Thêm lần lươt 2ml dung dịch NaCl, 10ml dung dịch H2SO4 vào
côc chịu nhiêt chưa 10 ml mẫu nghiên cưu, côc đươc đăt trong giá ngâm trong bể
nươc lạnh, bô sung 0,5 ml thuôc thư brucine, chuyển gia đựng côc thí nghiêm lên bể
nươc nóng ơ 95oC trong 20 phút, để nguôi va đo đô hấp thu màu ơ A410. Lương
nitrat trong mẫu nghiên cưu tính đươc khi đôi chiếu vơi đô thị chuân sư dung dung
dịch N-NO3- 1 mg/l.
Lập đương chuân: Cách lập đương chuân dung dịch NO3- cũng tương tự như
phương phap định lương NO2-
Nông đô NO3- (mg/l) 0 0.1 0.5 1 2 3 5
Đô hấp thụ mau 0 0.054 0.262 0.316 0.786 0.91 1.648
Đường chuẩn
y = 0.3197x + 0.0382
R2 = 0.987
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0 1 2 3 4 5 6
Hàm lượng NO3- (mg/l)
Độ hấp thụ màu
Linear (Độ hấp thụ màu)
2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của môt sô điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
trưởng của vi sinh vật.
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Chung nghiên đươc nuôi cấy lắc 220 vong / phút trên cac môi trương khác
nhau ơ nhiêt đô và pH thích hơp. Sau 2 ngay xac định pH sau nuôi cấy, mật đô tế
bào và hoạt tính enzym.
Ảnh hưởng của pH
Nuôi lắc vi khuân 220 vòng/phút ơ nhiêt đô thích hơp sau khi đa điêu chinh
pH ban đầu cua môi trương ơ các giá trị pH khác nhau vơi bươc nhay bằng 1. Xác
định OD, pH và hoạt tính enzym, hoạt tính kháng khuân sau nuôi cấy.
42
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Bô sung vao môi trương nuôi cấy thích hơp 1% các nguôn cacbon khác nhau
là: kitin, tinh bôt tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bôt ngô. Tiến hành nuôi cấy
lắc vi khuân vơi vận tôc 220 vòng/phút. Sau 24 giơ xac định OD, pH sau khi nuôi
cấy, hoạt tính enzym
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Bô sung nguôn nitơ khac nhau vao môi trương thích hơp vơi cac ham lương
1%: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, bôt đậu tương, cao nấm men, peptone. Cac bươc
tiếp theo tiến hanh tương tự như trên.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Vi khuân đươc nuôi cấy lắc trên môi trương vơi nguôn cacbon, nitơ, pH
thích hơp, cư sau 24h lại lấy mẫu để xac định OD, pH, hoạt tính enzym, hoạt tính
kháng khuân.
2.2.9. Phương pháp xác định môt sô đăc điểm sinh học của chủng lựa chọn
Xác định khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn
Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy vào các ông nghiêm. Đem cac ông này
đun cach thuy ơ 80oC trong 10 phút. Sau đó, dùng Pipetman hút 50µl dịch cấy trai
trên môi trương thạch thương, đăt vào tu ấm 30oC. Sau môt thơi gian, nếu trên đĩa
thạch xuất hiên khuân lạc thì chung vi khuân có kha năng hinh thanh bao tư và
ngươc lại.
Xác định khả năng hóa lỏng gelatin
Cấy vi khuân theo phương phap thẳng đưng, sâu vào ông nghiêm gelatin
đưng. Sau môt ngay đăt ơ 30oC, lấy ông nghiêm ra giữ ơ 4
oC trong 1 giơ. Kiểm tra
kết qua nếu thấy môi trương hóa lỏng thì kết luận chung vi khuân có kha năng hóa
lỏng gelatin va ngươc lại.
Xác định khả năng chịu muối
Cấy vi khuân lên đĩa peptri chưa môi trương thạch thương vơi các nông đô
muôi khác nhau từ 1-13% giữ trong tu ấm. Vi khuân moc đươc ơ nông đô muôi nào
thì ta kết luận chúng có kha năng chịu muôi ơ nông đô đó.
Xác định hoạt tính catalaza
43
Nuôi vi khuân trên hôp petri, khi chúng tạo thành các khuân lạc ta nhỏ môt
giot dung dịch H2O2 3% lên khuân lạc. Nếu thấy các bot khí xuất hiên chưng tỏ có
enzym catalaza.
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon: vi khuân đươc nuôi cấy trên môi
trương thạch thương có bô sung 1% các nguôn đương: Glucozơ, Dextrin, lactozơ,
sacarozơ, tinh bôt… Sau 2 ngay lấy ra quan sát sự sinh trương. Đôi chưng dương la
môi trương có glucoza, đôi chưng âm la môi trương không có đương.
+ Nếu vi khuân sinh trương mạnh hoăc kem hơn đôi chưng dương môt ít
nghĩa la có kha năng sư dung loại đương đó, ky hiêu la (+).
+ Nếu vi khuân sinh trương mạnh hơn đôi chưng dương, ky hiêu la (++).
+ Nếu vi khuân sinh trương bằng đôi chưng âm hay không moc nghĩa la
không có kha năng sư dung loại đương đó, ky hiêu la (-).
+ Nếu vi khuân sinh trương tôt hơn đôi chưng âm nhưng kem hơn đôi chưng
dương nhiêu, ky hiêu la (±).
2.3. Phƣơng phap tao chê phâm
2.3.1. Nghiên cưu cac điêu kiên thich hơp cho lên men xôp
Cấy giông cấp hai vao cac môi trương có chưa các loại chất mang khác nhau
như: cam gạo, bôt đậu tương , cám ngô , cam gạo , mùn cưa va hỗn hơp cua hai hoăc vài chất trên theo các ti lê khác nhau. Bô sung nươc đến đô âm 50%. Ủ trong 4-5
ngày ơ 30oC, sau đó xac định sô lương tế bào cua từng loại vi sinh vật.
Ảnh hưởng của ty lệ cám: trâu:
Tiên hanh lên men xôp cac vi sinh vât trên cac môi trương co ti lê cam : trâu
khac nhau (trong đo ty lê cam + trâu/ nươc = 1/1). Xac định hoạt tính enzyme bằng
phương phap nho dich , xac định hoạt tính k hang khuân bằng phương phap đuc lỗ
thạch
Ảnh hưởng của thời gian lên men
Chất mang sau khi bô sung giông va lam âm đươc nuôi ơ nhiêt đô 30oC. Sau
các khoang thơi gian 1, 2, 4, 5, 7, 9 ngày tiến hành lấy mẫu xac định hoạt
tính enzyme bằng phươn g phap nho dich , xac định hoạt tính khang khuân bằng
phương phap đuc lô thach
Ảnh hưởng của độ ẩm
44
Các chung đươc lên men riêng rẽ trên cac môi trương xôp thích hơp có đô
âm ban đầu khác nhau nuôi ơ điêu kiên 300C – 34
0C trong 4-5 ngày. Xac định hoạt
tính enzyme bằng phương phap nhỏ dịch , xac định hoạt tính khang khuân bằng
phương phap đuc lô thach
Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ
Cấy cac chung vao môi trư ơng xôp thích hơp, theo dõi trong 4, 5 ngày ơ các
nhiêt đô 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 (oC). Xac định hoạt tính enzyme bằng phương
phap nhỏ dịch , xac định hoạt tính khang khuân bằng phương phap đuc lỗ thạch
2.3.2. Trôn hôn hơp giông
Hôn hơp giông đươc trôn theo ti lê phôi trôn : vi khuân Bacillu s : vi khuân
lactic: vi khuân nitrat = 1: 1: 1. Sau đô đêm sô lương khuân lac trên đia thach , tùy
tưng loai ma phân lâp trên môi trương khac nhau đê kiêm tra sô lương bao tư co
trong chê phâm hôn hơp .
Sô lương bao tư vi sinh vât co trong 1 g chê phâm đươc xac đinh băng công
thưc :
X = a. b. 10n
A: sô khuân lac trng binh trong cac đia thach .
B: sô giot trong 1 ml
10n: đô pha loang mâu
X: sô lương vi sinh vât trong 1 g chê phâm .
2.3.3. Bảo quản chế p hâm:
Chê phâm đưng trong tui nilon kin , đươc bao quan ơ nhiêt đô phong . Sau 3
tuân kiêm tra sô lương vi sinh vât .
2.3.4. Thư nghiêm chê phâm trong xư ly nươc nuôi trông thuy san
Thí nghiêm sư dung chế phâm để lam sạch n ươc nuôi trông thuy san bị ô
nhiêm đươc tiên hanh trong 4 binh dung tích 1000ml. Cho vao môi binh 500ml
nươc lây tư đâm nuôi thang thư 3.
Binh 1 – đôi chưng; binh 2, 3, 4 – môi binh bô sung 0,5 g chê phâm/ lít (0,5 ‰)
Binh đô i chưng không co chê phâm . Tiên hanh thi nghiêm trong 10 ngay .
Lây mâu nươc ơ cac khoang thơi gian 1 ngay , sau 3 ngay , sau 7 ngay va sau 10
ngay để phân tích cac chi tiêu thuy lí , thuy hóa .
45
Chƣơng 3: KÊT QUA VA THAO LUÂN
3.1. Tuyên chon cac chung vi sinh vât
3.1.1. Bacillus
3.1.1.1. Phân lâp va tuyên chon
Môt trong những nguyên nhân chính làm ô nhiễm môi trương đâm nuôi đó
chính là thành phần các chất hữu cơ dư thừa trong đâm. Thành phần các chất hữu cơ
này rất đa dạng chưa ham lương protein, tinh bôt, kitin, xenlulozơ kha cao. Ngoai
ra, trong đâm nuôi cũng tôn tại nhiêu loài VSV gây bênh cho tôm ca. Cho nên, bươc
đầu chúng tôi tuyển chon vi khuân dựa trên 2 tiêu chí là chon ra chung có hoạt tính
enzym phân giai cơ chất cao va khang đươc vơi nhiêu vi sinh vật kiểm định.
Từ các mẫu đất va nươc thu thập tại địa bàn Hà Nôi, chúng tôi đa tiến hành
phân lập đươc 31 chung vi khuân Bacillus trên môi trương thạch thương theo
phương phap 2.2.1. Qua sơ tuyển bằng phương pháp khuyếch tan trên đĩa thạch
chúng tôi đa chon ra đươc 5 chung có kha năng sinh enzym ngoại bào cao phân giai
đươc ca 4 loại cơ chất là kitin, cazein, CMC, tinh bôt. Kết qua đươc trình bày ơ
bang 3.1.
Bang 3.1: Hoạt tính enzym cua 5 chung lựa chon
Kí hiêu chung Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
TL1 35 26 32 30
BD2 23 19 23 21
A4 25 20 22 24
D3 20 22 21 20
A2 26 20 23 23
Từ kết qua bang 3.1 ta thấy chung TL1 có kha năng sinh enzym phân giai
cac cơ chất mạnh nhất trong các chung phân lập đươc, đăc biêt là có hoạt tính
kitinaza rất mạnh (35 mm). Điêu nay rât cân thiêt cho viêc phân giai cac chât hưu
cơ không mong muôn trong môi trương nuôi trông thuy san . Kitinaza phân huy vo
tôm lôt xac , proteaza phân huy thưc ăn thưa va xac đông vât thuy sinh , xenlulaza
phân huy xac tao . Vì vậy, chúng tôi quyết định chon chung vi khuân TL1 cho các
nghiên cưu tiếp theo.
46
3.1.1.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng và
hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Trong qua trinh lên men khi tim đươc chung có hoạt tính cao, cần thiết phai
lựa chon môi trương lên men thích hơp nhất để phat huy năng suất tông hơp các san
phâm mong muôn. Môi trương đươc coi là thích hơp la môi trương vừa đam bao
chung san xuất có kha năng sinh trương tôt, vừa san xuất san phâm mong muôn vơi
hiêu qua cao nhất.
Tiến hành nuôi cấy lắc chung TL1 trên 5 loại môi trương khác nhau: LB,
ISP-4, NA, Gause I, Gause II ơ 28-30oC, pH trung tính. Hoạt tính enzym, pH sau
nuôi cấy và kha năng sinh trương cua vi khuân đươc xac định sau 48h.
Bang 3.2: Hoạt tính phân giai cơ chất cua chung TL1 trên 5 loại môi trƣơng
Môi
trƣơng pH sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
NA 7,2 0,881 26 23 25 19
LB 8,5 1,667 37 24 33 30
ISP4 7,7 0,671 20 16 21 28
Gause I 7,5 0,276 15 13 18 22
Gause II 8,0 1,202 28 25 30 18
Hình 3.1: Hoạt tính phân giai cơ chất cua chung TL1 trên 5 loại môi trƣơng
47
Các kết qua cho thấy chung TL1 có kha năng sinh trương trên các môi
trương khac nhau, trong đó tôc đô sinh trương và kha năng tông hơp enzym cua
chung nghiên cưu đêu thể hiên mạnh nhất trên môi trương LB. Có thể NaCl trong
môi trương đa tạo ra nông đô muôi phù hơp cho sinh trương cua các chung này. Vì
vậy, chúng tôi chon môi trương LB la môi trương nuôi cấy thích hơp cho chung
TL1 trong các thí nghiêm tiếp theo.
Ảnh hưởng của pH ban đầu
Chung TL 1 đươc nuôi lắc 220 vong/phút trên môi trương LB ơ 28-30oC, pH
ban đầu đươc chinh ơ các giá trị từ 5 đến 9. Sau 2 ngay, xac định hoạt tính enzym,
pH sau nuôi cấy và kha năng sinh trương cua vi khuân. Kết qua đươc trình bày
trong bang 3.3 và bang 3.4.
Qua bang va biêu đô ta thây , pH anh hương đến kha năng sinh trương cũng
như hoạt tính enzym chung nghiên cưu. Nhìn chung, chung TL1 thể hiên hoạt tính
enzym cao ơ pH trung tính hoăc kiêm yếu, còn ơ pH thấp hoăc kiêm cao thì hoạt
tính enzym giam. Chung TL1 ơ pH=7 hoạt tính enzym thể hiên mạnh nhất.
Bang 3.3: Anh hƣơng cua pH lên kha năng sinh trƣơng va sinh tổng hợp
enzym cua chung TL1
pH đầu pH sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
5 6,5 0,823 19 16 15 13
6 7,3 1,029 26 20 30 26
7 8,5 1,431 36 23 31 29
8 8,2 1,233 33 24 27 20
9 8,5 0,994 17 12 17 15
48
Hình 3.2: Anh hƣơng cua pH lên kha năng sinh trƣơng va sinh tổng hợp
enzym cua chung TL 1
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy chung vi khuân TL1 trong dich LB ơ pH =7. Dịch đươc
lăc vơi vân tôc 220 vong/ phút trong nhiêt đô 30oC. Cư sau 24 giơ lại lấy mẫu ra
kiểm tra các thông sô: pH, giá trị đo OD, hoạt tính enzym.
Bang 3.4: Anh hƣơng cua thơi gian đên kha năng sinh trƣơng va sinh tổng hợp
enzym ngoại bao cua chung TL1
Thơi gian
(giơ) pH sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
24 7,0 0,704 19 15 21 17
48 8,1 1,484 32 26 32 35
72 8,4 1,253 25 23 28 26
96 7,8 1,048 20 18 22 21
49
Hình 3.3: Anh hƣơng cua thơi gian đên kha năng sinh trƣơng va sinh tổng hợp
enzym ngoại bao cua chung TL1
Kết qua nghiên cưu cho thấy chung TL1 sinh trương và sinh enzym ngoại
bào mạnh nhất sau 48 giơ nuôi.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chung nghiên cưu đươc nuôi cấy trên môi trương LB vơi các nguôn cacbon
khác nhau là: kitin, tinh bôt tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bôt ngô.
Bang 3.5: Anh hƣơng cua nguôn cacbon lên kha năng sinh trƣơng va sinh tổng
hợp enzym cua chung TL1
Nguôn C
(1%)
pH
sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
Kitin 8,0 1,246 29 20 24 21
Tinh bôt 6,7 0,746 24 17 22 25
CMC 8,2 0,83 30 20 25 21
Glucoza 7,8 1,009 22 15 23 18
Lactoza 7,0 0,519 12 14 18 15
Bôt ngô 8,5 1,561 34 25 26 24
50
Hình 3.4: Anh hƣơng cua nguôn cacbon lên kha năng sinh trƣơng và sinh tổng
hợp enzym cua chung TL1
Kết qua nghiên cưu cho thấy chung TL1 có kha năng sinh trương và sinh
enzym ngoại bào trên 6 nguôn cacbon khác nhau. Chung TL1 sinh trương và sinh
enzym mạnh nhất ơ môi trương có nguôn cacbon là bôt ngô và yếu nhất vơi nguôn
cacbon là lactoza. Kết qua cũng cho thấy rằng nguôn cacbon vừa là nguôn dinh
dương vừa là chất cam ưng sinh tông hơp enzym. Vơi nguôn cacbon là kitin thì kha
năng sinh enzym kitinaza cao, cũng tương tự như vậy, enzym amylaza sinh ra nhiêu
nhất vơi nguôn cacbon là tinh bôt, proteaza là bôt ngô, xenlulaza là CMC.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Tiếp tuc tiến hành khao sát sự sinh trương và hoạt tính enzym cua chung
TL1 trên 6 nguôn nitơ khac nhau. Kêt qua như sau :
Bang 3.6: Anh hƣơng cua nguôn nitơ đên sinh trƣơng va hoạt tính enzym cua chung TL1
Nguôn N (1%) pH
sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
NaNO2 7,2 0,359 19 15 20 16
NaNO3 7,3 0,763 21 18 24 20
(NH4)2SO4 7,0 0,557 24 21 20 23
51
Bôt đậu tƣơng 7,5 1,870 34 27 30 28
Cao nấm men 8,4 1,534 30 24 32 27
Hình 3.5: Anh hƣơng cua nguôn nitơ đên sinh trƣơng và hoạt tính enzym cua
chung TL1
Kết qua cho thấy, chung TL1 sư dung đươc ca nguôn nitơ vô cơ cũng như
nitơ hữu cơ, va sinh trương tôt hơn vơi nguôn nitơ hữu cơ. Đang chú y la vơi nguôn
nitơ bôt đậu tương chung TL1 có kha năng sinh trương và sinh enzym mạnh nhất.
Đây la nguôn nitơ dễ kiếm và rẻ tiên, rất phù hơp để sư dung vơi muc đích san xuất
3.1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu
Chung nghiên cưu đươc tiến hành kiểm tra cac đăc điểm sinh hoc để bươc
đầu phân loại theo phương phap vi sinh thông thương. Kết qua đươc trình bày ơ
bang 3.7.
Bang 3.7: Đăc điêm hinh thai, sinh lí, sinh hoa cua chung nghiên cưu
Đăc điêm Kêt qua
Chung TL1
Hình dạng khuân lạc Trắng, khô, bê măt nhăn
nheo
Giông non hình que +
52
Kích thươc tế bào 0,5 x 2,5 µm
Thuôc Gram (+) +
Kha năng di đông +
Hiếu khí bắt buôc +
Kha năng chịu muôi 10%
Kha năng sinh axit từ
glucoza -
Nôi bào tư +
Hóa lỏng gelatin +
Catalaza +
Kitinaza 35
Amylaza 30
Proteaza 26
Xenlulaza 32
Kêt qua ghi ơ b ang 3.7 ta thây chung TL 1 có dạng hinh que , kích thươc tế
bao 0,5 x 2,5 µm, băt mau Gram +, sinh nô i bao tư , di đông đươc va co kha năng
sinh trương đươc trong môi trương chưa 2 -10% NaCl. Chung TL 1 không co kha
năng khư sunfat va nitrat , không co kha năng sinh axit tư glucoza . Đăc biêt la chung
TL1 có kha năng sinh nhiêu enzym vơi hoạt tính rất mạnh va rất cần thiết co viêc
phân giai cac chât hưu cơ không mong muôn trong môi trương nuôi tôm ca .
Đôi chiếu những đăc điểm cua chung TL1 trình bày ơ bang 3.7 vơi khóa
phân loại Bergey chúng tôi khẳng định rằng chung này thuôc chi Bacillus.
Chung Bacillus TL1 phân lâp đươc la chung co kha năng sinh trương tôt trên
cac nguôn cơ chất đơn gian va có kha năng sinh hang loạt enzym ngoại bao như
proteaza, xenlulaza, kitinaza va amylaza . Vi những ưu điểm trên , chung Bacillus
TL1 rât đang đươc xem xet đê đưa vao san xuât chê phâm probiotic dung trong xư
ly ô nhiễm nươc đầm nuô i trông thuy san .
53
3.1.2. Vi khuân Lactic
3.1.2.1. Phân lập và tuyển chọn
Như đa đê cập ơ phần 1.5.1, nhóm vi khuân lactic là môt trong những nhóm
vi khuân điển hinh có ích đôi vơi môi trương đâm nuôi trông thuy san . Nhiêu loai vi
khuân lactic c ó kha năng tông hơp cac chất khang khuân có kha năng ưc chế sinh
trương cua cac vi khuân gây bênh , trong đo co vi khuân Vibrio. Cac chất khang
khuân đươc xem như la cac chât khang sinh tư nhiên , không dung trong y tê , không
gây đôc hai cho con ngươi va môi trương , dê phân giai sau môt thơi gian sư dung
nên không đê lai dư lương trong san phâm . Vì vậy chúng tôi đa tiếp tuc thực hiên đê
tài vơi đôi tương là vi khuân lactic.
Từ tập hơp các chung vi khuân lactic đươc phân lập từ các mẫu lên men chua
trên môi trương MRS, chúng tôi đa tuyển chon đươc chung L5 có kha năng sinh
bacteriocin kháng mạnh vơi Vibrio parahaemolyticus (25mm).
Bang 3.8: Hoạt tính ưc chê cac vi sinh vật kiêm định cua chung L5
Chung Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)
V. parahaemolyticus E. coli Salmonella typhi
L5 25 20 9
3.1.2.2. Phân loại
Phân loại theo phƣơng phap truyên thống
Cac đăc điểm sinh hoc cua chung L5 đươc trình bày trong bang 15.
Bang 3.9: Đăc điêm hinh thai, sinh ly, sinh hoa cua chung L5
Đăc điêm Kêt qua
Hình dạng khuân lạc Tròn, trắng đuc
Hình dạng tế bào Que ngắn, xếp đơn lẻ hoăc tạo chuỗi ngắn
Kích thươc tế bào 0,5 - 1,5 µm
Kha năng hinh thanh bao tư -
Hiếu khí tùy tiên +
Nhuôm Gram +
54
Catalaza -
Kha năng di đông -
Kha năng sinh axit 24,5 mg/l
Hoạt tính enzym ngoại bào (D-d,mm)
Proteaza 18
Xenlulaza 9
Amylaza 12
Kha năng đông hoa đƣơng
Glucozơ +
Tinh bôt ±
Dextrin +
Lactozơ ±
Sorbitol -
Maltozơ +
Cac kết qua ghi ơ bang 3.10 cho thây , chung vi khuân L 5 có dạng que ngắn ,
kích thươc 0,5 – 1 µm, nhuôm Gram +, không co kha năng di đông va không hinh
thanh bao tư . Đây la vi khuân hiêu khi tuy tiên không co phan ưng catalase . Chung
L5 có kha năng đông hóa nhiêu loại đương . Khi so sanh cac đăc điểm trên vơi khóa
phân loại Bergey cho thấy chung L5 là vi khuân lactic điển hình thuôc chi
Lactobacillus [62].
Phân loại theo phƣơng phap sinh hoc phân tư
Trình tự rARN 16S của chủng L5
TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGCCTAAAGAATCTAATACGACTGTTGAAA TTTC
AGCACCCGCACTTTAGCAGCAATTGAACGGGCATCCCTGTTATCCCACGAAAGTCGCAAT
AATGTGGTTCGCTTCTCCGTTAACCAACGGACAAAACGATTACGATACATTTATCAAACGC
TACAGGCCTTATATCAGCAACAACAAGAACGCTTTCGGTAACTCACCAGATGTCGGGGAA
GTAACGGAACAACTACAGCCCACTGATTTGTCAGGTGACGAACTTGAAATTTCATTTAACC
CAGACTACATGAAAGAAGCGTTACGTTCGTTTGGGCAAGCTATGATCAAAATCTCATTCAC
GATGGCATTGCGCCCATTCACTTTAGTGCCAACTGAAGAAGGCGAAAACTTTATTCAGTTG
ATTACACCAGTTCGAACGTTTTAATTAGCTGAATAAATATACAATTCTAAATAAAAGGCCC
55
GCATTTCACCGTGAAATGCGGGCCTTTTATGACGGCTAAAACTAGCTAAAGATGGGGCAA
TGAATAGGCAATAGCGATGATGTAACTTTTGAAGTTTTAACTTATGCATATTATATTAGCT
GCTGGTGAATTGTCACGCTAACTATCGATGTTGCCCTACTAAAATCCCACCATCTGATGAA
CCCCAGTCCTTGCACTCGTTCGCTACAAACGCTCGCTTTCAGATAATGAATGCTGGCTTTA
GCCAATTTTTATAGGTAAAAAACAAGATATTTTATTAAAATCCGCAAAATTAGGGAATTTC
AGCAAATTTACCCCTAGGCTAGTATCCCGATATTAAAAAGCCCTAAATCGTCTTAAAATGG
CTCTGAGTGCGGTTATAAATTGAATTTTCATCAAAAAACAAGTATAATATAACCTGTTAGG
AGTGTGTGTAGCACGCCAGACAGTCGTTTAATAGCTTGTAATCAGATAGGCAGGTGACAT
TGTGAAACAGCCAATAGATATTAAAACCCCATATATGACGTTGGGGCAACTCTTAAAAGAA
ACGGCCATCATTGGATCGGGTGGTCAGGCGAAGTGGTTCTTAAAAGAA ACAACCGTGTTA
GTTAATGGTGAACCAGATGATCGGCGGGGTCGGAAACTTTATCCAGGCGATACGATTGAA
GTTGAAGACAACGGGTCATTTTTTATTCGCTCAAATCAAGAAACGACTGATTAGATGTACT
TAGAAAACTTAGTCTTGCATGATTTTCGGAACTACGCGGATTTGACCATTAATTTTAGTCA
GGGCGTTAATGTTCTATTAGGTGAAAATGCGCAGGGAAAGACGAACCTGTTGGAAGCCAT
TTATGTGTTGGCGTTAACGCGTAGTCACCGCACCGCTAACGATAAGGAATTAATTCGGTG
GCAAACCACCACGGCAACGTTGCAAGGCCGGTTACATAAAAGTACCGGTGCTGTCCCCTT
GGAACTTGAATTGGGGCGGCGGGGCAAGCGAGCGAAAGTCAATCATCTTGAGCAAGCCA
AATTATCCCAGTACGTCGGAAATTTGAACGTGATCGTGTTTGCACCTGAAGATTTATCCAT
CGTTAAAGGGGCACCCGCGGTTCGCCGTCGGTTTATGGATATGGAATTTGGTCAGATGAG
CCCTAAATACCTCTATAACCTAAGTCAGTATCGCACGATTTTAAAACAACGTAATCAATAC
TTACGGCAATTAAATCGGCAGCAGGCCAAGGATAAGGTTTATTTGGGTGTCTTGTCGGAT
CAATTGGCTGCATTTGGTGCGGAAATCATCCATAAACGACTACAACTGTTGCAGCAACTTG
AGAAATGGGCGCAAGCTGTTCACAGCGAGATTACGCAAGTGGACAGGCTGGATCACCTCC
TTT
Hình 3.6: Trinh tự nucleotit cua rARN 16S cua chung L5
Xây dựng cây phân loại
So sánh trình tự rARN 16S cua chung L5 bằng phần mêm CLUSTAL và
vơi các trình tự đa có sẵn thuôc chi Lactobacillus trong ngân hàng gen (Genbank),
chúng tôi đa xây dựng đươc cây chung loại phát sinh (hình 3.7).
56
Hình 3.7: Vị trí phân loại cua chung L5 va cac loai co quan hê ho hang gần
So sanh vơi dữ liêu trong ngân hang gen Quôc tế xac định đươc trinh tự gen
rARN 16S cua chung L5 tương đông 99,9 % vơi đoạn rARN 16S cua vi khuân
Lactobacillus plantarum.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp
chất kháng khuẩn của L. plantarum L5
Ảnh hưởng của pH ban đầu
L. plantarum L5 đươc nuôi cấy trên dịch MRS có pH thay đôi từ 4 đến 8, ơ
nhiêt đô 320C 2, trong 48h. Sau đo đem dich đo pH va phân tich kha năng sinh
trương, kha năng khang khuân . Đôi vơi cac thí nghiêm xac định kha năng đôi
khang , dịch nuôi cấy đươc trung hoa bằng kiêm NaOH (0,1 N) tơi pH trung tính để
chăc chăn răng vong vô khuân tao ra không phai do axit ma la bacteriocin do vi
khuân tiêt ra . Kết qua đươc biểu diễn ơ bang 3.10.
PHYLIP_1 Streptomyces AB217603
L5 Lactobacillus plantarum GQ289387
100
Lactobacillus paracollinoides
Lactobacillus lacrimicola
Lactobacillus paraplantarum
Lactobacillus durianis
Lactobacillus sp AF51 6
8
6
0
Lactobacillus suebicus AB2
Lactobacillus sp AJ78 1
00
8
0
Lactobacillus uvarum EU3
Lactobacillus pentosus AB36
Lactobacillus vaccinostercus 8
5
6
6
Lactobacillus collinoides
Lactobacillus paralimentarius 9
2
6
2
8
2
8
0
8
0
57
Bang 3.10: Anh hƣơng cua pH đên sự sinh trƣơng va kha năng tổng hợp chất
khang khuẩn cua L. plantarum L5
pH đầu pH sau OD
Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
4 3,8 0,468 11 9 2
5 3,6 0,924 21 18 5
6 4,0 1,207 25 20 10
7 4,5 1,354 24 19 9
8 5,2 1,173 18 15 3
Qua bang ta thây rằng L. plantarum L5 sinh trương đươc trên dai pH rông,
trong đó pH= 6 - 7 là phù hơp nhất cho sự sinh trương và hoạt tính kháng khuân. Ơ
pH hơi kiêm thì các chi sô nay có xu hương giam, còn ơ pH = 4 kha năng sinh
trương cua L. plantarum L5 kém.
Hình 3.8: Anh hƣơng cua pH đên sự sinh trƣơng va kha năng sinh tổng
hợp chất khang khuẩn cua L. plantarum L5
58
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy chung L5 trên môi trương dịch MRS, cư sau 24h xác
định các chi sô pH, OD và hoạt tính kháng khuân. Kết qua cho thấy thơi gian L.
plantarum L5 sinh trương và tông hơp chất kháng khuân mạnh nhất là sau 48 giơ.
Bang 3.11: Anh hƣơng cua thơi gian nuôi cấy đên sự sinh trƣơng va kha năng
tổng hợp chất khang khuẩn cua L. plantarum L5
Thơi gian
(giơ) OD pH
Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
24 0,804 4,8 15 8 0
48 1,085 4,3 25 19 10
72 0,988 4,5 21 14 5
96 0,721 5,0 18 11 3
Hình 3.9: Anh hƣơng cua thơi gian nuôi cấy đên sự sinh trƣơng va sinh chất
khang khuẩn cua L. plantarum L5
Ảnh hưởng của nồng độ muối
59
Tiến hành nuôi cấy L. plantarum L5 trên môi trương dịch MRS có bô sung
các nông đô muôi tư 2 % - 10% . Sau 48 giơ thu dich lam cac thi nghiêm tiêp theo .
Kêt qua thu đươc thê h iên qua bang va hinh bên dươi .
Bang 3.12: Anh hƣơng cua nông đô muối tơi kha năng sinh trƣơng va tổng hợp
chất khang khuẩn cua L. plantarum L5
Nông đô
muối (%) OD pH
Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)
Vibrio
parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi
2 1,197 4,2 23 18 8
4 0,971 4,5 16 11 4
6 0,562 5,0 10 4 0
8 0,129 6,0 0 0 0
10 0,091 6,3 0 0 0
Hình 3.10: Anh hƣơng cua nông đô muối tơi kha năng sinh trƣơng va tổng hợp
chất khang khuẩn cua L. plantarum L5
Kết qua biểu diễn trên đô thị cho thấy chung L5 có thể sinh trương và tông
hơp chất kháng khuân cao ơ nông đô muôi 2 - 4%, đây cũng la nông đô muôi cua
cac đầm nuôi thuy san nươc lơ va nươc biển. Còn từ nông đô muôi 6% trơ đi sự
60
sinh trương, sinh axit cũng như sinh chất kháng khuân cua chung kem đi, va gần
như không con ơ nông đô muôi 10%.
* Vơi cac đăc điêm la vi khuân hiêu khi tuy tiên , chịu đươc môi trương có
nông đô NaCl cao , có kha năng khang cac vi khuân gây bênh cho tôm ca (V.
parahaemolyticus, E.coli va Salmonella typhi ), thuôc nhom vi khuân an toan (vi
khuân lactic đươc FDA xac nhân la nhom vi khuân an toan - GRAS ) như đa xac
đinh đươc ơ trên , chung Lactobacillus plantarum L5 có thể đươc dùng để nghiên
cưu tao chê phâm xư ly nươc nuôi trông thuy san . 3.1.3. Vi khuân nitrat hoa
Trong nuôi trông thuy san , tiêu chuân ngang (28TCN – 171-2001) đôi vơi
lương amôni (NH3-N) la < 0,4 mg/l, vơi nitrat (NO3-) la <1 mg/l va vơi nitrit (NO2)
la 0,1 mg/l. Nếu vươt qua ngương nay , tôm ca co thê bi bênh . Muôn đat đươc cac
chi tiêu trên cần phai tiến hanh ox y hóa amôni thanh nitrit va nitrit thanh nitrat nhơ
cac vi khuân tự dương . Phan ưng đầu nhơ vi khuân Nitrosomonas, phan ư ng sau
nhơ vi khuân Nitrosobacter. Do đó, nhóm vi khuân oxy hóa amôni và nhóm vi
khuân oxy hóa nitrit tham gia vào quá trình nitrat thực hiên oxy hóa amôni thành
nitrat đóng vai tro rất quan trong trong viêc làm giam hơp chất nitơ gây đôc cho tôm ca.
3.1.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa
Chúng tôi tiến hành phân lập vi khuân oxy hóa amôni trên môi trương thạch
Winogradsky I từ môt sô mẫu nươc khac nhau, sau 6 ngay nuôi trong điêu kiên hiếu
khí ơ 28oC đa thu đươc 13 chung (bang 3.13).
Cũng tương tự, vi khuân oxy hóa nitrit hóa đươc phân lập trên môi trương
Winogradsky II, kết qua thu đươc 10 chung (bang 3.14).
Bang 3.13: Đăc điêm hinh thai cua cac chung oxy hoa amôni phân lập đƣợc
Ký hiêu
chung Đăc điêm khuẩn lạc
Ký hiêu
chung Đăc điêm khuẩn lạc
NA1 - be, đỏ nhạt, lôi, bóng,
d=0,5-1mm NA8
- vang đậm, rất bé, nhẵn
bóng, d < 0,5mm
NA2 - vàng nhạt,bóng,
d=1-1,3mm NA9
- trong, có nhân mau đỏ,
bóng, d= 0,8-1mm
NA3 - trong, bóng, d=1mm NA10 - màu nâu trong, to, d=1,2-
61
1,5mm
NA4 - màu cam, lôi, bé,
d=0,7mm NA11
- vàng chanh, to, dẹt,
d=1,5-2mm
NA5 - bé, trắng, lôi, d=0,5mm NA12 - nâu ria răng cưa, d= 1-
1,2mm
NA6 - trắng đuc, dẹt, d=1-1,2mm NA13 - cam nhạt, dẹt, bóng, to,
d=1,5-1,8mm
NA7 - nâu đỏ, bóng, d=1mm
Bang 3.14: Đăc điêm hinh thai cua 10 chung oxy hoa nitrit phân lập đƣợc
Ký hiêu
chung Đăc điêm khuẩn lạc
Ký hiêu
chung Đăc điêm khuẩn lạc
NT1 - nâu, bóng, d = 0,5-1mm NT6 - nâu nhạt, dẹt, d= 1,5mm
NT2 - vàng chanh, lôi,
d = 0,5-0,8mm NT7
- trắng đuc, bê măt khô, d
= 0,3 - 0,5mm
NT3 - hông, nhẵn bóng, d = 0,5 -
1mm NT8
- trắng đuc, dẹt, bóng, d =
0.5mm
NT4 - trắng trong, bé NT9 - mau đỏ, rìa trong, d =
1,5-1,7mm
NT5 - da cam, lôi, d= 0,8 - 1mm NT10 - nâu trong, bé, bóng,
d=0,3 – 0,5 mm
Để xac định kha năng chuyển hóa cua các vi khuân nitrat hóa phân lập đươc,
chúng tôi tiến hanh định lương nitrit tạo thành dựa trên phương phap Griss trên môi
trương Winogradsky I va ham lương nitrat tạo thanh theo phương phap Brucine trên
môi trương Winogradsky II sau 7 ngày nuôi lắc. Sinh trương cua vi khuân đươc
xác định thông qua đo mật đô quang hoc OD. Kết qua đươc trình bày ơ bang 3.15 và
3.16.
Bang 3.15: Ham lƣợng nitrit tạo thanh va sự sinh trƣơng cua 13 chung oxy hoa
amôni phân lập đƣợc
Chung OD NO2- tạo thành Chung OD NO2
- tạo thành
62
(mg/l) (mg/l)
NA1 0,413 1,71 NA8 0,539 2,88
NA2 0,735 3,26 NA9 0,980 4,21
NA3 1,316 5,23 NA10 1,728 6.86
NA4 0,909 4,13 NA11 0,511 2,56
NA5 0,492 1,55 NA12 1,674 6,12
NA6 0,689 2,14 NA13 0,755 3,70
NA7 1,869 7,06
Bang 3.16: Ham lƣợng nitrat tạo thanh va sự sinh trƣơng cua 10 chung oxy
hóa nitrit
Chung OD Ham lƣợng NO3
-
(mg/l) Chung OD
Ham lƣợng NO3-
(mg/l)
NT1 1,597 6,05 NT6 1,407 4,16
NT2 1,658 6,88 NT7 1,612 6,57
NT3 0,554 2,97 NT8 1,145 4,07
NT4 1,545 5,12 NT9 0,666 3,56
NT5 1,636 5,75 NT10 0,856 4,32
Trong cùng môt điêu kiên nuôi cấy như nhau, từ 13 chung oxy hóa amôni
phân lập đươc chúng tôi đa chon đươc chung NA7 và từ 10 chung oxy hóa nitrit
phân lập đươc đa chon đươc chung NT2 có kha năng chuyển hóa các hơp chất chưa
nitơ cao hơn cũng như sinh trương trôi hơn cac chung còn lại.
3.1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn
Bang 3.17: Môt số đăc điêm hinh thai, sinh hoa cua chung NA7 va NT2
Đăc điêm Chung NA7 Chung NT2
Hình dạng khuân lạc nâu đỏ, bóng, d=1mm vàng chanh, lôi,
d=0,5-0,8mm
63
Hình dạng tế bào Que ngắn Que thẳng
Kích thươc tế bào 1,0 x 1,5 µm 0,7 x 2,0 µm
Nhuôm Gram Gram (-) Gram (-)
Kha năng chuyển hóa nitơ Oxy hóa amôni Oxy hóa nitrit
Kha năng chịu muôi 4% 4%
Theo khóa phân loại Bergey, chung vi khuân oxy hóa amôni NA7 có đăc
điểm đăc trưng cua vi khuân thuôc chi Nitrosomonas. Còn chung vi khuân oxy hóa
nitrit NT2 có đăc điểm đăc trưng cua vi khuân thuôc chi Nitrobacter.
3.2. Tạo chê phẩm
Sư chuyên hoa vâ t chât trong tư nhiên la hêt sưc phưc tap . Viêc xư ly nươc
thai nuôi trông thuy san không phai la sư dung môt loai vi sinh vật thuần khiết nao
đo ma la ca môt hôn hơp nhiêu loai , tạo ra sự chuyển hóa hai hoa trong to an bô
chuôi vân chuyên . Môi loai sinh vât se thưc hiên môt hoăc vai măc xich trong toan
bô chuôi chuyên hoa .
Cac chung vi sinh vật đươc lựa chon nhằm san xuất chế phâm phai có hoạt
tính sinh hoc cao : kha năng phân gia i manh cac cơ chât , thơi gian moc nhnah , tích
ưng rông ơ ca c pH va nhiêt đô khac nhau , có kha năng khang cac chung gây bênh .
Cac chung vi sinh vật có hoạt tính sinh hoc cao thi khi sư dung sẽ nhân nhanh sinh
khôi trong môt thơi gian ngăn , tiêt ra môt lương lơn enzym phân giai .
Sau khi lam cac thi nghiêm phân lâp va tuyên chon , chúng tôi quyết định sư
dung 4 chung vi khuân Bacillus TL1, L. plantarum L5, Nitrosomonas sp. NA7 va
Nitrobacter sp. NT2 để tạo chê phâm xư ly nươc nuôi trông thuy san bi ô nhiêm .
3.2.1. Thư tinh đôi khang lân nhau cua cac chung vi khuân
Kiêm tra tinh đôi khang giưa cac chung vi sinh vât đa tuyên chon đê xem
trong qua trinh sinh trương va phat triên chung co ưc chê nhau không la viêc lam rât
cân thiêt . Bơi vi nêu cac chung vi sinh vât không ưc chê nhau thi chung ta mơi co
thê phôi trôn chung vao chung môt chê phâm đươc .
Cac chung đươc nuôi lắc trên môi trươn g thich hơp , sau đo thu dich nuôi co
chưa khang sinh . Thư kha năng đôi khang cua cac chung theo phương phap nho
64
dịch. Kêt qua đươc cho thây cac chung nay không co đôi khang nhau . Đây la cơ sơ
để có thể đưa cac chung nay v ao trong cùng môt chế phâm .
Bang 3.18: Thƣ ti nh đôi khang lân nhau cua cac chung vi khuân
Chung Bacillus TL1 L. plantarum L5 Nitrosomonas sp.
NA7
Nitrobacter sp.
NT2
Bacillus TL1
L. plantarum L5
Nitrosomonas sp.
NA7
Nitrobacter sp. NT2
3.2.2. Nghiên cưu cac điêu kiên lên men xôp thich hơp
Khi đa co 4 chung vi khuân : Bacillus TL1, L. plantarum L5, Nitrosomonas
sp. NA 7 va Nitrobacter sp. NT2 chúng tôi tiến hanh san xuất chế phâm dạng rắn .
3.2.2.1. Lưa chon môi trương lên men xôp thich hơp
Có thể nói viêc lựa chon môi trương lên men để san xuất chế phâm nao đó có
vai trò hết sưc quan trong, bơi lẽ thành phần dinh dương trong môi trương lên men
phai phù hơp vơi sự sinh trương, phát triển cua từng chung vi sinh vật, và tạo điêu
kiên kích thích sự hình thành các hoạt tính sinh hoc cua chúng, đông thơi lại phai
đam bao yếu tô nguôn nguyên liêu sẵn có, dễ kiếm và rẻ tiên.
Chúng tôi tiến hanh nuôi cấy c hung vi khuân Bacillus TL 1 va T. plantarum
L5 trên nguôn cơ chât khac nhau như cam ngô , cam gạo , bôt đâu tương , trâu vơi đô
âm thích hơp . Sau 4 ngay xac định cac hoạt tính enzym băng phương phap nho
dịch.
Kêt qua đươc thê hiên trong bang 3.19 va bang 3.20. Ca hai chung vi khuân
Bacillus TL1 va L. plantarum L5 đêu sinh trương va thê hiên hoat tinh enzym manh
khi đươc lên men xôp trên cac môi trương như cam ngô , cam gạo , bôt đâu tương .
Đăc biêt , vi khuân nay cho kêt qua cao nhât khi lên men trên môi trương cam : trâu
(tỷ lê 1: 1).
65
Bang 3.19: Anh hƣơng cua môi trƣơng lên men xôp lên Bacillus
Nguôn cơ chât Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
Cam ngô 24 16 20 21
Cam gạo 26 17 22 20
Cam ngô + bôt
đâu tương 22 15 19 20
Cam gạo + bôt
đâu tương 20 15 20 22
Cam ngô + trâu 24 20 24 22
Cam gạo + trâu 35 30 32 33
Bôt đâu tương +
trâu 25 18 20 19
Bang 3.20: Anh hƣơng cua môi trƣơng lên men xốp lên L. plantarum L5:
Nguôn cơ chât
Hoạt tính khang khuân
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
Cam ngô 12 11 6
Cam gạo 14 9 7
Cam ngô + Bôt
đâu tương 13 10 8
Cam gạo + bôt
đâu tương 15 12 7
Cam ngô + trâu 14 12 8
Cam gạo + trâu 25 22 12
Bôt đâu tương +
trâu 16 13 9
66
Qua hai bang kêt qua ta thây , môi trương thich hơp cho viêc lên men xôp cac
chung vi sinh vật đó la môi trương cam trấu . Điêu nay cung rât phu hơp cho viêc
san xuất chế phâm , vi đây la những nguyên liêu dễ kiế m, rẻ tiên.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám: trâu lên qua trinh lên men xôp
Sau khi đa lưa chon môi trương lên men xôp thich hơp cho cac chung vi sinh
vât , chúng tôi tiến hanh thí nghiêm xem xet anh hương cua ti lê cam : trâu tơi kha
năng sinh trương va tiêt enzym cua cac vi khuân .
Chúng tôi tiến hanh lên men xôp cac vi sinh vật trên cac môi trương có ti lê
cam: trâu khac nhau (trong đo ty lê cam + trâu/ nươc = 1/1). Sau bôn ngay xac định
hoạt tính enzyme bằng phương phap nhỏ dịch , xac định hoạt tính khang khuân bằng
phương phap đuc lô thach . Kêt qua đươc trinh bay như hai bang dươi đây .
Qua hai bang kêt qua ta thây , chung Bacillus TL1 sinh trương va thê hiên
hoạt tính enzym mạnh nhất ơ môi trương có tỷ lê cam : trâu la 1:1. Tương tư , vi
khuân L. plantarum L5 cũng cho kết qua cao nhất khi lên men trên môi trương có
cam: trâu la 1:1.
Bang 3.21: Anh hƣơng cua ti lê cam : trâu lên Bacillus TL1
Ti lê cam:
trâu
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
2: 8 10 9 11 8
3: 7 11 9 12 10
4: 6 15 12 13 11
5: 5 32 30 29 31
6: 4 19 20 17 18
7: 3 15 12 14 13
8: 2 14 13 16 10
67
Bang 3.22: Anh hƣơng cua ti lê cam : trâu lên L. plantarum L5
Ti lê cam: trâu
Hoạt tính khang khuân
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
2: 8 - - -
3: 7 9 8 6
4: 6 14 11 8
5: 5 23 21 10
6: 4 14 13 9
7: 3 12 11 7
8: 2 10 10 7
3.2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên qua trinh lên men xôp
Chúng tôi tiến hanh lên men xôp cac chung vi sinh vật trên môi trương cam :
trâu ti lê 1: 1. Sau 1, 2, 4, 5, 7, 9 ngay lấy thư hoạt tính enzym , khang khuân . Kêt
qua như sau :
Bang 3.23: Anh hƣơng cua thơ i gian lên men xôp lên Bacillus TL1
Thơi gian
(ngay)
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
1 8 9 10 8
2 12 10 11 13
4 29 32 27 32
5 20 23 25 17
7 19 20 17 16
9 13 12 11 12
Bang 3.24: Anh hƣơng cua thơi gian lên men xốp lên L. plantarum L5
Thơi gian (ngay ) Hoạt tính khang khuân
68
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
1 - - -
2 - - -
4 13 11 8
5 24 20 11
7 16 14 9
9 13 11 8
Như vây qua hai bang kêt qua ta thây , chung Bacillus TL1 sinh enzym manh
nhât sau 4 ngay lên men xôp . Con chung L. plantarum L5 thê hiên hoat tinh khang
khuân manh nhât sau 5 ngay lên men .
3.2.2.4. Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau
Nhiêt đô là môt trong những yếu tô môi trương có anh hương lơn tơi sự
sinh trương và phát triển cua chung trong quá trình nuôi cấy cũng như trong
thực tiễn. Ơ điêu kiên nuôi cấy trong phòng thí nghiêm, mỗi chung nuôi cấy
thương có môt giá tr ị nhiêt đô xac định là thích hơp nhất cho quá trình sinh
trương và phát triển.
Tiên hanh lên men xôp cac chung vi sinh vật trong cac điêu kiên thích
hơp ơ cac nhiêt đô khac nhau . Sau 4 ngay (vơi vi khuân Bacillus TL1) va 5
ngay (vơi vi khuân L. plantarum L5) đem thư cac chi sô sinh hoc .
Bang 3.25: Anh hƣơng cua nhiêt đô lên Bacillus TL1
Nhiêt đô
(oC)
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
20 9 8 11 9
25 20 19 18 21
30 31 33 30 31
35 20 22 24 18
40 19 20 18 16
69
45 15 16 13 14
50 13 12 11 12
Bang 3.26: Anh hƣơng cua nhiêt đô l ên L. plantarum L5
Nhiêt đô (oC)
Hoạt tính khang khuân
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
20 10 8 7
25 12 9 10
30 15 13 9
35 25 21 12
40 17 16 9
45 12 10 8
Qua kêt qua ơ bang ta thây chung vi khuân Bacillus TL 1 thích hơ p nhât khi
lên men ơ 30oC, con chung L. plantarum L5 thích hơp nhất khi lên men ơ 35
oC.
3.2.2.5. Ảnh hưởng của độ ẩm
Cac chung vi khuân đươc nuôi cấy trên cơ chất thích hơp có đô âm khac
nhau. Nuôi trong tu âm 4 ngay ơ 300C vơi Bacillus TL1 va 5 ngay ơ 35
oC vơi L.
plantarum L5. Sau đo đem xac đinh cac hoat tinh enzym , khang khuân .
Kêt qua cho thây ca hai chung đêu sinh trương va sinh enzym tôt nhât khi đô
âm môi trương lên men xôp la nươc : cam trấ u băng 1:1. Khi co qua it hoăc qua
nhiêu nươc đêu khiên cho sư sinh trương bi giam sut , đăc biêt vơi chung L.
plantarum L5 khi co qua it nươc thi không thê hiên kha năng khang khuân .
Kêt qua đươc thê hiên chi tiêt hơn tro ng cac bang dươi đây .
Bang 3.27: Anh hƣơng cua đô âm lên Bacillus TL1
Đô âm (tỷ
lê nươc:
cam trấu)
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
2: 8 10 8 11 10
70
3: 7 19 20 19 21
4: 6 21 22 25 20
5: 5 30 31 33 32
6: 4 19 21 22 17
7: 3 15 17 12 15
8: 2 12 12 11 13
Bang 3.28: Anh hƣơng cua đô ẩm lên L. plantarum L5
Đô âm (tỷ lê
nươc: cam trấu )
Hoạt tính khang khuân
Vibrio
parahaemolyticus E.coli
Salmonella
typhi
2: 8 - - -
3: 7 10 - 8
4: 6 12 11 9
5: 5 23 20 11
6: 4 16 17 9
7: 3 12 10 7
8: 2 - 8 -
3.2.3. Sản xuất chế phẩm
Tiên hanh nhân giông câp 1, câp 2 đôi vơi 4 chung vi sinh vật đa đươc tuyển
chon lam giông san xuất chế phâm vi sinh vật như sau :
Vi khuân Bacillus: lưa cho n nhưng ông giông thuân nhât rôi nhân sinh khôi
riêng re trong môi trương gia đô dich thê trên may lăc vơi tôc đô 180 vong/ phút
trong 24 giơ. Tiêp đên đem giông câp 1 nhân tiêp trong môi trương gia đô dich thê
trên may lă c 180 vong/ phút trong 48 giơ. Sau đo cây vao môi trương cam trâu u ơ
nhiêt đô thich hơp . Sau 4 ngay đem sấy khô ơ nhiêt đô 40oC.
71
Vi khuân lactic đươc nuôi cây trên môi trương MRS dang dich trong 2 ngay ,
sau đo đươc cây vao m ôi trương cam trâu ơ nhiêt đô thich hơp . Sau 5 ngay đem sấy
khô ơ 40oC.
Hai chung nitra t cung đươc nuôi cây trên Winogradsky I va wi nogradsky II
va cấy vao môi trương cam trấu như trên .
Bôn chung trên dươc trôn lân vơi nhau the o ty lê 1: 1: 1: 1 tạo thanh môt chế
phâm vi sinh vât .
Thu hôi san phâm sau lên men
San phâm sau lên men đươc đem đi sấy khô ơ nhiêt đô 40oC cho đến khi đô
âm khô đến 10%. Sau đó đươc phôi trôn theo ti lê: 1:1.
San phâm sau khi đươc phôi trôn sẽ đươc nghiên dươi dạng bôt, sau đó đươc
đóng gói trong túi polyme 2 lơp khôi lương 250g va đê ơ nhiêt đô phong . Cư sau 1
thang tiến hanh đếm sô lương cac loại vi sinh vật trong chế phâm .
Quy trinh san xuât chê phâm đươc thê hiên t heo sơ đô:
Ống giống
Nhân giông câp I (môi trƣơng
cai tiên dịch, 300C, pH =7,
nuôi 1 ngay)
(riêng tƣng chung )
Nhân giông câp II (môi trƣơng
cai tiên dịch,) 350C, pH =7,
nuôi 2 ngay)
(riêng tƣng chung )
Lên men xôp
72
(Cam, trâu , 30-35 0C, đô âm
50%, 4 – 5 ngay)
sây 40 0C, đô âm 10%
Nghiên, rây
Đong tui bao quan
Hinh 3.11: Sơ đô quy trinh san xuât chê phâm dang răn
3.2.4. Đanh gia kha năng lam sach nươc đâm nuôi thuy san cua chê phâm vưa
tạo được
Đê thư kha năng lam sach nươc cua chê phâm vưa tao đươc , chúng tôi tiến
hanh thư nghiêm lên đôi tương nghiên cưu la nươc đầm nuôi tôm ca bị ô nhiễm .
Tiên hanh thi nghiêm vơi 4 binh dung tích 500ml: môt binh đôi chưng không
bô sung chê phâm , 3 binh thí nghiêm đươc bô sung 0,5‰ (0,5 g/l) chê phâm . Lây
mâu nươc vao ngay đâu , sau 3 ngay , 7 ngay va 10 ngay để phân tích cac chi tiêu
thuy lí, thuy hóa . Kêt qua đươc thê hiên qua tưng chi sô môi trương .
3.2.4.1. Giá trị pH
Bang 3.29: Kêt qua gia tri pH sau cac ngay thí nghiêm
đơn vi
Binh thí nghiêm Binh đôi chưng
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
pH đv pH 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,2
73
Hinh 3.12: Gia trị pH sau các ngày thí nghiêm
Gia trị pH ơ ơ binh thí nghiêm va binh đôi chưng đêu giam sau 10 ngay thí
nghiêm. Tuy nhiên ơ binh thi nghiêm , pH giam manh hơn , tư pH = 7,4 ơ ngay đầu
đa giam xuông 7,2 sau 3 ngay va sau mươi ngay giam xuông 7,0. Con ơ binh đôi
chưng pH sau 3 ngay vẫn la 7,4 va đến ngay thư 10 giam xuông 7,2.
3.2.4.2. Nitơ tông sô
Bang 3.30 : Kêt qua gia tri nitơ tông sô sau cac ngay thí nghiêm
Cac thông
sô đơn vi
Binh thí nghiêm Binh đôi chưng
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
Nitơ tông sô mg/l
N
7,00±
0,30
5,30±
0,42
5,00±
0,15
4,36±
0,11 7,00 7,01 6,98 6,92
Hinh 3.13: Gia trị nitơ tông sau các ngày thí nghiêm
74
Nitơ tông sô biêu thi cho nguôn thưc ăn hưu cơ giau đam trong môi trương
nươc. Chúng quyết định sưc san xuất cua thuy sinh vật nói chung va tôm ca nói
riêng.
Theo kêt qua ơ bang va đô thi trên ta thây , ơ cac binh thí nghiêm ham lương
ni tơ tông giam ro rêt sau 10 ngay nghiên cưu . Trong khi đo ơ binh đôi chưng chi sô
nay có giam nhưng tôc đô giam chậm va giam ít . Ơ binh thi ngiêm ngay đâu tiên đo
đươc la 7,00 mg/l, sau 3 ngay thí nghiêm giam xuông 5,3 mg/l, sau 7 ngay giam con
5,00 mg/l va sau 10 ngay đa giam xuông con 4,36 mg/l. Con ơ binh đôi chưng ham
lương nitơ tông ngay đâu la 7,00 mg/l đên 3 ngay sau vẫn la 7,01 mg/l, sau 7 ngay
la 6,98 mg/l va sau 10 ngay la 6,92 mg/l; lương nitơ giam xuông rất nhỏ , không
đang kê .
3.2.4.3. Amôni
Amôni la san phâm khoang đầu tiên cua cac chất hữu cơ . Amôni ơ dạng
NH4+ không gây đôc cho thuy sinh vât nhưng NH 3 la chất gây đôc cho cac thuy
sinh vât .
Bang 3.31: Kêt qua gia tri amôni sau cac ngay thí nghiêm
cac
thông
sô
đơn
vị
Binh thí nghiêm Binh đôi chưng
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau
10
ngay
Ngay
đâu
Sau
3
ngay
Sau
7
ngay
Sau
10
ngay
amôni mg/l
NH3-N
1,34±
0,21
0,52±
0,023
0,15±
0,032
0,07±
0,015
1,34 1,33 1,35 1,32
75
Hinh 3.14: Gia trị amôni sau cac ngay thí nghiêm
Qua kêt qua đươc trinh bay ơ bang va đô thi ta thây . Ơ cac binh thí nghiêm ,
sau 10 ngay thí nghiêm ham lương NH 3 đa giam tư 1,34 xuông con 0,07 mg/l. Con
ơ binh đôi chưng thi lương NH 3 hâu như giam không đang kê , tư 1,34 mg/l xuông
1,32 mg/l sau 10 ngay thí nghiêm .
3.2.4.4. Nitrit
Bang 3.32: Kêt qua gia tri nitrit sau cac ngay thí nghiêm
thông
sô đơn vi
Binh thí nghiêm Binh đôi chưng
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
NO2- mg/l 0,23±
0,02
0,17±
0,01
0,13±
0,03
0,12±
0,01
0,23 0,19 0,17 0,18
Hinh 3.15. Gia trị nitrit sau cac ngay thí nghiêm
Nitrit la chi tiêu vê sinh , yêu tô chi thi cua qua trinh tư lam sach nươc trong
tư nhiên . Dạng nitrit thương vô hại nhưng trong môi trương nươ c ma ham lương
chlorinity thâp thi nitrit se gây đôc cho tôm ca .
Qua bang ta thây , ơ binh thí nghiêm ham lương nitrit giam ro rêt sau 10 ngay
thí nghiêm : tư 0,23 mg/l ngay đâu tiên xuôn g con 0,12 mg/l ngay thư 10. Trong khi
đo ơ binh đôi chưng , lương nitrit co giam nhưng giam it , ngay đầu la 0,23 mg/l va
đến ngay thư 10 la 0,18 mg/l.
76
3.2.4.5. COD và BOD
COD la nhu cầu ox y hóa hoc cần thiết cho qua trinh oxy hóa toan bô cac chất
hưu cơ trong nươ c thanh CO 2 va H 2O. BOD la nhu câu oxy sinh hoc cân thiêt cho vi
sinh vât tiêu thu đê oxy hóa cac chất hữu cơ có trong nươc .
Trong đâm nuôi trông thuy san , hai chi tiêu nghiên cưu chât lương nươc
COD va BOD đươc dung đê đanh g ia mưc đô nhiễm bân , phú dương đông thơi con
cho biêt sư phat triên cua sinh vât trong thuy vưc .
Theo kêt qua thi nghiêm chung tôi co bang sô liêu cung vơi sơ đô như sau :
Bang 3.33: Kêt qua gia tri COD va BOD sau các ngày thí nghiêm
cac
thông
sô
đơn vi
Binh thí nghiêm Binh đôi chưng
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
COD mg/l 15±
0,5
11,02±
0,49
7,08±
0,20
5,10±
0,36 15 14,2 13,9 13,5
BOD mg/l 8,9±
0,17
6,8±
0,16
4,7±
0,20
3,5±
0,10 8,9 8,2 8,0 7,8
Hinh 3.16. Gia trị COD sau các ngày thí nghiêm
77
Hinh 3.17: Gia trị BOD sau cac ngay thí nghiêm
Như vây , có thể nhận thấy rằng , sau 10 ngay thí nghiêm thi chi sô BOD va
COD ơ binh t hí nghiêm đa giam đang kể . Ơ ngay đầu COD la 15 mg/l va BOD la
8,9 mg/l thi đên ngay thư 10 COD chi con 5,10 mg/l va BOD con 3,5 mg/
. Con ơ binh đôi chưng cac chi sô nay tuy có giam nhưng giam chậm va ít ,
ngay đầu COD la 15 mg/l thi đên ngay 10 la 13,5 mg/l con BOD ngay đâu la 8,9
mg/l đên ngay thư 10 la 7,8 mg/l.
Đanh gia chung
Bang 3.34: Kêt qua xƣ ly nƣơc đâm nuôi thuy san cua chê phâm
cac
thông sô đơn vi
Binh thí nghiêm Binh đôi chưng
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
Ngay
đâu
Sau 3
ngay
Sau 7
ngay
Sau 10
ngay
pH đv pH 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,1
Đô muôi ‰ 21 19 19 20 21 20 19 20
Nitơ
tông sô
mg/l
N
7,00±
0,30
5,30±
0,42
5,00±
0,15
4,36±
0,11 7,00 7,01 6,98 6,92
NH3 N 1,34±
0,21
0,52±
0,023
0,15±
0,032
0,07±
0,015
1,34 1,33 1,35 1,32
NO2- mg/l
0,23±
0,02
0,17±
0,01
0,13±
0,03
0,12±
0,01 0,23 0,19 0,17 0,18
COD mg/l 15±
0,5
11,02±
0,49
7,08±
0,20
5,10±
0,36 15 14,2 13,9 13,5
BOD mg/l 8,9±
0,17
6,8±
0,16
4,7±
0,20
3,5±
0,10 8,9 8,2 8,0 7,8
78
Như vây co thê thây răng , kha năng lam sạch nươc đầm nuôi tôm ca cua chế
phâm vi sinh la rât cao va co hiêu qua ro r êt. Ơ 3 binh thí nghiêm có bô sung chế
phâm vi sinh , cac chi sô b ất lơi cua môi trương đa giam dần theo thơi gian , chât
lương nươc đươc cai thiên đang kê sau 3 ngay xư lí , cac chi sô môi trương như
NH3, NO2- giam mạnh nhưng vẫn ơ trạng thai ô nhiễm nhẹ . Sau 7 ngay nươc đa
đươc lam sach va năm trong giơi han chiu đưng cua sinh vât . Sau 10 ngay cac chi sô
ơ bể thí nghiêm giam ro rêt : nitơ tông giam 37,7%, amôni giam 91,8%, NO2- giam
47,8%, COD giam 66,0% va BOD giam 60,6% bê đôi chưng (không dung chê
phâm ) cac chi sô môi trương có giam nhưng không đang kể , sau 10 ngay thí
nghiêm, nươc vân ơ tinh trang ô nhiêm , qua trinh tự lam sạch tự nhiên diễn ra chậm .
Hang ngay , trong cac đâm nuôi trông thuy san nhât la nuôi công nghiê p,
lương chât thai hưu cơ liên tuc gia tăng do thưc ăn thưa , phân sinh vât , tao chết, xac
đông vât… nêu đê qua tinh tư lam sach tư nhiên thi đoi hỏi thơi gian rât dai , như
vây thi chât lương nươc ngay cang suy thoai , anh h ương đến s ự phat triển cua thuy
san nuôi . Khi bô sung chê phâm vi sinh vao nươc , cac vi sinh vật có ích thúc đây
qua trinh phân huy cac hơp chất hữu cơ dư thừa , cai thiên chất lương nươc theo
hương co lơi cho tôm phat tr iên. Kêt qua thu đươc cho thây khi dung chê phâm xư li
nươc nuôi trông thuy san đa bi ô nhiêm đêu co hiêu qua hơn khi nươc tư lam sach tư
nhiên.
79
KẾT LUẬN
Từ những kết qua thu đươc chúng tôi rút ra môt sô kết luận chính sau đây:
1. Đa tuyển chon đươc 4 chung vi sinh vật có kha năng lam sạch nươc
nuôi trông thuy san đó la cac chung: TL1, L5, NA7, NT2
- Chung TL1 đươc xac định thuôc chi Bacillus.
- Chung L5 đươc xac định thuôc vê loài Lactobacillus plantarum có
kha năng sinh bacteriocin, ưc chế mạnh vơi Vibrio parahaemolyticus.
- Chung NA7 có kha năng chuyển hóa amôni thành nitrit cao.
- Chung NT2 có kha năng chuyển hóa nitrit thành nitrat cao.
2. Đa nghiên cưu đăc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa cua 5 chung trên
3. Nghiên cưu môt sô điêu kiên lên men xôp thich hơp cho viêc tao chê
phâm vi sinh vât cua hôn hơp 4 chung Bacillus TL1, L. plantarum L5,
Nitrosomonas sp. NA7 va Nitrobacter sp. NT2.
4. Tạo chế phâm probiotic dạng rắn , thư nghiêm xư ly nươc đâm nuôi
tôm ơ quy mô ph ong thí nghiêm . Chê phâm đa co tac dung lam thay đôi đang kê
theo chiêu hương tich cưc cac chi sô trong nươc ơ đâm nuôi tôm ca , đat cac chi tiêu
cua tiêu chuân nganh nuôi trông thuy san : sau 10 ngày nitơ tông giam 37,7%,
amônia giam 91,8%, NO2- giam 47,8%, COD giam 66,0% va BOD giam 60,6% bê
đôi chưng (không dung chê phâm ) cac chi sô môi trương có giam nhưng không
đang kê , sau 10 ngay thí nghiêm , nươc vân ơ tinh trang ô nhiêm , qua trinh tự la m
sạch tự nhiên diễn ra chậm .
KIÊN NGHI
- Tiêp tuc thư nghiêm tac dung cua chê phâm tai hiên trương vơi cac phương thưc
nuôi khac nhau ơ quy mô lơn .
- Tiêp tuc nghiên cưu quy trinh lên men tao sinh khôi lơn cac chung vi sin h vât đê
phuc vu viêc san xuất chế phâm ơ quy mô lơn .
80
TÀI LIÊU THAM KHAO
Tiêng Viêt:
1. Nguyên Tac An (1996), Phương phap quan ly chât lương nươc phuc vu nuôi
trông thuy hai san, Giao trinh cao hoc , Đai hoc thuy san Nha T rang.
2. Nguyên Tac An (1998), Báo cáo đề tài “Điều tra hiện trạng môi trường ven
biên thanh phô Nha Trang va đê xuât cac giai phap cai thiên va phat triên
môi trương”, Nha Trang.
3. Bô khoa hoc công nghê va môi trương (2000), Tiêu chuẩn nước sinh hoạt
TCVN 6772-2000, tiêu chuẩn nước cho bảo vệ đời sống thủy sinh TCVN
6773-2000, Hà Nôi.
4. Lê Văn Cat (2007), Xử lý nước giàu hợp chất nitơ và photpho, Nhà xuất ban
Khoa hoc tự nhên và Công nghê, Hà Nôi.
5. Lê Văn Cat, Đỗ Thị Hông Nhung, Ngô Ngoc Cát (2006), Nước nuôi thủy sản:
Chất lượng và biện pháp cải thiện chất lượng, Nhà xuất ban Khoa hoc và
Kỹ thuật, Hà Nôi.
6. Công ty cô phân chưng khoan An Binh – Phong phân tích (2010), Báo cáo
Ngành Thủy sản Việt Nam.
7. Cuc Bao vê nguôn lơi thuy san (2000), “Hiên trạng sư dung thuôc kháng sinh,
hóa chất và chế phâm trong môi trương nuôi tôm”, Trích tham luận tại hôi
nghị phát triển nuôi tôm tạo san phâm vê sinh thực phâm khu vực miên
chung và miên nam, Thông tin Khoa học công nghệ, sô 9, tr 11-12.
8. Cuc Khai thac va Bao vê Nguôn lơi thuy san (2003), Chuyên đê: Tình hình nuôi
trông thuy san trên thê giơi va cac vân đê đang quan tâm – sô 4 / 2003.
9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đinh Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học,
Nhà xuất ban Giáo duc, Hà Nôi.
10. Nguyễn Thanh Đạt, Nguyễn Duy Thao (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất ban
Giáo duc, Hà Nôi.
11. Hô Thanh Hai (1999), Tiêm năng vê điêu kiên tư nhiên va nguôn lơi sinh vât
vung triều cửa sông ven biển cho phát triển thủy hải san, Bao cao hôi thao
81
khoa hoc vê quan ly va sư dung bên vưng tai nguyên va môi trương đât
ngâp nươc cưa sông ven biên , Ha Nôi .
12. Nguyễn Văn Hao (2002), Một số vấn đề về kĩ thuật nuôi tôm sú công nghiệp,
Nhà xuất ban Nông nghiêp, thành phô Hô Chí Minh.
13. Lại Thúy Hi ên (1998), “Môt sô đăc điểm sinh lí, sinh hóa cua môt sô chung vi
khuân khư sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hô”, Tạp chí sinh học, 8, tr.
37-38.
14. Nguyên Đưc Hôi (1996), Phương phap thu va phân tich mâu ly – hóa họ c
nươc, Trung tâm thông tin KHKT va kinh tê thuy san , Viên nghiên cưu
thuy san 1, Ha Nôi .
15. Hoang Huê (1996), Xư ly nươc thai, Nha xuất ban Xây dựng , Ha Nôi .
16. Khoa Thuỷ San, trương Đại hoc Cần Thơ (2000), Câm nang ki thuât nuôi thuy
sản nước lợ, Nhà xuất ban Nông nghiêp, Hà Nôi.
17. Lê Văn Khoa (Chu biên ) (2003), Chỉ thị sinh học môi trường , Nha xuất ban
Giao duc .
18. Trần Tương Lưu (1994), “Đanh gia vê môt sô khía cạnh môi trương liên quan
đến bênh tôm ơ khu vực phía Nam”, Báo cáo kết quả nghiên cứu chương
trình khảo sát nguyên nhân gây chết tôm nuôi tại khu vực phía Nam và
biện pháp phòng trừ để phát triển nghề nuôi tôm, Phần I, Viên nghiên cưu
môi trương thuy san II, thành phô Hô Chí Minh.
19. “Môt sô bênh tôm nuôi và biên pháp phòng chông”, Thông tin khoa học công
nghệ thủy sản, sô 9/2002.
20. Nguyễn Văn Nam, Phạm Văn Ty. “Vai tro cua chế phâm sinh hoc trong nuôi
trông thuy san”, Tạp chí Thông tin Khoa h ọc Công nghệ - Kinh tế thủy
sản, sô 3/2007, tr. 27 – 28.
21. Nguyễn Trong Nho (1994), Tình hình nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam, một
số đặc điểm của tôm sú, Đại hoc Thuy san.
22. Nguyên Trong Nho – Tạ Khắc Thương va ctv (1996), Các chỉ tiêu sinh thái chủ
yêu trong cac ao nuôi tôm ơ cac tinh Nam Trung bô va vân đê nâng cao
82
năng suât ơ đây, Bao cao tông kết đê tai nghiên cưu khoa hoc cấp Bô , Nha
Trang.
23. Nguyên Trong Nho , Tạ Khắc Cương , Luc Minh Diêp , Nguyên Thi Xuyên
(1997), Nghiên cưu cai tiên quy trinh nuôi tôm su thit tai Khanh Hoa đat
hiêu qua kinh tê cao va năng suât ôn đinh, Bao cao đê tai nghiên cưu khoa
hoc, Nha Trang.
24. Lương Đưc Phâm (2000). Vi sinh vật lương thực và thực phẩm, Nhà xuất ban
Giáo duc, Hà Nôi.
25. Lương Đưc Phâm (2002), Công nghệ xử lý nước thải bằng các biện pháp sinh
học, Nhà xuất ban Giáo duc, Hà Nôi.
26. Văn Phu (2003), “Bio – niêm tin tron ven cua ngươi nuôi tôm ”, Tạp chí thuy
san, (12/2002, 1/2003).
27. Lê Thi Phương (2010), Nghiên cưu chât lương nươc trong cac đâm nuôi tôm
vung rừng ngập mặn ven biên huyên Giao Thuy, tỉnh Nam Định và một số
biên phap sinh hoc lam sach nươc trong cac đâm nuôi tôm, Luân an tiên si
sinh hoc .
28. Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất ban giáo duc, Hà Nôi.
29. Phan Lương Tâm va ctv (1998), “Kết qua bươc đầu đanh gia nguyên nhân gây
chết tôm ơ các tinh phía Nam”, Tạp chí thủy sản, Ha Nôi , tr. 149-162.
30. Bùi Quang Tê (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất ban
Nông nghiêp, Hà Nôi.
31. Đăng Ngoc Thanh (1974), Thủy sản họ c đai cương , Nha xuất ban đại hoc va
trung hoc chuyên nghiêp , Ha Nôi .
32. PGS. TS Ngô Tự Thanh (2001), “ Sự phân bô, sinh trương và sinh tông hơp
protease ngoại bào cua Bacillus ơ vùng Hà Nôi”, Tạp chí sinh học 23, tr.
153-157.
33. Nguyễn Viêt Thắng (1998), “Xac định nguyên nhân chính gây bênh cho tôm ơ
Đông bằng sông Cưu Long và các giai pháp tông hơp”, Các công trình
nghiên cứu khoa học công nghệ thủy sản 1991-1995, Vu Khoa hoc công
nghê, Hà Nôi, tr. 163-173.
83
34. Nguyễn Hữu Tho (2001), “Biến đông cua sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD,
chlo hữu cơ trong môi trương nươc anh hương đến kha năng xay ra bênh
đôm trắng, bênh đau vang trên tôm nuôi ơ Khanh Hoa”, Tạp trí thủy sản,
43, Bô Thuy san-Trung tâm nghiên cưu thuy san III, tr. 5-15.
35. Vo Thị Thư , La Thi Nga, Trương Ba Hung , Nguyên Minh Dương , Nguyên Liêu
Ba (2003), Nghiên cưu tao chê phâm Biochie va đanh gia tac dung cua
chê phâm đên môi trương nươc nuôi tôm ca , Hôi nghi Công nghê sinh hoc
toan quôc 12/2003.
36. Phạm Văn Tinh (2003), Kĩ thuật nuôi tôm sú thâm canh, Nhà xuất ban Nông
nghiêp, Hà Nôi.
37. Lê Trinh (1997), Quan trăc va kiêm soat ô nhiêm môi trương nươc , Nha xuất
ban Khoa hoc kỹ thuật .
38. Vũ Thế Tru (1994), Cải tiến kĩ thuật nuôi tôm tại Việt Nam, Nhà xuất ban Nông
nghiêp, Hà Nôi.
Tiêng Anh
39. Artemia Internation LLC (2002), “Sprirulina superfood for ornamental fish”,
Technical Information Shrimp Larval and Enrichment Feeds, Dec 3.
40. Block E., Koops H.P., Ahlers B. (1991), The biochemistry of nitriflying
organisms, In Variations in Autotrophic Life, Academic Press Limited,
San Diego, pp. 171-177.
41. Block E., Sundermeyer-Klinger, Stackebraandt E. (1993), New facultative
lithoautotrophic nitrite- oxidizing bacteria, Arcg. Microbiol, 136, pp.281-
284
42. Bothe, Jost, Schloter. M., Ward B. and Witzel (2000), Molecular analysis of
ammonia oxidation and denitrification in the natural environments, FEMS
Microbiol. Rev.,24, pp. 673-682.
43. Boyd C. E. and Tucker C. S. (1998), Pond aquaculture water quality
Management, Kluwer Academic Publishers, London, pp. 5.
84
44. Chanratchakool P., Turnbull J. F. and liusuwan C. (1995), Health management
in shrimp pond, Aquatic animal health research institute kasetsart
university campus, Jatujak, Bangkok 10900 Thailand.
45. Chiu Liao P. (1992), Marine prawn culture industry of Taiwan, In marine
shrimp culture principle and practies. Elsevier – Amsterdam – London –
Newyork – Tokyo, pp. 653-674.
46. Diana J.S., Lin C.K., Schneeberger P.J. (1991), “Relationships amônig nutrient
inputs, water nutrient concentration, primary production, and yield of
Oroechromis niloticus in pond”, Aquaculture, pp. 323-341.
47. Emanuel V., Adrian V., Ovidiu P., Gheorghe C. (2005), “Isolation of a
Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the
preservation of fodders”, African Journal of Biotechnology, 50(3), pp.
403-404.
48. FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food
including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint
FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional.
49. Franson (1995), Standard methods for the Examinaition of Water and
Wastewater, Publication Office American Public Health Association-
Washington, DC 2005, 19th
Edition, pp. 225-227; 240-243.
50. Gaudiosa Almazan-Gonzales (1995), Pond limnology and water quality
parameters, Aquaculture derpartment southeast fisheries development
center training and information division techno-transfer section tigbanan.
Hoilo city, Philippines.
51. Hebe M. Dionisi, Alice C. Layton, Gerda Harms, Igrid R. Gregory, Kevin G.
Robinson and Gray S. Sayler (2002), “Quantification of Nitrosomonas
oligotropha - like Ammonia Oxidizing Bacteria & Nitrospira spp. from
Full-Scale Wastewater Treatment Plants by Competitive PRC” ,
Application and Evironmental Microbiology, pp. 245-253.
52. Hung-Hung Sung, Shi-Fang Hsu, Chih-Kun Chemical, Yun-Yuan Tinh, Wei-
Liang Chao. “Relationship between desease outbreak in cultured tiger
85
shrimp (Penaeus monodon) and the composition of Vibrio communites in
pond water and shrimp hetopancreas during cultivation”, Inc, Jan 9.
53. Hung-Soo, Mitsuyo, H. and Makoto (2005), Characteritics of ammonium
removal by heterotrophic nitrification - Aerobic denitrification by
Alcalgenes faecali, 100(2), pp. 184-191.
54. Ian L. Brown, Kenneth J. Mc Naught, Robert N. Ganly, Patric Lynne Conway,
Anthony John Evans, David Lioyd, Topping, XinWang (2000),Probiotic
compositions, US patent No: 6, 060, 050.
55. Kakani (2003), “Probiotics: their role in aquaculture, Energee - American
Standard Products”, Inc, Jan 10.
56. Keeton Jimmie A, William Diane P (2000) “Probiotic formulation and method
for reduction of pathogenic bacteria” US patent No: US
200331049091Nichols, Andrew W. (2007). "Probiotics and athletic
performance: A systematic review", Current Sports Medicine Reports
(Current Medicine Group LLC), pp. 269–273.
57. Paez-osuna F. (2001), “The environmental inpact of Shrimp aquaculture: cause,
effects, and mitigating alternatives”, Environ Manage, 46, pp. 65-69.
58. Sambasivam S., Chandrran R. & Ajmal Khan S. (2003), “Role of probiotics on
the environment of shrimp pond”, Environ Bio, 34, pp. 13-17.
59. Shan H., Obbanrd J. P. (2001), “Ammonia removal from prawn aquaculture
water using immobilized nitrifying bacteria”, Appl Microbiol Biotechnol,
71, pp 24-30.
60. Sirirat Dengripat et all (1998), Effects of probiotic bacterium on black tiger
shrimp Penaeus monodon survival and growth , In Aquaculture 167.
61. Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002),
Application of Probiotics in Aquaculture , Ocean University of Chindo,
China, May 20, pp. 145-147.
62. William et all (1994), Bergey’s Manual of detereminative Bacteriology , 9th,
edition, pp. 559-560
Website:
86
63. http://www.atcvietnam.com.vn
64. http://opac.lrc.ctu.edu.vn
65. http://vi.wikipedia.org/wiki
87
PHỤ LỤC
Môt sô hinh anh liên quan đên luân văn :
Hình 1: Hình dạng khuẩn lạc chung TL1 Hình 2: Hoạt tính kitinaza cua
chung TL1 (D-d=35mm)
Hình 3: Hoạt tính xenlulaza cua chung
TL1 (D-d=32mm)
Hình 4: Hoạt tính amylaza cua chung TL1
(D-d=30mm)
Hình 5: Hình dạng tê bào chung TL1
88
Hình 6: Hoạt tính kháng
Vibrio cua chung L5
Hình 7: Hoạt tính kháng V.
parahaemolyticus cua chung L5
Hình 8: Nhuôm Gram chung L5
Màu xanh: tê bào L5
Mau đỏ: tê bào E.coli
Hình 9: Hình dạng khuẩn lạc chung L5
Hình 10: Chuẩn đô axit lactic theo phƣơng phap Therner
89
Hình 11: Hình dạng tê bào chung NA7 Hình 12: Hình dạng tê bào chung
NT2
Hình 13: Định lƣợng nitrit bằng
phƣơng phap Griss
Hình 14: Định lƣợng nitrat bằng
phƣơng phap Brucine
Hinh 15: Thí nghiêm xac định tỷ lê cam:
trâu thi ch hơp cho lên men xôp
Hinh 16: Thí nghiêm xư ly nƣơc TTTS bị
ô nhiêm băng chê phâm
