VALIDAS METODE I BIOANALITIK
By. Dr.Herm nS anS urya MS di,
DEPARTEMEN FARMAS F I MIPA
Unive ita Indone ia rs s Univers s
Validasi Metode analitik Validasi Metode analitik adalah suatu
proses (serangkaian uji lab) untuk membuktikan bahwa
metode/prosedur analitik yang digunakan adalah sesuai /memenuhi
syarat untuk tujuan penggunaannya.
Tujuan utama validasi metode analitik Metode / prosedur analisis
terbukti handal/valid Data hasil analisis dapat dipercaya
Alasan utama : 1. Validasi adalah bagian yang sangat erat dengan
sistem pengendalian mutu (QC). 2. Merupakan persyaratan dalam cGMP
(CPOB).
Tingkatan/level/jenis Validasi Full Validationmisal : metode
bioanalitik I, analisis obat baru, revisi metode
(analit+metabolit)
Partial Validationmisal: perubhn lab, analist, matriks, dsb
Cross Validationmisal : perbandingan 2 metode yang berbeda; bbrp
tempat/lab untuk dipki u/studi yg sama.
Validasi Metode Bioanalitik 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Parameter dasar
: Akurasi Presisi Selektivitas Kurva kalibrasi & Linearitas
LOD,LOQ, LLOQ Reproducibility (% Recovery) Stabilitas
AkurasiAkurasi suatu metode bioanalitik menggambarkan kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi diukur
minimal lima kali pengukuran untuk setiap konsentrasi dan
menggunakan minimal tiga rentang konsentrasi yaitu konsentrasi
rendah, sedang dan tinggi. Pengukuran akurasi memenuhi syarat jika
nilai % diff tidak menyimpang dari 15%, kecuali pada konsentrasi
LLOQ maka tidak boleh menyimpang dari 20%
PresisiPresisi suatu metode bioanalisis menggambarkan kedekatan
hasil-hasil pengukuran individual suatu analit ketika prosedur
diterapkan berulang pada sejumlah aliquot yang diambil dari
campuran matriks biologis yang homogen. Presisi diukur minimal lima
kali pengukuran untuk setiap konsentrasi dan menggunakan minimal
tiga rentang konsentrasi yaitu konsentrasi rendah, sedang dan
tinggi. Pengukuran presisi dilakukan intra assay (dalam satu run)
dan inter assay (day to day variation). Suatu metode dikatakan
presisi jika harga koefisien variasi (KV) untuk masingmasing
tingkat konsentrasi tidak lebih dari 15%, kecuali jika pengukuran
dilakukan pada konsentrasi LLOQ, maka koefisien variasi tidak boleh
lebih dari 20%
Selektivitas (spesifisitas)Selektivitas suatu metode adalah
kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat
dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam
matriks sampel. Untuk selektivitas, matriks biologi yang akan
dianalisis (seperti plasma, urin dan matriks yang lain) harus
diperoleh sedikitnya dari 6 sumber. Setiap sampel blangko diuji
terhadap adanya gangguan pada batas kuantitasi terkecil (LLOQ)
Batas Deteksi dan Batas KuantitasiBatas deteksi (LOD) adalah
jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih
memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Batas
kuantitasi (LOQ) diartikan sebagai kuantitas terkecil sampel yang
masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama
Kurva KalibrasiKurva kalibrasi adalah hubungan antara respon
instrumen dengan konsentrasi analit yang diketahui. Persiapan kurva
kalibrasi dilakukan sama dengan sampel dalam matriks biologis yang
diuji dengan mencampur matriks dengan konsentrasi analit yang
diketahui (spiking). Pd pembuatan Kurva kalibrasi diperiksa: - satu
sampel blanko (matriks tanpa baku dalam), - satu sampel zero
(matriks dengan baku dalam)& - 6 - 8 sampel yang mencakup
kisaran pengukuran (termasuk konsentrasi LLOQ).
Linieritas dan RentangLinearitas suatu metode analisis harus
diuji untuk mengetahui adanya hubungan yang linear antara kadar
suatu zat dengan respon detektor. Linearitas diperoleh dari
koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linear yang di dapat
dari kurva kalibrasi. idealnya, r=1 ; yang baik r > 0,999 Dengan
dilakukan uji ini, maka dapat diketahui batas-batas konsentrasi
dari analit yang memberikan respon detektor yang linear
Perolehan Kembali (recovery)Perolehan kembali suatu analit
adalah perbandingan antara respons detektor yang diperoleh dari
sejumlah analit yang ditambahkan dan diekstraksi dari matriks
biologis dengan respons detektor yang diperoleh dari kadar
sebenarnya dari standar murni. Uji perolehan kembali dilakukan
dengan membandingkan hasil analisis dari ekstraksi sampel pada tiga
konsentrasi (rendah, sedang dan tinggi) Persyaratan uji perolehan
kembali adalah antara 85 -115%, kecuali bila pengukuran pada LLOQ
maka uji perolehan kembali antara 80-120%
StabilitasUntuk menentukan stabilitas obat dalam cairan biologis
tubuh maka analit harus dievaluasi kestabilannya melalui proses
pengambilan sampel dan penanganannya, tempat dan kondisi
penyimpanannya sampai proses analisisnya. Penentuan stabilitas obat
dalam matriks biologi dapat dilakukan dengan cara : a. Stabilitas
dengan pembekuan dan pencairan (Freeze and thaw stability) b.
Stabilitas jangka pendek (short-term stability) c. Stabilitas
jangka panjang (long-term stability)
Contoh :Analisis Obat Dalam Plasma Plasma banyak mengandung ion,
molekul organik dan anorganik Cara ekstraksi obat dalam plasma 1.
Pengendapan protein 2. Ultrafiltrasi 3. Ekstraksi cair-cair 4.
Ekstraksi fase padat
VALIDASI METODE ANALISIS FUROSEMID DALAM PLASMA IN VITRO SECARA
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGIFLUORESENSIMetode yang dilakukan
adalah plasma yang mengandung furosemid dan baku dalam ditambahkan
asetonitril 1,5 ml dan dikocok dengan vorteks selama 30 detik
kemudian ditambahkan 2 ml etil asetat dan dikocok dengan vorteks
selama 1 menit kemudian sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama
20 menit. Supernatan dipisahkan, diuapkan pada temperatur 50o C
sampai kering dan ditambahkan 250 l fase gerak kemudian dikocok
dengan vorteks selama 20 detik dan sentrifus dengan kecepatan 12000
rpm selama 3 menit. Sebanyak 20 l dari supernatan disuntikkan ke
alat KCKT.
Validasi Metode Analisis Furosemid dalam Plasma1. Pengukuran LOQ
dan LLOQ
larutan furosemid dalam plasma 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; 1,0; 1,5 g/ml
+ 100 l Propranolol HCl 50,0 g/ml
Ekstraksi, suntikkan Ke alat KCKT
LOQ diperoleh dari data kalibrasi - LLOQ diperoleh dengan
mengencerkan konsentrasi LOQ(1/2;1/4), suntikkan ke alat KCKT,
hitung % diff dan KV
2. Kurva Kalibrasi dan LinearitasSampel plasma blanko, sampel
zero & larutan furosemid dalam plasma 0,1; 0,3; 0,5; 0,8;
1,0;1,5 g/ml + 100 l baku dalam 50,0 g/ m l
Ekstraksi, suntikkan Ke alat KCKT
kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linear Hitung
koefisien korelasi
3. Uji presisilarutan furosemid dalam plasma konsentrasi rendah,
sedang, tinggi + baku dalamEkstraksi, suntikkan 5x Ke alat KCKT
Hitung KV
4. Uji akurasiLarutan furosemid dalam Plasma konsentrasi Rendah,
sedang, timggi + baku dalamEkstraksi, suntikkan 5x Ke alat KCKT
Hitung % diff 5. Uji selektivitas 6 plasma manusia yang berbeda
+ konsentrasi LLOQ ekstraksi suntik ke alat KCKT Hitung KV dan %
diff
6. Uji Perolehan Kembali (%recovery)larutan furosemid dalam
plasma 600,900,1200 ng/ml + baku dalam
Ekstraksi, suntikkan 5x Ke alat KCKT
Hitung%RecoveryPAR yang diekstraksi % recovery = PAR tanpa
ekstraksi x 100 %
7. Uji stabilitasA. Stabilitas jangka pendekLarutan furosemid
dalam Plasma konsentrasi rendah, sedang dan tinggi + baku dalam
Simpan pada Temperatur kamar
Suntikkan ke alat KCKT
Ekstraksi pada jam ke 0, 6, 24
Amati gejala ketidakstabilan
B. Stabilitas frezee and thawLarutan furosemid dalam Plasma
konsentrasi rendah, sedangdan tinggi 3 Siklus frezee and + baku
dalamthaw
Ambil pada hari Ke 0, 1, 2 dan 3
ekstraksi
Stabil/tidak
Suntikkan ke alat KCKT
Kromatogram Plasma blankoRespon detektor (mV/s)
Waktu retensi (menit)
Kromatogram furosemid + propranolol HCl
Respon detektor (m/Vs)
Waktu retensi (menit)
Kromatogram furosemid + propranolol HCl dalam Plasma
Respon detektor (mV/s)
Wakti retensi (menit)
DATA HASIL VALIDASIParameter analisis LLOQ Akurasi 0.6048/50,6
0,9027/50,6 1,2096/50,6 % recovery 0.6048/50,6 0,9027/50,6
1,2096/50,6 KV (%) 4,2871 10,9041 3,3881 1,1532 99,4874104,5304
93,8161102,9541 97,3462100.1323 0,2449 3,2511 20% -13,938513,1944
2,4306-1,9345 -1,3228- -1,9731 -0,2150- -1,5790 20% 15% 80-115%
Syarat 20% 15% % diff -3,4226 -7,3909 syarat 20% % recovery
syarat
Selektifitas Stabilitas jangka pendek 0.6048/50,6 0,9027/50,6
1,2096/50,6 Stabilitas beku-cair 0.6048/50,6 0,9027/50,6
1,2096/50,6
2,4306- 12,2354 -1,3228- 11,9335 -0,2150- -3,8442
15%
TERIMAKASIHWASSALAM
