2. Microorganismos de importancia industrial y

formulación de medios de cultivo

2.4. Medios para fermentaciones industriales

2.4.1. Conceptos Generales

Investigación detallada para determinar el medio más adecuado en un proceso de fermentación

Todos los microorganismos (m.o.) requieren de agua, fuentes de: energía, carbón, nitrógeno; elementos minerales y posiblemente vitaminas, así como oxígeno si son aerobios

Elementos principales requeridos por las células microbianas

ELEMENTO

FUENTEFUNCIÓN

METABÓLICA

C Compuestos orgánicos, CO2

Componente principal del material celular

O O2, H2O, compuestos orgánicos, CO2

Componente principal del material celular

H H2, H2O, compuestos orgánicos

Componente principal del material celular

N NH4+, NO3, N2,

compuestos orgánicosComponente principal del material celular

S SO4-2, S2O3, HS-, S,

compuestos orgánicosComponente de la cis, met, pirofosfato de tiamina, coenzima A, ác. -lipólico

(Cont.)

ELEMENTO FUENTE FUNCIÓN METABÓLICA

P HPO4-2 Componente de los ácidos nucléicos,

ATP y otros nucleótidos y fosfolípidos

K K+ Principal catión orgánico dentro de la célula, cofactor de algunas enzimas

Mg Mg+2 Cofactor de muchas enzimas (particularmente cinasas) presente en paredes y membranas celulares

Ca Ca+2 Cofactor de enzimas; presente en exoenzimas importantes ( amilasas, proteasas), componente de las endoesporas (cadipicolinato)

Fe Fe+2 , Fe+3 Componente de los citocromos, proteínas fierro-azufre (ferredoxinas) cofactor de enzimas (hidratasa)

Criterios para crear un medio

1. Máxima productividad2. Máxima concentración de producto o biomasa3. Máxima velocidad de formación del producto4. Productividad mínima de productos

indeseables5. Económico, calidad consistente, fácilmente

disponible6. Problemas mínimos en otros aspectos:

aereación y agitación, extracción, purificación y tratamiento de desechos

Ejemplos de medios que cumplen con dichos criterios

Fuentes de carbono: Mieles de caña, mieles de remolacha,

cereales, almidones, glucosa, sacarosa y lactosa

Fuentes de nitrógeno: Sales de amonio, ureas, nitratos, licor de

maíz, harina de soya, desechos de rastros y residuos de fermentación

2.4.2. Formulación del medio

Fuente de Fuente de Otros

Carbón y + nitrógeno + requeri-

Energía mientos

Biomasa + Productos + CO2 + H2O + Calor

celular

2.4.2. Formulación del medio

Cooney (1981): Demostró que algunos nutrientes

frecuente-mente están adicionados en exceso, ejem: P y K, y otros muy cerca de los valores límite (ejem: Zn y Cu)

Incrementos en P, incrementan la capacidad buffer del medio

Es necesario poner una atención considerable al diseño del medio

2.4.2. Formulación del medio

Algunos m.o. no pueden sintetizar nutrientes específicos, ejem: aminoácidos, vitaminas y nucleótidos

Se identifica un factor específico de crecimiento que deberá incorporarse al medio en cantidades adecuadas como un componente puro o como el componente de una mezcla compleja

2.4.2. Formulación del medio

El carbono tiene un papel importante en la biosíntesis y generación de energía

Los requerimientos de carbono bajo condiciones aeróbicas se pueden estimar a partir del coeficiente de productividad celular (Y, SoKo) definido como:

Cantidad de material celular seco producidoCantidad de carbono del sustrato utilizado

Valores de Y para bacterias (Abbot y Clamen, 1973)

SUSTRATO Y

Metano 0.62

N. Alcanos 1.03

Metanol 0.40

Etanol 0.68

Acetato 0.34

Maleato 0.36

Glucosa (mieles) 0.51

2.4.2. Formulación del medio

Cooney (1979): Calculó Y teóricas para la biosíntesis de

penicilina G sobre la base de balances de materia y energía, analizando la estequiometría de la reacción:

a2C6H12O6 + b2NH3 + c2O2 + d2H2SO4 + e2PAA

n2PenG + p2CO2 + q2H2O (1)

2.4.2. Formulación del medio

La solución a la ecuación (1) es:

10/6 C6H12O6 + 2NH3 + ½ O2 + H2SO4 + C8H8O2

C16H18O4 N2S + 2CO2 + 9H2O

Y teórica = 1 g de penicilina G por g de glucosa

2.4.2. Formulación del medio

USO DE LA GLUCOSA CONSUMIDA

FERMENTACIÓN INTERMITENTE

FERMENTACIÓN SEMICONTINUA

Producción celular 28% 26%

Mantenimiento 61% 70%

Producción de penicilina

11% 6%

• Valor máximo de Y experimental = 0.053 g/g

2.4.2.1. Agua

En los procesos fermentativos se requieren grandes cantidades de agua limpia y de composición consistente, ya que:

Es componente mayor de todos los medios de fermentación

Es necesaria en muchos servicios auxiliares Factores a considerar:

pH Sólidos disueltos Contaminación del efluente Contenido mineral

2.4.2.2. Fuentes de energía y carbono

La energía para el crecimiento proviene de:

Oxidación de los componentes del medio Luz

La mayoría de los m.o. industriales son quimiorganotrofos

La fuente más común de energía es la fuente de carbono: carbohidratos, lípidos y proteínas

Algunos m.o. utilizan metano o metanol como fuente de carbono y energía

Crecimiento fototrófico

TIPO Donador de e-

Fuente de

carbono

Organismo

Fotoliotrofía H2O

H2S,S,H2

CO2

H2O

Plantas, algas verde azulesChromatiaceae, Chlorobiaceae

Fotoorganotrofía

Orgánico Orgánico Rhodospirillaceae

Crecimiento quimiotrófico

Tipo Donador de

e-

Aceptor de e-

Fte. de carbon

o

Organismo

Quimioorganotrofía

Org.

Org.Org.

Org.

O2

NO3-

SO4-2

Org.

Org.

Org.Org.

Org.

Pseudomonas, Bacilli, levadurasBacillus licheniformisBacterias reductoras de sulfatoClostridia, bacilos del ácido láctico, E. Coli, levaduras

Crecimiento quimiotrófico (cont.)

Tipo Donador de

e-

Aceptor de e-

Fte. de carbon

o

Organismo

Quimiolitotrofía H2

H2 S

H2 S

Fe+2

NH4+

NH2-

H2

H2

O2

O2

NO3-

O2

O2

O2

CO2

CO2

CO2

CO2

CO2

CO2

CO2

CO2

CO2

CO2

Bacterias oxidantes de hidrógenoTiobacilosTh. DenitrificansTh. FerrooxidansNitrosomasNitrobacterMetanógenosAcetobacterium

Ejemplos de fuentes de carbón normalmente utilizadas

Carbohidratos: almidón de maíz, de cereales o de papas maíz y cereales parcialmente molidos preparaciones de glucosa a partir de

almidones hidrolizados malta (granos de cebada germinados

parcialmente y tratados térmicamente) sacarosa de caña o remolacha como melazas

(forma impura)

Composición de malta de cebada (carbohidratos) (Haris, 1962)

CARBOHIDRATO % b.s.

Almidón 58 – 60

Sacarosa 3 – 5

Azúcares reductores

3 – 4

Otros azúcares 2

Hemicelulosa 6 – 8

Celulosa 5

Análisis de melazas de caña y remolacha (Rhodes y Fletcher, 1966)

CARBOHIDRATO REMOLACHA

(% w/v)

CAÑA(% w/v)

Sacarosa 48.5 33.4

Rafinosa 1.0 0

Azúcar invertida 1.0 21.2

Ejemplos de fuentes de carbón normalmente utilizadas

Aceites vegetales comerciales

Oliva, maíz, semilla de algodón, linaza, soya, etc.

Son fuentes de carbono fundamentalmente como ácido oleico, linoleico y linolénico

Actúa como antiespumante en asociación con un agente surfactante

Ejemplos de fuentes de carbón normalmente utilizadas

Licor de maíz Subproducto en la extracción del almidón de

maíz Se utiliza principalmente como fuente de

nitrógeno, pero además contiene ácido láctico, azúcares reductores y polisacáridos complejos

Proteínas Albúmina bovina y harina de carne Se utilizan en la formulación de medios para la

producción de vacunas

Factores que influyen sobre la selección de la fuente de carbono

El producto principal que se desea obtener

La eliminación de impurezas de la fuente de carbohidratos

Legislaciones El método de preparación del medio,

particularmente la esterilización

Influencia de la fuente de carbono sobre la formación del producto

La velocidad a la cual la fuente de carbono es metabolizada puede influenciar la formación de biomasa o la producción de metabolitos primarios o secundarios

Crecimiento rápido por la presencia de altas concentraciones de azúcares rápidamente metabolizables genera baja productividad de metabolitos secundarios (Griseofulvina, Penicilina, Bacitracina, Estreptomicina y Actinomicina)

El problema se resuelve usando azúcares metabolizables más lentamente (lactosa) o con sistemas continuos y semicontinuos

2.4.2.3. Fuentes de nitrógeno

La mayoría de los m.o. industriales pueden utilizar fuentes orgánicas e inorgánicas de nitrógeno

Nitrógeno inorgánico: amoniaco (gas) o nitratos: condiciones

alcalinas sales de amonio: condiciones ácidas

Nitrógeno orgánico: Aminoácidos Proteína urea

Ejemplos de fuentes de nitrógeno

Licor de maíz Harina de soya Harina de cacahuate Harina de semillas de algodón Hidrolizado de caseína Desechos de rastro Harina de pescado Extracto de levadura

Factores que influyen sobre la selección de fuentes de nitrógeno

El amoniaco o ión amonio se prefiere como fuente de nitrógeno, pues la enzima nitrato reductasa es inhibida en presencia del mismo.

Además, el ión amonio controla la acción de ciertos sistemas enzimáticos en hongos para la incorporación de aminoácidos al m.o. (aminoácido permeasas)

Factores que influyen sobre la selección de fuentes de nitrógeno

En Aspergillus nidulans el amoniaco regula la producción de proteasas alcalinas y neutrales

La fuente de nitrógeno influye el patrón de fermentación. La producción de antibióticos puede ser inhibida por una utilización rápida del nitrógeno. Ejemplo: en la producción de polienantibióticos, la harina de soya es buena fuente de N.

Factores que influyen sobre la selección de fuentes de nitrógeno

Rhodes (1963) Demostró que la concentración óptima

de la fuente de nitrógeno disponible para la producción de griseofulvina varían en función de la forma del inóculo y del tipo de fermentador

Mejores fuentes de nitrógeno seleccio-nadas mediante planes de desarrollo

PRODUCTO PRINCIPAL FUENTE DE N

Penicilina Licor de maíz

Bacitracina Cacahuate granulado

Rivoflavina Digerido pancreático de gelatina

Novobiocina Solubles de destilería

Rifamicina Pharmamedia, Harina de soya, (NH4)2SO4

Giberalinas Sales de amonio y ftes. nats. de N vegetal

Butirosina Sangre seca o hemoglobina con (NH4)2SO4

Polienos Harina de soya

2.4.2.4. Minerales y vitaminas

a. Minerales En muchos medios Mg, P, K, S, Ca y Cl

son componentes esenciales en concentraciones tales que es necesario adicionarlos

Otros elementos como Co, Cu, Fe, Mn, Mo y Zn son esenciales pero están presentes como impurezas en otros ingredientes

Elementos traza requeridos por las células microbianas

Elemento

Función metabólica

Zn

Mn

NaClMo

Componente de la alcohol deshidrogenasa, fosfa-tasa alcalina, aldolasa, RNA y DNA polimerasaComponente de la superóxido dismutasa bacteria-na, PEP, carboxicinasa, citrato sintetasaRequerido por bacterias halofílicasRequerido por bacterias halofílicasComponente de la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato deshidrogenasa

Elementos traza requeridos por las células microbianas (cont.)

Elemento

Función metabólica

Se

Co

CuCrNi

Componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasaComponente de la vitamina B12 y enzimas con

vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa)Componente de la citocromo oxidasa y oxigenasasComponente de algunas formato deshidrogenasasComponente de la ureasa y del crecimiento autótrofo de bacterias que oxidan hidrógeno

Intervalos de concentraciones típicas de componentes minerales (g/dm3)

COMPONENTE INTERVALO

KH2PO4 1.0 – 4.0

MgSO4-7H2O 0.25 – 3.0

KCl 0.5 – 12.0

CACO3 5.0 – 17.0

FeSO4-4H2O 0.01 – 0.1

ZnSO4-8H2O 0.1 – 1.0

MnSO4-H2O 0.01 – 0.1

CuSO4-5H2O 0.003 – 0.01

NaMoO4-2H2O 0.01 – 0.1

Minerales

La concentración de los minerales puede ser muy crítica en ciertos procesos (metabolitos secundarios)

La concentración de fosfato inorgánico influye sobre la producción de bacitracinas, ácido cítrico, monomicina, novobiocina, oxitetraciclina, polienos, ristomiocina, rifamicina Y, estreptomicina y vancomicina

Minerales

Garner y col. (1950) sugirieron que una función importante del calcio en el medio de fermentación era precipitar el exceso de fosfatos inorgánicos y sugirieron que el calcio mejora indirectamente la productividad de estreptomicina

Minerales

Weinberg (1970): Mn, Fe y Zn son los minerales más críticos en

el metabolismo secundario La productividad del producto varía

linealmente con el logaritmo de la concentración del metal “clave” (No. atómico. 23-30, 42)

La relación lineal no se aplica a concentraciones insuficientes o tóxicas para el crecimiento

Elementos trazas requeridos en la obtención de metabolitos

PRODUCTO ELEMENTOS TRAZA

Bacitracina Mn

Riboflavina Fe, Co

Proteasa Mn

Actinomicina Fe, Zn

Cloramfenicol Fe, Zn

Elementos trazas requeridos en la obtención de metabolitos (cont.)

PRODUCTO ELEMENTOS TRAZA

Neomicina Fe, Zn

Acido cítrico Fe, M, Zn

Penicilina Fe, Zn, Cu

Griseofluvina Zn

Patulina Fe, Zn

Vitaminas

Muchas de las fuentes de carbono y nitrógeno contienen todas o algunas de las vitaminas necesarias

Para evitar una deficiencia de vitaminas es conveniente utilizar una mezcla cuidadosa de materiales

Cuando sólo se requiere de una vitamina, resulta más económico adicionarla en su forma pura

Ejemplos: uso de pantotenato de calcio en la formulación del medio destinado a la producción de vinagre y biotina para ácido glutámico

Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento

Compuesto Función metabólicaÁc. p-aminobenzóico

Biotina

Ac. fólico

Ac. nicotínicoAc. pantoténico

Precursor del tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de un carbonoCoenzima que participa en reacciones de carboxilaciónTetrahidrofolato necesario en la transferen-cia de unidades de un carbonoPrecursor de NAD y NADPPrecursor de coenzima A (portador de grupos de acilo)

Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento (cont.)

Compuesto Función metabólicaVitamina B2

Vitamina B6

Vitamina B1

Fosfato de piridoxal usado en reacciones de transminación y descarboxilaciónComponente de los grupos prostéticos FMN y FED de las flavoproteínasComponente del pirofosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y transcetolasas

Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento (cont.)

Compuesto Función metabólica

Vitamina B12

Vitamina K

Coenzima M

Coenzima que intervine en reacciones de rearreglo (glutamato mutasa)Precursor de la menaqinona un portador de electrones (por ejemplo, fumarato reductasa)Interviene en la metanogénesis

Recirculación del nutriente

Los fermentadores continuos de gran escala, utilizados en la producción de SCP, se diseñan para operarse con recirculación de la alimentación líquida

Es necesario ajustar en forma adecuada los niveles de nutrientes

Buffers

El control de pH es extremadamente importante si se quiere alcanzar una productividad óptima

Se debe adicionar al medio de cultivo un compuesto que sirva como buffer

pH 7 Carbonato de calcio Los fosfatos juegan un papel importante

como buffers Uso balanceado de fuentes de carbono y

nitrógeno control de pH Control externo del pH: adición de amoniaco

o hidróxido de sodio y ácido sulfúrico

Adición de precursores y reguladores metabólicos al medio

Precursores

Inhibidores

Inductores

Manipulan el progreso de la

reacción

Regulan la generación

de producto en lugardel crecimiento de

m.o.

Precursores

Algunos compuestos químicos cuando se adicionan a ciertas fermentaciones se incorporan directamente dentro del producto deseado

Ejemplo: incremento de la productividad de penicilina (de 20 a 100 unidades/cm3) al adicionar licor de maíz

Precursores

Fenilmetilamina

contenida en el + Penicilina Bencil penicilina

licor de maíz (Penicilina G)

Precursores

Precursor Producto Microorganismo

Ac. Fenilacético

Ac. Fenoxiacético

Cloruro

Penicilina G

Penicilina V

Clorotetraciclina

Penicillium chrysogenumPenicilliumchrysogenumSrepomicesaureofaciens

Precursores (cont.)

Precursor Producto Microorganismo

D-treonina

Glicina

Ac. amino butírico

L-isoleuina

L-serina

L-isoleucina

Serratia MarscescensCorynebacteriumglycinophilumBacillus subtilis

Inhibidores

Al adicionar ciertos inhibidores a las fermentaciones se puede producir más de un producto específico o un producto metabólico intermedio

Ejemplo: producción de glicerolOH

CH3CH=O + Na+SO3- CH3CH

SO3-Na+

Inhibidores

Producto InhibidorEfecto

principalMicroorganis

moGlicerol

Tetraiclina

Ac. glutámico

Rifamicina B

Bisulfito de sodio

Bromuro

Penicilina

Di-etil barbiturato

Reprime la producción de acetaldehidoReprime la formación de ClorotetraciclinaPermeabilidad de la pared celularInhibe otras rifamicinas

S. cerevisiae

Streptomyces aureofaciens

Micrococcus glutamicusNocardia mediterranei

Inductores

La mayoría de la enzimas de interés industria son inducidas

Las enzimas inducidas son sintetizadas sólo en respuesta a la presencia en el medio de un inductor

El inductor normalmente es el sustrato para la enzima o un compuesto estructuralmente relacionado

Precursores

Enzima Inductor Microorganismo

-amilasa

Celulasa

Pectinasas

AlmidónMaltosa

Celulosa

Pectina

Aspergillus sppBacillus subtilis

Trichoderma virde

Aspergillus spp