MEMOIRE - univ-oran1.dz · 2015-05-05 · Dédicaces A la mémoire de mes grands -parents A mes très chers parents qui ont toujours été là pour moi, et qui m'ont donné un magnifique

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université D’Oran Es- Sénia Faculté des sciences Département de Biologie Laboratoire de Microbiologie Appliquée

MEMOIRE

En vue de l’obtention du diplôme de Magister en Microbiologie

Option : Phytiatrie et Phytopharmacie

THEME

Etude de l’activité protéolytique et le profil protéique total chez Ascochyta rabiei

Présenté par :

TERBECHE FOUZIA

Membre de Jury :

Année Universitaire 2010-2011

Président : M. KIHEL Mebrouk Professeur à l’Université d’Oran

Rapporteur :

Co-rapporteur :

M. HENNI

Mme GUARBI

Jamal Eddine

Samia

Professeur à l’Université d’Oran

Maitre assistante A à l’U.S.T.O

Examinateur : M. SAHRAOUI Tewfik Professeur à l’Université d’Oran

Examinateur : M. SAIDI Noureddine Maitre de conférences à l’université d’Oran

Dédicaces

A la mémoire de mes grands-parents

A mes très chers parents

qui ont toujours été là pour moi, et qui m'ont donné un magnifique

modèle de labeur et de persévérance. J'espère qu'ils trouveront dans

ma réussite toute ma reconnaissance et tout mon amour.

A mes très chers frères et sœurs :

Nassima, Fodil, Zohir, Abd el azize , Lamia

et mon beau frère Omar.

A mes deux petits adorables anges : Annes et Khalil

A ma chère grande mère paternelle

A mon grand père maternel

A mes tantes et mes oncles

A mes cousins et cousines

A tous mes amis

Surtout Assia et Radia

Je dédie ce mémoire

Remerciements

Je tiens à remercier particulièrement mon encadreur, le professeur Henni Jamal-

Eddine, pour son aide précieuse et ces conseils judicieux qu’il m’a réservé durant la

réalisation de mon travail au sein de son Laboratoire de Microbiologie Appliquée, à

l’Université d’Oran au Département de Biologie, je lui assure le témoignage de ma profonde

reconnaissance.

Mes remerciements s’adressent à Madame Gharbi Samia, maitre assistante à

l'Université d'USTO, qui a accepté de me prendre en charge pour réaliser ce modeste travail.

Je remercie vivement les membres de mon jury :

Monsieur Kihal Mebrouk, Professeur au Département de Biologie à l'Université

d'Oran, pour son aide et ces conseils et d’avoir accepté de présider mon jury.

Monsieur Sahraoui Tewfik, Professeur au Département de Biologie à l'Université

d'Oran, Monsieur SAIDI Nour Eddine Maître de Conférences au Département de Biologie à

l'Université d’Oran, qui me font l’honneur d’examiner mon travail.

J’exprime mes plus vifs remerciements à M. karkachi,.M. Guessas madame Kaddar,

Melle

Benichou et Mme

Benfriha F, pour leur aide, conseils et encouragements.

Je tiens à remercier particulièrement M. Hassaïne O pour son précieuse aide, ces

conseils avisés et ces encouragements permanents.

J’adresse mes remerciements à Melle

Faiza et Monsieur Mohamed et tous mes

camarades de promotion.

Je n’omettrai pas de remercier la Direction des Services Agricole de la wilaya

d’Oran.

J’adresse mes sincères remerciements à mes parents et ma famille pour leur soutien,

aide et leurs encouragements. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma respectueuse gratitude et

de mon entière reconnaissance.

A toutes les personnes qui ont participé de manière directe ou indirecte à

l’élaboration de ce mémoire, un grand merci pour eux.

RESUME

Ascochyta rabiei est un champignon pathogène causant une des plus sévères

maladies du pois chiche. En effet c’est un champignon qui présente une grande variabilité

morphologique et pathologique. Ce phytopathogène dispose d’un bagage enzymatique varié

qui peut intervenir dans la pathologie de ce champignon sur le pois chiche.

L’objectif de notre travail est d’étudier l’activité protéolytique chez Ascochyta rabiei

et la recherche du polymorphisme au niveau du profil protéolytique.

La présente étude a été effectuée par la méthodologie suivante :

En premier temps, l’isolement du parasite à partir des plantes malades et

l’identification de 14 souches.

Par la suite, la sélection de la souche A31 qui a révélé une expression de l’activité

protéolytique la plus élevée par rapport à l’ensemble des souches pour l’utilisation dans les

parties qui suivent.

L’étude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31 dans le surnageant de

culture de différents milieux et à différents pH par deux méthodes (l’activité protéolytique

évaluée en milieu solide et par dosage à l’UV) a permis d’enregistrer que la sécrétion des

protéases est variable selon le milieu de culture et son pH, et que la présence de la caséine a

un fort effet sur l’expression des protéases.

L’étude de l’activité protéolytique in vitro a nettement montré l’influence de la source

de carbone sur l’activité enzymatique des protéases car en absence du glucose, le

champignon a utilisé différentes familles de protéases, il s’agit de protéases acides, neutres et

alcalines. Ces protéases peuvent avec d’autres groupements enzymatiques intervenir dans le

pouvoir pathogène au cours du processus d’infection du Pois chiche.

L’étude de l’évolution du poids du mycélium de la souche A31 nous a renseigné sur

l’effet important que occupe cette activité lors de la croissance de ce champignon.

Le test du pouvoir pathogène a confirmé que les deux souches testées sont pathogènes,

ainsi l’étude du polymorphisme protéolytique des 14 souches a montré que les souches

appartiennent à deux groupes hétérogènes dont le premier est formé deux souches ( A10 et

A12) et le deuxième formé de deux souches(A1 et A22) et onze sous groupes présentant des

taux d’homogénéité partiellement différents.

Mots clés :

Anthracnose, Ascochyta rabiei , Cicer arietinum, activité protéolytique, profil protéique.

SUMMARY

Ascochyta rabiei is a pathogen causing one of the most severe diseases of chickpea.

Indeed it is a fungus which presents pathological and morphological variability. The

phytopathogenic boasts a diverse enzymatic baggage which plays a role in its pathogenecity

among which the protease.

The objective of this work leads on study of proteolytic activity of Ascochyta rabiei

and research of the polymorphism on proteolytic profile.

The work has been done by the following methodology:

First, isolation of the parasite from diseased plants and 14 isolates identification, following

by selection of a strain A31 that presents high values of proteolytic activity.

The the protéolytic activity was analysed with two methods (enzyme essay on solid

media and enzyme assay with UV) in different medium and pH.

The results show that protease production is dependent on pH and the casein and

carbon source present on de medium and that the fungi has produced different kind of

protease which are acid neutral and alkaline protease proteolytic activity have a large effect

on growth of the fungi moreover.

Study of pathogenic capacity helped us to highlight the aggressiveness of isolates

A31et A10 on chickpea plants.

Protein profile obtained by electrophoresis (SDS - PAGE) system which showed that the 14

strains belong to two groups and nine pennies groups.

Keywords: anthracnose, Ascochyta rabiei, Cicer arietinum, proteolytic activity , pathogenic

capacity, protein profile.

Ascochyta rabiei

A31

A31

caséine

A31 A1

Ascochyta rabiei

DEDICACES

REMERCIEMENTS

RESUME

INTRODUCTION………………………………………………………………………………………………..1

ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE

1. La plante hôte Le Pois chiche(Cicer arietinum .)………………………………........…………………3

1.1. Valeur nutritionnelle ………………………………………………………………………………..…3

1.1. a- Valeur nutritive par 100 g comestibles……………………………………………………………..…4

1.2. Production internationale……………………………………………………………………………………………..………4

1.3. Place du Pois chiche en Algérie………………………………………………………………………………………..……………6

1.3.1. Production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran…………………………………………………………..…6

1.3.2. Prévision de la production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran…………………………………………………………..…7

1.4. Historique et origine…………………………………………………………………………..……………………………………………..… 7

1.5. Classification classique……………………………………………………………..…………………………………………………………..…8

1.6 Etude générale de la plante……………………………………………………………………..…………………………………………………..… 9

1.7. Types de cultures…………………………………………………………………………………..……………………………………..… 10

2. La maladie de l’anthracnose…………………………………………………………………………………..……………………………………..… 11

2.1. Impact économique……………………………………………………………………..………………………………………………..… 11

2.2. Symptômes…………………………………………………………………………..……………………………………………..… 11

2.3. Epidémiologie………………………………………………………………………………..………………………………………..… 12

2.4. Cycle de la maladie…………………………………………………………………………………..……………………………..…13

2.5. Mécanismes d’infection……………………………………………………………………………………..…………………………………..…15

2.5.1. Itinéraire d’infection………………………………………………………………………………..……………………………..…15

2.5.2. Adhérence et pénétration……………………………………………………………………………..…………………………………………..…15

2.6. Méthodes de lutte…………………………………………………………………………………..……………………………………..… 16

3. L’agent causal……………………………………………………………………………..…………………………………………..…17

3.1. Taxonomie et caractéristiques d’Ascochyta rabiei………………………………………………………………………………..…17

3.1.1. Systématique d’Ascochyta rabiei………………………………………………………………………………………..………………………………..… 17

SOMMAIRE

3.2. Variabilé d’Ascochyta rabiei…………………………………………………………………………………………..……………………………..…19

3.3. Résistance du pois chiche à Ascochyta rabiei…………………………………………………………..… 20

3.3.1. Sur le plan génétique……………………………………………………………………………..…………………………………………..…20

3.3.2. Sur le plan pathologique…………………………………………………………………………..……………………………………………..… 20

3.4. Détection des activités enzymatiques chez Ascochyta rabiei……………………………………..……………………………………………………..…21

3.5. Variabilité protéique chez Ascochyta rabiei…………………………………………………………..… 21

MATERIELS ET METHODES

1. Etude morphologique………………………………………………………………………………..………………………………………..… 22

1.1-Echantillonnage……………………………………………………………………..…………………………………………………..… 22

1.2. L’isolement et la purification……………………………………………………………..…………………………………………………………..… 22

1.3. Conditions d’incubation…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 23

1.4. L’obtention des Cultures monospores…………………………………………………………..…23

1.5. La conservation des isolats…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 24

1.6. L’étude macroscopique…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 24

1.7. L’étude microscopique…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 24

2. Etude enzymatique…………………………………………………………..……………………………………………………………..…25

2.1. Croissance mycélienne de toutes les souches…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 25

2.2- Evaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans

le surnageant de culture…………………………………………………..……………………………… 26

2.3- Dosage de l’activité protéolytique à l’UV…………………………………………………..……………………………… 26

3. Etude du pouvoir pathogène…………………………………………………..……………………………… 27

3.1. Les milieux de culture…………………………………………………..………………………………27

3.2. Conditions d’obtention des plantules…………………………………………………..……………………………… 27

3. 3. Préparation de l’inoculum…………………………………………………..……………………………… 29

3.4. Inoculation des plantes…………………………………………………..……………………………… 29

3.5. Réisolement du parasite…………………………………………………..……………………………… 30

4. Etude du profil protéolytique total…………………………………………………..……………………………… 31

4.1. Préparation des extraits enzymatiques pour le dosage des protéines totales des isolats………………………………………………..……………………………… 31

4 .1. 1. Culture du champignon……………………………………………..…………………………… 31

4 .1. 2. Obtention des extraits enzymatiques……………………………………………..…………………………… 31

4.2. Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford…………………………………………..………………………… 31

4.3 Electrophorèse des protéines totales par le système (SDS-PAGE)…………………………………………..………………………… 32

4.3.1. La préparation d’un gel (SDS-PAGE)…………………………………………..…………………………32

4.3.2. La dénaturation des échantillons…………………………………………..………………………… 33

4.3.3. La révélation des protéines totales…………………………………………..………………………… 33

RESULTATS ET DISCUSSIONS

1. L’étude morphologique des isolats…………………………………………..………………………… 34

1.1. Isolement…………………………………………..…………………………………………………………..…………………………34

1.2. Les caractères macroscopiques…………………………………………..………………………… 34

1.3. Les caractères microscopiques…………………………………………..………………………… 36

1.4. Conservation des isolats…………………………………………..……………………………………………………..………………………………………… 37

2. Etude enzymatique…………………………………………………………………………………..……………………………..…………………………38

2.1. Croissance mycélienne de toutes les souches sur différents milieux…………………………………………..…………………………38

2.2. Etude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31 dans le surnageant

de culture de différents milieux et à différents pH…………………………………………..…………………………40

2.2.1. Évaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans

le surnageant de culture………………………………………………………………………..………………………………………..…………………………40

2.2.2. Dosage de l’activité protéolytique exprimée dans le surnageant de culture……………………………………………..……………………………40

a- Dans le milieu Czapeck glucose additionné de la caséine……………………………………………..……………………………41

b- Dans le milieu Czapeck glucose………………………………………………..……………………………… 42

c- Dans le milieu Czapeck additionné de la caséine………………………………………………..……………………………… 43

2.3 Evolution du poids du mycélium dans différents milieux et à différents pH………………………………………………..……………………………… 45

a- Dans milieu Czapeck-glucose ajouté et ou dépourvu de caséine à pH :4, 6 et 8………………………………………………..……………………………… 45

b- dans milieu Czapeck caséine à pH : 4, 6 et 8………………………………………………..……………………………… 46

3. Evaluation du pouvoir pathogène des isolats d’Ascochyta rabiei………………………………………………..……………………………… 47

4. Etude du profil protéolytique………………………………………………..……………………………… 50

4.1 Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford………………………………………………..……………………………… 50

4.2 Electrophorèse des protéines totales………………………………………………..……………………………… 51

CONCLUSION GENERALE………………………………………………..……………………………… 54

ANNEXE

REFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Liste des abréviations

°C : Degré Celsius

cm : Centimètre

D.O : Densité optique.

FAO : Food and Agricultural Organization of the United Nations

g : Gramme

ha : Hectare

I.C.R.I.S.A.T : International Crops Research Institute for the Semi Arids tropics in

Inde.

I.C.A.R.D.A : International Center For Agricultural Research in the Dry Areas.

J : Jour

M : Molaire

mg : Milligramme

µg : Microgramme

ml : Millilitre

MQ : Moyenne quotidienne

P : Poids

PC : Milieu pois chiche

pH : Potentiel d'Hydrogène

q : Quintaux

q.s.p : Quantité suffisante pour

S.D.S-PAGE : Electrophorèse en gel de Polyacrylamide avec SDS (Sodium dodecyl

sulfate).

TCA : Acide Trichloracétique.

TEMED : Tetramethylaminomethane.

TRIS : Tris-Hydroxymétylaminomethane.

U : Unité

V : Volume

Liste des tableaux

Tableaux Pages

Tableau n° 01 : Table de composition des aliments 04

Tableau n° 02 : Bilan de production de pois chiche dans le monde durant la

période (2002-2007) (skypertz, 2006).

05

Tableau n° 03 : Récapitulatif des superficies, des productions, des rendements et

des taux d’accroissement 2005/2006 (Ministère de l’Agriculture).

06

Tableau n° 04 : Bilan des superficies et des productions de pois chiche durant la

période (2005-2010) dans la wilaya d’Oran.

06

Tableau n° 05 : Bilan des prévisions des superficies et des productions de pois

chiche durant la période (2011-2014) dans la wilaya d’Oran

07

Tableau n° 06 : Caractères systématiques d’ Ascochyta rabiei 17

Tableau n° 07 : Echelle quantitative à 9 points pour la notation des réactions du

pois chiche à l’anthracnose

30

Tableau n° 08 : Dilutions de la courbe d’étalonnage 32

Tableau n° 09 : Origine des souches d’Ascochyta rabiei isolées des différents

sites de l’Ouest Algérien

34

Tableau n° 10 : Comportement des hôtes différentiels vis-à-vis de la souche A31 et

A10

47

Tableau n° 11 : Densité optique (D.O.) de chaque dilution de la courbe

d’étalonnage des protéines totales

50

Tableau n° 12 : Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque

extrait enzymatique des isolats d’Ascochyta rabie

51

Tableau n° 13 : Résultats de l’éléctrophorèse des protéines totales 52

Tableau n° 14 : Taux de similitude des bandes des protéines de toutes les souches 52

.

Liste des photos

Photo n° 01 : le pois chiche, Cicer arietinum L 09

Photo n°02 : types de Graines de pois chiche : type Kabuli et type Desi 10

Photo n° 03 : Cycle de l’anthracnose du pois chiche 14

Photo n° 04 : Plantes de Pois chiche présentant les symptômes de l’anthracnose 22

Photo n° 05 : Pré germination des graines 28

Photo n° 06 : Germination des graines 28

Photo n° 07: Plantes de pois chiche saines âgées de 10 jours avant l’inoculation 28

Photo n° 08 : Plantes de pois chiche inoculées avec une suspension sporale de la

souche A31 recouvertes d’un sac en plastique

29

Photo n° 09 : Isolement d’Ascochyta rabiei à partir des tiges de plante malade 35

Photo n° 10 : Aspect morphologique du mycélium sur milieu pois chiche gélosé 35-

36

Photo n° 11 : Observations au microscope optique des pycnides d’Ascochyta

rabiei au grossissement (X 400)

37

Photo n° 12 : Conservation des souches dans des tubes à essai contenants milieu

pois chiche gélosé incliné

38

Photo n° 13 : Aspect du mycélium de la souche A31 sur milieu Czapeck glucose

additionné à la caséine

39

Photo 14 : Activité protéolytique exprimée dans le milieu solide 40

Photo 15 : Les différentes étapes du test de pouvoir pathogène 47-

49

Photo 16 : Profil éléctrophorétiques des protéines totales d’Ascochyta rabiei 51

Liste des figures

Figures Pages

Figure n° 01 : Représentation du développement de toutes les souches sur différents

milieux : Czapeck-caséine-glucose, Czapeck-glucose et Czapeck-caséine

38

Figure n° 02 : Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le

filtrat de milieu de culture (Czapeck-glucose+caséine) évaluée en milieu solide (A)

et par dosage à l’UV (B).

41

Figure n° 03: Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le

filtrat de milieu de culture (Czapeck-glucose) évaluée en milieu solide (A)


42

Figure n° 04 : Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le

filtrat de milieu de culture (Czapeck-caséine) évaluée en milieu solide (A)


43

Figure n° 05 : Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck glucose à pH : 4, 6

et 8 (A): en présence de caséine, (B) en absence de caséine.

45

Figure n° 06 : Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck+caséine

à pH : 4, 6 et 8

46

Figure n° 07 : Courbe d’étalonnage des protéines 50

Figure n° 08 : Représentation des 14 souches en dendrogramme 53

INTRODUCTION

INTRODUCTION

1

INTRODUCTION

Le pois chiche (Cicer arietinum) se compte parmi les cultures légumineuses les

plus importantes dans le monde. Il occupe la troisième place après le haricot (Phaseolus

vulgaris) (Saxena, 1992).

L’anthracnose du pois chiche causée par (Ascochyta rabiei) est responsable de la

régression de cette culture dans la plupart des zones où elle est cultivée

(Nene et Reddy, 1987).

En Algérie, cette culture qui fournit une graine riche en glucides et en protéines,

est caractérisée par une production instable due principalement à la présence de cette

maladie et à l’utilisation d’un matériel végétal hétérogène et peu amélioré. Les

programmes internationaux actuels, sur les légumes secs, encouragent les efforts

nationaux à améliorer la production de cette culture, notamment par l’utilisation de

variétés résistantes.

Pour stabiliser la productivité de cette culture, une attention particulière est

donnée à la sélection, pour la résistance aux différents stress biotiques et abiotiques.

L’évaluation de cette résistance pour l’anthracnose nécessite une meilleure

connaissance du champignon.

En effet, Ascochyta rabiei est un champignon qui présente une grande variabilité

morphologique et pathologique (Djaoui, 1985 ; Djellali,1988 ; Yamina,1990 ;

Labdi,1990 ; El Biari,1995).

Une étude portant sur la corrélation entre les activités enzymatiques in vitro et le

pouvoir pathogène a montré que les isolats les plus agressifs sont ceux qui produisent le

plus d’enzymes hydrolytiques (Tchicha, 1991). Par ailleurs, une étude sur les toxines a

également montré une corrélation positive entre l’agressivité et la sécrétion des toxines

(Latif et al., 1993). Ces études mettent en évidence une variabilité biochimique du

champignon.

INTRODUCTION

2

Tous ces travaux ont contribué à mieux connaitre le pathogène et sa pathologie

et donc à expliquer la différence dans le comportement des lignées sélectionnées. Ils

permettront la mise en place d’une stratégie de lutte spécifique afin d’améliorer la

sélection à la résistance.

Le but de notre travail serait donc d’apporter une contribution à la connaissance

de la diversité biochimique de ce champignon par l’étude in vitro de l’activité

enzymatique protéolytique et le profil protéolytique total.



3

1. La plante hôte Pois chiche (Cicer arietinum) :

1.1. Valeur nutritionnelle :

Le pois chiche, au même titre que la fève et les haricots, est une graine

protéagineuse cultivée pour sa richesse en protéine. Il fait partie du nombre très réduit

d’aliments qui apportent à la fois des protéines et un grand nombre de sels minéraux

(calcium, fer, potassium et phosphore) jouant un rôle important dans l’alimentation. Elle

renferme entre 20 % et 25% de protéines. A titre de comparaison, la teneur en protéines

de la viande est de 16 à 25% et celle du poisson de 14 à 20% (Anonyme b, 2004).

Leur teneur élevée en protéines est le principal atout des légumineuses.

A cet égard, les pois chiches s’en tirent moins bien que le soja, chez qui la proportion de

protéines atteint 39% des calories. Les pois chiches n’atteignent que 23%, mais cela

reste le double de ce que peuvent offrir les céréales, et plus que ce que l’on trouve dans

la viande.

En ce qui concerne l’acide aminé essentiel, la méthionine, la prétendue «valeur

biologique» de la protéine alimentaires activent la digestion, et la lécithine, un élément

important du métabolisme contenu dans toutes les légumineuses, diminue le taux de

graisse dans le sang et fortifie les nerfs. Différentes vitamines essentielles, comme

celles du groupe B – en particulier l’acide folique – et des sels minéraux comme le fer,

le potassium, le calcium, le magnésium et le phosphore, de même que divers oligo-

éléments, (Tableau n°01).

Les rumeurs persistantes selon lesquelles les légumineuses feraient grossir, sont comme

dans le cas des pommes de terre fausses. Si l’on excepte le soja, la part de graisse

contenue dans ce type d’aliments est minime. Dans le cas des pois chiches elle se monte

à 4%. Le fait qu’il s’agisse d’acides gras insaturés et qu’il ne s’y dissimule pas de

cholestérol, et plus encore, le fait que les pois chiches contiennent des saponines qui

influence positivement le taux de cholestérol, tout cela parle en faveur de cette

légumineuse. Elle présente un intérêt particulier pour les diabétiques, car elle fait

grimper moins vite le taux de sucre sanguin que les autres aliments riches en glucides

(BAUMGARTNER.A, 1998).


4

1.1. a- Valeur nutritive par 100 g comestibles :

Tableau n° 01 : Table de composition des aliments (BAUMGARTNER.A, 1998)

1.2. Production internationale

D’après les statistiques de la FAO, la production mondiale annuelle de pois

chiche et la superficie récoltée sont restées relativement stables entre 1961 et 2003, la

première avoisinant les 7 millions de tonnes et l’autre les 10 millions d’hectares. Les

principaux pays producteurs sont l’Inde, la Turquie, le Pakistan, la Canada, le Mexique

et l’Australie.

Energie (kcal) 275

Eau (g) 10.4

Protéines (g) 20.0

Graisse (g) 4.4

Glucides (g) 48

Fibres alimentaires (g) 15

Sodium (mg) 30

Potassium (mg) 700

Calcium (mg) 140

Phosphore (mg) 350

Magnésium (mg) 130

Fer (mg) 7

Vitamine A (μg) 30

Vitamine B1 (mg) 0.50


Niacine (mg) 1.5


Vitamine B9 [acide folique] (μg) 180

Vitamine C (mg) 4


5

Tableau n° 02: Bilan de production de pois chiche dans le monde durant la période

(2002-2007) (Skypertz, 2006).

Monde. Bilan de pois chiche

Année 2002-2003 2003-2004 2004-2005 2005-2006

ep

2006-2007 p

Superficie

récoltée (Kha)

9 900 10 925 10 545 10 710 10 800

Rendement

moyen (t/ha)

0.72 0.80 0.79 0.82 0.80

……………..milliers de tonnes……………

Stocks de report (e)

400 100 400 300 500

Production :

Inde

Turquie Pakistan

Australie

Iran Mexique

Mayanmar

Canada

Ethiopie Irak

Etats-Unis

Syrie Espagne

Maroc

Autre Production totale

Production totale

Kabuli (e)

Production totale Desi (e)

Offre totale

Utilisation totale (e)

Stocks de fin de

compagne (e) Rapport

stocks/Utilisation

4 240

650 362

139

300 235

212

156

187 97

38

89 70

51

253 7 085

2 103

4 982

7 485

7 385

100

1%

5 720

600 675

186

310 240

228

68

114 104

20

87 51

43

275 8 721

1 885

6 866

8 821

8 421

400

5%

5 470

620 611

123

310 240

230

51

136 100

27

45 57

42

271 8 333

1 871

6 462

8 733

8 433

300

4%

5 650

610 868

138

310 240

230

104

135 95

49

55 10

42

288 8 832

1 914

6 918

9 132

8 632

500

6%

5 700

610 400

304

280 240

230

163

135 100

67

55 40

40

286 8 650

2 005

6 645

9 150

8 650

500

6%

e : estimation d’AAC, septembre 2006 ; ep : estimation provisoire

p : prévision d’AAC et de Pulse Australia, septembre 2006 ; Source : FAO, India. Department of Agriculture. ABARE. Pulse Australia.USDA et Statistiques Canada.


6

1.3. Place du Pois chiche en Algérie :

Le pois chiche (Cicer arietinum L) est, en Algérie, la seconde légumineuse

alimentaire produite après les fèves. Sa culture a connu, durant la décennie 1980-90 une

certaine évolution progressive sur le plan des superficies et de la consommation et une

évolution régressive en terme de productivité (Anonyme d, 1994). Les causes de la

faiblesse de la productivité du pois chiche en Algérie sont souvent d’ordre agro

techniques liées aux conditions de semis (période, modes de semis, qualité de la

semence) et à l’infestation par les adventices (Hamadache et Ait Abdallah., 1998).

Tableau n° 03 : Récapitulatif des superficies, des productions, des rendements et

des taux d’accroissement 2005/2006 (Ministère de l’Agriculture).

2005 2006 Taux d’accroissement% 2005-2006

Sup

(ha)

Prod (q) Rdt

(q/ha)

Sup

(ha)

Prod (q) Rdt

(q/ha)

Sup Prod Rdt

Pois-

chiches

23 348 137 270 5.9 21 252 127 058 6.0 -9 -7 2

1.3.1Production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran :

Selon la direction des services agricole (service statistique) :

Tableau n° 04 : Production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran.

Année 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Superficie

(hectare)

140 202 96 82.5 114 181

Production

(quinto)

1325 970 598 195 880 /


7

1.3.2 Prévision de la production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran :

Tableau n° 05 : Prévision de la production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran.

Année 2011 2012 2013 2014

Superficie

(hectare)

116 185 187 188

Production

(quinto)

1180 1300 1400 1500

1.4. Historique et origine :

Le pois chiche est parmi les premières légumineuses à graines domestiquées par

l’homme depuis l’antiquité (Van Der Maesen., 1987). Les premières traces

d’utilisation du pois chiche comme aliment remontent à environ7000 ans. Il aurait été

cultivé pour la première fois dans la région méditerranéenne il y a 5000 ans.

Le pois chiche est originaire du Moyen-Orient, plus précisément du sud-est de la

Turquie et de la Syrie (Saxena, 1984 ;Smithson et al., 1985 ; Singh, 1997). Il arriva

sur les côtes du bassin méditerranéen après avoir traversé de nombreux pays et les

Phéniciens pourraient être à l’origine de cette diffusion (BAUMGARTNER.A, 1998).


8

1.5. Classification classique:

Selon : Bedard et al, 2005, la classification du Pois chiche est la suivante :

Le pois chiche

Règne Plantae

Sous-règne Tracheobionta

Division

Magnoliophyta

Classe

Magnoliopsida

Sous-classe Rosidae

Ordre Fabales

Famille Fabaceae

Genre

espèce

Cicer

arietinum

http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A8gne_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Plante

http://fr.wikipedia.org/wiki/Sous-r%C3%A8gne

http://fr.wikipedia.org/wiki/Tracheobionta

http://fr.wikipedia.org/wiki/Division_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Magnoliophyta

http://fr.wikipedia.org/wiki/Classe_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Magnoliopsida

http://fr.wikipedia.org/wiki/Sous-classe_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Rosidae

http://fr.wikipedia.org/wiki/Ordre_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fabales

http://fr.wikipedia.org/wiki/Famille_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fabaceae

http://fr.wikipedia.org/wiki/Genre_(biologie)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Cicer


9

1.6 Etude générale de la plante :

Le pois chiche est une légumineuse annuelle, autogame, herbacée

(Summerfield et Robert, 1985). C’est une plante haute de 20 à 50 cm, à port dressé,

cultivée pour ses graines rondes contenues au nombre de 1 ou 2 dans des gousses

(Photo n° 01) .Cicer arietinum est la seule espèce annuelle cultivée (Summerfield et

al, 1984 ; Van Der Maesen, 1987 ; Giller., 2001).

Le semis du pois chiche se fait au printemps dans la région Nord

méditerranéenne.

Les besoins en humidité dans le sol de la plante sont de 15- 40% pendant la germination

et le développement de la graine ; l’humidité excessive du sol à la floraison réduit le

rendement en grain (Wery et al, 1994).

Photo n° 01

le pois chiche, Cicer arietinum L. : tige feuillue (A), feuille composée de 16 folioles

(B), fleur zygomorphe (C), étamines, pistil et ovaire (D), gousses en

développement (E), graines (F). (Zohary et Hopf, l988).


10

1.7. Types de cultures :

On distingue 2 groupes principaux : les types kabuli et les types Desi ; il existe

également des cultivars intermédiaires. Les variétés de type Dési sont d’origine

Méditerranéenne (Wang et al., 2005) et présentent environ 85% du pois chiche cultivé,

elles ont habituellement de petites graines, angulaires, de couleur foncée, des fleures

rose et la pigmentation d’anthocyanine sur les tiges (Ahmed et al., 2005).

Les types Kabuli, d’origine Indienne (Wang et al, 2005), qui couvrent les 15%

restant des superficies, sont caractérisés par des grandes graines lisses, un manque de

pigmentation d’anthocyanine et leurs fleures sont blanches (Ahmed et al., 2005) (voir

Photo n° 02).

Photo n°02

types de Graines de pois chiche : type Kabuli- (gauche) et type Desi- (droite)


11

2. La maladie de l’anthracnose :

2.1. Impact économique :

Cette maladie a été décrite en Pakistan par Buttler (Nene et Reddy1987).

L’anthracnose dû exister avant puisque le pois chiche est une ancienne culture dans le

subcontinent Indien. Depuis, elle a été décrite dans la plupart des pays où la culture y

est pratiquée (Nene et Reddy,1987).

Cette maladie et sa capacité destructive fait qu’elle est devenue très répondue dans

plusieurs pays produisant cette culture.

2.2. Symptômes :

La maladie affecte toutes les parties de la plante et ce, durant tout le cycle végétatif

de l’hôte (Reddy, 1984). Les plantules provenant de semences contaminées montrent

des lésions brunes foncées au niveau du collet.

Sur les feuilles nouvellement formées, des petites taches blanches et nécrotiques

apparaissent en conditions favorables. Ces lésions s’étendent rapidement et s’unissent

causant le brunissement des bourgeons.

Sur feuilles âgées, les lésions sont arrondies ou allongées avec un centre gris et des

marges brunâtres.

Les pycnides apparaissent comme des points noirs arrangés en cercles

concentriques.

Les graines produites dans ces gousses infectées présentent des lésions brunes

foncées.

Quand les gousses sont atteintes dans leur jeune stade de développement, elles

deviennent brunes et ne produisent pas de semence, ou produisent alors des graines

sombres et ratatinées (Reddy, 1984).

Sur tiges et pétioles, les lésions sont brunes et allongées (3 à 4 cm), les pycnides

en forme de points noirs entourent souvent la portion affectée. Quand les lésions

entourent la tige, la portion de dessus meurt rapidement (Reddy, 1984).


12

2.3. Epidémiologie :

Les facteurs climatiques conditionnent l’importance de l’attaque du parasite.

Aucune attaque ne peut avoir lieu en dessous de 6°C et ce, quelque soit l’hygrométrie

et pendant les périodes d’humidité inférieures à 6 heures et ce, quelque soit la

température.

La température maximale permettant l’infection est de l’ordre de 30°C ; des

températures entre 15 et 25°C favorisent énormément le développement du pathogène.

En conditions naturelles, les périodes humides prolongées, avec des températures

d’environ 20°C sont très favorables à la propagation de la maladie. Les précipitations

sont le facteur le plus important, et elles déterminent la gravité de l’épidémie ; la pluie

contribue en effet à la réalisation de l’infection puis à la dissémination du parasite et le

vent aggrave la dissémination des spores (Bret, 1990).

La période de latence est définie comme étant le délai qui s’écoule entre

l’infection et l’apparition des premiers symptômes. Elle augmente avec les basses

températures : 5°C-18 jours ; 10°C- 9 jours ; 15°C- 7 jours ; 20°C à 25 jours

(Ameziane, 1985).

Ainsi, pour les températures de printemps qui correspondent à la période de

culture du pois chiche semé au printemps, la période de latence est courte, entraînant les

invasions successives et rapides.

Par contre, pour les semis d’hiver, la période de latence est beaucoup plus

longue, ce qui ralentit l’extension de la maladie (Ameziane, 1985).

Les rapports sur les épidémies de la maladie indiquent l’existence de

mécanismes efficaces pour la survie du champignon d’une saison à l’autre. Les débris

malades et les graines infectées sont une source d’inoculum importante pour l’infection

primaire pour la saison suivante.

Luthra et al en 1935, cité par (Nene et Reddy, 1987), ont été probablement les

premiers à démontrer la nature de la transmission du pathogène par semence. Ils

montrèrent que l’enveloppe de la graine et les cotylédons des semences infectées

contiennent du mycélium.

La propagation de la maladie a été attribuée principalement aux pycnospores

produites par le foyer primaire de l’infection qui opère soit à travers les débris de

récolte, ou les semences infectées. L’inoculum porté par les graines joue un rôle

primordial dans l’épidémiologie de la maladie, nettement plus important que celui

représenté par les débris, car plus que 93% des semences infectées sont capables de


13

produire un foyer d’infection. En condition défavorable pour la maladie, on peut

observer un démarrage rapide des plants affectés pouvant produire raisonnablement

selon la durée de la période de croissance (Nene et Reddy,1987).

2.4. Cycle de la maladie

Puisque la détection des traces d’Ascochyta rabiei à l’intérieur et sur les graines

est difficile, le champignon phytopathogène est facilement dispersé dans et sur les

graines de Pois chiche (Wiese et al., 1996) et constituent en plus des résidus infectés les

moyens primaires de la contamination par ce parasite.

Le champignon phytopathogène produit deux types de spores :

a) Spores asexuées : les spores asexuées les plus courantes sont les conidies qui

sont exsudées du pycnides dans une masse collante et exige les éclaboussures de la

pluie pour les écarter aux plantes environnantes. Ces spores résultent de la reproduction

asexuée du champignon phytopatogène, elles se développent aisément dans les

conditions humides et sont produites dan toutes la période de la saison de croissance.

b) Spores sexuées : La recherche récente en Saskatchewan (Canada) indique qu’un

deuxième type de spores peut se produire et se développe sur les résidus de Pois chiche

infectés. Les ascospores qui sont produites dans des pseudothèces pendant l’hiver

résultent de la reproduction sexuée (Pearse et al., 2005) (voir photo n°03).

Il s’est avéré que les pseudothèces et les pycnides peuvent rester viables pendant

au moins 2 années lorsqu’on les laisse à la surface du sol, mais ils sont seulement

viables 2 à 5 mois après enterrement (Weise et al., 1996).


14

Photo n°03:

Cycle de l’anthracnose du pois chiche causé par Ascochyta rabiei (Pearse et al., 2005).

En hiver les résidus infectés de pois

chiche produisent

de nouvelles spores Les conidies sont le résultat

de la reproduction asexuée

Les ascospores sont le résultat

de la reproduction sexuée

Des lésions entièrement

développées sur la feuille

du pois chiche

Propagation de la maladie par

l'éclaboussure de pluie des spores

pendant la saison de croissance

Les lésions au niveau

d’une gousse

Perte en rendement et en

qualité des semences

Des lésions entièrement

développées sur la tige

du pois chiche

Les premiers signes de

l’anthracnose, des lésions sur

le feuillage du pois chiche


15

2.5. Mécanismes d’infection

2.5.1 Itinéraire d’infection

Ascochyta rabiei pénètre normalement la plante de Pois chiche à travers la

cuticule du feuillet, après germination des spores, l’élongation du tube germinatif et la

formation d’un appressorium comme structure d’infection. La pénétration se produit à

travers les parois des cellules épidermiques, sans envahir le protoplaste le

phytopathogène s’étend dans l’espace intracellulaire entre les cellules épidermiques et

la palissade de parenchyme, procède par les lamelles moyennes dans les tissus de

parenchyme du feuillet par les pétioles à la tige. Le phytopathogène peut également

pénétrer la tige directement par la cuticule à l’intérieur, il s’étend principalement dans le

phloème mais les dommages importants se produisent dans les tissus parenchymateux,

les tissus non lignifiés sont complètement détruits, et les tissus lignifiés (en particulier

xylème) sont également endommagés mais restent structurellement intact (Jayakumar

et al, 2005).

2.5.2. Adhérence et pénétration

L’étape nécessaire dans l’infection par les microbes pathogènes est l’adhérence

aux surfaces des plantes. La première barrière pour le parasite est la cuticule de l’hôte,

toutes les parties aériennes des plantes sont normalement couvertes d’une cuticule. En

plus de la cutine, d’autres éléments principaux structuraux des parois des cellules de la

plante sont les pectines et les xylanes. Les tubes germinatifs du microbe sécrètent un

grand nombre d’exsudats mucilagineux qui produisent un contact serré à la cut icule, cet

exsudat également scelle le site d’infection et protège les tubes germinatifs contre la

dessiccation. L’appressoria d’Ascochyta rabiei est non mélanisé, donc la pénétration de

la cuticule n’est pas probablement due à des forces mécaniques, dans leurs absence, le

taux de pénétration de la cuticule est souvent accompagné par la production d’enzymes

tels que les cutinases, xylanases et les pectinases qui attaquent les parois cellulaires. Les

parois des cellules épidermiques sous les hyphes subcuticulaires sont particulièrement

digérées. Le cytoplasme devient désorganisé et des substances électron-denses

extracellulaires. Cette observation indique que les enzymes de dégradations des parois

cellulaires sont impliquées dans la pénétration (Jayakumar et al, 2005).


16

2.6. Méthodes de lutte :

La méthode de lutte la plus utilisée reste la lutte chimique. Elle concerne le

traitement des semences qui agit sur la phase de transmission de l’agent pathogène des

graines aux plantules et le traitement en végétation qui tente d’éviter la contamination

des gousses et donc des nouvelles graines.

Malgré l’importance de la contamination des semences dans l’apparition de la

maladie, la lutte par des techniques culturales appropriées est à prescrire pour diminuer

l’inoculum primaire.

Aussi, Reddy (1984) préconise le semis à 10 cm, ce mode qui rend l’inoculum

transmis par la semence inaffectif à cette profondeur, comme il préconise également la

rotation, avec l’alternance du pois chiche avec les céréales, et le labour profond pour

prévenir l’inoculum à partir des débris malades provenant des cultures précédentes.

Actuellement l’utilisation de cultivars tolérants à résistants, apparait être le

meilleur moyen pour contrôler la maladie.

Plusieurs sources de résistances ont été relevées chez les types Desi et Kabuli.

Seulement, l’utilisation de variétés résistantes exerce une pression de sélection sur la

population parasite qui conduit à l’apparition de nouvelles races ou pathotypes capables

de contourner cette résistance. En effet, Ascochyta rabiei possède une grande variabilité

pathogénique en raison de l’existence de plusieurs races physiologiques ou pathotypes

(Bedi et Aujla, 1969 ; Vir et Grewal, 1974 ; Reddy et Kabbabeh, 1985 et Labdi,

1990).


17

3. L’agent causal

3.1. Taxonomie et caractéristiques d’Ascochyta rabiei :

3.1.1. Systématique d’Ascochyta rabiei :

Tableau n°06 : Caractères systématiques d’ Ascochyta rabiei (Chadefaud et

Embrger , 1960)

Subdivision

Deuteromycotiana

Mycélium cloisonné, coloré ou hyalin; Cycle incomplet: forme

parfaite non connue. Reproduction asexuée avec formation de

conidies.

Classe

Coléomycétes

Regroupe les champignons se reproduisant asexuellement avec

des appareils sporifères de types pycnides ou acérvules.

Ordre

Sphaéropsidales

Produisant des conidies regroupées en stroma et formant des

pycnides. Libération de spores par des ouvertures de types

ostioles.

Famille

Sphaéropsidacées

Pycnides avec une ou plusieurs cavités, Spores sèches ou

mucilagineuses, hyalines ou de couleur brune, uni ou

pluricellulaires.

Genre

Ascochyta

Conidies hyalines, bicellulaires, ovoïdes ou légèrement

allongées, avec des extrémités arrondies

espèce

rabiei

Agent responsable de l’anthracnose du pois chiche.


18

La forme imparfaite du champignon est caractérisée par la formation de

pycnides visibles sur les lésions portées par l’hôte ; sphériques ou piriformes pourvues

d’un ostiole et mesurant 25µm de diamètre (Sattar, 1933 cité par Nene et Reddy,

1987).

Les hyphes sont hyalins ou bruns et septés. Les pycnides contiennent des spores

portées par de courts conidiophores baignant dans une masse mucilagineuse (cirrhe).

Les conidiospores sont généralement unicellulaires, occasionnellement

bicellulaires, ovales ou cylindriques, droites ou légèrement arrondies à une ou deux

extrémités et hyalines.Kovachevski en 1936 (Nene et Reddy 1987) rapporte une taille

des spores de 6.0 à 16.0 µm x 3.4 à 5.6 µm sur l’hôte et de 4.8 à 14.0 µm x 3.2 à 5.2 µm

sur milieu artificiel. Cette taille serait de 8.2 à 10 µm sur 4 à 5 µm selon (Khunet et

Kpoor ,1980) ou 8.2 à 10 µm sur4.2 à 4.5 µm selon (Nene et Reddy ,1987).

La forme parfaite d’Ascochyta rabiei , Ddymella rabiei (Kovachevski) v. Arx,

appartient à la subdivision des Ascomycotina, à la classe des loculoascomycetes et à

l’ordre des Dothideales (Arx, 1987).

La forme parfaite a été observée en 1936 par Kovachevski et la nomma

Mycosphaerella rabiei Kovachevski. Les périthèces ont été observés uniquement sur

des gousses abandonnées sur le champ durant l’hiver. Ils sont brun-noir globuleux ou

aplatis avec un bec très net et un ostiole, avec une taille variant de 76 à 152 x 120µm

Les asques sont cylindriques, plus ou moins courts, pédicellés mesurant de 48 à 70x 9 à

13.7 µm.

Les ascospores (8 par asque) sont ovoïdes, divisés en 2 ou unicellulaires avec

une constriction au niveau de la cloison, mesurant de 12.5 à 19 x 6.7 µm. La forme

parfaite a également été observée en URSS par Gorlenko et Bushkova en 1958 et en

Grèce par Zachos et al en 1963 in ; (Nene et Reddy,1987).


19

3.2Variabilé d’Ascochyta rabiei

Les études montrent que le champignon Ascochyta rabiei possède une forme

pathogène très variable. L’existence de races physiologiques a été signalée par( Bedi et

Aujla ,1969). Vir et Grewal, en 1974 ont identifié deux races (race 1 et 2) et un biotype

de la race 2. Reddy et Singh en 1983, ont identifié 4 races et 4 biotypes de ces races

suivant les réactions de 18 génotypes différentiels. En 1985, Reddy et Kabbabech ont

défini 6 races physiologiques du champignon selon les réactions différentielles de 6

génotypes de pois chiche.

Une étude sur la vérifiabilité géographique d’ Ascochyta rabiei montre que les

différences de pathogénèse des isolats seraient attribuées plutôt à une variation dans

l’agressivité (Gowen et al., 1989).

Hmidullah et Wiese (1991), dans une étude pour classer 39 isolats en race, ont

détecté 11 formes de virulences ; 9 des isolats ressemblaient aux 6 races de

l’I.C.A.R.D.A et seraient très virulents. Ils conclurent que la population d’ Ascochyta

rabiei dans la pelouse est composée de formes différentes de virulences.

L’existence d’une interaction différentielle entre les 6 races d’I.C.A.R.D.A et

des lignées de pois chiche n’a pas été complètement confirmée par l’étude de Labdi

(1995), qui montre que celle-ci est plutôt du type non spécifique. Il classe les 6 races en

deux groupes de pathogénie (race 6-4 et 1-5-2-3) dans les quelles l’agressivité est plus

prépondérante que la virulence.

En plus, les lignées ont une résistance incomplète et sont sensibles aux

conditions de l’environnement, ce qui a rendu difficile la mise en évidence des

comportements différentiels stables.


20

3.3. Résistance du pois chiche à Ascochyta rabiei :

3.3.1. Sur le plan génétique:

Il existe des cultivars de Pois chiche avec des niveaux variés de résistance ce qui

montre que la génétique de la résistance à Ascochyta rabiei est polygénique ainsi

différents degrés de résistance face au pathogène (Mohamed Bachir, 1984). La

résistance polygénique non spécifique est nettement plus difficilement contournable par

les parasites.

Selon (Peters et Tahiri, 1986), la résistance peut être estimée sur différents

organes et à différents stades de développement de la plante. Selon les mêmes auteurs, il

existe parfois des variations entre la résistance au stade végétatif et la résistance au

stade producteur, ce qui indique que plusieurs facteurs peuvent participer à la résistance

à l’anthracnose. Ces résultats ont été confirmés plus tard par (Labdi ,1995) qui a montré

que cette résistance peut être partielle, s’exprimant différemment selon les stades

physiologiques de la plante et régresserait après le stade floraison. Elle serait de nature

récessive, sous le contrôle de 2 à 4 gènes, et serait déterminée par des gènes différents

selon les stades physiologiques.

3.3.2. Sur le plan pathologique :

Vir et Grewal (1974) font apparaitre une forte corrélation positive entre les

attaques sur tiges et feuilles des variétés sensibles, mais non sur les variétés résistances.

Chez ces derniers, les feuilles sont très peu attaquées par rapport aux tiges. Ils concluent

que l’attaque de la tige est un critère plus approprié pour les classements des variétés

(Ameziane, 1981). Sattar (1933) considère qu’une sécrétion élevée d’acide malique de

par les feuilles au stade floraison-fructification, favorise l’infection


Par contre (Hafiz ,1952) trouve que le cultivar F8 secrète plus d’acide malique

qu’un cultivar sensible (Pb-7) et que l’acide malique est un inhibiteur de la germination

des spores et du développement du tube germinatif. Une autre étude menée à

ICRISTAT, n’indique pas de différence dans la germination de spore et le

développement du tube germinatif dans les exsudats des cultivars résistants et sensibles



21

Hafiz (1952) ne trouve pas de différence d’épaisseur de la cuticule entre les

types résistants et sensibles, mais l’acidité de la sève du type résistant est plus élevée

comparée à celle du type sensible. La même année, (Ahmed et al., 1952) signalent un

nombre de poils par unité de surface au niveau de la tige et de la feuille plus élevé et

plus ramifié chez le type résistant par rapport aux types sensibles.

3.4. Détection des activités enzymatiques chez Ascochyta rabiei :

Ascochyta rabiei se comporte comme un parasite nécrotrophe : il provoque à

distance une macération procédée par des réactions des noyaux et par des modifications

de la perméabilité cellulaire. L’étude des modalités de résistance d’un cultivar de Pois

chiche a mis en évidence une action pectinolytique et une dégradation de la cellulose

plus évidente dans les tissus vasculaires que dans le parenchyme (Ameziane, 1981).

Une étude sur l’activité enzymatique in vitro d’isolats algériens a révélé la

production d’une gamme d’enzymes de macération en milieu liquide. Ces enzymes sont

du groupe des amylases, des protéases, des polygalacturonases, des pectines

méthylestérases et des cellulases (Tchicha, 1991).

El Biari (1995), dans son étude sur la variabilité morphologique et culturale

d’Ascochyta rabiei , note l’influence positive sur la croissance de la présence de la paroi

cellulaire du Pois chiche comme source de carbone. Il conclue que le champignon est

capable de dégrader les parois cellulaires en sucres simples, probablement en produisant

des enzymes pectinolytiques.

3.5. Variabilité protéique chez Ascochyta rabiei

les protéines sont les moyens d’expression de l’information génétique

(Lehninger,1985). Il existe un très grand nombre de protéines différentes dans

l’organisme, chacune assurant une fonction spécifique déterminée par son gène.

Les difficultés de caractérisation de la variabilité des organismes à partir des

seuls critères morphologiques, ont conduit à l’utilisation de l’électrophorèse des

protéines.



22

1. ETUDE MORPHOLOGIQUE :

1.1-Echantillonnage :

Notre travail a été effectué avec des souches d’Ascochyta rabiei isolées de

l’Ouest algérien (Témouchent et Sidi bel Abbes) de plantes présentant des symptômes

de l’anthracnose.

Photo n° 04 :

Plantes de Pois chiche présentant les symptômes de l’anthracnose

1.2-L’isolement et la purification :

L’isolement est effectué à partir des organes aériens frais (feuilles, tiges et

gousses), par la méthode décrite par (Grewal, 1984), les plantes sont rincées à l’eau

courante afin de les débarrasser de leurs débris de terre. Après lavage les tiges ont

Feuilles mortes

Nécrose au niveau de la gousse

Nécrose au niveau de la tige


23

été découpées (sauf les graines et les feuilles) en fragments de 1 à 2 cm sur les fronts

d’attaques et désinfectées superficiellement par trempage dans une solution diluée de

l’eau de javel à 2% pendant 3 à 5 mn. Les fragments ont été ensuite rincés trois fois à

l’eau distillée stérile.

Une fois séchés avec du papier stérile trois fragments sont déposés dans des

boîtes de pétri contenant le milieu de culture à base de pois chiche gélosé (Annexe), et

mis en incubation. Dés l’apparition des filaments mycéliens autour des petits fragments,

nous procédons à la recherche d’Ascochyta rabiei par l’observation microscopique, une

fois l’identification primaire est établie, nous procédons au repiquage successif pour

obtenir des souches pures.

Les champignons isolés sont fréquemment contaminés par des bactéries et d’autres

champignons. Ceux ci restent parfois invisibles et modifient les caractères et le mode de

croissance des colonies recherchées. Afin d’éviter ce risque, le procédé le plus simple et

le plus sûr reste celui de la culture monospore.

1.3. Conditions d’incubation :

L’incubation s’effectue dans la chambre d’incubation à 22°C sous une

photopériode de 12 heures.

1.4- L’obtention des Cultures monospores :

Afin de travailler avec des souches génétiquement homogènes, nous avons

réalisé une culture monospore (Rappily, 1968 ; Zerrouk, 1994). Pour cela, nous avons

préparé une suspension de spores, en prélevant un explant à partir de la marge d’une

culture âgée de 10 jours sur milieu pois chiche solide, puis 1 ml de cette suspension est

déposée et étalée sur boîte de Pétri contenant milieu gélose à 2% (Annexe). Après 24h

d'incubation à l'aide d'une loupe binoculaire, les conidies germées sont repérées puis

délimitées d'un cercle d'environ 2mm, et à l'aide d'une aiguille stérile, nous avons

prélevé la conidie et la déposé sur boîte de Pétri contenant milieu pois chiche gélosé

(Zerrouk, 1994).


24

1.5- La conservation des isolats :

Les cultures purifiées sont conservés dans des tubes à essai inclinés contenant

le milieu pois chiche gélosé (Annexe), la conservation est effectuée à 4°C pour des

utilisations ultérieures (Rapilly , 1968).

1.6- L’étude macroscopique :

Ce type de caractérisation est basée essentiellement, sur l'aspect cultural de la

croissance des isolats sur des milieux artificiels, elle est envisagée pour la distinction

entre les isolats d’Ascochyta tout en se basant les critères suivantes ; la

pigmentation , l’aspect du mycélium , la vitesse de croissance, et l’abondance des

pycnides (Punithalingam et Gibson, 1976 ; Maufras, 1996).

1.7 - L’étude microscopique :

Cette étude se rapporte aux critères microscopiques des isolats, nous avons

préparé un frottis à partir d’un fragment mycélien âgées de 15 jours, ensuite une

observation microscopique des pycnides et des picnydiospores a été effectuée.

Pour voir la structure intacte du champignon, on passe par la culture sur milieu CLA

(qui est un milieu à substrat naturel contenant un morceau de la feuille d’œillet qui

favorise la sporulation) (Synder et al., 1947 ; Fisher et al., 1982).

Les petits morceaux de feuilles d’œillet sont préparés à partir d’une collecte de

cette plante d’œillet fraîche non traitée par des fongicides ou d’insecticides. Les feuilles

collectées sont découpées en petits morceaux de 5-8 mm2

(ils se rétrécissent après

séchage), puis séchés dans un four (~70 °C) pendant 3 à 4 heures, ils peuvent être

séchés aussi dans une micro-onde. Le stockage de ces petits morceaux se fait dans un

endroit sec de température ambiante jusqu’à 12 mois avant usage

(Leslie et Summerell, 2006).

Une bouture mycélienne est placée à côté de cette feuille d’œillet stérile, le tout,

dans une boîte de Pétri contenant le milieu Gélose 2%.

Après environ 3 à 4 semaines, nous avons pu observer nettement sous le

microscope, le mycélium cloisonné et les pycnides ainsi que les pycnidiospores

(monocellulaire et bicellulaire).


25

2. ETUDE ENZYMATIQUE

2.1 Croissance mycélienne de toutes les souches

Dans un premier temps, nous avons débuté cette étude par la sélection de la

souche la plus protéolytique en mesurant le diamètre de croissance des 14 isolats sur

trois différents milieux solides (Milieu Czapeck glucose additionné à la caséine à 1%,

milieu Czapeck caséine et milieu Czapeck glucose) (annexe), et cela pendant 10 jours

d’incubation.

Ces mêmes conditions de cultures ont été utilisés en milieu liquide (Czapeck

glucose caséine, Czapeck caséine et Czapeck glucose) pour suivre l’évolution de

l’activité protéolytique de la souche sélectionnée et cela aux différents pH (4, 6 et 8).

Pour le milieu liquide, durant les 10 jours d’incubation nous avons vérifié : le

poids du mycélium et le pH du filtrat.

Vérification du poids :

Pour le faire, nous avons récupéré le mycélium, après filtration sur papier filtre

le mycélium a été mis à sécher, puis pesé.

Vérification du pH :

Après avoir récupéré le filtrat, nous mesurons le pH.


26

2.2- Evaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans le

surnageant de culture :

L’activité protéolytique exprimée dans les filtrats de cultures (extrait

enzymatique) de chaque jour d’incubation a été évaluée en milieu solide (caséine

gélosé) (annexe) par la méthode des puits. Elle est réalisée par le dépôt de 100µl au fond

des puits préalablement réalisés sur la gélose à la caséine à 1%. Elle est exprimée après

24h d’incubation à 37°C par l’apparition de zones claires autour des puits.

2.3- Dosage de l’activité protéolytique à l’UV :

La solution enzymatique est récupérée chaque jour par une filtration et cela

durant les 10 jours d’incubation.

La caséine est dissoute à 5% dans tampon Tris-Hcl à 0.1M à pH 9.

Pour la solution test :

150 ml de la solution enzymatique est ajoutée à 50 ml de la solution caséine, le

mélange est mis à incuber à 60°C pendant 30 min. La réaction est stoppée par l’addition

de 600ml de TCA à 10% suivie par une centrifugation à 8000 g pendant 10 min pour

précipiter es protéines.

Pour le blanc, le TCA est ajouté avant la solution enzymatique, puis nous

suivons les mêmes procédures que celles de la solution test.

La lecture est effectuée par le spectrophotomètre à l’absorbance λ 280 nm

(Abidi et al., 2008).


27

3. ETUDE DU POUVOIR PATHOGENE :

3.1. Les milieux de culture

L’inoculum a été préparé sur milieu Czapeck glucose gélosé (annexe). Le milieu

est coulé dans des boites de Pétri de 9cm de diamètre à raison de 18ml chacune. Les

boites sont ensemencées pour la production d’inoculum et mises à incuber.

3.2. Conditions d’obtention des plantules

Les variétés du pois chiche utilisées (Benadla et Akim) sont fournies par Institut

National de la Recherche Agronomique Algérienne (INRAA) de Sidi Bel Abbes. Les

graines sont prétraitées à l’hypochlorite de sodium à 5% pendant 5mn puis rincées dans

3 bains successifs d’eau distillée stérile.

Ces graines sont mises à pré germer dans des boites de Pétri contenant deux

feuilles de papier buvard stériles imbibées d’eau distillée stérile, puis incubées à 22°c

pendant 5 jours.

Les graines pré germées (photo n°05), sont semis individuellement dans des

petits pots (photo n° 06), les plantules sont ensuite transplantées à raison de 03 graines

par pot et par isolats (pots contenant un mélange quantité terreau, quantité sable)

(photo n° 07). Le mélange est stérilisé avant son utilisation. Elles sont arrosées deux

fois par semaine, une fois avec l’eau distillée et la deuxième fois avec la solution KNOP

(Annexe).

A l’âge de dix jours, les plantules sont prêtes pour passer au test du pouvoir

pathogène.

La température moyenne de la serre est de 30 °C avec des fluctuations de

25 °C à 35 °C durant la période de l’expérimentation.


28

Photo n°05 : Photo n° 06 :

Pré germination des graines Germination des graines

Photo n° 07 :

Plantes de pois chiche saines âgées de 10 jours avant l’inoculation.


29

3. 3. Préparation de l’inoculum

La méthode utilisée est celle décrite par El Biari (1995), qui consiste à préparer

l’inoculum par addition de 5 ml d’eau distillée stérile sur des cultures fructifiées. Les

pycnidiospores sont libérés dans l’eau par grattage avec une pipette Pasteur courbée,

puis la suspension de spores est filtrée sur papier filtre stérile (la souche est âgée de 10

jours).

La concentration en spores est estimée à l’aide d’une cellule de Malassez, puis

ajustée à 106 spores/ml d’eau distillée stérile.

3.4. Inoculation des plantes

La pulvérisation de l’inoculum est réalisée à l’aide d’un pulvérisateur sur

toutes les parties aériennes de la plante pour régénérer son pouvoir pathogène. Toutes

les dispositions sont prises pour que chaque plante reçoit le même volume de

l’inoculum .

Les pots contenant les plantes sont ensuite recouverts d'un film plastique

transparent durant les soixante douze (72h) heures qui suivent l'inoculation

(Labdi ,1990).

Des pulvérisations légères d’eau sont poursuivies plusieurs fois par jour même

après avoir enlevé le film plastique de façon à maintenir une humidification continue

des organes aériens des plants afin de faciliter la germination des spores

(Bouznad, 1989).

Les plantes témoins sont pulvérisées avec de l’eau distillée stérile.

Photo n°08 :

Plantes de pois chiche inoculées avec une suspension sporale

de la souche A31 recouvertes d’un sac en plastique


30

Tableau n° 07 : Echelle quantitative à 9 points pour la notation des réactions du pois

chiche à l’anthracnose (d’après Reddy et al, 1984)

Note Pourcentage de

bourgeons

morts

Pourcentage

des feuilles

infectées

Pourcentage

des tiges avec

lésions

Pourcentage de

tiges cassées

Types de

réaction

1 0 0 0 0 Résistant

2 0 1.0 0 0 Résistant

3 0 – 2.5 5.0 80.0 5.0 Résistant

4 0 – 5.0 20.0 80.0 15.0 Résistant

5 10.0 40.0 100.0 40.0 Modérément

sensible

6 25.0 50.0 100.0 50.0 Modérément

sensible

7 40.0 75.0 100.0 75.0 Sensible

8 100.0 90.0 100.0 100.0 Sensible

9 Plantes complètement malades Très sensibles

3 .5. Réisolement du parasite :

Dès que les symptômes de l’anthracnose apparaissent nous passons au

ré isolement du parasite à partir des plantes testées par la méthode décrite par

(Grewal, 1984).

La recherche du parasite dans les plantes infectées a pour objectif de montrer la

capacité du champignon à pénétrer dans les plantes et de s’assurer que les symptômes

notés sont dus au parasite. Le champignon est recherché dans la tige de chaque plante.


31

4. ETUDE DU PROFIL PROTEOLYTIQUE TOTAL

4 .1. Préparation des extraits enzymatiques pour le dosage des protéines totales des

isolats

4 .1. 1. Culture du champignon

Des Erlenmeyers contenant 50 ml de milieu Gyp liquide (annexe) sont

ensemencées par 10 fragments mycéliens (de 6 mm de diamètre), prélevés de la zone

de croissance à partir d’une pré culture du champignon âgée de 10 jours sur milieu PC

solide et sont mis à incuber.

4 .1. 2. Obtention des extraits enzymatiques

Après 10jours, le mycélium est récupéré après filtration du milieu de culture à

l’aide d’une passoire stérile. Il est ensuite broyé dans un mortier maintenu au froid dans

de la glace, additionné du sable fin (le sable est lavé à l’acide sulfurique, rincé et lavé à

l’eau distillée, séché dans le four Pasteur) et du Tampon Phosphate (0,1 M - pH 7,1)

(P/P/V), jusqu’à l’obtention d’une pâte fine et homogène. Le broyât est récupéré dans

des tubes puis centrifugés à 10 000 g pendant 20 minutes dans une centrifugeuse

réfrigérée (4 °C).

Le surnageant est réparti rapidement dans des tubes Eppendorf par fraction de

100 µl. Il peut être utilisé directement pour l’électrophorèse, comme il peut être

conservé au congélateur.

Pour déterminer la concentration des protéines dans l’extrait enzymatique de

chaque échantillon, nous suivons la méthode de Bradford.

4.2 Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford :

La méthode Bradford (1976) consiste à une coloration des protéines par le Bleu

de Coomassie G250.

L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des protéines et

le maximum d’absorption est situé à λ 595nm.

Pour les dosages, il faut établir une courbe d’étalonnage. Elle est réalisée à partir

du SBA dont la solution mère est de 1mg/ml.

A partir de cette dernière, une série des solutions filles est préparée.


32

Tableau n° 08 : Dilutions de la courbe d’étalonnage.

Dilution 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 blanc

SBA (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 /

Eau distillée (µl) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 200

Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Pour déterminer la concentration en protéines dans les extraits enzymatiques,

nous prenons 100µl de chaque extrait, puis nous ajoutons 2ml du réactif de Bradford.

Après agitation au vortex et un petit moment de repos, la lecture se fait à λ 595nm

contre le blanc de la gamme. A la fin, nous extrapolons les densités optiques obtenues

sur la courbe d’étalonnage pour obtenir la concentration en protéines dans chaque

extrait enzymatique.

4.3- Electrophorèse des protéines totales par le système (SDS-PAGE) :

Une analyse quantitative des protéines solubles est effectuée par

électrophorèse sur gel polyacrylamide en conditions dénaturantes SDS-PAGE

(Lammli, 1970), où les molécules sont séparées uniquement en fonction de leur

masse molaire ( Lafont, 2005).

4.3.1-La préparation d’un gel (SDS-PAGE):

Cette méthode consiste à utiliser deux gels superposés de concentration et

de pH différents (annexe).

Le gel supérieur appelé gel de concentration, permet de concentrer la solution en

protéines en une fine bande , tandis que le gel inférieur est le gel de séparation

permettant de séparer les différentes protéines.

La polymérisation est déclenchée avec du persulfate et temed; il faut agiter

délicatement et dégazer avant d’ajouter le persulfate d’ammonium (Annexe).


33

4.3.2 La dénaturation des échantillons :

Nous avons réparti dans des tubes neufs des extraits protéiques et tampon de

dénaturation (tampon de charge) (Annexe) à raison de 80 µl, puis nous avons porté les

échantillons à ébullition dans un bain-marie pendant 5 minutes.

4.3.3 La révélation des protéines totales :

Après une migration complète et un démoulage du gel , ce dernier est fixé

puis coloré afin de visualiser les bandes protéiques.

Le gel subit ensuite une décoloration effectuée par plusieurs rinçages avec la

solution de décoloration (annexe).



34

1. ETUDE MORPHOLOGIQUE DES ISOLATS :

1.1 .Isolement :

L’isolement à partir les parties aériennes des plantes présentant les symptômes

de l’anthracnose récoltées de différentes régions, nous a permis d’obtenir 14 souches

(tableau n°09). Un exemple est donné dans la (photo09).

Tableau n° 09 : Origine des souches d’Ascochyta rabiei isolées des différents

sites de l’Ouest Algérien

Référence de la souche Site du prélèvement Partie d’isolement

A 1 Aïn Témouchent La tige

A 6 Sidi Bel-Abbès La gousse



A 17 Aïn Témouchent La gousse

A 20 Sidi Bel-Abbès La tige

A 22 Aïn Témouchent La gousse




A35 Sidi Bel-Abbès La gousse


A40 Sidi Bel-Abbès La tige

A 45 Aïn Témouchent La tige

1.2. Les caractères macroscopiques :

L’observation macroscopique de la nature du mycélium des isolats a révélé

quelques différences au niveau de la pigmentation qui varie entre noire ,marron

foncé et marron clair.

Les colonies mycéliennes d’Ascochyta rabiei ont un développement

relativement long, elles sont d’abord crémeuses , puis prennent des teintes

extrêmement variées selon les isolats et les milieux (vert clair, vert foncé, brun).


35

Après repiquage, elles présentent généralement des cercles concentriques très

caractéristiques (photo10).

Photo 09 : Isolement d’Ascochyta rabiei à partir des tiges.

Mycélium

d’Ascochyta rabiei

A


36

Photo010:

Aspect macroscopique de quelques souches d’Ascochyta (A) et la souche A31 (B) sur le

milieu pois chiche gélosé

1.3. Les caractères microscopiques :

L’observation microscopique des isolats d’Ascochyta rabiei par la culture sur

milieu CLA est caractérisée par la présence des pycnides, pycnidiospores.

Le stade imparfait est caractérisé par la formation des pycnides (organes

de fructification du champignon) , apparaissant sous forme de points noirs visibles

à l’œil nu .Les pycnides sont tapissés intérieurement de conidiophores très courts

portant des conidies ou pycnidiospores ovales à allongées , droites ou légèrement

courbées sur les deux extrémités, hyalines , non cloisonnées (photo11).

B


37

Photo11:

Observations au microscope optique des pycnides d’Ascochyta rabiei au grossissement

(X 400).

A : Eclatement d’une pycnide d’Ascochyta rabiei et libération des spores.

B: pycnidiospores :

-1 : pycnidiospore monocellulaire

-2 : pycnidiospore bicellulaire

1.4. Conservation des isolats :

Photo12:

Conservation des souches dans des tubes à essai contenants milieu pois chiche incliné

A B

2

1

3.7µm 3.7µm


38

2. ETUDE ENZYMATIQUE :

2.1. Croissance mycélienne de toutes les souches sur différents milieux:

Dans le but de sélectionner une souche exprimant une activité protéolytique la

plus élevée, nous avons suivi et comparé la croissance de l’ensemble des souches dans 3

différents milieux de culture, il s’agit de milieu Czapeck-glucose additionné de 1% de

caséine (Cz-glu-cs), le milieu Czapeck à 1% de caséine (Cz-cs) et le milieu Czapeck-

glucose( Cz-glu). Les diamètres de croissance ont été mesurés pendant 10 jours

d’incubation.

Les résultats obtenus montrent que la souche A31 présente une croissance

mycélienne la plus élevée en comparaison avec l’ensemble des souches, fort

probablement qu’elle dispose d’un équipement enzymatique performant qui lui a permis

d’utiliser les substrats retrouvés dans les différents milieux, et ceci justifie notre choix

pour cette souche (A31) pour le reste de notre travail.

Figure 01

Représentation du développement de toutes les souches sur différents milieux :

Czapeck-caséine-glucose, Czapeck-glucose et Czapeck-caséine.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45

diamètres en cm

souches

Croissance de toutes les souches sur différents milieux

10jcz cs glu

10jcz cs

10j cz glu

*


39

Photo 13

Aspect du mycélium de la souche A31 sur milieu Czapeck-glucose-caséine.

L’exemple donné dans la présente photo montre l’aspect morphologique après

15 jours d’incubation de la souche A31 sur milieu Czapeck-glucose additionné de 1%

caséine. Nous avons enregistré une légère différence de l’aspect morphologique par

rapport à celui obtenu par la même souche sur le milieu pois chiche. Cette différence

est relevée au niveau de la couleur et la zonation des cercles concentriques du

mycélium de cette souche.


40

2.2. Etude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31 dans le

surnageant de culture de différents milieux et à différents pH :

- a. Dans le milieu Czapeck glucose additionné de la caséine

- b. Dans le milieu Czapeck glucose

- c. Dans le milieu Czapeck additionné de la caséine

2.2.1. Évaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans le

surnageant de culture.

Nous avons étudié l’expression d’enzymes protéolytiques dans le filtrat de

différents milieux de cultures, (Cz-glu+cs, Cz-glu et Cz+cs) et à différents pH de la

souche sélectionnée (A31).

Le filtrat est déposé dans des puits réalisés préalablement dans une gélose à la

caséine. L’activité protéolytique après incubation se manifeste par la formation d’une

zone claire autour des puits dont le diamètre de cette dernière est exprimé en mm (photo

14). Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 2, 4 et 6.

2.2.2. Dosage de l’activité protéolytique exprimée dans le surnageant de culture.

A fin de mieux étudier l’expression d’enzymes protéolytiques dans le surnageant

de différents milieux de cultures (Cz-glu+cs, Cz-glu et Cz+cs) et à différents pH de la

souche sélectionnée (A31) nous avons dosé cette activité à l’UV (λ 280 nm) en utilisant

la caséine comme substrat. L’activité protéolytique exprimée dans le filtrat est exprimé

en pourcentage. Les résultats sont représentés dans les figures 3, 5 et 7.

Photo 14 :

Activité protéolytique exprimée dans le milieu solide

Zone claire de

protéolyse

pH4 pH6 pH8


41

a. Dans le milieu Czapeck glucose additionné de la caséine :

Figure 02

Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de milieu

de culture (Czapeck-glucose+caséine) évaluée en milieu solide (A)


L’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de culture du milieu Czapeck-

glucose additionné de caséine mesuré en milieu solide apparait dès le 4ème

jour

d’incubation (0.5mm de diamètre) et atteint son maximum au voisinage du 10ème

jour

(11 mm de diamètre) alors qu’au pH 8 cette expression enzymatique apparait dès le 3ème

jour d’incubation (2mm de diamètre) et évolue avec des valeurs plus au moins élevées

par rapport au pH 4 et 6.

De la même manière, cette activité protéolytique exprimée dans le filtrat de

culture du milieu Czapeck-glucose additionné de caséine obtenus par le dosage à l’UV

suit globalement le schéma retrouvé préalablement, c’est-a-dire, une augmentation

progressive pour atteindre son maximum au 10ème

jour d’incubation. Cette technique

offre l’avantage au manipulateur d’être plus précise, rapide et moins laborieuse.

B A


42

b. Dans le milieu Czapeck glucose :

Figure 03


de culture (Czapeck-glucose) évaluée en milieu solide (A) et par dosage à l’UV (B).

En présence du glucose et de la caséine, l’activité enzymatique des protéases apparait

au voisinage du 8ème

jour dans les différents pH mais avec une production plus au moins

importante au pH8.

l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de culture du milieu Czapeck-glucose

à différents pH mesurée par les deux méthodes, révèle que cette dernière est exprimée à

des niveaux très faibles en comparaison aux autres milieux ou la caséine est ajouté au

milieu, elle garde le même mode d’ascension que celui de la précédente (Czapeck-

glucose+caséine) car elle apparait au 7ème

et 8ème

jour pour atteint son maximum au

10ème

jour avec des valeurs très faibles, car elle ne représente que le 1/10ème

de ce qui est

enregistré précédemment lors de l’ajout de la caséine au milieu de culture ce qui laisse

suggérer que cette activité protéolytique est fortement liée à la présence de caséine dans

le milieu.

A b


43

c. Dans le milieu Czapeck additionné de la caséine :

Figure 04


de culture (Czapeck-caséine) évaluée en milieu solide (A) et par dosage à l’UV (B).

l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de culture de milieu Czapeck

additionné de caséine à différents pH mesurée par les deux méthodes apparait au

voisinage du 3ème

jour et atteint son maximum au voisinage du 10ème

jour, dans ce cadre

l’expression enzymatique des protéases garde la même cadence que celle enregistrée

dans les précédents cas, mais nous avons enregistré l’apparition d’un pic d’expression

important de cette activité entre le quatrième et le cinquième jour ce qui est totalement

différent des deux autres cas, c'est-à-dire l’absence du glucose dans le milieu de culture,

qui nous laisse penser que le champignon à vraisemblablement emprunté une autre voie

métabolique pour remédier l’absence du glucose dans le milieu par la synthèse d’une

seconde famille de protéase qui agit précocement, ces résultats se concordent avec ceux

trouvés par (Duniesky. M et al., 2003).

Cette activité protéolytique précoce a apparu dans les deux pH (4 et 6), ceci montre

bien qu’il s’agit famille de protéases acides et neutres et ces observations ont été

rapportées par (Kolaczkowska et al.,1980) chez un autre champignon phytopathogène

Fusarium moniliforme qui produit deux protéases acides et neutres.

A la fin d’incubation (10ème

jour) Nous avons remarqué que cette expression

protéolytique est plus importante au pH4, Fort probablement qu’il s’agit de production

de protéases acides. La même observation a été rapporté par (Tremacoldi et al., 2004),

A B


44

qui ont montré que les espèces d'Aspergillus synthétisent des protéases acides, ce même

type protéases est aussi synthétisé par les espèces de Rhizopus (Kumar et al., 2005).

La souche A31 produit des protéases. Ce résultat se concorde avec celui de

(Tchicha, 1990) qui a enregistré que Ascochyta rabiei produit des enzymes dégradant

la paroi cellulaire in vitro dont on peut décrire des des amylases, des protéases, des

polygalacturonases, des pectines mthylestérases et des cellulases. D’autres champignons

sont aussi capables de cette performance tels que Ascochyta pisi, Fusarium oxysporum

f.sp. ciceri, Verticillum alboatrum (Bouznad, 1983 ; Carder et al., 1987 ; Perès et

Tena, 1990).

La présente étude nous a permis de montrer l’influence de la composition du milieu et

les conditions de culture sur la production in vitro d’enzymes protéolytiques qui font

partie d’un ensemble d’équipement enzymatique de ce champignon (Ascochyta rabiei)

pour exercer et induire son rôle pathologique sur la plante hôte

Cela a été illustré par la réponse du champignon vis-à-vis la présence ou l’absence de la

caséine comme substrat et le glucose comme source de carbone. Batemant et Millar

(1966) ont montré que les conditions de culture et la composition du milieu peuvent

influencer nettement sur la production in vitro des enzymes dégradant La paroi

cellulaire que les protéases font partie d’eux.


45

2.3 Evolution du poids du mycélium dans différents milieux et à

différents pH :

a- Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck-glucose ajouté et ou

dépourvu de caséine à pH :4, 6 et 8

Figure 05 :

Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck glucose à pH : 4, 6 et 8 (A): en présence de caséine, (B) en absence de caséine.

Les résultats obtenus montrent que le poids du mycélium dans le milieu Czapeck

glucose (additionné (A) et ou dépourvu (B)) de la caséine à différents pH évolue en

fonction du temps et atteint un poids maximal au 10ème

jour avec des valeurs plus ou

moins importantes dans le milieu à pH6 pour le milieu de culture (a) alors que pour le

milieu de culture (b) les valeurs les plus importantes ont été relevées dans le milieu à

pH4.

Nous avons remarqué aussi que le poids du mycélium évolue lentement durant les

sept premiers jours et par la suite la vitesse d’évolution augmente et le poids atteint une

valeur maximale au dixième jour. Cette augmentation est fortement liée aux niveaux

élevés d’expressions de l’activité protéolytique ce qui renseigne sur l’effet important

que occupe cette activité lors de la croissance de ce champignon, ces résultats rejoignent

ceux enregistrés par (Seed Khan R., 1981) qui a montré l’existence d’une corrélation

entre la croissance du mycélium et l’activité protéolytique chez les Mucor.

B A


46

b- Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck caséine à pH : 4, 6 et 8

Figure 06 :

Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck+caséine à pH : 4, 6 et 8

Les résultats obtenus montrent que le poids du mycélium dans le milieu Czapeck

additionné de la caséine à différents pH évolue en fonction du temps et que les valeurs

obtenues dans le milieu à pH4 sont plus les importantes (5.1 g) par rapport au pH6

(1.2g) et pH8 (0.9).

En premier temps ces résultats semblaient inattendus pour nous (5.1g de poids dans

un milieu dépourvu de glucose alors que le poids du mycélium n’a pas dépassé 3.5g en

présence du glucose). Cependant, en comparant ces résultats avec ceux obtenus dans

l’étude de l’activité protéolytique nous avons remarqué que le poids du mycélium était

plus important quand l’expression protéolytique était aux plus élevés niveaux (voir 2.2.

figure 4). Vraisemblablement que les protéases acides ont agis plus fortement dans ce

milieu de culture.

Nous avons remarqué aussi que la vitesse de l’évolution du poids de mycélium dans

ce milieu de culture à augmenté dans le pH4 après le 4ème

jour là où nous avons

enregistré l’expression protéolytique par une deuxième famille de protéases. Ces

résultats rejoignent ceux cités précédemment montrant l’influence de l’activité

protéolytique sur la croissance de ce champignon.


47

3. Evaluation du pouvoir pathogène des isolats d’Ascochyta rabiei :

La vérification de l’agressivité des isolats utilisés est nécessaire afin de vérifier

la corrélation qui pourrait exister entre le pouvoir pathogène et la capacité à produire

des enzymes métabolites jouant un rôle dans la pathogénèse.

Les résultats obtenus ont montré que les isolats A31 et A10 d’Ascochyta rabiei

utilisés dans ce test attaquent les plantules après quelques jours de l’inoculation, en

provoquant chez celles-ci différents symptômes d’altération, tels qu’u .n jaunissement,

cassure des tiges, nécrose au niveau des tiges et des feuilles jusqu’à la mort totale de la

plante (après 15 jours de l’inoculation)

Les résultats obtenus sont représentés dans la (photo 15).

Les symptômes obtenus sont évalués selon l’échelle à 9 points décrite par

(Reddy et al, 1984). Cette dernière est essentiellement basée sur la réponse de l’hôte et

le développement des symptômes sur les différentes parties aériennes Tableau n° 10.

Pour pouvoir confirmer les symptômes constatés du pouvoir pathogène des souches

A31 et A10, il est nécessaire de passer par le ré-isolement du champignon qui a révélé sa

présence dans les tiges et les feuilles de chaque plantule.

Tableau n° 10: Comportement des hôtes différentiels vis-à-vis de la souche A10 et A31

Hôtes

Isolats

Benadla Akim 91

A31 Modérément sensible sensible.

A10 Modérément sensible sensible.

Photo 15 :

Les différentes étapes du test de pouvoir pathogène

A : Plantules saines avant l’inoculation

B : Le témoin

C : Plantules après inoculation

D : Apparition des symptômes dus à l’isolat A10 sur la variété Akim 91

E : Apparition des symptômes dus à l’isolat A31 sur la variété Benadla


48

F : la mort totale de toutes les plantules inoculées par A10 après 15 jours d’incubation

G : la mort totale de toutes les plantules inoculées par A31 après 15 jours d’incubation

H : Ré isolement à partir des feuilles présentant des symptômes d’anthracnose du à

l’isolat A 31 sur la variété Benadla

I : Ré isolement à partir des feuilles présentant des symptômes d’anthracnose du à

l’isolat A 10 sur la variété Akim 91

A B

C D

Cassure au

niveau de tige

Nécrose au

niveau de la

feuille


49

E F

G

H I

Nécrose

au niveau

de la tige

Mort totale des plantes

Mycélium

d’Ascochyta rabiei


50

4. ETUDE DU PROFIL PROTEOLYTIQUE :

4.1 Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford:

Après la lecture au spectrophotomètre à la longueur d’ondes λ = 595 nm, les

résultats de la densité optique de chaque dilution sont représentés sur le Tableau n°11.

Ils seront par la suite reportés sur la Figure n°16 qui constitue la courbe d’étalonnage

D.O. = f (concentrations).

La concentration en protéine dans chaque échantillon d’extrait enzymatique, est

calculée par l’équation de la droite de la courbe d’étalonnage Tableau n°12.

Tableau n° 11 : Densité optique (D.O.) de chaque dilution de la courbe d’étalonnage

des protéines totales.

Dilutions 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10

D.O 0.397 0.393 0,383 0,380 0,378 0,365 0,356 0,343 0,334

Figure n°07 :

Courbe d’étalonnage des protéines

y = 0,0095x + 0,0125R² = 0,9817

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 10 20 30 40 50

D.O

concentration de SBA µg/ml

Courbe d' étalonnage des protéines totales


51

Tableau n° 12 : Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque

extrait enzymatique des isolats d’Ascochyta rabie.

4.2 Electrophorèse des protéines totales :

Le profil électrophorètique des protéines totales des 14 souches par

électrophorèse sur gel polyacrylamide en conditions dénaturantes SDS-PAGE a

révélé six niveaux de migration de bandes protéiques.

Photo 16 :

Profil électrophorètique des protéines totales d’Ascochyta rabiei

souches A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45

D.O 0.265 0.231 0.220 0.172 0.186 0.235 0.175 0.205 0.263 0.232 0.219 0.154 0.261 0.25

[ ] µg/ml 26.4 23 21.9 17.1 18.5 23.4 17.4 20.4 26.2 23.1 21.8 17.3 26 25.1

A45 A40 A38 A35 A31 A27 A23 A22 A20 A17 A12 A10 A6 A1


52

Tableau n°13 : Résultats de l’électrophorèse des protéines totales

A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45

N1 + + - - + + + + + + + + + +

N2 + - - - + + + + - + + + + -

N3 + + - - - + + + + + - + - +

N4 + + + - - + + + - - - + + +

N5 + + + + - + + + + + + + + -

N6 + - + + - + + - - - - + + -

Tableau n° 14 : Taux de similitude des bandes des protéines de toutes les souches

A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45

A1 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0

A6 66,7 100,0 33,3 16,7 16,7 66,7 66,7 66,7 50,0 50,0 33,3 66,7 50,0 50,0

A10 50,0 33,3 100,0 33,3 0,0 50,0 50,0 33,3 16,7 16,7 16,7 50,0 50,0 16,7

A12 33,3 16,7 33,3 100,0 0,0 33,3 33,3 16,7 16,7 16,7 16,7 33,3 33,3 0,0

A17 33,3 16,7 0,0 0,0 100,0 33,3 33,3 33,3 16,7 33,3 33,3 33,3 33,3 16,7

A20 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0

A22 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0

A23 83,3 66,7 33,3 16,7 33,3 83,3 83,3 100,0 50,0 66,7 50,0 83,3 66,7 50,0

A27 50,0 50,0 16,7 16,7 16,7 50,0 50,0 50,0 100,0 50,0 33,3 50,0 33,3 33,3

A31 66,7 50,0 16,7 16,7 33,3 66,7 66,7 66,7 50,0 100,0 50,0 66,7 50,0 33,3

A35 50,0 33,3 16,7 16,7 33,3 50,0 50,0 50,0 33,3 50,0 100,0 50,0 50,0 16,7

A38 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0

A40 83,3 50,0 50,0 33,3 33,3 83,3 83,3 66,7 33,3 50,0 50,0 83,3 100,0 33,3

A45 50,0 50,0 16,7 0,0 16,7 50,0 50,0 50,0 33,3 33,3 16,7 50,0 33,3 100,0


53

Le dendrogramme suivant nous a permis de classer les souches en deux groupes

hétérogènes.

Le premier groupe est formé de A10 et A12. Il est très hétérogène par rapport au

deuxième groupe formé de A1 et A22 , à partir de ce dernier 11 sous groupes sont

classés dans un ordre croissant de homogénéité partielle, il s’agit de : A17, A45, A35,

A31, A6, A40, A23, A38.

Figure n°08 :

Représentation des 14 souches en dendrogramme

DENDROGRAMME DES 14 SOUCHES

DISTANCE EUCLIDIENNE

65 70 75 80 85 90 95 100 105

A12

A10

A17

A45

A35

A27

A31

A6

A40

A23

A38

A20

A22

A1

CONCLUSION

Conclusion

54

CONCLUSION GENERALE

Notre étude menée au laboratoire de microbiologie appliqué nous a permis de

rapporter de nouvelles approches sur la pathologie d’Ascochyta rabiei.

Notre travail a été abordé par l’isolement et la purification de 14 souches d’Ascochyta

rabiei, Par la suite la sélection de la souche A31 qui a révélé une expression de l’activité

protéolytique la plus élevée par rapport à l’ensemble des souches pour l’ut ilisation dans les

parties qui suivent.

Le travail a été suivi par l’étude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31

dans le surnageant de culture de différents milieux et à différents pH

Cette étude nous a permis d’enregistrer que la sécrétion des protéases est variable

selon le milieu de culture et son pH :

En présence du glucose, l’activité protéolytique est mieux exprimée au cours du 10ème

jour.

En absence du glucose, l’expression protéolytique a apparu en deux phases, la

première est similaire à la précédente et la seconde a apparu précocement (4ème

-5ème

jour),

cela nous a laissé de suggérer que le champignon a emprunté une autre voie métabolique pour

remédier cette carence, et de supposer que le champignon dispose de plusieurs familles de

protéases, il s’agit de protéases acides, neutres et alcalines.

En absence de la caséine, cette expression protéolytique est très faible, ce résultat nous

a autorisé de relier cette expression protéolytique à la présence de la caséine.

L’étude de l’activité protéolytique in vitro a nettement montré l’influence de la source

de carbone sur l’activité enzymatique des protéases qui peuvent avec d’autres groupements

enzymatiques intervenir dans le pouvoir pathogène au cours du processus d’infection du Pois

chiche.

L’étude de l’évolution du poids du mycélium de la souche A31 a permis de penser que

la croissance mycélienne est liée aux niveaux élevés d’expressions de l’activité

protéolytique ce qui renseigne sur l’effet important que occupe cette activité lors de la

croissance de ce champignon.

Le test du pouvoir pathogène a confirmé que les deux souches testées sont pathogènes,

ainsi l’étude du polymorphisme protéolytique des 14 souches montre qu’elles appartiennent à

deux groupes et onze sous groupe.

Conclusion

55

Cependant, il serait intéressant de poursuivre cette étude par la Purification de l’enzyme

protéase par la chromatographie, Par la suite tester l’effet de cette enzyme sur les plantules de

pois chiche et étudier d’autres enzymes qui peuvent avoir un rôle dans la pathologie du

parasite étudié.

Annexe

Annexe

COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

- Tous les milieux de culture sont stérilisés à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes sous une

pression de 1 bar.

Milieu Pois chiche (g/ l) :

Pois chiche …………………….. 200 g

Glucose …………………….. 20 g

Agar agar …………………….. 20 g

Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml

- le Pois chiche est trempé dans de l’eau distillée pendant une nuit puis cuit dans de l’eau distillée.

Après cuisson, le filtrat est récupéré, ajusté à 1000 ml puis ajuster le pH à 6.

Gélose 2 % :

Agar agar …………………….. 20 g


Milieu Gyp:

Glucose 20 g

Peptone

Extrait de levure

5 g

5 g

Eau distillée q.s.p.

1000 ml

Milieu Czapeck glucose 2% (g/ l):

Glucose …………………….. 20 g

KH2PO4 …………………….. 1 g

KCl …………………….. 0,5 g

Na2No3 …………………….. 2 g

MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g

FeSO4 …………………….. 0,01 g

Agar agar …………………….. 20 g


Annexe

pH = (4 / 6 /8)

Milieu Czapeck caséine 2% (g/ l):

Caséine …………………….. 20 g

KH2PO4 …………………….. 1 g

KCl …………………….. 0,5 g

Na2No3 …………………….. 2 g

MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g

FeSO4 …………………….. 0,01 g

Agar agar …………………….. 20 g


pH = (4 / 6 /8)

Milieu Czapeck caséine 1% + glucose 1% (g/ l):

Caséine …………………….. 10 g

Glucose …………………….. 10 g

KH2PO4 …………………….. 1 g

KCl …………………….. 0,5 g

Na2No3 …………………….. 2 g

MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g

FeSO4 …………………….. 0,01 g

Agar agar …………………….. 20 g


pH = (4 / 6 /8)

Remarque : pour préparer des milieux liquides il suffit de ne pas ajouter l’agar agar.

Annexe

PREPARATION DES SOLUTIONS DE L’ELECTROPHORESE

Tampon de charge (SDS-PAGE) :

(Tris –Hcl :0,125 M ;SDS :4% ; Glycérol : 20% ; 2- Mercaptoethanol 0,04% ;

pH =6,8) :

Tris- Hcl 0,5M …………………… 1,25ml

SDS10 ………………….2 ml

Glycérol …………………..5 ml

2-mercaptoethanol ………………...0,5 ml

Bleu de Bromophénol1 …………………..1 ml

Eau distillée q.s.p …………………10 ml

Le tampon est réparti à raison de 0,5ml par tube à hémolyse avant d’être conservé au

congélateur jusqu’au moment de l’emploi.

Tampon de migration :

(Tris : 0,25M ;Glycine :1,92M ; SDS :0,1 ;pH =8,3) :

Tris 3,03 g

Glycine 14,4 g

SDS 1 g

Eau distillée 1000 ml

Le tampon est conservé au réfrigérateur.

Annexe

Solution d’acrylamide : 30 % :

Acrylamide 30g

Eau distillée 1000ml

Solution de bis –acrylamide 1% :

bis –acrylamide 1g


Tampon de séparation :

(Tris-Hcl : 1,5 M ; pH =8,8)

Tris 36.3g


Tampon de concentration :

(Tris-Hcl : 0,5 M ; pH =6,8)

Tris 3g


Pour les deux derniers tampons , le pH est ajusté avec environ 24 ml d’HCL , 1N puis

complété à 200 ml avec de l’eau distillée .Après filtration les solutions sont conservées à 4°C.

Annexe

Tampon Tris – HCL 0,5M, pH=8,5:

Tris (hydroxyméthyl-amino-méthane) 6,05g

H2O q .s. p. 95ml

Ajuster à Ph=8,5 avec HCL ½ concentré, completer à 100 ml avec H2O.

Tampon Na-phosphate 0,1 M – pH = 7,1 (1) :

Solution A : KH2PO4, H2O …………… 2,76 g dans 100 ml H2O

Solution B : Na2HPO4, 2 H2O …………… 7,12 g dans 100 ml H2O

Ajuster le pH de la solution A à 7,1 avec la solution B.

Solution de fixation :

Acide acétique …………………….. 200 ml


Solution de coloration

Bleu de coomassie G250 …………………….. 1,5 g

Ethanol …………………….. 250 ml



Solution de décoloration

Ethanol …………………….. 250 ml

Annexe



Solution de conservation :



La composition des gels de polyacrylamide en SDS-PAGE

Solutions mères Gel de séparation

15% (ml)

Gel de concentration

5% (ml)

Solution 30% acrylamide mix

Tampon de séparation (pH: 8.8)

Tampon de concentration (pH: 6.8)

Eau distillée

Solution SDS 10 %

Temed

Solution persulfate d’Ammonium 10%

7,5

3,8

-

3,5

0,15

0,006 ml

0.15

0,83

-

0,63

3,4

0.05

0,005 ml

0.05

Annexe

CALCULS DES DIAMETRES QUOTIDIENS EN CM ET LES VALEURS DES DENSITES

OPTIQUES

Diamètre quotidien des souches d’Ascochyta rabiei sur milieu Czapeck caséine1% +

glucose 1% pendant 10 jours d’incubation :

Moyenne

quotidienne

des souches

MQ A1 MQ A6 MQ A10 MQ A12 MQ A17 MQ A20 MQ A22

1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

2ème

jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

3ème

jour 0.63 1.2 0.63 0.5 0.4 0.53 0.58

4ème

jour 0.77 1.08 0.88 0.58 0.47 0.8 0.68

5ème

jour 0.88 0.88 1.12 0.72 0.62 0.85 0.9

6ème

jour 1.00 0.53 1.5 0.92 0.77 1.28 1.12

7ème

jour 1.27 0.57 1.9 1.13 1.22 1.45 1.28

8ème

jour 1.32 0.6 1.32 1.32 1.4 1.63 1.35

9ème

jour 1.4 0.72 2.2 1.32 1.3 1.82 1.47

10ème

jour 1.55 0.75 2.4 1.65 1.63 1.93 1.68

Moyenne 10

jours des

souches

0.901 0.808 0.901 0.813 0.82 1.04 0.923

Moyenne

quotidienne

des souches


1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

2ème

jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

3ème

jour 0.62 0.62 0.68 0.45 0.58 0.47 0.55

4ème

jour 0.75 0.88 0.82 0.73 0.8 0.67 0.67

5ème

jour 1.08 0.95 1.12 0.92 1.02 1.02 0.87

Annexe

6ème

jour 1.37 1.53 1.42 1.22 1.37 1.47 0.93

7ème

jour 1.65 1.72 1.97 1.58 1.58 1.5 1.00

8ème

jour 1.78 2.08 2.15 1.73 1.78 1.7 1.17

9ème

jour 1.9 2.27 2.52 2 1.5 1.98 1.22

10ème

jour 2.1 2.5 2.72 2.27 2.15 2.18 1.4

Moyenne 10

jours des

souches

1.136 1.291 1.378 1.16 1.141 1.201 0.871

Diamètre quotidien des souches d’Ascochyta rabiei sur milieu Czapeck caséine2%

pendant 10 jours d’incubation :

Moyenne

quotidienne

des souches


1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

2ème

jour 0.6 0.7 0.6 0.75 0.6 0.75 0.65

3ème

jour 0.6 0.9 0.75 0.95 0.65 0.95 0.65

4ème

jour 0.65 1.1 0.85 1 0.8 1.2 0.7

5ème

jour 0.75 1.15 1.05 1.1 1.05 1.35 0.9

6ème

jour 0.9 1. 3 1.15 1.25 1.15 1.5 0.95

7ème

jour 0.5 1.4 1.3 1.35 1.25 1.7 1.05

8ème

jour 1.32 0.6 1.32 1.32 1.4 1.63 1.35

9ème

jour 1.1 1.6 1.45 1.75 1.65 1.8 1.25

10ème

jour 1.2 1.7 1.5 1.8 1.75 1.85 1.35

Moyenne 10

jours des

souches

0.73 1.135 1 1.15 1.035 1.28 0.865

Annexe

Moyenne

quotidienne

des souches


1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

2ème

jour 0.65 0.8 0.8 0.6 0.6 0.65 0.9

3ème

jour 0.9 0.9 1 0. 7 0.85 0.8 1.05

4ème

jour 1.05 0.95 1.2 0.9 1 1 1.05

5ème

jour 1.15 0.95 1.4 1.05 1.15 1.15 1.15

6ème

jour 1.35 1.1 1.5 1.25 1.25 1.25 1.25

7ème

jour 1.4 1.15 1.6 1.3 1.45 1.4 1.45

8ème

jour 1.6 1.45 1.8 1.35 1.45 1.55 1.6

9ème

jour 1.75 1.75 2.05 1.45 1.65 1.85 1.95

10ème

jour 2.1 2.5 2.72 2.27 2.15 2.18 1.4

Moyenne 10

jours des

souches

1.155 1.07 1.325 1 1.105 1.13 1.21

Annexe

Diamètre quotidien des souches d’Ascochyta rabiei sur milieu Czapeck glucose 2%

pendant 10 jours d’incubation :

Moyenne

quotidienne

des souches


1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

2ème

jour 0.6 0.7 0.6 0.75 0.6 0.75 0.65

3ème

jour 0.6 0.9 0.75 0.95 0.6 0.75 0.65

4ème

jour 0.65 1.1 0.85 1 0.8 1.2 0.7

5ème

jour 0.75 1.15 1.05 1.1 1.05 1.35 0.9

6ème

jour 0.9 1. 3 1.15 1.25 1.15 1.5 0.95

7ème

jour 0.5 1.4 1.3 1.35 1.25 1.7 1.05

8ème

jour 1 1.5 1.35 1.55 1.45 1.7 1.15

9ème

jour 1.1 1.6 1.45 1.75 1.65 1.8 1.25

10ème

jour 1.2 1.7 1.5 1.8 1.75 1.85 1.35

Moyenne 10

jours des

souches

0.235 0.595 0.46 0.615 0.495 0.74 0.39

Moyenne

quotidienne

des souches


1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

2ème

jour 0.65 0.8 0.65 0.6 0.6 0.65 0.9

3ème

jour 0.9 0.9 0.8 0. 7 0.85 0.8 1.05

4ème

jour 1.05 0.95 0.95 0.9 1 1 1.05

5ème

jour 1.15 0.95 1.4 1.05 1.15 1.15 1.15

6ème

jour 1.35 1.1 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25

7ème

jour 1.4 1.15 1.4 1.3 1.45 1.4 1.45

8ème

jour 1.6 1.45 1.5 1.35 1.45 1.55 1.6

Annexe

9ème

jour 1.7 1.65 1.7 1.4 1.65 1.65 1.7

10ème

jour 1.75 1.75 1.8 1.45 1.65 1.85 1.95

Moyenne 10

jours des

souches

0.615 0.575 0.58 0.465 0.565 0.59 0.67

Mesure des diamètres obtenus dans le test de la mise en évidence de l’activité

protéolytique sur milieu solide

CZ + CS+ Glu CZ + Glu CZ+CS

pH4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8

1er jour 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2ème

jour 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3ème

jour 0 0 2 0 0 0 3 0 0

4ème

jour 1 1 2 0 0 0 8 5 1

5ème

jour 1 1 2 0 0 0 10 12 2

6ème

jour 1 1 2 0 0 0 1 1 1

7ème

jour 1 1 3 0 0 0 2 2 2

8ème

jour 1 1 4 1 1 1 3 3 4

9ème

jour 2 2 6 1 1 1 6 3 3

10ème

jour 11 10 11 1 2 1 10 4 3

Annexe

Mesure des D.O obtenues dans le dosage protéolytique à L’UV

Moyenne des D.O de

dosage dans milieu

Czapeck glucose caséine

2%

Moyenne des D.O de

dosage dans milieu Czapeck

caséine 2%

Moyenne des D.Ode

dosage dans milieu

Czapeck glucose 2%

pH 4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8

1er

jour 0 0,0093 0 0,138 0 0,046 0 0,002 0,033

2ème

jour 0 0 0 0,079 0,036 0,0383 0 0 0

3ème

jour 0,008 0 0,0006 0,042 0,013 0,01855 0 0 0

4ème

jour 0,0143 0,017 0,01766 0 0,065 0,0275 0,0003 0,024 0,005

5ème

jour 0 0,0146 0,03 0,262 0,46 0,2506 0,001 0 0,0583

6ème

jour 0 0 0,0426 0 0,031 0,0245 0 0,004 0,13

7ème

jour 0 0,019 0 0,222 0,103 0,1083 0 0 0,0633

8ème

jour 0,0263 0,0223 0,048 0,122 0,039 0,0696 0 0,039 0,0116

9ème

jour 0,0053 0,018 0,0616 0,438 0,023 0,1742 0,003 0,023 0,0123

10ème

jour 0,0513 0,0333 0,099 0,496 0,032 0,209 0,0033 0,032 0,0566

Annexe

Mesure des variations quotidiennes de pH et de Poids de la souche A31 sur milieu

liquide Czapeck caséine glucose 2% pendant 10 jours d’incubation :

paramètres

ΔpH et

Δ poid

pH 4

pH 6

pH 8

Δ poid ΔpH Δ poid Δ poid Δ poid ΔpH

1er jour 0,27 5,3 0,27 5,8 0,27 6,9

2ème jour 0,27 5,6 0,27 6,55 0,32 6,82

3ème jour 0,31 5,2 0,36 6,4 0,36 6,9

4ème jour 0,31 5,2 0,51 6,3 0,38 6,8

5ème jour 0,52 5,2 0,81 6,3 0,41 6,9

6ème jour 0,8 5,4 0,99 6,3 0,55 6,8

7ème jour 1,18 5,2 1,06 6,2 0,91 6,7

8ème jour 1,56 4,9 1,62 5,9 1,41 6,3

9ème jour 2,12 5,3 2,49 5,7 2,15 6,1

10ème jour 2,7 6,3 3,16 5,4 2,7 5,9

Annexe

Mesure des variations quotidiennes de pH et de Poids de la souche A31 sur milieu liquide

Czapeck caséine 2% pendant 10 jours d’incubation :

paramètres

ΔpH et Δ

poid

pH 4

pH 6

pH 8

Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH

1er jour 0,13 5,98 0,14 6,23 0,13 7

2ème jour 0,13 6,2 0,19 6,41 0,16 7,45

3ème jour 0,52 5,99 0,3 6,44 0,36 7,07

4ème jour 0,6 6,02 0,37 6,47 0,4 7,31

5ème jour 0.9 9 0.5 9 0.9 9

6ème jour 1,84 5,37 0,46 6,83 0,63 7,35

7ème jour 2,69 5,8 0,83 6,78 0,79 7,53

8ème jour 3,55 5,66 0,91 7,14 0,92 7,73

9ème jour 4 5,53 1,52 8,6 1,4 8,67

10ème jour 5,17 5,95 2,28 7,27 1,77 7,82

Annexe

Mesure des variations quotidiennes de pH et de Poids de la souche A31 sur milieu liquide

Czapeck glucose 2% pendant 10 jours d’incubation :

paramètres

ΔpH et Δ

poid

pH 4

pH 6

pH 8

Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH

1er jour 0,14 5,5 0,1 6,45 0,13 7.1

2ème jour 0,14 5,81 0,1 6,49 0,13 7,03

3ème jour 0,14 6,1 0,14 6,6 0,18 7,46

4ème jour 0,18 5,81 0,39 6,64 0,33 7,44

5ème jour 0,21 6,1 0,48 6,78 0,42 7,52

6ème jour 0,37 6,66 0,69 6,72 0,67 7,2

7ème jour 0,89 7,49 1,18 6,84 0,92 7,47

8ème jour 1,53 5,93 1,48 6,04 1,16 6,28

9ème jour 2,58 4,96 1,96 4,83 1,27 5,14

10ème jour 2,97 4,57 2,17 4,9 1,47 5,08

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Références bibliographiques

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1. Ferid Abidi.F, Ferid Limam.F, Marzouki M., 2008. Production of alkaline

proteases by Botrytis cinerea using economic raw materials: Assay as biodetergent.

Process Biochemistry. 43. P.1202–1208

2. Ahmed F., gaur P.H., crosser J., 2005. genetics Ressources, Chromosomes, in

Singh J., Prem et Jaulian, volume: 1; page: 326, edition: Quae.

3. Ahmed,G.D., Hafiz, A. and ashraf, M., 1952. Association of morphological

characters with blight resistance. In Procedings of the fourth Pakistan Science

conference.

4. Ameziane,E. A., 1981 .Modalité d’expression de la résistance d’un cultivar de Pois

chiche (Cicer aritinum ) à Ascochyta rabiei, (Pass.) Lab. Thèse de docteur-ingénieur,

E. N. S. A., Rennes : 41p. alimentaire, synthèse des travaux du stage de formation,

Rabat, 10-16 Feb. 1985,55-59.

5. Ameziane, E.A., 1985. L’anthracnose du Pois chiche. ICARDA. Amélioration des

légumineuses alimentaires, synthèse des travaux du stage de formation, Rabat, 10-16

Feb. 1985,55-59.

6. ANDREAS BAUMGARTNER, ASA.1998. .Le Pois chiche : la viande des

pauvres.TABULA NO3.18p.

7. Anonyme a. Legumineuses. Mémoire de magister. Université Mentouri.

Constatine.16p.

http://membres.lycos.fr/fafawaroux/legumine.htm

8. Anonyme b. 2004. Information about the family leguminosea. International legume

database & information service. . Mémoire de magister. Université Mentouri.

Constatine. 16p.www.ILDIS.UK.

9. Anonyme c. 1994. Analyse statistique de l ’évolution de la culture des principaux

produits agricoles durant la période 1964-1994. DSAEE. Ministère de

l’agriculture,Alger.

10. Arx,J. A., von, 1987. Plant pathologenic Fungi.J. Cramer, Berlin, D, 288p.

11. Bateman D.F., Miller R.l., 1966. Pectic enzymes in tissues degradation. Annu. Rev.

Phytopat. 4.

http://membres.lycos.fr/fafawaroux/legumine.htm


12. BAUMGARTNER.A, le pois chiche : la viande des pauvres, TABULA , 1998,

NO3.p :16-19.

13. Bedi, P. S., Aujla, S.S., 1969. Variability in Phyllostica rabiei (Pass.) Trot., the

iniciant of blight disease of gram in the Punjab.J. Res. PunjabAgr. Univ.6, 103-106.

14. Bedard, A., 2005. (Dt.P.,M.Sc.,nutritionniste, Institut des nutraceutique et des

aliments fonctionnels INAF,Université Laval).-Le pois chiche au fil du temps,usage

culinaires,conservation ,jzrdinage biologie et écologie et environnement .

15. Bret, E., 1990. L’anthracnose du pois chiche : contribution à la mise au point de

techniques de tests de comparaison variétale. Mémoire de maitrise de Bio-

physiologie. Univ.

16. Bouznad, Z., 1989 : Contribution à la connaissance du genre Ascochyta, cas

particulier de l'étude biologique, ultrastructurale et cytochimique des relations hôte-

parasite chez le couple Pisum sativum L. / Ascochyta pisi Lib. Thèse de Doctorat

d'Etat. 217 p., Université Pierre et Marie Curie, Paris VI, France.

17. Bradford, M., 1976. A rapid and sensitive method for the quontitation of microgram

quantities of protein utilizing the principe of protein-dye binding. Anal.biochem., 72 :

248-254.

18. Chadefaud, M et Emberger, L., 1960. Traité de botanique. Systématique. Les

végétaux non vasculaires. (Cryptogamie) T.1. Eds. Masson et Cie. Paris. p: 1018.

19. Direction des Services Agricoles, 2010. La superficie et la production du pois chiche

à partir de l’année 2005 jusqu’au 2010 ainsi que les prévisions pour les quatre

prochaines années dans la wilaya d’Oran.

20. Djaoui,A.,1985. Etude de l’anthracnose du Pois chiche : pouvoir pathogène et

comportement variétal vis-à-vis de quelques souches d’Ascochyta rabiei. Mémoire

d’ingénieur Agronome, alger,53p.

21. Djellali,M. ,1988. Etude en plein champ de la résistance du Pois chiche à

l’anthracnose. Mémoire d’ingénieur.INA, El-Harech.p.47.

22. Duniesky Martínez García, Carlos Hernández Díaz., 2003. Biotecnología

Aplicada;20.p:170-172.

23. El Biari, A.,1995. Etude de l’anthracnose du Pois chiche due à Ascochyta rabiei

(Pass.) lab : polymorphisme des populations et diagnostic immuno-enzymatique.

Thèse de Doctorat. Université de Paris Sud.100p.


24. Ferid, A, Ferid, L, Marzouki ,M., 2008. Production of alkaline proteases by

Botrytis cinerea using economic raw materials: Assay as biodetergent Process

Biochemistry 43. 1202–1208p.

25. Gowen ,S.R., Orton, M., Thurley, B and White, A.,1989. Variationin pathogenicity

of Ascochyta rabiei on chickpea. Trop. Pest Manage. 35, 180-186.

26. Grewal, RK et Jhooty, J.S., 1984. Rating of gram Cicer arietinum blight in

fungicical trials. Crop. Improv_ 11(1): 71-72.

27. Hafiz, A., 1952. Basis of resistace in gram to Mycosphaerella blight.

Phytopathology,42,p 422-443.

28. Hamadache A et Ait Abdallah F. 1998. Lutte contre les adventices en culture du

Pois chiche d’hiver : un facteur déterminant pour la valorisation du matériel végétal et

du semis précoce .céréaliculture N°33 ISSN 1011-9582.

29. Hmidullah et Wiese., 1991. Virulence forms of Ascochyta rabiei affecting

chickpeas. Agricultura mediterranea (pisa) vol 119(2),148-151.

30. Jayakumar P., Gosseen B.D., Gan Y.T., Wrkentin T.D and Baniza S., 2005.

Ascochyta blight of Chickpea: infection and host resistance mechanisms. Canadian

journal of plant pathology. 27, 499-509.

31. Kolaczkowska, M.K., Polanowski, A. and Czaplinska, S.1980. Extracellular

proteinases of Fusarium moniliforme. Hodowla Roslin Aklimatyzacja i Nasiennictwo

.vol 24. p 1–7.in: A. Pekkarinen*, L. Mannonen†, B. L. Jones and M.-L. Niku-

Paavola. Production of Proteases by Fusarium Species Grown on Barley Grains and

in Media Containing Cereal Proteins. Journal of Cereal Science 31 (2000) 253–261

32. Kumar, S., Sharma, N. S., Saharan, M.R. & Singh, R. ,2005. Extracellular acid

protease from Rhizopus oryzae: Purification and characterization. Process Biochem.

40:1701-1705. In: in: Chekireb Djamel, Tahar Ali and Cochet Nelly, Acid Protease

Production by Isolated Species of Penicillium ,European Journal of Scientific

Research, (2009), Vol.25 No.3. pp.469-477.

33. Labdi,M.,1990. Contribution à l’étude de la variabilité d’isolats d’ Ascochyta rabiei,

agent de l’anthracnose du Pois chiche en Algérie. Mémoire de D.A.A de

phytotechnie.INRA, Versailles. 36p.

34. Labdi,M., 1995. Etude de la résistance à l’anthracnose (Ascochyta rabiei (Pass.) lab)

chez le pois chiche (Cicer arietinum L.) Thèse de l’ENSA Monpelier.155p.


35. Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of

bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

36. Lafont, R., 2005 . Biologie et multimédia-Université Pierre et Marie Curie –UFR

de Biologie.

37. Latif,Z,Strange,R.N.,Bilton,Jand Riazuddin,S., 1993. Production of pytotoxins,

solanapyrones Aand C cytochalasin D among nine isolats of Ascochyta rabiei. Plant

pathology 42, 172-180.

38. Lehninger, A., 1985. Principe de biochimie. Fammarion Medecine Sciences. Paris,

981p.

39. Leslie J.F., Summerell B.A., 2006. The Fusarium Laboratory Manuel. Edit.

Blackwell Publishing Professional. ISBN-13: 978-0-8138-1919-8. 2121 State

Avenue. Ames, Iowa 50014, USA 388 p.

40. Mohamed Bachir,I., 1984. Slow blighthing a resistance mechanism that needs to be

explored if it exists in chickpea germplasm. Proceeding of a training course

3,10March 1984, NARC, Islamabad, Pakistan. ICARDA, Aleppo, 47-49.

41. Nene, Y.L., et Reddy, M.V. ,1987. Chickpea diseases and their control. In the

chickpea. Saxena, M. C., and Singh, K.B., eds. Wallingford, Oxfordshire,Uk,223-

270.

42. Pearse P., Mcvicar R., Yasionowski J. ea., 2005. Agriculture de Saskathewan et

nourriture, p.200.

43. Peters, R., et Tahiri,A.,1986. Breeding chickpea for horizontal resistance to

ascochyta blight in Morocco. FAO Plant. Prot. Bull., 34(2).

44. Punithalingam, E et Gibson, A.S., 1976. Phoma medicaginis var pinodella. In

description of pathologens fungi and bacteria. Commenwealth Agricultural institute.

Surry. England 334-340.

45. Rappily, F., 1968. Les techniques de mycologie en pathologie végétales. Ann.

Epiphyties. I.N.R.A. Paris vol. 19,102 p.

46. Reddy ,M.V., and Singh, K. B.,1984. Evaluation of a world collection of chickpea

germ accessions for resistance to Ascochyta rabiei (Pass.) lab in Syria and

Lebanon. Phytopathologie meditarranea, 24, 265-266.

47. Reddy ,M.V., and Kabbabeh, S., 1985. Pathogenic variability in Ascochyta rabiei

(Pass.) Lab in Syria and Lebanon. Phytopathologianmediterranea, 24, 265-266.

48. Saxena N. P., 1984. Chickpea, the physiologie of tropical fields crops. Edited by

Goldsworthy, P. R. and Fisher Jhon Willy, N. M., and sons Ltd, 419-446.


Smithson et al 1985, Singh 1997

49. Saxena, M. C.1992. Current status and prospects of kabuli chickpea production. In:

Disease Resistance Breeding in Chickpea international Center for Agricultural

Research in the Dry Areas. Aleppo, Syria;185pp.

50. Sattar, A., 1933 On occurrence, perpetuation and control of gram (Cicer arietinum

L.) blight caused by Ascochyta rabiei (Pass) with special reference to Indian

conditions. Analysis of Applied Biology. 20:612-632.

51. Skypertz S., 2006. Analyse des légumineuses et culture spéciale : le bulletin

bimensuel. Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC). Volume 19 numéro 13.

52. Summerfield R.J and Roberts. 1985. (Cicer arietinum.L) .Reprinted with

permission from: Handbook of flowering .Ed. Halevy A.H., C.R.S. Press INC, Boca

Raton, Florida .Vol.1:92-99.

53. Summerfield R.J., Hadley P., Roberts E.H., Minchin F.R. and Rawsthorne

S.1984. Sensitivity of chickpea (Cicer arietinum L.) to hot temperatures during the

reproductive period. Exp. Agri, 20: 77-93.

54. Snyder W. C., and H. N. Hansen. 1947. Advantages of natural media and

environments in the culture of fungi. Phytopathology 37: 420-421. (2, 4).

55. Tchicha,K.,1991. Etude de deux isolats d’ Ascochyta rabiei agent de l’anthracnose

du pois chiche : recherche des enzymes hydrolytiques et leurs relations avec la

virulence. Mémoire de fin d’études d’Ingéniorat d’Etat. INES Agro. Blida. 36p.

56. Tremacoldi, C.R., Watanabe, N.K., Carmona, E.C. (2004). Production of

extracellular acid

57. proteases by Aspergillus clavatus. World J. Microbiol. Biotechnol. 20:639-642. in:

Chekireb Djamel, Tahar Ali and Cochet Nelly, Acid Protease Production by Isolated

Species of Penicillium ,European Journal of Scientific Research, (2009), Vol.25 No.3.

pp.469-477.

58. Vir,S., Grewal,J.S.,1974. Physiologic specialisation in Ascochyta rabiei the causal

organism of gram blight. Indian physiopathol. 27,335-360.

59. Wang Y., Lin M., Tian Z., Elmerich G., Newton, W., 2005: Biological Nitrogen

Fixation, Sustainable Agriculture and the Environnement, page: 254, edition Springer.

60. Wery J., Silim S.N., Kinght E.J., Malhotra R.S. and Cousin R. 1994. Screening

techniques and sources of tolerance to extremes of moisture and air temperature in


cool season food legumes. Euphytica, 73 : 73-83.

61. Wiese M.V., kaiser W.J. Smith L.J., Muehlbauer F.J., 1996. Ascochyta blight of

Chickpea. Cooperative extension system, University of Idaho, Moscow, Idaho.

62. Yamina,W.,1990. Contribution à l’étude de l’anthracnose du Pois chiche.

Standarisation des méthodes d’inoculation artificielle et étude du pouvoir pathogène

de quelques isolats

d’Ascochyta rabiei. Mémoire ing. INES. Agro.Blida, 43p.

63. Zerrouk, M.M., 1994 . Etude de quelques aspects biologiques et physiologiques du

champignon Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. Agent causal de l’anthracnose du pois

chiche (Cicer aietinum L). Mémoire de Magister en Microbiologie, Université de

Sétif Algérie.

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MEMOIRE - univ-oran1.dz · 2015-05-05 · Dédicaces A la mémoire de mes grands -parents A mes très chers parents qui ont toujours été là pour moi, et qui m'ont donné un magnifique