Pázmány Péter Katolikus Egyetem

Információs Technológiai és Bionikai Kar

Szakdolgozat

Mikroglia sejtek stressz indukálta morfo-

funkcionális elemzése

Gulyás Krisztina

Molekuláris bionika mérnöki BSc

2017

Témavezető:

dr. Kovács Krisztina

2

Alulírott Gulyás Krisztina, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai és

Bionikai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a szakdolgozatot meg nem engedett segítség

nélkül, saját magam készítettem, és a szakdolgozatban csak a megadott forrásokat használtam

fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más

forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Ezt a Szakdolgozatot más

szakon még nem nyújtottam be.

___________________________________

Aláírás

3

Tartalomjegyzék

1. Bevezetés ........................................................................................................................ 6

2. Irodalmi áttekintés .......................................................................................................... 8

2.1. Mikroglia sejtek funkciója és morfológiája ............................................................ 8

2.2. Stresszválaszt befolyásoló agyi régiók és hormonok .............................................. 10

2.3. Mikroglia sejtek kapcsolata a gyulladásos és a stresszel járó folyamatokkal ......... 11

2.4. Mikroglia sejtek különböző paramétereinek meghatározása képelemző

eljárásokkal ............................................................................................................. 12

2.5. Képek szegmentálására alkalmazott módszerek áttekintése ................................... 13

2.6. Sejtek szegmentálására használt képfeldolgozási technikák ................................... 15

3. Módszerek ....................................................................................................................... 17

3.1. Kísérleti állatok és kísérleti elrendezés ................................................................... 17

3.2. Perfúzió és szövetfeldolgozás ................................................................................. 19

3.3. Felvételek elemzésére kidolgozott módszer bemutatása ......................................... 21

3.3.1. Sejtek detektálása ........................................................................................... 22

3.3.1.1. Előfeldolgozás .................................................................................... 24

3.3.1.2. Szegmentálás ...................................................................................... 26

3.3.2. Nyúlványrendszer modellezése ...................................................................... 28

3.3.3. Paraméterek meghatározása ........................................................................... 31

3.4. Grafikus felhasználói felület bemutatása ................................................................ 32

3.5. Felvételek elemzése ImageJ szoftver segítségével .................................................. 35

4. Eredmények .................................................................................................................... 37

4.1. Krónikus stressz kísérlet ......................................................................................... 37

4.2. Az automatikus sejtdetekció eredménye ................................................................. 38

4.3. A különböző módszerekkel meghatározott paraméterek kiértékelése .................... 39

4.4. A felvételek elemzésére alkalmazott módszerek összehasonlítása ......................... 41

5. Diszkusszió, konklúzió ................................................................................................... 43

6. Összefoglalás .................................................................................................................. 46

7. Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................ 47

8. Irodalomjegyzék ............................................................................................................. 48

9. Mellékletek ..................................................................................................................... 51

4

Kivonat

A mikroglia sejtek a központi idegrendszer rezidens immunsejtjei. Mikrokörnyezetük

megváltozására dinamikusan reagálnak mind funkcionális, mind pedig morfológiai értelemben.

Ennek hátterében állhat sérülés, kórokozók, de az újabb tanulmányok értelmében akár stressz

hatására bekövetkező változások is indukálhatják. A mai napig számos kutatás témája a

mikroglia morfológiája és funkciója közti összefüggés vizsgálata, illetve a csupán morfológia

alapján történő elemzés. A sejtek detektálása illetve szegmentálása kiemelt szerepet játszik a

sejtekre jellemző morfológiai információ kinyerésében. Manuális módon ez a folyamat igen

időigényes, mivel általában nagy adathalmaz áll rendelkezésre, valamint nem túl objektív, így a

feladat automatizálásába nagy erőket fektettek az elmúlt évtizedekben.

Jelen dolgozatban a stressz és a mikroglia aktiváció kapcsolatát vizsgáltuk krónikus

variábilis stressznek kitett patkányok hipotalamuszában. A kísérleti állatokat 3 héten keresztül,

napi két alkalommal véletlenszerűen válogatott stresszoroknak tettük ki, majd megmértük ennek

hatását az állatok testtömeg gyarapodására, cukor preferenciájára és ACTH illetve

kortikoszteron szintjére. Ez után immunhisztokémiai eljárás során egy mikroglia-specifikus

marker (ionizált kálciumkötő adapter molekula, Iba-1) segítségével jelenítettük meg a sejteket,

majd az eredményről fénymikroszkópos felvételeket készítettünk.

Az így kapott felvételek feldolgozásához kifejlesztettem egy MATLAB-alapú automatizált

képelemző eljárást, mely lehetővé teszi sejtek detektálását, nyúlványrendszerük modellezését

és jellemző paramétereik meghatározását, ezzel segítve a morfológiai elemzést. A detekció

alapját logaritmikus képjavítás és intenzitásérték-alapú szegmentáció képzi, míg a nyúlványok

modellezéséhez régió alapú aktív kontúr módszert használtam. A kifejlesztett algoritmus többek

között meghatározza a sejtek számát, az általuk elfoglalt területet és annak a legkisebb konvex

sokszögnek a nagyságát, mellyel a teljes sejt lefedhető (Convex Environmental Area, CEA). A

felvételek elemzését ImageJ programmal is elvégeztem, melyben globális intenzitásküszöb

alapján szegmentáltam a képeket.

A sejtek automatikus detektálására kifejlesztett módszer a sejtek 92.41%-át megtalálta.

A felvételek minőségbeli változatossága, és a mikrogliára jellemző morfológiai sokszínűség

miatt a kifejlesztett eljárás jobb eredményt adott a képen lévő összes sejt morfológiai

információjának egy lépésben történő kinyerésére, mint a globális intenzitás-alapú küszöbölés.

Összességében, a kapott eredmények azt mutatták, hogy a krónikus stressz hatására csökkent az

állatok testtömeg gyarapodása és cukor preferenciája, valamint fokozódott a hipotalamusz-

hipofízis-mellékvesekéreg tengely aktivitása. A mikroglia aktiváció tekintetében a krónikus

stressz jelentősen növelte a sejtek által elfoglalt összterületet a sejtek számában való növekedés

nélkül a hipotalamusz paraventrikuláris magjában (PVN), mely a neuroendokrin stresszválasz

egyik fő szabályzó központja.

5

Abstract

Microglia cells are resident immune cells of the central nervous system. They react with

dynamic morphological and functional changes as a response to any change in their

microenvironment, such as injury, pathogens, and even various systemic stressors due to recent

studies. Several researches focused on the relationship between morphology and function of

microglia, and analysis based solely on cell morphology. Detection and segmentation of cells

plays an important role in extracting morphological information. This process in a manual way

is time-consuming due to the large amount of available data and also not objective, so in the last

decades, many efforts have been devoted to automate this process.

In this study, we investigated the relationship between stress and microglia activation

in various regions of the hypothalamus of rats after chronic variable stress. For 3 weeks, the

experimental animals were subjected to randomly selected stressors twice a day. We determined

the effect of stress on the weight gain, sucrose preference, ACTH and corticosterone levels of

the animals. After that, immunohistochemistry was performed using a microglia-specific marker

(ionized calcium-binding adapter molecule, Iba-1), followed by imaging with a light

microscope.

To evaluate the images, we developed a MATLAB-based automated image analyzing method,

that allows detection of the cells, modeling of their processes and determining their

characteristic parameters thus helping morphological analysis. Detection is based on logarithmic

enhancement and intensity thresholding, while we used region-based active contours to model

the processes. The implemented algorithm among others, determines the number of cells, the

area occupied by the cells and the size of the smallest convex area which can cover the whole

cell (Covered Environmental Area, CEA). I also analyzed the images with ImageJ, using a

segmentation method based on global intensity thresholding.

The developed method for automated cell detection found 92.14% of the cells. Due to

the varying quality of the images and the morphological diversity of microglia, the proposed

method compared to the global intensity-based thresholding gave better results in extracting the

morphological information of all the cells. Overall, present results revealed that chronic stress

induce a decrease in sucrose preference and body weight gain, as well as increased the activity

of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. With regard to microglia activation, we found that

chronic stress significantly increased the total area covered by the cells in the hypothalamic

paraventricular nucleus (PVN), the main regulator of neuroendocrine stress response, without

an increase in the number of cells.

6

1. Bevezetés

A mikroglia sejtek, vagy más néven (felfedezőjük után), Hortega-féle sejtek a központi

idegrendszerben található gliasejtek, melyek fontos szerepet játszanak az idegrendszer

immunológiai védelmében [2]. Kóros folyamatot észlelve a mikroglia sejtek nyugvó

állapotukból morfológiai változásokon keresztül aktív/reaktív állapotba kerülnek [4]. Az elmúlt

időszakban számos tanulmány foglalkozott a mikroglia aktiváció és a stressz kapcsolatával.

Ezek többsége egyetért abban, hogy a stressznek szerepe lehet a mikroglia morfológiai

aktiválásában [4-5][10][35].

A sejtek morfológiájának és a szövetek szerkezetének vizsgálatára széles körben

használják a mikroszkópos felvételek elemzését. Amennyiben egy adott kezelés által kiváltott

morfológiai változásokat szeretnénk vizsgálni, akkor a sejteket nem elég megjeleníteni. Ekkor

a kezelés hatására bekövetkező változások kvantitatív elemzésére van szükség. Néhány kutatás

keretein belül foglalkoztak olyan automatizált képelemző módszerek kifejlesztésével, melyek

segítik a celluláris változások monitorozását, valamint megkönnyítik a sejtek különböző

tulajdonságainak meghatározását, így nagyban felgyorsítják a munkafolyamatot [7-8]. A

képelemzés egy olyan módszer, melyet a képeken lévő releváns információ kiemelésére,

kinyerésére használnak [12]. A tudomány és az ipar számos területén alkalmazzák, ilyen például

az orvostudomány, orvosbiológia, mikroszkópia, űrkutatás, geográfia, ipari automatizálás és a

robotika is. A képek elemzésére használt módszerek jelentősen eltérnek az alkalmazástól

függően. Mikroszkópos felvételek esetén általában a képen található objektumok lehető

legpontosabb meghatározása, számlálása, általuk elfoglalt terület vagy egyéb paraméter

kiszámítása, esetleg egyes objektumok követése a cél. Általánosságban ennek főbb lépései a

képek javítása, majd azok szegmentálása. Előbbi a feladat szempontjából lényegtelen, vagy akár

zavaró információ csökkentésére, illetve a lényeges információ kihangsúlyozására, utóbbi pedig

a hasonló tulajdonságokkal rendelkező régiók kiemelésére szolgál [11].

A manuális módon történő sejtszámlálás és az egyes sejtek különböző paramétereinek

meghatározása igen időigényes és monoton feladat főleg, ha nagyobb mennyiségű felvétel áll

rendelkezésünkre. Ez indokolttá teszi egy olyan algoritmus implementálását, amely segíti és

gyorsítja ezt a folyamatot, ezáltal megkönnyíti a kutatók mindennapos munkáját.

Szakdolgozatom célja a mikroglia aktiváció és a krónikus stressz kapcsolatának

vizsgálata, valamint egy olyan algoritmus implementálása, mely automatikusan detektálja és

elemzi a mikroglia sejtekről készített fénymikroszkópos felvételeket. További célom egy olyan

interaktív grafikus felhasználói felület létrehozása, melynek segítségével a felhasználó

módosíthat a detektált sejteken (hozzáadhat, illetve törölhet közülük), ezzel pontosítva a

végeredményt.

7

A munkám során elvégzendő feladatok a következők voltak:

mikroglia sejtek morfológiai és funkcionális szempontok alapján történő osztályozása,

valamint a morfológia és funkció közötti összefüggés meghatározása

mikroglia sejtek megjelenítése fénymikroszkópiával

mikroglia sejtek automatikus detektálására, valamint nyúlványhálózatuk modellezésére

alkalmas program kifejlesztése

a sejtek különböző paramétereinek meghatározása az implementált algoritmus

segítségével

krónikus stresszen átesett patkányok különböző agyterületein a mikroglia sejtek

elemzése, morfológiai változásainak vizsgálata

A fénymikroszkópos felvételek készítését, és az ezt megelőző munkálatokat a Magyar

Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet (MTA-KOKI) Molekuláris

Neuroendokrinológia csoportjánál végeztem. A kutatócsoport jelenleg az ImageJ nevű szoftvert

használja a fénymikroszkópos felvételek elemzésére. Az általuk alkalmazott módszer nem

biztosít automatizált elemzést, így munkám során szerettem volna létrehozni egy olyan eszközt,

ami segítheti későbbi munkájukat.

8

2. Irodalmi áttekintés

2.1. A mikroglia sejtek funkciója és morfológiája

A mikroglia sejtek a központi idegrendszer immunsejtjei, melyek a neuronoktól eltérően

mezodermális eredetűek [1]. Fontos szerepet játszanak a gyulladásos folyamatokban és

fertőzésekben, a szinaptikus plaszticitás szabályozásában [3], a neurogenezisben [2], a

sejttörmelék és egyéb anyagok extracelluláris térből történő eltakarításában [3]. Élettani

körülmények között a mikroglia sejtek nyugalmi, „kereső” állapotban vannak. Ekkor jellemzően

kiterjedt és dúsan elágazó nyúlványrendszerrel rendelkeznek, mellyel folyamatosan pásztázzák

környezetüket, így gyorsan tudnak reagálni a különböző káros behatásokra [2]. Nyúlványaik

kiterjesztésével majd visszahúzásával mintavételezik mikrokörnyezetüket és fenntartják a

homeosztázist [3]. Modern, in vivo képalkotó módszerekkel kimutatták, hogy a motilis

mikroglia nyúlványok kapcsolatot hoznak létre az idegsejtek dendritjeivel [2], így a mikroglia

sejtek aktívan közreműködhetnek az információ feldolgozásában az agyban.

Patológiás változások következtében a mikroglia sejtek gyorsan aktiválódnak, mely

során a sejtek morfológiai változásokon mennek keresztül [2][39]. Ezen változás

eredményeképp először rövid nyúlványú, úgynevezett reaktív mikrogliává, szélsőséges esetben

pedig nyúlványokkal nem rendelkező, amőboid, fagocitáló mikrogliává alakulnak. A folyamatra

jellemző továbbá, hogy a sejt a sérülés irányába vándorol [39]. Az aktivációt különböző

extracelluláris jelek indukálhatják, például sejtpusztulás következtében kibocsátott anyagok,

kórokozók vagy sérülés. Az aktivációs folyamat nem csak morfológiai változásokkal jár, hanem

előidézi az intracelluláris jelátviteli és génexpressziós folyamatok megváltozását is, melyek

következtében a sejtek gyulladáskeltő vagy csökkentő citokineket termelhetnek [1][3].

A mikrokörnyezetükből érkező különböző ingerek hatására változás mutatkozik a sejtek

citokin-, receptor- és más egyéb markereinek expressziójában, mely alapján a mikroglia sejteket

különböző funkcionális fenotípus kategóriákba sorolhatjuk. A mikroglia esetében a

makrofágokhoz hasonlóan kétféle aktivált fenotípust különböztet meg az irodalom, melyek a

klasszikusan aktivált M1-es és az alternatívan aktivált M2-es típus [32]. Az M1 típusú

mikrogliára fokozott proinflammatorikus citokin (például interleukin-1β és tumor nekrózis

faktor-α) és szabadgyök (például nitrogén-monoxid) termelés jellemző, így ez a típus szerepet

játszhat a gyulladás következtében fellépő szöveti károsodásban [13][32]. Ezen változások

mellett a klasszikusan aktivált sejtek morfológiája is jelentősen megváltozik. A gyulladásos

válaszokban résztvevő mikroglia esetében megfigyelték, hogy a vékony nyúlványok

fokozatosan visszahúzódnak, megvastagodnak, majd végül a sejt amőboid formát vesz fel [13].

Az M2-es fenotípusú mikroglia antiinflammatorikus citokineket (például interleukin-10) és

9

növekedési faktorokat termel, valamint fokozott fagocitotikus aktivitás jellemzi. Ez a típus részt

vehet a sérülések utáni regenerációban és a sejttörmelék eltakarításában [32].

Összességében, a különböző környezeti változásokra reagálva a mikroglia sejtek

jelentős fenotípusos plaszticitást mutatnak mind morfológiai, mind funkcionális szempontból,

valamint szerepet játszhatnak neurotoxikus és neuroprotektív folyamatokban egyaránt. A

morfológiai változásokból viszont sajnos nem lehet egyértelműen következtetni a sejtek

expressziós profiljára, vagyis funkcionális orientációjára [3][39].

1. ábra: Mikroglia aktiváció fokális központi idegrendszeri sérülést követően [40].

Nekrotikus sejthalál következtében a károsodott szövet és az azt körülvevő asztrociták ATP-t

bocsátanak ki, mely specifikus, mikroglia sejtek által expresszált receptorokat aktivál. Az ábrán

jelölt P2X4R és P2Y12R receptorok aktív állapotban a sérülés felé lévő nyúlványok sérülés

irányába történő kiterjesztését, illetve a többi nyúlvány visszahúzását indukálják. Ezt követően,

a P2Y6R receptor közvetítésével a sejt egyetlen fagocitotikus nyúlványt alakít ki, ami végül

egybeolvad a sejttesttel. Az így kialakult fagocita részt vesz a sejttörmelék extracelluláris térből

történő eltakarításában.

10

2. ábra: A mikroglia sejtek változatos morfológiájának sematikus ábrázolása [41].

Nyugalmi állapotban (A) a sejtekre hosszú és elágazó nyúlványok jellemzők. Enyhén aktivált

állapotban (B) a nyúlványrendszer elágazódása fokozódik, míg közepesen aktivált/reaktív

állapotban (C) megnagyobbodott sejttest, rövidebb és vastagabb (visszahúzódó) nyúlványok

figyelhetők meg. Az amőboid állapotra (D) lekerekített forma, kevés nyúlvány, vagy a

nyúlványok hiánya, valamint nagy proinflammatorikus aktivitás jellemző.

2.2. Stresszválaszt befolyásoló agyi régiók és hormonok

A stressz egy olyan faktor, mely befolyásolni tudja az immunrendszer reakciókészségét,

tartós jelenléte esetén jelentősen fokozhatja a gyulladásos folyamatokat és meghosszabbítja

azok fennállását [4-5], valamint a különösen nagy stresszel járó események a depresszió

elsődleges rizikófaktorai [13]. Felismerték már, hogy stressz hatására számos fiziológiás és

patológiás változás következik be mind a periférián, mind a központi idegrendszer szintjén.

A krónikus stressz okozhat idegi károsodást, illetve negatívan befolyásolhatja a

neurogenezist és a plaszticitást [4]. A stressz központi idegrendszerre gyakorolt hatásai

nagyrészt a keringési rendszerben jelenlévő kortikoszteroidoknak tulajdoníthatók, melyek a

hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg tengely stressz által történő aktiválódása során

szabadulnak fel, majd a vér-agy gáton átjutva, specifikus receptorokon keresztül fejtik ki az

idegsejtekre gyakorolt hatásukat [4]. A mellékvesekéreg az emlősök egyik fő stressz szerve,

mely közvetítő szerepet játszik a külső és belső stresszorok által kiváltott stresszreakcióban

glükokortikoidok, például rágcsálók esetében kortikoszteron termelésével. A mellékvesekéreg

kortikoszteroid szintézisének és szekréciójának fő szabályozója az adrenokortikotrophormon

(ACTH) [28]. Az ACTH egy peptidhormon, mely az adenohipofízesben képződik.

Termelődését a hipotalamuszban lévő paraventrikuláris mag parvocelluláris magcsoportja által

termelt kortikotropin felszabadító hormon stimulálja [29], tehát a hipotalamusz-hipofízis-

mellékvesekéreg tengely hormontermelésének egyik fő szabályozója a paraventrikuláris mag,

11

mely stressz hatására serkenti az ACTH szekréciót. Az ACTH stimulálja a kortikoszteron

szintézist, mely végül negatív visszacsatolás révén visszahat a rendszerre [29].

A stresszválaszban további fontos résztvevő a szimpatikus idegrendszer is, mely stressz hatására

adrenalint és noradrenalint szabadít fel. Ezek fiziológiás hatása igen gyors, jelentős szívritmus

emelkedést, perifériás vazokonstrikciót, vérnyomás emelkedést és energia mobilizációt

eredményeznek [13].

Ezen kívül jól ismert, hogy a stressz hatással van a szervezet metabolizmusára, végső

soron befolyásolja a testtömeg változását [4]. A hipotalamuszban található nucleus arcuatus a

táplálékfelvétel és az energia felhasználás egyik fontos központi szabályozó régiója, valamint a

perifériáról érkező metabolikus és humorális szignálok (metabolitok, leptin, inzulin) szenzora

[6][31]. A nucleus aruatusban található neuronok másodlagos neuronoknak továbbítják az

információt, mint például a paraventrikuláris mag parvocellularis sejtjeinek [31], így

befolyásolják a szervezetet érintő stresszre adott neuroendokrin és autonóm választ.

2.3. Mikroglia sejtek kapcsolata a gyulladásos és a stresszel járó

folyamatokkal

Az agyban fellépő gyulladásos reakciók, melyek igazolhatók a mikroglia sejtek

tulajdonságainak változásával a neurodegeneratív betegségek közös jellemzői [32]. Számos

tanulmány vizsgálta már a mikroglia sejteket, mint lehetséges mediátorokat a gyulladással járó

idegi kórfolyamatokban, melyek kimutatták, hogy több neurodegeneratív megbetegedés,

például a Parkinson kór, az Alzheimer kór, a Huntington kór és a sclerosis multiplex esetén is

megfigyelhető kóros mikroglia aktiváció [4]. Kimutatták, hogy az akut fizikai illetve érzelmi

stressz jelentős hatással van mikroglia morfológiai aktiválására a hipotalamusz és hippocampus

területén [4-5], és az aktiváció mértéke arányos a stressz időtartamával [4]. Ezen kívül ismert,

hogy az akut stressz jelentősen növelheti a proinflammatorikus citokinek szintjét a patkányok

agyában, melyek egyik fő forrása a mikroglia [13].

Egy másik kutatásban [5], melyben a krónikus stressz hatását vizsgálták patkányokon arra

jutottak, hogy a krónikus stressz szelektíven növeli a mikroglia sejtek számát bizonyos stressz-

érzékeny agyi területeken, és a nyugalmi állapotban lévő mikroglia sejtek átalakulását indukálja.

Összesen 15 agyterületet vizsgáltak, melyből 9 esetben mutatkozott szignifikáns különbség a

kísérleti és kontroll csoport között. Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a mikroglia

aktiváció fontos szerepet játszhat a stresszválasz szabályozásában és a stresszhez való

alkalmazkodásban. Kreisel és mtsai [10] a mikroglia aktiváció dinamikus változásának szerepét

vizsgálták krónikus stressz indukálta depressziószerű állapot kialakulásában, rágcsálókon.

Kutatásuk eredményeképp azt kapták, hogy a mikroglia sejtek működésének zavara etiológiai

szerepet játszik a stressz indukálta depresszióban. Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a

12

mikroglia stimulátorok gyorsan ható antidepresszánsként szolgálhatnak a depresszív és stresszel

kapcsolatos állapotok egyes formáiban.

2.4. Mikroglia sejtek különböző paramétereinek meghatározása

képelemző eljárásokkal

Az automatizált képelemző eljárások előnye a manuális módszerekkel szemben, hogy

nagy adathalmazok gyors és objektív elemzését teszik lehetővé. A továbbiakban ismertetem

néhány, a szakirodalomban fellelhető módszer áttekintését. A tanulmányok többségében a

sejteket egy mikroglia-specifikus markerrel, az ionizált kálciumkötő adapter molekulával (Iba-

1) detektálták [5][7-9], de volt, hogy genetikai manipuláció következtében, specifikusan a

mikroglia sejtekben expresszálódó zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) használtak [10]. Az

elemzésre szánt felvételeket a fehérje jelölés módjától függően konfokális [7-8][10] vagy

fénymikroszkóppal [4][9] készítették.

Sugama és mtsai. [4] intenzitásérték-alapú szegmentálást alkalmaztak. Minden olyan

pixelt, aminek értéke nem haladta meg a küszöbértéket a sejthez rendeltek, míg ellenkező

esetben a háttérhez. A küszöbértéket minden egyes sejthez manuálisan állították be. Az

eredmény egy bináris kép lett, melyből a WinROOF képelemző szoftver segítségével

kiszámították a sejt felszínét. Tynan és mtsai. [5] szintén az intenzitásértékeket vették alapul a

felvételek szegmentálásához, majd méretalapú szűrést is alkalmaztak a pontosabb eredmény

érdekében. Meghatározták a sejtek számát, valamint az Iba-1 pozitív területek százalékos

arányát a vizsgált régióban. A sejtek méretének becslésére a sejtek által elfoglalt összterületet

elosztották a sejtek számával.

Zhang és mtsai [7] a retinában található mikroglia sejtek térbeli jellemzőit vizsgálták

képfeldolgozó eljárásokkal. Kifejlesztettek egy olyan MATLAB-alapú módszert, melynek fő

építőelemei a képjavítás és szegmentálás, a morfológiai alapú sejtfelismerés és a területszámítás.

A feldolgozás során logaritmikus képjavítást és küszöbérték-alapú szegmentálást alkalmaztak.

Kozlowski és Weimer [8] szintén MATLAB-alapú módszert implementált a mikroglia sejtek

morfológiájának automatikus meghatározására. A szegmentáció első lépéseként lokális

maximumkereső algoritmussal meghatározták a sejtek pozícióját. A sejtmaszkokat az egyes

pozíciók meghatározott környezetében számított iteratív lokális küszöbérték alapján hozták

létre. A sejtenkénti morfológiai elemzéshez lokális iteratív küszöbérték-alapú szegmentálással

különítették el a sejteket a háttértől. Az így kapott sejtek alakjának jellemzéséhez a sejtek

kerületét, kiterjedését, excentricitását és a sejttest méretét vették alapul. Belátták, hogy az olyan

marker segítségével történő elemzés, mely intenzitása változik a mikroglia aktivációs állapotától

13

függően külön kihívást rejt magában, mivel az aktivált sejtek így könnyebben detektálhatók,

mint a nyugalmi állapotban lévők. Ilyen marker például az Iba-1 is.

A következő tanulmányban [9] patkányok prefrontális lebenyében lévő mikroglia sejteket

vizsgáltak NeuroExplorer és MATLAB szoftverek segítségével. Meghatározták a sejttest

kerületét, az elsődleges nyúlványok számát, az elágazások számát, a nyúlványok hosszát,

valamint azt a területet, mely magában foglalja az egész sejtet. Utóbbit abból a konvex

sokszögből határozták meg, melyet a sejt legtávolabbra nyúló nyúlványaira illesztve kaptak.

Egy másik tanulmányban Kriesel és mtsai. [10] a sejtek számát és a sejttestek által elfoglalt

területet Nikon Imaging Elements Software segítségével automatikusan határozták meg. A

nyúlványok hosszának kiszámításához az egyes nyúlványokat manuálisan követték nyomon, és

jelölték.

2.5. Képek szegmentálására alkalmazott módszerek áttekintése

A képek szegmentálása fontos, és gyakran alapvető lépés a képelemzés, objektum

reprezentáció és sok más képfeldolgozási feladat tekintetében is. Ez alatt azt a folyamatot értjük,

melynek során felosztjuk a képet több, az elvégzendő feladat szempontjából érdekes részre.

Főként a felvételen található objektumok kinyerésére használják. Számos szegmentáló eljárást

fejlesztettek ki az elmúlt időszakban, melyeket a következő főbb kategóriákba sorolhatjuk [12]:

1. Küszöbérték alapú szegmentáció

2. Régió alapú szegmentáció

3. Él alapú szegmentáció

4. Klaszterezés

5. Illesztés (matching)

1. Küszöbérték alapú szegmentáció

A küszöbölés egy gyakran használt, nagyon egyszerű és kis számítási teljesítményt igénylő

szegmentációs eljárás, melynek során többnyire az intenzitásértékeket veszik alapul. Ennél

a módszernél feltesszük, hogy a kép egyes részei szétválaszthatók az intenzitásértékeik

alapján, tehát létezik egy t érték, melynél kisebb értékű pixelek a háttérhez (0), nagyobb

értékű pixelek pedig az objektumokhoz (1) tartoznak [7][11] világos előtér objektumokat

feltételezve:

𝑦(𝑛1, 𝑛2) = { 0 𝑥(𝑛1, 𝑛2) ≤ 𝑡

1 𝑥(𝑛1, 𝑛2) > 𝑡

Az optimális küszöbérték, vagyis t meghatározása több módon történhet. Az egyik ilyen az

Otsu által kifejlesztett módszer alkalmazása, mely automatikusan meghatározza az optimális

14

globális küszöbértéket az intenzitásosztályok közötti variancia maximalizálásával [7]. A kép

felosztásához továbbá hisztogram küszöbölést illetve vágást szoktak használni.

Ez a technika jól alkalmazható olyan képekre, melyek sötétebb háttéren világos

objektumokat tartalmaznak [12] (vagy fordítva), de sajnos sok esetben egy sima küszöbölés

nem elegendő a kívánt cél eléréséhez, például a kép egyenetlen megvilágítása miatt [11]. A

munkám során vizsgált felvételeken a háttér és a sejttesteknek megfelelő régiók

intenzitástartománya jelentősen eltér, így ez a módszer alkalmazható.

Nem csak az intenzitásértékek alapján lehet küszöbölni. A szegmentáció eredményeképp

kapott bináris képen lehet például az objektumok mérete alapján történő küszöböléssel

finomítani az eredményen.

2. Régió alapú szegmentáció

A régió alapú szegmentálás két alapvető művelettel dolgozik, a terület-szétválasztással és a

területegyesítéssel. Mindkét esetben definiálni kell egy hasonlósági kritériumot, mely

alapján az alkalmazott algoritmus eldönti, hogy mit csináljon az aktuális régióval (például

szétválassza a régiót vagy sem) [12]. Ez lehet akár textúra vagy színbéli hasonlóság, például

egyesíthetünk két régiót az alapján, hogy az intenzitásértékeik átlagának különbsége elér-e

egy előre meghatározott értéket [11].

3. Él alapú szegmentáció

Ennél a módszernél azzal a feltevéssel élünk, hogy a képen lévő élek az objektumok

körvonalait reprezentálják, ily módon alkalmasak azok azonosítására. A szegmentáció első

lépése általában egy olyan bináris kép létrehozása, ami csak az éleket tartalmazza [12].

Tekintsünk a képre egy függvényként, melynek értelmezési tartománya a pixelek halmaza,

értékkészlete pedig a felvehető intenzitásértékek halmaza (intenzitásfüggvény). Ekkor az

intenzitásértékekben bekövetkező változás mértékét és irányát a gradiens kiszámításával

tudjuk meghatározni [11]:

𝑱(𝑥, 𝑦) = ∇𝐼(𝑥, 𝑦) = (𝜕𝐼(𝑥, 𝑦)

𝜕𝑥,𝜕𝐼(𝑥, 𝑦)

𝜕𝑦) (𝑥, 𝑦).

Az élek a kép azon részei, ahol az intenzitás hirtelen változik, tehát azokat a pontokat

keressük, ahol a gradiens nagy.

Az élek detektálása után a következő lépés, hogy az észlelt élek közül kizárjuk azokat,

melyek nem zártak, majd a fennmaradó zárt éleket kitölthetjük az eredeti kép megfelelő

részeivel [12]. Így megkapjuk eredményül a szegmentált képet. Ez a módszer érzékeny a

zajra, és nem működik jól azokon a képeken, melyekre alacsony kontraszt, valamint az

objektumok és a háttér közötti sima átmenet jellemző. Mivel a vizsgált felvételek sok esetben

15

zajosak (például fedés közben keletkezett buborékok), jellemző rájuk a sima átmenet és az

alacsony kontraszt, ezért nem ezt a módszert alkalmaztam a munkám során.

4. Klaszterezés

A klaszterező módszerek valamilyen szempontból hasonló minták csoportosítására

hivatottak. Az egyik alapvető módszer a K-közép klaszterezés, melynek célja a kép K darab

szegmensre történő felosztása a klaszteren belüli variancia minimalizálásával. Hátránya,

hogy a klaszterek számát (K) előre meg kell adni [12].

A másik elterjedt módszer az úgynevezett mean-shift algoritmus, ami egy nem paraméteres

iteratív klaszterezési technika, mely egy ismeretlen sűrűségfüggvényből származó mintákkal

modellezi az egyes pixelekhez tartozó jellemzővektorokat (feature vector), majd megpróbál

klasztereket találni az így kapott eloszlásban [11].

5. Illesztés

Ha van előzetes információnk arról, hogy az objektum, amit azonosítani szeretnénk a

képeken hogyan néz ki, akkor ezt felhasználhatjuk a szegmentálás során. Ehhez szükséges

egy sablon, ami jól reprezentálja az adott objektumot. A sablont a kép különböző részeihez

hasonlítjuk mindaddig, amíg meg nem találjuk a kívánt objektumot [12]. Az általunk vizsgált

sejtek alakja elég változatos, így nem állt rendelkezésemre olyan általános sablon, ami

megfelelően reprezentálná a sejtek különböző állapotait, így munkám során nem

alkalmaztam ezt a módszert.

2.6. Sejtek szegmentálására használt képfeldolgozási technikák

A mikroszkópos képek szegmentálásának célja a sejtmagok, sejtek vagy szöveti

komponensek elkülönítése a kép többi részétől [14]. A sejteket ábrázoló képek automatizált

szegmentálása általában nagyobb kihívást jelent, egyrészt a sejtekre jellemző tulajdonságok

(például alak, méret, textúra és sejtsűrűség) nagy változatossága, másrészt a különböző festési

eljárások és mikroszkópok miatt [15].

Az intenzitás alapú küszöbölés a legrégebbi, és a mai napig az egyik leggyakrabban

használt módszer [14-15], mivel a festési eljárások eredményeképp a sejtek jelentősen eltérő

intenzitással rendelkeznek, mint a háttér. Ez a módszer önmagában általában nem szolgáltat jó

eredményt, ezért sok esetben ez csak a szegmentáció első lépése.

Elterjedt módszer továbbá a különböző morfológiai operátorok, mint például az erózió és

dilatáció alkalmazása mind elő, mind utófeldolgozási lépésként. Ezen kívül gyakran

alkalmazzák a watershed transzformációt és az aktív kontúr módszert is. Tekintsünk a képre egy

elárasztott topografikus térképként, ahol az élek jelzik a kiemelkedéseket. A watershed

16

transzformáció megtalálja a képen lévő vízgyűjtő medencéket (vagyis objektumokat), melyeket

vízválasztó vonalak választanak el egymástól. Ezen vonalak összessége adja a watershed

vonalat. Az elárasztás forrásaként szolgáló jelzőpontokat definiálhatjuk a gradiens lokális

minimumaiként, ám ez gyakran túlszegmentáláshoz vezet [11][20][26]. A jelzőpontokat

meghatározhatjuk más módszerekkel is, például morfológiai operátorok alkalmazásával [20].

Az aktív kontúr módszer igen ígéretes technikának bizonyult, mellyel jó eredményeket lehet

elérni, de ugyanakkor kihívást jelenthet a megfelelő kezdeti állapot megválasztása [14].

17

3. Módszerek

Ebben a fejezetben bemutatom azokat a módszereket, melyeket munkám során

alkalmaztam. Ezek három nagy csoportra bonthatók, melyek a következők: (1) kísérleti állatok

stresszelése, melynek célja változás indukálása a mikroglia sejtekben, (2) kísérleti állatok

feldolgozása, mely magában foglalja az állatok agyának előkészítését, a mikroglia sejtek

kimutatását és fénymikroszkóppal történő megjelenítését, (3) fénymikroszkópos felvételek

elemzése, melynek célja a mikroglia sejtek kvantitatív vizsgálata, a stressz kísérlet hatására

esetlegesen bekövetkező változások kimutatása.

3.1. Kísérleti állatok és kísérleti elrendezés

A stressz kísérletben összesen 55 Wistar patkányt (kísérleti csoport: n = 31 ♂, kontroll

csoport: n = 24 ♂) vizsgáltunk. A kísérleti csoport egyedein posztnatálisan anyai szeparációt

végeztünk, vagyis születésüktől számított 2 héten keresztül napi 3 órára elválasztottuk az

anyjuktól őket. Ily módon ezek az egyedek korai, úgynevezett „early life” stressznek lettek

kitéve. A korai stressz után az állatokat csoportosan helyeztük el, és 7 hetes (felnőtt) koruktól

kezdve, 3 héten keresztül, napi két alkalommal különböző enyhe stresszhatásoknak tettük ki

őket. A stresszorokat a kísérlet tervezésekor random módon válogattuk. Ezt a procedúrát

krónikus variábilis stressznek (chronic variable stress, CVS) nevezi az irodalom. Az általunk

alkalmazott krónikus variábilis stressz protokollt az 1. táblázat szemlélteti.

Az állatok testtömeg gyarapodásának követése céljából a CVS előtt és után is

megmértük testtömegüket. A kísérleti és a kontroll csoport állatait feldolgozásuk módja alapján

további két alcsoportra bontottuk. Az első csoport (kísérleti csoport: n = 8 ♂, kontroll csoport:

n = 8 ♂) metabolikus paramétereit (például légzési hányados, energia leadás) a kísérlet 18.

napjától kezdve 3 napon keresztül indirekt kalorimetriával felvételeztük. A metabolikus mérés

végeztével ezen állatokat perfundáltuk, agyukat feldolgoztuk.

A másik csoport (kísérleti csoport: n = 23 ♂, kontroll csoport: n = 16 ♂) egyedein a kísérlet

végeztével viselkedés teszteket, például cukor preferencia tesztet végeztünk. A cukor

preferencia teszt során a kísérleti állatok 24 órán keresztül szabadon választhattak két palack

közül. Az egyik 1%-os szacharóz oldatot, a másik sima csapvizet tartalmazott. A két palackot

felcseréltük 12 óra letelte után. Az állatok folyadék fogyasztását a palackok tömegének

mérésével követtük. A cukor preferencia kiszámításánál az elfogyasztott szacharóz oldat

százalékos arányát viszonyítottuk a teljes elfogyasztott folyadékmennyiséghez. Végül

dekapitáltuk a csoport egyedeit, és vért vettünk tőlük hormonvizsgálat céljából. A levett

vérmintákat egyből centrifugáltuk és az így kapott vérplazmát felhasználásig -20°C-on tároltuk.

A plazma ACTH és kortikoszteron koncentrációját direkt radioimmunoassay segítségével

18

határoztuk meg. Ez a specifikus eljárás antigén-antitest reakción alapszik, segítségével

meghatározható kis koncentrációjú, antigén sajátosságot mutató molekulák mennyisége. A

továbbiakban az általam részletesebben vizsgált, első csoporton alkalmazott módszereket fogom

ismertetni.

Nap Délelőtt Délután

1. cukor preferencia teszt világosság és nedves alom, 1 éjszaka

2. macska vizelet szaganyag, 15 p elektromos sokk (0,5 mA 30 mp-enként),

5 p

3. alom nélküli izoláció zsúfoltság alomtársakkal

4. mozgáskorlátozás, 30 p tiszta ketrec, alja 4°C-ra hűtve

5. stroboszkóp zsúfoltság alomtársakkal

6. predátor szaganyag (róka) és izoláció,

15 p sötétség és izoláció, 1 éjszaka

7. x szociális elkerülés

8. elektromos sokk (0,5 mA 30 mp-enként),

5 p világosság

9. alom nélküli izoláció dőlt ketrec és nedves alom

10. mozgáskorlátozás, 30 p világosság, 1 éjszaka

11. dőlt ketrec szociális kudarc

12. stroboszkóp világosság, 1 éjszaka

13. sötétség sötétség

14. mozgáskorlátozás, 30 p nedves alom, 1 éjszaka

15. elektromos sokk (0,5 mA 30 mp-enként),

5 p alom nélküli izoláció és világosság

16. zsúfoltság és sötétség, 4 ó stroboszkóp

17. tiszta ketrec, alja 4°C-ra hűtve predátor szaganyag (róka), 15 p

18. zsúfoltság dőlt ketrec és nedves alom

19. stroboszkóp világosság, 1 éjszaka

20. elektromos sokk (0,5 mA 30 mp-enként),

5 p izoláció

21. kényszerített úszás teszt cukor preferencia teszt

22. cukor preferencia teszt megemelt keresztpalló teszt

23. x stroboszkóp

1. táblázat: CVS protokoll összefoglalása naponkénti bontásban

19

3.2. Perfúzió és szövetfeldolgozás

A metabolikus mérést követően az első csoport állatainak túlaltatása (200 mg/ttkg

nembutállal), majd transzkardiális perfúziója következett először fiziológiás sóoldattal (0.9%

NaCl), majd 70 ml jéghideg fixálóval (4% paraformaldehid, 0.4 M foszfát pufferben, pH:7). A

perfúzió célja a vérerek kimosása és a szövet fixálása, mely közvetlenül az állat saját keringési

rendszeren keresztül végzett, úgynevezett belső fixálással valósul meg. Előnye, hogy a fixáló

folyadék a kapilláris hálózaton keresztül eljut mindenhova, így a fixálás a célszerv teljes

területén szinte egyszerre kezdődik. További előnye, hogy a szervet/szöveteket még azelőtt

rögzítjük, hogy az állatból eltávolítottuk volna, ezzel nagymértékben csökkentve az esetlegesen

fellépő mechanikai roncsolódást vagy számottevő bomlást [38].

A perfúzió után a koponyából eltávolított agyat 10% szacharózt tartalmazó fixáló folyadékban

tároltuk 3 órán keresztül (poszt-fixálás), majd 10% szacharózt tartalmazó 0.1M KPBS-ben

(kálium-foszfát puffer, pH7.4) tároltuk egy éjszakán át 4oC-on. Ezt követően 25µm-es koronális

metszeteket készítettünk fagyasztó mikrotomon, melyeket felhasználásig fagyálló folyadékban,

-20oC-on tároltunk. Ezután a metszetek immunhisztokémiai festése következett.

Az immunhisztokémiai festés egy olyan általános biokémiai eljárás, mellyel szöveti

antigéneket lehet kimutatni egy adott mintában specifikus ellenanyag segítségével. Ez történhet

enzimreakció következményeképp kiváló csapadék vagy fluorofórok segítségével. Előbbi

esetben az eredmény fénymikroszkóppal, míg utóbbi esetben floureszcens mikroszkóppal

vizsgálható [38]. Az immunhisztokémiai eljárás során lezajló reakció sematikus ábrázolása a 3.

ábrán látható.

Az Iba-1 immunhisztokémiai eljáráslépései az alábbiak voltak:

1. KPBS-el történő mosás 4x5 percig a fagyálló metszetekből történő kimosása céljából

2. Endogén peroxidázok gátlása, 0,3 %-os H2O2 (hidrogénperoxid) oldattal történő mosás

5 percig

3. KPBS-el történő mosás 4x5 percig a H2O2 oldat metszetből történő kimosása céljából

4. Blokkoló szérum (2% normál kecske szérum) 1 óra

5. Primer antitestet tartalmazó oldatban (nyúlban termeltetett anti Iba-1, 1:1000

hígításban) történő inkubálás 4°C-on egy éjszakán át

6. KPBS-el történő mosás 4x5 percig

7. Szekunder antitestet (kecskében termeltetett biotinilált anti-nyúl IgG, Vector,

Burlingame, CA, USA) tartalmazó oldatban történő inkubálás 1 órán keresztül

8. KPBS-el történő mosás 4x5 percig

9. Avidin-biotin-enzim (HRP, torma peroxidáz) komplexet (Elite Plus kit, Vector)

tartalmazó oldatban történő inkubálás 1 órán keresztül

20

10. KPBS-el történő mosás 4x5 percig

11. Na-acetátos (0,1M) mosás 2x10 percig az ideális pH beállítása céljából

12. Előhívás (7,5 ml DV (desztillált víz) + 15 mg DAB (3,3´- diaminobenzidin) + 7,5 ml

NAS (nikkel ammónium szulfát) + 225 µl 0.3%-os H2O2 (500 µl DV-be 5 µl 30%-os))

13. Na-acetátos (0,1M) mosás 2x10 percig

14. KPBS-el történő mosás 2x10 percig

15. Festett metszetek felhúzása zselatinos tárgylemezre

16. Dehidrálás felszálló alkoholsorban

17. Depex fedőanyaggal történő fedés

Az ily módon megfestett metszetekről fénymikroszkópos felvételeket készítettünk húszszoros

nagyításban Nikon Eclispe 6000 mikroszkóp és Spot RT színes digitális kamera (Diagnostic

Instruments Inc., IL, USA) segítségével. Dolgozatomban a hipotalamuszban található nucleus

paraventricularisról és a nucleus arcuatusról készített felvételeket vizsgáltam, állatonként

átlagosan 3-3 metszeten bilaterálisan. Ezen agyterületek sematikus ábrázolása a 4. ábrán látható.

A metszeteket patkány agyatlasz [30] alapján válogattuk.

3. ábra: Az immunhisztokémiai eljárás során lezajló reakció sematikus ábrázolása [42]. A

vizsgált fehérje (esetünkben Iba-1) más fajba beoltva antigénként viselkedik, tehát indukálja a

rá specifikus antitestek termelődését. Az antitestekben gazdag vérplazmából készült primer

ellenanyagot használhatjuk az Iba-1 kimutatására. Az avidin-biotin komplex módszer esetén

biotinilált szekunder (primer ellenanyagot specifikusan felismerni képes) antitestek kapcsolják

Biotin

Avidin

Riporter enzim

Szöveti antigén

Primer antitest

Biotinilált szekunder antitest

21

össze a primer antitesteket az avidin-biotin-peroxidáz komplexekkel. Színtelen szubsztrát

hozzáadása után az enzimreakció lezajlik, mely során oldhatatlan, színes csapadék képződik.

4. ábra: A dolgozatban vizsgált agyterületek sematikus ábrázolása [43]. Az ábra bal oldalán

lévő metszeten a nucleus paraventrikularis (PVN), míg a jobb oldalán lévőn a nucleus arcuatus

(ARC) látható, melyeket pirossal jelöltem.

3.3. Felvételek elemzésére kidolgozott módszer bemutatása

Az elkészült felvételeket MATLAB (R2017a) szoftver, és annak képfeldolgozó

eszköztára segítségével elemeztem. A képek eredeti mérete 1600x1200 pixel volt, de mivel

olyan régiókat is tartalmaztak, melyek nem az általam vizsgált területekhez tartoztak, ezért

kivágtam belőlük a vizsgálni kívánt részletet. A kidolgozott eljárás három főbb lépésből áll,

melyek a következők: (1) sejtek detektálása, (2) a sejtekhez tartozó nyúlványrendszer

modellezése, (3) a detektált mikroglia sejtek különböző paramétereinek meghatározása a stressz

kísérlet hatására esetlegesen bekövetkező változások kimutatása céljából. A 16 kísérleti állatból

összesen 178 felvételt készítettünk, ezért létrehoztam egy 30 darab, random módon válogatott

képből álló tesztadatbázist, melyen a különböző kipróbált módszereket teszteltem. Azt a

módszert, mely jó eredményt adott a tesztadatbázison kipróbáltam a teljes adatbázisra lefuttatva

is, majd a legjobb eredményt adó eljárás mellett döntöttem.

3.3.1. Sejtek detektálása

A sejtek detektálására olyan módszerek használhatók, melyek azok alapvető jellemzőit

képesek hatékonyan kiemelni. Mivel a szürkeárnyalatos képek esetén hiányzik a

színinformáció, így a sejteket leginkább az őket leíró, a háttértől különböző intenzitásértékekkel

és a belső textúrákkal tudjuk jellemezni. Ez a korlátozott jellemzőkészlet leszűkíti az

alkalmazható eljárások skáláját is, így a munkám során az intenzitás alapú küszöbölő és régió

22

alapú eljárásokkal, illetve textúra alapú csoportosítással próbálkoztam. Sejtszegmentálás esetén

elterjedt még a sejtek alakjára vonatkozó alaki megkötésekkel dolgozó eljárások alkalmazása

[23], ezek azonban a mikroglia sejtek rendkívül változatos nyúlványrendszere miatt nem

jöhettek szóba. Mivel a sejtekhez tartozó nyúlványrendszer pontos detektálása kulcsfontosságú

a stressz hatására esetlegesen bekövetkező változások követése céljából, így a nyúlványok

modellezésére régió alapú aktív kontúr módszert használtam, mely képes a nagy alaki

változatosság kezelésére.

A különböző módszerek tesztelése során megpróbáltam a képekre a [22]-ben leírt

textúra alapú eljárást alkalmazni. Ez a módszer kisebb egységekre, úgynevezett textúra

atomokra bontja, majd az atomok statisztikai megkülönböztethetősége alapján osztályozza a

képet. Az eljárás négy főbb szakaszra bontható, melyek sorrendben a következők: rotáció

invariáns, szomszédság alapú textúra ábrázolás; ritka textúrák modellezése textúra atom

tanuláson keresztül; az atomok statisztikai megkülönböztethetősége alapján egy teljes, súlyozott

gráf létrehozása, ahol a csúcsok a textúra atomok, az élek súlyai pedig az élek által összekötött

két atom statisztikai megkülönböztethetősége; a textúra atomok előfordulási valószínűsége és

statisztikai megkülönböztethetősége alapján feltűnőségi térkép (saliency map) kiszámítása.

Alapvetően a természetes képeken lévő kiugró régiók detektálására lett kifejlesztve, melyhez az

optimális atomszámot 20-nak találták. Mivel az általam vizsgált képeken jóval kevesebb típusú

textúra fordul elő, mint a természetes képeken, ezért az atomszámot csökkentve teszteltem a

módszert. Ez az eljárás ígéretesnek tűnt a képek egy részén, viszont több esetben egy osztályba

sorolta a sejtmagoknak megfelelő homogénebb régiókat a háttérrel (5. ábra). Mivel több

atomszám kipróbálásával sem sikerült olyan beállítást találni, mely a tesztképeken egységesen

működött volna, így elvetettem ezt a módszert.

Ezen kívül megpróbáltam a sejteket csupán aktív kontúr eljárás segítségével detektálni. Ennél a

módszernél fontos a megfelelő kiindulási állapot megválasztása, így ha nem rendelkezünk

előzetes információval az objektumok vélhető elhelyezkedéséről, az pontatlan eredményre

vezethet. A detekció kezdetén nem volt előzetes információm, ami alapján el tudtam volna

indítani az algoritmust, ezért egy négyzetrácsos maszkkal inicializáltam. Ez sajnos nem vezetett

jó eredményre az esetek egy részében (6. ábra), mivel az algoritmus minden egyes négyzetben

próbált valami struktúrát keresni és ez alapján meghatározni az előteret, így az eljárás

alkalmazása önmagában nem hatékony, szükséges hozzá egy előfeldolgozási lépésben

előállított kezdeti maszk, mely a sejtek pozíciójára jó közelítést ad.

A különböző eljárások kipróbálása során arra jutottam, hogy a sejtek textúra jellemzőjének

változatossága nem teszi lehetővé a textúra, mint önálló sejtjellemző alkalmazását a hatékony

szegmentálás eléréséhez, így a kidolgozott módszer a sejteket az intenzitásértékük alapján

különbözteti meg a háttértől. A következőkben ismertetem a választott módszert, mely alapját

logaritmikus transzformáció és többszintű, küszöbérték-alapú szegmentálás képzi.

23

5. ábra: A textúra alapú eljárás eredményének bemutatása 4-es atomszámmal. Az ábra A

és C részén egy-egy részlet látható két különböző képből, míg a B és D részén ezen képek

osztályozott változata szerepel. Látszik, hogy a második esetben (D-vel jelölt kép) a háttér és a

sejtmagoknak megfelelő régiók is feketével jelennek meg, tehát az algoritmus egy osztályba

sorolta őket, míg az első esetben (B-vel jelölt kép) a sejtmagokat külön osztályba sorolta.

24

6. ábra: Aktív kontúr módszerrel kapott eredmény négyzetrácsos maszkkal történő

inicializálás esetén. Az ábra A és C részén egy-egy részlet látható két különböző képből, míg

a B és D részén ezen képek szegmentált változata szerepel. Látható, hogy az első esetben (B

kép) megfelelő a szegmentálás eredménye, míg a második esetben (D kép) mintha felcserélné

az előteret és a hátteret a nem megfelelő inicializálás következtében.

3.3.1.1. Előfeldolgozás

A feldolgozás első lépéseként adaptív hisztogram kiegyenlítést alkalmaztam

(adapthisteq függvény). A hisztogram megadja, hogy egy képen összesen hány pixel veszi fel

az adott intenzitásértéket. A hisztogram kiegyenlítés célja a kontraszt növelése az

intenzitásértékek teljes dinamikatartományon történő egyenletes elosztásával. Az adaptív

módszer nem globálisan, hanem a képet kisebb részekre osztva, minden részre egymástól

függetlenül alkalmazza a hisztogram kiegyenlítést [11]. Ezeket a kisebb részeket csempének is

szokták hívni. Az adapthisteq függvény a [16]-ban leírt, kontraszt-limitált adaptív hisztogram

kiegyenlítést implementálja, melyet eredetileg orvosi képalkotáshoz fejlesztettek ki. Sima

adaptív hisztogram kiegyenlítés esetén sajnos számolni kellene a módszer jelentős hátrányával,

ami a zaj nagymértékű erősítése. A zaj amplifikáció csökkenthető a homogén területeken történő

kontrasztjavítás korlátozásával. Ezek a területek azonosíthatók egy-egy nagyobb kiugrással a

hisztogramban, mivel az őket alkotó pixelek közel azonos intenzitástartományba esnek. A

kontraszt-limitált módszer korlátozza az egyes csempék lokális hisztogramjaihoz tartozó

25

pixelek maximális számát, majd az így eltávolításra kerülő pixeleket egyenletesen szétosztja a

teljes hisztogramon. Végül, a szomszédos csempék egyesítése bilineáris interpolációval történik

a folyamat során létrejött mesterséges határvonalak megszüntetése céljából.

Ezután az im2double függvényt alkalmaztam, mely a [0-1] intervallumra skálázza a képeket,

majd logaritmikus transzformációt használtam. Ha a kép minden egyes pixelének vesszük a

logaritmusát, akkor a kép dinamikatartománya szűkül, így ez a transzformáció kiemeli az

alacsony (sötét pixelek) és elnyomja a magas intenzitásértékeket (világos pixelek). Ennek

következtében a logaritmikus transzformáció alkalmazása megfontolandó, mivel az

alacsonyabb intenzitásértékek ugyan fokozódnak, viszont a magasabb intenzitásértékkel

rendelkező régiókban információvesztést eredményez [17]. Az általunk vizsgált képeken a

sejtek sötétebbek, a háttér pedig nem tartalmaz a feladat szempontjából releváns információt,

így a logaritmikus transzformáció alkalmazható. Mivel a képek tartalmazhatnak fekete pixeleket

(vagyis olyan pixeleket, melyre I(x,y) = 0), melynek logaritmusa mínusz végtelen, ezért a

transzformáció, és az im2double függvénnyel történő átskálázás előtt hozzáadtam egyet a

pixelértékekhez, tehát a következő képletet alkalmaztam a képekre pixelenként, c értékét egynek

választva [12]:

𝑦(𝑛1, 𝑛2) = ln(𝑥(𝑛1, 𝑛2) + 𝑐).

Ezután a mat2gray függvény segítségével visszaalakítottam a transzformáció eredményéül

kapott mátrixot intenzitás képpé.

7. ábra: Logaritmikus transzformáció működése. Ezt az ábrát a logaritmikus transzformáció

működésének bemutatása céljából készítettem. Látható, hogy az alacsonyabb intenzitásértékek

a transzformáció következtében az eredetinél egy jóval szélesebb, míg a magasabb

intenzitásérték viszonylag szűk tartományra skálázódnak.

26

8. ábra: Az előfeldolgozás lépéseinek bemutatása. Az ábra A-val jelölt részén az eredeti kép,

B-vel jelölt részén az adaptív hisztogram kiegyenlített, míg C-vel jelölt részén a logaritmikus

transzformáció eredményeképp kapott kép szerepel. A végeredmény egy olyan kép, melyen jól

elkülönül a háttér, a sejttest és a nyúlványok. Ez segíti a későbbi automatikus feldolgozást.

3.3.1.2. Szegmentálás

A következő lépés a képek szegmentálása volt, melyhez a 2.5. fejezetben ismertetett

módszerek közül az intenzitásértékek alapján történő küszöbölést választottam, mivel a vizsgált

képeken a háttér és az objektumok jelentősen eltérő intenzitástartományba estek. A mikroglia

sejtek háttértől való elválasztásához többszintű, küszöbérték-alapú szegmentálást használtam.

A küszöbértékeket a multithresh függvény segítségével határoztam meg, mely tetszőleges

számú küszöbérték számítását végzi el, Otsu módszerét alkalmazva. A meghatározni kívánt

küszöbértékek számát kettőnek választottam, így végül három osztályt kaptam. Az első

osztályba a kép azon részei estek, melyek a legsötétebbek, vagyis főként a sejttestek, így ezt

vettem alapul a képen található sejtek számának meghatározásához. Ehhez a megfelelő

küszöbérték alapján szegmentáltam a képet, így eredményül egy olyan bináris képet kaptam,

melyen fekete a háttér, az objektumok pedig fehéren ábrázolódnak. Innentől kezdve a

sejtszámlálás felfogható úgy, mint a képen lévő összefüggő komponensek (objektumok)

számának meghatározása.

Az objektumokat a bwlabel függvényt alkalmazva jelöltem meg. Ez a függvény egy bináris

képet vár bemenetéül és egy úgynevezett címke mátrix-szal tér vissza, melyben a különböző

összefüggő régiókban lévő pixelek más-más értéket vesznek fel, így a későbbiekben

egyértelműen azonosíthatók. Tehát, ha adott a következő mátrix, mely egy bináris képet

reprezentál:

27

[1 1 01 1 00 0 0

0 0 01 1 11 1 1

],

akkor a bwlabel függvényt alkalmazva a címke mátrix az alábbi mátrix lesz.

[1 1 01 1 00 0 0

0 0 02 2 22 2 2

].

Ezután a regionprops függvény segítségével meghatároztam a sejtek detektálásához szükséges

paramétereket. A regionprops függvény a képen lévő régiók tulajdonságainak mérésére szolgál.

Mivel bemenetéül egy olyan mátrixot adtam meg, melyen előzetesen megjelöltem az

objektumokat, ezért a kívánt paramétereket objektumonként számította ki. Meghatároztam ezen

összefüggő régiókat alkotó pixelek számát és lineáris indexét, valamint a régiók súlypontját.

Ekkor a képen még szerepeltek olyan objektumok, melyek nem tekinthetők teljes sejtnek

(például képbe belógó nyúlványok), ezért kizártam azokat az objektumokat, melyek által

elfoglalt terület egy bizonyos pixelszám alatt volt. Ezt a minimális pixelszámot empirikus

módon határoztam meg, mivel nem volt előzetes információm az átlagos sejtméretről, és az

összes objektum átlagos méretét véve túl kicsi számot kaptam. Néhány érték kipróbálása után a

legjobbnak tűnőn finomítottam tovább és végül a minimális méretet 235 pixelnek választottam.

Ezután meghatároztam a képen maradt objektumok számát. A detekció eredményét a 9. ábra

szemlélteti. A sejtek alakja elég változatos, ezért előfordulhat olyan eset, hogy az így kapott

maszkon szerepelnek konkáv objektumok, melyek súlypontja nem minden esetben esik az

objektumon belülre. Mivel a későbbiekben (például NND meghatározása, lásd 3.3.3. fejezet)

szükségem lesz egy olyan pontra, ami biztosan az adott régióhoz tartozik, úgy módosítottam a

súlypont koordinátáit, hogy a kapott új pont a régión belülre essen.

28

9. ábra: A detekció eredménye. A bal oldalon egy fénymikroszkópos felétel látható, melyen

előzetesen meg lettek jelölve a mikroglia sejtek (ezeket piros ponttal jelöltem). Jobb oldalon a

bemutatott módszerrel történő szegmentálás eredményéül kapott bináris maszk látható.

3.3.2. Nyúlványrendszer modellezése

A következő lépésben a detektált sejtekhez hozzárendeltem a nyúlványrendszerüket,

melyhez aktív kontúr módszert használtam. Az aktív kontúr módszer, vagy másnéven snake

alapötlete, hogy egy olyan görbe segítségével detektálja az objektumokat, melyet iteratív módon

alakít az adott kép függvényében. A módszer célja az alábbi energiafüggvény minimalizálása:

𝐸 = ∫1

2

1

0

(𝛼|𝒗′(𝑠)|2 + 𝛽|𝒗"(𝑠)|2) + 𝐸𝑒𝑥𝑡(𝒗(𝑠)) 𝑑𝑠 ∶ 𝒗(𝑠) = [𝑥(𝑠), 𝑦(𝑠)],

ahol α és β a belső energia rugalmassági és merevségi komponenseinek súlyozására szolgáló

paraméterek, Eext pedig a képből származó külső energia [21]. Az aktív kontúr módszerek

alapvetően két csoportba sorolhatók, megkülönböztetünk parametrikus [24-25], illetve

nemparametrikus (régió alapú) módszereket [19]. A parametrikus módszerek általában

érzékenyebbek a zajra és a paraméter beállításokra, ezen kívül a nagy görbületű kontúrok

detekciója is problémás. A régió alapú aktív kontúr eljárások előnye, hogy kevésbé érzékenyek

a kezdőkontúr kijelölésre és több, akár komplex objektumot is képesek egyszerre megtalálni.

Azonban problémát jelent számukra a nyitott élek és a körvonalon belüli intenzitásváltozás,

valamint a konvergencia sebességük is lassabb.

A fentiek alapján a nyúlványrendszer változatos és komplex objektumainak

körvonalazására a régió alapú módszer lehet alkalmasabb, ráadásul ebben az esetben egy jó

29

inicializálással egy lépésben az összes sejt nyúlványrendszere kinyerhető. Ehhez a beépített

activecontour függvényt használtam, mely a Chan és Vese [19] által leírt módszert

implementálja. Ebben a szerzők egy level-set (szinthalmaz) alapú görbe evolúciós formulát

javasoltak, mely implicit módon írja le a változó kontúrt. A módszer alapvető célja az adott kép

két régióra (háttér és objektum) történő felosztása az által, hogy az objektum határait egy

háromdimenziós level-set függvény nullaszintű görbéjének feleltetik meg, tehát az eljárás során

egy olyan level-set alapú görbét keresünk, mely minimalizálja az energiát (ECV). Legyen ϕ egy

level-set függvény, ekkor a Chan-Vese formula a következőképp írható:

𝐸𝐶𝑉(𝑐1, 𝑐2, 𝜙) = 𝜆1 ∫(𝑓 − 𝑐1)2

𝛺

𝐻(𝜙) 𝑑𝑥 + 𝜆2 ∫(𝑓 − 𝑐2)2

𝛺

(1 − 𝐻(𝜙)) 𝑑𝑥 + 𝜇 ∫|∇𝐻(𝜙)| 𝑑𝑥

𝛺

ahol λ1, λ2 > 0 és μ ≥ 0 az egyes tagok súlyozására szolgáló fix paramétereket, f a vizsgált képet,

H pedig az egységugrás függvényt jelöli. Az első tag az objektumra, a második a háttérre, a

harmadik tag pedig a görbe hosszára vonatkozik. Az objektum (ϕ ≥ 0) és a háttér (ϕ < 0) átlagos

intenzitásértékeit c1, illetve c2 jelöli. A vizsgált kép szegmentálásához ezt az energiafüggvényt

minimalizálni kell c1-re, c2-re és ϕ-re vonatkozóan. A keresett kontúr a level-set függvény

nullaszintű pontjainak halmaza, vagyis azoké a pontoké, melyekre a függvényérték zérus (ϕ =

0).

10. ábra: A Chan-Vese formula alapján a görbe, mint a level-set függvény nullaszintű

vonala. Forrás: [19]

A MATLAB-os activecontour függvénynek az adaptív hisztogram kiegyenlített képeket adtam

bemenetéül, kezdeti kontúrként pedig a detekció eredményeképp kapott maszkot használtam.

Az így kapott bináris képen a nyúlványok látványosan vastagabbak voltak, mint az eredeti

felvételen, ezért morfológiai vékonyítást alkalmaztam. A végső eredmény a 11. ábrán látható.

Sok esetben előfordult, hogy az egymáshoz közel lévő sejtek érintkeztek, vagy éppen

nyúlványaik átfedtek egymással, ezért a maszkon egy objektumként jelentek meg. Mivel

szerettem volna a sejteket külön-külön is elemezni, fontos volt erre a problémára megoldást

találni. Első lépésként kiszűrtem az átfedő sejteket a detekció eredményeképp kapott maszk

alapján. Amennyiben egy adott objektum a detekció során kapott maszkon lévő objektumok

30

közül egynél többet tartalmazott, úgy a sejtek nyúlványrendszere átfedett. A következő lépés

ezen sejtek szétválasztása volt, melyhez gyakran watershed transzformációt használnak. Ez

olyan konvex objektumok esetében működik jól, melyek kismértékben fednek át egymással [26-

27]. Ezt alátámasztották az általam elvégzett tesztek is, mivel a módszer a sejtek szétválasztására

nem adott hatékony eredményt. A mikroglia sejtek nyugalmi állapotában a nyúlványrendszer

igen kiterjedt (tehát konkáv objektumokról beszélünk), ezért a szétválasztást szintén az

activecontour függvénnyel oldottam meg.

A függvény ContractionBias paraméterével lehet befolyásolni, hogy a kontúrok milyen irányba

tendáljanak. Értékét növelve, mely alapértelmezetten nulla, a kezdeti kontúrok egyre kevésbé

terjednek ki, vagyis a megfelelő értéket megválasztva elérhető a kívánt cél, viszont számolni

kell a folyamat következtében fellépő nyúlványveszteséggel is. A szétválasztáshoz kivágtam az

eredeti képből és a detekció eredményeképp kapott maszkból a megfelelő régiót, majd addig

növeltem a ContractionBias paramétert, amíg a szegmentáció eredménye pontosan annyi

objektum lett, amennyi átfedett. Végül lecseréltem az átfedő objektumokat az így kapott

eredményre. Amennyiben a sejtek szétválasztása sikertelen volt (például a vártnál több

objektumot eredményezett), úgy kizártam őket a sejtenkénti analízisből.

11. ábra: Aktív kontúr módszerrel történő szegmentálás eredménye. Bal oldalon az eredeti

fénymikroszkópos felvétel, míg jobb oldalon az aktív kontúr módszerrel történő szegmentálás

eredményéül kapott bináris maszk látható. A kezdeti kontúrokat a 9. ábrán látható maszkkal

adtam meg.

31

12. ábra: Érintkező/átfedő sejtek szétválasztásának eredménye. Az ábra A és D részén 2-2

egymással érintkező sejt látható, B és E részén pedig a róluk készült maszk. Az ábra C és F

részén ugyanezen sejtekről készült maszk látható az aktív kontúr módszerrel történő

szétválasztás után. Első esetben (C-vel jelölt kép) a szétválasztáshoz elegendő volt egyszer

növelni a ContractionBias paramétert, így a nyúlványveszteség is minimális. Második esetben

(F-el jelölt kép) a szétválasztás több iteráció alatt zajlott csak le, így a nyúlványvesztés

kifejezettebb.

3.3.3. Paraméterek meghatározása

A vizsgált paraméterek meghatározását a maszkolt képeken végeztem. A detektált

mikroglia sejtek által elfoglalt összterület meghatározásánál még figyelembe vettem az átfedő

sejteket is, így a szétválasztásból fakadó nyúlványveszteség ezt nem befolyásolja. A képeken

egy pixel 1264⁄ mm-nek felel meg, így a területszámításnál az alábbi képletet használtam:

(1264⁄ )

2∗ (𝑓𝑒ℎé𝑟 𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙𝑒𝑘 𝑠𝑧á𝑚𝑎).

Az egyes sejtekre vonatkozó paramétereket a regionprops függvény segítségével határoztam

meg. Kiszámítottam sejtenként a lefedett területet (covered area, CA), valamint annak a

legkisebb konvex környezeti területnek a nagyságát, mellyel a teljes sejt lefedhető (covered

environmental area, CEA). Ezt a sejtek legtávolabbra nyúló nyúlványaira illesztett konvex

sokszögből határoztam meg (13. ábra). Ezután kiszámítottam a sejtenkénti terület és konvex

környezeti terület hányadosát, mely egyfajta becslést adhat a sejtek morfológiájára. Ez az

arányszám akkor maximális, hogyha az objektum, amire a sokszöget illesztjük a lehető

legnagyobb mértékben kitölti azt, vagyis megegyezik vele. Tehát minél inkább illeszkedik a

sokszög az objektumra, a hányados annál nagyobb. Ez a vizsgált sejtekre vonatkoztatva annyit

32

jelent, hogy a fagocitáló, amőboid formát mutató sejtekre számolt arányszám magasabb lesz,

mint a nyugalmi állapotban lévő mikroglia sejtekre számított érték.

Ezen kívül meghatároztam minden képre a sejtek legközelebbi szomszédjának átlagos

távolságát (nearest neighbor distance, NND). Ehhez minden sejtre kiszámítottam a hozzá

legközelebb lévő szomszédjától vett távolságot (euklideszi távolság alapján), majd vettem a

kapott eredmények átlagát. A pontokat, melyek alapján a távolságszámítás történt a regionprops

függvény által kiszámított súlypont adta.

Az eredményeket a könnyebb átláthatóság végett szöveges dokumentumba mentettem.

13. ábra: Konvex környezeti terület ábrázolása. Az ábra bal oldalán az eredeti képből

kivágott egyetlen sejt látható, míg jobb oldalán a sejtről készített maszkot ábrázoltam szürkével,

a sejt legtávolabbra nyúló nyúlványaira illesztett konvex sokszöget pedig fehérrel.

3.4. Grafikus felhasználói felület bemutatása

Kitűzött céljaim között szerepelt egy olyan interaktív grafikus felhasználói felület (GUI)

létrehozása, melynek segítségével a felhasználó korrigálhatja a detekció eredményét, ezzel

pontosítva az elemzés végeredményén. Ezt a felületet szintén MATLAB-ban implementáltam.

Az elemezni kívánt kép kiválasztása után a 3.3.2-es pontban ismertetett detekciós

algoritmus lefut a képre, és az eredménye egyből láthatóvá válik a felhasználó számára. Ezt

követően a felhasználónak lehetősége nyílik a módosításra, vagyis törölhet, illetve hozzáadhat

sejteket a detekció eredményéhez (14. ábra). A törlés lehetőség egyszerűen eltávolítja a

kiválasztott sejtre vonatkozó eltárolt adatokat, illetve a detekció eredményéül kapott jelölt

maszk megfelelő régiójában lévő pixelek értékét nullára változtatja (vagyis egyenlővé teszi a

háttérrel). A hozzáadás lehetőséget választva meg kell adni a kiválasztott sejt egy pontját, amit

legegyszerűbben a sejtre történő jobb egérgombbal való kattintással lehet megkapni. A pont

megadása után a maszkon létrejön egy új objektum, melynek súlypontja a felhasználó által

megadott pont, valamint hozzáadódik egy új elem az adatokat tároló struktúrához az új

objektumra vonatkozó adatokkal. A módosítás során a maszkon létrejött változásokat a 15. ábra

szemlélteti.

33

14. ábra: A grafikus felhasználói felület segítségével megvalósítható módosítások

bemutatása. Sárga jelölés látható azokon a sejteken, amiket a program automatikusan

meghatározott. Zölddel jelöltem azokat, melyeket az Add point gombot használva, utólag lettek

hozzáadva a detekció eredményéhez. Amennyiben a felhasználó törölni szeretne a megjelölt

sejtek közül, akkor ezt az eltávolítandó sejt sorszámát megadva, a Delete point gombbal teheti

meg. Ennek hatására a sejt jelölése megszűnik.

34

15. ábra: A felhasználói beavatkozás hatására történő változások bemutatása a

sejtdetekció eredményéül kapott maszkon. A bal oldali képen az automatikus detekció

eredményéül kapott maszk látható. Pirossal jelöltem azokat az objektumokat, melyeket a

grafikus felhasználói felület segítségével el szeretettem volna távolítani. A jobb oldali képen a

már módosított maszk látható. Pirossal jelöltem azokat a régiókat, melyeket a felhasználói

felület segítségével adtam hozzá a detekció eredményéhez. Ezen kívül látszik, hogy az

eltávolítás céljából megjelölt sejtek itt már nem jelennek meg, tehát sikeresen törlődtek.

Miután már csak azok a sejtek vannak megjelölve, amit a felhasználó jónak lát, akkor

elindíthatja a nyúlványrendszer modellezését (Create mask gomb) a módosított maszkkal.

Ekkor lefut a 3.3.2-es pontban leírt, nyúlványhálózat modellezésére alkalmazott eljárás az

érintkező/átfedő sejtek szétválasztása nélkül, melynek eredménye, vagyis a teljes sejtekről

készült maszkolt kép megjelenik egy külön ablakban. Ekkor a felhasználónak lehetősége nyílik

az érintkező sejtek manuális szétválasztására (Separate cells gomb). Ezt a folyamatot a 16. ábra

szemlélteti. Amennyiben a felhasználó az eredményt látva már nem végezne további

módosításokat, akkor elvégezheti a részletes elemzést (Analyse gomb, 3.3.3-as pontban leírt

számítások), majd elmentheti ennek eredményét szöveges dokumentum formájában, valamint a

maszkolt képet is (Save results illetve Save mask gombok). A fejezetben szereplő példa felvétel

részletes elemzésének eredménye megtekinthető a mellékletek között (1. melléklet).

35

16. ábra: A manuális sejt szétválasztás bemutatása. Az ábra A-val jelölt részén két érintkező

sejtről készült maszk látható. A felhasználónak a Separate cells gombra kattintva lehetősége

nyílik a sejtek szétválasztására. Ehhez csupán bele kell kattintani a képbe és húzni kell egy

egyenest, ami átszeli azt a régiót, ahol el szeretnénk választani a két sejtet (ezt a B-vel jelölt kép

szemlélteti). Az ábra C-vel jelölt részén a szétválasztás eredményét jelenítettem meg. Látható,

hogy ezzel a módszerrel alig pár pixelnyit veszítünk a sejtekből, így a nyúlványveszteség

elhanyagolható. Összehasonlítva az automatizált szétválasztással (12. ábra), a manuális módszer

jóval kevesebb információvesztéssel jár, valamint, mivel a felhasználó jelölheti meg a

szétválasztás helyét, ezzel a módszerrel pontosabb eredmény érhető el.

3.5. ImageJ szoftverrel történő elemzés

A kutatócsoport tagjai jelenleg ImageJ programmal elemzik a munkájuk során készített

felvételeket, mely egy Java-alapú, széleskörben használt képelemző alkalmazás. A

dolgozatomban vizsgált képek elemzését megcsináltam ImageJ-vel is, hogy legyen mivel

kvantitatív módon összehasonlítani a kapott eredményeket. Az elemzés során azt a módszert

alkalmaztam, amit ők is szoktak, és a szoftver 1.51j8-as verzióját használtam.

A sejteket a Multi-point Tool segítségével számláltam és jelöltem meg. Ez az eszköz a

megjelölt pontok koordinátáit rögzíti, így ezeket szöveges dokumentum formájában el lehet

menteni (Save as XY Coordinates). Az így kapott koordináták alapján, MATLAB segítségével

a 3.3.3-as pontban ismertetett módon kiszámítottam az NND-t.

A képekre ezután alkalmaztam az Enhance Contrast parancsot, mely hisztogram nyújtással

valósítja meg a kontraszt növelését [33]. Hisztogram nyújtással elérhetjük, hogy az

intenzitásértékek a teljes dinamikatartományt kihasználják. Erre az általános képlet a következő

[18]:

𝑦(𝑛1, 𝑛2) = 255 ∗ (𝑥(𝑛1, 𝑛2) − min

𝑛1,𝑛2

(𝑥(𝑛1, 𝑛2))

max𝑛1,𝑛2

(𝑥(𝑛1, 𝑛2)) − min𝑛1,𝑛2

(𝑥(𝑛1, 𝑛2)))

36

A következő lépés a képek élesítése volt, melyet a Sharpen parancs alkalmazásával értem el.

Ez a művelet az egyes képpontokat az azok 3*3-as szomszédságában lévő pixelek súlyozott

átlagával helyettesíti, mely kiszámításához a következő súlymátrixot használja [33]:

[−1 −1 −1−1 12 −1−1 −1 −1

]

Ezt követően az intenzitásértékek alapján küszöböltem a képet. A Threshold/Auto parancs

automatikusan meghatározza a küszöbértéket a hisztogram alapján, az IsoData algoritmus

segítségével [33]. Sok esetben módosítanom kellett ezen a küszöbértéken, hogy a szegmentálás

megfelelő legyen.

Az így kapott bináris képen méret alapú küszöbölést alkalmaztam. Ehhez az Analyse Particles

parancs kiválasztása után a Size lehetőségnél beállítottam egy minimális pixelértéket, így

kizártam azon objektumokat a további analízisből, melyek területe ezt nem érte el. Ezt a

minimális méretet minden képre manuálisan állítottam be úgy, hogy a legjobb eredményt adja.

Előfordult, hogy a képen így is maradtak olyan objektumok, melyek nem lettek sejtként jelölve.

Végül kiszámítottam a képen maradt objektumok összeterületét a képen lévő, objektumokat

reprezentáló pixelek összegzésével.

17. ábra: ImageJ-vel és a kifejlesztett módszerrel történő szegmentáció eredménye. Az ábra

A-val jelölt részén az eredeti kép egy részlete, a B-vel jelölt részen ImageJ-vel történő

szegmentálás eredménye, míg a C-vel jelölt részen az általam kifejlesztett módszerrel történő

szegmentálás eredménye látható. A B és a C részt összevetve látszik, hogy a C részen a

nyúlványrendszer részletesebb.

37

4. Eredmények

4.1. Krónikus stressz kísérlet

A stressz kísérlet során kapott eredményeken kétmintás t-próbát végeztem, melyet

megelőzően a minták szórásának egyenlőségét F-próbával ellenőriztem.

Az állatok testtömeg gyarapodásában nem mutatkozott szignifikáns különbség a csoportok

között. A kísérleti csoport testtömeg gyarapodását 84.25 ± 8.71g-nak, míg a kontroll csoportét

89.88 ± 16.43g-nak találtuk.

Hogy átfogóbb képet adjak a stressz kísérlet eredményéről, a továbbiakban ismeretem a másik

módszerrel feldolgozott csoport hormonvizsgálatának és cukor preferencia mérésének

eredményeit is. A hormonvizsgálat eredményének kiértékelése során nem mutatkozott

szignifikáns különbség a csoportok között sem az ACTH (kísérleti: 17.86±1.22 fmol/ml,

kontroll: 15.85±1.72 fmol/ml), sem pedig a koritkoszteron (kísérleti: 69.55±17.21 pmol/ml,

kontroll: 45.40±8.90 pmol/ml) szintekben. A cukor preferencia vizsgálat sem mutatott jelentős

eltérést a két csoport között (kísérleti csoport: 86.98 ± 1.01%, kontroll csoport 88.58 ± 1.34%),

viszont ahogy a testtömeg gyarapodás és a hormonvizsgálat esetén, itt is megfigyelhető a

csoportok közti átlagos különbség.

1. diagram: A hormonvizsgálat eredménye (átlag ± szórás). A két csoport között ugyan

szignifikáns különbség nem mutatkozott, de a kísérleti csoport kortikoszteron értékei átlagosan

meghaladják a kontroll csoportét.

0

15

30

45

60

75

90

ACTH szint [fmol/ml] Kortikoszteron szint[pmol/ml]

Kontroll csoport (n = 16)

Kísérleti csoport (n = 23)

38

2. diagram: Az első csoport állatainak testtömeg gyarapodása a stressz kísérlet elejétől a

18. napjáig (átlag ± szórás). Látható, hogy a kísérleti csoport testtömeg gyarapodása elmaradt

a kontroll csoportétól.

3. diagram: Cukorpreferencia teszt eredménye (átlag ± szórás). A kísérleti csoport

átlagosan kevesebbet fogyasztott a szacharóz oldatból, mint a kontroll csoport.

4.2. Az automatikus sejtdetekció eredménye

Az automatikus sejtdetekció eredményének kiértékelésekor az általam elemzett

felvételek manuálisan megjelölt változatát használtam referenciaként. A kifejlesztett módszer

teljesítményének mérésére kiszámítottam a találati arányt (hit rate, vagy másnéven recall) és a

pozitív prediktív értéket (Positive Predictive value, PPV, vagy másnéven precision) a következő

módon:

𝑟𝑒𝑐𝑎𝑙𝑙 =𝑇𝑃

𝑇𝑃 + 𝐹𝑁

𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖𝑜𝑛 = 𝑇𝑃

𝑇𝑃 + 𝐹𝑃

30

50

70

90

110

Kontroll csoport (n = 8) Kísérleti csoport (n = 8)

Test

töm

eg g

yara

po

dás

[g]

75

80

85

90

95

Kontroll csoport (n = 16) Kísérleti csoport (n = 23)

%

39

ahol TP jelöli az érvényes találatokat, FN a fals negatív, FP pedig a fals pozitív találatokat.

Előbbi 0.9241-nek, míg utóbbi 0.9-nek adódott, tehát a kifejlesztett módszer az előzetesen

megjelölt sejtek 92.41%-át megtalálta, és az összes találat közül 90% volt érvényes.

Sejtszám Kísérleti csoport Kontroll csoport

Módszer PVN ARC PVN ARC

Manuális 52 ± 4 44 ± 5 49 ± 3 46 ± 7

Automatizált 51 ± 6 47 ± 6 50 ± 6 47 ± 7

2. táblázat: A manuális és az automatizált detekció eredménye. A táblázatban a különböző

módszerekkel detektált sejtek száma (átlag ± szórás) szerepel. Szignifikáns eltérést egyik

módszer esetén sem mutatkozott a két csoport között.

4.3. A különböző módszerekkel meghatározott paraméterek kiértékelése

A felvételek elemzését három módon végeztem el (ImageJ-vel, a kifejlesztett

automatizált módszerrel és az ehhez készült grafikus felhasználói felület segítségével). A kapott

eredményeken kétmintás t-próbát végeztem, melyet megelőzően a minták szórásának

egyenlőségét F-próbával ellenőriztem. A GUI-es elemzés során úgy módosítottam a detekció

eredményét, hogy az teljesen megegyezzen az előzetesen manuálisan megjelölt sejtekkel. Az

eredmények a 2-7. táblázatokban megtekinthetők, melyek a különböző agyterületekre

kiszámított átlagértéket és szórást tartalmazzák.

Az elemzés során a sejtek számát, az általuk elfoglalt összterületet, a legközelebbi

szomszédjuktól vett átlagos távolságukat (NND), a sejtek áltagos méretét, konvex környezeti

területének átlagos méretét (CEA) és az utóbbi két paraméter hányadosát vettem alapul. A

vizsgált paraméterek tekintetében egyedül a PVN területén, a sejtek által elfoglalt összterület

esetén mutatkozott szignifikáns különbség a kísérleti és a kontroll csoport között. A csoportok

közti eltérés mindhárom alkalmazott módszer esetén megfigyelhető (3. táblázat), viszont csak a

GUI-s elemzés során lett szignifikáns (p = 0.042).

40

Összterület [%] Kísérleti csoport Kontroll csoport

Módszer PVN ARC PVN ARC

ImageJ 4.13 ± 0.30 4.08 ± 0.48 3.87 ± 0.35 3.84 ± 0.80

Automatizált 4.00 ± 0,63 4.75 ± 0.90 3.58 ± 0.63 5.20 ± 1.22

GUI 4.05 ± 0.46 4.38 ± 0.76 3.46 ± 0.44 4.92 ± 1.27

3. táblázat: A különböző módszerekkel meghatározott sejtek által elfoglalt összterület.

Szignifikáns különbség csak a grafikus felhasználói felülettel történő elemzés során mutatkozott

két csoport között, kizárólag a PVN esetében (vastaggal szedve).

NND [μm] Kísérleti csoport Kontroll csoport

Módszer PVN ARC PVN ARC

ImageJ 380 ± 16 350 ± 20 391 ± 10 343 ± 24

Automatizált 385 ± 23 338 ± 22 392 ± 22 339 ± 24

GUI 380 ± 16 350 ± 19 389 ± 10 342 ± 24

4. táblázat: A különböző módszerekkel meghatározott sejtekre kiszámított NND. Bár az

ImageJ-s és a GUI-s eredmények ugyanazon sejtek alapján számítódtak, mégis látható köztük

némi eltérés. Ennek magyarázata, hogy a GUI-s elemzéskor a sejtek egy jó részét az algoritmus

automatikusan detektálta, és az objektumok súlypontja (mely az NND számítás alapját adta)

nem pontosan oda esett ahova az ImageJ-s elemzés során a jelölés.

CA [μm2] Kísérleti csoport Kontroll csoport

Módszer PVN ARC PVN ARC

ImageJ - - - -

Automatizált 12296 ± 676 11592 ± 684 11307 ± 925 12381 ± 1581

GUI 12740 ± 1065 12064 ± 870 11667 ± 1150 12858 ± 1819

5. táblázat: A különböző módszerekkel meghatározott sejtek átlagos területe. A két

módszer által kapott eredményben való eltérés két dologból adódhat. Az egyik, hogy az

automatikus detekcióból fakadóan volt eltérés a vizsgált sejtek tekintetében a két módszer között

(lásd 4.1-es fejezet). A másik pedig, hogy az automatikus szétválasztás jelentős

nyúlványveszteséggel, így a sejt által elfoglalt terület csökkenésével járhat (12. ábra), míg a

GUI-es elemzés során a manuális szétválasztás során fellépő információvesztés minimális (16.

ábra).

41

CEA [μm2] Kísérleti csoport Kontroll csoport

Módszer PVN ARC PVN ARC

ImageJ - - - -

Automatizált 47368 ± 4438 40219 ± 1976 43561 ± 5820 42487 ± 6846

GUI 50537 ± 5659 42364 ± 1961 45701 ± 7422 43932 ± 7635

6. táblázat: A különböző módszerekkel meghatározott sejtek átlagos konvex környezeti

területe. A két módszer kissé eltérő eredményeinek hátterében az 5. táblázathoz tartozó

leírásban megfogalmazott okok állnak. A kísérleti és a kontroll csoportot összehasonlítva

látható, hogy a PVN területén átlagosan nagyobb CEA-t mértünk a stresszelt állatokon, de a

különbség nem szignifikáns.

CA/CEA Kísérleti csoport Kontroll csoport

Módszer PVN ARC PVN ARC

ImageJ - - - -

Automatizált 0.30 ± 0.03 0.33 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.33 ± 0.02

GUI 0.29 ± 0.03 0.32 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.33 ± 0.02

7. táblázat: A különböző módszerekkel meghatározott sejtek átlagos terület és konvex

környezeti terület aránya. Ez az arányszám információt ad a sejtek morfológiai értelemben

vett tömörségéről (solidity).

4.4. A felvételek elemzésére alkalmazott módszerek összehasonlítása

A három alkalmazott módszer összehasonlítására páros t-próbát alkalmaztam. Az

összehasonlításkor a sejtek által elfoglalt összterületet vettem alapul, mivel a sejtek számán

kívül ez az egyetlen paraméter, amit mindegyik módszerrel meghatároztam.

A PVN esetében csak az ImageJ-s és a GUI-s elemzés során kapott eredmények között

mutatkozott szignifikáns különbség (p = 0.038), viszont az ARC területén számított értékek

eltérése mindhárom esetben szignifikáns volt (ImageJ és GUI: p = 0.0002; ImageJ és

automatizált módszer: p = 0.0001; GUI és automatizált módszer: p = 0.0098).

Az automatizált és a többi módszer között fennálló eltérés a vizsgált sejtek

különbözőségével magyarázható. Az ImageJ-s és a GUI-s eredmények közti különbség több

okból adódhat. Az ImageJ-s elemzés során sokszor előfordult, hogy a szegmentálás alapjául

szolgáló automatikusan meghatározott intenzitásértéket nagymértékben módosítanom kellett

ahhoz, hogy megfelelő eredményt kapjak. Előfordult, hogy a háttérből nagyobb, összefüggő

részek teljesen egybeolvadtak az objektumokkal, ezért a globális küszöbértéket növelnem

kellett, ami viszont a kép egyes részein jelentős nyúlványvesztést eredményezett. Számos

42

alkalommal előfordult az ellenkező eset is, mikor az elemezni kívánt sejtek egy részéből jelentős

részletek hiányoztak, ezért a küszöbértéket csökkentenem kellett. Ez a többi, eredetileg szépen

kirajzolódó sejt esetében is az objektumok növekedését eredményezte. Ezen kívül számolni kell

azzal is, hogy a kifejlesztett módszer a nyúlványok modellezésekor hozzáveszi a sejthez azokat

a nyúlványrészleteket is, amik ugyan nem lettek előzetesen detektálva, de érintkeznek a sejttel.

43

5. Diszkusszió, konklúzió

A stressz kísérlet eredményeképp megfigyeltük, hogy a kísérleti állatok testtömeg

gyarapodása és cukorpreferenciája kismértékben elmaradt a kontroll csoportétól. A

cukorpreferencia csökkenése enyhe anhedóniás állapot kialakulására enged következtetni. Bár

a csoportok közti különbség nem volt szignifikáns, de az eredmény jól tükrözi, hogy ezek a

tünetek általában krónikus stressz hatására alakulnak ki [5] [10]. A hormonszintekben való

eltérés a hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg tengely fokozott aktivitására utal, és

összhangban van más krónikus stresszel foglalkozó kutatások eredményével [10] [34].

A PVN területén történő stressz-indukálta mikroglia aktivációval több tanulmány is

foglalkozott az elmúlt időszakban [5] [34] [35], de az ARC-ban stressz hatására történő

morfológiai aktiváció egyelőre feltérképezetlen terület. A sejtek számában nem találtunk

szignifikáns eltérést egyik vizsgált agyterület esetében sem a kísérleti és a kontroll csoport

között. Ez összhangban van Tynan és mtsai [5] által kapott eredménnyel, miszerint az általuk

vizsgált 15 stressz-reszponzív agyterület közül a PVN-ben nem növekedett jelentős mértékben

a sejtek száma krónikus stressz hatására. Fontos megemlíteni, hogy az általuk és az általunk

alkalmazott stressz protokoll eltérő, viszont Kopp és mtsai [34] CVS-t is alkalmaztak munkájuk

során, és ők sem találtak eltérést a sejtek számában a PVN területén.

A sejtek által átlagosan elfoglalt terület (CA) mértékében csak átlagos különbséget mutattunk

ki a két csoport között, viszont a GUI-s elemzés során a sejtek által elfoglalt összterület a PVN-

ben szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a kísérleti csoportban. Ennek egyik oka lehetne

például, hogy a kísérleti csoportban lényegesen magasabb volt a sejtek száma. Esetünkben ez

nem teljesül, így a különbség inkább a nyúlványrendszer nagyobb mértékű elágazódására,

esetleg kiterjedésére utalhat, ami a sejtek nyugalmi állapotból enyhén aktivált állapotba való

lépését jelezheti. Ezt alátámaszthatja az a megfigyelés is, miszerint az Iba-1 intenzitása az

aktivációval fokozódik [4-5] [34]. Wohleb és mtsai [35] is hasonló eredményre jutottak, bár ők

egereken végezték a vizsgálatot, és az általuk alkalmazott stressz időtartama csak

szubkrónikusnak minősül [13]. A többi krónikus stresszt alkalmazó kutatás [5] [34] során nem

találtak számottevő különbséget a két csoport között a PVN területén. Az ARC területén pont

ellenkező változásokat figyeltünk meg, de a csoportok közti különbség egyik esetben sem volt

jelentős.

A CA/CEA értékben akkor figyelhető meg jelentős különbség, hogyha vizsgált csoportok a

sejtek morfológiájában nagymértékben eltérnek, mivel ez a szám a sejtek morfológiai

aktivációjával arányosan nő [36]. Ebben az értékben nem találtunk eltérést a csoportok között

egyik vizsgált agyterület esetében sem, ami arra enged következtetni, hogy a CVS hatására nem

alakult ki jelentős morfológiai aktiváció sem a PVN, sem az ARC területén.

44

Az NND-ben sem mutatkozott számottevő különbség a csoportok között, vagyis stressz hatására

nem indult meg a sejtek migrációja. Ez várható volt, mivel az amőboid formát öltő sejtek

jellemzője, hogy a sérülés irányába vándorolnak [39], az általunk vizsgált felvételeken pedig

nem ez a forma volt a jellemző (lásd CA/CEA arány).

Összességében, a kapott eredmények azt mutatták, hogy a CVS hatására csökkent az

állatok testtömeggyarapodása és cukor preferenciája, valamint fokozódott a hipofízis-

mellékvesekéreg tengely aktivitása. A mikroglia aktiváció tekintetében a CVS jelentősen

növelte a sejtek által elfoglalt összterületet a PVN-ben, a sejtek számában való növekedés

nélkül. Bár az Iba-1 expressziója növekszik a központi idegrendszerben történő fertőzés és

gyulladás következtében [37], a kapcsolódó kutatások, melyek kimutatták a sejtek morfológiai

aktivációját, nem találtak gyulladásra utaló változásokat stressz következtében [4-5].

Esetünkben, a sejtek citokin expressziós profiljának meghatározásához egyéb vizsgálatok is

szükségesek lennének.

A munkám során kifejlesztett detekciós módszer az előzetesen megjelölt sejtek 92.41%-

át megtalálta, viszont ezen felül talált olyan objektumokat is, melyek nem lettek megjelölve.

Ezen objektumok egy része tekinthető sejtnek, mivel a gyakorlatban sokszor nehéz eldönteni,

hogy a fénymikroszkópos felvételeken látható bonyolultabb sejtek/sejtrészletek közül mit

jelöljünk meg további analízisre. Az eljárás néhány esetben sejtként érzékelt olyan

objektumokat is, melyek nem tekinthetők annak, például nagyobb nyúlványok, melyek

belógnak a képbe. Ennek ellenére a detekció pontossága (precision) 90% lett, ami egy jó

kiindulási alapot biztosíthat a felvételek elemzéséhez a GUI adta lehetőségekkel kiegészítve.

A mikroglia sejtek szegmentálása esetén nagyon fontos az alak minél pontosabb

megőrzése a sejt morfológiai tulajdonságainak meghatározásához. Az alkalmazott módszerek

összehasonlításakor megfigyelt különbség mögött több dolog állhat. Az egyik, hogy

amennyiben a háttérben nagymértékű változás figyelhető meg a kép egyes részei között, úgy

globális intenzitásküszöb alkalmazása során eltérő lesz a szegmentáció jósága a sejtek

elhelyezkedésétől függően. Az ImageJ-s elemzés során alkalmazott módszer globális

intenzitásküszöb alkalmazásával szegmentálja a képet, míg a kifejlesztett eljárás régió-alapú

aktív kontúr módszert használ a morfológiai információ kinyerésére. A másik, hogy bár az aktív

kontúr módszerrel történő szegmentáció eredménye sokkal részletgazdagabbnak és

pontosabbnak bizonyult, sajnos ez sem volt tökéletes. A módszer a nyúlványok modellezésekor

hozzávette a sejthez azokat a nyúlványrészleteket is, amik ugyan nem lettek előzetesen

detektálva, de érintkeznek a sejttel.

Összességében elmondható, hogy a felvételek minőségbeli, és a sejtek morfológiai

változatossága miatt az intenzitás-alapú küszöbölés a kifejlesztett módszerrel összehasonlítva

kevésbé effektív a képen lévő összes sejt morfológiai információjának egy lépésben történő

45

kinyerésére. Ezzel együtt, az implementált módszeren még szükséges dolgozni, további

fejlesztési lehetőségei a következők:

1) a sejtdetekcióra használt technika finomítása a pontosabb eredmény elérése végett

2) az átfedő sejtek automatikus szétválasztásának fejlesztése, hogy az minél kevesebb

információvesztéssel járjon

3) további paraméterek meghatározása, például nyúlványok száma és hossza

4) a GUI fejlesztése, például lehetőség a detekció elvetésére, oda nem illő

nyúlványrészletek törlésének lehetősége, illetve felhasználói visszajelzés alapján

történő egyéb fejlesztések/módosítások

46

6. Összefoglalás

A mikroglia sejtek a központi idegrendszer rezidens immunsejtjei, melyek kiemelt

szerepet játszanak annak védelmében és működésében. Nyugalmi állapotban ezek a sejtek

folyamatosan mintavételezik környezetüket, így gyorsan képesek reagálni különböző káros

behatásokra. Ebben az állapotban viszonylag kis sejttest, valamint vékony, kiterjedt és elágazó

nyúlványrendszer jellemző rájuk. Kóros folyamatot észlelve a sejtek aktiválódnak, melynek

során morfológiai és funkcionális változásokon mennek keresztül. Aktiváció során a

nyúlványok visszahúzódnak, a sejttest megnagyobbodik és változás következik be a sejt által

expresszált anyagok tekintetében is.

Több kutatás célja volt már a mikroglia sejtek és a stressz kapcsolatának vizsgálata. Ezen kívül

néhány tanulmányban foglalkoztak automatizált képelemző módszerekkel, melyek segítségével

nyomon lehet követni a mikroglia sejtek változásait mikroszkópos felvételeken. Jelen dolgozat

célja a stressz indukálta mikroglia aktiváció vizsgálata automatizált képelemző eljárásokkal.

A kísérleti állatok 3 hétig, naponta kétszer különböző stresszhatásoknak lettek kitéve,

majd az agyukból készített metszetekről immunhisztokémiai eljárást követően

fénymikroszkópos felvételeket készítettünk hússzoros nagyításban. A képeket MATLAB

(R2017a) szoftver, és annak képfeldolgozó eszköztára segítségével értékeltem ki. A kifejlesztett

módszer lehetővé teszi sejtek detektálásán túl a nyúlványrendszerük modellezését és jellemző

paramétereik meghatározását. Az automatikus detekció alapját logaritmikus képjavítás és

intenzitásérték-alapú szegmentáció, valamint méret alapú küszöbölés képzi. A sejtek

nyúlványrendszerének modellezésére régió alapú aktív kontúr módszert alkalmaztam. Az

elemzés során a sejtek számán kívül meghatároztam az általuk elfoglalt összterület százalékos

arányát, a legközelebbi szomszédjuktól vett átlagos távolságukat, a sejtek áltagos méretét,

konvex környezeti területének átlagos méretét és az utóbbi két paraméter hányadosát, mely

becslést adhat a sejtek morfológiai aktivációjának mértékére. Ezen kívül létrehoztam egy

grafikus felhasználói felületet, mely lehetőséget biztosít a detekció eredményének módosítására

és az érintkező sejtek manuális szétválasztására. A detekcióra használt módszer teljesítményét

a felvételek előzetesen manuálisan megjelölt változata alapján értékeltem. A módszer a

megjelölt sejtek 92.41%-át megtalálta, és az összes találat közül 90% volt érvényes.

A stressz kísérlet következtében csökkent az állatok testtömeggyarapodása és cukor

preferenciája, valamint fokozódott a hipofízis-mellékvesekéreg tengely aktivitása. A vizsgált

paraméterek tekintetében csak a sejtek által elfoglalt összterületben találtunk jelentős változást

stressz hatására, kizárólag a PVN területén, ami csekély mértékű mikroglia aktivációra utalhat.

Összességében, sikerült létrehozni egy olyan algoritmust, mely megkönnyítheti a

változatos morfológiával rendelkező mikroglia sejtek kvantitatív elemzését.

47

7. Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretnék köszönetet mondani konzulensemnek, Dr. Kovács Krisztinának,

amiért elvállalta a témavezetést. Köszönettel tartozom Winkler Zsuzsannának (MTA-KOKI,

Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium) és Dr. Manno-Kovács Andreának (MTA

Számítástechnikai és Automatizálási Kutatóintézet, Gépi Érzékelés Kutatólaboratórium), akik

folyamatos szakmai támogatásukkal és iránymutatásukkal segítették szakdolgozatom

megvalósulását.

48

8. Irodalomjegyzék

[1] D. Orłowski, Z. Sołtys and K. Janeczko, "Morphological development of microglia in the

postnatal rat brain", International Journal of Developmental Neuroscience, vol. 21, no. 8,

pp. 445-450, 2003.

[2] H. Wake, A. Moorhouse and J. Nabekura, "Functions of microglia in the central nervous

system – beyond the immune response", Neuron Glia Biology, vol. 7, no. 01, pp. 47-53,

2011.

[3] M. Lull and M. Block, "Microglial activation and chronic neurodegeneration",

Neurotherapeutics, vol. 7, no. 4, pp. 354-365, 2010.

[4] S. Sugama et al, "Stress induced morphological microglial activation in the rodent brain:

Involvement of interleukin-18", Neuroscience, vol. 146, no. 3, pp. 1388-1399, 2007.

[5] R. Tynan et al, "Chronic stress alters the density and morphology of microglia in a subset

of stress-responsive brain regions", Brain, Behavior, and Immunity, vol. 24, no. 7, pp.

1058-1068, 2010.

[6] L. Varela and T. Horvath, "Leptin and insulin pathways in POMC and AgRP neurons that

modulate energy balance and glucose homeostasis", EMBO reports, vol. 13, no. 12, pp.

1079-1086, 2012.

[7] Y. Zhang et al, "Image processing methods to elucidate spatial characteristics of retinal

microglia after optic nerve transection", Sci. Rep. 6, 21816, 2016.

[8] C. Kozlowski and R. Weimer, "An Automated Method to Quantify Microglia Morphology

and Application to Monitor Activation State Longitudinally In Vivo", PLoS ONE, vol. 7,

no. 2, p. e31814, 2012.

[9] R. Kongsui et al, "Quantitative assessment of microglial morphology and density reveals

remarkable consistency in the distribution and morphology of cells within the healthy

prefrontal cortex of the rat", Journal of Neuroinflammation 11:182, 2014.

[10] T. Kreisel et al, "Dynamic microglial alterations underlie stress-induced depressive-like

behavior and suppressed neurogenesis", Molecular Psychiatry, vol. 19, no. 6, pp. 699-709,

2013.

[11] R. Szeliski, Computer Vision, 1st ed. London: Springer-Verlag London Limited, 2011, pp.

107-110.

[12] T. Maintz, Digital and Medical Image Processing. 2017, pp. 273-330.

[13] F. Walker, M. Nilsson and K. Jones, "Acute and Chronic Stress-Induced Disturbances of

Microglial Plasticity, Phenotype and Function", Current Drug Targets, vol. 14, no. 11, pp.

1262-1276, 2013.

49

[14] C. Smochina, P. Herghelehiu and V. Manta, "Image processing techniques used in

microscopic image segmentation", Universitatea Tehnică „Gheorghe Asachi” din Iasi

Tomul LVII (LXI), vol. 2, pp. 83-98, 2011.

[15] E. Meijering, "Cell Segmentation: 50 Years Down the Road [Life Sciences]", IEEE Signal

Processing Magazine, vol. 29, no. 5, pp. 140-145, 2012.

[16] K. Zuiderveld, "Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization", Graphics Gems, pp.

474-485, 1994.

[17] U. Manikpuri and Y. Yadav, "Image Enhancement Through Logarithmic Transformation",

International Journal of Innovative Research in Advanced Engineering, vol. 1, no. 8, pp.

358-362, 2014.

[18] A. Abdul-Nasir, M. Mashor and Z. Mohamed, "Modified Global and Modified Linear

Contrast Stretching Algorithms: New Colour Contrast Enhancement Techniques for

Microscopic Analysis of Malaria Slide Images", Computational and Mathematical

Methods in Medicine, vol. 2012, pp. 1-16, 2012.

[19] T. Chan and L. Vese, "Active contours without edges", IEEE Transactions on Image

Processing, vol. 10, no. 2, pp. 266-277, 2001.

[20] F. Meyer, "Topographic distance and watershed lines", Signal Processing, vol. 38, no. 1,

pp. 113-125, 1994.

[21] M. Kass, A. Witkin and D. Terzopoulos, "Snakes: Active contour models", International

Journal of Computer Vision, vol. 1, no. 4, pp. 321-331, 1988.

[22] C. Scharfenberger et al, "Statistical Textural Distinctiveness for Salient Region Detection

in Natural Images", 2013 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition,

2013.

[23] B. Misselwitz et al, "Enhanced CellClassifier: a multi-class classification tool for

microscopy images", BMC Bioinformatics, vol. 11, no. 1, p. 30, 2010.

[24] C. Xu and J. Prince, "Gradient Vector Flow: A New External Force for Snakes", IEEE

Proceedings Conference on Computer Vision and Pattern Recognition, pp. 66-71, 1997.B.

[25] Li and S. Acton, "Active Contour External Force Using Vector Field Convolution for

Image Segmentation", IEEE Transactions on Image Processing, vol. 16, no. 8, pp. 2096-

2106, 2007.

[26] Q. Wu, F. Merchant and K. Castleman, Microscope image processing. Amsterdam:

Elsevier/Academic Press, 2008, pp. 146-148.

[27] R. Burduk, Computer recognition systems 4. Berlin: Springer, 2011, p. 631.

[28] C. Mohn et al, "The rapid release of corticosterone from the adrenal induced by ACTH is

mediated by nitric oxide acting by prostaglandin E2", Proceedings of the National Academy

of Sciences, vol. 102, no. 17, pp. 6213-6218, 2005.

50

[29] J. Djordejevic, G. Cvijic and V. Davidovic, "Different Activation of ACTH and

Corticosterone Release in Response to Various Stressors in Rats", Physiological Research,

vol. 52, pp. 67-72, 2003.

[30] L. W. Swanson, Brain maps: structure of the rat brain, 1st ed. Amsterdam: Elsevier, 1992.

[31] S. Bouret, "Formation of Projection Pathways from the Arcuate Nucleus of the

Hypothalamus to Hypothalamic Regions Implicated in the Neural Control of Feeding

Behavior in Mice", Journal of Neuroscience, vol. 24, no. 11, pp. 2797-2805, 2004.

[32] D. Walker and L. Lue, "Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative

disease: challenges to detecting microglial polarization in human brains", Alzheimer's

Research & Therapy, vol. 7, no. 1, 2015.

[33] T. Ferreira, "ImageJ User Guide - IJ 1.46r", Imagej.nih.gov, 2017. [Online]. Available:

https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html. [Accessed: 26- Nov- 2017].

[34] B. Kopp, D. Wick and J. Herman, "Differential effects of homotypic vs. heterotypic chronic

stress regimens on microglial activation in the prefrontal cortex", Physiology & Behavior,

vol. 122, pp. 246-252, 2013.

[35] E. Wohleb et al, "β-Adrenergic Receptor Antagonism Prevents Anxiety-Like Behavior and

Microglial Reactivity Induced by Repeated Social Defeat", Journal of Neuroscience, vol.

31, no. 17, pp. 6277-6288, 2011.

[36] Z. Soltys et al, "Morphology of reactive microglia in the injured cerebral cortex. Fractal

analysis and complementary quantitative methods", Journal of Neuroscience Research,

vol. 63, no. 1, pp. 90-97, 2001.

[37] S. Das Sarma, K. Chatterjee, H. Dinda, D. Chatterjee and J. Das Sarma,

"Cytomorphological and Cytochemical Identification of Microglia", ISRN Immunology,

vol. 2013, pp. 1-10, 2013.

[38] L. Lajos és mtsai, Szövettani és sejtbiológiai vizsgálómódszerek. Budapest: ELTE TTK

Biológiai Intézet, 2012, pp. 15-16, 100-102.

[39] H. Kettenmann, U. Hanisch, M. Noda and A. Verkhratsky, "Physiology of Microglia",

Physiological Reviews, vol. 91, no. 2, pp. 461-553, 2011.

[40] D. Nayak, "Microglia Development and Function", Figure 2 a. 2014.

[41] F. Crews et al, "Molecular Mechanisms of Alcohol Neurotoxicity", Figure 1., 1993.

[42] "IHC detection systems: Advantages and Disadvantages: Novus Biologicals",

Novusbio.com, 2017. [Online]. Available: https://www.novusbio.com/ihc-detection.

[Accessed: 20- Nov- 2017].

[43] Y. Date et al, "Orexins, orexigenic hypothalamic peptides, interact with autonomic,

neuroendocrine and neuroregulatory systems", Figure 2/F, Figure 2/I, 1999.

51

9. Mellékletek

---------------------------INFO---------------------------

Name of the image: 10_Iba1_PVN1b_20x.tif

Size of the image: 1151x805 pixel

CA: covered area

CEA: covered environmental area

Solidity: CA/CEA

Last modified: 24-Nov-2017 20:31:19

---------------------------DATA---------------------------

Number of cells: 30

Total CA: 0.378644 mm^2; percentage: 2.848185 %

Nearest neighbor distance: 111.638475

Number of extracted cells for further measurements: 30

Total CEA: 1.550620 mm^2; percentage: 11.663852 %

Cell CA [mm^2] CEA [mm^2] Solidity

1 0.008968 0.029901 0.299904

2 0.012655 0.040275 0.314214

3 0.016529 0.063820 0.258993

4 0.015195 0.063318 0.239973

5 0.011808 0.053260 0.221713

6 0.012741 0.114210 0.111558

7 0.011579 0.064265 0.180174

8 0.018681 0.084108 0.222108

9 0.007705 0.019599 0.393119

10 0.011005 0.032814 0.335374

11 0.012741 0.052901 0.240846

12 0.011966 0.044508 0.268859

13 0.008996 0.018911 0.475721

14 0.015855 0.073634 0.215316

15 0.009613 0.034694 0.277089

16 0.018150 0.060735 0.298842

17 0.013860 0.087996 0.157509

18 0.010517 0.027046 0.388859

19 0.018523 0.067924 0.272708

20 0.007002 0.014262 0.490946

21 0.016830 0.041681 0.403787

22 0.014735 0.059688 0.246875

23 0.013788 0.070922 0.194416

24 0.019685 0.133221 0.147765

25 0.010431 0.032039 0.325571

26 0.009599 0.030891 0.310729

27 0.006471 0.011005 0.588005

28 0.015955 0.052973 0.301192

29 0.009039 0.031494 0.287016

30 0.008006 0.039228 0.204097

mean 0.012621 0.051711 0.289109

1. melléklet: Egy felvétel részletes elemzésének eredménye.