Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ... · diagnóstico e da fase leucêmica, foram encontradas alterações cromossômicas identificadas por aCGH; Duas alterações

i

JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS

MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS

Orientador (es): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault

Dr. Martin Hernan Bonamino

RIO DE JANEIRO

2014

Ministério da Saúde

Instituto Nacional de Câncer

Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu

ii

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

Pós-Graduação em Oncologia




Tese apresentada ao Instituto Nacional de Câncer

como parte do requisito para obtenção do título de

Doutor em Oncologia

Orientador (es): Dra. Ilana Zalcberg Renault

Dr.Martin Hernan Bonamino

RIO DE JANEIRO

2014




iii

FICHA CATALOGRÁFICA SERÁ ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INCA PARA A VERSÃO

FINAL DA TESE

(A ser impressa no verso da primeira folha de rosto)

INDICAR APENAS AS PALAVRAS-CHAVE NA VERSÃO APRESENTADA PARA A DEFESA

PÚBLICA DA TESE

Palavras-chave: 1. Neoplasias mieloproliferativas crônicas; 2. Caracterização molecular; 3.

Hibridização genômica comparativa (aCGH); 4. Sequenciamento completo de Exoma (WES).

iv


Pós-Graduação em Oncologia




ORIENTADOR (ES): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault

Dr. Martin Hernan Bonamino

Aprovada em: _____/_____/_____

EXAMINADORES:

Prof. Dr. João Paulo de Biaso Viola - Presidente

Prof. Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira

Prof. Dr. Katia Borgia Barbosa Pagnano

Prof. Dr. Lorena Lôbo de Figueiredo Pontes

Prof. Dr. Marcelo Alex de Carvalho – Suplente I

Prof. Dr. Adriana Cesar Bonomo – Suplente II

RIO DE JANEIRO

2014




v




RESUMO

TESE DE DOUTORADO


As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP) clássicas são caracterizadas por proliferação hematopoética

mielóide anormal e presença da mutação p.Val617Phe no gene JAK2 (JAK2V617F) em diferentes frequências

(Policitemia Vera-PV-95%, Trombocitemia Essencial-TE- e Mielofibrose-MF-50%). Aproximadamente 85% dos

pacientes JAK2V617F negativos apresentam inserções e deleções (INDELs) no gene da calreticulina (CALR). As

NMP podem evoluir para MF secundária (30%) ou para leucemia aguda (7%). Não existem, até o momento,

marcadores preditivos da progressão para LA. Técnicas genômicas de alta resolução representam as

ferramentas ideais possibilitam sequenciar (WES - whole exome sequencing) e avaliar a variação no número de

cópias (aCGH - array comparative genomic hybridization) de vários genes em centenas de pacientes ao mesmo

tempo, o que vai de encontro aos objetivos deste trabalho. Os objetivos deste trabalho foram: a) buscar

compreender a relação entre os biomarcadores (JAK2 e CALR) de interesse e seu papel na resposta terapêutica

dos pacientes com NMP submetidos ao tratamento com hidroxiureia (HU) e ao Ruxolitinib a partir da

implementação das técnicas para análise e quantificação destes biomarcadores; b) investigar o papel de novos

biomarcadores na progressão leucêmica secundária à NMP, utilizando técnicas genômicas de alta resolução

(aCGH e WES). Pacientes e Métodos: A partir de uma coorte central de 1236 pacientes referidos para o

diagnóstico de NMP, uma subcoorte de 162 pacientes foi utilizada neste trabalho, cujas amostras foram triadas

por PCR alelo específico para detecção da mutação p.Val617Phe. Além disso, a determinação da carga alélica

foi realizada por PCR-C (análise de fragmentos) e uma nova abordagem por q-PCR foi implementada e

comparada aos resultados obtidos por PCR-C (R²=0,9916). As amostras de 5 pacientes com TE foram

analisadas por aCGH e WES ao diagnóstico e na progressão leucêmica. Resultados: A partir da subcoorte de

162 pacientes caracterizamos que 92% PV, 46% TE e 48% MF apresentaram a mutação JAK2V617F. Em

pacientes com PV e negativos para JAK2V617F não foram encontradas mutações nos éxons 12 e 14 de JAK2.

Em contraste, em 3/45 pacientes com TE e negativos para JAK2V617F, foi detectada a mutação (p.Trp515Leu)

em MPL. Em 46% (31/68) dos pacientes V617F negativos e não PV apresentaram mutações em CALR. A

variação da carga alélica ao longo do acompanhamento mostrou dois padrões frente ao tratamento com HU:

oscilações, que não se correlacionavam com a dose de HU administrada e outro de estabilidade, também

observado nos pacientes com MF submetidos ao tratamento com Ruxolitinib. Em 3/5 pacientes com amostras ao

diagnóstico e da fase leucêmica, foram encontradas alterações cromossômicas identificadas por aCGH; Duas

alterações (+2p e del(5q)) foram recorrentes (2/3 pacientes) somente na progressão leucêmica, sugerindo que

estas alterações sejam específicas desta fase. A análise das alterações localizadas em regiões gênicas

específicas mostrou que na região da del5q estão localizados genes envolvidos na via de sinalização JAK-STAT

e na hematopoese. No chr 2, com ganho de cópia, estão posicionados genes de regulação epigenética. Dos

pacientes analisados por WES, um paciente foi positivo para a mutação JAK2V617F, outro para SF3B1

(p.Lys700Glu) (ARSA-t), e o terceiro para Ins de 5pb em CALR (p.Lys385fs*47) e com perda monoalélica de

TP53 não associada à mutação no alelo remanescente. Alterações em TP53, específicas da fase de progressão

leucêmica, foram reveladas por WES em 2/3 pacientes. A extensão deste trabalho piloto para uma coorte

JAK2V617F negativa em amostras da fase MPN mostrou que 7% (3/45) dos pacientes apresentaram mutações

em TP53, nenhuma mutação foi observada em SF3B1 e foram observados alguns polimorfismos nos éxons 11 e

12 de MAPK15. Conclusão: A redução da carga alélica de JAK2V617F é mais evidente no inicio do tratamento

com HU; O uso do inibidor de JAK2 não impacta a carga alélica, apesar da melhoria dos sintomas clínicos; Mutações em CALR foram encontradas respectivamente em 62% e 67% de pacientes com TE e MF; O evento

de transformação leucêmica mostrou-se bastante heterogêneo do ponto de vista molecular, devido à quantidade

de alterações cromossômicas e mutações encontradas por paciente, sendo a +2p e del(5q) as únicas alterações

recorrentes entre os pacientes e especificamente observadas nas amostras da fase aguda. Mutações em TP53

foram observadas preferencialmente associadas à transformação leucêmica, mas também ocorreram desde a

fase crônica.




vi




ABSTRACT

TESE DE DOUTORADO


Myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by abnormal myeloid proliferation and the presence of the

JAK2 mutation, p.Val617Phe, in 95% of Polycythemia Vera-PV, and 50% Essential Thrombocythaemia–ET and

Myelofibrosis–MF. Around 85% JAK2V617F negative patients have insertions-deletions (indels) in calreticulin

gene (CALR). MPN diseases could progress to secondary myelofibrosis (30%) or to acute leukemia (AL-7%)

although there are no predictive markers identified so far. High throughput genomic technologies are important

discovery tools because they enable whole exome sequencing (WES) and chromosome copy number variation

analysis (by SNP array or aCGH-array comparative genomic hybridization) from many patients at the same time.

Our aim was: a) study the relationship between diagnostic biomarkers (JAK2 and CALR) and their role in

monitoring therapeutic responses to hydroxyurea and Ruxolitinib and implement an analysis and quantification

assay for those MPN diagnostic biomarkers; b) investigate progression to acute leukemia secondary to MPN

using WES and aCGH. Patients and Methods: A subset group of 162 patients from a central cohort with 1236

patients referred to BioMol laboratory for MPN diagnosis was investigated in this work. First, those patients

samples were characterized by JAK2V617F mutation with allelic-specific PCR (AS-PCR) and the allelic burden

determined by fluorescent AS-PCR followed by fragment analysis (C-PCR). A q-PCR was also implemented for

comparing C-PCR results (R²=0,9916). We analyzed a subset of 5 patients that progressed from ET to AL by

aCGH and WES. Results: A 162 MPN coohort showed 92% PV, 46% ET and 48% MF patients bearing the

JAK2V617F mutation. PV JAK2V617F negative patients showed no mutations in exons 12 and 14 of JAK2 gene.

In contrast, 3/45 ET JAK2V617F negative patients showed mutations in the MPL gene (p.Trp515Leu) and 46%

(31/68) patients showed CALR indels. Allelic burden variation during follow up showed two patterns in patients

with HU use: oscillations that did not correlate with HU dose and stability, also observed in MF patients treated

with Ruxolitinib. We identified some chromosome abnormalities by aCGH in 3/5 MPN patients that progressed to

AL. Specific and recurrent AL alterations included +2p e del5q, indicating these can be specific markers. Gene

ontology analysis showed that del5q region includes some genes enrolled in JAK-STAT signaling and

hematopoietic cell lineage differentiation/proliferation while epigenetic regulator genes were mapped on the region

involved in +2p. WES results showed one patient positive to the JAK2V617F mutation while the other two tested

were negative, but one of the negative patients had a SF3B1 mutation with anemia in diagnosis, suggesting a

RARS-t. The other JAK2V617F negative patient showed a 5bp insertion in CALR (p.Lys385fs*47) and also a

monoalelic loss of TP53 without mutation in the reminiscent allele. The first two patients described had TP53

mutations specific to AL phase. An extension screening comprising JAK2V617F negative patients (ET, MF, MPN-

U and MDS) to look for TP53 mutations in chronic phase samples showed 7% (3/45) patients point mutations. We

also analyzed SF3B1 gene and did not find mutations. In MAPK15 gene we found some polymorphisms in exons

11 and 12. Conclusion: Allele burden decrease is more evident just after HU treatment; JAK2 inhibitor do not

have impact in allelic burden although improve clinical symptoms; CALR mutations are present in 62% and 67%

ET and MF patients, respectively; Acute leukemia progression is a heterogeneous molecular event with more

chromosome abnormalities and mutations in AL than MPN phase; We also found that +2p and del5q

chromosomes abnormalities are recurrent and specifically associated to AL progression. TP53 mutations were

observed preferentially associated to AL progression, but also occurred in the chronic MPN phase.




vii

Em memória aos meus

pais, meus grandes

incentivadores.

viii

Agradecimentos

À minha orientadora Ilana Zalcberg Renault por todo apoio e incentivo nestes

cinco anos de convivência; Obrigada por ter acreditado nesta morfologista e ter

proporcionado a chance de conhecer o mundo “genômico-molecular”; Todo o

estímulo dado foi importante em cada passo desta imensa avenida molecular que fui

apresentada, inclusive quando fui desafiada ao doutorado sanduíche; pelo incentivo

a resgatar a bioinformata que existia dentro de mim; O aprendizado advindo das

discussões foram peças importantes para meu amadurecimento profissional. E

principalmente, por toda a compreensão nos momentos mais difíceis.

Ao meu orientador Martin Hernan Bonamino que desde o primeiro contato se

mostrou um pesquisador bastante entusiasmado pela ciência, pelo incentivo

constante, pela ajuda e frutíferas discussões científicas; Por ter acompanhando este

trabalho com tanto carinho e zelo, estando sempre presente, mesmo quando

fisicamente distante. Este apoio foi de fundamental importância para minha

perseverança. E claro, obrigada por ter depositado sua confiança e me apresentado

à Dra Ilana Zalcberg.

Ao meu orientador Esteban Braggio por todo auxílio neste trabalho, que foram

além dos oito meses que trabalhei fisicamente em seu grupo. Todos os momentos

de discussões foram admiráveis, e sua atenção a cada detalhe foi impecável: desde

os preparativos pré-viagem, até as discussões de dados meses após o retorno ao

Brasil. Seu amor e carinho pela profissão são materializados na riqueza de detalhes

e precisão de suas respostas a qualquer aluno ou pesquisador que se dirigisse ao

seu escritório para discussão de dados. Muito obrigada pelo suporte durante a

instalação em Scottsdale e por ter feito meus dias longe do Brasil mais alegres ao

me apresentar três Brasileiras incríveis: Silvana, Marina e Sofia.

À Drª Eliana Abdelhay por todo incentivo e pelas discussões pontuais e

precisas.

Ao meu marido André Vidal, por ter sido um companheiro incondicional: me

apoiado desde o início quando resolvi retornar a vida acadêmica; por ter incentivado

minha ida ao laboratório americano; por todas as noites mal dormidas durante este

período do sanduíche, em que ficava acordado até tarde, por vezes até às 2h da

madrugada, só para nos falarmos via Skype; e é claro, pelo lindo arranjo de flores

que me enviou em Scottsdale no dia do meu aniversário!

ix

Ao meu pai, que sempre incentivou a lutar pelos meus objetivos e a seguir a

profissão que escolhi. Infelizmente não estará presente fisicamente em mais um

momento especial da minha vida, mas agradeço imensamente por todos os valores

ensinados.

A toda minha família e amigos por todo o carinho, apoio e preocupação, e por

estarem presentes nos preciosos e importantes momentos da vida: na alegria e na

tristeza, na saúde e na doença. Não enunciarei nomes para não arriscar me

esquecer de alguém em função dos preparativos intensos para tese que me fazem

ter a memória falha, mas vocês serão devidamente listados e agradecidos

pessoalmente num futuro próximo. Mas saibam todos, que o incentivo especial de

vocês, notadamente nos momentos mais árduos, foi inesquecível.

Aos colegas e amigos do laboratório de biologia molecular, do laboratório de

oncovirologia – CEMO – e do MartinLab (CPQ) por todo apoio, carinho e incentivo,

especialmente nos momentos mais difíceis. A caminhada com vocês foi mais

divertida! Meus sentimentos mais sinceros e profundos a todos aqueles que ficaram

até tarde no laboratório para me ajudar nos experimentos; não enunciarei nomes

para não ser injusta. Obrigada a Juliana Pontes, Natália Amaral, Ana Caroline

Coelho e Diego Coutinho pela ajuda no desenvolvimento de alguns dados e

experimentos deste trabalho. Um agradecimento especial a Michelle por todo o

apoio administrativo, como a ajuda na emissão de documentos, envio de laudos, só

para citar algumas das suas multifunções. Obrigada a Bárbara Monte-Mor por todos

os questionamentos e pelas discussões, sempre enriquecedoras e bem colocadas e

claro, pela revisão pontual desse manuscrito.

Aos colegas e amigos que fiz na Clínica Mayo-Arizona, por terem feitos meus

dias longe do Brasil mais alegres. Com certeza as reuniões e festinhas em que

Danielle, Juhi, Sinto, Martin, Jan, Leena, Victoria e Esteban organizaram tornaram a

nossa convivência muito mais lúdica. Obrigada por terem me acolhido como membro

de suas famílias, de forma bastante calorosa e acolhedora, em especial a Danielle

Miranda, minha mais nova irmã de coração.

Ao setor de quimioterapia do HUAP, em especial ao Dr. Adelmo Daumas

Gabriel, e ao setor de Hematologia do HUPE, em especial à Drª Cristiana Solza, por

todo carinho e auxílio na consulta aos prontuários dos pacientes e particularmente

por todas as discussões clínicas proporcionadas que foram muito importantes para o

x

desenvolvimento deste trabalho. Aos setores de Anatomia Patológica do HUAP e do

HUPE pela revisão das lâminas e recorte de blocos.

À Maria Emmerick Gouveia pela enérgica e alegre ajuda na coleta dos dados

clínicos e pelas discussões científicas.

Ao Dr. Alexandre Mello de Azevedo pela ajuda na elaboração das fichas

clínicas e das tabelas de coleta de dados.

Ao programa de Pós Graduação em Oncologia pelas excelentes aulas e

discussões proporcionadas; A toda equipe técnico-administrativa do Programa de

Pós-graduação em Oncologia, Danielle, Rodrigo e Andreia, por toda a ajuda e

eficácia nos mais diversos momentos e documentos solicitados.

Ao INCa, CNPq, INCT, FAPERJ e Clínica Mayo por todo apoio técnico e

financeiro para execução deste trabalho. Em especial ao INCT pela bolsa de

doutorado sanduíche.

A todos vocês a minha imensa gratidão e o mais sincero obrigada!

xi

”...a plenitude da atividade humana é

alcançada somente quando nela coincidem, se

acumulam, se exaltam e se mesclam o trabalho, o

estudo e o jogo; isto é, quando nós trabalhamos,

aprendemos e nos divertimos, tudo ao mesmo tempo

(...) é o que eu chamo de ócio criativo”

Domenico de Masi

xii

Índice RESUMO .................................................................................................................................v

ABSTRACT ................................................................................................................................ vi

Lista de tabelas ....................................................................................................................... xiv

Lista de figuras ........................................................................................................................ xv

Lista de Anexos: ..................................................................................................................... xvi

Lista de abreviaturas ............................................................................................................. xvii

1. Introdução ............................................................................................................... 1

1.1. Histórico .................................................................................................................. 1

1.2. Diagnóstico: ............................................................................................................ 4

1.2.1. Diagnóstico Molecular: .......................................................................................... 5

1.3. Via de sinalização JAK-STAT ................................................................................ 6

1.1. Mutações em NMP .................................................................................................. 7

1.1.1. JAK2 ......................................................................................................................... 7

1.1.1.1. Carga alélica da mutação JAK2 ............................................................................ 9

1.1.1.2. Metodologias para estimativa da carga alélica JAK2 ....................................... 13

1.1.2. CALR ..................................................................................................................... 15

1.1.3. MPL ........................................................................................................................ 18

1.2. Tratamento ............................................................................................................ 18

1.3. Progressões naturais nas NMP .......................................................................... 21

2. Objetivos ....................................................................................................................... 26

2.1. Principal................................................................................................................. 26

2.2. Secundários .......................................................................................................... 26

3. Metodologia .......................................................................................................... 27

3.1. Pacientes ............................................................................................................... 27

3.2. Banco de dados .................................................................................................... 28

3.3. Preparo das amostras .......................................................................................... 28

3.4. Análise de mutações em genes específicos ..................................................... 29

3.4.1. Análise de mutações no gene JAK2 ................................................................... 29

3.4.1.1. Mutação V617F - Reação qualitativa .................................................................. 29

3.4.1.2. Mutação V617F - Reação quantitativa ................................................................ 30

3.4.1.3. Análise de mutações dos éxons 12 e 14 de JAK2 ............................................ 32

3.4.2. Análise de mutações no éxon 9 de CALR .......................................................... 32

3.4.3. Análise das mutações em MPL ........................................................................... 33

3.4.4. Análise de mutações nos éxons 14 e 15 de SF3B1 .......................................... 34

3.4.5. Análise de mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8 ............................ 34

3.4.6. Análise de mutações nos éxons 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 de TP53 ............................. 35

3.4.7. Análise de mutações em IDH1 e 2 ...................................................................... 35

3.4.8. Análise de mutações em TET2 ............................................................................ 36

xiii

3.4.9. Análises estatísticas ............................................................................................ 36

3.4.10. Análise de hibridização genômica comparativa em conjunto (aCGH – array

comparative genomic hybridization) .................................................................................................. 37

3.4.11. Sequenciamento completo do exoma (WES - Whole exome sequencing) .... 38

4. Resultados ............................................................................................................ 42

4.1. PCR qualitativa (alelo – específico) para a mutação JAK2V617F ................... 44

4.2. Padronização de ensaios moleculares para a detecção da carga alélica de

JAK2V617F 46

4.2. Correlação entre a carga alélica de JAK2V617F e as diferentes categorias da

OMS/WHO 50

4.3. Estabelecimento das metodologias para a detecção de mutações adicionais

em amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo ......................................................... 59

4.3.1. MPL ........................................................................................................................ 59

4.3.2. Éxon 12 de JAK2 .................................................................................................. 60

4.3.3. Éxon 14 de JAK2 .................................................................................................. 60

4.4. Análises moleculares nos pacientes com neoplasias mielóides/ NMP que

apresentaram progressão leucêmica ................................................................................................. 61

4.4.1. Análise de hibridização genomica comparativa (aCGH – array comparative

genomic hybridization) ........................................................................................................................ 65

4.4.2. Sequenciamento do exoma completo (WES - Whole exome sequencing) .... 71

4.4.3. Validação de alguns genes do WES numa coorte JAK2 negativa .................. 77

5. Discussão .............................................................................................................. 80

5.1. JAK2 ....................................................................................................................... 80

5.2. CALR ...................................................................................................................... 82

5.3. Progressão leucêmica ......................................................................................... 84

6. Conclusão ............................................................................................................. 96

7. Perspectivas ......................................................................................................... 98

8. Referências Bibliográficas .................................................................................. 99

9. Anexos ................................................................................................................. 115

xiv

Lista de tabelas

Tabela 1.1: Critérios diagnósticos das NMP .....................................................................................5

Tabela 1.2: Frequências das alterações cromossômicas recorrentes....................................... 24

Tabela 1.3: Taxa das mutações descritas em NMP ..................................................................... 24

Tabela 3.1 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TP53. .... 35

Tabela 3.2: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TET2. ... 36

Tabela 4.1: Curva de plasmídeo de JAK2 pelo método da PCR-C ........................................... 47

Tabela 4.2: Variabilidade intra e interensaio de JAK2 por PCR-C.. ........................................... 48

Tabela 4.3: Comparativo da curva de DNA por PCR-C e q-PCR ............................................... 49

Tabela 4.4: Características clínicas dos pacientes com PV. ....................................................... 52

Tabela 4.5: Comparação dos eventos adversos em PV .............................................................. 52

Tabela 4.6: Características clínicas dos pacientes com TE. ....................................................... 53

Tabela 4.7: Comparação dos eventos adversos em TE.. ............................................................ 53

Tabela 4.8: Características clínicas dos pacientes com MF. ...................................................... 54

Tabela 4.9: Comparação dos eventos adversos em MF. ............................................................ 54

Tabela 4.10: Tabela resumo das respostas hematológicas à terapia citorredutora (HU) e as

respostas de carga alélica. ............................................................................................................... 56

Tabela 4.11: Características clínicas–demográficas dos pacientes com NMP com

progressão leucêmica ........................................................................................................................ 62

Tabela 4.12: Parâmetros hematológicos dos pacientes com NMP com progressão leucêmica

............................................................................................................................................................... 62

Tabela 4.13: Eventos adversos na progressão leucêmica. ......................................................... 63

Tabela 4.14: Genes analisados na progressão leucêmica. ......................................................... 64

Tabela 4.15: Anormalidades exclusivas da progressão leucêmica observadas por aCGH ... 69

Tabela 4.16: Anormalidades observadas por aCGH desde ao diagnóstico de MPN .............. 70

xv

Lista de figuras

Figura 1.1: Representação esquemática da molécula de JAK2 ...........................................................8

Figura 1.2: Espectro de INDELS detectadas no gene CALR ............................................................... 17

Figura 4.1: Fluxograma de avaliação de mutações em NMP ............................................................... 43

Figura 4.2: Desenho experimental do estudo ....................................................................................... 44

Figura 4.3: Distribuição das NMP nos dois centros participantes ......................................................... 45

Figura 4.4: Frequência de distribuição da mutação JAK2V617F .......................................................... 45

Figura 4.5: Gráfico de correlação do PCR-C. ....................................................................................... 47

Figura 4.6: Correlação entre as metodologias (PCR-C e q-PCR) de quantificação da carga alélica de

JAK2 ...................................................................................................................................................... 50

Figura 4.7: Frequência da carga alélica da mutação JAK2V617F ........................................................ 50

Figura 4.8: Distribuição da carga alélica de JAK2 ao diagnóstico e por sexo. ..................................... 51

Figura 4.9: Variação da carga alélica de JAK2 em pacientes com PV e TE.. ...................................... 55

Figura 4.10: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F na progressão PV para

mielofibrose secundária. ....................................................................................................................... 57

Figura 4.11: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F na progressão TE para

mielofibrose secundária ........................................................................................................................ 57

Figura 4.12: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F ao longo do uso do

inibidor de JAK2 (paciente 471) ............................................................................................................ 58

Figura 4.13: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617Fao longo do uso do

inibidor de JAK2 (paciente 616). ........................................................................................................... 58

Figura 4.14: Curva de sensibilidade de detecção da mutação p.Trp515Leu em MPL por HRM. ........ 59

Figura 4.15: Cromatogramas de sequenciamento do gene MPL ......................................................... 60

Figura 4.16: Frequência das mutações nos éxons 12 e 14 do gene JAK2 e no éxon 10 do gene MPL.

............................................................................................................................................................... 61

Figura 4.17: Cromatogramas de sequenciamento do éxon 3 do gene TET2 ....................................... 64

Figura 4.18: Número de alterações total por paciente, obtido por aCGH ............................................. 66

Figura 4.19: Número e tipo de alteração por aCGH. ............................................................................ 66

Figura 4.20: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de crônica ......................................... 67

Figura 4.21: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de leucemia aguda secundária ........ 67

Figura 4.22: Alterações observadas no cromossoma 2 por aCGH ...................................................... 68

Figura 4.23: Alterações observadas no cromossoma 5 por aCGH ...................................................... 68

Figura 4.24: Análise de clonalidade nos pacientes analisados por WES. ............................................ 74

Figura 4.25: Análise individual da frequência alélica dos genes associados às NMP ao longo da

progressão da doença da fase crônica para fase aguda. ..................................................................... 75

Figura 4.26: Resumo dos resultados de análise genômica (aCGH e WES) ........................................ 76

Figura 4.27: Distribuição das mutações em CALR ............................................................................... 77

Figura 4.28: Distribuição das mutações em CALR de acordo com as categorias clínicas analisadas. 78

xvi

Lista de Anexos:

Anexo 1 – Tabela 1 - valores de referência hemograma normal...................................................115

Anexo 2 – Carta de Aprovação CEP-INCa ......................................................................................116

Anexo 3 – Ficha clínica.....................................................................................................................117

Anexo 4 – Publicações em colaboração relacionadas à tese – Publicação 1.............................124

Anexo 5 – Publicações em colaboração relacionadas à tese – Publicação 2.............................125

Anexo 6 - Manuscritos em preparo .................................................................................................126

Anexo 7 – Publicações em colaboração.........................................................................................127

xvii

Lista de abreviaturas

AAS - ácido acetilsalicílico ABL - abelson murine leukemia viral oncogene homolog aCGH - array comparative genomic hybridization ARSA - anemia refratária com sideroblastos em anel ARSA-t - anemia refratária com sideroblastos em anel com trombocitose AS – allelic specific AS-PCR – alelic specific PCR (PCR alelo específico) ATP – Adenosine triphosphate (adenosina trifosfato) Bcl-Xl - B-cell lymphoma-extra large BMO-biópsia de medula óssea CALR – calreticulina CEMO - Centro de Transplantes de Medula Óssea CH- clínico hematológica COSMIC - Catalog of Somatic Mutations in Cancer Ct - threshold cycle DNA - ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) EPO – eritropoietina ERK - extracellular-signal-regulated kinases FDA – food and drug administration FERM - 4.1, Ezrina, Radixina, Moesina GATK - Genome Analyis Toolkit GM-CSF - granulocyte macrophage colony-stimulating factor HAPMAP - haplotype map Hel - human erythroleukemia HU - Hidroxiureia HUAP - Hospital Universitário Antônio Pedro HUPE - Hospital Universitário Pedro Ernesto IGF-1 insulin like growth factor IGV – integrated genomic viewer IL-3 – interleucina 3 ILD - infusão de linfócitos do doador INDELS – inserções e deleções IR – inhibitory region JAK2 – Janus Kinase2 KDEL - Lys-Asp-Glu-Leu LA – leucemia aguda LLA – leucemia linfocítica aguda LLC – leukemia linfocítica crônica LMA – leucemia mieloide aguda LMC – leucemia mielóide crônica MAPK - mitogen-activated protein kinases MF – mielofibrose MFS – mielofibrose secundária MPL - myeloproliferative leukemia virus oncogene MPN – myeloproliferative neoplasms MT – mutado NGS – next generation sequencing NMP- Neoplasias mieloproliferativas NMP-U - Neoplasias mieloproliferativas crônicas-unclassified (não classificadas)

xviii

OMS – organização mundial de saúde OSM – oncostatina M PBS - phosphate buffer solution PCR – polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) PCR-C – PCR capilar (análise de fragmentos) PIAS - protein inhibithors of activated STATs PTP - protein tyrosine phosphatases PV – policitemia vera q-PCR – quantitative PCR (PCR quantitativo em tempo real) RCLB - red cell lysis buffer RDC – Resolução da Diretoria Colegiada RE- retículo endoplasmático RNA - ribonucleic acid (ácido ribonucleico) Rpm – rotações por minuto SCF – stem cell factor SF3B1 - splicing factor 3b subunit 1 SH2 - Src homology 2 SMD – síndrome mielodisplásica SMD/SMP – síndrome mielodisplásica/ síndrome mieloproliferativa SNV - single nucleotide variant SOCS - suppressores of cytokine signaling SOE – sem outra especificação STAT - Signal transducers and activators of transcription TCAG - The Centre for Applied Genomics TCTH - transplante alogênico de células tronco hematopoéticas TE – trombocitemia essencial TET - ten eleven translocation TPO - trombopoetina TREAT - Targeted RE-sequencing Annotation Tool UAF – unidades arbritárias de fluorescência USA – United States of America WES - whole exome sequencing WGS - Whole genome sequencing WHO – World Health Organization WT – wild type (selvagem)

1

1. Introdução

1.1. Histórico

Neoplasia Mieloproliferativa (NMP) é o termo utilizado para caracterizar um

grupo de doenças clonais, decorrentes da transformação maligna de uma célula

tronco hematopoética, sendo caracterizadas por um aumento da proliferação de

células mielóides e um risco aumentado de desenvolvimento de Leucemia Mielóide

Aguda (LMA). Historicamente, as NMP foram classificadas de acordo com o tipo de

célula (eritrócitos, plaquetas e granulócitos) predominante no sangue periférico ou

medula óssea (DE KEERSMAECKER; COOLS, 2006; TEFFERI; VARDIMAN, 2007).

O grupo das NMP clássicas é constituído pela Leucemia Mielóide Crônica

(LMC), Policitemia Vera-PV, Trombocitemia Essencial-TE e Mielofibrose-MF,

dependendo do fenótipo apresentado.

A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) constitui o paradigma do estabelecimento

das bases genéticas do câncer a partir da identificação do cromossomo Filadélfia

(Ph). Desta identificação resultaram a clonagem dos genes BCR e ABL, justapostos

molecularmente como resultado da t(9;22), a caracterização da atividade tirosina

cinase, constitutiva do ABL do gene de fusão, e a geração da primeira terapia alvo -

específica contra o ABL (o inibidor de tirosina cinase, Imatinib).

Neste trabalho serão abordadas as NMP clássicas com exceção da LMC. Não

serão discutidas outras NMP, tais como: leucemia neutrofilica crônica, leucemia

eosinofilica crônica, mastocitose, leucemia mielomonocitica e neoplasias

mieloproliferativas não classificáveis (TEFFERI; VARDIMAN, 2007).

Nas NMP clássicas BCR-ABL negativas, a produção excessiva de células

maduras ocorre sem distúrbio óbvio de diferenciação e envolve principalmente a

linhagem eritróide na PV, a linhagem megacariocitica na TE e as linhagens

megacariocitica e granulocítica na MF. A proliferação anormal do progenitor inicial

está associada à hipersensibilidade ou independência a citocinas, incluindo

eritropoetina (EPO), interleucina 3 (IL-3), stem cell factor (SCF), insulin like growth

factor (IGF-1), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) e

trombopoetina (TPO). Tais anormalidades de sinalização intracelular decorrem de

atividade tirosino-quinase constitutiva, resultante de translocações ou mutações

ativadoras.

2

A PV é caracterizada por possuir uma expansão exacerbada da linhagem

eritrocítica e por isso os indivíduos portadores apresentam eritrocitose (hemoglobina

>16,5 e 18,5 g/dL, mulheres e homens), enquanto a TE apresenta trombocitose

(>450mil/mm3) e a MF é caracterizada por extensa fibrose medular e presença de

megacariócitos atípicos e em alta proliferação (tabela 1.1 e tabela1 do anexo 1)

(TEFFERI; VARDIMAN, 2007; TEFFERI, 2013a).

Além das NMP clássicas acima expostas, será discutida a anemia refratária

com sideroblastos em anel com trombocitose (ARSA-t), um tipo de NMP, inserida na

categoria provisória de NMP/síndrome mielodisplásica (SMD) e caracterizada por

trombocitose com diagnóstico diferencial com as TE (VARDIMAN et al., 2009;

BROSÉUS et al., 2012, 2013). Este tipo de NMP apresenta trombocitose em níveis

semelhantes à TE (>450mil/mm3), e cursa com hematócrito baixo ao diagnóstico

(inferior a 35 e 40%, em mulheres e homens). A presença de sideroblastos em anel

em 15% ou mais na medula óssea é um dos critérios diagnósticos, mas esta

característica também está presente nas ARSA sem trombocitose. A classificação da

ARSA-t como uma entidade única ainda é controversa devido aos vários critérios

sobrepostos com outras entidades e a falta de um marcador exclusivo deste grupo.

Entretanto, trabalhos multicêntricos retrospectivos na Europa defendem a hipótese

de que esta é uma entidade única (BROSÉUS et al., 2012, 2013).

A primeira proposta de categorização das NMP foi realizada por Dameshek

(DAMESHEK, 1951). Esta classificação compreendia a divisão das NMP, então

denominadas doenças mieloproliferativas, em Leucemia Granulocítica Crônica,

Policitemia Vera (PV), Metaplasia Mielóide Agnogênica ou Idiopática do baço,

Leucemia Megacariocítica e Eritroleucemia. Ao longo dos anos, a eritroleucemia foi

redefinida como leucemia eritróide aguda (LMA-M6) e as outras quatro doenças

classificadas como doenças mieloproliferativas clássicas (TEFFERI; VARDIMAN,

2008).

A primeira grande revisão da categorização das neoplasias mieloproliferativas

foi realizada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), na terceira edição do

manual de classificação de neoplasias e foi publicada em 2001 (JAFFE; WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2001). Este critério de classificação era subdividido em:

1) Doenças Mieloproliferativas clássicas (LMC, PV, TE, MF, Leucemia neutrofílica

crônica, Leucemia eosinofílica crônica/ síndrome hipereosinofílica e doenças

mieloproliferativas não classificáveis), 2) Síndromes Mielodisplásicas, 3) Síndromes

3

Mielodisplásicas/Mieloproliferativas e 4) doenças mastocitárias. Esta classificação foi

em pouco tempo invalidada, pois numa avaliação prospectiva, seus critérios não

demonstraram total consistência, e além disso, alguns aspectos clínicos tais como a

correlação da concentração de hemoglobina venosa (critério de classificação para

eritrocitose absoluta) com os casos de Policitemia Vera não puderam ser validados

(JOHANSSON; SAFAI-KUTTI; KUTTI, 2005).

Em 2005 foi descoberta uma mutação somática no gene que codifica a

proteína tirosina cinase JAK2, que foi demonstrada estar presente em

aproximadamente 95% dos casos de Policitemia Vera e 50% dos casos de

Trombocitose essencial e Mielofibrose primária (BAXTER et al., 2005; JAMES et al.,

2005; JOHANSSON; SAFAI-KUTTI; KUTTI, 2005; KRALOVICS et al., 2005; LEVINE

et al., 2005; ZHAO et al., 2005).

A quarta edição dos critérios da OMS, publicada em 2008 (VARDIMAN;

WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008), primeiramente modificou o termo

“doença” por “neoplasia”, colocou as doenças mastocitárias como um subgrupo de

neoplasias mieloproliferativas (NMP) e as neoplasias mielóides associadas com

eosinofilias e anormalidades de PDGFRA, PDGFRB, ou FGFR1 constituindo um

grupo à parte. Além disso, a ARSA-t neste momento passa a figurar como entidade

provisória das neoplasias mieloproliferativas/ síndromes mielodisplásicas. Desta

forma, a classificação das neoplasias mielóides ficou assim organizada: 1) leucemia

mielóide aguda; 2) síndromes mielodisplásicas; 3) neoplasias mieloproliferativas

(LMC, PV, TE, MF primária, leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica

crônica SOE (sem outra especificação), síndrome hipereosinofílica, doença

mastocitária e NMP não classificáveis), 4) SMD/NMP, 5) neoplasias mielóides

associadas com eosinofilias e anormalidades de PDGFRA, PDGFRB, ou FGFR1.

Esta classificação é a mais atual e compreende, além dos critérios clínicos,

diversos critérios laboratoriais tais como genéticos, morfológicos, citoquímicos e

imunofenotípicos (tabela 1.1). Entretanto, em virtude da descoberta de novos

marcadores moleculares, devido à utilização das técnicas de sequenciamento

massivo paralelo ou sequenciamento de próxima geração, vários autores têm

sugerido a atualização desta última revisão da OMS (BROSÉUS et al., 2013;

TEFFERI et al., 2014).

4

1.2. Diagnóstico:

O diagnóstico de pacientes com NMP pressupõe uma abordagem

multidisciplinar: clínica-laboratorial (tamanho do baço por palpação ou

ultrassonografia), parâmetros hematológicos (hemograma e bioquímica), anatomia

patológica (biópsia de medula óssea e mielograma) e alterações genéticas

detectadas por biologia molecular (detecção de mutações). Resultados deste tipo de

análise servem para o diagnóstico e a classificação do paciente com NMP.

Algoritmos individualizados são propostos para auxiliar na discriminação entre os 3

fenótipos, PV, TE e MF, que podem se sobrepor e evoluir de forma similar

(JANSSEN et al., 1990; BERGLUND; ZETTERVALL, 1992). Assim, a incorporação

da pesquisa de mutação no gene JAK2 foi realizada rapidamente aos critérios de

classificação da OMS/WHO.

O estabelecimento do diagnóstico das NMP é difícil, por exemplo, o clínico

que não possui treinamento direcionado para hematologia provavelmente teve

pouco contato com pacientes apresentando a doença, que é de baixa incidência,

3/100.000 nos EUA (NCI, 2014), não existindo ainda uma estimativa brasileira. Além

disso, a doença tem uma história natural longa (décadas), o que faz com que o

doente seja frequentemente acompanhado por mais de um médico (SPIVAK;

SILVER, 2008). Outros complicadores para o estabelecimento do diagnóstico são

que as manifestações clínicas podem se modificar ao longo do tempo, dificultando o

diagnóstico e a classificação das NMP (JANSSEN et al., 1990) e que as

manifestações clínicas dessas doenças (PV, TE, MF primária ou secundária, ARSA-

t) podem se sobrepor e evoluir de forma similar. Por exemplo, a PV pode apresentar

eritrocitose (BERGLUND; ZETTERVALL, 1992) associada à leucocitose e à

trombocitose (SHIH; LEE, 1994), enquanto que em cerca de 20% dos casos de MF a

presença de trombocitoses isoladas ou de eritrocitose pode ser observada (BAROSI

et al., 1981; SPIVAK; SILVER, 2008). Além disso, a MF pode ser uma progressão

secundária à PV ou TE, ocorrendo em cerca de 20% dos casos (DINGLI et al., 2006;

HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009). A ARSA-t apresenta níveis plaquetários

semelhantes à TE, porém se diferencia por apresentar anemia ao diagnóstico e

sideroblastos em anel, fato que pode ser negligenciado (TEFFERI; VARDIMAN,

2007, 2008; VARDIMAN et al., 2009).

Tais fatos reforçam a relevância da análise molecular na prática clínica para

determinação do diagnóstico.

5

Tabela 1 Tabela1.1: critérios diagnósticos das NMP, segundo OMS/WHO (2008). BMO – biopsia de

Medula Óssea; MO medula óssea; LDH – lactato desidrogenase; H-Homens; M-mulheres;

1.2.1. Diagnóstico Molecular:

No panorama genético, nas três NMP e na ARSA-t, a origem da doença se

desenvolve de um progenitor hematopoético comum, que pode apresentar a mesma

mutação, a p.Val617Phe no éxon 14 do gene JAK2 em 98% dos pacientes com PV,

50% dos pacientes com TE, 60% das MF e 50% das ARSA-t (BAXTER et al., 2005;

JAMES et al., 2005; JOHANSSON; SAFAI-KUTTI; KUTTI, 2005; KRALOVICS et al.,

2005; LEVINE et al., 2005; ZHAO et al., 2005).

Outras mutações, menos frequentes, acometem: o éxon 12 do gene JAK2,

mais associada a PV (SCOTT et al., 2007; JONES et al., 2008; LI et al., 2008;

RAPADO et al., 2009; SCHNITTGER et al., 2009); o exon 10 do gene MPL, em 5%

das TE e 10% das MF(PARDANANI et al., 2006; PIKMAN et al., 2006; LIU et al.,

2009; RUMI et al., 2013).

Em 2011 foi descoberta a presença de mutações em SF3B1 fortemente

associadas às anemias refratárias com sideroblastos em anel com ou sem

trombocitose (PAPAEMMANUIL et al., 2011).

critérios Policitemia Vera Trombocitose essencial Mielofibrose Primária

maiores 1 - Hemoglobina: 1 - plaquetas:1 - proliferação megacariocítica, atipia e

presença de fibrose;

> 18,5g/dL (H) > 450 mil/mm³

na ausência de fibrose, as mudanças

megacariocíticas devem ser

acompanhadas com o aumento de

celularidade na MO (proliferação

granulocítica e diminuição eritrocítica)

> 16,5g/dL (M)

2 - BMO com proliferação da linhagem

megacariocítica, com megacariócitos

maduros, aumentados em tamanho e

proliferação

2 - JAK2 p.Val617Phe

2 - JAK2 p.Val617Phe3 - exclusão de critérios diagnósticos para

as outras NMPC

mutações em MPL ou outro marcador

genético clonal

4 - JAK2 p.Val617Phe ou outro marcador

genético clonalexclusão de fibrose secundária

exclusão de trombocitose reativa3 - exclusão de critérios diagnósticos para

as outras NMPC

menores BMO com panmielose leucoeritroblastose

eritopoietina sérica diminuída aumento nos níveis de LDH

formação de colônia eritróide endógena in

vitroanemia

espenomegalia palpável

Diagnóstico:2 critérios maiores e pelo menos 1

critério menor4 critérios 3 critérios maiores e 2 critérios menores

6

Em dezembro de 2013, a caracterização de mutações do tipo inserções e

deleções (INDELS) no gene calreticulina (CALR) nos pacientes com NMP JAK2

negativas (TE, MF e ARSA-t) abriu uma perspectiva de melhoria no diagnóstico, pois

conjuntamente com JAK2, será possível diagnosticar, por exames de biologia

molecular, praticamente todos os pacientes com NMP, pois cerca de 67-82% dos

pacientes com TE, 80-88% dos pacientes com MF e 12,5% em ARSA-t apresentam

INDELS em CALR (KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a). Desta forma, a

caracterização molecular dos pacientes com NMP está quase completa, sendo

poucos aqueles que não apresentem um biomarcador diagnóstico.

Nos últimos anos, a classificação das NMP tem mudado, especialmente com

a incorporação de marcadores moleculares. Entretanto, a análise de mutações nos

genes SF3B1 e CALR ainda não foram incluídas como critério diagnóstico da OMS,

no entanto espera-se para breve a formalização destes critérios.

Como consequência, tem-se buscado a investigação dos processos celulares

desregulados em função das mutações encontradas, em especial, no que se refere

à via de sinalização intracelular de JAK2. A importância que esta proteína

desempenha na célula é inquestionável e sua desregulação pode trazer sérias

consequências na fisiologia celular bem como nos processos de homeostase, devido

à proliferação exacerbada de alguns tipos celulares hematopoéticos.

1.3. Via de sinalização JAK-STAT

As células eritróides e megacariocíticas são estimuladas a crescer e proliferar

quando fatores de crescimento hematopoéticos se ligam a seus receptores de

eritropoietina e trombopoietina, respectivamente. Neste momento, a proteína tirosina

cinase JAK2 associada à porção citoplasmática destes receptores de membrana é

ativada, permitindo a fosforilação de moléculas citoplasmáticas, especialmente as da

família dos transdutores de sinais e ativadores de transcrição (STATs) (AARONSON;

HORVATH, 2002).

As STATs (Signal transducers and activators of transcription) são fatores de

transcrição que se ligam aos resíduos de tirosina fosforilados do receptor, através

dos domínios SH2 (Src homology 2). Os domínios SH2 fosforilados são capazes de

reconhecer o domínio análogo em outra molécula de STAT fosforilada, ocorrendo a

dimerização de STATs e a conseqüente dissociação do receptor. As STATs

dimerizadas são importadas para o núcleo onde atuam como fatores de transcrição

7

de citocinas e ativando ou reprimindo a transcrição de genes-alvo como Bcl-XL,

Ciclina D, Pim, SOCS e oncostatina M (OSM) (YOSHIMURA et al., 1996; KREBS;

HILTON, 2001; WANG et al., 2001; RAWLINGS; ROSLER; HARRISON, 2004; LIM;

CAO, 2006). Os reguladores negativos da via JAK-STAT são as proteínas SOCS

(suppressores of cytokine signalling), PIAS (protein inhibithors of activated STATs),

PTP (protein tyrosine phosphatases)/SHP e Pim.

Células eritróides e megacariocíticas positivas para mutação em JAK2, ou em

MPL, demonstram um fenótipo de hiperproliferação celular necessitando de

concentrações baixíssimas ou nula de citocinas. A via de JAK-STAT é o principal

mecanismo de sinalização de várias citocinas, tais como interferon, interleucina,

eritropoetina e GM-CSF. Desta forma, a ativação de JAK pode estimular a

proliferação, diferenciação, migração e apoptose, já tendo sido descrita na

hematopoese, desenvolvimento imune, a adipogênese, desenvolvimento das

glândulas mamárias e lactação, dentre outros (RAWLINGS; ROSLER; HARRISON,

2004).

1.1. Mutações em NMP

1.1.1. JAK2

A mutação somática de maior frequência nas NMP é a p.Val617Phe (a partir

de agora chamada de JAK2V617F). Esta mutação ocorre, no éxon 14 do gene

JAK2 (localização 9p24), pela troca de uma guanina por uma timina, que resulta na

proteína funcional mutada, p.Val617Phe, ou seja uma valina é substituída por uma

fenilalanina na posição 617. A presença da JAK2V617F está associada a um

fenótipo mieloproliferativo e tem como consequência a hiperativação da proteína

JAK2 nas células portadoras desta mutação. A pesquisa da mutação JAK2V617F, é

hoje parte integrante de uma abordagem diagnóstica para as NMP.

As proteínas JAK são formadas por sete domínios do tipo JH. O domínio JH1,

situado na região C-terminal, possui atividade catalítica de fosfotirosina cinase; e o

domínio JH2, localizado entre o SH2-like e o JH1, é um domínio pseudo-cinase, que

possui um papel importante na regulação da ativação de JAK. Os domínios JH3 e

JH4 compartilham alguma similaridade com o domínio SH2, entretanto não possuem

a habilidade de ligação fosfotirosina (SH2-like). O domínio FERM (4.1, Ezrina,

Radixina, Moesina) é formado pelas regiões JH5, 6 e 7 e está envolvido em

8

interações de JAK com outras cinases. O domínio FERM regula a ligação a regiões

de box1 e box2 na porção citoplasmática dos receptores associados à membrana e

parece estar envolvido na estabilização da expressão do receptor. No domínio

pseudocinase foram descritas três regiões inibitórias: IR1(619-670), IR2 (725-757) e

IR3 (758-807) (figura 1.1) (RAWLINGS; ROSLER; HARRISON, 2004; VALENTINO;

PIERRE, 2006; SANZ et al., 2011).

Figura 1 Figura 1.1: Representação esquemática da molécula de JAK2 com a identificação dos seus

sete domínios homólogos e da localização da mutação JAK2V617F. Adaptado de QUINTÁS-CARDAMA et al. (2011).

A detecção de outras mutações em JAK2, pouco frequentes, e que não co-

ocorrem com a JAK2V617F, são apresentadas em ordem decrescente de

frequência: no éxon 12 de JAK2; no éxon 14, em posição diferente da V617F. Estas

mutações estão mais frequentemente associadas aos pacientes com PV. Desta

maneira parece correto afirmar que pacientes com PV são virtualmente 100%

positivos para mutação no gene JAK2 (GRÜNEBACH et al., 2006; SCHNITTGER et

al., 2006; LEE et al., 2009; MA et al., 2009;). Em estudo de pacientes com PV

negativos para V617F (SCOTT et al., 2007), a presença de mutações no éxon 12 foi

observada em 10/11 pacientes. Em geral, os pacientes positivos para estas

mutações apresentaram as seguintes manifestações clínicas: eritrocitose, baixos

níveis séricos de eritropoietina, com biópsia de medula óssea mostrando uma

hiperplasia eritróide com megacariopoese e neutropoese normais (SCOTT et al.,

2007). Vale ressaltar que as mutações descritas tanto para o éxon 12 quanto para

outras localizações no éxon 14 podem se posicionar em diferentes regiões. Uma

provável causa do aparecimento de mutações no éxon 12 seria o deslizamento no

9

pareamento da polimerase na região do aminoácido 541, que possui duas

repetições AGA próximas e que leva à deleção de 6 pb. Outras mutações no éxon

12 incluem a troca (simples, dupla) de aminoácidos (CAZZOLA, 2007). As mutações

no éxon 14, por serem bem mais raras, não são sugeridas na inclusão diagnóstica,

mesmo em pacientes com PV, somente as mutações do éxon 12 (TEFFERI, 2013a).

1.1.1.1. Carga alélica da mutação JAK2

A mutação JAK2V617F é encontrada em PV, TE e MF e devido à presença

da mesma mutação em diferentes doenças (um único genótipo gerando diferentes

fenótipos), tem-se discutido se PV, TE e MF são doenças distintas, manifestações

diferentes de uma mesma doença ou uma combinação de características (SPIVAK;

SILVER, 2008). Uma tentativa de diferenciação destas três entidades foi através da

investigação da influencia que a quantidade de mutação (carga alélica) poderia

exercer no fenótipo apresentado.

Desta maneira, diferentes metodologias foram propostas para dosagem da

quantidade de células positivas para a JAK2V617F, obtida pelo cálculo da razão

entre alelo mutado e alelo selvagem, ao que chamamos carga ou taxa alélica.

Surpreendentemente, vários pacientes quando avaliados, apresentaram carga

alélica > 50%, implicando que, por algum motivo estes pacientes cursavam com

perda de heterozigosidade (BAROSI et al., 2007b; HUSSEIN et al., 2009; SCOTT,

2006).

O evento de perda de heterozigosidade (LOH) pode ocorrer devido à deleção

de um dos alelos ou à recombinação homóloga. Foi demonstrado que pacientes com

100% de carga alélica quase sempre possuíam os dois alelos e estes

frequentemente eram provenientes do mesmo progenitor (dissomia uniparental),

sem que existisse recorrência do alelo de um dos progenitores na população de

pacientes mutados, sugerindo a inexistência de imprinting genômico no processo de

perda de heterozigosidade. Em contraste, não foram observados pacientes com dois

alelos selvagens provenientes do mesmo progenitor, mostrando que a perda de

heterozigosidade só acontece no alelo mutado (KRALOVICS et al., 2005).

A homozigose é mais frequentemente observada em pacientes com PV (25-

30%) comparada aos com TE (2-4%) (JONES et al., 2005; SCOTT, 2006; TEFFERI

et al., 2006; VANNUCCHI et al., 2007b). Em TE, a perda de heterozigosidade nos

progenitores hematopoéticos foi observada após a transformação para PV (SCOTT,

2006; HUSSEIN et al., 2009). Em MF, também foi observada a progressão da carga

10

tumoral (mudança do padrão de heterozigose para homozigose em algumas células)

e esta mudança não esteve associada a nenhuma aquisição de mutação adicional

(BAROSI et al., 2007b).

Os pacientes que possuem carga alélica de JAK2 V617F mutada acima de

50% apresentam um maior tempo de evolução da doença se comparados aos que

possuem carga alélica abaixo dos 50%, mostrando que a aquisição da mutação em

homozigose em alguns clones, requer tempo para que os eventos genéticos

aconteçam; estes eventos ocorrem com a evolução natural da doença (KRALOVICS

et al., 2005). A maior proporção de pacientes portadores da JAK2V617F em

homozigose na PV pode ser atribuída ao fato desses pacientes demorarem muito

tempo para serem diagnosticados, repercutindo numa fase de pré-diagnóstico maior,

ou pode ser devido a uma maior suscetibilidade desses pacientes à recombinação

homóloga (SCOTT, 2006). Este fato é fortalecido pela observação de que pacientes

portadores da mutação JAK2V617F ao diagnóstico são mais velhos do que os que

apresentam o gene JAK2 na sua versão selvagem, inclusive nos casos NMP

familiares (CAMPBELL et al., 2005; BELLANNE-CHANTELOT, 2006; VANNUCCHI

et al., 2007b; ANTONIOLI et al., 2008).

Alguns trabalhos também avaliaram a influência do sexo na distribuição da

carga alélica e da doença: PV, onde virtualmente todos os pacientes são portadores

da mutação JAK2V617F, é mais frequente em homens (MARCHIOLI, 2005) em

contraste, TE JAK2V617F positiva, é mais frequente em mulheres (ANTONIOLI et

al., 2005; CAMPBELL et al., 2005; ANTONIOLI et al., 2008). Em pacientes com

trombose venosa esplênica, a mutação é mais frequente em mulheres (COLAIZZO

et al., 2011).

Assim, vários grupos buscaram estudar associações entre a carga do alelo

mutado, parâmetros clínico-laboratoriais, e resposta ao tratamento. Níveis elevados

do alelo mutado foram relacionados a um risco aumentado para eventos

cardiovasculares ao diagnóstico e durante o acompanhamento. Por exemplo, a

carga alélica acima de 50% é um fator de risco aumentado para eventos trombóticos

arteriais ao diagnóstico na TE (VANNUCCHI et al., 2007a, 2007c; ANTONIOLI et al.,

2008), para eventos trombóticos arteriais em NMP familial (BELLANNE-

CHANTELOT, 2006), para eventos trombóticos, especialmente arteriais em MF

(BARBUI et al., 2012), para eventos trombóticos venosos (CAMPBELL et al., 2005;

DE STEFANO et al., 2010). Níveis de carga alélica maiores que 25% são associados

11

a sintomas e eventos microvasculares (TEFFERI et al., 2007; ANTONIOLI et al.,

2008;); e maior risco de trombose venosa esplênica em mulheres (LEVINE et al.,

2005; COLAIZZO et al., 2011;). Entretanto, pacientes com maior susceptibilidade à

trombose venosa e acidente vascular cerebral isquêmico, mas sem indícios

evidentes de NMP concomitante, possuem baixa prevalência da mutação

JAK2V617F (XAVIER et al., 2008). No entanto, 22% (24/108) dos pacientes com

trombose venosa esplâncnica (trombose venosa portal e síndrome de Budd-Chiari)

apresentaram a mutação JAK2V617F com carga alélica não superior a 50%. Destes,

9/24 foram enquadrados nos critérios diagnósticos de NMP ao longo do estudo

(XAVIER et al., 2010).

A presença de carga alélica de JAK2V617F acima de 50% também foi

correlacionada com esplenomegalia (BAROSI et al., 2007b; VANNUCCHI et al.,

2007a; ANTONIOLI et al., 2008;), aumento de prurido em PV (TEFFERI et al., 2006;

VANNUCCHI et al., 2007a) e em MF(BAROSI et al., 2007b), alta taxa de

transformação fibrótica (BELLANNE-CHANTELOT, 2006; TEFFERI et al., 2006;

VANNUCCHI et al., 2007a), aumento do hematócrito e dos níveis de hemoglobina ao

diagnóstico, leucometria total e número de neutrófilos aumentados, eritropoiese e

granulopoiese medular aumentadas, mas com diminuição no número de plaquetas

em pacientes com TE e PV (ANTONIOLI et al., 2005; CAMPBELL et al., 2005;

CAMPBELL, 2006; TEFFERI et al., 2006; VANNUCCHI et al., 2007a, 2007b;

ANTONIOLI at al., 2008).

Através da presença da JAK2V617F foi possível diferenciar subtipos de TE:

portadores da mutação V617F possuem similaridades fenotípicas com a PV, ou seja,

eritrocitose, observada através dos níveis de hemoglobina e hematócrito

aumentados em contraste aos pacientes que possuem o alelo selvagem, entretanto

a eritrocitose observada na TE JAK2V617F positiva não atinge os mesmo níveis

encontrados na PV (CAMPBELL et al., 2005; PALANDRI et al., 2009).

Entretanto, quando o grupo JAK2V617F foi subdivido em dois grupos de

acordo com a carga alélica, <12,5% (baixa) e >12,5% (alta), uma associação inversa

foi observada entre níveis baixos de hemoglobina, hematócrito e número de

plaquetas e taxa alélica alta. Uma possível explicação para este quadro foi à

presença de displasia medular nas três linhagens, e presença de doença mais

severa. Estes pacientes também apresentaram um número aumentado de

micromegacariócitos (PICH et al., 2012).

12

Os pacientes com MF JAK2V617F positivos necessitam menos transfusão

sanguínea, mas cursam com sobrevida global menor quando comparados aos

negativos para a mutação (CAMPBELL, 2006). Dentre as diferenças apontadas em

relação a sobrevida global e livre de progressão, pacientes com MF e baixa carga de

alelo mutado (quartil inferior) em MF apresentam doença mais agressiva (TEFFERI

et al., 2008).

Pacientes com a carga alélica da mutação JAK2V617F acima de 50% tem

risco aumentado para progressão para MF e leucemia aguda secundária

(CAMPBELL et al., 2005; KRALOVICS et al., 2005; BELLANNE-CHANTELOT, 2006;

VANNUCCHI et al., 2007b).

A relevância da quantificação da carga alélica para fins de pesquisa é

inquestionável, embora ainda controversa em relação a nortear a conduta clínica–

terapêutica (ANTONIOLI et al., 2010). Entretanto, alguns pacientes conseguem

atingir a resposta molecular completa após a terapia com hidroxiureia (HU)

(GIRODON et al., 2008), interferon-alfa (HASSELBALCH, 2011) ou inibidores de

JAK2 (PARDANANI et al., 2011, 2013). O valor, a longo prazo, do desaparecimento

molecular do clone JAK2 ainda é uma questão em aberto, o que faz com que

recentemente a quantificação da V617F venha ganhando relevância (SCOTT et al.,

2007; GIRODON et al., 2008;).

Pacientes JAK2V617F positivos são mais sensíveis ao tratamento e requerem

doses de HU menor do que os pacientes JAK2V617F negativos (CAMPBELL et al.,

2005; BONAMINO et al., 2009;). Este fato foi atribuído a uma rápida diminuição da

carga alélica logo após o início do tratamento citorredudor com HU (RICKSTEN et

al., 2008). Outro trabalho mostrou que mulheres apresentaram maior sensibilidade

ao tratamento com drogas citorredutivas associadas a uma maior redução da carga

alélica ao longo do tratamento (GIRODON et al., 2008). Um estudo de quantificação

da carga alélica em neutrófilos e plaquetas de homens e mulheres mostrou que os

neutrófilos femininos tendem a apresentar carga alélica mais baixa, podendo explicar

a maior sensibilidade destas células ao tratamento (BAROSI et al., 2007b;

PEMMARAJU et al., 2007; VANNUCCHI et al., 2007a, 2007b).

Estudos de acompanhamento da carga alélica ao longo do curso da doença

inicialmente sugeriram que o clone tumoral permanecia estável durante anos

(CAMPBELL et al., 2006; GALE et al., 2006; ANTONIOLI et al., 2008; HUSSEIN et

al., 2009; LARSEN et al., 2009; ANTONIOLI et al., 2010). Alguns estudos mostraram

13

que pode ocorrer aumento do clone JAK2 mutado ao longo dos anos, sendo esse

aumento mais pronunciado em PV do que TE tanto no sangue periférico como na

medula óssea (TEFFERI et al., 2007; CAROBBIO et al., 2009).

Em contraste, outros grupos utilizando amostras sequenciais do mesmo

paciente mostraram uma maior redução da carga alélica inicial logo após o início da

terapia citorredutiva e uma flutuação mais sutil ao longo dos anos (GIRODON et al.,

2008; RICKSTEN et al., 2008; THEOCHARIDES et al., 2008; ZALCBERG et al.,

2011). Estas variações parecem ser mais frequentes entre o 2º e 3º quartis

(ZALCBERG et al., 2011). Pacientes mais idosos tem carga alélica mais alta e

possuem tendência a aumento da carga alélica com o tempo (ANTONIOLI et al.,

2008). Alguns pacientes conseguem atingir a resposta molecular completa, ou seja,

níveis indetectáveis de JAK2V617F durante o acompanhamento (GIRODON et al.,

2008; RICKSTEN et al., 2008).

Além disso, o uso da quantificação da carga alélica, para avaliação de doença

residual mínima, no monitoramento pós transplante alogênico de células tronco

hematopoéticas (TCTH) em pacientes JAK2V617F positivos tem aumentado. A

presença de carga alélica >1% no dia 28 pós transplante e a falha de obtenção de

uma resposta molecular completa em 6 meses pós TCTH, tem se mostrado um

parâmetro precoce de recidiva e utilizado para guiar o uso de infusão de linfócitos do

doador (ILD). O monitoramento da doença residual mínima pode ser realizado tanto

em amostras de medula óssea e de sangue periférico com a mesma eficiência.

(LANGE et al., 2013). Pacientes com MF negativos para JAK2V617F apresentam

sobrevida menor quando comparados ao grupo JAK2V617F positivo. (KROGER et

al., 2006; BENJAMINI et al., 2008; GIRODON et al., 2008; KROGER et al., 2009;

ALCHALBY et al., 2010; LANGE et al., 2013).

Desta maneira, vale ressaltar a importância do desenvolvimento e

uniformização de métodos moleculares para a quantificação de JAK2V617F, a fim de

utilizá-los na prática clínica.

1.1.1.2. Metodologias para estimativa da carga alélica JAK2

Estudos visando relacionar a carga alélica com as características clínico-

laboratoriais se basearam, inicialmente, na presença da mutação em hetero ou

homozigose. A metodologia utilizada baseava-se na amplificação do éxon 14 de

JAK2 seguida de digestão com a enzima BsaXI.

14

A primeira técnica semiquantitativa desenvolvida para a quantificação da

carga alélica utilizou um PCR, com iniciadores fluorescentes, para a amplificação

das regiões alvo, seguido de análise de fragmentos. Embora bastante específica, é

uma técnica demorada, por envolver múltiplas etapas, e de pouca precisão para

quantificar amostras com baixa carga tumoral (<5%), embora a sensibilidade da

técnica possa chegar a 1% (VANNUCCHI et al., 2006; LIPPERT et al., 2009;

HUIJSMANS et al., 2011).

Recentemente, a análise por PCR quantitativo em tempo real vem sendo

utilizada (q-PCR) (LARSEN et al., 2007a). Esta técnica é a que oferece maior

sensibilidade, detectando até 0,01% do alelo mutado, e envolve somente um

procedimento. Entretanto, requer uma padronização meticulosa a fim de que sejam

obtidos resultados que possam nortear tomadas de decisão clínica. Neste caso, a

escolha da curva padrão controle é o parâmetro mais importante (LIPPERT et al.,

2009).

Uma variação do q-PCR é a análise por HRM (temperatura de melting ou high

resolution melting) (RAPADO et al., 2009). Este procedimento é simples e envolve

uma padronização com apenas dois controles: uma amostra com o gene JAK2 na

forma selvagem (WT) e outra com a V617F. A quantificação é estabelecida através

da comparação da temperatura de desnaturação do DNA teste com uma curva de

calibração contendo proporções diferentes dos DNAs-controle.

Finalmente, alguns laboratórios utilizam o sequenciamento de Sanger ou o

piro-sequenciamento como metodologia de avaliação da carga alélica. Entretanto,

estas metodologias têm sido abandonadas devido à baixa sensibilidade que

oferecem. Um ponto positivo deste tipo de abordagem é permitir um processamento

rápido de um grande número de amostras (LIPPERT et al., 2009).

Fóruns destinados a validação interlaboratorial das metodologias de

quantificação da carga alélica definiram a metodologia de q-PCR, com sondas

Taqman, como a mais sensível (1%); em relação a precisão (variação inter e intra-

ensaio), o q-PCR e o PCR-Alelo específico (AS) seguido de análise de fragmentos

por eletroforese capilar (PCR-C) foram as metodologias sugeridas. O q-PCR com

oligonucleotídeos AS foi o método que atingiu a maior sensibilidade (0,2%).

Este estudo chama atenção para alguns parâmetros técnicos importantes: a)

o uso da linhagem HEL como controle, que possui mais de duas cópias do gene

JAK2. De fato, alguns trabalhos relatam em torno de 8 cópias (QUENTMEIER et al.,

15

2006a). Desta forma, o uso desta linhagem para a confecção de uma curva padrão

para a quantificação de JAK2 não seria o mais apropriado, e caso esta linhagem

fosse utilizada seria necessário a geração um fator de correção capaz de normalizar

o número de cópias do gene JAK2; b) utilização de um gene controle para

estabelecimento da porcentagem do número de cópias do alelo JAK2 mutado (taxa

alélica de 100% é definida quando há o mesmo número de cópias do gene controle

e JAK2); geram variações na quantificação da carga alélica que podem sub ou super

estimar a carga alélica.

Em 2013, a rede européia LeukemiaNet e o consórcio MPN&MPNr-EuroNet,

realizaram uma avaliação interlaboratorial com 9 técnicas diferentes de quantificação

da carga alélica. Foram distribuídos entre os centros: a) os padrões utilizados:

plasmídeos (comercial) e DNA de linhagens celulares (HEL ou UKE-1 e K562); b) os

reagentes para reação de q-PCR; c) as condições de realização de cada ensaio.

Os resultados mostraram que a uniformidade entre os ensaios continua sendo

um grande problema, pois uma amostra teste distribuída pelo laboratório central de

controle de qualidade, que foi estimada como tendo 10% de carga alélica, foi

quantificada pelos grupos mostrando resultados conflitantes, que variavam, dentre

os laboratórios, em um intervalo de 23 a 80%.

Ao final das sete rodadas de controle de qualidade, o ensaio baseado na

publicação de LARSEN et al. (2007b) foi eleito como mais sensível, de maior

acurácia e performance. Este ensaio de q-PCR envolve a utilização de

oligonucleotídeos alelo específicos e sondas do tipo TaqMan, em duas reações

independentes. Este ensaio foi eleito como o mais confiável na detecção de cargas

alélicas abaixo de 1% e por isso o mais indicado para o monitoramento pós

transplante.

1.1.2. CALR

A CALR é um gene localizado no cromossomo 19, contendo 9 éxons, com

tamanho de 4,6kb. Este codifica uma proteína, a Calreticulina, que é uma chaperona

ligante de cálcio, de localização luminal no reticulo endoplasmático, sendo altamente

conservada entre espécies. A proteína possui um peso de 46kDa e três domínios

com diferentes propriedades funcionais e estruturais: a) um domínio N-terminal

globular, ligante de lectinas que possui uma sequência de endereçamento da

proteína ao retículo endoplasmático (RE); b) uma região intermediária rica em

prolina (domínio-P); c) e uma região acídica c-terminal (carregada negativamente),

16

que contém a sequência KDEL de endereçamento de proteínas da região cis do

complexo de Golgi para retorno ao retículo endoplasmático, e também com alta

capacidade de ligação ao Cálcio (Ca2+), sendo assim responsável pela homeostase

do Ca2+ intracelular (CHI et al., 2013a; GUGLIELMELLI et al., 2014).

Recentemente, alterações do tipo inserção e deleção (indels) foram descritas

no gene CALR (CHI et al., 2013a; KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a).

Cerca de 40 diferentes indels foram relatadas no exon 9 (figura 1.2), sendo a mais

frequente uma deleção de 52pb, que tem início no aminoácido leucina, na posição

367. Como resultado desta inserção, ocorre uma troca na fase de leitura que resulta

em um códon de parada, que ocorre 46 aminoácidos após a deleção. A deleção de

52 pb é chamada de tipo 1, e é encontrada com maior frequência nas MF. A

segunda alteração mais frequente é uma inserção de 5pb (TTGTC) com início no

aminoácido lisina, na posição 385. Esta inserção resulta em troca da fase de leitura

que resulta num códon de parada a 47 aminoácidos após a inserção e é

denominada de tipo 2, e é mais comumente observada nas TEs. Os indels em CALR

estão presentes em cerca de 67 a 82% dos pacientes com TE e 80 a 88% dos

pacientes com MF, negativos para a mutação V617F em JAK2 (CHI et al., 2013b;

KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a).

Desta forma, alterações em um único gene (CALR), discriminam um outro

grande grupo, dentre as NMP JAK2V617F negativas. Alterações gênicas em CALR e

JAK2 são mutuamente excludentes.

Em relação aos parâmetros hematológicos, é descrita a associação positiva

entre menores níveis de hemoglobina e leucócitos; níveis elevados de plaquetas ao

diagnóstico; risco diminuído para trombose e maior sobrevida em pacientes com TE

portadores de indels em CALR.

Na MF, indels em CALR estão associados à leucopenia, trombocitose e

aumento da sobrevida (KLAMPFL et al., 2013). A carga alélica tumoral de CALR

parece ser mais baixa em TE do que em pacientes com MF secundária à TE (32% X

50%). Pacientes com TE e CALR mutado tem menor incidência de transformação

tanto para PV como para leucemia aguda. Em relação ao sexo, os homens

apresentam maior incidência de mutações em CALR (KLAMPFL et al., 2013).

Ensaios in vitro com células Ba/F3 transduzidas com a mutação mais frequente de

CALR (del 52pb), mostraram ativação de STAT5 e crescimento independente de IL3

(KLAMPFL et al., 2013).

17

Praticamente todos os indels descritos em CALR geram deleção do domínio

KDEL, podendo, portanto, afetar a localização proteica. A expressão em membrana

de CALR parece mediar os sinais de “coma-me”, ao ser exposta na superfície de

células com sinal de morte por apoptose (GARDAI et al., 2005), e também por

mediar a fagocitose de blastos (CHAO et al., 2010). Entretanto, ao contrário do que

se esperaria, a CALR, em presença de deleção do domínio KDEL, permanece no RE

(NANGALIA et al., 2013a).

Figura 2 Figura 1.2: Figura ilustrativa do espectro de INDELS detectadas no gene CALR. A barra em

cinza representa o exon 9 do gene Calreticulina; as barras vermelhas indicam as deleções, as letras

azuis indicam os nucleotídeos inseridos, e em laranja as substituições somáticas adquiridas. Estão

ressaltadas as alterações mais frequentes: Tipo 1 (Type 1), deleção de 52pb e tipo 2 (type 2),

inserção de 5pb. Adaptado de KLAMPFL et al. (2013).

Mutações em CALR não são exclusivas das NMP, estando presentes em

baixa frequência em outras neoplasias mielóides que são parte do diagnóstico

diferencial com as NMP. Como exemplo: ARSA-t (3/24-12%) (KLAMPFL et al.,

2013), SMD (anemia refratária, anemia refratária com excesso de blastos, ARSA),

leucemia mielóide crônica atípica e leucemia mielomonocítica crônica (NANGALIA et

al., 2013a). Alterações em CALR não foram observadas em controles normais,

neoplasias linfóides, leucemia mielóide aguda e tumores sólidos, mostrando ser

desta forma, pela alta especificidade, um relevante biomarcador diagnóstico

(GUGLIELMELLI et al., 2014).

18

1.1.3. MPL

O receptor de trombopoietina é codificado pelo gene MPL, que está localizado

no braço curto do cromossoma 1, na região p24. As mutações mais frequentes em

MPL estão no éxon 10, mais especificamente nos códons 505 – p.Ser505Asn e 515

- p.Trip515Leu/Lys. Mutações em MPL estão presentes em pacientes com sintomas

clínicos das neoplasias mieloproliferativas, mas que, em geral, são negativos para a

mutação JAK2V617F. As mutações em MPL são observadas em 10% dos pacientes

com mielofibrose idiopática (PARDANANI et al., 2006; PIKMAN et al., 2006), e em 1-

5% dos pacientes com trombocitemia essencial (PARDANANI et al., 2006).

PARDANANI et al. (2006) detectaram mutações em MPL em 20/1182 pacientes,

sendo que 6/20 pacientes possuíam mutações concomitantes em JAK2 e MPL.

Anormalidades citogenéticas, megacariócitos displásicos e risco de transformação

para mielofibrose ou leucemia mielóide aguda foram observados em pacientes com

TE, negativos para JAK2V617F, e positivos para mutações em MPL (SCOTT et al.,

2007).

Em resumo, atualmente apenas uma pequena parcela de pacientes com

suspeita clínica de NMP (16,5% dos pacientes com TE e 6% dos pacientes com MF)

não pode ser caracterizada ao diagnóstico por um marcador molecular, utilizando as

mutações nos genes aqui apresentados (KLAMPFL et al., 2013).

Esta pequena fração, ainda é de difícil diagnóstico, porque o conjunto de

sinais e sintomas clínicos é pouco específico. A procura de novos biomarcadores do

diagnóstico continua e o entendimento atual aponta para que esta pequena fração

venha a ser caracterizada por alterações em diferentes genes de muito baixa

frequência.

1.2. Tratamento

A Hidroxiureia (HU) é um composto orgânico simples, sintetizado por Dresler

e Stain em 1869 e aprovado pela FDA (Food and Drug Administration /USA) em

1967. Em pacientes com NMP, o tratamento padrão no Brasil é a utilização de

Hidroxiureia em doses proporcionais à massa do paciente e ao nível de

desregulação dos parâmetros hematológicos.

O monitoramento do tratamento dos pacientes é realizado através de

hemogramas frequentes, como forma de obter uma normalização, mesmo que

parcial, dos parâmetros hematológicos. Quando há uma diminuição nos valores de

19

alguns dos parâmetros, tais como hematócrito, plaquetas e leucócitos, que estejam

fora dos limites mínimos considerados normais, a utilização do fármaco é

interrompida até que o referido parâmetro encontre-se novamente normalizado.

Alguns pacientes não respondem satisfatoriamente à HU ou tornam-se refratários ao

longo do tratamento. Conforme descrito na literatura (ANTONIOLI et al., 2010;

ZALCBERG et al., 2011), a carga alélica de JAK2 não é diretamente afetada pela

HU, apesar das flutuações observadas nos parâmetros hematológicos ao longo do

tempo. A carga alélica de JAK2 possui maiores flutuações no intervalo inicial do

tratamento ou em períodos curtos de observação. Em pacientes com carga alélica

entre o 2º e 3º quartis esta flutuação parece ser mais evidente (ZALCBERG et al.,

2011).

Recentemente, inibidores para as tirosinas cinases da família JAK foram

descritos. Pelo menos quatro compostos já foram utilizados em testes clínicos, e foi

comprovado que cada um deles possui uma ação mais seletiva entre as diferentes

proteínas da família JAK. Os inibidores disponíveis são Ruxolitinib (INCB018424,

Axon MedChem; Jakafi™, Incyte e Novartis), TG101348 (SAR302503, Fedratinib,

Sanofi), Lestaurtinib (CEP-701, Cephalon) e XL019 (Exelixis).

O Ruxolitinib® possui potente atividade inibitória para JAK1/2, atividade

moderada para TYK2 e praticamente nenhuma atividade para JAK3. O tempo médio

para observar-se um efeito terapêutico é de 15 meses. A toxicidade não

hematológica (graus 1 e 2) foi relatada em menos de 10% dos pacientes (QUINTÁS-

CARDAMA et al., 2011).

Estudos clínicos de fase 3 com este inibidor demonstraram a redução do baço

em praticamente todos os pacientes do grupo que utilizou o inibidor, com média de

redução de 31,6% após 24 semanas de tratamento, com manutenção do tamanho

do baço por pelo menos 48 semanas. O grupo tratado com placebo teve um

aumento médio de 8,1% do tamanho do baço. O grupo tratado com o inibidor

também teve maior redução no escore total de sintomas quando comparado ao

grupo placebo (49,5% X 5,3%). Este estudo também analisou a redução da carga de

JAK2V617F nos dois grupos: os pacientes tratados com o inibidor tiveram uma

redução de 10,9% e 21,5% após 24 e 48 semanas de tratamento, enquanto que o

grupo placebo apresentou aumento médio de 3,5% e 6,3% na carga alélica após

mesmo intervalo de análise (VERSTOVSEK et al., 2012).

20

A partir de julho de 2008, o inibidor Ruxolitinib obteve aprovação nos EUA

para uso em pacientes com PV refratários ou intolerantes à terapia com HU. No total

foram eleitos 34 pacientes no estudo, que foram tratados, em média, por 3 anos. Em

quatro semanas, o hematócrito foi reduzido para <45% e os sintomas também

melhoraram substancialmente tais como prurido e sudorese noturna. Clinicamente

os pacientes também apresentaram redução no perfil de citocinas inflamatórias e de

ativação granulocítica (VERSTOVSEK et al., 2014).

O inibidor TG101348 (SAR302503, fedratinib, Sanofi) é um inibidor

competitivo do sítio de ATP de JAK2 WT e mutado (V617F), que possui maior

seletividade entre os membros da família de JAK. Os estudos de fase I mostraram

redução da carga alélica à metade nos pacientes estudados. Quatro pacientes

JAK2V617F positivos tiveram aumento da carga alélica (PARDANANI et al., 2011).

No estudo de fase III (JAKARTA), o principal resultado foi a taxa de resposta

do baço (diminuição em > 35% do volume em relação ao diagnóstico após 24

semanas) que foi de 47% (400mg) e 49% (500mg) em 24 semanas e de 36% (400

mg) e 40% (500 mg) após 28 semanas. Os pacientes tratados com inibidor também

tiveram melhoras consideráveis nos sintomas, quando comparados ao grupo

controle (p>0,0001) (PARDANANI et al., 2013). Entretanto, em 18 de novembro de

2013, o estudo do inibidor teve de ser descontinuado devido ao desenvolvimento de

encefalopatia de Wernicke, o que fez com que a análise de risco-benefício não fosse

favorável. O FDA aconselhou a Sanofi a colocar todos os estudos com a droga em

espera clínica.

Outros inibidores como o Lestaurtinib® (CEP-701, Cephalon), XL019

(Exelixis) e CYT3387 vem sendo testados em diferentes fases de ensaios clínicos.

Atualmente existem outros inibidores em desenvolvimento, chamados de segunda

geração, que estão, inclusive, com testes clínicos em andamento, tais como

SB1518, AZD1480, INCB028050, INCB16562, Tasocitinib, NVP-BSK805

(PASSAMONTI; MAFFIOLI; CARAMAZZA, 2012).

Em 2009, um grupo de pesquisadores europeus patrocinados pela Rede de

trabalho Comunitária de Excelência ou LeukemiaNet desenvolveu um guia para a

definição do grau e da qualidade da resposta ao tratamento em PV e TE (BAROSI et

al., 2009). O grupo desenvolveu três categorias de resposta: a) clínico-hematológica

(CH); b) molecular; c) histológica; estas categorias são ainda agrupadas em:

completa, parcial e ausência de resposta.

21

Na TE, a resposta clínico-hematológica (CH) representa: redução/

normalização dos níveis de plaquetas (<400mil/mm³); ausência de sintomas

relacionados à doença (distúrbios microvasculares, prurido e dor de cabeça);

redução/ normalização da esplenomegalia em exames de imagem; redução/

normalização do número de leucócitos (< 10mil/mm³). Desta forma, a resposta CH

completa representa a conquista de todos os requisitos; a resposta parcial em uma

diminuição dos níveis de plaqueta para < 600mil/mm³ ou diminuição de > 50% do

nível ao diagnóstico; e a resposta histológica no desaparecimento da hiperplasia

megacariocítica.

A avaliação terapêutica por métodos moleculares na TE depende da

determinação prévia de um marcador molecular. A redução dos níveis do marcador

é observada com o uso de metodologias quantitativas para detecção da

anormalidade molecular detectada ao diagnostico. Desta maneira, classifica-se

como resposta completa aquela onde a redução dos níveis é tal que o marcador

molecular não pode ser detectado pelas metodologias moleculares; parcial quando

há uma redução de mais de 25% ou 50% da carga alélica observada ao diagnóstico,

para pacientes que possuíam carga alélica <50% ou >50%, respectivamente.

Na PV, a resposta clínico-hematológica (CH) é obtida quando os seguintes

critérios são obtidos: hematócrito <45% sem flebotomia; níveis de plaquetas <

400mil/mm³; leucócitos < 10mil/mm³; baço de tamanho normal ao exame de imagem

e nenhum dos sintomas, distúrbios microvasculares, prurido e dor de cabeça, são

observados. Desta forma, a resposta completa é aquela onde todos os parâmetros

acima relacionados são alcançados, uma resposta parcial quando o hematócrito

<45% sem flebotomia ou 3 ou mais critérios são atingidos. A resposta histológica

requer a normocelularidade ajustada para a idade e ausência de fibrose reticulínica.

Finalmente, a resposta molecular na PV segue os mesmos critérios de TE.

1.3. Progressões naturais nas NMP

As NMP clássicas, PV, TE e MF, conforme já introduzido anteriormente,

podem ter uma evolução tumoral, passando de um estado em que a maioria dos

clones apresenta heterozigose em JAK2 para um estado de perda de

heterozigosidade e aquisição de alguns clones com JAK2 mutados em homozigose,

sugerindo um percurso de evolução natural da doença. Em TE, já discutimos que a

presença desta carga alélica acima de 50% está relacionada com a aquisição de

fenótipos mais semelhantes à PV. Na PV, a carga alélica acima de 50% está

22

associada à maior propensão a fibrose medular, sugerindo uma evolução para MF

secundária. Pacientes com TE também podem evoluir para MF secundária, que

pode ser um estágio intermediário para evolução para leucemia aguda (BAROSI et

al., 2007a). A progressão para MF secundária ocorre em cerca de 20-30% dos casos

(DINGLI et al., 2006; HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009) e a progressão

leucêmica é um evento mais raro, ocorrendo em cerca de 5-7% dos casos

(ABDULKARIM et al., 2009), sendo um evento altamente agressivo, com prognóstico

altamente adverso, e que até o momento não existe um marcador preditivo de

progressão (MESA; TIBES, 2012).

A progressão leucêmica ou leucemia aguda secundária (LA) ou fase blástica,

é um estágio de progressão das NMP e das SMDs, que possui prognóstico muito

desfavorável, com risco de morte em pouco tempo (dias ou meses) após o

diagnóstico de LA. Em comparação com a LMA de novo, a transformação advinda

das NMP apresenta um desfecho ainda mais adverso (SEKERES et al., 2009;

MILOSEVIC et al., 2012;).

A taxa de transformação leucêmica em NMP clássica é de cerca de 7%

(ABDULKARIM et al., 2009), enquanto que na SMD pode chegar a 30% dos casos

(GREENBERG et al., 1997). Quanto a origem da progressão leucêmica dentro das

NMP, a taxa de prevalência da LA proveniente de PV ou TE é de 6% e após a MF é

de 16% (ABDULKARIM et al., 2009).

Tipicamente, a leucemia aguda secundária evolui a partir de uma MF

secundária, ou após uma fase fibrótica intermediária. Somente cerca de 10-30%

desses casos evoluem para LA (BAROSI et al., 2007a). Apenas a minoria dos casos

transformam diretamente de uma PV ou TE, sem passar pelo estágio fibrótico

(MESA; TIBES, 2012). O panorama é de que nos primeiros 10 anos após o

diagnóstico, entre 8 a 23% dos pacientes com MF progridem para LA, e em cerca de

18 anos, 4-8% dos pacientes com PV e TE evoluem para LA (GAIDANO et al., 1994;

NAJEAN; RAIN, 1997; MESA, 2004; ABDEL-WAHAB et al., 2010;).

Alguns eventos já foram associados à progressão leucêmica, como a

presença de JAK2V617F, especialmente quando a carga alélica se apresenta acima

dos 50% (CAMPBELL et al., 2005; KRALOVICS et al., 2005; BELLANNE-

CHANTELOT, 2006; VANNUCCHI et al., 2007b). Em geral, é mais comum um

paciente JAK2V617F positivo se tornar negativo durante a progressão leucêmica

devido ao aparecimento de um novo clone não carreador da mutação JAK2V617F

23

do que um paciente V617F negativo adquirir a mutação (CAMPBELL et al., 2006;

THEOCHARIDES et al., 2007). Em alguns casos, os dois clones, o responsável pela

NMP e o responsável pela LA secundária, apresentam a mesma origem, conforme

observado por estudos de marcadores microssatélites (THEOCHARIDES et al.,

2007). Sabe-se também que a contagem de blastos periféricos superior a 3% ou

contagem de plaquetas inferior a <100 mil ao diagnóstico podem ser considerados

fatores preditivos de transformação leucêmica para pacientes com MF (HUANG et

al., 2008).

Sobre a influência do tratamento na progressão leucêmica, sabe-se que a

sobrevida livre de leucemia em pacientes com diagnóstico de MF não é afetada pelo

tratamento com HU, interferon alfa, talidomida, lenalidomida e corticoisteróides,

entretanto a progressão leucêmica foi menor em pacientes tratados com

estimuladores de eritropoiese (HUANG et al., 2008).

Alterações citogenéticas são detectadas em pacientes com NMP e mais

comumente em SMD, sendo ainda mais frequente na progressão leucêmcia

proveniente de SMD. Em TE é descrito que 5-15% dos pacientes apresentam

anormalidades citogenéticas, 15-35% na PV e 40-50% na MF. A frequência de

alterações citogenéticas pode variar de acordo com a técnica empregada, se

citogenética convencional (TEFFERI et al., 2001; STEENSMA; TEFFERI, 2002;

GANGAT et al., 2008) ou hibridização genômica comparativa (array-based

comparative genomic hybridization - aCGH). Esta última é mais específica, sensível

e permite uma análise global cromossômica mais precisa, entretanto não detecta

translocações (TEFFERI et al., 2009).

As anormalidades citogenéticas comuns descritas nas NMP são as trissomias

do cromossomo 8 e do 9, deleções do 12p, do 13q e do 20q, e parcial duplicação do

1q (BENCH et al., 1998; PANANI, 2007). A complexidade cariotípica aumenta na

progressão para MF secundária e LA (MILOSEVIC; KRALOVICS, 2012). Algumas

das anormalidades citogenéticas comuns na LA também estão presentes na MF, o

que pode refletir a história de evolução natural da doença. São elas: deleção do

cromossoma 20q, deleção do 13q23 (ambas associadas com prognóstico favorável),

trissomia do cromossoma 8 e do 9, e anormalidades do cromossoma 1 e 7 (BENCH

et al., 1998; NAJFELD et al., 2002). Anormalidades tais como 9p24.3 (dissomia

uniparental) (31%), 9p24 (13%), 1q32.1 (13%), 6p23 (10%), 6p22.3 (10%) são

observadas na LA secundária de evolução das NMP. Outras alterações são

24

observadas frequentemente na LA, mas também são compartilhadas com a LA

proveniente de SMD (MILOSEVIC et al., 2012) (tabela 1.2).

localização cromossômica

frequência

NMP-LA (%) SMD-LA(%)

5q31 20,8 16,2

7q36.1 20,8 24,3

5q14->q15 18,8 13,5

7q22.1 16,7 27

Tabela 2 Tabela 1.2: Tabela comparativa das frequências das alterações cromossômicas recorrentes

nas evoluções para leucemia aguda provenientes de NMP e SMD. Adaptado de MILOSEVIC et al.

(2012).

Do ponto de vista molecular, distintas mutações em diferentes genes têm sido

sugeridas como associadas ao processo de transformação leucêmica. Os genes

mais frequentemente citados são: TP53, ASXL1, CBL, FLT3, IDH1, IDH2, KRAS,

RUNX1, TET2, EZH2, LNK (tabela 1.3) (ROCQUAIN et al., 2010; MARTÍNEZ-

AVILÉS et al., 2011; TEFFERI; NOEL; HANSON, 2011).

Colunas1 JAK2 p.Val617Phe JAK2 exon12 MPL TET2 IDH1/2 ASXL1 EZH2 CBL DNMT3 IKZF1 LNK

PV 96% 3% NA 16% 2% NA 3% RARO 7% NA RARO

TE 55% NA 3% 5% 1% 3% NA RARO NA NA RARO

MF 65% NA 10% 17% 4% 13% 7% 6% 7% NA RARO

CRISE BLÁSTICA 50% NA 5% 17% 20% 18% NA NA 14% 19% 10% Tabela 3 Tabela 1.3: Taxa das mutações descritas em NMP. Adaptado de Tefferi et al. (2011). PV -

Policitemia Vera; TE – Trombocitose essencial; MF – mielofibrose.

No entanto, a maior parte dos estudos disponíveis foram decorrentes da

progressão leucêmica secundária à SMD (GONDEK et al., 2007a, 2007b; BEER et

al., 2009;HEINRICHS et al., 2009) ou não especifica qual doença de base a LA

ocorreu (SANTANA-DAVILA et al., 2008a); ou analisa a progressão leucêmica de

SMD e NMP conjuntamente como se fosse um mesmo fenômeno (GONDEK et al.,

2007a, 2007b; STEGELMANN et al., 2009; KLAMPFL et al., 2011; RUMI et al.,

2011). Mesmo em situações onde existe um esforço em discriminar melhor os

subgrupos, pela raridade do evento, poucas amostras por doença foram até hoje

analisadas (PV, TE e MF) (REILLY et al., 1997; TEFFERI et al., 2005; DINGLI et al.,

2006; GANGAT et al., 2008, 2009; ABDULKARIM et al., 2009; BEER et al., 2009;

HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009; KNOOPS et al., 2009; STEGELMANN et al.,

25

2009; TEFFERI et al., 2009; ABDEL-WAHAB et al., 2010; THOENNISSEN et al.,

2010; VISANI et al., 2011).

Desta forma, é de grande importância que mais estudos sejam focados em

subgrupos específicos a fim de melhorar o entendimento dos mecanismos

subjacentes à progressão para leucemia aguda secundária nas NMP. Avaliações

seriadas de pacientes ao longo da evolução das NMP são necessárias para este tipo

de estudo. É neste contexto, em um agrupamento de doenças englobadas sob a

mesma denominação, mas altamente heterogêneas, no momento de maior evolução

clonal, que este trabalho está inserido.

26

2. Objetivos

2.1. Principal

O objetivo principal deste trabalho foi identificar perfis moleculares

diferenciados em pacientes com NMP pela presença ou ausência de mutações nos

genes JAK2, CALR e MPL, correlacioná-los aos padrões de resposta terapêutica

além de identificar mecanismos genéticos subjacentes à progressão leucêmica

revelados por técnicas genômicas de alta resolução.

Para isto, foram propostos os seguintes objetivos secundários:

2.2. Secundários

Estabelecer um banco de dados clínicos de um grupo de pacientes com NMP

para estudos de correlação e associação com biomarcadores moleculares;

Estabelecer metodologias para detecção de mutações descritas na literatura:

mutações do exon 12 e 14 do gene JAK2, inserções e deleções no gene CALR e

mutações no gene MPL;

Correlacionar a presença e a frequência das mutações encontradas com o

curso clínico dos pacientes no grupo estudado;

Analisar a carga alélica da mutação p.val617phe em JAK2 e correlacioná-la

com resposta ao tratamento e progressão da doença;

Avaliar a presença de mutações em IDH1, IDH2 e TET2 em subgrupos de

pacientes de NMP com progressão leucêmica e correlacionar com aspectos clínicos;

Avaliar a variação do número de cópias (alterações cromossômicas) em

pacientes com NMP com progressão leucêmica por técnicas de alta resolução

(aCGH – array comparative genomic hybridization);

Avaliar, através de técnicas de sequenciamento massivo paralelo (WES –

Whole exome sequencing), a presença de mutações pontuais, inserções e deleções

visando avaliar o possível papel preditivo destas para o diagnóstico, prognóstico e

principalmente como marcador preditivo ou associado à progressão leucêmica;

Analisar a arquitetura clonal da NMP de acordo com a evolução clonal nos

casos de progressão leucêmica;

Iniciar a análise de algumas das mutações encontradas pelo WES em uma

subcoorte de NMP.

27

3. Metodologia

3.1. Pacientes

A coorte central deste estudo é composta de 1.892 amostras provenientes de

1.236 pacientes com suspeita diagnóstica de NMP enviadas e registradas ao

laboratório de Biologia Molecular (LabBioMol) do Centro de Transplantes de Medula

Óssea (CEMO) para análise molecular da mutação p.Val617Phe no gene JAK2 de

janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013. Esta coorte central possui 25 centros de

diversos Estados brasileiros (RJ, BA, CE, RS, ES).

No presente estudo foi avaliada uma subcoorte retrospectiva e prospectiva de

218 pacientes com NMP (38 PV, 91 TE, 33 MF, 43 NMP-U, 13 SMD) contendo 883

amostras sendo 70 pacientes provenientes do Hospital Universitário Pedro Ernesto

(HUPE/UERJ) e 148 pacientes do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF)

durante o período de janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013. Além da amostra

inicial / diagnostico, sempre que possível foram avaliadas trimestralmente amostras

prospectivas de pacientes positivos para referida mutação para fins de

acompanhamento/ progressão da doença, bem como de resposta ao tratamento à

hidroxiureia e com inibidores específicos de JAK1/2 (Ruxolitinib). A partir desta

coorte selecionamos uma coorte de estudo utilizando-se dois centros (HUAP/n=101

e HUPE/n=61), formada por 162 pacientes (38 PV, 91 TE e 33 MF) (figura 4.2 –

resultados). Esta seleção foi realizada tendo-se como base a colaboração cientifica

com os clínicos destes serviços, o que permitiu o acesso a uma caracterização

clínica detalhada dos pacientes, além de revisão dos critérios diagnósticos para

categorização das NMP (PV, TE e MF) pelo patologista de referência dos dois

serviços escolhidos. A caracterização clínica detalhada foi realizada a partir da

criação de um banco de dados construído a partir dos dados inseridos em uma ficha

clínica específica para este estudo (anexo 3). Uma busca ativa foi realizada por um

trabalho junto ao corpo clínico associado à consulta aos prontuários no setor de

Hematologia de cada um dos hospitais. Desta forma, os parâmetros clínicos,

hematológicos, patológicos e moleculares ajudaram no diagnóstico final dos

pacientes através dos critérios da OMS/WHO 2008.

Os pacientes utilizados neste estudo foram identificados em nosso banco de

dados através de uma identificação numérica única, que será utilizada neste

trabalho, quando tivermos a necessidade de citarmos especificamente um paciente.

28

Um termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado pelo paciente ou

por seu responsável legal. As amostras de sangue periférico e/ou biópsia de medula

óssea foram coletadas dos pacientes para diagnóstico (ou exame de

acompanhamento) e as amostras excedentes foram utilizadas para pesquisa.

O presente estudo obedece às diretrizes de pesquisa envolvendo seres

humanos do Conselho Nacional de Saúde (RDC nº196/1996) e encontra-se

aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer sob o nº

62/08 (anexo 2).

3.2. Banco de dados

Os dados clínicos dos pacientes foram coletados através da consulta aos

prontuários dos pacientes, onde uma ficha clínica desenvolvida para este trabalho foi

preenchida para fins de alimentação do banco de dados clínicos (anexo 3).

3.3. Preparo das amostras

As amostras de sangue periférico e de biópsia de medula óssea foram

centrifugadas em gradiente de Ficoll-Hypaque® para a separação das frações de

granulócitos e células mononucleares. A fração de granulócitos foi retirada e tratada

com solução para lise de eritrócitos (red cell lysis buffer - RCLB) de 5 a 10 min a

4ºC. A seguir, a solução foi centrifugada (300g por 10min a 20ºC), o pellet de

granulócitos foi ressuspendido em PBS (phosphate buffer solution) e centrifugado

(200g por 10min a 20ºC) para a retirada de plaquetas. A seguir os granulócitos foram

centrifugados (4000 rpm por 10min) com solução hipotônica (20 mM Tris HCl - pH

8.0, 10 mM EDTA) a 4ºC. O DNA genômico foi extraído com 1mL de DNAzol® (1-3 X

107 células), precipitado com 500 L de etanol absoluto, lavado (2X) com etanol

75%, solubilizado em 8mM de NaOH, neutralizado com HEPES e o DNA

armazenado a 4ºC.

Quando não foi possível a separação da porção de granulócitos, a amostra foi

tratada diretamente com RCLB e o DNA genômico de todas as linhagens celulares

foi extraído com uma solução de DNAzol® ou Trizol® segundo as especificações do

fabricante.

29

3.4. Análise de mutações em genes específicos

De maneira geral, as amostras foram submetidas a uma reação em cadeia da

polimerase (PCR – polimerase chain reaction) para amplificação de fragmentos

contendo a região de interesse, utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores

específicos. A seguir, estes fragmentos foram visualizados em gel de agarose 2%

através de uma eletroforese convencional e os géis foram documentados através do

sistema de transiluminação Gel Doc XR (BioRad®) utilizando-se o software Quantity

One (BioRad®). Para as reações de sequenciamento pelo método de Sanger, os

fragmentos foram purificados em kits comerciais que utilizam a metodologia de

coluna, seguindo as especificações do fabricante. Os produtos purificados foram

semiquantificados em gel de agarose utilizando-se o marcador de peso molecular

low mass (Invitrogen®), e submetidos à reação de sequenciamento de Sanger

utilizando-se o reagente Big Dye V3.1, conforme especificações do fabricante. As

reações de PCR foram realizadas no termociclador Veriti® 96 poços (Applied

Biosystems). A corrida eletroforética de sequenciamento capilar foi realizada no

analisador genético 3130xl (Applied Biosystems). Os eletroferogramas foram

analisados utilizando-se os softwares Chromas V2.32 (Technelysium Pty Ltd) e

Mutation Surveyor V3.3 (SoftGenetics LLC).

3.4.1. Análise de mutações no gene JAK2

3.4.1.1. Mutação V617F - Reação qualitativa

As amostras foram submetidas a uma reação em cadeia da polimerase (PCR

– polimerase chain reaction) alelo específica qualitativa para detecção da mutação

p.Val617Phe no éxon 14 do gene JAK2 conforme descrito por BAXTER et al. (2005)

com algumas alterações. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nesta reação

são um reverso comum (R – 5’ CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA

3’), um controle interno (IC) que se anela no íntron a montante do éxon 14 (IC – 5’

ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG 3’) e um iniciador direto que se

anela no alelo mutado (F – 5’ AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT ATT 3’).

Foi utilizada a concentração de 1M para o oligonucleotídeo

para os oligonucleotídeos interno e direto. A reação produz dois amplicons, um de

364pb comum a todos os pacientes e outro de 203pb presente somente nos

indivíduos com a mutação. O perfil térmico utilizado é uma desnaturação inicial de

94ºC durante 5 min, e 36 ciclos com temperatura de desnaturação de 94ºC durante

30

30s, temperatura de anelamento de 57ºC durante 30s e temperatura de extensão de

72ºC durante 1min e extensão final de 10min.

3.4.1.2. Mutação V617F - Reação quantitativa

As amostras positivas para a mutação p.Val617Phe foram quantificadas pelo

método de análise de fragmentos utilizando-se uma PCR multiplex alelo específica e

o sequenciador MegaBACE 1000 DNA Analysis System (GE Healthcare) ou a

plataforma 3130xl (Applied Biosystems®) para corrida de eletroforese capilar. A

reação de PCR foi realizada segundo descrito por VANNUCCHI et al. (2006) e os

resultados foram analisados no software Peak Scanner V1.0® (Applied

Biosystems®). A quantificação foi determinada através da seguinte equação: % alelo

mutado = (mt/(wt+mt)).

Nesta reação foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos iniciadores não

marcados a 1,6M de concentração final FO – 5’ TCC TCA GAA CGT TGA TGG

CAG 3’/ RO – 5’ ATT GCT TTC CTT TTT CAC AAG AT 3’ e os seguintes iniciadores

marcados com 6 carboxifluoresceína (6FAM) a 0,8M de concentração final Rm* -

5’ GTT TTA CTT ACT CTC GTC TCC ACA AAA 3’/ FI-1* - 5’ GCA TTT GGT TTT

AAA TTA TGG AGT ATA TG 3’.

Os oligonucleotídeos FO e RO se anelam nas extremidades, formando um

amplicon de 452 pb que foi utilizado como controle de amplificação. O

oligonucleotídeo FI-1 se anela à sequência selvagem (WT), produzindo um amplicon

de 228 pb e o oligonucleotídeo Rm se anela ao alelo mutado, produzindo um

amplicon de 278 pb. O perfil térmico possui desnaturação inicial de 5 min a 94ºC,

seguido de 30 ciclos com temperatura de desnaturação de 94ºC durante 30s,

temperatura de anelamento de 53ºC durante 30s e temperatura de extensão de

72ºC durante 45s e extensão final de 20 min. AS placas para eletroforese capilar

foram preparadas utilizando-se 8,7L de formamida, 0,3L de Liz500 (Applied

Biosystems) e 1,0L de produto de PCR diluído 1:5.

A fim de verificar a acurácia da técnica foi construída uma curva de

plasmídeos mutado e não mutado, diluídos um contra o outro nas seguintes

proporções: 100%, 95%, 90%, 70%, 50%, 30%, 10%, 5% e 0% de alelo mutado.

Para tal, um paciente com 100% de alelo mutado e um doador de medula

óssea tiveram seu DNA amplificado pelos oligonucleotídeos iniciadores FO e RO e o

amplicon inserido no plasmídeo comercial TA cloning® Kit (Invitrogen) de acordo

31

com as especificações do fabricante. A bactéria competente XL1 foi transformada,

selecionada, plaqueada, algumas colônias selecionadas, triadas, o plasmídeo

extraído por lise alcalina e purificado por PEG 8000 a 13% (protocolo recomendado

pela Applied Biosystems).

De maneira similar, outra técnica foi estabelecida para a quantificação da

mutação JAK2V617F por PCR em tempo real com química Taqman®. Para esta

técnica foram empregadas duas curvas padrão, uma de plasmídeo e outra de

linhagens celulares. A curva de plasmídeos construída em nosso laboratório já foi

descrita previamente e a curva de linhagem foi construída a partir de DNA da

linhagem celular Hel (human erythroleukemia) diluída em DNA da linhagem K562. As

células da linhagem Hel são proveniente de uma eritroleucemia humana, derivada

do sangue periférico de um paciente com doença de Hodgkin que desenvolveu uma

eritroleucemia secundária. Esta linhagem foi estabelecida a partir das células

mononucleares do sangue periférico e possui o alelo JAK2 mutado (p.Val617Phe)

em homozigose e com a presença de mais de 8 cópias do alelo mutado (MARTIN;

PAPAYANNOPOULOU, 1982; QUENTMEIER et al., 2006a). A linhagem K562,

também é uma linhagem de leucemia mielogênica com células do tipo eritroleucemia

humana. Esta linhagem celular foi estabelecida a partir de uma crise blástica de uma

paciente de 53 anos com leucemia mielogênica crônica. As células derivadas dessa

linhagem possuem o alelo selvagem de JAK2, mas apresentam o gene de fusão

BCR-ABL.

Para a reação de q-PCR foram empregados os seguintes oligonucleotídeos

iniciadores na concentração final de 300nmol/L: direto - 5’-

CTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGA-3’/ reverso wildtype (wt) (selvagem) - 5’-

GTAGTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAtAC-3’/ reverso mutado (mt) - 5’-

ACTTACTCTCGTCTCCACAtAA-3’ e a seguinte sequência para a sonda taqman, na

concentração final de 200nmol/L: 6-FAM-

TGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-TAMRA. O perfil térmico utilizado foi

uma desnaturação inicial a 95ºC por 10min, seguido de 40 ciclos de 15s a 95ºC e

60s a 60ºC. Para a reação foi utilizado o master mix de PCR TaqMan® universal

(Applied Biosystems) na concentração final de 1x e 30ng/uL de DNA. Todas as

reações foram realizadas em duplicatas. Para quantificação, foi utilizada uma curva

padrão de plasmídeos de 107 cópias a 101. Para fins de sensibilidade da técnica,

também foi utilizada uma curva padrão utilizando-se DNA de uma linhagem

32

contendo apenas o alelo selvagem (K562) e de uma linhagem contendo o alelo

mutado (Hel) em diluições seriadas. As diluições continham de 10.000 cópias a 10

cópias da mutação p.Val617Phe em JAK2 (Hel) e da cópia selvagem de JAK2

(K562). As reações foram realizadas no sistema de detecção ABI PRISM® 7000.

Os resultados foram analisados através da seguinte fórmula, extraída da

equação da reta da curva padrão y=-ax+b, onde a é a inclinação da reta (slope), e b

o intercepto. A seguir é feita uma diferença entre os logs do alelo selvagem (wt) e do

alelo mutado (mt), utilizando a seguinte equação: y=b1x+a1-(b2x+a2), onde b1 é o

intercepto do alelo wt, a1 é a inclinação da reta da curva padrão wt, b2 é o intercepto

do alelo mt, a2 é a inclinação da reta da curva padrão mt. A esta diferença foi

aplicado o cálculo de eficiência, elevando-se à potência de 10 a diferença entre os

logs, para estabelecimento da proporção de cada alelo.

3.4.1.3. Análise de mutações dos éxons 12 e 14 de JAK2

Os pacientes negativos para a mutação p.Val617Phe de JAK2 que tiveram o

diagnóstico de Policitemia Vera ou os pacientes com diagnóstico de NMP/SMD, que

foram negativos para indels no gene CALR foram submetidos à testagem de

mutações nos éxons 12 e 14 do gene JAK2. As amostras foram amplificadas

utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores para o éxon 12: direto

5’AGTTCAATGAGTTGACCCCT3’ / Reverso 5’TTTGCTAACATCTAACACAAGGT3’

e para o éxon 14: direto 5’ GGGTTTCCTCAGAACGTTGA 3’/ Reverso 5’

TCATTGCTTTCCTTTTTCACAA 3’ (UGO et al., 2010). Todos os oligonucleotídeos

foram utilizados na concentração final de 0,4M. O perfil térmico utilizado foi uma

extensão inicial a 94ºC por 4 min, seguida de 36 ciclos de desnaturação a 94º por

30s, anelamento a 55ºC por 30s e extensão a 72ºc por 1min, com extensão final de

20min. O produto de PCR do éxon 12 possui 464pb e o do éxon 14, 460pb. A seguir

os fragmentos seguiram o protocolo previamente descrito para a reação de

sequenciamento de Sanger.

3.4.2. Análise de mutações no éxon 9 de CALR

As amostras negativas para a mutação p.Val617Phe foram triadas para busca

de indels no gene CALR pelo método de análise de fragmentos utilizando-se a

plataforma 3130xl (Applied Biosystems®) para corrida de eletroforese capilar. Os

oligonucleotídeos, descritos por KLAMPFL et al. (2013), foram utilizados para

ampllificação do produto na concentração final de 0,4M. O oligonucleotídeo direto

33

foi marcado com 6carboxifluoresceína (6-FAM). O perfil térmico utilizado foi de uma

extensão inicial a 95ºC por 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95º por

30s, anelamento a 67ºC por 30s e extensão a 72ºc por 1min, com extensão final de

10min. O produto de PCR selvagem possui 263pb.

A seguir, as placas para eletroforese capilar foram preparadas e analisadas

conforme descrito anteriormente. Foram considerados como uma possível mutação

(indel) qualquer variação de tamanho em relação ao alelo selvagem, desde que

tivesse um pico com altura similar ao alelo selvagem (wt).

As amostras também foram analisadas pelo métodos de sequenciamento de

Sanger para fins de validação dos resultados da análise de fragmentos, utilizando-se

os seguintes oligonucleotídeos na concentração final de 0,4mM: direto

5’TAACAAAGGTGAGGCCTGGT3’ / Reverso 5’TCTTAGCTCCCCTCCAACCT3’ . O

perfil térmico utilizado foi uma extensão inicial a 95ºC por 4 min, seguida de 35 ciclos

de desnaturação a 95º por 30s, anelamento a 65ºC por 45s e extensão a 72ºc por

1min, com extensão final de 10min.

3.4.3. Análise das mutações em MPL

Os pacientes negativos para a mutação p.Val617Phe e para indels em CALR

que possuíam diagnóstico de trombocitemia essencial, mielofibrose ou SMD/SMP

foram submetidos à testagem de mutações em MPL. Primeiramente um grupo de

pacientes foi analisado pelo método de sequenciamento de Sanger, utilizando-se os

seguintes oligonucleotídeos iniciadores: direto- 5’TCCTAGCCTGGATCTCCTTGG 3’/

Reverso–5’CACAGAGCGAACCAAGAATGCC3’. O perfil térmico utilizado para

reação de amplificação foi uma extensão inicial a 94ºC por 3 min, seguida de 34

ciclos de desnaturação a 94º por 30s, anelamento a 54ºC por 30s e extensão a 72ºc

por 1min, com extensão final de 10min. O produto de 186pb foi submetido a reação

de sequenciamento, conforme protocolo previamente descrito.

Após o estabelecimento de pelo menos um controle mutado, a triagem foi

realizada através da técnica de High Resolution Melting (HRM) utilizando-se o

termociclador Rotor-GeneQ 6000. Para reação de amplificação seguida de HRM foi

utilizado o kit de PCR Type-it HRM PCR Kit (Qiagen) na concentração final de 1x,

0,5mM MgCl2 e os oligonucleotídeos iniciadores foram: direto

5’TAGCCTGGATCTCCTTGGTG3’/ Reverso 5’GCGGTACCTGTAGTGTGCAG3’

(BOYD et al., 2010) na a concentração final de 0,7pmol/L e 30ng/L de DNA por

reação. O produto final de amplificação possui 107pb. Os DNAs testes de pacientes

34

foram corridos em duplicata. O perfil térmico utilizado foi uma desnaturação inicial a

95ºC por 7 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15s, anelamento a

60ºC por 30s e extensão a 72ºC por 20s. A seguir a reação passou por uma etapa

de HOLD a 50ºC por 30s e uma etapa de HRM de 80ºC a 88ºC, com aquisição de

dados a cada 0,03ºC. As barras de normalização foram ajustadas para as posições

84,28-84,48 e 85,32-85,52. Os dados foram analisados no software Rotor-GeneQ

Series V.1.7 build94 (Qiagen) e Screen-Clust HRM Software V1.10.1.3 (Qiagen). Os

produtos de PCR foram purificados, quantificados e submetidos à reação de

sequenciamento de Sanger conforme descrito anteriormente para confirmação e

identificação da mutação encontrada.

3.4.4. Análise de mutações nos éxons 14 e 15 de SF3B1

Os pacientes com diagnóstico de eritrocitose, trombocitose essencial,

trombocitose e anemia, mielofibrose secundária à trombocitose, anemia, diagnóstico

não classificável e outros diagnósticos foram submetidos à testagem de mutações

nos éxons 14 e 15 do gene SF3B1. As amostras foram amplificadas utilizando-se os

seguintes oligonucleotídeos iniciadores para os éxons 14 e 15 direto

5’TAGAGTGGAAGGCCGAGAGA3’ / Reverso 5’GGTTTGGCTGCTTTCTTGAA3’

(CUI et al., 2012). O perfil térmico utilizado foi uma extensão inicial a 95ºC por 4 min,

seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95º por 30s, anelamento a 63ºC por 1min e

extensão a 72ºc por 1min, com extensão final de 10min. O produto de PCR possui

1120pb. Em seguida os produtos foram submetidos à reação de sequenciamento de

Sanger, conforme especificado previamente.

3.4.5. Análise de mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8

Os pacientes com NMP JAK2V617F negativos foram submetidos à testagem

de mutações nos éxons 11 e 12 do gene MAPK15. As amostras foram amplificadas

utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores, desenhados pelo nosso

grupo, para os éxons 11 e 12 (na concentração final de 0,4M,): direto

5’CCTATGTCAGAGACCCCCAAAC3’ / Reverso

5’TCTGCACCTTTCAGTGACCCT3’. O perfil térmico utilizado foi uma extensão

inicial a 95ºC por 4 min, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 95º por 30s,

anelamento a 65ºC por 30s e extensão a 72ºc por 45s, com extensão final de 10min.

O produto de PCR dos éxons 11-12 possui 571pb. Os produtos foram submetidos à

reação de sequenciamento de Sanger conforme protocolo especificado previamente.

35

3.4.6. Análise de mutações nos éxons 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 de TP53

Os pacientes com NMP foram submetidos à testagem de mutações dos éxons

2 a 8 do gene TP53. As amostras foram amplificadas utilizando-se os seguintes

oligonucleotídeos iniciadores na concentração final de 0,4M (“IARC TP53

Database”):

exon Foward Reverso amplicon

2-3 GTGGGAAGCGAAAATTCCAT ATGAGACTTCAATGCCTGGC 506

4-5 TGTTCACTTGTGCCCTGACT TCTCTGGGAGGAGGGGTTAA 467

6 GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA TCCACCTCTCATCACATCCC 390

7-8 GACAAGGGTGGTTGGGAGTA GTTTTACCTGCAATTGGGGC 500 Tabela 4: Tabela 3.1 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TP53.

O perfil térmico utilizado foi uma extensão inicial a 94ºC por 2 min, seguida de

50 ciclos de desnaturação a 94º por 30s, anelamento a 61ºC para os exons 2-3, 4-5

e 7-8 e de 65ºC para o éxon 6 por 45s e extensão a 72ºc por 45s, com extensão final

de 10min. Os produtos foram submetidos à reação de sequenciamento de Sanger

utilizando-se protocolo previamente descrito.

3.4.7. Análise de mutações em IDH1 e 2

Os pacientes que leucemizaram foram submetidos à testagem de mutações

no éxon 4 dos genes IDH1 e IDH2. Primeiramente o grupo de pacientes foi

analisado pelo método de sequenciamento de Sanger, utilizando-se os seguintes

oligonucleotídeos iniciadores (concentração final 0,4M): éxon 4 do gene IDH1 –

direto - 5’TGCCACCAACGACCAAGTCA 3’ /Reverso–

5’TGTGTTGAGATGGACGCCTATTTG3’ e para o éxon 4 do gene IDH2 direto – 5’

GGGGTTCAAATTCTGGTTGA 3’ / Reverso – 5’ CTAGGCGAGGAGCTCCAGT 3’

(WAGNER et al., 2010). O perfil térmico utilizado para reação de amplificação foi

uma extensão inicial a 94ºC por 3 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94º

por 30s, anelamento a 60ºC por 30s e extensão a 72ºc por 1min, com extensão final

de 10min. O amplicon de IDH1 possui 437pb e o IDH2 251pb. Ambos foram

submetidos à reação de sequenciamento pelo método de Sanger.

36

3.4.8. Análise de mutações em TET2

Os pacientes que leucemizaram foram submetidos à testagem de mutações

nos éxons 3 e 9 do gene TET2 pelo método de sequenciamento de Sanger,

utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos iniciadores (ROCQUAIN et al., 2010) na

concentração final de 0,4M:

Nome do oligo Sequência do oligonucleotídeo iniciador Tamanho do fragmento

TET2 ex3 PCR1F 5'-TGAACTTCCCACATTAGCTGGT-3'

TET2 ex3 PCR1R 5'-GAAACTGTAGCACCATTAGGCATT-3' 955pb

TET2 ex3 PCR1seq 5'-GATAGAAATAAACACATTTT-3'

TET2 ex3 PCR2F 5'-CAAAAGGCTAATGGAGAAAGACGTA-3' 836pb

TET2 ex3 PCR2R 5'-GCAGAAAAGGAATCCTTAGTGAACA-3'

TET2 ex3 PCR3F 5'-GCCAGTAAACTAGCTGCAATGCTAA-3' 846pb

TET2 ex3 PCR3R 5'-TGCCTCATTACGTTTTAGATGGG-3'

TET2 ex3 PCR4F 5'-GACCAATGTCAGAACACCTCAA-3' 867pb

TET2 ex3 PCR4R 5'-TTGATTTTGAATACTGATTTTCACCA-3'

TET2 ex3 PCR5F 5'-TTGCAACATAAGCCTCATAAACAG-3' 788pb

TET2 ex3 PCR5R 5'-ATTGGCCTGTGCATCTGACTAT-3'

TET2 ex3 PCR6F 5'-GCAACTTGCTCAGCAAAGGTACT-3' 781pb

TET2 ex3 PCR6R 5'-TGCTGCCAGACTCAAGATTTAAAA-3'

TET2 ex9F 5'-TGTCATTCCATTTTGTTTCTGGATA-3' 361pb

TET2 ex9R 5'-AAATTACCCAGTCTTGCATATGTCTT-3'

Tabela 5: Tabela 3.2: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação de TET2.

Os perfis térmicos utilizados possuíam uma desnaturação inicial de 94ºC por

3min, seguida de 35 ciclos com desnaturação de 94ºC por 30s, etapa de anelamento

por 30s e extensão a 72ºC por 1min, seguida de extensão final a 72ºC por 10min. A

temperatura de anelamento foi de 55ºC para as PCRs 4 e 5 do éxon 3 e para o éxon

9; de 60ºC para as PCRs 1 e 3 do éxon 3; e 65ºc para as PCRs 2 e 6 do éxon 3.

3.4.9. Análises estatísticas

Para comparação entre os valores hematológicos em cada subgrupo de

doença estudado foi utilizado o teste-t ou o teste de Mann-Whitney não pareado

bicaudal, com 95% de intervalo de confiança, para dados paramétricos e não-

paramétricos, respectivamente. Para comparação entre os valores hematológicos

entre a fase crônica e aguda dos pacientes que evoluíram para leucemia aguda foi

utilizado o teste pareado bicaudal de Wilcoxon, com intervalo de confiança de 95%.

O nível de significância utilizado em todos os testes foi de p<0.05. As análises

estatísticas foram realizadas no programa Prisma V5.00.

37

3.4.10. Análise de hibridização genômica comparativa em conjunto

(aCGH – array comparative genomic hybridization)

Os pacientes que progrediram para leucemia aguda tiveram a amostra ao

diagnóstico ou a primeira amostra enviada para o laboratório e a amostra da

progressão leucêmica estudadas por aCGH. Havendo disponibilidade, uma amostra

intermediária também foi analisada.

As amostras de DNA que não possuíam uma taxa de pureza 260/280 entre

1,8 e 1,9 e 260/230 acima de 1,9 foram submetidas à purificação através do kit

Gentra®Puregene®Cell Kit (Qiagen®), segundo especificações do fabricante.

As amostras ao diagnóstico e do estado leucêmico dos pacientes com NMP

que progrediram para leucemia (DNA tumoral) foram hibridizadas contra o DNA de

referência, utilizando-se uma lâmina de microarranjo de alta resolução 244k (Agilent

Technologies©, Palo Alto, CA, USA) contendo 236.231 alvos distintos, 5.000 alvos

de elementos repetitivos e 5.045 alvos de controle interno, permitindo uma resolução

de 19Kb. Todas as lâminas foram lidas no escâner Agilent Sure Scan e analisadas

no programa Genomic Workbench.

DNA referência foi obtido a partir de uma mistura de amostras de DNAs de

linhagens linfoblastóides do repositório Coriell provenientes de nove indivíduos

normais (mulheres).

Para tal, 1,2µg do DNA tumoral e do DNA referência foram digeridos

separadamente utilizando-se a enzima DNAseI (Ambion®, Austin, TX, USA) durante

12 min a temperatura ambiente. O DNA tumoral foi marcado com o fluoróforo

AlexaFluor5 e o DNA referência com AlexaFluor3 (Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA)

através de uma reação de nicktranslation utilizando-se iniciadores randômicos e

fragmentos de exo-Klenow (Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA) a 37ºC durante 2h. Os

DNAs marcados foram purificados pelo kit de colunas Bioprime® Total for Agilent

(Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA) e os DNAs tumoral e referência foram

hibridizados entre si por 30 min e depois hibridizados nas lâminas de microarranjo de

DNA de alta-resolução a 65ºC por 40h. As lâminas foram lavadas em tampão de

lavagem OligoaCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 e 2 (Agilent Technologies) e

escaneadas no escâner de microarranjo (Agilent Technologies). A extração dos

dados foi realizada utilizando-se o programa Feature extraction versão 10.7.3.1

(Agilent Technologies). Os dados foram analisados utilizando-se o programa

Genomic Workbench versão 5.0.14 (Agilent Technologies). O número de cópias das

38

anormalidades foi calculado utilizando-se o módulo de detecção de anormalidades

ADM-1, com um limiar de 6,0. Para detecção de anormalidades foi utilizado um filtro

com os seguintes parâmetros: detecção de pelo menos 5 sondas consecutivas com

taxa de log2 acima de 0,25. A taxa de log2 é calculada utilizando-se a razão entre o

número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência. A fim de identificar e eliminar

as variações polimórficas de número de cópias (CNV) germinativas foi utilizado um

banco de dados de CNVs criado pelo grupo do Dr Rafael Fonseca (Clínica Mayo-

Scottsdale) que incluía as variações reportadas nos estudos recentes de alta-

resolução de número de cópias (usando a plataforma SNP6.0) e estudos de

seqüenciamento disponíveis no portal de dados do Centro para Genômica Aplicada

(The Centre for Applied Genomics - TCAG) e nos estudos do próprio grupo utilizando

10 amostras controles do estudo HAPMAP empregando o chip de microarranjo

Sureprint G3 arrays.

3.4.11. Sequenciamento completo do exoma (WES - Whole exome

sequencing)

Os pacientes que progrediram da fase crônica para leucemia aguda e

apresentaram alterações pela técnica de aCGH tiveram a amostra ao diagnóstico, ou

a primeira amostra enviada para o laboratório, e a amostra da progressão leucêmica

estudadas por WES.

Para tal, 3µg de DNA genômico de amostras de pacientes com NMP que

progrediram para leucemia foram preparadas para o sequenciamento do exoma

(WES-whole exome sequencing). O exoma foi enriquecido através do kit SureSelect

Human All Exon V4, segundo especificações do fabricante, utilizando-se a estação

de trabalho NGS (Agilent Technologies) e o sequenciamento foi realizado na

plataforma Illumina HiSeq2000. O sequenciamento, as análises primária e

secundária das amostras foram realizados no centro de bioinformática da Clínica

Mayo (Rochester, Minesota, EUA). A análise terciária seguiu uma fluxo de trabalho

definido pelo grupo de Hematologia e Oncologia da Clínica Mayo (Scottsdale,

Arizona, USA) e a análise de clonalidade foi realizada através dos pacotes Mclust,

clValid, fpc do programa R.

Brevemente, as amostras foram sonicadas em fragmentos entre 150 e 200pb

utilizando-se colunas apropriadas (Covaris) no ultra sonicador M220 Focused-

ultrasonicator™ que utiliza a tecnologia AFA (adaptative-focused acoustics). Os

fragmentos obtidos foram purificados utilizando-se beads magnéticas Agencourt

39

AMPure XP (Beckman Coulter). Os fragmentos foram quantificados e a qualidade

verificada através do analisador 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Inc). A

seguir, foram adicionadas pontas cegas, caudas “poli A” e adaptadores aos

fragmentos para que as bibliotecas pudessem ser amplificadas. Após a amplificação,

os produtos da biblioteca passaram por mais uma etapa de purificação por beads

magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter), por mais uma etapa de

quantificação e verificação da qualidade da biblioteca amplificada através do

Bioanalyser. Uma massa equivalente a 750ng da biblioteca foi concentrada a vácuo

e ressuspendida em 3,4ul de água livre de nucleases. O tampão de hibridização e

captura de biblioteca contendo as iscas biotiniladas foi acrescentado à biblioteca e

hibridizado por 24h a 65ºC. Em seguida, os híbridos biblioteca de captura - DNA

genômico foram capturados utilizando beads magnéticas revestidas por

estreptavidina. A seguir as bibliotecas capturadas foram indexadas com etiquetas,

amplificadas e capturadas por beads magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman

Coulter). A qualidade e quantificação da biblioteca indexada foi verificada pelo

Bioanalyser, e seguiu para o sequenciamento.

A análise primária consistiu no controle de qualidade do processo químico do

sequenciamento e foi avaliado através do programa FastQC (Babraham Institute,

Cambridge, UK). As leituras com pelo menos 100pb foram alinhadas contra o

genoma humano (versão hg19) utilizando o programa Novoalign (Novocraft

Technologies, Malaysia). Após o alinhamento, as taxas de duplicação do PCR e a

porcentagens das leituras mapeadas nos alvos foram usadas para acessar a

qualidade de preparação das amostras. A análise secundária consistiu o

realinhamento, a recalibração e a chamada de variantes que foram realizados

seguindo o protocolo de boas práticas do kit de ferramentas de análise genômica

(GATK - Genome Analyis Toolkit - Broad Institute, Boston, USA) para detecção de

variantes V3.

As variantes germinativas foram determinadas através do programa

SomaticSniper e as inseções e deleções (indels) foram chamadas pelo algoritmo do

detector de indels do GATK. Cada variante detectada nas regiões exônicas do

genoma tiveram a sua previsão do efeito determinada pelo programa SnpEff e

PolyPhen-2. As variantes encontradas foram anotadas utilizando o fluxo de trabalho

TREAT, desenvolvido pelo grupo de bioinformática da Clínica Mayo (Rochester)

(ASMANN et al., 2011). Uma das funções dessa ferramenta é associar às variantes

40

do seqüenciamento a frequência alélica reportada nos bancos de dados tais como:

dbSNP, 1000 genomes, HAPMAP (populações Caucasianas (CEU),Yoruban (YRI), e

leste asiático (CHB/JPT)), the Exome Variant ServerNHLBI GO Exome Sequencing

Project (ESP)(Seattle, WA; http://evs.gs.washington.edu/EVS/) , BGI – Danish

Sequencing Project.

A análise terciária foi realizada seguindo um fluxograma que se inicia na

retirada das variantes reportadas nos bancos de dados citados anteriormente,

exceto se esta variante também estivesse reportada no banco de dados COSMIC. A

seguir foram excluídas as variantes que possuíam menos de 10 leituras. Variantes

não exônicas foram excluídas das análises. Ao final, a inspeção visual foi realizada

no Visualizador Genômico Integrativo (Integrative Genomics Viewer – IGV) para

confirmação das variantes e para retirada de SNPs germinativos observados em

material não tumoral de 25 amostras.

Para descoberta de variantes que pudessem estar implicados na progressão

leucêmica, foram consideradas somente as variantes que possuíam uma razão entre

as freqüências alélicas da amostra da progressão leucêmica e a amostra do

diagnóstico maior ou igual a 1.

A análise de clonalidade foi realizada somente nas variantes somáticas com

pelo menos 50 leituras, utilizando o pacote clValid (BROCK et al., 2011) do

programa R (R CORE TEAM, 2012). Este pacote utiliza 9 algoritmos de

agrupamento tais como agrupamento hierárquico (KAUFMAN; ROUSSEEUW,

1990), k-means (HARTIGAN; WONG, 1979), DIANA, PAM, CLARA (KAUFMAN;

ROUSSEEUW, 1990), FANNY (KAUFMAN; ROUSSEEUW, 1990), SOM

(KOHONEN, 1997), Expectation-Maximization (FRALEY; RAFTERY, 2001), SOTA

(DOPAZO; CARAZO, 1997) da base de distribuição do R, além de pacotes

adicionais como cluster (KAUFMAN; ROUSSEEUW, 1990; MAECHLER et al., 2013),

kohonen (WEHRENS; BUYDENS, 2007), mclust (FRALEY; RAFTERY, 2006;

FRALEY; RAFTERY; SCRUCCA, 2013;), e uma função para implemenatção do

SOTA (DOPAZO; CARAZO, 1997). Além dos pacotes de agrupamento, clValid tem

funções de validação interna e de medida de estabilidade do agrupamento. As

medidas de validação interna medem a qualidade do agrupamento como

compactação, conectividade e separação das partições dos agrupamentos. Neste

estudo foram utilizadas as medidas de conectividade, Dunn (DUNN, 1974) e

Silhoueta (ROUSSEEUW, 1987). Como foram analisadas duas amostras por

41

paciente, não foi possível rodar os algoritmos de medição da estabilidade do

agrupamento do pacote clValid. Para tal empregamos do pacote fpc (Flexible

procedures for clustering) a função de bootstrap e utilizamos as medidas de força da

predição, o melhor número de agrupamentos, os valores de instabilidade média para

cada agrupamento e a matriz com os valores de instabilidade para cada rodada de

bootstrap. A análise de ontologia de genes foi realizada através do banco de dados

de anotação, visualização e descoberta integrada V6.7 (DAVID- Database for

Annotation, Visualization and Integrated Discovery) do Instituto Nacional de Alergia e

Doenças Infecciosas (NIAID - National Institute of Allergy and Infectious Diseases,

NIH) (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2009a, 2009b).

42

4. Resultados

No período de 2007 a 2009 foram referidas ao LabBioMol 370 amostras para

diagnóstico de NMP, sendo aproximadamente 130 amostras/ano. Desta maneira,

estimávamos uma entrada de 560 amostras, oriundas dos 9 centros parceiros

participantes do grupo de estudo inicial, ao longo do período deste estudo (2010-

2013). É de se notar, que após termos estreitado o grupo de estudo original para

dois centros, ainda assim, a entrada de amostras superou nossas estimativas

originais perfazendo um total de 513 amostras (diagnóstico e acompanhamento)

relativas a 162 pacientes classificados como NMP.

Desta forma, no período entre janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013

foram referidas 1892 amostras ao LabBioMol relativas a 1236 pacientes (coorte

central) com suspeita de NMP para análise da mutação p.Val617Phe no gene JAK2

(figura 4.2). Amostras com leucocitose com suspeita de NMP, seguiram o seguinte

algoritmo laboratorial: i) PCR multiplex para avaliação de transcritos BCR-ABL, este

quando positivo, estabeleceu o diagnóstico de LMC. Quando negativo, as amostras

seguiram o fluxograma abaixo (figura 4.1): PCR qualitativo para detecção da

mutação JAK2V617F; as amostras negativas para JAK2V617F e com suspeita de

PV foram testadas para presença de mutação no gene JAK2 no éxon 12 ou no éxon

14 para mutações diferentes da JAK2V617F. Da mesma maneira, pacientes com

suspeita clínica de TE negativos para JAK2V617F, foram também, testados para

presença de mutação no éxon 9 do gene CALR e no éxon 10 do gene MPL.

Finalmente, pacientes com suspeita de anemia refrataria associada à trombocitose

(ARSA-T) foram também avaliados para mutações nos éxons 14 e 15 do gene

SF3B1.

O desenho experimental do estudo encontra-se simplificado na figura 4.2.

Brevemente, a partir de uma coorte central de 1236 pacientes, identificamos 218

pacientes provenientes de dois hospitais universitários parceiros – HUPE e HUAP –

dos quais coletamos os dados clínicos e hematológicos. A partir destes dados e em

conjunto com os dados de BMO e diagnóstico molecular, estes pacientes receberam

um diagnóstico final pelo clínico responsável pelo acompanhamento dos pacientes.

Após esta etapa, obtivemos 162 pacientes, sendo 38 PV, 91 TE e 33 MF. Destes,

tivemos 8 pacientes que transformaram para leucemia aguda secundária. Entretanto,

somente 5 pacientes possuíam amostra da fase de NMP (crônica) e da

transformação leucêmica (aguda) e estas foram estudadas por aCGH e WES.

43

Figura 3 Figura 4.1: Fluxograma de avaliação de mutações em NMP. Retângulos representam

ensaios diagnósticos para detecção de mutações em determinados genes. Círculos ou ovais verdes representam subgrupos de NMP. Como as mutações somáticas em JAK2, CALR e MPL são excludentes, uma vez detectada a mutação JAK2V617F, a análise de uma NMP foi considerada finalizada.

44

Figura 4 Figura 4.2: Desenho experimental do estudo. O laboratório de Biologia Molecular do

CEMO recebeu de 2007 a novembro de 2013, amostras 1236 pacientes para o diagnóstico molecular

da mutação V617F em JAK2 provenientes de 25 centros parceiros. Para o presente estudo,

escolhemos uma subcoorte contendo dois centros (HUPE e HUAP) nos quais tivemos 218 pacientes

que receberam o diagnóstico final de NMP/SMD pelo clínico responsável por cada um dos centros.

Destes, 162 pacientes tiveram o diagnóstico de PV, TE ou MF confirmados através de exames

hematológicos, moleculares e de anatomia patológica (critérios da OMS/WHO). Destes, 8 pacientes

progrediram para leucemia aguda secundária, mas enfatizamos nesta gravura, somente aqueles

pacientes que tiveram suas amostras estudadas molecularmente. As setas indicam quais as

metodologias empregadas em cada etapa do estudo.

4.1. PCR qualitativa (alelo – específico) para a mutação JAK2V617F

Após a análise da mutação JAK2V617F em 162 pacientes com diagnóstico

final de PV, Te e MF, observamos uma distribuição semelhante das categorias

clínicas abordadas neste estudo nos dois centros envolvidos, demonstrando uma

homogeneidade na distribuição dos pacientes, independentemente do centro (figura

4.3).

45

Figura 5 Figura 4.3: Distribuição das NMP, BCR-ABL negativas, clássicas (PV, TE e MF primária ou

secundária), de acordo com a Classificação da OMS/WHO-2008, nos dois centros participantes deste

estudo. PV- Polictemia Vera; TE-Trombocitemia Essencial; MF-Mielofibrose; HUPE – Hospital

Universitário Pedro Ernesto (UERJ); HUAP – Hospital Universitário Antônio Pedro (UFF).

A frequência da distribuição da mutação JAK2V617F entre as categorias

clínicas mostrou que 92% dos pacientes com PV e que 46% e 48% dos pacientes

com TE e MF apresentavam a mutação JAK2V617 (figura 4.4).

Figura 6 Figura 4.4: Frequência de distribuição da mutação JAK2V617F por cada uma das categorias

de NMP de acordo com a Classificação da OMS/WHO-2008. PV- Polictemia Vera; TE-Trombocitemia

Essencial; MF-Mielofibrose; HUPE – Hospital Universitário Pedro Ernesto (UERJ); HUAP – Hospital

Universitário Antônio Pedro (UFF).

46

4.2. Padronização de ensaios moleculares para a detecção da carga

alélica de JAK2V617F

A padronização da quantificação da mutação JAK2V617F foi realizada por

duas metodologias: PCR com oligonucleotídeos fluorescentes seguido de análise de

fragmento (PCR-C) e por PCR em tempo real (q-PCR). A escolha da PCR-C foi por

ser esta, em um primeiro momento, uma abordagem de baixo custo e alta

especificidade e a q-PCR, por ser hoje a mais largamente utilizada pela maioria dos

grupos (LIPPERT et al., 2009).

Para a quantificação da mutação JAK2V617F por PCR-C, uma curva padrão

foi confeccionada a partir de diluições seriadas de um plasmídeo contendo o alelo

mutado contra um plasmídeo contendo o alelo selvagem clonados, em nosso

laboratório. Estes plasmídeos foram clonados a partir de uma amostra de um doador

de medula óssea e de um paciente portador da mutação JAK2V617F em

homozigose (XAVIER et al., 2008).

A quantificação realizada sempre foi comparada com a curva padrão de DNA

plasmidial. Para tal, foi realizada uma diluição seriada do DNA plasmidial, nas

seguintes concentrações do alelo mutado: 0%, 10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 95%,

100%, na qual o N da tabela 4.1 representa o número de amostras testadas para

cada diluição. A variação do número de amostras testadas para cada uma das

concentrações se deve ao fato de que todas as diluições não foram incluídas em

todos os ensaios, mas os pontos de 0% e 100% foram sempre testados (tabela 4.1).

A curva foi criada para avaliar a eficiência da reação e o limite de detecção da carga

alélica do nosso ensaio que foram de R²=0,9941 e 10%, respectivamente (figura

4.5). O gráfico representa a correlação entre os valores teóricos esperados a partir

da diluição seriada entre os plasmídeos com 0% e 100% de alelo mutado e os dados

obtidos experimentalmente. Cada ponto representa a média de cada amostra

utilizada em cada ponto da curva.

47

pontos da curva (% alelo mutado)

Média Desvio médio

N

0 0 0 49

10 6,1525 0,5793417 20

30 30,26744 1,247185 39

50 53,70474 2,219058 19

70 70,04642 1,151473 28

90 83,642 1,442174 5

95 92,772 2,197432 5

100 99,6952 0,1991292 50

Tabela 6 Tabela 4.1: Representação da média de leitura dos pontos da curva de plasmídeo de JAK2

pelo método da PCR-C. O N corresponde ao número de amostras para cada ponto da curva.

Figura 7 Figura 4.5: Gráfico de correlação entre o dado teórico e o obtido experimentalmente por

análise de fragmentos. Cada ponto representa a média obtida em cada um dos pontos da curva

padrão gerada a partir da diluição dos plasmídeos que contém 0% do alelo selvagem e 100% do alelo

mutado para JAK2V617F.

Da mesma maneira, os produtos fluorescentes da PCR foram testados para

estabelecimento da melhor concentração de uso em duas plataformas utilizadas

neste estudo: sequenciador MegaBACE 1000 DNA Analysis System (GE Healthcare)

e sequenciador 3130xl (Applied Biosystems®). Para a primeira, foi estabelecida a

diluição de 1:10 do produto e para a segunda a melhor diluição foi de 1:5. Os

critérios adotados para validação das corridas do PCR-C foram: a) qualidade do

marcador Liz 500 (Sizing Quality – SQ) linear (próximo a 1); b) Picos selvagens (wt)

com intensidade entre 1000 e 8000 unidades arbitrárias de fluorescência (UAF); c)

Picos mutados (mt) com intensidade mínima de 50 UAF. Como regra geral, amostras

48

com carga alélica inferior a 30%, verificada por eletroforese em gel de agarose, não

necessitaram de diluição para visualização dos produtos por eletroforese capilar. Na

prática, uma correlação entre uma carga alélica <30% e a intensidade da banda

visualizada em gel de agarose pode ser utilizada para o planejamento das diluições.

Para validações intra e interensaios foram utilizadas amostras da coorte

central sendo avaliadas 74 e 54 amostras, respectivamente. As diluições foram

separadas por quartil e calculadas as médias e o desvio das médias dos valores

encontrados para as amostras em cada quartil (tabela 4.2). Para a variação

intraensaio foi considerada a diferença para cada uma das triplicatas, enquanto que

a variação interensaio foi mensurada comparando-se cada ensaio.

Quartil da carga alélica

n intra ensaio

Média da variação

intra ensaio

desvio médio

n inter ensaio

Média da variação inter

ensaio

desvio médio

75-100 6 0,32 0,41 5 1,06 0,67

50-75 18 1,66 1,26 8 2,22 1,38

25-50 24 1,35 0,87 16 2,73 1,25

0-25 26 1,23 0,85 25 1,41 0,80 Tabela 7 Tabela 4.2: Ensaio para avaliar a variabilidade intra e interensaio de JAK2 por PCR-C. Para

cada quartil foi calculada a média e o desvio médio de cada amostra.

A técnica padrão ouro para a quantificação da mutação JAK2V617F utiliza

diluição de linhagens celulares positivas para esta mutação contra linhagens

negativas (LIPPERT et al., 2009; JOVANOVIC et al., 2013;). A fim de comparar a

quantificação pela diluição de DNA plasmidial com a de linhagens celulares uma

nova curva foi construída a partir de diluições seriadas (0%, 25%, 50%, 75% e 100%

mt) de DNA da linhagem HEL (JAK2V617F positiva) contra DNA de K562

(JAK2V617F negativa).

Para cada ponto da diluição foi avaliada a porcentagem do alelo mutado

observado tanto pelo método de análise de fragmento (PCR-C) quanto pelo Real

Time (q-PCR). A eficiência para cada um desses ensaios foi bem semelhante:

0,7353 e 0,7233, respectivamente (Tabela 4.3). Os resultados obtidos com a curva

padrão plasmidial mostraram uma eficiência de reação bem similar entre o

plasmídeo selvagem (0,995) e mutado (0,9834) (resultados não mostrados).

Analisando a diluição de 50%, pela técnica de PCR-C, que esperaríamos

encontrar uma razão entre o alelo JAK2 mutado contra o alelo JAK2 selvagem igual

49

a 1, observou-se que o valor obtido no alelo mutado era 8 vezes maior do que o

esperado. Tal fato esta de acordo com a literatura que descreve a presença de um

maior número de cópias de JAK2 na linhagem celular HEL (JELINEK et al., 2005;

QUENTMEIER et al., 2006b). Desta forma, consideramos um fator de correção 8,

para equalizar os resultados obtidos com a curva HEL, que quando aplicado gerou

uma quantificação bem próxima da esperada, e uma eficiência de reação de 0,9991

(tabela 4.3).

De forma similar ao descrito para PCR-C, na diluição de 50%, no qPCR

(quando esperaríamos encontrar um mesmo Ct de amplificação para os alelos

mutado e selvagem), foi observado uma diferença de 3 Cts de amplificação entre Ct

JAK2 selvagem e Ct JAK2 mutado (tabela 4.3). Esta diferença é indicativa de um

aumento de número de cópias do alelo mutado de JAK2 na linhagem HEL, e similar

àquela obtida por PCR-C (2³ = 8). Após correção dos resultados obtidos por qPCR,

observamos valores semelhantes ao esperado, e a eficiência da reação foi de R² de

0,9965 (tabela 4.3).

A fim de comparar a quantificação da mutação de JAK2 pela curva padrão da

HEL pelas técnicas de PCR-C e q-PCR foi realizada uma regressão linear antes e

depois dos valores corrigidos (figura 4.6 A e B), podendo-se observar uma

correlação positiva tanto antes (R2 = 0,9995), quanto depois (R2 = 0,9916) da

aplicação do fator de correção.

Estes resultados demonstraram que para utilização de uma curva padrão a

partir de linhagens, estas devem ser sabidamente diplóide para JAK2, ou, caso

contrario, o número de cópias seja conhecido e utilizado como fator de correção.

Diluição análise de

fragmentos (observado)

real time (observado)

diferença ct observado

entre wt-mt

quantitativo esperado

para 8 cópias

análise de fragmentos (corrigido)

real time (corrigido )

Hel 100% 99,00 99,88 9,68 100,00 100,00 99,03

Hel 75% 95,40 97,00 5,02 96,00 72,14 80,22

Hel 50% 88,50 89,11 3,04 89,00 49,12 50,65

Hel 25% 71,00 73,65 1,49 72,00 23,41 25,95

K562 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

R² 0,7353 0,7233 0,9991 0,9965

Tabela 8 Tabela 4.3: Comparativo da curva de DNA de células da linhagem Hel diluídas em DNA de

células da linhagem K562 nas duas metodologias padronizadas e o quantitativo corrigido pelo número

de cópias extras em Hel.

50

Figura 8 Figura 4.6: Correlação entre as metodologias (PCR-C e q-PCR) de quantificação da carga

alélica de JAK2 utilizando a curva padrão de Hel diluída em K562. A) Correlação entre as

metodologias antes da aplicação do fator de correção e após o ajuste (B).

4.2. Correlação entre a carga alélica de JAK2V617F e as diferentes

categorias da OMS/WHO

A análise da carga alélica nas três diferentes categorias de NMP (PV, TE e

MF) evidenciou variações de carga alélica características a cada uma das categorias

distribuídas ao longo de todos os quartis. A mediana da carga alélica dos pacientes

com TE foi mais baixa do que a de pacientes com PV (p= 0,0002) e MF (p= 0,0090)

(figura 4.7). Quando comparada a distribuição da carga alélica entre os sexos não foi

observada diferença significativa entre as medianas (figura 4.8).

Figura 9 Figura 4.7: Frequência da carga alélica da mutação JAK2V617F nas três categorias clínicas

analisadas: PV- Polictemia Vera; TE-Trombocitemia Essencial; MF-Mielofibrose; As medianas das

51

cargas alélicas foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney não pareado bicaudal (95% IC,

p<0,05) * - p<0,05; ** - p<0,01; ***- p<0,001.

Figura 10 Figura 4.8: Distribuição da carga alélica de JAK2 ao diagnóstico entre os subgrupos de NMP

e por sexo. Uma amostra com carga alélica abaixo de 50% foi considerada como contendo clones em

heterozigose do alelo de JAK2; em contraste carga alélica acima de 50% foi associada à presença de

subclones contendo alelos de JAK2V617F em homozigose. PV-Polictemia Vera; TE-Trombocitemia

Essencial; MF-Mielofibrose; M-mulher; H-homem.

A PV foi mais frequente em mulheres do que em homens. Além disso, a

análise dos parâmetros hematológicos mostrou que pacientes positivos para

JAK2V617F cursaram com número de plaquetas mais alto que os pacientes

portadores do alelo selvagem (JAKV617F negativos) (p=0,03). Pacientes com PV e

JAK2V617F com carga alélica >50% apresentaram hematócrito mais altos que os

pacientes com carga alélica <50% (p=0,0145). Pacientes com a mutação

JAK2V617F tem mais chances de cursarem com esplenomegalia do que aqueles

que apresentam o alelo selvagem.

A análise de outros parâmetros clínicos (trombose, prurido, hemorragia) -

hematológicos (tabela 4.4 e 4.5) tais como níveis de hemoglobina, neutrófilos e

plaquetas não mostrou diferença estatisticamente significativa entre os pacientes

com carga alélica acima ou abaixo de 50%.

52

CARGA ALÉLICA JAK2 V617F

PV TOTAL (n) NEG POS p TOTAL (n) HETEROZIGOSE (n±dp) HOMOZIGOSE (n±dp) p

CARACTERÍSTICAS

PACIENTES 36 3 33 30 11 19

IDADE (média ±dp) 66,2±11,3 55±15 67±11 0,1515 66,6+-10,9 63,3+- 15,6 68,7+-6,6 0,2048

IDADE (Mediana - min-max) 68 (40-85) 55 (44-66) 69 (40-85) 69 (40-85) 65 (40-85) 69,5 (49-78)

SEXO (Fem/masc) 22/14 1/2 21/12 19/12 7/4 12/7

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

HEMATÓCRITO (%) 57,7±8,2 59,7±6,8 57,5±8,4 0,6717 58,1+-8,5 53,2+-6,6 60,9+-8,4 0,0145

HEMOGLOBINA (g/dL) 18,7±2,1 19,8±1,8 18,6±2,1 0,335 18,8+-2,2 17,9+-2,0 19,3+-2,1 0,0861

LEUCÓCITOS (/mm3) 11906±5632 7733±1106 12285±5730 0,1839 12471+-5427 12847+-6360 12800+-5026 0,6613

NEUTRÓFILOS (%) 68,2±10,7 62±10,4 62±10,4 0,3002 69,9+-9,3 66,1+-9 72,2+-8,9 0,0852

LINFÓCITO (%) 20,2±10,6 28,3±9,3 19,4±10,5 0,1654 18,3+-8,9 22,3+-9,6 16+-7,7 0,0609

MONÓCITO (%) 6,6±3,4 8,0±1,4 6,4±3,5 0,5524 6,4+-3,6 7,5+-4,6 5,8+-3 0,3132

PLAQUETAS (/mm³) 474919±264434 16333±46543 502412±257966 0,0312 490567+-250875 598909+-240869 427842+-240504 0,0711

Descrição das características clínicas-hematológicas do pacientes com PV

JAK2 V617F

Tabela 9 Tabela 4.4: Características clínicas dos pacientes com PV. As características analisadas

foram comparadas pelo teste t não pareado bicaudal (95% IC, p<0,05).

PV TOTAL (N-%) V617F (N-%) JAK2 NEG (N-%) RR (95% IC) OD (95% IC)

EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 37 34 3

EMAGRECIMENTO 4 (11%) 4 (12%) 0% 1,033 (0,04538 - 23,50)

HEMORRAGIA 1 (3%) 1 (3%) 0% 0,3134 (0,01061 - 9,257)

TROMBOSE 8 (22%) 7 (21%) 1 (33%) 0,6176 (0,1093 - 3,489) 0,5185 (0,04085 - 6,581)

PARESTESIA 4 (11%) 3 (9%) 1 (33%) 0,2647 (0,03837 - 1,826) 0,1935 (0,01330 - 2,816)

PRURIDO 3 (8%) 3 (9%) 0% 0,7778 (0,03290 - 18,39)

ESPLENOMEGALIA 10 (27%) 10 (29%) 0% 3 (0,1420 - 63,40)

HEPATOMEGALIA 2 (5%) 2 (6%) 0% 0,5385 (0,02128 - 13,63)

Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com PV JAK2V617F positivos e negativos

Tabela 10 Tabela 4.5: Comparação dos eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou

durante o acompanhamento dos pacientes com PV. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.

A TE foi mais frequente em mulheres do que em homens não tendo sido

encontrada uma associação significativa entre idade e positividade para

JAK2V617F.

Pacientes TE JAK2V617F positivos (alelo mutado) apresentaram hematócrito

(p= <0,0001), níveis de hemoglobina (p=0,0001) mais altos quando comparado a

pacientes JAK2V617F negativos (alelo selvagem). Já o número de linfócitos teve

correlação inversa (p= 0,0432).

A quantidade de alelo mutado maior que 50% em TE foi estatisticamente

significativa para o número de linfócitos mais baixos (p=0,0211) (tabela 4.6). Não

foram observadas outras associações significativas em relação às características

demográficas ou parâmetros hematológicos.

Os pacientes TE JAK2V617F positivos possuem mais chances de terem

eventos adversos como hemorragia, trombose, emagrecimento, parestesia e

organomegalias (baço e fígado) quando comparados aqueles JAK2V617F negativos

(tabela 4.7).

53

TE TOTAL (n) NEG POS p HETEROZIGOSE (n±dp) HOMOZIGOSE (n±dp) p

CARACTERÍSTICAS

PACIENTES 87 49 40 26 9

IDADE (média ±dp) 62,7±15,9 59,6±17,2 66,1±13,8 0,0615 64,8±13,8 74,4±11,6 0,0663

IDADE (Mediana - min-max) 62,5 (19-88) 59 (19-88) 67 (38-88) 65 (38-88) 73 (56-86)

SEXO (Fem/masc) 65/22 38/11 27/11 21/8 6/3


HEMATÓCRITO (%±dp) 39,6±6,1 37,2±5,2 42,6±5,8 <0,0001 42,1±5,5 43,5±6,9 0,5429

HEMOGLOBINA (g/dL±dp) 12,9±2,0 12,1±1,7 13,7±2,0 0,0001 13,7±2,0 13,7±2,1 0,9192

LEUCÓCITOS (/mm3±dp) 11777±13553 11360±17249 12277±7122 0,7539 11022±6286 15937±9649 0,0913

NEUTRÓFILOS (%±dp) 62,9±10,1 62,5±10,0 63,3±10,4 0,7563 62,0±8,5 65,6±15,0 0,3732

LINFÓCITO (%±dp) 23,7±8,5 25,5±8,2 21,6±8,5 0,0432 23,7±7,8 16,0±8,0 0,0211

MONÓCITO (%±dp) 8,9±6,2 8,8±6,0 8,9±6,4 0,955 9,8±6,8 6,9±4,6 0,2673

PLAQUETAS (/mm³±dp) 1016216±392486 995429±338103 1042333±455004 0,5805 1002862±391024 1111571±585980 0,554

Descrição das características clínicas-hematológicas do pacientes com TE

JAK2 V617F CARGA ALÉLICA JAK2 V617F

Tabela 11 Tabela 4.6: Características clínicas dos pacientes com TE. As características analisadas


TE TOTAL (N-%) V617F (N-%) JAK2 NEG (N-%) RR (95% IC) OD (95% IC)


EMAGRECIMENTO 10 (13%) 9 (24%) 1 (3%) 9,711 (1,290 - 73,11) 12,41 (1,488 - 103,5)

HEMORRAGIA 8 (10%) 7 (18%) 1 (3%) 7,553 (0,9735 - 58,60) 9,032 (1,055 - 77,36)

TROMBOSE 13 (16%) 11 (29%) 2 (5%) 5,934 (1,405 - 25,07) 7,944 (1,628 - 38,76)

PARESTESIA 6 (8%) 5 (13%) 1 (3%) 5,395 (0,6595 - 44,13) 6,061 (0,6739 - 54,51)

PRURIDO 0% 0% 0%

ESPLENOMEGALIA 16 (20%) 13 (34%) 3 (7%) 4,675 (1,443 - 15,15) 6,587 (1,702 - 25,49)

HEPATOMEGALIA 7 (9%) 6 1 (3%) 6,474 (0,8161 - 51,35) 7,5 (0,8581 - 65,55)

Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com TE JAK2V617F positivos e negativos


durante o acompanhamento dos pacientes com TE. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.

Na MF, pacientes positivos para JAK2V617F apresentaram número de

neutrófilos significativamente mais altos em comparação ao grupo JAK2V617F

negativo (p= 0,017). A análise de outros parâmetros hematológicos (tabela 4.8) tais

como hematócrito, níveis de hemoglobina, neutrófilos e plaquetas não mostrou

diferença estatisticamente significativa entre pacientes JAK2V617F positivos e

negativos. Da mesma forma, os níveis de carga alélica não impactaram os

parâmetros hematológicos. A esplenomegalia foi o evento mais frequente em

pacientes com MF (86%), entretanto, nenhum evento adverso teve maiores chances

de ocorrência entre os pacientes portadores ou não da mutação JAK2V617F (tabela

4.9).

54

JAK2 V617F CARGA ALÉLICA JAK2 V617F

MF TOTAL (n) NEG POS p HETEROZIGOSE (n) HOMOZIGOSE (n±dp) p

CARACTERISTICAS

PACIENTES 25 14 11 4 7

IDADE (média ±dp) 56,2±13,2 54,8±14,3 57,3±11,1 0,6262 59,5±11,7 59,2±10,2 0,9588

IDADE (Mediana - min-max) 56,5 (21-75) 56 (21-75) 62 (41-71) 64,5 (42-67) 62 (45-71)

SEXO (Fem/masc) 13/12 9/5 4/7 2/2 2/5


HEMATÓCRITO (%) 34,5±13,2 30,3±6,3 38,5±16,8 0,0964 30,0±13,2 43,2±21,0 0,2905

HEMOGLOBINA (g/dL) 11,0±3,8 9,8±1,9 12,1±4,7 0,1063 9,5±4,3 13,2±5,7 0,2825

LEUCÓCITOS (/mm³) 12101±11955 11902±15925 12286±7090 0,9329 13100±7559 12800±7961 0,9526

NEUTRÓFILOS (%) 63,6±12,0 58,3±12,5 68,9±9,2 0,017 69,3±10,4 72,2±5,3 0,57

LINFÓCITO (%) 20,5±8,0 23,3±9,0 17,7±5,8 0,0558 18,5±7,5 16,2±6,3 0,6085

MONÓCITO (%) 9,7±5,8 10,0±5,4 9,4±6,3 0,7998 10,3±3,3 6,8±5,1 0,2755

PLAQUETAS (/mm³) 374393±334745 354846±339012 3913335±341953 0,7796 632250±458542 369000±310023 0,2811

Descrição das características clínicas-hematológicas do pacientes com MF

Tabela 13 Tabela 4.8: Características clínicas dos pacientes com MF. As características analisadas


MF TOTAL (N-%) V617F (N-%) JAK2 NEG (N-%) RR (95% IC) OD (95% IC)


EMAGRECIMENTO 12 (41%) 6 (40%) 6 (43%) 0,9333 (0,3925 - 2,219) 0,8889 (0,2025 - 3,902)

HEMORRAGIA 0% 0% 0%

TROMBOSE 1 (3%) 1 (7%) 0% 3 (0,1125 - 79,98)

PARESTESIA 0% 0% 0%

PRURIDO 1 (3%) 1 (7%) 0% 3 (0,1125 - 79,98)

ESPLENOMEGALIA 25 (86%) 14 (93%) 11 (79%) 1,188 (0,8754 - 1,612) 3,818 (0,3472 - 41,99)

HEPATOMEGALIA 7 (24%) 2 (13%) 5 (36%) 0,3733 (0,08588 - 1,623) 0,2769 (0,04365 - 1,757)

Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com MF JAK2V617F positivos e negativos


durante o acompanhamento dos pacientes com MF. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.

A variação da carga alélica foi estudada em amostras seriadas ao longo do

acompanhamento de pacientes positivos para JAK2V617F. Como resultados foram

observados padrões de oscilação ou estabilidade da carga tumoral.

Em nosso trabalho recente (ZALCBERG et al., 2011) (anexo 4), analisamos a

variação da carga alélica, entre a primeira e a última amostra disponível no

laboratório, de pacientes submetidos a tratamento com Hidroxiureia (HU). A

comparação da carga alélica da amostra inicial de pacientes virgens de tratamento

com a última amostra de acompanhamento, disponível no laboratório, sugere que a

carga alélica inicial é maior, em pacientes com PV e TE. Já as variações observadas

em pacientes cuja primeira amostra disponível era após o início do tratamento esta

variação foi mais sutil (figura 4.9).

Análises de acompanhamento de alguns pacientes mostraram que a dose de

HU utilizada no tratamento teve impacto nos parâmetros hematológicos (pacientes 3-

PV, 4-TE, 6-TE, 7-PV, 10-TE, 11-TE, 31-TE e 63-PV) sem que houvesse uma

correlação direta entre a dose de HU utilizada e os níveis de JAK2V617F. Os

pacientes 1-PV e 2-PV mostraram um aumento da carga alélica, apesar de

55

apresentarem uma resposta hematológica em resultado ao uso de HU (anexo 4,

publicação 1).

De modo geral, nossos resultados mostraram que a carga tumoral permanece

estável durante o tratamento com HU. Pacientes com níveis de carga alélica

situados no 1º e 4º quartis (53-PV; 62-TE; 31-TE; 34-TE; 51-TE e 54-TE) tendem a

apresentar maior estabilidade dos níveis de carga alélica, enquanto que os

pacientes com níveis intermediários (2º e 3º quartil) apresentam maiores variações

(pacientes 3-PV e 12-PV) (tabela 4.10). Alguns pacientes que necessitaram

interromper o tratamento em função dos parâmetros hematológicos (número de

plaquetas, hematócrito baixo), apresentaram um aumento da carga tumoral

(pacientes 3-PV e 8-TE) (anexo 4, publicação 1).

Os pacientes 53-PV, 62-PV, 4-TE, 10-TE, 11-TE, 17-TE, 34-TE e 54-TE

apresentaram oscilações discretas da carga alélica. Em função da observação que

pacientes com PV apresentaram carga alélica mais alta (4º quartil) em comparação

aos com TE (1º quartil), propusemos uma correlação entre níveis de carga alélica e

categoria de NMP (anexo 4, publicação 1).

Figura 11 Figura 4.9: Variação da carga alélica de JAK2 em pacientes com PV e TE. À esquerda está

demonstrada a dinâmica entre uma amostra inicial do diagnóstico (sem tratamento) e a última amostra de acompanhamento disponível no laboratório. À direita a mesma dinâmica é demonstrada com a diferença de que na data da coleta da amostra inicial os pacientes já haviam iniciado o tratamento. As análises foram realizadas utilizando o teste pareado não paramétrico de Wilcoxon.

56

Paciente Doença Resposta hematológica às modificações nas doses de HU Resposta JAK2V617 às modificações nas doses de HU

2 PV oscilação oscilação V617F não relacionada à HU

3 PV oscilação oscilação V617F não relacionada à HU

9 PV oscilação discreta ausência de modificações (4º quartil)

53 PV oscilação discreta ausência de modificações (4º quartil)

63 PV oscilação discreta variação independente de V617F

6 TE oscilação ausência de modificações (2º quartil)

13 TE oscilação oscilação relacionada à HU

17 TE oscilação ausência de modificações (1º quartil)

31 TE oscilação modificação induzida por HU? (1º-2º-1º quartil)

34 TE oscilação ausência de modificação

51 TE oscilação oscilação V617F não relacionada à HU

54 TE oscilação oscilação discreta (1º quartil)

18 TE-LA ausência de variações modificação discreta (3º-2º-3º quartil)

Tabela 15 Tabela 4.10: Tabela resumo de alguns pacientes ressaltando as respostas hematológicas à

terapia citorredutora (HU) e as respostas de carga alélica.

Durante o acompanhamento, cinco pacientes evoluíram para mielofibrose

secundária. O diagnóstico inicial dos pacientes era: PV(2) e TE(3). O paciente #192,

portador de TE, cursou com níveis baixos de carga alélica, sendo a inicial de 10% e

durante o acompanhamento oscilando em torno de 5%. Este paciente ainda se

encontra em acompanhamento para avaliar se um aumento da carga alélica é

observado, como o esperado, em uma progressão de TE para mielofibrose

secundária (MFS). A carga alélica do paciente #714, portador de PV aumentou

durante o acompanhamento sendo observada uma mudança dos níveis da

JAK2V617F de < 50% para >50%. Entretanto a mudança de padrão não foi preditiva

ou concomitante ao aparecimento de MFS, sendo esta detectada somente 4 anos

após o aumento da carga alélica de JAK2V617F acima dos 50% (figura 4.10). Para o

paciente #341, portador de TE, com carga alélica próxima a 100% na amostra inicial,

não foi possível avaliar o comportamento da carga alélica ao longo da doença até a

transformação para MFS por perda de seguimento. Em contraste, para o paciente

#502 portador de PV, estavam disponíveis somente amostras do acompanhamento

após o período da transformação para MFS, quando a carga alélica era próxima a

100%. Para o paciente #144, portador de TE, várias amostras do seguimento

estavam disponíveis. A análise seriada destas amostras, ao longo do tratamento

com HU, mostra uma diminuição de clones JAK2V617F positivos com reflexo na

diminuição da carga alélica após o primeiro ciclo de HU e um aumento da carga

alélica, com níveis similares ao do diagnóstico, um ano antes da progressão. A

última amostra analisada após a transformação apresentou níveis de carga alélica

mais elevados do que a carga inicial (figura 4.11).

57

Figura 12 Figura 4.10: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente

#714, portador de PV e progressão para mielofibrose secundária (janeiro de 2013).


#144 portador de TE e progressão para mielofibrose secundária (junho de 2012).

O uso compassivo do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib), aprovado em 2012 pela

ANVISA, e revogado em 2013, em três pacientes, permitiu avaliar se o uso do

Ruxolitinib apresentava impacto na carga alélica de JAK2V617F em pacientes

positivos para a mutação. As figuras 4.12 e 4.13 mostram a cinética da carga alélica

ao longo do tratamento em 2/3 pacientes submetidos ao inibidor de JAK2V617F

positivo. É de se notar a não alteração dos níveis de JAK2V617F, sugerindo uma

não diminuição relevante do clone mutado. Em contraste, os pacientes

apresentaram uma melhora global dos sintomas clínicos. O terceiro paciente

58

negativo para JAK2V617F, submetido ao inibidor de JAK2 também apresentou

melhora global dos sintomas, apesar das intercorrências diretas (neutropenia) ou

indiretas (acentuação dos eventos adversos: microcirculação vascular – ferida no pé

associada à diabetes; lesão hipocrômica associada à hanseníase), associadas ao

tratamento. O paciente continua em uso do inibidor, com melhora das lesões,

parâmetros hematológicos estáveis e diminuição do baço.


#471 portador de mielofibrose ao longo do uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib).

Figura 15 Figura 4.13: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2V617F, do paciente #

616 portador de mielofibrose, ao longo do uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib).

59

4.3. Estabelecimento das metodologias para a detecção de mutações

adicionais em amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo

Amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo foram testadas para

a presença de outras mutações somáticas, de forma hierárquica, de acordo com a

suspeita clínica (figura 2). Desta forma, o rastreamento para mutações em MPL foi

realizado em pacientes com TE e MF e o rastreamento para mutações no gene

JAK2 no éxon 12 e ao longo de todo o exon 14 foi realizado nos casos de PV e MFS

à PV. A análise do status mutacional foi primeiramente realizada pelo método de

sequenciamento direto de Sanger. Os casos com mutações identificadas pelo

sequenciamento direto foram utilizados para padronização da técnica de HRM

utilizada posteriormente como de triagem.

4.3.1. MPL

A técnica de HRM para MPL foi padronizada utilizando-se amostras de

pacientes saudáveis doadores de medula óssea e de uma amostra, de padrão em

homozigose definido por sequenciamento direto, positiva para a mutação

p.Trp515Leu (W515L). Para fins de determinação de sensibilidade da técnica foi

realizada uma curva com diluições seriadas do DNA da amostra mutada contra a

amostra do tipo selvagem (100%, 75%, 50%, 25%, 10%, 5%, 1% e 0%mt). O gráfico

mostra que amostras positivas para a mutação p.Trp515Leu em MPL podem ser

diferenciadas daquelas do tipo selvagem quando presentes em um percentual ≥ 5%

(figura 4.14).

deg.

84,2 84,4 84,6 84,8 85,0 85,2 85,4 85,6 85,8 86,0 86,2 86,4 86,6

Norm

alis

ed m

inus w

t

0

-5

-10

-15

-20

-25

Figura 16 Figura 4.14: Curva de sensibilidade de detecção da mutação p.Trp515Leu em MPL por

HRM.

60

Uma vez estabelecida esta metodologia foi utilizada para a triagem e

identificação de pacientes portadores de mutações no éxon 10 de MPL. Desta

forma, 45 pacientes negativos para JAK2V617F foram avaliados por HRM para a

presença de mutações no éxon 10 de MPL. A mutação p.Trp515Leu foi observada

em três pacientes (figura 4.16). Pacientes cuja positividade para a mutação foi obtida

por HRM foram também avaliados por sequenciamento direto (figura 4.15). A análise

do cromatograma definiu a mutação em heterozigose nos três pacientes avaliados.

Figura 17 Figura 4.15: Cromatogramas de sequenciamento do gene MPL: (A) amostra tipo selvagem;

(B) mutação em homozigose (TGG TTG), (C) mutação em heterozigose.

4.3.2. Éxon 12 de JAK2

Os estudos para pesquisa de mutações no éxon 12 de JAK2 foram realizados

em três pacientes por sequenciamento direto. Dos pacientes testados, todos foram

negativos para a presença de mutação nesta região (figura 4.16). A ausência de

identificação de portadores de mutações se deve à baixa incidência das mutações

no éxon estudado, já relatada na literatura (SCHNITTGER et al., 2009).

4.3.3. Éxon 14 de JAK2

Para pesquisa de outras mutações no éxon 14 que não sejam a JAK2V617F

foram testados três pacientes com diagnóstico de PV, não tendo sido encontrados

pacientes portadores de mutações na região estudada (figura 4.16).

61

Figura 18: Figura 4.16: Frequência das mutações nos éxons 12 e 14 do gene JAK2 e no éxon

10 do gene MPL.

4.4. Análises moleculares nos pacientes com neoplasias mielóides/ NMP

que apresentaram progressão leucêmica

No grupo de estudo dos 162 pacientes, um subgrupo de 12 pacientes cursou

com evolução clínica associada à transformação para leucemia aguda além dos

cinco pacientes discutidos anteriormente e que evoluíram para MFS. Dos 12

pacientes, dois evoluíram para SMD, dois com diagnóstico de SMD transformaram

para LMA secundária e oito pacientes com NMP clássica transformaram para

leucemia aguda secundária. Destes últimos, sete com o diagnóstico inicial de TE e

um com diagnóstico de NMP-U (U=não classificável). O tempo médio para

progressão para leucemia aguda desde o diagnóstico de NMP foi de cinco anos e

meio com mediana de quatro anos (intervalo de 2 a 11 anos). Os pacientes que

progrediram para leucemia aguda possuíam a média de idade semelhante à média

de idade obtida nas três categorias clínicas estudadas (PV, TE e MF). Os pacientes

foram em sua maioria mulheres (88%) e negativos para a mutação JAK2V617F

(88%). A evolução da leucemia foi muito agressiva, com sobrevida média de 82 dias

(16 - 299) (tabela 4.11). A fase leucêmica, como esperado, foi caracterizada por

anemia e linfopenia periférica aumento da leucometria e presença de blastos (tabela

4.12). O evento adverso mais comum durante a fase crônica foi hemorragia (29%) e

em menor frequência trombose, esplenomegalia e emagrecimento. O evento

trombótico ocorreu no paciente com a maior contagem plaquetária, sendo este o

único paciente positivo para a mutação JAK2V617F (tabela 4.13). Destes oito

62

pacientes, cinco possuíam amostras da fase crônica (NMP), e da fase de progressão

leucêmica, um paciente com amostra somente da progressão leucêmica e dois

pacientes com amostras relativas ao período anterior à progressão leucêmica, ainda

em vigência de NMP.

Leucemia aguda secundária à NMP

JAK2

V617F

CARACTERÍSTICAS TOTAL (n) NEG POS

PACIENTES 8 7 1

IDADE (diagnóstico-média) 57±8,5 56,1±8,8 63

IDADE (diagnóstico-mediana-min-max) 59,5 (41-66) 59 (41-66)

IDADE (leucemização secundária-média) 62,5±8,5 61,4±8,6 70

IDADE (leucemização secundária-mediana-min-max) 63 (51-74) 62 (51-74)

SEXO (Fem/masc) 7/1 7/0 0/1

Tempo para transformação (anos)(média±dp) 5,6±3,1 5,4±3,3 7

Tempo para transformação (anos)(mediana-min-max) 4(2-11) 4(2-11)

Duração da leucemia aguda secundária (dias)(média±dp) 82,13±90,3 88,8±95,4 35

Duração da leucemia aguda secundária (dias)(mediana-min-máx) 64 (16-299) 72 (16-99)

Tabela 16 Tabela 4.11: Características clínicas–demográficas dos pacientes com NMP que

progrediram para leucemia aguda (n=8).

leucemização aguda

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DIAGNÓSTICO LEUCEMIZAÇÃO p NEG POS

HEMATÓCRITO (%) 35,7±6,8 24,6±3,9 0,0156 35,8±7,3 34,6

HEMOGLOBINA (g/dL) 11,25±2,1 8,2±1,6 0,0298 11,3±2,2 10,5

LEUCÓCITOS (/mm³) 20400±16300 44400±36041 0,0078 18230±16337 35600

NEUTRÓFILOS (%) 56,3±12,6 29,8±13,2 0,0313 57,0±13,6 52

LINFÓCITO (%) 24,0±1,4 14,4±4,5 0,0313 23,8±1,5 25

MONÓCITO (%) 10,7±13,4 13,8±15,2 0,75 11,7±14,4 5

PLAQUETAS (/mm³) 1070250±637219 240250±151732 0,0078 881000±373422 2395000

BLASTOS (%) 33,5±6,3

JAK2 V617F

Descrição das características clínicas-hematológicas dos pacientes leucemizados

Tabela 17 Tabela 4.12: Parâmetros hematológicos dos pacientes com NMP que progrediram para

leucemia aguda (95% IC, p<0,05, teste de Wilcoxon).

63

Descrição dos eventos adversos durante a fase crônica dos pacientes leucemizados

Leucemia aguda secundária à NMP TOTAL (N-%)

EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 7

EMAGRECIMENTO 1

HEMORRAGIA 2

TROMBOSE 1

PARESTESIA 0

PRURIDO 0

ESPLENOMEGALIA 1

HEPATOMEGALIA 0 Tabela 18 Tabela 4.13: Eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou durante o

acompanhamento (fase crônica) dos pacientes com NMP que progrediram para leucemia aguda.

A procura de um marcador preditivo da progressão leucêmica teve início pela

busca de mutações nos genes IDH1 e IDH2, estas descritas em trabalhos anteriores

(MARDIS et al., 2009; ANDRULIS et al., 2010; GREEN; BEER, 2010;) como

associadas à progressão leucêmica. O estudo em amostras antes e na progressão

leucêmica, para mutações pontuais no éxon 4 dos genes IDH1 e 2, nos 5 pacientes

em questão não revelou positividade para estas mutações. Desta forma a presença

de mutações na região codificante de TET2, outro gene envolvido na regulação

epigenética, foi investigada. A alteração p.Pro363Leu no éxon 3 de TET2 do

paciente #834 foi observada nas duas amostras estudadas (figura 4.17). Após a

consulta em bancos de dados (100genomas, dbSNP, UniProt) relativos a frequência

populacional, esta troca de um único nucleotídeo foi caracterizada como

polimorfismo (tabela 4.14). A presença deste SNV (troca simples de nucleotídeo)

ocorreu no paciente com a menor contagem de plaquetas durante a progressão

leucêmica.

64

JAK2 JAK2 MPL IDH1 IDH2

diagnóstico

leucemização

diagnóstico

leucemização

diagnóstico

leucemização

diagnóstico

leucemização

diagnóstico

leucemizaçãoneg neg neg neg

neg neg neg neg

neg

TET2

Éxon 3 Éxon 9

neg neg neg

neg

neg

719 + neg

negneg negneg

249 neg

neg

neg

neg847 neg neg neg

negneg

883 neg neg

Paciente AmostraJAK2

V617F Éxon 12 Éxon 14

neg

834 neg neg neg

Éxon 10

neg

Éxon 4

neg negp.Pro363

Leu

Éxon 4

neg

Tabela 19 Tabela 4.14: Genes analisados para presença de mutações em amostras pré e no

momento da progressão leucêmica em pacientes com NMP que progrediram para leucemia aguda. Identificação do polimorfismo p.Pro363Leu no éxon 3 de TET2 (+ positivo; neg – negativo).

Figura 19 Figura 4.17: Cromatogramas de sequenciamento do éxon 3 do gene TET2, (A) forma

selvagem (WT), (B e C) presença de SNV em heterozigose em amostras do paciente 834 durante a

fase crônica (B) e de progressão para leucemia aguda secundária (C).

Mediante a complexidade, morosidade e baixa sensibilidade do

sequenciamento direto para análises de genes grandes como o TET2, e pelo grande

número de genes possivelmente envolvidos no processo de progressão leucêmica,

sugeridos na época de elaboração deste trabalho, partimos para a investigação

desta questão, ou seja, a definição de marcadores moleculares preditivos de

transformação, com técnicas genômicas de alta resolução.

65

4.4.1. Análise de hibridização genomica comparativa (aCGH – array

comparative genomic hybridization)

Dos oito pacientes que progrediram para leucemia aguda, cinco pacientes

com diagnóstico de TE possuíam amostras da fase crônica (NMP), e da fase de

progressão leucêmica, e foram analisados pela técnica de aCGH. Destes cinco

pacientes, três apresentaram alterações (amplificações e deleções) na amostra da

progressão leucêmica e por isso também tiveram o DNA da amostra ao diagnóstico

analisado por aCGH. O paciente #883 possuía uma amostra intermediária, 10 meses

após o diagnóstico de NMP e cinco meses anterior ao diagnóstico de leucemia

aguda e desta forma teve também esta amostra analisada.

Os resultados mostraram que 3/5 dos pacientes apresentaram alterações

cromossômicas detectáveis pela técnica de aCGH com chips de alta resolução

(244k). A mediana do tamanho mínimo teórico (resolução) detectável por este chip

são alterações de 19Kb. Como esperado, o número de alterações cromossômicas foi

maior na fase de leucemia aguda do que na fase de NMP, sendo o evento de perda

cromossômica o mais recorrente (figura 4.18 e figura 4.19). A média do número de

alterações/paciente foi de 6,3 (5 - 8) nas amostras na leucemia aguda e de 2,5 (1-

10) ao diagnóstico (figura 4.20 e 4.21 e tabelas 4.16 e 4.17). Nas amostras durante a

progressão leucêmica os pacientes tinham na média 29,3 Mb alterados, 2,3

amplificações/paciente, sendo o tamanho médio das amplificações de 33,3Mb

(mediana de 27,5Mb, variando de 1Mb a 71,5Mb). Dentre as deleções foi observado

uma média de 4 deleções/paciente sendo que o tamanho médio das deleções foi de

27 Mb (mediana de 14,6Mb, variando de 80kb a 92Mb) (figura 4.20 e 4.21 e tabelas

4.16 e 4.17).

Interessantemente, duas alterações (+2p e del(5q)) foram especificas da

leucemia aguda e ambas recorrentes com co-ocorrência em 2/3 pcs (figuras 4.22 e

4.23). Estas alterações não foram identificadas no diagnóstico em nenhum dos

casos, estando inclusive ausente na amostra intermediária do paciente #883 relativa

a 5 meses antes da progressão leucêmica (tabela 4.17). A presença desta alteração

esteve associada a níveis de hemoglobina e hematócrito mais altos, quando

comparados os pacientes positivos para estas alterações com os que não

apresentavam estas duas alterações.

Foi observado que 2/3 pacientes apresentaram alterações desde o

diagnóstico, que foram exclusivas, a cada um deles, ou seja, não se mostraram

66

recorrentes entre eles. A comparação entre as amostras da fase NMP e da

progressão leucêmica mostrou em um paciente, 10 alterações, e no outro, uma

alteração comum entre as duas fases. As alterações observadas eram em sua

maioria do tipo deleção (del), e com um comprimento médio de 2,7Mb (848Kb-

6,4Mb). Somente um ganho de 500Kb foi observado (tabela 4.17 e figura 4.21).

Os outros dois pacientes analisados não apresentaram alterações do número

de cópias nas amostras de progressão leucêmica e por isso não tiveram a amostra

ao diagnóstico investigada.

Figura 20 Figura 4.18: Gráfico mostra o número de alterações total por paciente, obtido por aCGH, em

amostras da progressão leucêmica e da fase crônica (NMP) da doença. NMP- amostra da fase de NMP; LA- amostra da fase de leucemia aguda.

Figura 21 Figura 4.19: Gráfico mostra o número e tipo de alteração (ganho ou perda) encontrada na

fase de leucemia aguda dos pacientes estudados por aCGH.

67

Figura 22 Figura 4.20: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de crônica das amostras

estudadas. Chr-cromossomo; CNV – copy number variation

Figura 23 Figura 4.21: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de leucemia aguda (LA) das

amostras estudadas. Notar que as alterações do cromossoma 2 e 5 estão localizadas na mesma região e são recorrentes. Chr-cromossomo; CNV – copy number variation

68

Figura 24 Figura 4.22: Resultado de aCGH mostrando as alterações observadas no cromossoma 2

dos 3 pacientes com rearranjos cromossômicos. Cada cor de linha representa um paciente: azul – paciente #883; lilás – paciente #249; vermelho – paciente #719. No eixo das abcissas, temos a representação do cromossoma 2, sendo à esquerda o braço curto e à direita o braço longo. No eixo das ordenadas temos o valor de log2 da razão entre o número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência

Figura 25 Figura 4.23: Resultado de aCGH mostrando as alterações observadas no cromossoma 5

dos 3 pacientes com rearranjos cromossômicos. Cada cor de linha representa um paciente: azul – paciente 883; lilás – paciente 249; vermelho – paciente 719. No eixo das abcissas, temos a representação do cromossoma 5, sendo à esquerda o braço curto e à direita o braço longo. No eixo das ordenadas temos o valor de log2 da razão entre o número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência

69

paciente #883

cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)

chr2 p25.3 - p13.3 ganho 71,46132

chr5 q23.3 - q35.3 perda 53,123196

chr7 q32.3 perda 0,160687

chr10 p15.1 - p14 perda 7,063712

chr12 q24.31 perda 0,090047

chr17 q25.1 - q25.3 perda 9,846114

paciente #249


chr2 p25.3 - p25.1 perda 9,881828

chr9 p21.3 - p11.2 perda 19,422864

chr9 q13 - q34.3 perda 69,912548

chr18 q12.1 perda 0,085504

chr18 q12.3 - q23 perda 36,338132

paciente #719


chr2 p25.3 - p16.1 ganho 55,610263

chr3 q23 - q29 ganho 56,230282

chr5 q14.3 - q35.3 perda 92,121742

chr6 p25.3 - p22.1 perda 26,713382

chr6 p22.1 - p12.1 ganho 27,558361

chr8 q23.2 - q23.3 ganho 1,065098

chr8 q24.13 - q24.3 ganho 19,67531

chr17 p13.3 ganho 1,3239 Tabela 20 Tabela 4.15: anormalidades exclusivas da progressão leucêmica observadas pela técnica

de aCGH

70

paciente #883


chr1 p36.31 - p36.23 perda 2,000608

chr1 p32.3 perda 1,000292

chr3 p25.1 - p24.3 perda 6,155235

chr3 p22.2 perda 0,848593

chr3 p21.31 perda 3,95882

chr3 q21.3 - q22.1 perda 2,186143

chr7 q22.1 perda 2,003467

chr13 q12.12 ganho 0,49895

chr17 p13.3 - p13.1 perda 6,400794

chr17 q11.2 perda 1,807016

paciente #249


chr12 q24.31 perda 1,080697

paciente #719


ausência de alterações comuns Tabela 21 Tabela 4.16: Anormalidades presentes na amostra ao diagnóstico de MPN e que

permaneceram na leucemia aguda observadas pela técnica de aCGH.

Nas amostras da fase de leucemia aguda secundária foram observadas

alterações na via JAK-STAT como a perda monoalélica de SOCS3 (região 17q25.1 -

q25.3), que é um regulador negativo da via, no paciente #883 e ganho no gene da

trombopoetina (região 4q23 - q29), THPO, no paciente #719. Foram observadas

deleções em diversos cromossomas afetando genes de regulação epigenética do

complexo polycomb2 e em proteínas que participam ou interagem com o complexo

SET: PHF1, PHF19, JARID2, SETD1B, WDR5, CXXC1, associados à repressão da

transcrição.

Dos genes alterados desde o diagnóstico de NMP, podemos destacar a perda

monoalélica de eritropoietina (EPO) (região7q22.1), SUZ12 (17q11.2), TP53,

POLR2A (17p13.3 - p13.1) e SETD1B (12 q24.31).

A análise de processos biológicos dos genes das regiões comumente

alteradas na fase de leucemia aguda secundária mostrou que no cromossomo 5q há

71

9 genes deletados envolvidos na via de JAK-STAT (CSF2, TSLP, IL3, IL4, IL5, IL9,

IL13, IL12B, SPRY4) e 4 desses genes também envolvidos na via de diferenciação

hematopoética (CSF2, IL3, IL4, IL5). No cromossoma 2 foi observado o ganho em

genes de regulação epigenética (DNMT3A, ASXL2 e DPY30) e de reparo de

mismatch (MSH2).

4.4.2. Sequenciamento do exoma completo (WES - Whole exome

sequencing)

Pela a técnica de WES foram analisadas seis amostras (NMP e leucemia

aguda) dos três pacientes que apresentaram alterações cromossômicas na fase de

leucemia aguda pela técnica de aCGH. Neste momento, foram analisados três

pacientes com diagnóstico inicial de TE (um JAK2 V617F e dois negativos para esta

mutação). Após o alinhamento das leituras de 100 pb de cada paciente, o exoma

sequenciado foi alinhado contra o genoma humano, versão hg19, do qual obtivemos

os seguintes resultados:

O WES teve em média: 71 milhões de regiões exônicas de 100pb mapeadas;

cobertura de 99,6x por nucleotídeo; qualidade de 80% das regiões-alvo

seqüenciadas; 7% de regiões duplicadas. Foram observadas em média 199

mutações exônicas somáticas não sinônimas / paciente (144 mutações pontuais e

55 INDELS).

Foram observadas em média 10752 variações não sinônimas, sendo 924

ainda não reportadas em bancos de dados (dbSNP, HAPMAP, 1000 genomas etc) e

12057 variações sinônimas, sendo 844 não reportadas. A razão entre mutações não

sinônimas/ sinônimas foi em média de 0,89. Após a triagem dos dados, com

enriquecimento das variações somáticas (após exclusão das SNV reportadas em

banco de dados), observamos uma taxa de variações não sinônimas/ sinônimas de

1,8, 2,3 e 1,6 para os pacientes 883, 249 e 834, respectivamente. A taxa de

transições/transversões foi de 2,4 e de 2,2 para as variações únicas de nucleotídeos

conhecidos (já reportados em banco de dados) e novos, respectivamente.

Dentre as mutações já sabidamente associadas às NMP encontramos JAK2 e

CALR. O paciente 719 apresentou JAK2 V617F e o paciente 883 apresentou CALR.

O resultado de JAK2 por WES confirmou os dados que já tínhamos do PCR alelo

específico (qualitativo) e do quantitativo (PCR-C). A carga alélica de JAK2 por WES

foi de 40% e de 52%, com uma taxa de cobertura de 77 e 27 leituras (reads), no

diagnóstico e na fase de leucemia aguda, respectivamente. Por PCR-C a carga

72

alélica estimada foi de 37% e 66%. A mutação em CALR encontrada foi a

p.K385fs*47, que é a mais frequente em TE. A frequência da carga alélica de CALR

por WES neste paciente mostrou variação de 44% para 29%, com 16 e 48x

cobertura, para a amostra de NMP e da leucemia aguda, respectivamente.

Mutações em alguns genes tais como TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, DNMT3A já

foram associados à NMP, principalmente à progressão leucêmica. Desta forma, já

havíamos escolhido os éxons acometidos com maior frequência por mutações (hot

spots) dos genes TET2, IDH1 e IDH2 para a busca de mutações, através de

sequenciamento direto utilizando o método de Sanger. Como discutido, quando

analisados por sequenciamento direto, não foram observadas mutações exônicas

nestes genes. O sequenciamento por WES confirmou e ampliou estes resultados,

mostrando ausência de mutações nos éxons analisados por sequenciamento direto

e nos outros éxons cobertos pelo WES, dos genes previamente estudados (TET2,

IDH1 e IDH2) e também nos genes ASXL1 e DNMT3A.

Entretanto, mutações nas diferentes isoformas dos genes TET3, ASXL2,

DNMT3B foram observadas.

Um gene recorrentemente mutado em 2/3 pacientes foi o TP53, no paciente

719, JAK2V617F positivo, que apresentou duas mutações em TP53, p.Tyr236Asp e

p.Arg267Trp, e o paciente 249 que apresentou a alteração p.Ser106fs (deleção de

1pb). A mutação p.Tyr236Asp é descrita no COSMIC (Catalog of Somatic Mutations

in Cancer) em 2/7 pacientes com neoplasias linfoides (B e T) e a mutação

p.Arg267Trp descrita em 1/30 amostras de leucemia linfoide aguda (LLA-B). Para a

posição 106, estão descritas somente quatro tipos de mutações, tendo sido

encontrada somente uma descrição com o mesmo tipo de mutação que

encontramos, e esta associada a câncer de esôfago.

Com relação à categoria de genes associados ao spliceossoma, encontramos

mutações no gene SF3B1 e nas isoformas de outros genes desta categoria, já

descritos em SMD e NMP, tais como os genes U2AF1L4 e SRSF3. Mutações em

SF3B1 foram descritas como fortemente associadas à presença de sideroblastos em

anel nos subtipos de SMD, ARSA (85%) e ARSA-t (87%). Nós encontramos a

mutação descrita como de maior frequência, p.Lys700Glu, no paciente #249. Ao

diagnóstico, este paciente apresentava trombocitose (plaquetas >450mil/mm³) e

anemia (hemoglobina < 12g/dL). A presença de sideroblastos em anel não pode ser

verificada porque a coloração de Perls na BMO não funcionou, muito provavelmente

73

devido ao efeito deletério do ácido no processo de descalcificação e o mielograma

do paciente não estava acessível para análise. De fato, a recomendação para

realização da técnica para evidenciar sideroblastos em anel é no material de

mielograma para que sejam evitados problemas, do tipo que nos deparamos,

decorrentes do pré-analíticos.

Com relação à descoberta de novas mutações que possam estar implicadas

na progressão da fase crônica de uma NMP para leucemia aguda, foram observadas

uma média de 16 mutações exônicas/paciente (13 SNV e 3 INDELS), que possuem

pelo menos 1,5X de aumento na amostra leucêmica, quando comparada à amostra

ao do diagnóstico de NMP. Se ampliarmos a análise para todos os clones que

aumentaram na progressão leucêmica, observamos uma média de 85 mutações

exônicas/paciente (69 SNV e 16 INDELS) e 13 mutações que foram estáveis entre o

diagnóstico e a progressão leucêmica (12 SNV e 1 INDEL).

A análise da evolução clonal mostrou que há dois clones que permanecem

em equilíbrio (frequência alélica estável), mesmo após a leucemogênese (figura

4.24). O clone dominante está presente em cerca de 70% do tumor e apresenta

mutações diretoras encontradas nas NMP associadas a mutações em JAK2, a

clássica V617F, e uma nova (p.Arg1063Cys) localizada no domínio cinase e

revelada pela primeira vez neste trabalho (figura 4.25). O outro clone ocupa o

restante dos 30% do tumor e carrega as mutações subclonais associadas a

leucemia aguda (figura 4.24). Neste clone temos um subclone que regride de

tamanho na leucemia aguda e que carrega a mutação em CALR, outro que se

prolifera e que apresenta mutações em TP53, MDM4 e MAPK15 (figura 4.25). O

paciente #719 apresenta uma evolução clonal convergente, pois na amostra ao

diagnóstico ele já apresentava uma mutação pontual em TP53 em 66% do tumor

que regrediu na progressão leucêmica, entretanto o outro subclone adquiriu uma

nova mutação em TP53.

74

Figura 26 Figura 4.24: Análise de clonalidade nos pacientes analisados por WES. A análise individual

dos pacientes mostrou o mesmo padrão clonal em todos eles, com um clone majoritário ocupando 70% do tumor e um clone minoritário ocupando o restante do tumor. Os clones também se apresentaram em equilíbrio ao longo da progressão da doença da fase crônica para fase aguda.

75

Figura 27 Figura 4.25: Análise individual da frequência alélica dos genes associados às NMP ao longo

da progressão da doença da fase crônica para fase aguda. Notar que as mutações presentes no clone majoritário são as mutações classicamente associadas às NMP. Na fase aguda, observamos dois pacientes com mutações em TP53 que são específicas desta fase. No paciente JAK2V617F, observamos uma mutação em TP53 desde a fase de NMP, mas o clone que contém esta mutação tem uma perda proliferativa na fase aguda. O paciente com ins 5pb em CALR não apresentou mutação em TP53.

76

Avaliando a possibilidade de existirem recorrências de genes mutados nos

três pacientes analisados, observamos que 28 genes apresentavam-se nesta

condição, sendo que 16 deles possuíam mutações exclusivas, que algumas vezes

apresentava-se como indel em um paciente e como SNV em outro; os outros 12

genes possuíam o mesmo tipo de mutação entre os pacientes. Apesar de termos

excluído as variantes reportadas em bancos de dados de SNPs e termos

confrontado nossos dados com 25 controles, a possibilidade de serem SNPs não

pode ser refutada, uma vez que não foi utilizado nenhum tecido não tumoral do

mesmo paciente para exclusão das variantes germinativas.

A análise de ontologia de genes baseando-se nos dados de anotações

funcionais mostrou que as mutações somáticas encontradas remetem para vias de

transcrição, regulação da transcrição e regulação do processo metabólico do RNA

(108 genes estão na via de RNA / 295 genes com mutações somáticas = 36%). A

análise somente com os genes associados ao mecanismo de progressão leucêmica

mostrou um agrupamento e recorrência de genes envolvidos na via de regulação da

transcrição e regulação de RNA. Estes genes eram praticamente todos pertencentes

à família dedo de zinco.

A figura 4.26 mostra um resumo integrativo dos resultados de aCGH e WES

dos três pacientes que progrediram para leucemia aguda.

Figura 28 Figura 4.26: Resumo dos resultados de análise genômica utilizando as técnicas de aCGH e

WES nos três pacientes com diagnóstico inicial de TE que progrediram para leucemia aguda. Em cada círculo estão representados os genes alterados que já possuem alguma associação com NMP. As interseções representam os achados recorrentes. O paciente 719 possui duas mutações pontuais em TP53 e o paciente 249 apresentou um indel em TP53 que ocasionou mudança na fase de leitura. Na amplificação do 2p e no círculo menor denominado del17 estão representados os genes situados na região alterada (número de cópias) que possuem associação previamente descrita com NMP.

77

4.4.3. Validação de alguns genes do WES numa coorte JAK2 negativa

Para validar alguns de nossos achados, escolhemos dentro do subgrupo de

estudo HUPE-HUAP os pacientes JAK2V617F negativos, com diagnóstico inicial de

TE, MF, NMP-U e SMD para validação dos resultados. Optamos para validação a

inclusão dos seguintes genes e éxons: CALR (éxon9), SF3B1 (éxons 14 e 15), TP53

(éxon 2 a 8) e MAPK15/ERK8 (éxon 11 e 12).

Para CALR estudamos 66 pacientes JAK2V617F negativos e os resultados

mostraram que 46% dos pacientes possuem alterações do tipo INDEL em CALR e

54% possuem o alelo na sua versão selvagem (figura 4.27).

Figura 29 Figura 4.27: Distribuição das mutações em CALR em um subgrupo de pacientes

JAK2V617F negativos proveniente de 2 centros (HUPE e HUAP). wt- wild type (selvagem).

Nesta validação inicial conseguimos cobrir, do total de pacientes JAK2V617F

negativos, 70% das TE, 35% das MF, 88% das NMP-U e 44% das SMD presentes

em nosso subgrupo de estudo HUPE-HUAP com 332 pacientes.

Em TE observamos que 62% dos pacientes JAK2V617F negativos

apresentaram indels em CALR, sendo a inserção de 5pb (p.K385fs*47) a mais

frequente. Em MF, observamos indels em CALR em 67% dos pacientes, que neste

caso apresentou deleção de 52pb (p.L367fs*46) como a mais frequente. Nos casos

de NMP-U observamos somente 23% dos pacientes portadores de indels, sendo

neste caso a mais recorrente a inserção de 5pb. Em SMD não conseguimos detectar

indels em CALR (figura 4.28).

78

Figura 30 Figura 4.28: Distribuição das mutações em CALR de acordo com as categorias clínicas

analisadas. Em TE, a ins5pb e a del52pb estão presentes em 41% e em 21% dos pacientes, respectivamente. Em MF, a ins5pb e a del52pb estão presentes em 17% e 50% dos pacientes. Em NMP-U observamos 18% e 5% das mutações sendo ins5pb e del34pb, respectivamente. TE-trombocitemia essencial; MF – mielofibrose; NMP-U – neoplasia mieloproliferativa crônica não classificável; SMD – síndrome mielodisplásica; wt – wild type (selvagem).

Adicionalmente foram avaliados quatro pacientes JAK2V617F positivos que

serviram como controles negativos para mutações no éxon 9 de CALR. Os

resultados destes quatro pacientes confirmaram os achados de outros grupos

publicados previamente em que as mutações em JAK2V617F e CALR são

excludentes. Esses quatro pacientes testados possuem o diagnóstico de TE e MF.

O segundo gene testado foi SF3B1, que está mutado em 86% dos casos de

ARSA e ARSA-t e somente 2% dos casos de TE e MF. Os éxons 14 e 15 deste gene

foram avaliados em 51 pacientes, todos apresentando a versão selvagem do alelo.

Alterações no gene TP53 têm alta prevalência no câncer, e também na

leucemia mielóide aguda secundária. É de se notar que, na comparação dos genes

candidatos encontrados neste trabalho, associados a progressão para leucemia

aguda, com os genes encontrados em outros trabalhos que utilizaram técnicas de

sequenciamento massivo paralelo em NMP, este foi o único gene recorrente. Nesta

parte do trabalho quando analisamos os éxons 2 a 8, por sequenciamento direto,

observamos 3/45 (7%) pacientes portadores de mutações em TP53. As mutações

encontradas foram: p.Trp146*, p.Cys242Gly, p.Arg273Cys. Na posição 242

encontramos a mutação p.Cys242Gly reportada previamente, no COSMIC, em

casos de neoplasias hematológicas de origem linfóide e em cânceres de origem não

79

hematológica. O paciente da nossa coorte, portador deste tipo de mutação,

apresentava o diagnostico de TE. A mutação p.Arg273Cys também foi observada

em um paciente com diagnóstico de TE, e este tipo de mutação tem sido

classicamente associada a Síndrome de Li Fraumeni. No banco de dados COSMIC,

a mutação p.Arg273Cys tem 477 ocorrências, sendo 23 relatadas em tecidos

hematopoéticos. Há 40 descrições da mutação p.Trp146* (c.437G>A) no COSMIC,

sendo que 5 dessas mutações foram observadas em amostras de tecido

hematopoético. Neste trabalho, o paciente portador desta mutação foi diagnosticado

com MF.

Para os éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8 triamos 49 pacientes, sendo que 40

(82%) deles portavam o alelo selvagem e 9 (18%) o alelo variante (p.Pro358Leu,

p.Gly385Asp, p.Ala373Pro, p.Leu424Pro). Dos que portavam o alelo selvagem em

MAPK15, 17 possuíam indels em CALR e dois apresentaram mutação em MPL. Dos

pacientes que apresentaram variações em MAPK15 (p.Pro358Leu, p.Gly385Asp), 5

possuíam indels em CALR (p.L367fs*46, p.K368fs*51, p.K385fs*47). As variações

encontradas em MAPK15, em geral foram muito recorrentes, sugerindo tratarem- se

de polimorfismos. A variação mais frequente neste gene a p.Pro358Leu, possui uma

frequência de 5% reportada no projeto 1000genomas, e foi encontrada em 4/49

(8%) dos pacientes (3 TE e 1 MF) deste estudo. A variação p.Gly385Asp foi

observada em 2/49 (4%) pacientes (1 TE e 1 NMP-U) e é reportada no banco de

dados 1000genomas em frequência de 1% dos indivíduos. A variação p.Ala373Pro

foi observada em 1/49 (2%) pacientes e no 1000 genomas em 5% das 1088 pessoas

estudadas. A variação p.Leu424Pro foi observada em 1/49 pacientes (NMP-U) neste

estudo e com frequência de 3% no 1000genomas, sugerindo que esta variação

também seja um polimorfismo. Esta variação também foi observada no paciente

#249 no estudo de WES. No início desse estudo, os dados do 1000genomas ainda

não estavam disponíveis para consulta.

Os três pacientes com mutações em MPL não apresentaram mutações

adicionais em nenhum dos éxons dos genes estudados.

80

5. Discussão

5.1. JAK2

A análise da frequência da mutação V617F em JAK2 e da sua carga alélica

frente ao tratamento, bem como a descoberta de biomarcadores que possam servir

como marcador de diagnóstico e monitoramento da resposta terapêutica em NMP

têm sido alvo de estudo durante anos. De forma semelhante, nosso estudo visou

comparar a nossa coorte com os resultados já descritos na literatura e aprofundar o

estudo em alguns aspectos ainda não completamente elucidados, como a

investigação sobre alguns dos mecanismos responsáveis pela progressão da fase

crônica para a fase aguda (leucemia) em NMP.

Dessa forma, este trabalho implementou e aprimorou no laboratório algumas

das metodologias de diagnóstico em NMP e estabeleceu alguns exames que não

estavam disponíveis anteriormente a este trabalho. Como exemplo, temos os

ensaios de detecção de mutações em MPL, éxon 12 e 14 de JAK2, CALR, IDH1/2,

TET2, em que alguns deles já estão incluídos na rotina diagnóstica. A quantificação

da carga alélica de JAK2V617F foi aprimorada e validada por outras metodologias e

permitiu a análise da flutuação da carga alélica frente ao tratamento com hidroxiureia

durante o acompanhamento de pacientes JAK2V617F, que culminou em dois

trabalhos de colaboração. O estudo da progressão leucêmica usando tecnologias

genômicas de alta resolução é pioneiro e trouxe novas informações sobre o

entendimento da heterogeneidade clonal em NMP.

A avaliação da frequência de JAK2 na coorte de estudo mostrou resultados

semelhantes à literatura, em que a frequência da mutação JAK2V617F em PV é

acima de 95%, em TE cerca de 50% e em MF por volta de 60%. Em nosso subgrupo

de estudo, tivemos em PV 92% dos pacientes portando a mutação JAK2V617F, em

TE 46% e em MF 48%. Na literatura, para PV, é demonstrado que praticamente

todos os pacientes possuem mutações em JAK2, seja no éxon 12 ou 14. Em nosso

subgrupo não encontramos pacientes portadores de mutações em JAK2 que não

fossem a p.Val617Phe. Nestes casos, além de uma revisão criteriosa da biópsia de

medula óssea, também é recomendada a dosagem de eritropoietina (TEFFERI,

2013a). Entretanto, este exame laboratorial raramente é realizado nos hospitais que

nos enviaram as amostras e por isso vários pacientes não possuem este dado

laboratorial em seus prontuários. Além disso, utilizamos o sequenciamento direto

81

pelo método de Sanger modificado para detecção das mutações no éxon 12 de

JAK2. Dessa forma, é possível que a sensibilidade do ensaio por nós realizado não

seja suficiente para detectar mutações no éxon 12 em todos os pacientes. Relatos

na literatura mostraram uma maior prevalência de mutações no éxon 12 de JAK2

quando o ensaio é realizado especificamente no DNA extraído da linhagem

eritrocítica e por isso a extração de DNA de colônias eritróides seria mais

recomendado do que a utilização de granulócitos (CAZZOLA, 2007).

Através da dosagem da carga alélica de JAK2V617F foram evidenciadas

algumas associações descritas na literatura, tais como: a) maior homozigosidade em

PV; b) cargas alélicas abaixo de 50% em TE; c) PV é mais frequente em homens e

TE em mulheres; d) os pacientes com carga alélica mais alta possuem maior

tendência a apresentar eventos trombóticos; e) os pacientes com TE e com carga

alélica mais alta (>50%) geralmente apresentam níveis de hematócrito,

hemoglobina, leucócitos e neutrófilos mais altos e número de plaquetas mais baixo

do que os pacientes que apresentam o alelo em heterozigose (CAMPBELL et al.,

2005; CAMPBELL, 2006; BAROSI et al., 2007b; VANNUCCHI et al., 2007c;

ANTONIOLI et al., 2008;).

Em vista desses dados, foi possível comparar nosso subgrupo de estudo com

alguns já descritos na literatura. Em geral, os nossos resultados estão em

conformidade com os descritos na literatura. Por exemplo, observamos que a

maioria dos pacientes com PV apresentou carga alélica da mutação V617F acima

dos 50% e hematócrito mais alto em relação aos pacientes com carga alélica abaixo

dos 50%. O número de plaquetas costuma ser mais baixo nos pacientes com PV

com carga alélica acima de 50% do que aqueles com carga alélica abaixo dos 50%.

Nesse sentido, nosso resultado foi controverso, mas há relatos na literatura de que

pacientes com PV podem cursar com trombocitose e ter um maior risco de eventos

trombóticos (OHYASHIKI et al., 2007). De fato, os eventos trombóticos foram o

segundo evento adverso mais frequente em PV. Desta forma, estes dados podem

sugerir que tenhamos um subgrupo de pacientes que cursam com trombocitose,

sendo interessante estendermos as nossas análises. Outro dado em contradição

com a literatura foi a observação da PV sendo mais frequente em mulheres do que

em homens.

Em TE observamos um maior número de pacientes com carga alélica da

mutação abaixo dos 50%, e em nossa coorte os pacientes mais velhos

82

apresentaram carga alélica mais alta. Além disso, a TE também se apresentou mais

frequente em mulheres do que em homens, reforçando os dados publicados

previamente por outros grupos (ANTONIOLI et al., 2005, 2008; CAMPBELL et al.,

2005).

Com relação à flutuação da carga alélica ao longo do acompanhamento,

nossos resultados foram semelhantes à literatura com relação a uma maior

diminuição da carga alélica na primeira administração da hidroxiureia após o

diagnóstico. Já a manutenção da hidroxiureia ao longo do tratamento resultou em

variações mais sutis da carga alélica. Nosso grupo foi o primeiro a demonstrar que

as maiores variações parecem estar nos pacientes com carga alélica entre o 2º e 3°

quartis (ZALCBERG et al., 2011).

A frequência de mutações em MPL na nossa coorte também foi semelhante à

literatura, com frequência de 7% em TE.

5.2. CALR

Em dezembro de 2013 foi descrito pela primeira vez, que pacientes

JAK2V617F negativos podem apresentar Indels na CALR em cerca de 67-82% dos

pacientes com TE, 80-88% dos pacientes com MF e 12,5% em ARSA-t (KLAMPFL

et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a) o que demonstra a importância que a

detecção molecular destas alterações terão no auxílio ao diagnóstico das NMP. Este

novo marcador recentemente descrito nos levou a avaliar em nossa coorte

JAK2V617F negativa a frequência dessas alterações, para que pudéssemos

correlacionar o seu impacto no prognóstico e na caracterização genética desses

pacientes.

A nossa análise inicial no subgrupo de estudo mostrou a inserção de 5pb

(p.K385fs*47) em 62% das TE, e a deleção de 52pb (p.L367fs*46) em 67% das MF,

o que foi semelhante aos resultados relatados nos estudos que descreveram este

novo marcador (KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013b). Neste subgrupo de

validação, resolvemos avaliar as NMP-U por ser um grupo de difícil diagnóstico e no

qual a caracterização da mutação poderá ajudar na decisão clínica quanto ao

diagnóstico final. Assim, foi possível observar que 23% dos casos de NMP-U eram

portadores de indels em CALR, sendo a inserção de 5pb a mais recorrente. Este

dado será importante numa possível correlação desta mutação com o fenótipo

destes pacientes, principalmente naquelas entidades clínicas que apresentam a

trombocitose como manifestação clínica, tais como a TE, a MFS à TE, e a ARSA-t.

83

Por exemplo, em um dos pacientes com NMP-U detectamos a presença de uma

deleção de 34pb (p.K368fs*51) que foi observada anteriormente em casos de TE e

MF primária (NANGALIA et al., 2013a) mostrando, dessa forma, a importância do

rastreamento molecular de mutações para o direcionamento do diagnóstico clínico.

Apesar da literatura relatar uma baixa frequência de indels em CALR em

SMD, em nossa pesquisa inicial não detectamos indels em CALR.

Um fato curioso são os baixos relatos de INDELS em CALR em pacientes

com progressão da doença tanto para MFS quanto para LA (KLAMPFL et al., 2013),

diferentemente do que observamos em nossa coorte na qual tivemos um paciente

com TE que progrediu para LA. A identificação de mutações em genes na LA com

frequência superior à fase crônica sugere a relação desses genes com o processo

de progressão leucêmica. Desta forma, a análise adicional desses genes deve ser

realizada para avaliar a importância destes como marcadores prognósticos.

Do ponto de vista celular, a calreticulina é uma proteína imunogênica

fortemente associada a sinais de apoptose da célula neoplásica, induzindo a

fagocitose mediada por células dendríticas (GARDAI et al., 2005; TESNIERE et al.,

2007; ZITVOGEL et al., 2008; KEPP et al., 2009; CHAO et al., 2010). Entretanto, os

resultados dos estudos funcionais com células COS-7 transfectadas com a proteína

CALR mutante mostraram que a CALR permanece no RE (NANGALIA et al., 2013a).

Células tumorais tratadas com antraciclinas ou radiação induzem a expressão de

CALR na superfície, como sinal de morte. Seria interessante observar se a proteína

mutada possui esta função preservada após o tratamento com antracilinas, o que

poderia torná-la um alvo terapêutico.

A deleção do domínio KDEL em 21 proteínas de localização no RE resultou

na secreção/ exposição na superfície de somente três destas, demonstrando que

outros mecanismos são necessários para causar distúrbios na localização celular de

proteínas que apresentam este peptídeo de localização. Proteínas como CALR e

CALR3 podem formar complexos que fazem com que elas permaneçam no RE,

mesmo com a perda do domínio KDEL c-terminal. A deleção do domínio KDEL em

CALR3 não afetou a localização no RE, indicando que este domínio não é

determinante para o sinal de localização desta proteína (RAYKHEL et al., 2007). O

paciente que apresentou a inserção de 5pb também apresentou uma mutação

pontual em CALR3. Investigar o efeito da interação entre essas duas proteínas

84

mutantes pode ser interessante na busca de um entendimento mais profundo da

biologia da doença.

Estudos in vitro com células Ba/F3 transduzidas com a mutação mais

frequente de CALR (del 52pb), mostraram ativação de STAT5 e crescimento

independente de IL3 (KLAMPFL et al., 2013). Estes resultados mostram que a via

JAK2-STAT5, que sabidamente está ativada nos pacientes JAK2V617F positivos,

parece ser uma via de ativação comum dos pacientes com NMP independente da

mutação encontrada (LAUBACH et al., 2009; OKU et al., 2010).

5.3. Progressão leucêmica

As progressões de NMPs para as leucemias são eventos raros e ocorrem em

cerca de 5-7% dos casos (ABDULKARIM et al., 2009). A evolução mais comum é

uma transição de TE e PV para MF secundária e, a partir da MF, a evolução para

leucemia aguda. Semelhante aos dados descritos na literatura, observamos em

nosso grupo de estudo uma frequência de progressão para LA de 7%.

Há relatos na literatura sobre a presença de anormalidades citogenéticas na

fase de NMP, sendo detectada de 5-15% em TE, 15-35% em PV e 44-50% em MF

(TEFFERI et al., 2001; STEENSMA; TEFFERI, 2002; GANGAT et al., 2008, 2009;

TEFFERI et al., 2009). Em nosso estudo, foi observada uma maior complexidade

citogenética na fase de leucemia aguda, com um aumento do número e da

amplitude das anormalidades, o que demonstra a severidade da progressão

leucêmica. Vale ressaltar que um dos pacientes apresentou, desde a amostra ao

diagnóstico, muitas alterações em diversos cromossomos, e mesmo na fase de

leucemia aguda este paciente apresentou aumento das regiões alteradas, com

aquisição da +2p e del5q. O número de regiões alteradas não superou o número de

anormalidades cromossômicas ao diagnóstico, mas o tamanho das novas alterações

adquiridas foi, em geral, maior.

Diferentemente dos casos já descritos na literatura, não observamos

mutações no éxon 4 dos genes IDH1 e 2, já amplamente associadas à leucemia

aguda, e também não observamos as alterações citogenéticas recorrentes tais como

del(20q), del(13q), que possuem prognóstico mais favorável (DINGLI et al., 2006),

+8, +9, e anormalidades nos cromossomas 1 e 7 (BENCH et al., 1998; NAJFELD et

al., 2002).

Encontramos recorrência nas alterações de +2p e del5q. A +2p possui raras

descrições prévias na literatura (BRECQUEVILLE et al., 2013; GANGAT et al.,

85

2009), mas a del 5q é bastante recorrente (SANTANA-DAVILA et al., 2008a, 2008b;

GANGAT et al., 2009; THOENNISSEN et al., 2010; MILOSEVIC et al., 2012;

BRECQUEVILLE et al., 2013), principalmente na SMD, onde constitui uma entidade

clínica distinta e de bom prognóstico (GIAGOUNIDIS et al., 2004; LEHMANN et al.,

2007; EBERT, 2009;).

As características da síndrome do 5q, como a doença é conhecida, são

anemia macrocítica, número de plaquetas normal ou elevado, micromegacariócitos

hipolobados, contagem de neutrófilos normal ou discretamente diminuída, e um

baixo índice de progressão para leucemia aguda (GIAGOUNIDIS et al., 2004;

EBERT, 2009, 2011;). A região comum minimamente deletada do 5q possui mais de

40 genes, com vários genes supressores de tumor inclusos. Nesta região há duas

deleções mais comuns, uma mais proximal e outra mais distal. A proximal está na

região q31 e inclui genes como EGFR1 e a distal, q33, onde estão genes como

RPS14, que causa o bloqueio da diferenciação eritróide e, como consequência, o

desenvolvimento de anemia macrocítica. O gene RPS14 codifica a subunidade

ribossomal 40S (EBERT et al., 2008).

Outro alvo importante desta região são os microRNAs, miR145 e miR146a,

que, após o knockdown, foram apontados como responsáveis pelo fenótipo de

megacariócitos hipolobados e trombocitose periférica em camundongos. Em

humanos foi observada a baixa expressão desses dois miRNAs em pacientes com

SMD (STARCZYNOWSKI et al., 2009). Os pacientes que analisamos apresentaram

anemia durante a progressão leucêmica, mas não podemos afirmar que era

macrocítica por falta de uma descrição detalhada do hemograma. A BMO dos

pacientes ressalta o aumento de megacariócitos, mas não descreve com maior

riqueza de detalhes a morfologia dessas células. Outro fato interessante é o próprio

prognóstico dos pacientes que apresentaram a del5q na progressão leucêmica. Na

SMD, a del 5q é tida como fator de bom prognóstico e de menor risco de progressão

para leucemia aguda. Nesta síndrome, no entanto, a del5q é encontrada isolada,

fato que não observamos em nossos pacientes. A presença de outras alterações

cromossômicas junto com a del5q parece modificar o prognóstico e o fenótipo da

doença, que neste caso se mostra muito mais agressiva.

A análise de agrupamento de genes na região deletada do cromossoma 5q

mostrou 9 genes deletados envolvidos na via de JAK-STAT (IL4, CSF2, TSLP, IL3,

IL5, IL9, IL13, IL12B, SPRY4) e 4 desses genes também envolvidos na fisiologia

86

hematopoética (CSF2, IL3, IL4, IL5). Alguns estudos apontam o papel que a

modulação de citocinas em tumores sólidos pode desempenhar no recrutamento de

linfócitos, gerando um microambiente tumoral que pode ser importante no controle

da proliferação tumoral (FINN, 2008). No caso de tumores líquidos como as NMP,

essa modulação pode estar ocorrendo diretamente no plasma, gerando um efeito

sistêmico ou ainda no microambiente da medula óssea. A variação no número de

cópias dos genes de citocinas e de receptores de citocinas em câncer colorretal

mostrou que a diminuição de expressão de IL15 e de genes de citocinas agrupados

no cromossoma 4 modula a quantidade de linfócitos T e B infiltrantes e, como

conseqüência, há uma maior proliferação tumoral e maior risco de recorrência e

metástase (MLECNIK et al., 2014). O impacto das deleções que descrevemos neste

trabalho ainda devem ser avaliadas sob o ponto de vista tanto da função na

maturação da célula mutada, quanto nas interações com outras populações

celulares.

Vários genes de citocinas estão localizados nos cromossomas 1, 5 e 9 e já é

sabida a existência de vários pacientes com NMP com alteração do número de

cópias nos cromossomas 5 e 9. Desta forma, estes resultados sugerem um papel

potencial das citocinas nestas doenças, aspecto ainda pouco explorado. De fato, o

tratamento de pacientes refratários ao uso de hidroxiureia com interferon alfa tem-se

mostrado eficaz (HASSELBALCH et al., 2014). Os dados do tratamento de pacientes

com ruxolitinib, que inibe JAK1 e JAK2, mostrou a diminuição do nível sérico de

várias citocinas pró-inflamatórias tais como a proteína C reativa (VERSTOVSEK et

al., 2010).

A região amplificada do cromossoma 2p nos pacientes analisados mostrou

ganho em genes da maquinaria de controle epigenético, tais como DNMT3A,

ASXL2, DPY30, o que pode representar um aumento no padrão de metilação global

do DNA caso esses genes estejam funcionando de forma exacerbada devido a uma

desregulação estequiométrica. De fato, mutações em genes da maquinaria

epigenética já foram associados à fase crônica de NMP (VANNUCCHI; BIAMONTE,

2011) e com frequência aumentada na fase aguda ou blástica (TEFFERI; NOEL;

HANSON, 2011). Desta forma, seria interessante aprofundar o estudo nesta região,

utilizando um maior numero de casos, a fim de observar a frequência da del2p e

tentar associar esta deleção com a progressão da doença.

87

A perda do padrão de metilação com a consequente hipermetilação global do

genoma é um fenômeno amplamente associado ao processo de carcinogênese

(SHEN; LAIRD, 2013). O padrão de metilação aberrante foi observado na leucemia

aguda promielocítica, mas não parece ser o evento chave, tendo um papel

secundário na leucemia aguda secundária (SCHOOFS et al., 2013). A desregulação

da expressão de genes através da alteração dos mecanismos epigenéticos da célula

foi observada como um dos principais processos patogênicos na SMD e na LMA

secundária, mas que ainda não é bem entendido. Sabe-se que há mutações em

diversos genes que regulam a maquinaria epigenética, tais como TET2, IDH1/2,

EZH2, DNMT3A, e que essas mutações estão pouco associadas às neoplasias

linfoproliferativas (VOSO et al., 2013).

Em NMP, um estudo com 35 amostras de fase crônica, TE e PV, não mostrou

padrão de metilação aberrante ou diferencial entre as doenças estudadas. Desta

forma, a alteração no padrão de metilação não parece ser um evento essencial na

fase crônica das NMP clássicas (BARRIO et al., 2011). Entretanto, diversos estudos

tentaram mostrar que reguladores negativos da via JAK-STAT poderiam estar

silenciados através de metilação do gene, alterando, portanto a sua expressão

(JOST et al., 2007; FOUROUCLAS et al., 2008).

No caso da transformação leucêmica dos pacientes que estudamos, uma

investigação adicional será necessária para obtermos dados sobre o padrão de

metilação desses pacientes. Dessa forma poderemos saber se a evolução para

leucemia aguda está induzindo algum padrão aberrante de metilação e se este

padrão está presente desde a fase crônica ou se seria um evento específico da

progressão leucêmica. Em geral, as alterações encontradas em reguladores

epigenéticos sugerem perda de função, como no caso de DNMT3A na leucemia

aguda (LEY et al., 2010). No nosso caso, estas alterações, diferente do esperado,

tiveram como consequência um aparente aumento de função. De forma adicional,

não foram encontradas mutações nos genes da maquinaria de metilação

classicamente associados às NMP, somente nas suas isoformas. Faz-se, portanto,

necessário um estudo funcional destas alterações novas a fim de que seja possível

um melhor entendimento do papel destas mutações na patogênese da doença.

Mutações em genes de maquinaria de splicing também já foram reportadas

em NMP (BRECQUEVILLE et al., 2012), e na leucemia aguda (MAKISHIMA et al.,

2012), mas estas mutações são mais frequentes na SMD ou na leucemia linfocítica

88

crônica (LLC) (GRAUBERT et al., 2011; PAPAEMMANUIL et al., 2011; QUESADA et

al., 2011; WANG et al., 2011; LANDAU et al., 2013). O gene mais recorrentemente

mutado é o SF3B1 que compõe a subunidade U2 da maquinaria de splicing, mas há

outros genes como o U2AF1 que também estão largamente associados à SMD.

Nos casos que estudamos, encontramos a mutação mais frequentemente

reportada em SF3B1, a p.Lys700Glu, que está fortemente associada à ARSA (85%)

e ARSA-t (87%). A descoberta da mutação em SF3B1 conjuntamente com os dados

clínicos que mostraram trombocitose e anemia ao diagnóstico no paciente que

estudamos, são fortes indícios de que o diagnóstico final deste paciente

provavelmente seja uma anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitose

(ARSA-t). Infelizmente não conseguimos ter acesso ao mielograma para realizarmos

a coloração de Perls a fim de evidenciar os depósitos de ferro nos eritrócitos.

Tivemos acesso aos blocos da BMO, mas a coloração não funcionou, muito

provavelmente devido ao efeito deletério do ácido na descalcificação (THAM;

COUSAR, 1993; STUART-SMITH, 2005). Este caso ilustra o impacto da

investigação de lesões moleculares e mutações na determinação do diagnóstico

hematológico correto, especialmente para entidades complexas em que pode haver

diagnósticos imprecisos.

A análise de clonalidade mostrou que a mutação em SF3B1 está presente no

subclone majoritário e que praticamente não há flutuação de carga alélica entre a

fase crônica e aguda. De fato, resultados recentes da literatura corroboram nossos

dados, mostrando que as mutações em SF3B1 são adquiridas desde o diagnóstico e

que a progressão da doença ocorre com a aquisição de mutações em outros genes

(LIN et al., 2014). Ao procurarmos mutações em SF3B1 nos pacientes que possuíam

evidências de trombocitose e anemia ao diagnóstico, não observamos nenhum outro

paciente portador de mutação neste gene. No trabalho de LIN et al. (2014), a

detecção de mutações em SF3B1 em dois pacientes só foi possível a partir da

clonagem do DNA amplificado dos mesmos. O grupo reportou a presença de

mutações em SF3B1 em 10% dos pacientes analisados com diagnóstico de SMD

(48/479), sendo 62% das mutações presentes em ARSA. Já o trabalho de WANG et

al. (2014) mostrou a presença de mutações em SF3B1 em 2/31 pacientes com PV.

A taxa de incidência da ARSA-t é baixa (e.g. 21 casos em 20 anos em

Duesseldorf) (WARDROP; STEENSMA, 2009), sendo que de 10 a 20% dos

pacientes com ARSA apresentam trombocitose. Tais dados demonstram a

89

dificuldade em se ter um bom diagnóstico e uma coorte de ARSA-t que possibilite a

descoberta de marcadores que melhor diferenciem ARSA-t da TE e da ARSA. O

caso que estudamos apresentou mutação em U2AF1L4, que também faz parte da

maquinaria de splicing, sugerindo que pacientes que apresentem fenótipo de doença

com características mais relacionadas à SMD parecem apresentar genes

relacionados à maquinaria de splicing mais frequentemente mutados.

Trinta e um a 76% dos pacientes com ARSA-t também podem apresentar

mutações em JAK2 (BOISSINOT, 2006; JEROMIN et al., 2013) e, em alguns casos

(13%), podem não apresentar mutação em SF3B1, mas apresentar somente a

mutação clássica em JAK2 (JEROMIN et al., 2013). No paciente que analisamos,

não foi detectada a mutação clássica de JAK2, mas observamos uma mutação não

reportada previamente, no domínio cinase de JAK2 (p.Arg1063Cys), que foi definida

como mutação pela análise in silico por ter um potencial efeito deletério na função

proteica.

Previamente, o domínio cinase de JAK2 foi estudado e foram observados

3/93 pacientes com diagnóstico de PV com mutações somáticas não sinônimas no

mesmo resíduo (p.Arg1063His), mas gerando uma modificação diferente da

alteração que encontramos (LEVINE et al., 2005). Recentemente foram descritas

duas mutações no domínio cinase de JAK2, p.Arg867Gln e p.Arg938Gln, ambas em

casos de trombocitose familiar. Estas mutações mostraram, em estudos funcionais

com células da linhagem Ba/F3-MPL, crescimento espontâneo e ativação de STAT1

(MARTY et al., 2014). No caso em que estudamos, não foi possível obter maiores

dados sobre os familiares do paciente, pois este declarou durante as anamneses

que não possuía contato com outros parentes além de seu filho, impossibilitando

uma análise mais aprofundada da nova mutação identificada com a hereditariedade.

Estudos funcionais que investiguem o efeito da mutação, bem como se há algum

efeito aditivo quando uma célula apresenta a mutação clássica em SF3B1 e a

mutação no domínio cinase de JAK2, contribuirão para um maior entendimento da

patogênese.

Buscando correlacionar a presença de genes mutados que pudessem

participar de vias de sinalização previamente descritas nas NMP, tais como JAK-

STAT, MAPK e PI3K, pudemos detectar pelo sequenciamento do exoma mutações

em MAPK15 em 3 pacientes. Uma das alterações encontradas foi prevista in silico

como tendo um efeito danoso. Após o início do nosso estudo de validação de

90

mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15 numa coorte de 49 pacientes JAK2V617F

negativos, os dados do projeto 1000 genomas para este gene se tornaram

disponíveis. Neste momento, pudemos comprovar que as duas mutações

observadas fora do domínio cinase pela técnica do WES eram polimorfismos e, de

fato, a previsão in silico era de um efeito benigno dessas alterações.

Apesar de MAPK15/ERK7/ERK8 ter sido a última molécula da família a ser

descrita (ABE et al., 2002), sua função já foi associada com o controle do ciclo

celular (GROEHLER; LANNIGAN, 2010; YANG et al., 2013), do fuso mitótico através

de ativação de proteínas que se ligam aos telômeros (CERONE et al., 2011),

ativação de ciclina D1(GROEHLER; LANNIGAN, 2010) e à transformação maligna

de linhagens de câncer de cólon (XU et al., 2010). O papel mais importante atribuído

a esta proteína foi na promoção da instabilidade genômica, e da proliferação celular,

tendo como resultado a transformação celular. Uma das funções atribuídas à

MAPK15 é interagir com PCNA, inibindo a ligação de HDM2 (GROEHLER;

LANNIGAN, 2010; NGUYEN; BIELINSKY, 2010). Mutações com perda de função em

ERK8 podem causar a degradação de PCNA através da sua poliubiquitinação

promovida por HDM2. A perda de função de PCNA no reparo do DNA causa

acúmulo de mutações e instabilidade genômica, o que pode resultar em

transformação celular. A ativação de ERK8 parece ser mediada pela quebra do DNA

em fita simples, recrutando-a para o reparo do DNA (KLEVERNIC; MARTIN;

COHEN, 2009).

Pouco se sabe sobre os reguladores da via que estão tanto a montante

quanto a jusante de ERK8. Sabe-se que ERK8 se autofosforila e não parece ter

reguladores a montante. Proteínas fosfateses parecem regular negativamente a

molécula (ABE et al., 2002; KLEVERNIC et al., 2006). Também já foi descrita uma

homologia proteica com ERK1/2/5 no motivo Thr-Glu-Tyr no loop de ativação

(KLEVERNIC et al., 2006). Além disso, sabe-se que em linhagens de câncer de

mama foi observada a perda de imunoreatividade à ERK8 e essa perda foi

correlacionada com a progressão tumoral, onde foi observada uma diminuição na

expressão de ERK8 sem que houvesse diminuição de ER1/2. Por isso tem-se

considerado a possibilidade de que ERK8 atue como um supressor tumoral

(HENRICH et al., 2003).

A presença de um mesmo perfil de sinalização que ativa a via JAK-STAT em

pacientes mutados para JAK2 e CALR sugere uma via comum de transformação

91

entre esses pacientes (RAMPAL et al., 2014). Assim, MAPK15 poderia estar

desempenhando um papel anterior a JAK2 na transformação neoplásica nas NMP.

Papel semelhante foi observado com TET2, que parece ser um evento anterior à

aquisição de mutações em JAK2 e a outras mutações associadas às NMP

(DELHOMMEAU et al., 2009).

O estudo de clonalidade sugere que a mutação em MAPK15 está presente no

mesmo clone de JAK2 e que a flutuação de carga alélica da fase crônica para a fase

aguda é praticamente imperceptível. Estudos visando agrupar as diferentes NMP de

acordo com as vias de sinalização ainda não conseguiram demonstrar uma

correlação clara entre a ativação de diferentes vias (STAT1, 3 e 5, AKT e PI3K), o

genótipo JAK2V617F mutado e o subtipo clínico de NMP (TEOFILI et al., 2007;

GRIMWADE et al., 2009; LAUBACH et al., 2009; MEYER et al., 2009; CHEN et al.,

2010; ANAND et al., 2011;). Um estudo recente utilizando arrays de expressão

mostrou expressão diferencial entre os pacientes mutados para JAK2, CALR e TET2

e doadores saudáveis. Para JAK2 também foi possível observar genes

diferencialmente expressos entre os pacientes com carga alélica de JAK2V617F

acima ou abaixo dos 50%. No entanto, os estudos de agrupamentos hierárquicos

não conseguiram agrupar de forma clara os diferentes subgrupos de NMP clássicas

de acordo com os perfis de expressão observados. PV foi o grupo mais homogêneo,

mas o resultado foi mais bem interpretado levando-se em consideração o efeito da

carga alélica em JAK2 acima de 50% que estes pacientes apresentam (RAMPAL et

al., 2014). Este fato reforça a heterogeneidade molecular observada entre os

subgrupos de NMP.

O primeiro artigo publicado em NMP utilizando técnicas genômicas de

sequenciamento de alta resolução tinha a proposta de sequenciamento de células

únicas (single cell) para estudo da heterogeneidade clonal. O grupo sequenciou as

células de um paciente com diagnóstico de TE, JAK2 negativo e que também não

apresentou mutações em outros genes classicamente associados às NMP tais como

TET2, MPL, ASXL1, CBL, IDH, e IKZF1 (HOU et al., 2012).

Quanto à heterogeneidade clonal, este trabalho sugeriu, através de

simulações de modelos matemáticos de evolução mono ou policlonal, a existência

de um único clone, com frequência alélica de mutações somáticas em torno de 50%,

resultado semelhante ao que observamos em nosso estudo de progressão

leucêmica. Eles também comentam que resultados sugerindo a presença de

92

somente um clone também podem ser encontrados quando um clone específico

possui uma vantagem seletiva maior que os demais, promovendo uma alta

proliferação deste clone majoritário. Por isso o grupo não descarta a possibilidade de

existir um subclone minoritário. Além disso, a análise de frequências alélicas de

mutações somáticas mostra um enriquecimento de mutações na frequência de 10 a

20% e um outro pico entre 50 e 60%. Este resultado de evolução clonal está

alinhado ao resultado que encontramos em nosso estudo de progressão leucêmica,

onde observamos a presença de um clone majoritário que compõe cerca de 70% do

tumor e um clone minoritário compondo 30%. O clone majoritário apresentou as

mutações que dirigem o tumor das NMP e o clone minoritário exibiu as mutações

mais fortemente associadas ao subclone leucêmico, como TP53. Ao final, o grupo

propõe uma lista de quatro genes (SESN2, ST13, DNAJC17 e TOP1MT)

considerados de interesse biológico para a patogênese da doença, mas nenhuma

validação destes genes foi realizada (HOU et al., 2012). Comparando esta lista de

genes com a lista dos genes que encontramos com aumento da frequência alélica

em pelo menos 1,5 vezes na amostra da fase aguda, não foi possível observar

correspondência, sugerindo que estes genes não participam na promoção da

leucemogênese.

O trabalho de BRECQUEVILLE et al. (2013) sequenciou 23 genes e analisou

por aCGH 80 pacientes com mielofibrose durante a fase crônica e a fase aguda com

progressão para mielofibrose secundária e para fase blástica. O estudo mostrou

alterações recorrentes, tais como del20q, del17 e del12p, que já haviam sido

descritas anteriormente. Os genes mais frequentemente mutados foram JAK2,

ASXL1, TET2, EXH2 e NF1. Os autores também enfatizaram que a análise global

dos resultados aponta para uma heterogeneidade genômica nos casos de MF,

apesar de algumas alterações recorrentes. Dentro desta diversidade apresentada,

pudemos observar semelhanças deste estudo aos resultados encontrados em nosso

trabalho, como um paciente apresentando ganho no 2p25.3p14, que foi a mesma

região recorrente nos dois pacientes que analisamos (+2p25.3p16.1 e

+2p25.1p13.3). O mais interessante nessas três amostras é a recorrência da região

de quebra. Este paciente que apresentou +2p também apresentou mutação em

TP53, e a ausência de del5q, bem como ausência da mutação clássica em JAK2.

Em nosso estudo, o paciente com +2p também apresentou o alelo selvagem de

93

JAK2, mas com perda monoalélica de TP53, sem mutação no alelo remanescente. A

comparação destes dados só reforça ainda mais o quanto as NMP são um grupo

bastante heterogêneo do ponto de vista genético.

O estudo de MERKER et al. (2013) se propôs a sequenciar o genoma

completo (WGS- whole genome sequencing) de um paciente com MF, que possuía o

alelo selvagem de JAK2, mas apresentava a mutação pTrp515Lys em MPL. Este

estudo mostrou 6 genes candidatos que apresentaram mutações e expressão

diferencial após análise de WGS e RNAseq. A validação dos 6 genes em uma coorte

de 178 pacientes com NMP (PV, TE e MF) não mostrou recorrência de mutação em

nenhum dos genes analisados. A comparação desses 6 genes candidatos com a

nossa lista de genes candidatos também não apontou nenhuma recorrência.

O trabalho de LUNDBERG et al. (2014) sequenciou 104 genes em uma coorte

de 197 pacientes com NMP. Os resultados mostraram que não houve aumento

expressivo de genes mutados entre as amostras do diagnóstico e do

acompanhamento dos pacientes analisados e que as mutações somáticas em TP53

com perda de heterozigosidade estavam fortemente associadas à transformação

leucêmica. Essas mutações em TP53 foram observadas desde a fase inicial da

doença e permaneceram com frequência alélica baixa até o momento da perda de

heterozigosidade, quando o clone leucêmico se expandiu rapidamente. Dos genes

selecionados neste trabalho, 3 foram recorrentes nas nossas análises (JAK2, TP53 e

GDF15).

Mutações em TP53 têm sido associadas à progressão leucêmica em cerca de

30% dos casos, mas a maioria das descrições mostrou associação das mutações

em TP53 com pacientes que também continham a mutação clássica em JAK2

(HARUTYUNYAN et al., 2011; TEFFERI, 2013b). ZHANG et al. (2012) mostrou

mutações em TP53 em 6/17 pacientes com NMP, sendo que somente um paciente

era positivo para JAK2V617F e também apresentava mutação em SRSF2. Dois

pacientes tinham co-ocorrência de mutações em SRSF2, e três com mutações

concomitantes em TET2 e TP53. No estudo de BRECQUEVILLE et al.(2013)

também foi observada a presença de 2 casos com mutação em TP53 em pacientes

com MF JAK2 positivos e 2 casos de fase blástica de MF secundária à TE com JAK2

WT (BRECQUEVILLE et al., 2013). Em nosso trabalho, observamos por WES

mutações em TP53 no paciente com diagnóstico de RARS-t e TE-JAK2V617F

positivo, sendo que o paciente TE apresentou um caso interessante com duas

94

mutações em TP53 com diferentes frequências alélicas. Uma delas presente na fase

crônica, com redução do clone na fase aguda, e a outra mutação específica da fase

aguda. Um caso semelhante foi observado num paciente com leucemia linfocítica

crônica (LLC) que apresentou del11q13 e mutações em SF3B1 (p.Gly742Asp) e

DDX3X (p.Glu196fs) no clone anterior ao tratamento quimioterápico. Após a terapia,

o clone não apresentava níveis detectáveis, o que poderia representar uma

subclonalidade. Entretanto, na recaída o paciente reapresentou um novo subclone

com del11q13 e outras mutações em SF3B1 (p.Lys700Glu) e DDX3X (p.Leu21fs)

(OJHA et al., 2013). No estudo de validação de mutações em TP53 em nossa coorte

mostramos a ocorrência de mutações em TP53 em 3/45 (7%) pacientes JAK2V617F

negativos. Devido à ampla associação de alterações em TP53 com os mecanismos

neoplásicos e a recorrência de mutações TP53 em NMP, principalmente em casos

que sofrem progressão da fase crônica para fase aguda, tem-se sugerido cada vez

mais a utilização da caracterização de mutações neste gene como um marcador de

prognóstico ruim para as NMP (TEFFERI, 2013b; LUNDBERG et al., 2014; WANG et

al., 2014)

A comparação da lista dos nossos genes candidatos com a lista de genes dos

trabalhos de sequenciamento do exoma que evidenciaram as mutações em CALR

(KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a) mostrou que 26 genes estavam

mutados em nosso trabalho e em pelo menos mais um e por isso sugerimos que

estes genes podem ser importantes no processo de leucemogênese. Devido a esses

achados, planejamos a validação futura desses genes em nossa coorte de pacientes

com NMP clássicas.

A análise detalhada da lista de genes candidatos gerada por este trabalho

mostra três recorrências em genes “drivers” ou diretores (genes envolvidos em vias

celulares fundamentais para a sobrevivência da célula tumoral) descritos por

VOGELSTEIN et al. (2013) em câncer: MLL3, TP53 e JAK2. As alterações

recorrentes em JAK2 e P53 foram as únicas encontradas neste trabalho que foram

também evidenciadas como alterações recorrentes no trabalho de NANGALIA et al.

(2013). Comparando nossos achados com os de KLAMPFL et al. (2013), três genes

recorrentes foram evidenciados (MYBPC1, KIF12, C10orf71). Quando a comparação

deste trabalho foi feita contra os genes descritos por LUNDBERG et al., (2014),

foram encontrados dois genes recorrentes: JAK2 e TP53. O resultado da

comparação dos genes encontrados neste trabalho contra os trabalhos até hoje

95

disponíveis apontam três genes, JAK2, TP53 e C10orf71, em comum e participantes

da progressão leucemogênica. Estes genes foram encontrados em pelo menos dois

trabalhos além do nosso.

96

6. Conclusão

A análise integral dos resultados nos permitiu concluir que:

1) A frequência da distribuição da mutação JAK2V617F nas neoplasias

mieloides clássicas, BCR-ABL negativas, da classificação da OMS/WHO, foi

de 92% em pacientes com PV, 46% e 48% em pacientes com TE e MF

respectivamente. Na TE e na MF, pacientes JAK2V617F positivos

apresentaram maiores chances de ocorrência de eventos adversos quando

comparados aqueles JAK2V617F negativos.

2) A carga alélica de pacientes com TE é mais baixa do que a de pacientes com

PV (p= 0,0002) e MF (p= 0,0090). A quantificação do clone mutado realizada

PCR-C ou QPCR forneceu informação complementar sobre o papel do

tamanho clone, características clínicas e parâmetros hematológicos.

3) A redução da carga alélica de JAK2V617F, durante o tratamento com HU, é

mais evidente no inicio do tratamento, sendo pouco relevante ao longo da

utilização da droga. O uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib) não impacta a

carga alélica, apesar da melhoria dos sintomas clínicos.

4) A incorporação de mutações somáticas recém descritas (JAK2, CALR, MPL)

em algoritmos de análise para as NMP permitiu definir, até o presente

momento, 73% e 61% dos casos de TE e MF, respectivamente, apesar da

análise de mutações em CALR nos pacientes JAK2V617F negativos ainda

não ter sido concluída. Mutações no gene CALR foram encontradas

respectivamente em 62% e 67% de pacientes com TE e MF negativos para

JAK2V617F analisados.

5) As técnicas de alta resolução genômica evidenciaram a heterogeneidade

molecular nos casos analisados e permitiram identificar lesões moleculares e

mutações nas amostras analisadas.

6) As alterações cromossômicas +2p e del (5q) foram específicas das amostras

de fase aguda, mostrando-se preferencialmente associadas à transformação

leucêmica. Análises destas regiões revelaram a presença de genes

envolvidos na regulação epigenética (DNMT3A, ASXL2 e DPY30) e em genes

das vias de proliferação e diferenciação hematopoética (CSF2, TSLP, IL3,

IL5, IL4, IL9, IL13, IL12B, SPRY4)

7) No presente trabalho, foram identificados 26 genes com status mutacional

diferenciado entre a fase crônica (NMP) e fase leucêmica. Alterações em 3

97

destes genes, CALR, MAPK15 e TP53 foram confirmadas por

sequenciamento direto.

8) Mutações em TP53 foram observadas desde a fase crônica, mas a presença

de mutações que aparecem preferencialmente na fase aguda pode estar

relacionada/ou ser preditiva da progressão leucêmica.

De maneira geral, podemos concluir que nas NMP clássicas a utilização

exclusiva da carga alélica de JAK2 para previsão da progressão da doença ainda é

controversa, pois não há um padrão previsível. Pacientes portadores de PV, TE e

MF podem progredir para leucemia aguda secundária portando mutações em JAK2,

CALR, ou não apresentar nenhuma mutação previamente associada à patogênese

das NMP. O processo de progressão para leucemia aguda secundária também

parece apresentar um panorama bastante heterogêneo devido à presença de

diversas lesões genéticas/moleculares, e a presença escassa de lesões recorrentes

e específicas da fase de leucemia aguda secundária nos três pacientes analisados.

98

7. Perspectivas

1) Estudo de validação dos 26 genes com frequência aumentada na progressão

leucêmica (fase aguda) em uma coorte de NMP, incluindo casos de

progressão para mielofibrose e leucemia aguda, a fim de verificarmos a

potencial associação desses genes com a evolução e o prognóstico dos

pacientes;

2) Estudo de validação da del2p e +5q em amostras de células de sangue

periférico de pacientes com NMP através da técnica de FISH;

3) Avaliar a frequência da nova mutação no domínio cinase de JAK2

(p.Arg1063Cys) em uma coorte de pacientes NMP e SMD e correlaciona-la

com parâmetros clínico-hematológicos;

4) Estudar o papel de ERK8 nas quatro diferentes NMPs (PV, TE, MF e ARSA-t),

gerando dados sobre a expressão e a frequência de mutações em uma coorte

de pacientes;

5) Realização de estudos funcionais das mutações de ERK8 encontradas nos

pacientes com a expressão concomitante de mutações em JAK2 e CALR;

6) Estudo comparativo do perfil proteico de pacientes NMP entre pacientes

JAK2V617F, CALR mutados, e pacientes que não possuam mutações em

JAK2, CALR e MPL através da técnica de proteômica.

99

8. Referências Bibliográficas

AARONSON, D. S.; HORVATH, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science (New York, N.Y.), v. 296, n. 5573, p. 1653–1655, 31 maio 2002.

ABDEL-WAHAB, O. et al. Genetic Analysis of Transforming Events That Convert Chronic Myeloproliferative Neoplasms to Leukemias. Cancer Research, v. 70, n. 2, p. 447–452, 12 jan. 2010.

ABDULKARIM, K. et al. AML transformation in 56 patients with Ph− MPD in two well defined populations. European Journal of Haematology, v. 82, n. 2, p. 106–111, fev. 2009.

ABE, M. K. et al. ERK8, a new member of the mitogen-activated protein kinase family. Journal of Biological Chemistry, v. 277, n. 19, p. 16733–16743, 2002.

ALCHALBY, H. et al. Impact of JAK2V617F mutation status, allele burden, and clearance after allogeneic stem cell transplantation for myelofibrosis. Blood, v. 116, n. 18, p. 3572–3581, 20 maio 2010.

ANAND, S. et al. Increased basal intracellular signaling patterns do not correlate with JAK2 genotype in human myeloproliferative neoplasms. Blood, v. 118, n. 6, p. 1610–1621, 2011.

ANDRULIS, M. et al. IDH1 R132H mutation is a rare event in myeloproliferative neoplasms as determined by a mutation specific antibody. Haematologica, v. 95, n. 10, p. 1797–1798, 2010.

ANTONIOLI, E. et al. Clinical implications of the JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia. Leukemia, v. 19, n. 10, p. 1847–1849, 4 ago. 2005.

ANTONIOLI, E. et al. Influence of JAK2V617F allele burden on phenotype in essential thrombocythemia. Haematologica, v. 93, n. 1, p. 41–48, 1 jan. 2008.

ANTONIOLI, E. et al. Hydroxyurea does not appreciably reduce JAK2 V617F allele burden in patients with polycythemia vera or essential thrombocythemia. Haematologica, v. 95, n. 8, p. 1435–1438, ago. 2010.

ASMANN, Y. W. et al. TREAT: a bioinformatics tool for variant annotations and visualizations in targeted and exome sequencing data. Bioinformatics, v. 28, n. 2, p. 277–278, 15 nov. 2011.

BARBUI, T. et al. Disease characteristics and clinical outcome in young adults with essential thrombocythemia versus early/prefibrotic primary myelofibrosis. Blood, v. 120, n. 3, p. 569–571, 13 jun. 2012.

BAROSI, G. et al. Erythropoiesis in myelofibrosis with myeloid metaplasia: recognition of different classes of patients by erythrokinetics. British Journal of Haematology, v. 48, n. 2, p. 263–272, jun. 1981.

BAROSI, G. et al. Proposed criteria for the diagnosis of post-polycythemia vera and post-essential thrombocythemia myelofibrosis: a consensus statement from the International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment. Leukemia, v. 22, n. 2, p. 437–438, 2007a.

BAROSI, G. et al. JAK2 V617F mutational status predicts progression to large splenomegaly and leukemic transformation in primary myelofibrosis. Blood, v. 110, n. 12, p. 4030–4036, 1 dez. 2007b.

100

BAROSI, G. et al. Response criteria for essential thrombocythemia and polycythemia vera: result of a European LeukemiaNet consensus conference. Blood, v. 113, n. 20, p. 4829–4833, 10 mar. 2009.

BARRIO, S. et al. Epigenomic profiling in polycythaemia vera and essential thrombocythaemia shows low levels of aberrant DNA methylation. Journal of Clinical Pathology, v. 64, n. 11, p. 1010–1013, 6 ago. 2011.

BAXTER, E. J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet, v. 365, n. 9464, p. 1054–1061, 19 mar. 2005.

BEER, P. A. et al. Two routes to leukemic transformation after a JAK2 mutation-positive myeloproliferative neoplasm. Blood, v. 115, n. 14, p. 2891–2900, 11 dez. 2009.

BELLANNE-CHANTELOT, C. Genetic and clinical implications of the Val617Phe JAK2 mutation in 72 families with myeloproliferative disorders. Blood, v. 108, n. 1, p. 346–352, 1 jul. 2006.

BENCH, A. J. et al. Molecular genetics and cytogenetics of myeloproliferative disorders. Baillière’s clinical haematology, v. 11, n. 4, p. 819–848, dez. 1998.

BENJAMINI, O. et al. Relapse of postpolycythemia myelofibrosis after allogeneic stem cell transplantation in a polycythemic phase: successful treatment with donor lymphocyte infusion directed by quantitative PCR test for V617F-JAK2 mutation. Leukemia, v. 22, n. 10, p. 1961–1963, 7 ago. 2008.

BERGLUND, S.; ZETTERVALL, O. Incidence of polycythemia vera in a defined population. European Journal of Haematology, v. 48, n. 1, p. 20–26, jan. 1992.

BOISSINOT, M. The JAK2-V617F mutation and essential thrombocythemia features in a subset of patients with refractory anemia with ring sideroblasts (RARS). Blood, v. 108, n. 5, p. 1781–1782, 9 maio 2006.

BONAMINO, M. H. et al. QUALITITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSIS OF JAK2V617F MUTATIONS UNRAVELS HIGHER RESPONSIVENESS OF JAK2+ ET PATIENTS TREATED WITH HYDROXYUREA. Haematologica, v. 94, n. suppl 2, p. 581 abstract 1494, 6 jul. 2009.

BOYD, E. M. et al. Clinical utility of routine MPL exon 10 analysis in the diagnosis of essential thrombocythaemia and primary myelofibrosis. British journal of haematology, v. 149, n. 2, p. 250–257, 2010.

BRECQUEVILLE, M. et al. Mutation analysis of ASXL1, CBL, DNMT3A, IDH1, IDH2, JAK2, MPL, NF1, SF3B1, SUZ12, and TET2 in myeloproliferative neoplasms. Genes, Chromosomes and Cancer, p. n/a–n/a, 2012.

BRECQUEVILLE, M. et al. Array comparative genomic hybridization and sequencing of 23 genes in 80 patients with myelofibrosis at chronic or acute phase. Haematologica, v. 99, n. 1, p. 37–45, 30 ago. 2013.

BROCK, G. et al. clValid, an R package for cluster validation. Journal of Statistical Software (Brock et al., March 2008), 2011.

BROSÉUS, J. et al. Clinical features and course of refractory anemia with ring sideroblasts associated with marked thrombocytosis. Haematologica, v. 97, n. 7, p. 1036–1041, 24 abr. 2012.

101

BROSÉUS, J. et al. Age, JAK2V617F and SF3B1 mutations are the main predicting factors for survival in refractory anaemia with ring sideroblasts and marked thrombocytosis. Leukemia, v. 27, n. 9, p. 1826–1831, 18 abr. 2013.

CAMPBELL, P. J. et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on< i> JAK2</i> V617F mutation status: a prospective study. The Lancet, v. 366, n. 9501, p. 1945–1953, 2005.

CAMPBELL, P. J. et al. Mutation of JAK2 in the myeloproliferative disorders: timing, clonality studies, cytogenetic associations, and role in leukemic transformation. Blood, v. 108, n. 10, p. 3548, 2006.

CAMPBELL, P. J. V617F mutation in JAK2 is associated with poorer survival in idiopathic myelofibrosis. Blood, v. 107, n. 5, p. 2098–2100, 1 mar. 2006.

CAROBBIO, A. et al. JAK2V617F allele burden and thrombosis: A direct comparison in essential thrombocythemia and polycythemia vera. Experimental Hematology, v. 37, n. 9, p. 1016–1021, set. 2009.

CAZZOLA, M. Somatic mutations of JAK2 exon 12 as a molecular basis of erythrocytosis. Haematologica, v. 92, n. 12, p. 1585–1589, 1 dez. 2007.

CERONE, M. A. et al. High-Throughput RNAi Screening Reveals Novel Regulators of Telomerase. Cancer Research, v. 71, n. 9, p. 3328–3340, 29 abr. 2011.

CHAO, M. P. et al. Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Science translational medicine, v. 2, n. 63, p. 63ra94, 22 dez. 2010.

CHEN, E. et al. Distinct Clinical Phenotypes Associated with JAK2V617F Reflect Differential STAT1 Signaling. Cancer Cell, v. 18, n. 5, p. 524–535, nov. 2010.

CHI, J. et al. Calreticulin gene exon 9 frameshift mutations in patients with thrombocytosis. Leukemia, 24 dez. 2013a.

CHI, J. et al. Calreticulin exon 9 frame-shift mutations in patients with thrombocytosis. Leukemia, 24 dez. 2013b.

COLAIZZO, D. et al. Sex modulation of the occurrence of jak2 v617f mutation in patients with splanchnic venous thrombosis. Thrombosis Research, v. 128, n. 3, p. 233–236, set. 2011.

CUI, R. et al. Clinical importance of SF3B1 mutations in Chinese with myelodysplastic syndromes with ring sideroblasts. Leukemia Research, v. 36, n. 11, p. 1428–1433, nov. 2012.

DAMESHEK, W. Some speculations on the myeloproliferative syndromes. Blood, v. 6, n. 4, p. 372–375, abr. 1951.

DE KEERSMAECKER, K.; COOLS, J. Chronic myeloproliferative disorders: a tyrosine kinase tale. Leukemia: Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, v. 20, n. 2, p. 200–205, fev. 2006.

DE STEFANO, V. et al. Increased risk of recurrent thrombosis in patients with essential thrombocythemia carrying the homozygous JAK2 V617F mutation. Annals of Hematology, v. 89, n. 2, p. 141–146, fev. 2010.

102

DELHOMMEAU, F. et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. The New England Journal of Medicine, v. 360, n. 22, p. 2289–2301, 28 maio 2009.

DINGLI, D. et al. Presence of unfavorable cytogenetic abnormalities is the strongest predictor of poor survival in secondary myelofibrosis. Cancer, v. 106, n. 9, p. 1985–1989, 1 maio 2006.

DOPAZO, J.; CARAZO, J. Phylogenetic Reconstruction using a Growing Neural Networkthat Adopts the Topology of a Phylogenetic Tree. Journal of Molecular Evolution, p. 226–233, 1997.

DUNN, J. Well Separated Clusters and Fuzzy Partitions. Journal on Cybernetics, v. 4, p. 95–104, 1974.

EBERT, B. L. et al. Identification of RPS14 as a 5q- syndrome gene by RNA interference screen. Nature, v. 451, n. 7176, p. 335–339, 17 jan. 2008.

EBERT, B. L. Deletion 5q in myelodysplastic syndrome: a paradigm for the study of hemizygous deletions in cancer. Leukemia, v. 23, n. 7, p. 1252–1256, 2009.

EBERT, B. L. Molecular Dissection of the 5q Deletion in Myelodysplastic Syndrome. Seminars in Oncology, v. 38, n. 5, p. 621–626, out. 2011.

FINN, O. J. Cancer Immunology. New England Journal of Medicine, v. 358, n. 25, p. 2704–2715, 19 jun. 2008.

FOUROUCLAS, N. et al. Methylation of the suppressor of cytokine signaling 3 gene (SOCS3) in myeloproliferative disorders. Haematologica, v. 93, n. 11, p. 1635–1644, 11 set. 2008.

FRALEY, C.; RAFTERY, A. Model-based Clustering, Discriminant Analysis, and DensityEstimation. Journal of the American Statistical Association, v. 17, p. 126–136, 2001.

FRALEY, C.; RAFTERY, A. MCLUST Version 3 for R: Normal Mixture Modeling and Model-Based Clustering. Washington, USA: Department of Statistics, University of Washington, 2006. Disponível em: <http://CRAN.R-project.org/package=mclust.>.

FRALEY, C.; RAFTERY, A.; SCRUCCA, L. MCLUST Version 4 for R: Normal Mixture Modeling for Model-Based Clustering, Classification, and Density Estimation: 597. Washington, USA: Department of Statistics, University of Washington, 2013. Disponível em: <http://www.stat.washington.edu/mclust/>.

GAIDANO, G. et al. Molecular mechanisms of tumor progression in chronic myeloproliferative disorders. Leukemia: official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, v. 8 Suppl 1, p. S27–29, abr. 1994.

GALE, R. E. et al. Long-term serial analysis of X-chromosome inactivation patterns and JAK2 V617F mutant levels in patients with essential thrombocythemia show that minor mutant-positive clones can remain stable for many years. Blood, v. 109, n. 3, p. 1241–1243, 5 out. 2006.

GANGAT, N. et al. Cytogenetic studies at diagnosis in polycythemia vera: clinical and JAK2V617F allele burden correlates. European Journal of Haematology, v. 80, n. 3, p. 197–200, mar. 2008.

GANGAT, N. et al. Cytogenetic abnormalities in essential thrombocythemia: prevalence and prognostic significance. European Journal of Haematology, v. 83, n. 1, p. 17–21, jul. 2009.

GARDAI, S. J. et al. Cell-Surface Calreticulin Initiates Clearance of Viable or Apoptotic Cells through trans-Activation of LRP on the Phagocyte. Cell, v. 123, n. 2, p. 321–334, 21 out. 2005.

103

GIAGOUNIDIS, A. A. N. et al. Clinical, morphological, cytogenetic, and prognostic features of patients with myelodysplastic syndromes and del(5q) including band q31. Leukemia, v. 18, n. 1, p. 113–119, jan. 2004.

GIRODON, F. et al. Frequent reduction or absence of detection of the JAK2-mutated clone in JAK2V617F-positive patients within the first years of hydroxyurea therapy. Haematologica, v. 93, n. 11, p. 1723–1727, 11 set. 2008.

GONDEK, L. P. et al. Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS, MDS/MPD, and MDS-derived AML. Blood, v. 111, n. 3, p. 1534–1542, 25 out. 2007a.

GONDEK, L. P. et al. SNP Array Karyotyping Allows for the Detection of Uniparental Disomy and Cryptic Chromosomal Abnormalities in MDS/MPD-U and MPD. PLoS ONE, v. 2, n. 11, p. e1225, 21 nov. 2007b.

GRAUBERT, T. A. et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nature Genetics, v. 44, n. 1, p. 53–57, 11 dez. 2011.

GREEN, A.; BEER, P. Somatic mutations of IDH1 and IDH2 in the leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine, v. 362, n. 4, p. 369–370, 2010.

GREENBERG, P. et al. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood, v. 89, n. 6, p. 2079–2088, 15 mar. 1997.

GRIMWADE, L. F. et al. Phospho-STAT5 and phospho-Akt expression in chronic myeloproliferative neoplasms. British journal of haematology, v. 147, n. 4, p. 495–506, 2009.

GROEHLER, A. L.; LANNIGAN, D. A. A chromatin-bound kinase, ERK8, protects genomic integrity by inhibiting HDM2-mediated degradation of the DNA clamp PCNA. The Journal of Cell Biology, v. 190, n. 4, p. 575–586, 23 ago. 2010.

GRÜNEBACH, F. et al. Detection of a new JAK2 D620E mutation in addition to V617F in a patient with polycythemia vera. Leukemia: Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, v. 20, n. 12, p. 2210–2211, dez. 2006.

GUGLIELMELLI, P. et al. CALR mutations in myeloproliferative neoplasms: Hidden behind the reticulum: CALR Mutations in Myeloproliferative Neoplasms. American Journal of Hematology, p. n/a–n/a, jan. 2014.

HARTIGAN, J.; WONG, M. A K-means Clustering Algorithm. Applied Statistics, v. 28, p. 100–108, 1979.

HARUTYUNYAN, A. et al. p53 lesions in leukemic transformation. New England Journal of Medicine, v. 364, n. 5, p. 488–490, 2011.

HASSELBALCH, H. C. A new era for IFN-in the treatment of Philadelphia-negative chronic myeloproliferative neoplasms. Expert Review of Hematology, v. 4, n. 6, p. 637–655, 2011.

HASSELBALCH, H. C. et al. Transcriptional Profiling of Whole Blood Identifies a Unique 5-Gene Signature for Myelofibrosis and Imminent Myelofibrosis Transformation. PLoS ONE, v. 9, n. 1, p. e85567, 13 jan. 2014.

104

HEINRICHS, S. et al. Accurate detection of uniparental disomy and microdeletions by SNP array analysis in myelodysplastic syndromes with normal cytogenetics. Leukemia, v. 23, n. 9, p. 1605–1613, 2009.

HENRICH, L. M. et al. Extracellular Signal-Regulated Kinase 7, a Regulator of Hormone-Dependent Estrogen Receptor Destruction. Molecular and Cellular Biology, v. 23, n. 17, p. 5979–5988, 1 set. 2003.

HOU, Y. et al. Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm. Cell, v. 148, n. 5, p. 873–885, mar. 2012.

HUANG, D. W.; SHERMAN, B. T.; LEMPICKI, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature protocols, v. 4, n. 1, p. 44–57, 2009a.

HUANG, D. W.; SHERMAN, B. T.; LEMPICKI, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic acids research, v. 37, n. 1, p. 1–13, jan. 2009b.

HUANG, J. et al. Risk factors for leukemic transformation in patients with primary myelofibrosis. Cancer, v. 112, n. 12, p. 2726–2732, 15 jun. 2008.

HUIJSMANS, C. J. J. et al. Sensitive Detection and Quantification of the JAK2V617F Allele by Real-Time PCR. The Journal of Molecular Diagnostics, v. 13, n. 5, p. 558–564, set. 2011.

HUSSEIN, K. et al. JAK2V617F allele burden discriminates essential thrombocythemia from a subset of prefibrotic-stage primary myelofibrosis. Experimental Hematology, v. 37, n. 10, p. 1186–1193.e7, out. 2009.

HUSSEIN, K.; VAN DYKE, D. L.; TEFFERI, A. Conventional cytogenetics in myelofibrosis: literature review and discussion. European Journal of Haematology, v. 82, n. 5, p. 329–338, maio 2009.

IARC TP53 Database. WebContent. Disponível em: <http://p53.iarc.fr/ProtocolsAndTools.aspx>. Acesso em: 2 maio. 2014.

JAFFE, E. S.; WORLD HEALTH ORGANIZATION. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon; Oxford: IARC Press ; Oxford University Press (distributor), 2001.

JAMES, C. et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature, v. 434, n. 7037, p. 1144–1148, 28 abr. 2005.

JANSSEN, J. W. et al. Essential thrombocythemia in two sisters originating from different stem cell levels. Blood, v. 75, n. 8, p. 1633–1636, 15 abr. 1990.

JELINEK, J. et al. JAK2 mutation 1849G> T is rare in acute leukemias but can be found in CMML, Philadelphia chromosome–negative CML, and megakaryocytic leukemia. Blood, v. 106, n. 10, p. 3370–3373, 2005.

JEROMIN, S. et al. High frequencies of SF3B1 and JAK2 mutations in refractory anemia with ring sideroblasts associated with marked thrombocytosis strengthen the assignment to the category of myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms. haematologica, v. 98, n. 2, p. e15, 2013.

JOHANSSON, P. L.; SAFAI-KUTTI, S.; KUTTI, J. An elevated venous haemoglobin concentration cannot be used as a surrogate marker for absolute erythrocytosis: a study of patients with polycythaemia

105

vera and apparent polycythaemia. British Journal of Haematology, v. 129, n. 5, p. 701–705, jun. 2005.

JONES, A. V. et al. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood, v. 106, n. 6, p. 2162–2168, 15 set. 2005.

JONES, A. V. et al. Rapid identification of JAK2 exon 12 mutations using high resolution melting analysis. Haematologica, v. 93, n. 10, p. 1560–1564, 1 out. 2008.

JOST, E. et al. Epigenetic alterations complement mutation of JAK2 tyrosine kinase in patients with BCR/ABL-negative myeloproliferative disorders. Leukemia, v. 21, n. 3, p. 505–510, 2007.

JOVANOVIC, J. V. et al. Establishing optimal quantitative-polymerase chain reaction assays for routine diagnosis and tracking of minimal residual disease in JAK2-V617F-associated myeloproliferative neoplasms: a joint European LeukemiaNet/MPN&MPNr-EuroNet (COST action BM0902) study. Leukemia, v. 27, n. 10, p. 2032–2039, 17 jul. 2013.

KAUFMAN, L.; ROUSSEEUW, P. Finding Groups in Data: An Introduction to Cluster Analysis. New York: Wiley, 1990.

KEPP, O. et al. Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment. Apoptosis, v. 14, n. 4, p. 364–375, 15 jan. 2009.

KLAMPFL, T. et al. Genome integrity of myeloproliferative neoplasms in chronic phase and during disease progression. Blood, v. 118, n. 1, p. 167, 2011.

KLAMPFL, T. et al. Somatic Mutations of Calreticulin in Myeloproliferative Neoplasms. New England Journal of Medicine, v. 369, n. 25, p. 2379–2390, 19 dez. 2013.

KLEVERNIC, I. V. et al. Characterization of the reversible phosphorylation and activation of ERK8. Biochemical Journal, v. 394, n. 1, p. 365, 15 fev. 2006.

KLEVERNIC, I. V.; MARTIN, N. M. B.; COHEN, P. Regulation of the activity and expression of ERK8 by DNA damage. FEBS Letters, v. 583, n. 4, p. 680–684, fev. 2009.

KNOOPS, L. et al. Analysis of the progression of JAK2 V617F positive myeloproliferative neoplasms by single-nucleotide polymorphism array does not reveal a strong chromosomal instability. Cancer Genetics and Cytogenetics, v. 192, n. 2, p. 102–104, jul. 2009.

KOHONEN, T. Self-Organizing Maps. 2nd. ed. [s.l.] Springer-Verlag, 1997.

KRALOVICS, R. et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. The New England Journal of Medicine, v. 352, n. 17, p. 1779–1790, 28 abr. 2005.

KREBS, D. L.; HILTON, D. J. SOCS proteins: negative regulators of cytokine signaling. Stem Cells (Dayton, Ohio), v. 19, n. 5, p. 378–387, 2001.

KROGER, N. et al. Monitoring of the JAK2-V617F mutation by highly sensitive quantitative real-time PCR after allogeneic stem cell transplantation in patients with myelofibrosis. Blood, v. 109, n. 3, p. 1316–1321, 5 out. 2006.

KROGER, N. et al. JAK2-V617F-triggered preemptive and salvage adoptive immunotherapy with donor-lymphocyte infusion in patients with myelofibrosis after allogeneic stem cell transplantation. Blood, v. 113, n. 8, p. 1866–1868, 19 fev. 2009.

106

LANDAU, D. A. et al. Evolution and Impact of Subclonal Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cell, v. 152, n. 4, p. 714–726, fev. 2013.

LANGE, T. et al. JAK2 p.V617F allele burden in myeloproliferative neoplasms one month after allogeneic stem cell transplantation significantly predicts outcome and risk of relapse. Haematologica, v. 98, n. 5, p. 722–728, 8 jan. 2013.

LARSEN, T. S. et al. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymphocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. British Journal of Haematology, v. 136, n. 5, p. 745–751, mar. 2007a.

LARSEN, T. S. et al. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymphocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. British Journal of Haematology, v. 136, n. 5, p. 745–751, mar. 2007b.

LARSEN, T. S. et al. Limited efficacy of hydroxyurea in lowering of the JAK2 V617F allele burden. Hematology, v. 14, n. 1, p. 11–15, fev. 2009.

LAUBACH, J. P. et al. Polycythemia vera erythroid precursors exhibit increased proliferation and apoptosis resistance associated with abnormal RAS and PI3K pathway activation. Experimental Hematology, v. 37, n. 12, p. 1411–1422, dez. 2009.

LEE, T. S. et al. Structural effects of clinically observed mutations in JAK2 exons 13-15: comparison with V617F and exon 12 mutations. BMC structural biology, v. 9, n. 1, p. 58, 2009.

LEHMANN, S. et al. Common deleted genes in the 5q- syndrome: thrombocytopenia and reduced erythroid colony formation in SPARC null mice. Leukemia, v. 21, n. 9, p. 1931–1936, 2007.

LEVINE, R. L. et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell, v. 7, n. 4, p. 387–397, abr. 2005.

LEY, T. J. et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine, v. 363, n. 25, p. 2424–2433, 2010.

LI, S. et al. Clonal heterogeneity in polycythemia vera patients with JAK2 exon12 and JAK2-V617F mutations. Blood, v. 111, n. 7, p. 3863–3866, 1 abr. 2008.

LIM, C. P.; CAO, X. Structure, function, and regulation of STAT proteins. Molecular bioSystems, v. 2, n. 11, p. 536–550, nov. 2006.

LIN, C.-C. et al. SF3B1 mutations in patients with myelodysplastic syndromes: The mutation is stable during disease evolution: SF3B1 Mutations in MDS. American Journal of Hematology, p. n/a–n/a, abr. 2014.

LIPPERT, E. et al. Concordance of assays designed for the quantification of JAK2V617F: a multicenter study. Haematologica, v. 94, n. 1, p. 38–45, 1 jan. 2009.

LIU, K. et al. Evidence for a founder effect of the MPL-S505N mutation in eight Italian pedigrees with hereditary thrombocythemia. haematologica, v. 94, n. 10, p. 1368–1374, 2009.

LUNDBERG, P. et al. Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood, 29 jan. 2014.

107

MA, W. et al. Mutation profile of JAK2 transcripts in patients with chronic myeloproliferative neoplasias. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD, v. 11, n. 1, p. 49–53, jan. 2009.

MAECHLER, M. et al. cluster: Cluster Analysis Basics and Extensions. [s.l: s.n.].

MAKISHIMA, H. et al. Mutations in the spliceosome machinery, a novel and ubiquitous pathway in leukemogenesis. Blood, v. 119, n. 14, p. 3203–3210, 5 abr. 2012.

MARCHIOLI, R. Vascular and Neoplastic Risk in a Large Cohort of Patients With Polycythemia Vera. Journal of Clinical Oncology, v. 23, n. 10, p. 2224–2232, 7 fev. 2005.

MARDIS, E. R. et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. New England Journal of Medicine, v. 361, n. 11, p. 1058–1066, 2009.

MARTIN, P.; PAPAYANNOPOULOU, T. HEL cells: a new human erythroleukemia cell line with spontaneous and induced globin expression. Science, v. 216, n. 4551, p. 1233, 1982.

MARTÍNEZ-AVILÉS, L. et al. TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, and c-CBL genes in JAK2- and MPL-negative myeloproliferative neoplasms. Annals of Hematology, v. 91, n. 4, p. 533–541, 9 set. 2011.

MARTY, C. et al. Germ-line JAK2 mutations in the kinase domain are responsible for hereditary thrombocytosis and are resistant to JAK2 and HSP90 inhibitors. Blood, v. 123, n. 9, p. 1372–1383, 27 fev. 2014.

MERKER, J. D. et al. Comprehensive whole-genome sequencing of an early-stage primary myelofibrosis patient defines low mutational burden and non-recurrent candidate genes. Haematologica, v. 98, n. 11, p. 1689–1696, 19 jul. 2013.

MESA, R. A. Leukemic transformation in myelofibrosis with myeloid metaplasia: a single-institution experience with 91 cases. Blood, v. 105, n. 3, p. 973–977, 28 set. 2004.

MESA, R. A.; TIBES, R. MPN blast phase: clinical challenge and assessing response. Leukemia research, v. 36, n. 12, p. 1496–1497, dez. 2012.

MEYER, T. et al. Activated STAT1 and STAT5 transcription factors in extramedullary hematopoietic tissue in a polycythemia vera patient carrying the JAK2 V617F mutation. International Journal of Hematology, v. 91, n. 1, p. 117–120, 16 dez. 2009.

MILOSEVIC, J. D. et al. Clinical significance of genetic aberrations in secondary acute myeloid leukemia. American Journal of Hematology, v. 87, n. 11, p. 1010–1016, nov. 2012.

MILOSEVIC, J. D.; KRALOVICS, R. Genetic and epigenetic alterations of myeloproliferative disorders. International Journal of Hematology, 12 dez. 2012.

MLECNIK, B. et al. Functional Network Pipeline Reveals Genetic Determinants Associated with in Situ Lymphocyte Proliferation and Survival of Cancer Patients. Science Translational Medicine, v. 6, n. 228, p. 228ra37–228ra37, 19 mar. 2014.

NAJEAN, Y.; RAIN, J. D. The very long-term evolution of polycythemia vera: an analysis of 318 patients initially treated by phlebotomy or 32P between 1969 and 1981. Seminars in hematology, v. 34, n. 1, p. 6–16, jan. 1997.

108

NAJFELD, V. et al. Exploring polycythaemia vera with fluorescence in situ hybridization: additional cryptic 9p is the most frequent abnormality detected*. British journal of haematology, v. 119, n. 2, p. 558–566, 2002.

NANGALIA, J. et al. Somatic CALR Mutations in Myeloproliferative Neoplasms with Nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine, v. 369, n. 25, p. 2391–2405, 19 dez. 2013a.

NANGALIA, J. et al. Somatic CALR Mutations in Myeloproliferative Neoplasms with Nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine, v. 369, n. 25, p. 2391–2405, 19 dez. 2013b.

NGUYEN, H. D.; BIELINSKY, A.-K. HDM2 ERKs PCNA. The Journal of cell biology, v. 190, n. 4, p. 487–489, 2010.

OHYASHIKI, K. et al. Uncontrolled thrombocytosis in polycythemia vera is a risk for thrombosis, regardless of JAK2V617F mutational status. Leukemia, v. 21, n. 12, p. 2544–2545, 2007.

OJHA, J. et al. Genomic Landscape and Clonal Heterogeneity Underlying Progression and Relapse In Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood, v. 122, p. abstract 2855, 2013.

OKU, S. et al. JAK2 V617F uses distinct signalling pathways to induce cell proliferation and neutrophil activation. British journal of haematology, v. 150, n. 3, p. 334–344, 2010.

PALANDRI, F. et al. JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia: correlation with clinical characteristics, response to therapy and long-term outcome in a cohort of 275 patients. Leukemia & lymphoma, v. 50, n. 2, p. 247–253, fev. 2009.

PANANI, A. D. Cytogenetic and molecular aspects of Philadelphia negative chronic myeloproliferative disorders: Clinical implications. Cancer Letters, v. 255, n. 1, p. 12–25, set. 2007.

PAPAEMMANUIL, E. et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. New England Journal of Medicine, v. 365, n. 15, p. 1384–1395, 2011.

PARDANANI, A. et al. Safety and efficacy of TG101348, a selective JAK2 inhibitor, in myelofibrosis. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology, v. 29, n. 7, p. 789–796, 1 mar. 2011.

PARDANANI, A. D. et al. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood, v. 108, n. 10, p. 3472–3476, 2006.

PARDANANI, A. D. et al. Results Of a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Phase III Study (JAKARTA) Of The JAK2-Selective Inhibitor Fedratinib (SAR302503) In Patients With Myelofibrosis (MF). Blood, v. 122, n. 21, p. abstract 393, 2013.

PASSAMONTI, F.; MAFFIOLI, M.; CARAMAZZA, D. New generation small-molecule inhibitors in myeloproliferative neoplasms. Current Opinion in Hematology, v. 19, n. 2, p. 117–123, mar. 2012.

PEMMARAJU, N. et al. The quantitative JAK2 V617F neutrophil allele burden does not correlate with thrombotic risk in essential thrombocytosis. Leukemia, v. 21, n. 10, p. 2210–2212, 2007.

PICH, A. et al. JAK2V617F mutation and allele burden are associated with distinct clinical and morphological subtypes in patients with essential thrombocythaemia. Journal of Clinical Pathology, v. 65, n. 10, p. 953–955, 20 jun. 2012.

109

PIKMAN, Y. et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Medicine, v. 3, n. 7, p. e270, jul. 2006.

QUENTMEIER, H. et al. JAK2 V617F tyrosine kinase mutation in cell lines derived from myeloproliferative disorders. Leukemia, v. 20, n. 3, p. 471–476, 2006a.

QUENTMEIER, H. et al. JAK2 V617F tyrosine kinase mutation in cell lines derived from myeloproliferative disorders. Leukemia, v. 20, n. 3, p. 471–476, 2006b.

QUESADA, V. et al. Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia. Nature Genetics, v. 44, n. 1, p. 47–52, 11 dez. 2011.

QUINTÁS-CARDAMA, A. et al. Janus kinase inhibitors for the treatment of myeloproliferative neoplasias and beyond. Nature Reviews. Drug Discovery, v. 10, n. 2, p. 127–140, fev. 2011.

R CORE TEAM. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2012.

RAMPAL, R. et al. Integrated genomic analysis illustrates the central role of JAK-STAT pathway activation in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Blood, 16 abr. 2014.

RAPADO, I. et al. High Resolution Melting Analysis for JAK2 Exon 14 and Exon 12 Mutations. The Journal of Molecular Diagnostics, v. 11, n. 2, p. 155–161, mar. 2009.

RAWLINGS, J. S.; ROSLER, K. M.; HARRISON, D. A. The JAK/STAT signaling pathway. Journal of cell science, v. 117, n. 8, p. 1281–1283, 2004.

RAYKHEL, I. et al. A molecular specificity code for the three mammalian KDEL receptors. The Journal of Cell Biology, v. 179, n. 6, p. 1193–1204, 17 dez. 2007.

REILLY, J. T. et al. Cytogenetic abnormalities and their prognostic significance in idiopathic myelofibrosis: a study of 106 cases. British journal of haematology, v. 98, n. 1, p. 96–102, jul. 1997.

RICKSTEN, A. et al. Rapid decline of JAK2V617F levels during hydroxyurea treatment in patients with polycythemia vera and essential thrombocythemia. Haematologica, v. 93, n. 8, p. 1260–1261, 2008.

ROCQUAIN, J. et al. Combined mutations of ASXL1, CBL, FLT3, IDH1, IDH2, JAK2, KRAS, NPM1, NRAS, RUNX1, TET2 and WT1 genes in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. BMC Cancer, v. 10, p. 401, 2010.

ROUSSEEUW, P. Silhouettes: A Graphical Aid to the Interpretation and Validation ofCluster Analysis. Journal of Computational and Applied Mathematics, v. 20, p. 53–65, 1987.

RUMI, E. et al. Identification of genomic aberrations associated with disease transformation by means of high-resolution SNP array analysis in patients with myeloproliferative neoplasm. American Journal of Hematology, v. 86, n. 12, p. 974–979, dez. 2011.

RUMI, E. et al. Acquired copy-neutral loss of heterozygosity of chromosome 1p as a molecular event associated with marrow fibrosis in MPL-mutated myeloproliferative neoplasms. Blood, v. 121, n. 21, p. 4388–4395, 10 abr. 2013.

SANTANA-DAVILA, R. et al. Chromosome 5q deletion: Specific diagnoses and cytogenetic details among 358 consecutive cases from a single institution. Leukemia Research, v. 32, n. 3, p. 407–411, mar. 2008a.

110

SANTANA-DAVILA, R. et al. Primary myelofibrosis is the most frequent myeloproliferative neoplasm associated with del(5q): Clinicopathologic comparison of del(5q)-positive and -negative cases. Leukemia Research, v. 32, n. 12, p. 1927–1930, dez. 2008b.

SANZ, A. et al. Analysis of Jak2 Catalytic Function by Peptide Microarrays: The Role of the JH2 Domain and V617F Mutation. PLoS ONE, v. 6, n. 4, p. e18522, 18 abr. 2011.

SCHNITTGER, S. et al. Report on two novel nucleotide exchanges in the JAK2 pseudokinase domain: D620E and E627E. Leukemia: Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, v. 20, n. 12, p. 2195–2197, dez. 2006.

SCHNITTGER, S. et al. Detection of JAK2 exon 12 mutations in 15 patients with JAK2V617F negative polycythemia vera. haematologica, v. 94, n. 3, p. 414–418, 2009.

SCHOOFS, T. et al. DNA methylation changes are a late event in acute promyelocytic leukemia and coincide with loss of transcription factor binding. Blood, v. 121, n. 1, p. 178–187, 3 jan. 2013.

SCOTT, L. M. Progenitors homozygous for the V617F mutation occur in most patients with polycythemia vera, but not essential thrombocythemia. Blood, v. 108, n. 7, p. 2435–2437, 1 out. 2006.

SCOTT, L. M. et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. The New England Journal of Medicine, v. 356, n. 5, p. 459–468, 1 fev. 2007.

SEKERES, M. A. et al. Time from diagnosis to treatment initiation predicts survival in younger, but not older, acute myeloid leukemia patients. Blood, v. 113, n. 1, p. 28–36, 1 jan. 2009.

SHEN, H.; LAIRD, P. W. Interplay between the Cancer Genome and Epigenome. Cell, v. 153, n. 1, p. 38–55, mar. 2013.

SHIH, L. Y.; LEE, C. T. Identification of masked polycythemia vera from patients with idiopathic marked thrombocytosis by endogenous erythroid colony assay. Blood, v. 83, n. 3, p. 744–748, 1 fev. 1994.

SPIVAK, J. L.; SILVER, R. T. The revised World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocytosis, and primary myelofibrosis: an alternative proposal. Blood, v. 112, n. 2, p. 231–239, 2008.

STARCZYNOWSKI, D. T. et al. Identification of miR-145 and miR-146a as mediators of the 5q– syndrome phenotype. Nature Medicine, v. 16, n. 1, p. 49–58, 8 nov. 2009.

STEENSMA, D. P.; TEFFERI, A. Cytogenetic and molecular genetic aspects of essential thrombocythemia. Acta haematologica, v. 108, n. 2, p. 55–65, 2002.

STEGELMANN, F. et al. High-resolution single-nucleotide polymorphism array-profiling in myeloproliferative neoplasms identifies novel genomic aberrations. Haematologica, v. 95, n. 4, p. 666–669, 16 dez. 2009.

STUART-SMITH, S. E. Are routine iron stains on bone marrow trephine biopsy specimens necessary? Journal of Clinical Pathology, v. 58, n. 3, p. 269–272, 1 mar. 2005.

TEFFERI, A. et al. Cytogenetic findings and their clinical relevance in myelofibrosis with myeloid metaplasia. British journal of haematology, v. 113, n. 3, p. 763–771, jun. 2001.

111

TEFFERI, A. et al. Prognostic diversity among cytogenetic abnormalities in myelofibrosis with myeloid metaplasia. Cancer, v. 104, n. 8, p. 1656–1660, 15 out. 2005.

TEFFERI, A. et al. The clinical phenotype of wild-type, heterozygous, and homozygous JAK2V617F in polycythemia vera. Cancer, v. 106, n. 3, p. 631–635, 1 fev. 2006.

TEFFERI, A. et al. Bone marrow JAK2V617F allele burden and clinical correlates in polycythemia vera. Leukemia, v. 21, n. 9, p. 2074–2075, set. 2007.

TEFFERI, A. et al. Low JAK2V617F allele burden in primary myelofibrosis, compared to either a higher allele burden or unmutated status, is associated with inferior overall and leukemia-free survival. Leukemia, v. 22, n. 4, p. 756–761, 24 jan. 2008.

TEFFERI, A. et al. Oligonucleotide array CGH studies in myeloproliferative neoplasms: Comparison with JAK2V617F mutational status and conventional chromosome analysis. Leukemia Research, v. 33, n. 5, p. 662–664, maio 2009.

TEFFERI, A. Polycythemia vera and essential thrombocythemia: 2013 update on diagnosis, risk-stratification, and management. American journal of hematology, v. 88, n. 6, p. 507–516, 2013a.

TEFFERI, A. Primary myelofibrosis: 2013 update on diagnosis, risk-stratification, and management. American journal of hematology, v. 88, n. 2, p. 141–150, 2013b.

TEFFERI, A. et al. An overview on CALR and CSF3R mutations and a proposal for revision of WHO diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms. Leukemia, 20 jan. 2014.

TEFFERI, A.; NOEL, P.; HANSON, C. A. Uses and Abuses of JAK2 and MPL Mutation Tests in Myeloproliferative Neoplasms. The Journal of Molecular Diagnostics, v. 13, n. 5, p. 461–466, set. 2011.

TEFFERI, A.; VARDIMAN, J. W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia, v. 22, n. 1, p. 14–22, 2007.

TEFFERI, A.; VARDIMAN, J. W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia: Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, v. 22, n. 1, p. 14–22, jan. 2008.

TEOFILI, L. et al. Different STAT-3 and STAT-5 phosphorylation discriminates among Ph-negative chronic myeloproliferative diseases and is independent of the V617F JAK-2 mutation. Blood, v. 110, n. 1, p. 354–359, 2007.

TESNIERE, A. et al. Molecular characteristics of immunogenic cancer cell death. Cell Death & Differentiation, v. 15, n. 1, p. 3–12, 2007.

THAM, K. T.; COUSAR, J. B. Combined silver Perls’s stain for differential staining of ringed sideroblasts and marrow iron. Journal of clinical pathology, v. 46, n. 8, p. 766–768, 1993.

THEOCHARIDES, A. et al. Leukemic blasts in transformed JAK2-V617F-positive myeloproliferative disorders are frequently negative for the JAK2-V617F mutation. Blood, v. 110, n. 1, p. 375–379, 15 mar. 2007.

112

THEOCHARIDES, A. et al. The allele burden of JAK2 mutations remains stable over several years in patients with myeloproliferative disorders. Haematologica, v. 93, n. 12, p. 1890–1893, 11 set. 2008.

THOENNISSEN, N. H. et al. Prevalence and prognostic impact of allelic imbalances associated with leukemic transformation of Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms. Blood, v. 115, n. 14, p. 2882–2890, 12 jan. 2010.

UGO, V. et al. Interlaboratory Development and Validation of a HRM Method Applied to the Detection of JAK2 Exon 12 Mutations in Polycythemia Vera Patients. PLoS ONE, v. 5, n. 1, p. e8893, 26 jan. 2010.

VALENTINO, L.; PIERRE, J. JAK/STAT signal transduction: regulators and implication in hematological malignancies. Biochemical pharmacology, v. 71, n. 6, p. 713–721, 2006.

VANNUCCHI, A. et al. Prospective identification of high-risk polycythemia vera patients based on JAK2V617F allele burden. Leukemia, v. 21, n. 9, p. 1952–1959, 2007a.

VANNUCCHI, A. M. et al. A quantitative assay for JAK2(V617F) mutation in myeloproliferative disorders by ARMS-PCR and capillary electrophoresis. Leukemia: Official Journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, v. 20, n. 6, p. 1055–1060, jun. 2006.

VANNUCCHI, A. M. et al. Clinical profile of homozygous JAK2 617V>F mutation in patients with polycythemia vera or essential thrombocythemia. Blood, v. 110, n. 3, p. 840–846, 19 abr. 2007b.

VANNUCCHI, A. M. et al. Clinical profile of homozygous JAK2 617V>F mutation in patients with polycythemia vera or essential thrombocythemia. Blood, v. 110, n. 3, p. 840–846, 19 abr. 2007c.

VANNUCCHI, A. M.; BIAMONTE, F. Epigenetics and mutations in chronic myeloproliferative neoplasms. Haematologica, 1 jan. 2011.

VARDIMAN, J. W. et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood, v. 114, n. 5, p. 937–951, 2009.

VERSTOVSEK, S. et al. Safety and efficacy of INCB018424, a JAK1 and JAK2 inhibitor, in myelofibrosis. New England Journal of Medicine, v. 363, n. 12, p. 1117–1127, 2010.

VERSTOVSEK, S. et al. A double-blind, placebo-controlled trial of ruxolitinib for myelofibrosis. New England Journal of Medicine, v. 366, n. 9, p. 799–807, 2012.

VERSTOVSEK, S. et al. A phase 2 study of ruxolitinib, an oral JAK1 and JAK2 inhibitor, in patients with advanced polycythemia vera who are refractory or intolerant to hydroxyurea: Ruxolitinib in Advanced Polycythemia Vera. Cancer, v. 120, n. 4, p. 513–520, 15 fev. 2014.

VISANI, G. et al. SNPs Array Karyotyping Reveals a Novel Recurrent 20p13 Amplification in Primary Myelofibrosis. PLoS ONE, v. 6, n. 11, p. e27560, 14 nov. 2011.

VOGELSTEIN, B. et al. Cancer Genome Landscapes. Science, v. 339, n. 6127, p. 1546–1558, 28 mar. 2013.

VOSO, M. T. et al. Mutations of epigenetic regulators and of the spliceosome machinery in therapy-related myeloid neoplasms and in acute leukemias evolved from chronic myeloproliferative diseases. Leukemia, v. 27, n. 4, p. 982–985, abr. 2013.

113

WAGNER, K. et al. Impact of IDH1 R132 Mutations and an IDH1 Single Nucleotide Polymorphism in Cytogenetically Normal Acute Myeloid Leukemia: SNP rs11554137 Is an Adverse Prognostic Factor. Journal of Clinical Oncology, v. 28, n. 14, p. 2356–2364, 5 abr. 2010.

WANG, L. et al. SF3B1 and other novel cancer genes in chronic lymphocytic leukemia. New England Journal of Medicine, v. 365, n. 26, p. 2497–2506, 2011.

WANG, L. et al. Whole-exome sequencing of polycythemia vera revealed novel driver genes and somatic mutation shared by T cells and granulocytes. Leukemia, v. 28, n. 4, p. 935–938, abr. 2014.

WANG, Z. et al. Pim-1: a serine/threonine kinase with a role in cell survival, proliferation, differentiation and tumorigenesis. Journal of Veterinary Science, v. 2, n. 3, p. 167–179, dez. 2001.

WARDROP, D.; STEENSMA, D. P. Is refractory anaemia with ring sideroblasts and thrombocytosis (RARS-T) a necessary or useful diagnostic category? British Journal of Haematology, v. 144, n. 6, p. 809–817, mar. 2009.

WEHRENS, R.; BUYDENS, L. Self- and Super-organising Maps in R: the kohonen package. J. Stat. Softw, v. 21, n. 5, 2007.

XAVIER, S. G. et al. Low prevalence of the JAK2V617F in patients with ischemic stroke or cerebral venous thrombosis. Blood coagulation & fibrinolysis: an international journal in haemostasis and thrombosis, v. 19, n. 5, p. 468–469, jul. 2008.

XAVIER, S. G. et al. JAK2V617F mutation in patients with splanchnic vein thrombosis. Digestive Diseases and Sciences, v. 55, n. 6, p. 1770–1777, jun. 2010.

XU, Y. M. et al. Extracellular Signal-Regulated Kinase 8-Mediated c-Jun Phosphorylation Increases Tumorigenesis of Human Colon Cancer. Cancer Research, v. 70, n. 8, p. 3218–3227, 14 abr. 2010.

YANG, S.-W. et al. The Distribution and Possible Role of ERK8 in Mouse Oocyte Meiotic Maturation and Early Embryo Cleavage. Microscopy and Microanalysis, v. 19, n. 01, p. 190–200, 28 jan. 2013.

YOSHIMURA, A. et al. Mouse oncostatin M: an immediate early gene induced by multiple cytokines through the JAK-STAT5 pathway. The EMBO Journal, v. 15, n. 5, p. 1055–1063, 1 mar. 1996.

ZALCBERG, I. R. et al. Hydroxyurea dose impacts hematologic parameters in polycythemia vera and essential thrombocythemia but does not appreciably affect JAK2-V617F allele burden. Haematologica, v. 96, n. 3, p. e18–20, mar. 2011.

ZHANG, S.-J. et al. Genetic analysis of patients with leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms shows recurrent SRSF2 mutations that are associated with adverse outcome. Blood, v. 119, n. 19, p. 4480–4485, 10 maio 2012.

ZHAO, R. et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. The Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 24, p. 22788–22792, 17 jun. 2005.

ZITVOGEL, L. et al. Immunological aspects of cancer chemotherapy. Nature Reviews Immunology, v. 8, n. 1, p. 59–73, jan. 2008.

114

115

9. Anexos

Anexo 1 – Tabela 1

valores de referência hemograma normal

Homens Mulheres Unidade

Hemacias 4,40 a 5,90 4,00 a 5,20 milhoes/mm3

Hemoglobina 13,0 a 18,0 12,0 a 16,0 g/dL

Hematocrito 40,0 a 54,0 36,0 a 48,0 %

% /mm3

Leucocitos: 4,0 a 11,0 mil/mm3

Basofilos: 0 a 1% 0 a 110 /mm3

Eosinofilos: 1 a 5% 40 a 550 /mm3

Bastoes: 1 a 7% 40 a 770 /mm3

Segmentados: 40 a 65% 1600 a 7150 /mm3

Linfocitos: 22 a 45% 880 a 4950 /mm3

Monocitos: 2 a 10% 80 a 1100 /mm3

Plaquetas 150 a 450 mil/mm3

SERIE VERMELHA

SERIE BRANCA

116

Anexo 2 – Carta de Aprovação CEP-INCa

117

Anexo 3 – Ficha Clínica

FICHA DE COLETA DE DADOS GRUPO DE PESQUISA JAK2

DADOS GERAIS

Nome:__________________________________________ Matrícula: ___________ Instituição: (1) INCA (2) HUCFF (3) HUPE (4) HUGG (5) HSRC-ES (6) HEMORIO (7) OUTRO: ________________________ Sexo: (0) Fem (1) Masc Data de nascimento: __ / __ / ____ Data de diagnóstico: __ / __ / ____ Município de origem: _____________________________ Estado de origem: _____ Profissão: ___________________________ Avaliação inicial? (0) Não (1) Sim

EXAMES AO DIAGNÓSTICO

Data: __ / __ / ____ Hemograma:

Hemoglobina

Hematócrito

RDW

Reticulócitos %

Leucócitos

Blastos %

Bastões %

Neutrófilos %

Eosinófilos %

Basófilos %

118

Linfócitos %

Monócitos %

Plaquetas

Coagulograma:

PTT-R

PT-RNI

Suspeita clínica: ___________________________

DADOS CLÍNICOS AO DIAGNÓSTICO

Peso (Kg): ____________ Febre: (0) Não (1) Sim Emagrecimento: (0) Não (1) Sim Perda de peso (kg): ____________ Hemorragia: (0) Não (1) Sim Local: _______________________ Trombose ao diagnóstico:(0) Não (1) Sim Local: _______________________ Parestesia ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Prurido ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Baço palpável ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Tamanho do baço à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fez US abdominal? Comprimento do baço ao US?(0) Não (1) Sim ______ cm Fígado palpável ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Tamanho do fígado à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCD e umbigo (3) Na FID ou além da linha média

119

EXAMES ESPECÍFICOS AO DIAGNÓSTICO

Saturação arterial de O2 ao ar ambiente ( ) Não realizado

Eritropoetina sérica ( ) Não realizado

Ferro sérico ( ) Não realizado

Ferritina sérica ( ) Não realizado

Vitamina B12 ( ) Não realizado

Ácido úrico ( ) Não realizado

LDH ( ) Não realizado

Cariótipo normal (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Cromossomo Filadélfia (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Rearranjo bcr-abl (0) Neg (1) Pos (-1) não realizado

Dacriocitose (HMG) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Leucoeritroblastose (HMG) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Diseritropoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Disgranulopoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Dismegacariocitopoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Blastos % (Mielo)

Fibrose (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Grau de fibrose (BMO) (0) (1) (2) (3) (4)

Hiperplasia eritróide (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Hiperplasia granulocítica (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Hiperplasia megacariocítica (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado

Diagnóstico final: ___________________________________ Outro diagnóstico final: ____________________________________

TRATAMENTO E COMPLICAÇÕES

Já recebeu tratamento específico anteriormente? (0) Não (1) Sim Tratamento 1: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 2: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 3: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 4: ________________________________ Início: __ / __ / ____ Tratamento 5: ________________________________ Início: __ / __ / ____

120

Ocorreu transformação leucêmica? (0) Não (1) Sim Evoluiu com neutropenia não-associada ao tratamento? (0) Não (1) Sim Evoluiu com trombocitopenia não-associada ao tratamento? (0) Não (1) Sim Evoluiu com trombose? (0) Não (1) Sim Evoluiu com sangramento? (0) Não (1) Sim

ÚLTIMOS EXAMES

Data do último exame: __ / __ / ____ Hemograma:

Hemoglobina

Hematócrito

RDW

Reticulócitos %

Leucócitos

Blastos %

Bastões %

Neutrófilos %

Eosinófilos %

Basófilos %

Linfócitos %

Monócitos %

Plaquetas

Coagulograma:

PTT-R

PT-RNI

SITUAÇÃO ATUAL

Peso (Kg) atual ____________ Febre: (0) Não (1) Sim Hemorragia: (0) Não (1) Sim Trombose: (0) Não (1) Sim

121

Baço palpável: (0) Não (1) Sim Tamanho do baço à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fez US abdominal? Comprimento do baço ao US?(0) Não (1) Sim ______ cm Fígado palpável: (0) Não (1) Sim Tamanho do fígado à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCD e umbigo (3) Na FID ou além da linha média Necessitando atualmente de transfusão de hemácias? (0) Não (1) Sim Necessitando atualmente de sangria terapêutica? (0) Não (1) Sim Em uso atualmente de aspirina? (0) Não (1) Sim Em uso atualmente de hidroxiuréia? (0) Não (1) Sim Qual a dosagem? ___________ Data de coleta da amostra para pesquisa de JAK-2: __ / __ / ____ JAKV617F qualitativo: (0) Neg (1) Pos JAK2 % (quantitativa): ____________ JAK2 12 (qualitativo): (0) Neg (1) Pos JAK2 14 (qualitativo): (0) Neg (1) Pos MPL (qualitativo): (0) Neg (1) Pos Ficha preenchida por: ______________________________________________ Data: __ / __ / ____

122

FICHA DE COLETA DE DADOS GRUPO DE PESQUISA JAK2

FICHA DE ACOMPANHAMENTO

DADOS GERAIS

Nome:______________________________________________ Matrícula: ___________ Instituição: (1) INCA (2) HUAP (3) HUPE (7) OUTRO: ________________________ Sexo: (0) Fem (1) Masc Diagnóstico: (1)PV (2)TE (3)MF (4)SMP/SMD (5)outro Qual?_______________

Data de consulta: ___/___/___

SITUAÇÃO CLÍNICA ATUAL

Hemorragia (0) Não (1) Sim

Trombose (0) Não (1) Sim

transformação leucêmica (0) Não (1) Sim

neutropenia associada ao tratamento (0) Não (1) Sim

trombocitopenia associada ao tratamento (0) Não (1) Sim

transfusão de hemácias (0) Não (1) Sim Transfusão de plaquetas (0) Não (1) Sim outros Qual?_____________ Baço palpável? (0) Não (1) Sim ______ cm

123

Tamanho do baço à palpação: (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fígado palpável: (0) Não (1) Sim (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média

TRATAMENTO

sangria terapêutica? (0) Não (1) Sim uso de aspirina? (0) Não (1) Sim Início: __ / __ / ____ Fim: __ / __ / ____ uso de hidroxiuréia? (0) Não (1) Sim Início: __ / __ / ____ Fim: __ / __ / ____ Outro tratamento? (0) Não (1) Sim Qual?_________________

Exame atual

Data: __ / __ / ____ Hemograma:

Hemoglobina

Hematócrito

eritroblasto

Reticulócitos %

Leucócitos

Blastos %

Bastões %

Neutrófilos %

Eosinófilos %

Basófilos %

Linfócitos %

Monócitos %

Plaquetas

124

Anexo 4 – Publicações relacionadas à tese

Publicação 1

Zalcberg IR, Ayres-Silva J, de Azevedo AM, Solza C, Daumas A, Bonamino M. Hydroxyurea

dose impacts hematologic parameters in polycythemia vera and essential thrombocythemia but

does not appreciably affect JAK2-V617F allele burden. Haematologica, v. 96, n. 3, p. e18–20, mar.

2011

125

Anexo 5 – Publicações relacionadas à tese

Publicação 2

Kaeda J, Bonamino M, Ayres-Silva J, Solza C, Ringel F, Blau O, Daumas A, Oberender C, Dörken

B, le Coutre P, Zalcberg I. JAK2 V617F allele burden quantified by real time quantitative polymerase

chain reaction and competitive polymerase chain reaction in patients with chronic

myeloproliferative neoplasia. Leukemia & lymphoma, v. 55, n. 1, p. 128–135, jan. 2014.

126

Anexo 6 - Manuscritos em preparo

1. Ayres-Silva, J.P.; Gouveia, M.E.; Praxedes, M.L.; Daumas, A.H.; Solza, C; Monte-Mor, B;

Bonamino, M.H.; Zalcberg, I.R.; Braggio, E. Genomic landscape of leucemogenesis in

myeloproliferative neoplasia

2. Ayres-Silva J.P; Monte-Mor, B; Coelho, A.C.; Bonamino, M.H.; Zalcberg, I.R. Study of CALR mutations in Brazilian Cohort (provisório)

127

Anexo 7 – Publicações em colaboração

1. Coutinho DF, Diniz C, Filgueiras RL, Baptista RL, Ayres-Silva JP, Monte-Mór BC, Bonamino MH, Zalcberg IR. Case Report A novel TET2 mutation in a patient with refractory cytopenia with multilineage dysplasia. Genetics and Molecular Research, v. 12, n. 4, p. 5858–5862, 2013.

2. Juhi Ojha, Jackline Ayres, Charla Secreto, Renee Tschumper, Kari Rabe, Daniel Van Dyke, Susan Slager, Tait Shanafelt, Rafael Fonseca, Neil Kay, Esteban Braggio

Deep sequencing identifies high genetic heterogeneity and recurrent convergent evolution in chronic lymphocytic leukemia

Será submetido à Blood ou Leukemia como Artigo completo. Manuscrito em preparo.

3. Dr. Juhi Ojha , Charla Secreto , Dr. Renee Tschumper, Ms. Kari Rabe , Jackline Ayres-

Silva, Dr. Daniel Van Dyke , Dr. Susan Slager , Dr. Rafael Fonseca , Dr. Tait SHANAFELT , Dr. Neil KAY. Monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL) is characterized by mutations in CLL putative driver genes and clonal competition many years prior to disease progression.

Submetido à Leukemia (JILL14-LEU-0231) como letter to the editor, aceito para publicação.

4. Dr. Brian O'Neill , Mr. Scott Van Wier , Dr. Juhi Ojha , Dr. Ellen Remstein McPhail , Dr. Yan Assmann , Dr. Jan Egan , Jackline Ayres-Silva , David Schiff , Dr. Beatriz Lopes , Mr. Paul Decker , Dr. Riccardo Valdez , Dr. Raoul Tibes , Bruce Eckloff , Dr. Thomas Witzig , Dr. A. Keith Stewart , Dr. Rafael Fonseca.

Genome-wide analysis uncovers novel recurrent alterations in primary central nervous system lymphomas

Submetido à Leukemia (14-LEU-0369R) como Original Article.

Documents

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ... · diagnóstico e da fase leucêmica, foram encontradas alterações cromossômicas identificadas por aCGH; Duas alterações