Upload
dokiet
View
224
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
3
AGRONOMSKI FAKULETE
SVUČILIŠTA U ZAGREBU
Tea Odak, dipl. ing.
MOLEKULARNO-BIOLOŠKA OBILJEŽJA ENDEMSKE
MEKOUSNE PASTRVE (SALMOTHYMUS
OBTUSIROSTIRS SALONITANA)
Magistarski rad
Zagreb, 2004.
4
1. UVOD
Hrvatska je u svjetskim ihtiološkim krugovima poznata po postojanju
brojnih endemskih vrsta i podvrsta riba (Economidis i Banarescu, 1991).
Razlog izuzetne specijacije slatkovodne ihtiofaune je postojanje dva velika
riječna sliva, dunavskog i jadranskog na relativno malom području, koji su u
Sloveniji međusobno odijeljeni Alpama, a u Hrvatskoj Dinaridima. Jadranski
sliv, sa pripadajućom površinom od 23800 km2 ubraja se među najmanja
ihtiofaunska područja ovog dijela Europe. Rijeke toga sliva znatno se
međusobno razlikuju po dužini toka i mjestu poniranja, (jezero, more ili kraške
rupe), a ako ih usporedimo s rijekama Dunavskoga sliva, uočavamo da su
izrazito kratke i izolirane (Mrakovčić i sur., 1995). Procesom specijacije u
njima su se razvile endemske riblje vrste i podvrste (ponajprije iz porodice
pastrva, Salmonidae te šaranki, Cyprinidae, ali i druge). Gotovo svaka rijeka
tog područja ima bar jednu endemsku vrstu. Iako su posljednjih godina vršena
su brojna istraživanja ihtiofaune (Popović, 1985; Bianco i Knežević, 1987;
Mrakovčić i Mišetić, 1989), postoji ipak određeni broj nedovoljno opisanih
vrsta, pa premda se brojni istraživači slažu da se radi o vrlo interesantnom
području (Lelek, 1989), mali se broj istraživača bavio ekologijom, biologijom,
taksonomijom i međuvrsnim odnosima riba. Za razliku od tropskog pojasa,
danas je rijetkost u Europi naći neku nepoznatu vrstu kralježnjaka. Pa ipak je
u Hrvatskoj još prije nekoliko godina otkrivena nova vrsta glavoča –
Knipowitichia mrakovcici (Mrakovčić i Kreovec, 1997).
Po nekim teorijama, baziranim na fosilnim i paleogeografskim
istraživanjima (Bianco, 1990; Snoj, 2001), endemi jadranskog sliva
predstavljaju ostatke populacija, izvedenih iz primarnih paratetskih riba, koje
su prodrijele u Jadransko područje prije pet milijuna godina, kada je cijelo
Sredozemno more bilo djelomično punjeno sa slatkom vodom iz Paratetisa.
Nakon invazije slane vode kroz Gibraltarski kanal, ribe u Jadranskom moru su
nestale, a preživjele su samo one koje su živjele u peri-Jadranskim prastarim
rijekama. Te ribe su kasnije bivale ugrožene sa nekoliko ledenih doba. Upravo
5
njihova dugotrajana izoliranost uzrokovala je formiranje nekoliko različitih
homogenih populacija.
Mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostris salonitana) je endemska
pastrva sa izvornim staništem u rijeci Jadro, pokraj Splita. Naknadno je dio
populacije prebačen i u rijeku Žrnovnicu, te danas ona i tamo obitava. Spada
u porodicu Salmonidae. Kao i ostale podvrste roda Salmothymus (S. o.
oxyrhynchus, S. o. krkensis i S. o. zetensis), ograničena je na usko područje
rasprostranjenja, te i najmanji utjecaji na njeno stanište imaju znatno
djelovanje na malu populaciju. U rijekama gdje uz mekousnu pastrvu živi i
potočna pastrva javlja se problem mogućeg križanja između dviju vrsta i
nastanak hibrida.
Prepoznati hibride između potočne i mekousne pastrve vrlo je teško,
stoga su uz morfološke korištene i molekularne metode razlikovanja
populacija.
Kod endemske mekousne pastrve solinke (Salmothymus obtusirostris
salonitana) evolucijska povijest, klasifikacija i filogenetsko mjesto u skupini
salmonida nisu još određeni. Također još nije jasno utvrđeno da li se solinka
križa sa potočnom pastrvom (Salmo trutta), te ako da, da li to ugrožava
njezino postojanje. Stoga je osnovni cilj ovoga rada bio odrediti molekularno
genetsku strukturu solinke te na taj način odgovoriti na gore navedena pitanja.
Pri tome ćemo uz klasične morfološke metode koristiti dva tipa molekularnih
metoda – analizu mitohondrijske i nuklearne DNA (mikrosateliti i gen za laktat
dehidrogenazu). Mitohondrijska DNA, koja je radi strukturalne jednostavnosti
genoma, hipervarijabilnih regija, homozigotnosti i drugih svojstava jedan od
najprimjenjenijih alata za molekularno genetske i populacijske studije, te
mikrosatelitska DNA, koja radi svoje lokusne specifične hipervarijabilnosti
predstavlja odličan molekularni alat, s kojim je moguće utvrditi razlike na nivou
roda, ali i nižih taksonomskih jedinca da bismo što potpunije ispitali
podudaranje evolucijske dinamike mitohondrijske i nuklearne DNA.
6
1.1. PREGLED LITERATURE
1.1.1. Općenito o Salmonidima
Porodica Salmonidae pripada u red Salmoniformes, koji spada u grupu
primitivnih Euteleostei. Red Salmoniformes sastoji se od dva podreda:
Osmeroidei i Salmonoidei.
Vrste podreda Osmeroidi razvrstane su u šest porodica, a
rasprostranjene su u sjevernim dijelovima Atlantskog i Tihog oceana. Žive u
priobalnim zonama, odakle za vrijeme mrijesta ulaze u rijeke. U nekim
dijelovima areala dostižu veliku brojnost, pa čine ekonomski važne ribe.
Salmonidi su karakteristični za sjevernu Zemljinu hemisferu. Nalazimo
ih u morima i rijekama Europe, sjeverne i zapadne Azije, sjeverne Amerike i
Afrike. Radi njihove ekonomske i športske vrijednosti introducirane su i u vode
južne Amerike, Novog Zelanda i Australije (Wheeler, 1992).
Sistematika Salmonidae prema Stearley i Smith (1993).
Red: Salmoniformes
Podred: Salmonoidei
Porodica: Salmonidae Regan, 1914
Podporodica: Coregoninae (ozimice)
Podporodica: Thymallinae (lipljani)
Podporodica: Salmoninae
Rod: Brachymystax
Rod: Platisalmo
Rod: Salmothymus
Vrsta: Salmothymus obtusirostris (mekousne pastrve)
Rod: Acantholingua
Rod: Hucho (mladice)
Rod: Salvelinus (zlatovčice)
Rod: Oncorhynchus (pacifički lososi i pacifičke pastrve)
Rod: Salmo
Vrsta: Salmo salar (atlantski losos)
Vrsta: Salmo trutta (pastrva)
7
Slika 1: Shematski odnos između rodova Salmonidae (Glubokovsky, 1995)
Podred Salmonoidei uključuje anadromne grupe, koje veći dio životnog
ciklusa provode u morima, sa spektakularnim migracijama u slatke vode za
vrijeme mrijesta. Zavičajno ponašanje je jako izraženo. Kod anadromnih
slatkovodnih riba primarna se metamorfoza događa za vrijeme nizvodnih
migracija, a sekundarna tijekom uzvodnih migracija pred period mrijesta. Kod
pripadnika roda Salmo dolazi do regresivne metamorfoze, odnosno do
gubljenja morfoloških karakteristika nastalih sekundarnom metamorfozom
tijekom njihovih nizvodnih migracija nakon reprodukcije. Ciklus morfoloških
promjena događa se svaki put u vrijeme mrijesta (Saunders i Schom, 1985).
Prema postojećoj klasifikaciji, podporodica Salmoninae, uz
podporodice ozimica (Coregoninae) i lipljena (Thymallinae) sačinjava
porodicu Salmonidae. Prema njihovoj morfologiji Coregoninae i Thymallinae
su evolucijski jako stare, dok su Salmoninae napredniji i noviji oblici.
Paleontološki dokazi ukazuju na pojavljivanje salmonidnih vrsta u periodu
kasnog tercijara, u epohi pliocena, dok su u pleistocenu već široko
rasprostranjene. Njihovi su preci pripadali redu sleđovki (Clupeiformes),
(Smith i sur., 1982). Mnogi se znanstvenici slažu da Salmonidae potječu iz
slatkih voda (Neave, 1958; Vladykov, 1963), iako postoje i oni koji vjeruju u
njihovo prvotno morsko stanište (Schmidt, 1947). Brojne studije o porijeklu
Salmonidae bave se filogenetskim odnosima između rodova, oslanjajući se
8
pritom na morfološke (Janković, 1961; Delling i sur., 2000), kariološke
(Svärdson, 1945; Simon, 1963) i genetske (Giuffra i sur., 1996; Bernatchez,
2001) podatke, pri čemu su sastavljena različita filogenetska stabla. Međutim,
gotovo svi se slažu da su rodovi Salmo i Oncorhynchus evolucijski
najnapredniji i najbolje proučeni (Domanico i sur, 1997), dok je mjesto ostalih
rodova još pod znakom pitanja (npr. Platysalmo, Acantholingua,
Salmothymus), (Osinov, 1999).
Složena sistematika porodice Samonidae pripisuje se njihovoj izuzetnoj
sposobnosti adaptacije koja je proizašla nakon tetraploidnog događaja, koji se
zbio kod njihova pretka prije 50 do 100 miliuna godina (Allendorf i Thorgaard,
1984). Tezu da Salmonidae imaju poliploidno porijeklo, prvi je propagirao
Svardson 1945. godine. On je promatrao kromosomski broj salmonidnih vrsta
i utvrdio njegovo opadanje u umnošku sa 10. Tek kasnije, 1970. godine Ohno
predlaže konkretne dokaze tezi da Salmonidae imaju tetraploidno porijeklo, a
to su:
- Količina DNA u stanici Salmonidae je 80% veća od količine DNA koju
nalazimo u sisavaca, a to je gotovo dvostruko više od DNA u
stanicama drugih srodnih riba.
- Salmonidae imaju obično oko 100 kromosoma što je gotovo dvaput
više od drugih srodnih riba.
- Multivalentnost je često nađena u mejotičkim preparatima od nekoliko
salmonidnih vrsta.
- Salmonidae nose velik broj dupliciranih enzimskih lokusa.
Slika 2: Područje rasprostranjenosti porodice Salmondiae (Maitland, 1995)
9
Osnovna obilježja koja su zajednička za vrste ove porodice su:
- sitna masna peraja na leđima, iza leđne peraje
- kratka leđna peraja
- čitavo tijelo, izuzev glave, pokriveno sitnim ljuskama
- dodatna kost na gornjo-viličnoj kosti
- velika usta
- šiljasti zubi, osim na čeljustima, koji su prošireni i na jezik
- izražena bočna linija
- velik broj piloričkih nastavaka (između 17 i 210)
- veliki riblji mjehur
- ribolovno su interesantne
- mrijeste se u slatkoj vodi (Vuković i Ivanović, 1971)
Sve salmonidne vrste riba obitavaju isključivo u hladnim, bistrim i
nezagađenim potocima, rječicama ili rijekama brzog toka, koje su bogate
otopljenim kisikom, ili u planinskim jezerima gdje se temperatura vode kreće
oko 10oC i koja, ni u najtoplije doba godine ne prelaze 18oC ili 20oC. To su
sve reofilne vrste riba, vretenastog oblika tijela, prilagođenog životu u brzim
riječnim tokovima.
Salmonidae su izraziti predatori, jedu živu hranu, stoga im je želudac
prilagođen probavi hrane animalnog porijekla, širok je i mišićav.
Sazrijevanje gonada riba iz ove porodice nastupa u kasnim jesenskim
danima, od studenog do prosinca. Izuzetak su mladica (Hucho hucho) i
mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostis) koje se mrijeste u proljeće
(ožujak – travanj). Relativna plodnost kod salmondinih vrsta riba je poprilično
mala, kod potočne pastrve se kreće oko 1500 jaja, a kod mladice oko 12 000
jaja na 1 kg tjelesne težine (Aganović, 1979).
Salmonidae su slatkovodne ribe, no mnoge od njih imaju hranidbene
migracije u more, a u slatke vode se vraćaju kada su zrele za mrijest. Nagon
odlaska u more nakon izvaljivanja više je izražen na sjeveru. Stoga svi
salmonidi arktičkih rijeka migriraju u more, dok se oni sa južnih predjela
ograničeni na slatke vode. Mnoge od tih južnih populacija je ograničavaju su
na jezera i rijeke, koje su kolonizirale tijekom perioda širenja polarnog leda, a
10
u kojima su ostale zarobljene podizanjem temperature mora. Živeći u tim
staništima tisućama godina znatno su promijenile svoj izgled i ponašanje.
Razlike u njihovim staništima uvjetovale su veliku fenotipsku različitost i
genetsku izolaciju odvojenih populacija. Stoga je sistematika porodice
Salmonidae izuzetno složena. Više od pedeset različitih vrsta opisano je kroz
prošla dva stoljeća, u kojima danas prepoznajemo samo jednu, Salmo trutta
(Behnke, 1986). Utvrđivanje točnog filogenetskog odnosa unutar porodice
Salmonidae je vrlo važno pri njihovoj zaštiti, budući da se mnoge vrste unutar
ove porodice smatraju ugroženima (Crivelli, 1996). Kod prijašnjih klasifikacija,
koje su se bazirale uglavnom na morfološkim i ekološkim karakteristikama,
uočene su brojne nepravilnosti. Kod nekih rodova (Oncorhynchus, Salmo,
Salvelinus, Brachymystax i Hucho) klasifikacija je obnovljena zahvaljujući
molekularnim metodama (Phillips i Oakley, 1997).
POTOČNA PASTRVA – Salmo trutta, Linnaeus 1758
Potočnu pastrvu kao autohtonu vrstu nalazimo na širokom području od
Europe i Azije do Sjeverne Amerike. Rasprostranjena je od sjevera Norveške
do sjeverno-istočnog dijela Rusije te južno do Atlas gorja u sjevernoj Africi.
Sastoji se od brojnih, udaljenih geografskih oblika, velike fenotipske
različitosti. Osnovna karakteristika pastrve je vretenasto, izduženo tijelo.
Odličan je i brz plivač. Na trupu ispod i iznad bočne linije nalaze se
mnogobrojne crne točke. Na glavi su izražena velika usta u kojima su zubi
raspoređeni u dva reda koje zadržava tijekom cijelog života. Gornja vilica
doseže do zadnjeg oboda oka. Na prvom škržnom luku ima od 18 do 24
branhiospina, a broj piloričkih nastavaka varira od 40 do 100. Diploidni broj
kromosoma iznosi 84, uz znatno variranje u intraspecijskim formama.
Za vrijeme mrijesta izražen je spolni dimorfizam. Ženke imaju zaobljen
trbuh i crveno nabubren spolni otvor. Mrijesti se krajem jeseni i početkom
zime od studenog do siječnja. Ikru odlaže na kamenitom dnu sa brzim tokom
vode. Dijametar jaja je veliki i iznosi od 4,5 do 5 mm. Inkubacijski period je
ovisan o temperaturi vode, od 60 do 90 dana. Ličinke izvaljene u siječnju ili
veljači imaju veliku žumanjčanu vrečicu, koja im omogućuje ishranu, ali im
11
istovremeno otežava kretanje. Aktivan život ličinki započinje trošenjem
žumanjčane vrečice na 1/3 njene veličine. Početkom jeseni, kad mlađ
dosegnu dužinu od oko 10 cm, seli se nizvodno u mirnije vode u potrazi za
hranom. Spolna zrelost nastupa sa 2 do 3 godine starosti. U prvoj godini
pastrva naraste od 10 do 14 cm. Tada nosi tzv. mladenačko ruho, obilježeno
sa desetak crnih vertikalnih mrlja na bokovima tijela. Daljnjim rastom ova
obilježja se gube.
Pastrva se hrani različitim organizmima: ribama, ličinkama vodenih
insekata, ikrom dugih riba, kukcima koji lete nad vodom i padaju na njenu
površinu, račićima i drugim beskralježnjacima.
Pastrva naseljava hladne vode u gornjim tokovima rijeka umjereno
kontinentalne klime, iako je nalazimo i u ravničarskim rijekama borealne zone,
i jezerima sa čistom, hladnom vodom sjeverne hemisfere. Izuzetno je
prilagodljiva na različite uvjete staništa, a prilagodljivost se odražava i u
različitim morfološkim oblicima, (Wheeler, 1992). Postoje tri različita ekološka
oblika pastrva:
Potočni oblik – Salmo trutta m. fario
Jezerski oblik – Salmo trutta m. lacustris
Morski oblik – Salmo trutta m. trutta
Potočna i jezerska pastrva stalno žive u slatkoj vodi. Jezerska pastrva
radi boljih uvjeta staništa dosta je krupnija od potočne. Lako se razlikuje od
nje i po tome što joj je tijelo prekriveno nepravilnim crnim točkama dok crvenih
točaka obično nema, a ako one i postoje imaju oblik slova x. Jezerske
pastrve, u jesen, za vrijeme mrijesta, odlaze iz jezera u rijeke, da bi se kasnije
ponovno vratile u jezera. Morski oblici pastrva vale se u slatkim vodama, no
odmah po izvaljenju migriraju u mora, gdje žive do spolne zrelosti, kada
odlaze na mrijest u rijeke ili jezera (Treer i sur., 1995).
Vanjski izgled tih triju tipova ponajprije ovisi o okolišu, u kojem riba živi,
jer ako bi mlađ potočne pastrve stavili u jezero, ona bi pridobila vanjski izgled
jezerskog tipa pastrve i obrnuto. Bernatchez i suradnici (1992) su promatrali
mtDNA sekvence triju različitih ekoloških oblika i nisu uočili signifikantne
12
razlike. Stoga su zaključili da se izvor različitih ekoloških oblika ne temelji na
njihovom zajedničkom pretku, već na zajedničkom okolišu.
Slika 3: Potočna pastrva iz rijeke Krke (foto Odak)
Genetskim analizama pastrva iz različitih dijelova Europe, uočeno je,
da pastrve određenog geografskog područja imaju zajedničke osobine i na
genetskom nivou, (Bernatchez, 2001). Na taj način uočeno je pet različitih
grupa pastrva vezanih za određena geografska područja, odnosno za
osnovne riječne slivove u Europi. Izdvojeno je pet samostalnih jedinica,
filogenetskih grupa, odnosno geografskih linija:
- atlantska linija
- dunavska ili crnomorska linija
- sredozemna linija
- jadranska linija
- marmoratus linija
Bernatchez i suradnici (1992) pokušavajući utvrditi složene filogenetske
odnose među udaljenim populacijama služe se teorijom molekularnog sata,
gdje razlika u sekvencama od 2% označava period od milijun godina (Brown i
sur., 1979).
Prije približno 10 milijuna godina, iz zajedničkog pretka došlo je do
nastanka dviju vrsta: lososa (Salmo salar) i pastrve (Salmo trutta).
Razdvajanje pastrva prema filogenetskim linijama od zajedničkog pretka zbilo
se prije 2,5 milijuna godina. Prvo se, prije 2,5 milijuna godina, iz jedinstvene
vrste pastrva odcijepila atlantska linija, a kasnije, kroz oko milijun godina (već
13
u ledenom dobu) formirale su se još dvije nove grupe: dunavska i jadransko-
mediteranska. Kasnije, radi burnih geomorfoloških zbivanja u ledenom dobu,
nastale su još tri linije: mediteranska, jadranska i linija marmoratus. Predviđa
se, da je staništa jadranskog sliva prvo naselila jadranska linija potočne
pastrve, a kasnije se na tom području pojavila i glavatica, odnosno linija
marmoratus. U vrijeme hladnijih intervala ledenog doba, radi nastanka velikih
količina leda, nivo mora spustio se čak za više od 150 metara. Posljedica
sniženja nivoa mora bilo je i povezivanje rijeka, koje su se ranije izlijevale
direktno u more. Upravo je to omogućilo ribama, da nesmetano migriraju iz
jedne rijeke u drugu (Bianco, 1990; Bernatchez, 2001).
Svaka linija ima neka zajednička morfološka obilježja. Za atlantsku
liniju karakteristična je crna pigmentacija, koja znatno prevladava nad
crvenom, i nalazi se pretežno na prsnom dijelu (Giuffra i sur., 1996).
Dunavska linija ima jednoliko zastupljene crne i crvene točke, koje su
jednakomjerno raspoređene po cijelom tijelu. Karakteristične osobine
vanjskog izgleda jadransko-mediteranske linije su četiri šira tamna pojasa u
obliku obruča oko tijela. Jedan se pojas nalazi na glavi, dva na trupu i jedan
na repu. Kod nekih primjeraka pojasi su jače izraženi, a kod nekih slabije. Za
jadransko-mediteransku liniju pastrva karakteristična je još i sitna, crno -
crvena pigmentacija. Linija marmoratus odnosi se na glavaticu, koja naseljava
isto područje kao i linija jadranskih pastrva.
MEKOUSNA PASTRVA (Salmothymus obtusirostris Heckel, 1851.)
Mekousna pastrva je zasigurno jedna od najintrigantnijih vrsta, čija je
klasifikacija pobuđivala pozornost znanstvenika od pionirskih studija do
današnjih dana. Uvrštavamo je u rod Salmothymus, u koji spada samo jedna
vrsta – monofiletski rod. Mekousna pastrva ima četiri podvrste koje su
endemične za srednji i južni jadranski sliv. Karakterizira je neobična sličnost
sa oboje, lipljenom i pastrvom. Osim morfološke sličnosti sa lipljenom,
naročito u području trupa, sa njim dijeli i neka druga obilježja; zauzimaju ista
staništa, imaju slične hranidbene navike, obje vrste žive u jatima i mrijeste se
u proljeće. Međutim, lipljen nikada nije bio autohton na područjima gdje
14
nalazimo mekousnu pastrvu, već je tamo naknadno unesen. Njihova izrazita
sličnost može se objasniti u sličnosti staništa koje su naselili u prošlosti i njima
se prilagodili (Snoj i sur. 2002b). Radi specifičnog izgleda mekousnu pastrvu
nazivaju reliktom ostatkom davne zemljine prošlosti, posjeduje veći broj
"primitivnih" obilježja – pleistomorfi (kratke čeljusti, mala usta, kratki zubi i
spada u obligatorne slatkovodne ribe).
Izdvojene su četiri podvrste mekousne pastrve:
Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882.
Salmothymus obtusirostris salonitana Karaman, 1926.
Salmothymus obtusirostris krkensis Karaman, 1926.
Salmothymus obtusirostris zetensis Karaman, 1932.
Slika 4: Područje rasprostranjenja četiri podvrste mekousne pastrve (Snoj,
2003)
15
Zajedničke karakteristike podvrsta mekousne pastrve su:
- malene ljuske
- zlatni sjaj tijela
- mala usta sa mesnatim usnama
- kratke čeljusti
- sitni zubi
- želudac sa velikim brojem piloričkih nastavaka (48 – 91)
- guste tamne točke iza škrga sve do leđne peraje
- rijetko raspoređene crvene točke koje dopiru do kraja tijela
- peraje nisu pigmentirane, izuzev leđne peraje
- proljetni mrijest
Salmothymus obtusirostris salonitana Karaman, 1926.
Podvrsta mekousne pastrve ″solinka″ (S. o. salonitana) naseljava
kratke kraške rijeke Jadro i Žrnovnicu, koje se ulijevaju u more u blizini grada
Splita. Ukupna duljina Jadra je 4,5 km. Iako se vodom iz rijeke Jadro
opskrbljuje grad Split i njegova okolica, područje sliva te rijeke izuzetno je
podložno onečišćenju. Žrnovnica je kratka, kraška rijeka, dužine toka od
svega 5,3 km (Štambuk-Giljanovic, 2002). Prije izgradnje brane kod
Prančevića rijeka Žrnovnica nije imala je stalan tok. Za vrijeme ljetnih mjeseci
rijeka je presušivala, pa stoga ihtiofaune u njoj nije bilo. Kad je prije 25
godina, brana izgrađena, rijeka je dobila stalan tok. Tada su prof. Pažur sa
Agronomskog fakulteta i gosp. Ritterman, vlasnik obližnjeg ribogojilišta,
prenijeli dio populacije mekousne pastrve iz rijeke Jadro u rijeku Žrnovnicu.
Danas je Žrnovnica postala pogodna i za druge vrste riba, pa uz mekousnu
pastrvu nalazimo kalifornijsku pastrvu i jegulje. Treer i suradnici (2003a;
2003b) proučavali su rast i kondiciju mekousne pastrve u rijekama Žrnovnici i
Jadru. Zaključili su da ona ima dobar rast u oba staništa, no bolji rast ipak
pokazuje u rijeci Žrnovnici. Naglašavaju da se translokacija u novo stanište u
ovom slučaju pokazala kao dobar postupak za zaštitu ove ugrožene vrste.
16
Djelomično slabiji rast u rijeci Jadro objašnjavaju time što je Jadro znatno više
pod utjecajem čovjeka, od vodnih regulacija do izuzetne naseljenosti uz rijeku.
Osim toga u rijeci Jadro postoji mnogo veća vrsna kompeticija.
Mekousnu pastrvu karakterizira zaobljena njuška, usta su joj mala i
mesnata, a gornjovilične kosti su i kratke i široke. Kao i druge podvrste, ima
velik broj piloričkih nastavaka, do 81. Leđa su sivkasto-žuta bez točaka, crne
točke se nalaze samo na prednjem dijelu tijela, a crvene se pružaju po
čitavom tijelu. Peraje su bez točki, a dok jedino na leđnoj nalazimo. Broj žbica
u perajama je D IV 11, a IV 9, V II 8, P I 12, C 19. Živi u mirnim tokovima
rijeka. Hrani se gamarusima, malim puževima i insektima (Vuković i Ivanović,
1971). Mrijesti se u ožujku. Na osnovu podataka o kondiciji dobivenih pri kraju
perioda mrijesta, Treer i sur. (2003a) su zaključili da je početak mrijesta
mekousne pastrve u Žrnovnici u trećoj, a puni mrijest u četvrtoj godini života.
Slika 5: Mekousna pastrva ″solinka″ (S. o. salonitana) iz rijeke Jadro (foto
Odak)
17
Salmothymus obtusirostris krkensis Karaman, 1926.
Mekousna pastrva, ″zlousta″ endem je rijeke Krke. Krka spada među
najljepše rijeke u Hrvatskoj, nacionalnim parkom proglašen je 1985. godine.
Izvire podno slapa Krčića, pokraj grada Knina. Do spajanja s morem duga je
72 km. Kvaliteta vode varira od prve pa sve od četvrte kategorije koju
nalazimo u području grada Knina.
Mekousna pastva u rijeci Krki odlikuje se jakom, tupom i kratkom
njuškom na kojoj su smještena mala usta. Gornja vilica joj je kraća i šira nego
donja, pa ne doseže ni do sredine oka. Tijelo joj je srebrnaste boje, posuto sa
crvenim i crnim točkama. Crne točke su sitnije od crvenih koje su rasute po
čitavom tijelu. Za vrijeme mrijesta u proljeće, točke su prisutne i na leđnoj
peraji, dok su ostale peraje bez pjega. ″Zlousta″ živi u otvorenom dijelu rijeke i
nikada se na skriva pod kamenjem. Kao i ostale mekousne pastrve mrijesti se
u proljeće, na krupnijem pijesku. Hrani se pretežno kukcima s površine vode
(Vuković i Ivanović, 1971).
Slika 6: Mekousna pastrva ″zlousta″ (S. o. krkensis), (foto Schöffman)
18
Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882
Neretvansku pastrvu danas nalazimo u rijeci Neretvi i njenim pritocima
Buni, Rami, Rakitnici. Nekada je u rijeci Buni mekousna pastrva sačinjavala
99% svih salmonida (Taler, 1952), no danas je ovdje, vrlo ugrožena kao i u
ostalim staništima. U Hrvatskoj je nalazimo u maloj rječici Vrljici pokraj
Imotskog, čiji je izvorišni dio 1971. godine proglašen ihtiološkim rezervatom.
Mekousnu pastrvu lako prepoznajemo po karakterističnom obliku glave
i ispupčenim lubanjskim kostima oko očiju. Njuška joj je izdužena, a usta
mala, mesnata i mekana, sa zubima koji su poprilično pokriveni odebljalom
kožom. Gornjovilična kost dopire do polovine oka. Boja tijela je maslinasta, po
bokovima se preklapaju crne i narančaste točke. Crvene točke su vrlo rijetke
(Vuković i Ivanović, 1971).
Neretvanska mekousna pastrva živi u otvorenim tokovima rijeka, češće
se zadržava na mirnim, dubljim mjestima, a rjeđe u brzacima i bukovima.
Mrijesti se u travnju i svibnju. Mužjaci postaju spolno zreli u četvrtoj odnosno
petoj godini, a ženke nešto kasnije (od pete do sedme godine). Tada ženke
kopaju gnijezda na dubini od 34 cm do 1,4 m, a mužjaci ih čuvaju. Optimalna
temperatura vode za mrijest je od 9,3 do 10,10C. Kosorić i suradnici (1969) su
ispitivali mogućnost umjetne hibridizacije ove vrste, pri tome naglašavaju
optimalnu temperaturu (100C) za umjetni mrijest, pri kojoj je postotak
oplođene ikre najveći.
Usporedbom mekousne pastrve iz Bune sa mekousnim pastrvama
dalmatinskih voda, uočene su mnoga zajednička obilježja, ali i znatan broj
razlika u morfološkim obilježjima, što ukazuje na njihovo zajedničko srodstvo,
ali i na posljedice prostorne i ekološke izolacije.
Slika 7: Neretvanska mekousna pastrva (S. o. oxyrhynchus), (foto Pleško)
19
Salmothymus obtusirostris zetensis Karaman, 1932.
Mekousna pastrva je najugroženija riblja vrsta u Crnoj Gori, naseljava
usko područje od svega 50 km dužine donjeg toka rijeke Zete, kao i njen
zapadni pritok, rijeku Moraču (Marić, 1995).
Rod Salmothymus je monofiletski rod s vrstom mekousnom pastrvom
koja je prema staništu podijeljena u četiri podvrste. Brojni autori su imali
različita mišljenja o odnosima te četiri podvrste.
Mekousna pastrva prvi put je opisana u rijekama Jadru i Vrljici (Heckel,
1851), kao Salar obtusirostris. Steindachner (1882) opisuje mekousnu pastrvu
u rijeci Neretvi, koju radi sličnosti s lipljenom, uvrštava u rod Thymallus, kao
Thymallus microlepis. Kasnije uviđa da se tu radi o rodu Salmo, te mekousna
pastrva iz Neretve dobiva novo ime Trutta obtusirostirs oxyrhnchus po
karakterističnoj šiljatoj njušci. Steindachner također ukazuje na njezinu
sličnost s vrstom Coregonus oxyrhynchus.
Berg (1908) prvi ujedinjuje mekousne pastve u jedan rod
Salmothymus. U rod Salmothymus uvrštena je i endemska pastrva iz
Ohridskog jezera u Makedoniji, belvica Acantholingua (Salmo) ohridana.
Steindachner (1892) je prvi opisao belvicu.
Proučavajući morfološka i ekološka obilježja mekousne pastrve iz
Bune, Janković (1961) ih je usporedila endemskim pastrvama Ohridskog
jezera, letnicom (Salmo letnica Karaman, 1924) i belvicom (Acantholingua
(Salmo) ohridanus Steindacher, 1892). Ona pretpostavlja da su vrste iz
Ohridskog jezera nekada bile u bliskom srodstvu sa vrstama iz dalmatinskih
voda. Međutim, nakon duge odvojenosti, te su vrste dobile posebne
morfološke i ekološke odlike po kojima se danas jasno razlikuju. Stearley i
Smith (1993) na osnovu osteoloških mjerenja tvrde da su S. obtusirostris i A.
ohridanus pripadnici istog roda Salmothymus, pa u taj rod smještaju i vrste
Salmo ishchan i Salmo carpio. Hadžišće (1961) smatra da prema morfološkim
karakteristikama belvica ipak spada u rod Acantholingua. Međutim, nakon
molekularnih analiza (Oakley i Phillips, 1999) za belvicu je utvrđeno da
pripada rodu Salmo. To su potvrdili i Snoj i sur. (2002b), uspoređujući
20
sekvence kontrolne regije i citokroma b sa mtDNA i dijela LDH C*1 gena sa
nuklearne DNA molekule.
Uspoređujući morfološka obilježja mekousne pastrve iz Jadra s onima
iz Bune Heckel i Kner (1857) su uočili značajne razlike u dužini njuške i
sličnosti u dužini gornje vilice (dopire do polovine oka). Broj žbica u svim
perajama je jednak, međutim zapazili su veći broj ljuski u bočnoj liniji kod
mekousne pastrve iz rijeke Bune. Morfološke karakteristike i ponašanje
mekousne pastrve iz Jadra, Krke i Neretve opisao je Karaman (1927). Behnke
(1968) smatra da se Karamanovo poimanje vrste kosi s modernim
taksonomskim pogledima, te da je potrebno napraviti reviziju njegova rada.
Karaman je prvi opisao mekousnu pastrvu u rijeci Zeti koju je nazvao
Trutta obtusirostris, smatrajući da se radi o formi mekousne pastrve koja
obitava u Ohridskom jezeru u Makedoniji Salmo letnica Kraman, 1924. Svoju
tvrdnju Karaman je objasnio time što je Skradarsko jezero, kojemu je rijeka
Zeta pritok, povezano rijekom Bojanom s donjim dijelom rijeke Drima koji je
pritok Ohridskog jezera. Hadžišće je 1962. godine na osnovu sličnih
karakteristika sa rodovima Salmothymus i Acantholingua zaključio da se radi
o novoj vrsti koju je nazvao Salmo zetensis. Karaman (1966) smatra da
mekousna pastrva u rijeci Zeti predstavlja prijelazni oblik između var.
obtusirostris i var. ohridanus, ali naglašava da treba nastaviti ispitivanja kako
bi se među njima utvrdile razlike i sličnosti. Danas mekousna pastrva (S. o.
zetensis) obitava samo u donjem dijelu rijeke Zete i njenom zapadnom
pritoku, rijeci Morači. Radi zagađenja i izlovljavanja spada u jednu od
najugroženijh slatkovodnih riba u Crnoj Gori (Marić, 1995).
Stefanović (1948) se bavi usporedbom mekousne pastrve s azijskim
rodom salmonida Brachymystax, na čiju je sličnost ukazivao i Berg (1923).
Mekousna pastrva iz rijeke Bune i azijska vrsta Brachymystax lenok Pallas
imaju približno jednak broj žbica u perajama. Međutim, mekousna pastrva ima
manji broj ljuski u bočnoj liniji i te nešto širu granicu variranja broja
branhiospina u prvom škržnom luku. Povezuje ih broj slijepih crijeva (oko
100), dužina gornjovilične kosti, koja dopire do polovine oka, te jednako
razdoblje mrijesta - proljeće. Stoga, iznosi pretpostavku o eventualnoj
srodnosti mekousnih pastrva s azijskim salmonidima roda Brachymystax.
21
Dorofeyeva (1989) iznosi filogenetsku hipotezu da rod Salmothymus
nije u vezi sa rodom Brachymystax i ponovo naglašava njegovo mjesto u
skupini Salmo.
Specifičan izgled mekousne pastrve i njena ekološka svojstva iznio je
Taler u nizu članaka (1951, 1952, 1953, 1954). Sistematskim položajem
endemske mekousne pastrve bavio se Stanković (1960). Kosorić i suradnici
(1969) su ispitivali mogućnost umjetnog mrijesta mekousne pastrve iz rijeke
Neretve (subsp. oxyrhinchus). Utvrdili su da je optimalna temperatura za
mrijest 100C jer je pri toj temperaturi postotak oplođene ikre najviši.
Prema pregledu prošlih istraživanja na rodu Salmothymus očito je da
su se morfološke karakteristike kao kriterij za klasifikaciju pokazale
nedovoljnima i nepouzdanima. Stoga je bilo neophodno preispitati filogenetski
odnos i sa gledišta molekularne genetike.
Klasifikacija porodice Salmonidae i intergenerični odnosi unutar nje,
određeni su uglavnom na osnovu morfoloških istraživanja (Stearley i Smith,
1993), no takve analize, iako brojne, u suprotnosti su sa genetičkim
analizama (Phillips i Oakley, 1997). Brojni autori predlažu različite odnose
unutar Salmonidae. Na osnovu osteoloških obilježja (Shaposhinikova, 1975),
porodica Salmonidae podijeljena je u tri podporodice: Salmoninae,
Coregoninae i Thymallinae. U prvoj porodici nalazi se 6, u drugoj 3, a u trećoj
1 rod. Istraživano je 6 rodova: Salvelinus, Hucho, Brachymystax podporodice
Salmoninae i Stenodus, Prosopium i Coregonus podporodice Coregoninae.
Osteološka istraživanja omogućila su da se ustanove njihova taksonomska
obilježja i da se odredi taksonomski položaj u porodici.
Analize na biokemijskom nivou podporodice Salmoninae vršili su
Osinov i Lebedev (2000) na 31 – 37 genskih lokusa kod 21 vrste iz 7 različitih
rodova. Utvrđeno je monofiletsko porijeklo (Oncorhynchus + Parasalmo) i
(Hucho + Brachymystax). U filogenetskom stablu najproblematičniji je bio rod
Parahucho. Točna i opće prihvaćena klasifikacija porodice Salmonidae samo
je djelomično završena i to uglavnom kod dobro proučenih rodova (npr.
Oncorhynchus, Salmo, Salvelinus i Hucho) zahvaljujući ponajprije
molekularnim analizama (Phillips i Oakley, 1997), dok su brojne vrste sa
staništima u Aziji i Balkanskom poluotoku (npr. Brachymystax, Acantholingua,
22
Salmothymus) vrlo slabo proučene, a njihovo sistematsko mjesto je i dalje
upitno (Osinov, 1999).
Slika 8: Četiri osnovne hipoteze za odnose između rodova Brachymystax,
Hucho i Salvelinus: (A) Norden (1961), (B) Kendall i Behnke (1984), (C)
Dorofeyeva (1989) i (D) Stearley i Smith (1993)
Općenito je prihvaćeno da je rod Oncorhynchus najudaljeniji u porodici
Salmoninae, a prate ga rodovi Salmo i Salvelinus. Norden (1961) smatra da je
svaki rod monofiletski, i da se grana zasebno od debla (Slika 8, A). Kendall i
Behnke (1984) smatraju da su sva tri "problematična" roda (Brachymystax,
Hucho i Salvelinus) potekla iz jedne monofiletske grupe (Slika 8, B).
Dorofeyeva (1989) na osnovu osteoloških analiza smatra da su rodovi
Brachymystax, Hucho i Salvelinus potekli s jedne, a rod Salvelinus sa druge
monofiletske strane (Slika 8, C). Stearley i Smith (1993) odvajaju rodove
Brachymystax, Hucho i Salvelinus u dvije zasebne monofiletske grane, pa u
jednu spadaju rodovi Hucho i Salvelinus, a u drugu rod Brachymystax (Slika
8, D).
Tek nakon ulaska molekularne tehnologije u područje istraživanja
sistematike Salmonidae, dobiven je točan i opće prihvaćen položaj spornih
rodova.
23
Sekvencioniranjem hormona rasta (GH2C) Oakley i Phillips (1999)
dokazali su da je rod Braxhymystax napredni predstavnik roda Hucho, te
odbacili hipotezu o Braxhymystaxu kao rodu arhaičnih salmonida.
Slika 9: Brachymystax lenok (foto Schöffman)
Slika 10: Acantholingua ohridana
(http://www.ittiofauna.org/webmuseum/acantholingua_ohridana/index.htm)
Predmet istraživanja Phillipsa i sur. (2000) je sistematsko mjesto roda
Acantholingua. Sekvencioniranjem hormona rasta (GH2C), te dijela
ribosomske DNA (ITSI) i citokroma b na mitohondrijalnoj DNA ustanovili su da
je rod Acantholingua filogenetski vrlo blizu rodu Salmo.
Snoj i sur. (2002b) proučavali su mtDNA (kontrolnu regiju i citokrom b
gen) i nuklearnu DNA (dio laktat dehidrogenaze C1 gena). Na osnovu
sekvencioniranja navedenih dijelova izvedeno je filogenetsko stablo (Slika
11).
24
Slika 11: Sistematika porodice Salmondiae, s posebnim osvrtom na odnose
između rodova Salmothymus, Acantholingua i Salmo, na osnovu
sekvencioniranja kontrolne regije mtDNA i citokroma b, iz nuklearne DNA
(Snoj i sur, 2002)
Kako su se rodovi Salmothymus, Acantholingua i Salmo pokazali jako
bliski, smješteni su u zasebnu skupinu, poput rodova Salvelinus,
Oncorhynchus i ostalih. Upravo taj podatak ukazuje na nepravilnosti prijašnjih
klasifikacija. Blizak odnos između rodova Salmo i Salmothymus potvrđen je i
analizom LDH gena, koji je utvrđen samo kod predstavnika rodova
Salmothymus, Acantholingua i Salmo, što ga čini važnim filogenetskim
markerom.
U narednim istraživanjima filogenetskih odnosa analizirani su LDH i
ITS1 gen (Snoj, 2003), kako bi se odredio točan položaj roda Salmothymus u
Salmo skupini.
25
Slika 12: Sistematika porodice Salmoniae na osnovu sekvencioniranja
kontrolne regije mtDNA, citokorma b, LDH-C1* i ITS1 gena nuklearne DNA
(Snoj, 2003).
Unutar roda Salmo prisutna su tri ogranka; S. salar, S. trutta kompleks
sa S. marmoratus i treći A. ohridana i S. obutusirostris, koji predstavlja
evolucijski prijelaz između Atlantskog lososa i potočne pastrve.
Na osnovu sekvencioniranja kontrolne regije mitohondrijalne DNA
(Snoj i sur., 2002b; Snoj, 2003) utvrđena je bliska veza podvrste
Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus i rodova Salmo i Acantholingua (Slika
12). Filogenetsko drvo proizašlo iz analize mtDNA i nuklearne DNA ukazuje
da su podvrste Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus i Acantholingua
sestrinske vrste, znatno bliže sa S. trutta, nego sa S. salar. Stoga, rodovi
Salmothymus i Acantholingua, smatra autor, predstavljaju posebni ogranak
koji se filogenetski nalazi između S. salar i S. trutta. Ovo otkriće pobija
današnju klasifikaciju roda Salmothymus kao zasebnog roda, i nameće
njegovu reklasifikaciju na razinu vrste unutar roda Salmo.
0.01
Salvelinus fontinalis
Oncorhynchus mykiss
Salmo salar
SSaallmmootthhyymmuuss oobbttuussiirroossttrriiss
Acantholingua ohridana 100
Da
At
Ma
Ad 81
94
100
100
Salmo trutta/ marmoratus complex
Salmo obtusirostris
26
1.1.2. Metode razlikovanja ribljih populacija
Ribe su najbrojnija grupa kralježnjaka sa 24 600 različitih vrsta (Nelson,
1994). Da bi opisali i sistematski odredili različite vrste, sistematičari su razvili
različite metode.
1.1.2.1. Morfološke metode razlikovanja ribljih populacija
Danas postoje brojne metode kojima je moguće odrediti genetsku
strukturu neke populacije. Najstarije, a ipak još uvijek najviše korištene
metode, su klasične morfološke metode, morfometrijske i merističke metode.
Razlozi njihove široke korištenosti su jednostavnost i pristupačnost, a također
i ekonomski značaj. Morfometrija je područje istraživanja gdje se
kvantitativnim analizama opisuje oblik i veličina neke morfološke jedinke ili
karakteristike (Oxnard, 1978). Morfometrijskim metodama utvrđuju se
dimenzije pojedinih dijelova tijela, kao i odnosi među njima. Pri tome je, radi
pouzdanosti usporedbi, potrebno voditi računa o starosti i spolu uspoređivanih
riba. Ovakva klasična metoda odnosa pojedinih tjelesnih dužina pokazala se
posebno prikladnom za utvrđivanje ekoloških utjecaja na morfologiju riba
(Treer i sur., 1995; 2000). Za prikazivanje morfoloških razlika između genetski
bliskih populacija ili taksona riba, bolje rezultate daje metoda vezane mreže
(truss metwork), kojom se mjere elementi oblika, bazirani na linearnim
mjerenjima između homolognih ključnih anatomskih točaka (Delling i sur.
2000). Uz dužine na tijelu riba, morfometrijskim osobinama pripadaju i one
unutar tijela, kao što su npr. dužina probavila, dužina branhiospina, promjer
ikre i dr. Vanjski utjecaji mogu bitno djelovati na morfometrijske osobine, jer
su njihovi heritabiliteti (h2) u pravilu vrlo niski (Tave, 1993). Morfološka
istraživanja, kako ona što se bave vanjskom morfologijom, a tako i ona
osteološka, često su izvor podataka za analizu filogenetskih odnosa pojedinih
vrsta riba (Shaposhnikova, 1975). Zadatak takovih istraživanja je da se utvrdi
stanje određenih karakteristika i njihova učestalost u istraživanim vrstama.
Time je omogućeno utvrđivanje statusa nekih karakteristika u filogenetskom
27
smislu, odnosno da li su one odavno prisutne u populaciji (pleizmorfne) ili su
izvedene (apomorfne), (Hening, 1966).
Za razliku od morfometrijskih osobina, merističke osobine imaju znatno
veći stupanj nasljeđivanja, a time i veću pouzdanost u razlikovanju ribljih
populacija. To su parametri koji se na tijelu riba mogu izbrojiti, kao npr. broj
žbica u perajama, broj ljuski u bočnoj pruzi, iznad i ispod nje, broj kralježaka i
dr. U genetskim istraživanjima posebno značajan u razlikovanju ribljih
populacija pokazao se broj branhiospina (Alegria Hernandez, 1985).
1.1.2.2. Genetičke metode razlikovanja ribljih populacija
Funkcijska jedinica DNA molekule što se pri reprodukciji prenosi sa
roditelja na potomstvo zove se gen. Geni zajedno s faktorima okoline uvjetuju
različita tjelesna obilježja i ponašanja. Različiti oblici pojedinog gena su
alelomorfni geni ili aleli (Stryer, 1995). Složenim uklapanjima molekule DNA i
proteina nastaju kromosomi. Svaki organizam ima karakterističan set
kromosoma koji se zove kariotip. Diploidni organizmi posjeduju dvije kopije
jednog kromosoma, pri čemu je jedan naslijeđen od majke, a drugi od oca. Na
kromosomu se nalazi veliki broj gena. Lokus označava položaj gena na
kromosomu. Tako na svakom lokusu diploidni organizmi imaju dva alela,
jedan je na majčinskom, a drugi na očinskom kromosomu. Homozigoti su oni
organizmi koji imaju jednake alele na lokusima, odnosno jednak slijed
nukleotida na oba alela. Kod heterozigota to nije slučaj (Lewin, 2000).
Molekularni marker je sekvenca na DNA molekuli ili proteinu koja se
može lako detektirati i čije je nasljeđivanje moguće izučavati. Varijabilnost ili
polimorfizam čini molekularni marker korisnim u genetskom razlikovanju
populacija (Ford-Lloyd, 1996).
Molekularna sistematika bavi se razvojem makromolekula i na toj
osnovi rekonstruira povijest gena i organizma, a šire gledano, objašnjava
genetsku različitost (Moritz i Hillis, 1996).
Molekulu DNA nalazimo u jezgri i u mitohondrijima. Kod riba, veličina
nuklearnog genoma kreće se od 0,3 do 4 bilijuna parova baza (Ohno, 1974),
28
a mitohondrijalnog genoma od 14 000 do 20 000 parova baza (Park i Morgan,
1994).
Polimorfizam na DNA razini nastaje kao rezultat točkastih mutacija i
pogreški prilikom replikacije. Istraživanje tih varijacija postalo je moguće
zahvaljujući razvoju tehnika DNA analize, ponajprije otkrićem restrikcijskih
enzima, koji režu molekulu DNA na fragmente, te razvojem lančane reakcije
polimeraze (PCR), koja omogućuje amplifikaciju fragmenta DNA od
minimalnog uzorka.
Metodološka područja molekularne genetike, koja se često u
istraživanjima koriste su: aloenzimi, mitohondrijska DNA i ponavljajuće
sekvence DNA molekule, mikrosateliti.
1.1.2.2.1. Aloenzimi
Sedamdesetih godina u molekularnoj populacijskoj genetici riba glavni
alat bili su enzimi. Razlikovanje alelnih varijanti proteina (aloenzima) pomoću
elektroforeze pokazalo se vrlo uspješno pri istraživanju genetske različitosti.
Aloenzimi kao genetski markeri su vrlo uvjerljivi i relativno se lako koriste,
međutim, potrebno je spomenuti i njihove mane pri korištenju kod nekih ribljih
vrsta. Ponajprije se pojavio problem kada se utvrdilo da je njihova varijabilnost
kod nekih vrsta znatno niska. Osim toga, često se nalaze na vrlo malom
kodirajućem dijelu genoma i teško ih je detektirati elektroforezom. Za
istraživanje tom metodom potreban je veći uzorak tkiva, koji ako se duže čuva
dolazi do njegove degradacije (Carvalho i Hauser, 1994). U ranijim studijama
enzimski lokusi su prvo korišteni kao biokemijski markeri ribogojilišnih linija,
radi otkrivanja i popravljanja rijetkih alela (Utter i Seeb, 1990), tek kasnije i
kao dijagnostika za razlikovanje domaćih od divljih populacija. Osim toga,
enzimski polimorfizam je bio efikasno korišten kao genetski marker pri
određivanju strukture populacija različitih ribljih vrsta. Međutim, javila se
potreba za više polimorfnim markerima pri detektiranju inbridinga u
populacijama, u studijama uspjeha križanja divljih populacija.
29
1.1.2.2.2. Mitohondrijska DNA
Mitohondrijska DNA molekula ima jednostavnu strukturu i organizaciju,
zatvorenog je i kružnog oblika. Vrlo je značajan dio genoma i nalazimo je u
svakoj stanici sa 0.0006% ili 1% ukupne mase stanične DNA (Cables, 2001).
Duga je od 14 do 20 kbp, a sadrži 37 gena, dva ribosomska DNA (rDNA)
gena, 22 transverzna RNA (tRNA) gena i 13 gena što kodiraju proteine
uključene u transport elektrona ili ATP sintezu. Na mtDNA se nalaze dijelovi
za kodiranje nasljednih proteina: citokroma b, tri podjedinice citokrom
oksidaze, tri podjedinice ATP sintetaze i sedam podjedinica NADH
dehidrogenaze. Također sadrži i kontrolnu regiju (engl. D-loop region), dužine
oko 1000 bp sa sekvencama koje djeluju u začetku replikacije i transkripcije
(Harrison, 1989). Dok su geni za rRNA molekule izuzetno konzervativni,
područje kontrolne regije često je podložno promjenama (Shedlock i sur.,
1992). Određeni segmenti kontrolne regije imaju različit stupanj varijabilnosti.
Najbolje je sačuvan njen centralni dio, koji je posebno bogat citozinskim i
gvaninskim bazama, dužine 270 bp (Shedlock i sur., 1992). Velika
varijabilnost kontrolne regije objašnjava se time što jedan od dva lanca
zavojnice biva premješten sintezom novog lanca tijekom replikacije. Kontrolna
regija je kod riba dosta duga i često sadrži tandemski ponavljajuće sekvence.
Mitohondrijska DNA (mtDNA) je izuzetno vrijedan genetski marker u
populacijskoj i evolucijskoj biologiji. Razlog tome je, što je relativno lako
izolirati čiste homologne sekvence, budući da je prisutna sa velikim brojem
kopija - do 1000 po stanici. Jednostavna organizacija, materinsko
nasljeđivanje i odsutnost rekombinacija uz visoki stupanj mutacija, čine
mtDNA idealnim markerom za istraživanje strukture populacija (Zhang i
Hewitt, 1996). Pri promatranju strukture neke populacije, mtDNA je vrlo
korisna, bilo da se radi o razlikama između različitih vrsta (interspecifična
divergenca) ili unutar pojedine vrste (intraspecifična divergenca). MtDNA kao
molekularnim markerom moguće je razlučiti strukturu populacije i pratiti
intraspecifične varijacije pojedinih, geografski odvojenih populacija (Snoj,
1997).
Radi materinskog nasljeđivanja mtDNA replicira se zasebno od
nuklearne DNA, pri čemu samo dio populacije prenosi mtDNA na potomstvo.
30
Mitohondrijalni geni predstavljaju neprekinutu liniju genetske informacije
unatrag do prve ženke ili populacije ženki (Cables, 2001). Zbog haploidnosti
mitohondrijalnog genoma, efektivna veličina populacije za mtDNA je samo
jedna četvrtina nuklerane DNA (Nei i Tajima, 1981). Pri tome ne dolazi do
rekombinacija, kao što je slučaj sa nuklearnom DNA, već se mtDNA prenosi
nepromijenjena na potomstvo. Magoulas i Zouros (1993) navode da
materinsko nasljeđivanje mtDNA nije isključivo, tako u slučajevima
heteroplazmije udaljenih mitohondrijskih linija to nije slučaj. Postotak zamjene
nukleotida u mt DNA je 5 do 10 puta veći nego u nuklearnoj DNA, izmjerena
je vrijednost od 5,7 x 10-8 supstitucija za pojedinačno nukleotidno mjesto za
godinu dana (Brown i sur. 1982). Pretpostavljajući konstantnim stupanj
promjene mtDNA sekvence uz procjenu postojeće različitosti, moguće je
izračunati vrijeme kada su dvije vrste dijelile istog ženskog pretka. Stupanj u
kojem mtDNA akumulira mutacije je 2 – 4% u milijun godina (Lewin, 2000).
Signifikantne razlike mtDNA u različitim geografskim područjima i materinsko
(klonalno) nasljeđivanje čine mtDNA efikasnim genetskim markerom za
proučavanje evolucije, uključujući migracije, introdukcije i ″uska grla″
populacija. Ti markeri uz razlikovanje populacija i identificiranje podrijetla riba,
omogućuju ispitivanje efikasnosti uvođenja pojedinih linija u akvakulturu, a
vrlo su efikasni za kontrolu djelovanja unesenih linija na domaće autohtone
vrste (Li i sur., 1993). Usporedbom mtDNA sa sekvencama koje se prenose
sa oba spola (autosomalni geni) i onima što ih prenose samo mužjaci,
moguće je uočiti znatne razlike u strukturi populacije između mužjaka i ženki,
te ukazati na razlike u njihovoj ekologiji i ponašanju (Harrison, 1996).
Mnoge studije u određivanju stupnja različitosti između i unutar
populacija koriste se tehnikom rezanja mtDNA s restrikcijskim
endonukleazama (engl. restriction fragment length polymorphism – RFLP), pri
čemu se molekula razreže specifičnim restrikcijskim enzimima, a potom se
produkti odvajaju po veličini koristeći gel elektroforezu. Restrikcijska mjesta se
mapiraju, osnosno bilježi se njihova prisutnost ili odsutnost. Korištenje ove
tehnike nije toliko preporučljivo pri određivanju razlika između vrsta i viših
taksonomskih jedinica (Dowling i sur., 1990).
Mitohondrijska DNA regija je dobro proučena kod različitih ribljih vrsta.
Poznavanje i korištenje univerzalnih začetnih nukleotida (engl. primer) za
31
amplifikaciju sekvenci lančanom reakcijom polimeraze, učinilo ju je vrlo
prihvatljivim alatom u molekularnoj genetici kod riba. Područja gdje su
smješteni geni za kodiranje proteina i područje kontrolne regije, pokazala su
se posebno korisnima pri analizi odnosa nedavno odvojenih populacija.
Međutim, ta područja radi pojave višestrukih supstitucija nisu dovoljna pri
analizi viših taksonomskih jedinica, pa se pri takvim istraživanjima koriste
konzervativnija područja poput 12S i 16S ribosomskih RNA gena (Stepien i
Kocher, 1997).
Evolucija mtDNA sekvence je dobro proučena kod riba. Zamjena baza
se događa dosta često, no struktura mtDNA i poredak gena je jako
konzervativan. Budući da se mtDNA prenosi kao jedan gen, treba biti oprezan
pri donošenju zaključaka o čitavoj populaciji, jer se evolucija pojedinog gena
može razlikovati od evolucijskog prosjeka čitavog genoma.
Citokrom b je vjerojatno najbolje proučen gen u mtDNA kod riba. On
ima ulogu u kodiranju proteina važnih u procesu disanja kod staničnog
metabolizma. Citokrom b se vrlo često koristi kod istraživanja strukture i
porijekla ribljih populacija. Tako ga Basely i Bernatchez (2001) koriste uz
mikrosatelite kod jezerske ozimice (Coregonus clupeaformis), a Sušnik i sur.
(2001) proučavaju genetske strukture različitih populacija lipljena (Thymallus
thymallus).
32
1.1.2.2.3. Ponavljajuća DNA
Ponavljajuću DNA molekulu nalazimo u dva oblika; kao raspršenu i kao
tandemski ponavljajuću. Raspršenu ponavljajuću DNA molekulu dijelimo s
obzirom na broj ponavljanja na: duge rasute elemente (LINE) koji su duži od
1000 baza i kratke rasute elemente (SINEs), koji su kraći od 500 baza. Ako je
prisutno mnogo kopija, oko 1000 jedne ponavljajuće jedinice, tada govorimo o
satelitima. Pri manjem broju ponavljanja koristimo termine minisateliti i
mikrosateliti. Minisateliti nisu posebno prihvaćeni u ribarstvu, pa je većina
istraživanja koncentrirana na drugu klasu ponavljajuće DNA, mikrosatelite.
1.1.2.2.3.1. Mikrosateliti
Mikrosateliti su otkriveni u eukariotskim stanicama prije više od
petnaest godina, no njihovo postojanje u početku nije pobuđivalo veći interes
znanstvenika (Jarne i Lagoda, 1996). Tada su nazvani beznačajna DNA
(engl. junk DNA), iako je vrlo brzo otkrivena njihova vrijednost kao genetskih
markera. Termin mikrosateliti odnosi se na najmanje ponavljajuće jedinice.
Sastoje se od jednostavnih ponavljajućih sljedova nukleotida, veličine od 2 do
6 parova baza, npr. (TG)n ili (AAT)n i rijetko sadrže više od 70 ponavljajućih
jedinica. Brojni su u eukariotskim genomima, no nalaze se i u prokariota, ali
sa manjom učestalošću. Nalaze se po cijelom genomu, u kodirajućim i u
nekodirajućim regijama. Manji broj ih se nalazi na području centromernih i
telomernih regija (Tautz, 1993). Ipak, izgleda da svaki gen ima jedan
mikrosatelit.
Mikrosateliti su prisutni u genomu svih do sada proučenih organizama.
Genom riba je vrlo bogat tim sekvencama, pa u genomu potočne pastrve
nalazimo od oko 33 000 do 109 000 mikrosatelita (Estoup i sur. 1993). Vrlo su
pogodni za istraživanja, jer se uspješno mogu izolirati iz različitih materijala.
33
Najčešće se izoliraju iz krvi i tkiva riba, ali ih je moguće izolirati i iz dlake, sline
ili izmeta (Constable i sur., 1995). Također se uspješno izoliraju iz suhih ljuski
(Miller i Kapuscinski 1996), i iz otolita (Hutchinson i sur. 1999), te iz vrlo malih
količina biološkog materijala, kao što je arheološki materijal, koji može
sadržavati gotovo razgrađenu DNA (Bruford i sur., 1998). Mogućnost izolacije
mikrosatelita iz vrlo malih dijelova biološkog materijala učinio ih je korisnima
pri istraživanju rijetkih i ugroženih vrsta (Queller i sur., 1993).
Zbog ponavljajućih sljedova nukleotida koje sadrže, mikrosateliti su
izuzetno podložni pogreškama prilikom replikacije DNA. Taj se proces naziva
pogrešno sparivanje iskliznutog lanca (engl. slipped - stand misparing) ili
klizanje (engl. slippage), a dovodi do skraćenja ili produljenja DNA molekule
prilikom replikacije (Schlötterer i Pemberton, 1994). Najčešća mutacija kod
mikrosatelita je promjena od jedne ponavljajuće jedinice. Takav tip mutacija
omogućuje da lokusi evoluiraju procesom tzv. stepenaste mutacije (engl.
Stepwise Mutation Model – SMM). Stupanjski mutacijski model može se
pojaviti u dva podoblika: jednostupanjski (engl. single-step mutation model) i
dvofazni mutacijski model (engl. two-phase mutational model), (Dirienzo i sur.,
1994). U prvom se modelu pretpostavlja da mutacijske promjene dovode do
povećanja ili smanjenja u broju jedne ponavljajuće jedinice, dok drugi model
uključuje jednostupanjski mutacijski model, ali dopušta i mutacije
ponavljajućih jedinica. Slatkin (1995) objašnjava da je mutacija kod tih lokusa
proces s memorijom (tzv. konvergentna priroda memorije), odnosno, da se u
procesu mutacije novi mutant nadovezuje na prethodni alel, pa u tom slučaju
razlika u dužini između alela sadrži informaciju koja ima filogenetičku
vrijednost. Razlika u dužini između dva alela daje informaciju o vremenu koje
je prošlo od kada su ta dva alela dijelila jedan zajednički, ancestralni alel.
34
Slika 13: Stvaranje polimorfizma DNA sekvence pogrešnim sparivanjem baza,
ispadom dijela sekvence
a) Ispad unatrag uzrokuje inserciju
b) Ispad naprijed uzrokuje deleciju (Strachan i Read, 1996)
35
Brzina mutacije mikrosatelita je izuzetno velika. Spontana mutacija za
mikrosatelitske lokuse je 10-2 do 10-4 po generaciji, što je znatno više od
promjena na enzimima od 10-6 po generaciji (Nei, 1987). To dovodi do
promjene u broju ponavljajućih nukleotida, odnosno do produženja ili
skraćenja lanca DNA tijekom replikacije. Mutacije su prisutne i kod
deseterostrukog ponavljanja dinukeotidne sekvence. Stupanj polimorfizma je
razmjeran broju ponavljanja osnovnog motiva. Mutacijski stupanj kod
dinukleotidnih ponavljanja je za 1,5 do 2 puta veći od mutacijskog stupanja
tetranukleotidnih ponavljanja, dok je stupanj mutacije kod tronukleotidnih
ponavljanja, između ova dva (Chakraborty i sur., 1997).
Mikrosatelite dijelimo u tri skupine:
- potpuni mikrosateliti (CACACACACACACACACACA)
- sastavljeni mikrosateliti (CACACACACAGAGAGAGAGA)
- prekinuti mikrosateliti (CACATTCACACATTCATTCA)
Sastavljeni i prekinuti mikrosateliti pokazuju manji stupanj polimorfizma od
potpunih mikrosatelita (Jarne i Lagoda. 1996).
Visoki stupanj polimorfnosti, kodominantnost (heterozigoti se razlikuju
od homozigota) te jednostavan Mendeljevski način nasljeđivanja, čini
mikrosatelite vrlo popularnim molekularnim markerima (Page i Holmes, 1998).
Zahvaljujući njihovom visokom stupnju polimorfizma, ti markeri su se pokazali
korisnima u istraživanju vrsta s malim enzimskim varijacijama kao što je npr.
atlantski losos (Salmo salar), (Gavin i sur. 1996) i jezerska zlatovčica
(Salvelinus alpinus), (Brunner i sur. 1998).
Mikrosateliti su vrlo korisni pri istraživanjima genetske varijacije u
populacijskoj genetici, jer se lako otkivaju pomoću PCR tehnike i jer se razlika
u alelima od samo 1 bp može uočiti na visoko rezolucijskim gelovima (Hansen
i sur., 2001). Lančanu reakciju polimeraze je moguće dobro optimizirati pa je
moguće u jednom procesu amplificirati više različitih lokusa. Mikrosateliti se
često koriste pri određivanju roditeljstva, srodnosti i identifikaciji jedinki
(Queller i sur., 1993). Radi velikog polimorfizma mnogi mikrosateliti
omogućuju uspješnu identifikaciju jedinki i odnosa unutar porodica. To
uključuje veliki broj mikrosatelita (engl. DNA fingerprinting), koji predstavljaju
36
različite genotipove. Ti markeri omogućuju istraživačima da identificiraju
srodstvo i vezu ne samo u prvoj, nego i u daljnjim generacijama, a to
omogućuje analizu reprodukcijskog uspjeha i “fitness” pojedine jedinke
(Crivelli i sur. 2000). Aliah i suradnici (2000) ih koriste pri istraživanju bliskih
linija, kod populacija koje su ugrožene “uskim grlom” (engl. bottlenecks) kao
rezultatom križanja.
Ono što bitno pridonosi popularnosti mikrosatelita kao markera je da su
mikrosatelitski lokusi bliskih vrsta gotovo jednaki, pa je stoga moguće koristiti
iste začetne nukleotide i procedure. Međutim, kod filogenetski udaljenih vrsta
ipak je potrebno ponovno izolirati nove lokuse, jer ne postoje univerzalni
začetni nukleotidi (Schlötterer i Tautz, 1992).
Dužina alela mikrosatelitskog lokusa određuje se umnažanjem
određenog lokusa pomoću lančane reakcije polimerazom (PCR). Međutim,
prije nego što se mikrosatelitski lokus umnoži potrebno je spoznati sljedove
baza koji se nalaze neposredno uz istraživani lokus, tada je moguće napraviti
začetne nukleotide. Za neke životinje postoji veći broj mikrosatelita. Te
podatke je moguće pronaći u literaturi ili u računalnim bazama podataka
(EMBL ili GenBank). Ako za istraživanu vrstu na postoje već otkriveni
mikrosateliti, tada pristupamo analizi izolacija mikrosatelitskih lokusa i njihovih
postranih sljedova (Schlötterer, 1998).
Jedan od problema koji se javlja pri interpretaciji rezultata nakon
elektroforeze je pojava niza odjeljaka (engl. stutter bands), a ne samo jednog
ili dva (ovisno da li se radi o homozigotu ili heterozigotu). Taj problem je
naročito izražen kod dinukleotidnih ponavljanja nukleotida. Obično je odjeljak
najvećeg intenziteta onaj očekivani, no razlike u intenzitetu nisu dovoljne da bi
se sa sigurnošću moglo zaključiti koji je odjeljak ishodišni alel. Nastanak
dodatnih odjeljaka rezultat je klizanja DNA (engl. slippage) za vrijeme PCR
umnažanja in vitro (Schlötterer, 1998).
37
1.1.3. Očuvanje genetske različitosti ribljih populacija
Genetska varijabilnost je osnova biološke evolucije svega živoga, pri
čemu je posebno važna genetska varijabilnost unutar vrste, jer je nužna za
uspješno prilagođavanje promjenama okoliša i za preživljavanje vrste. S
gubitkom genetske različitosti dolaze posljedice različitog stupnja, pri čemu je
najtragičnija ona što dovodi do izumiranja vrste. Biološka različitost je u prirodi
hijerarhično organizirana. Svaki ekosustav se sastoji od velikog broja jedinki
koje su različitim filogenetskim vezama povezane unutar i među vrsta. Osim
toga, i svaka evolucijska linija ima svoj vrsni diverzitet. Često je potrebno
poznavati izvor i način biološke raznolikosti za uspješno očuvanje neke vrste
(Vida, 1994, Sušnik, 2001).
Evolucijski signifikantne jedinke (engl. ESU; Evolutionary Signifacant
Units) su populacija ili skupina populacija koje su reproduktivno izolirane od
drugih populacija iste vrste i predstavljaju važan element u genetskoj
raznolikosti vrste (Waples, 1991). Najprimjerenije za očuvanje bile bi one
vrste koje su autohtone u nekom geografskom području i genetski su što više
udaljene od srodnih vrsta (Maitland, 1995).
Na Konferenciji o biološkoj raznolikosti (Rio de Janeiro, 1992)
zaključeno je da su genetski različite populacije primarne jedinice za
očuvanje, bez obzira na njihov taksonomski status. Stoga se uspješno
očuvanje temelji na genetskim razlikama među jedinicama, bez obzira da li se
radi o vrsti, podvrsti ili o lokalnoj populaciji (Moritz, 1994).
Hibridizacija je međusobno križanje individua iz genetički dalekih
populacija (Rhymer i Simberloff, 1993). Hibridne zone su obično uski prostori
gdje se susreću i mrijeste genetički različite populacije. Za visok postotak
hibridizacije između bliskih ribljih vrsta zaslužno je nekoliko faktora:
• gubitak ili smanjenje prirodnih staništa neke vrste
• povećanje staništa od strane neke vrste
• akvakultura
• introdukcija
• vanjska oplodnja
38
• slab mehanizam izolacije
• nejednaka prisutnost obaju roditelja
• kompeticija za mali mrjestilišni prostor (Campton, 1987).
Hibridizacija je česta pojava u riba. Uočeno je da se hibridizacija u riba
pojavljuje mnogo češće nego u ostalih skupina kralježnjaka, a razlog tome
pripisuje se vrlo čestoj vanjskoj oplodnji. U ribljim populacijama uočeno je
križanje unutar rodova (Avise i Saunders, 1984), kao i između različitih rodova
(Verspoor, 1988). Formiranje hibridnih populacija između prirodnih i unesenih
vrsta je vrlo česta pojava među salmonidima u SAD (Allendorf i Leary, 1988),
kao i u Europi (Jordan i Verspoor, 1993). Vrste koje se u velikom postotku
sastoje od hibrida karakterizira velik broj srodnih oblika sa sličnom ekologijom
i staništima.
Hibridizacija može biti prirodna ili uvjetovana ljudskim faktorom –
antropogena hibridizacija. Često je vrlo teško utvrditi na koji način je do
hibridizacija došlo u nekoj populaciji. Allendorf i suradnici (2001) mogućnost
nastanka hibridizacije razvrstavaju u šest tipova, od kojih se prva tri tipa
odnose na prirodnu hibridizaciju, a ostala tri na antropogenu hibridizaciju:
1. Prirodni tip hibrida Hibrid koji je nastao križanjem u davnoj prošlosti,
a danas je ugrožena vrsta kojoj je potrebna zaštita. Hibridizacija
između ribljih vrsta često je vezana uz prirodne promjene i geološke
događaje. Ledeno doba pleistocena jako je doprinjelo promjeni staništa
brojnih ribljih vrsta i utjecalo na karakteristike i stupanj povezanosti
vodenih područja (Bernachez i Wilson, 1998). Riblje populacije ranije
izolirane ledom, miješale su se prateći povlačenje leda, što je uvelike
omogućilo hibridizaciju.
2. Prirodna introgresija Dvije vrste žive na istom području, razlikuju se
fenotipski i ekološki, no njihova genetska udaljenost je mnogo bliža,
nego što je za očekivati za promatranu vrstu. Stoga dolazi do
povremene hibridizacije između tih dviju vrsta. Populacija nastala
nakon ovakve hibridizacije sadrži i alele od druge vrste, no daljnja
39
hibridizacija ne smanjuje frekvenciju tih alela. Takva introgresija je dio
evolucijskog procesa.
3. Prirodne hibridne zone Široka područja na kojima zajedno žive dvije
populacije, populacija hibrida i populacija njihovih davnih roditelja.
Prirodna selekcija uz stanišne razlike dovela je do održanja roditeljskih
i hibridnih populacija. Općenito, veličina i stabilnost hibridne zone ovisi
o stupnju protoka gena, različitostima između roditelja i hibrida u
genotipskom fitnessu, veličini različitosti genskih frekvencija između
roditeljskih populacija, stupnju populacijske strukture i stupnju
promijene okoliša.
4. Hibridizacija bez introgresije Obuhvaća hibridizaciju između
autohtone i alohtone vrste, no uz slabo preživljavanje hibrida prve
generacije. Osnovni problem u ovom slučaju je gubitak reprodukcijskog
materijala.
5. Uvelike prisutna introgresija Hibridizacija sa introgresijom je uvelike
prisutna tamo gdje se na istom području nalaze dvije vrste koje se
uspješno razmnožavaju. Često se u udaljenim i nepristupačnim
predjelima mogu naći čiste populacije takovih vrsta, pa se u smislu
zaštite i obnavljanja upravo na njih treba koncentrirati.
6. Potpuna hibridizacija populacije Prirodna populacija je jako mala,
ako uopće i postoji. Kad je hibridizacija jednom započela, teško ju je
zaustaviti, naročito kada su hibridi fertilni a razmnožavaju se i
međusobno i sa roditeljima. Nakon nekoliko generacija takvog procesa
dolazi do stvaranja populacije koja se sastoji samo od jedinki hibridnog
porijekla. Tada je potrebno je zaštiti hibride jer je to jedina moguća
opcija ako želimo izbjeći potpuni gubitak vrste.
Problem hibridizacije dugo je bio podcijenjen i slabo prepoznat, pa se
nije na vrijeme spriječilo unošenje novih vrsta u staništa i izmjena prirodnih
staništa, za što se ustanovilo da uvelike doprinosi ovoj pojavi (Allendorf i sur.,
2001). Važnost ljudskog faktora u hibridizaciji i gubitku ribljeg biodiverziteta
danas je jako poznat. Ljudske aktivnosti koje su dovele do promjena u
prirodnom staništu nekih vrsta, što je posljedično dovelo do hibridizacije su:
izgradnja brana i kanala, smanjenje vodenog stupca radi korištenja vode za
40
navodnjavanje poljoprivrednih površina, zagađenje, uklanjanje submerzne
vegetacije. Čovjek je svojim aktivnostima, prenošenjem jedne vrste u prirodno
stanište druge, doprinjeo da se ranije izolirane vrste susretnu i razmnožavaju,
uz to je i smanjenje mrjestilišnog prostora doprinjelo je pojavi hibridizacije.
Međutim, neki hibridi su namjerno stvoreni sa ciljem da se poveća
produktivnost akvakulturnih linija ili mogućnost ulova pri udičarenju (Pipas i
Bulow, 1998; Dowling i Secor, 1997).
Carvalho (1993) uviđa da izolacija pojedinih ribljih populacija radi
nemogućnosti migracija između riječnih sustava, često dovodi do veće
genetske raznolikosti i do prilagođenosti tih populacija za određeno stanište.
Do promjene genetskog sastava populacija dolazi unošenjem genetski
neprimjerenih linija u riječne sustave, kao i njihovim križanjem sa pripadnicima
autohtonih populacija. Unošenje različitih ribljih vrsta u otvorene vode
uglavnom ima za cilj povećanje veličine populacija radi sportskog ribolova.
Mnogo godina se prakticirao unos riba u nova im staništa bez ikakvih
razmišljanja o budućim posljedicama smanjenja biološke raznolikosti.
Unošenjem novih vrsta ili populacija, kod izdvojenih populacija dolazi do
izmjene gena koji su nastali tijekom evolucije kroz milijun godina. Nastavak
takovog procesa vodi ka nenadomjestivom gubitku genetskog identiteta
pojedinih populacija i prema umjetnoj tvorbi jedne "miješane" vrste bez
međupopulacijskih razlika (Avise, 1994). Posljedice toga su gubitak lokalne
genetske populacijske strukture i specifičnih genotipskih kombinacija sa
potencijalnom adaptivnom vrijednošću (Hansen i Loeschcke, 1994). Jedno od
mogućih rješenja za popravak stanja u tim vodama je unošenje autohtonih
jedinki, prethodno umjetno izmriještenih sa ciljem da se poveća broj
autohtonih jedinki. Uz to potrebno je spriječiti unos tuđih gena. Međutim
javljaju se i negativne posljedice pomoćnog unošenja, npr. razmnožavanje u
srodstvu sa čime se smanjuje ukupna genetska raznolikost (Berrebi i sur.,
1999).
Osnovna pravila u vezi očuvanja vrsta i populacija slatkovodnih riba, pri
čemu je najvažnije očuvanje prirodnih ekosistema i genetske strukture
populacija. postavili su Berrebi i sur. (1999). Genetska struktura populacija je
važna u početku procesa zaštite pa prvo određujemo genetski identitet
41
populacije a na osnovi njega određujemo prikladne jedinke za očuvanje. Pri
uzgoju riba s namjerom očuvanja određenih populacija, potrebno je prije
unošenja uzgojenih jedinki proučiti njihove morfološke, ekološke i genetske
osobine.
Meffe (1986) je ujedinio čitav proces koji dovodi do ugroženosti ribljih
populacija, te predlaže neka pravila za upravljanje ugroženim populacijama.
Uzroci koji smanjuju genetsku raznolikost su: mala veličina populacije, efekt
uskog grla, slučajan tok alela, razmnožavanje u srodstvu, umjetna selekcija i
dugotrajno miješanje sa ribogojilišnim linijama. Sva ta djelovanja uzrokuju
povećanje homozigotnosti, gubitak polimorfizma i povećano izražavanje
recesivnih alela, što utječe na smanjenu sposobnost preživljavanja. S
genetskog stajališta, jedino pravilno upravljanje ribljim populacijama mora se
temeljiti na praćenju genetske strukture prirodnih i uzgojenih populacija,
uporabi većeg broja roditeljskih jedinki pri uzgoju, selektivnom razmnožavanju
koje bi spriječilo razmnožavanje u srodstvu, što kraćem vremenu života
potomstva u zatočeništvu i odvojenom uzgoju različitih genetskih linija ili
populacija. Nakon stavljanja uzgojenih jedinki u prirodnu sredinu, potrebno ih
je pratiti genetskim analizama i preko statistike ribolova. Osim identifikacija
populacije, potreban je opis cjelokupnog biološkog kompleksa, koji je nužan
za očuvanje ugroženih jedinki, jer mnoge rijetke i ugrožene životinjske vrste
žive u manjim i izoliranim populacijama (Sušnik, 2001).
Genetika zaštite živih organizama (engl. conservation genetics) bavi se
genetskim istraživanjima rijetkih ili ugroženih vrsta. Proučavajući čimbenike
koji su utjecali na učestalost alela, pokušava se dokučiti evolucijski razvoj
populacije. Takva su saznanja važna za daljnja planiranja gospodarenja
određenom vrstom u svrhu njenog očuvanja, odnosno očuvanja odgovarajuće
genetske raznolikosti (Crivelli i sur., 2000). Genetika zaštite živih organizama
se također bavi istraživanjima u bliskom srodstvu, uspješnošću
razmnožavanja, te općenito istraživanjima genetske raznolikosti (Beaumont i
Bruford, 1999).
Očuvanje prirodnog staništa i genetskog polimorfizma vrlo je važno za
preživljavanje mnogih ugroženih vrsta, kao i onih vrsta čije je prirodno stanište
drastično smanjeno. Stoga je, naročito za ugrožene populacije potrebno
42
očuvati što veći stupanj heterozigotnosti u populaciji, jer je tada veći i postotak
preživljenja. Međutim vrlo često je slučaj upravo suprotan, da ugrožene
populacije imaju vrlo nizak stupanj heterozigotnosti, što je najčešće posljedica
efekta "uskog grla" (Carvalho, 1993).
Veliki problem hibridizacije u riba je to, što je potomstvo hibrida vrlo
često fertilno pa se i dalje normalno razmnožava generacijama. Stoga je vrlo
važno uočiti i prepoznati hibrida, ali i vrlo složeno. Do 1966. godine, u tu svrhu
su se koristile isključivo merističke i morfološke metode. Detekcija hibrida
uporabom morfoloških metoda polazi od pretpostavke da će hibrid fenotipski
izgledati negdje između obaju roditelja (Smith, 1992). Međutim, to često i nije
slučaj, jer hibridi ponekad pokazuju i čitav spektar roditeljskih fenotipova
(Campton, 1987), a ponekad uopće i ne sliče roditeljima. Morfološke značajke
ne omogućavaju otkrivanje da li hibrid pripada prvoj generaciji ili nekoj
daljnjoj.
Korištenje molekularnih markera uvelike olakšava identifikaciju i opis
hibridnih populacija. Korištenje molekularnih markera započelo je s
proteinskom elektroforezom (aloezimima) sredinom šezedestih godina, a
sredinom osamdesetih godina, u tu svrhu koristi se i mtDNA. Današnje
prednosti u molekularnoj tehnologiji, naročito nakon mogućnosti amplifikacije
pomoću lančane reakcije polimerazom, znatno je povećalo broj lokusa koji se
koriste u hibridizaciji. Osim toga, molekularne tehnike su vrlo pogodne za
male ugrožene populacije, jer za istraživanje nije potrebno žrtvovati ribu
(Taberlet, 1999). Perez i sur. (1999) vrlo su uspješno koristili restrikcijski
enzim SacI pri razlikovanju hibrida od čistih roditeljskih linija pastrva i lososa.
No, unatoč velikoj popularnosti molekularnih metoda, morfološke analize su i
dalje uobičajene, najčešće zajedno sa genetskim markerima (Pipas i Bulow,
1998).
Procjena podudarnosti između različitih genetskih markera koji se
koriste u filogeografskim istraživanjima, danas je postala važnim pitanjem
(Avise, 2000), pa se velik broj istraživanja bavi odnosima između populacija.
Oni koriste nekoliko različitih genetskih markera na različitim regijama DNA
molekule (Lu i sur., 2001). Podudarnost različitih molekularnih tehnika
omogućuje točan uvid u evolucijsku povijest vrste, ali je značajno i njihovo
43
nepodudaranje, jer omogućuje bolje razumijevanje evolucijskog procesa i udio
selekcije i hibridizacije (Rieseberg, 1998).
Razpet i suradnici (2003) proučavali su hibride između potočne (Salmo
trutta) i mekousne (Salmo obtusirostis) pastrve u rijeci Neretvi. Između te dvije
vrste u rijeci Neretvi postoje hibridi, a morfološki se razlikuju od roditelja. Koje
lokalni stanovnici ih nazivaju "kosor". Pomoću tehnika mikrosatelita i
sekvencioniranja II introna gena laktat dehidrogenaze i C introna gena
hormona rasta na mtDNA, razdvojili su grupe - potočne pastrve, mekousne
pastrve, njihove hibride. Znatna varijabilnost hibrida navodila je na to da su
hibridi fertilni.
Nekoliko čimbenika treba uzeti u obzir kada se promatra potencijal
hibridne populacije. Jedan od njih je broj preostalih čistih populacija. Što je
manji broj preostalih čistih populacija, potrebna je veća zaštita preostalih
hibridnih populacija.
Mogućnost obnavljanja prvotne populacije bez hibrida najbolje je
moguće onda kad se populacija sastoji od roditelja i hibrida prve generacije.
Tada se uz korištenje većeg broja dijagnostičkih lokusa, odvoje čiste jedinke
od hibrida. Obnavljanje populacije moguće je uz umjetni mrijest.
Primjer negativnog utjecaja unešenih potočnih pastrva, uzgojenih u
ribogojilištu, na prirodnu populaciju glavatice (Salmo trutta marmoratus,
Cuvier 1817) vidljiv je u rijeci Soči u Sloveniji (Snoj, 1997). Uzgojene pastrve
imale su vrlo slab "homing" efekt koji je uzrokovao genetski tok između
reproduktivno izoliranim prirodnim populacijama glavatice i potočne pastrve,
koje su zauzimale različite dijelove riječnog sustava. Situacija je bila znatno
otežana činjenicom da su križanci potočne pastrve i glavatice bili plodni.
Kako bi se očuvala čista glavatica u Sloveniji je razrađen plan za
njezinu zaštitu (Povž i sur., 1996):
• Gospodarenje glavaticom uključuje prekid naseljavanja potočne
pastrve i povećanje izlova križanaca i potočne pastrve iz rijeka
jadranskog sliva.
• Zaštita staništa glavatice, naročito vodotoka sa čistom glavaticom.
44
• Zaštita glavatice, koja bi uključivala očuvanje bioloških i genetskih
obilježja. Osnivanje rezervata sa glavaticom, koja bi se birala na prema
fenotipskim i prema raspoloživim genetskim markerima (Snoj i sur.,
1996; Snoj, 1997; Sušnik i sur., 1997; Berrebi i sur., 2000). Sa
namjerom smanjenja negativnih posljedica unosa uzgojenih glavatica u
njihova prirodna staništa, pastrve se neko vrijeme drže u ribogojilištu,
gdje se pokušavaju imitirati uvjeti što sličniji njihovom prirodnom
staništu. Potomci se prvo smještaju u uzgojne potoke, pri čemu se
svake godine dio matične populacije zamjenjuje sa dijelom potomaka iz
rezervata.
Posljednjih godina hibridizacija je naročito dobila na popularnosti kao
značajna sila u evoluciji (Harrison, 1993), naime vrlo često je moguće hibridnu
zonu promatrati kao jedan "prirodni laboratorij", gdje se mogu promatrati
djelovanja i interakcije evolucijskih sila (Barton i Hewitt, 1989). Hibridi imaju
sposobnost formiranja multi genetskog kompleksa koji u određenim
okolnostima može dovesti do hibridske specijacije. Ipak, mnogo češće
genetske promjene između hibridnih vrsta nisu recipročne, već direktne, gdje
se geni jedne vrste uklope u genom druge vrste, odnosno dolazi do
introgresivne hibridizacije (Mayr, 1963), pri čemu vrlo često hibridi pokazuju
manji fitness od roditelja.
Dugo se smatralo da populacije kod kojih je došlo do hibridizacije sa
genetski različitim pripadnicima drugih populacija, ne bi trebale biti zaštićene,
međutim danas postoje i suprotna mišljenja. Avise (1994) smatra da se
hibridizacija kod većine organizama spontano događa u prirodi, a to bi značilo
da bi vrlo mali broj vrsta trebao biti uvršten u programe zaštite. Stoga Hansen
i Loeschcke (1994) smatraju da se hibridne populacije ne bi trebale isključivati
iz programa zaštite.
Uska distribucija endemskih slatkovodnih riba Mediterana čini ih vrlo
osjetljivim na promjene okoliša. Osnovni razlog ugroženosti i nestanka
endemskih vrsta je uništavanje njihova prirodnoga staništa, a prate ga
organsko i industrijsko onečišćenje.
45
Za mekousnu pastrvu možemo reći da je jedna od najugroženijih
slatkovodnih riba. Područje koje naseljava je poprilično usko, pa njegovo
zagađenje ima drastične posljedice za ovu vrstu. Naglašenom smanjenju
njene brojnosti doprinose i drugi čimbenici:
1. Nekontrolirano unošenje alohtonih vrsta u njena prirodna staništa
(kalifornijska pastrva), kada dolazi do direktne kompeticije u
hranidbenoj niši i do genetičkog onečišćenja (mekousna pastrva se
uspješno križa s potočnom pastrvom na prostoru gdje dijele ista
staništa).
2. Izgradnja pregrada i retencija koje postepeno dovode do zagrijavanja
vode. Temperatura od 20oC je letalna za mekousnu pastrvu.
3. Prekomjerno oduzimanje vode dovodi do smanjenja protoka i brzine
vode, što posebno za ljetnih mjeseci uvjetuje zagrijavanje vode.
Smanjenje brzine vodenog toka ima za posljedicu manju količinu
otopljenog kisika, na što je mekousna pastrva naročito osjetljiva.
Smanjen protok dovodi do nestanka brzica i slapova gdje
jednogodišnje jedinke nalaze zaklon.
4. Organska i druga onečišćenja su posredno i neposredno uzrok
smanjenja populacije. Razgradnjom organske tvari dolazi do povećane
potrošnje kisika, a mekousna pastrva se pokazala vrlo osjetljivom na
smanjenje količine kisika u vodi (Bonacci i sur., 1998).
5. Ribolov, naročito prelov, uzrokuje smanjenje prirodnih populacija, a s
time i inerpopulacijski i intrapopulacijski polimorfizm.
Mogućnost očuvanja ove vrste bila bi ponajprije prestanak unosa
alohtonih kompeticijskih ribljih vrsta, njena potpuna zaštita u smislu izlova,
nemijenjanje i neuništavanje njenih staništa, te uzgoj nasadnog materijala u
ribogojilištima, čije bi se potomstvo unosilo u prirodna staništa mekousne
pastrve. Ponovno obnavljanje uništenih i promijenjenih staništa vrlo je složeno
i zahtijeva velika sredstva.
Zaštita i obnavljanje promijenjenih i uništenih staništa vrlo je važna za
dugoročno očuvanje ugroženih vrsta. Pri tome bi prednost trebale imati one
vode kod kojih utjecaj čovjeka nije prevelik i u kojima još obitava vrsta ili
populacija koju želimo zaštiti. Potreban je potpuni nadzor takovih voda, a sve
46
aktivnosti koje bi negativno djelovale na ugroženu populaciju, treba svesti na
minimum (Sušnik, 2001).
Filogeografija je znanost koja se bavi geografskim distribucijama
evolucijskih linija i geografskim procesima koji su utjecali na te distribucije sa
osvrtom na različitost između i unutar srodnih vrsta. Filogeografske studije su
uvelike doprinijele razumijevanju evolucijskog procesa u riba (Avise, 2000) i
pomoću njih je poboljšan opis geografskih distribucija, filogenetskih odnosa i
genetskih udaljenosti između evolucijskih linija (Berningham i Moritz, 1998).
Kod filogeografskih istraživanja kao marker najviše je korištena
varijabilnost mtDNA. Razlog tome je njezina brza evolucija i materinsko
prenošenje bez intermolekularne rekombinacije (Avise, 2000). Međutim, zbog
toga što mitohondrijalni genom predstavlja samo mali fragment od ukupnog
povijesnog događaja, studije u kojima je korištena samo mtDNA često su bile
upitne i podvrgavane kritikama (Palumbi i Baker, 1994). Razlog tome je što u
takvim studijama često može doći do pogrešne interpretacije filogenetskih
veza, naročito u slučajevima kad je uključena i hibridizacija sa introgresijom
(Riesberg, 1998).
47
1.1.4. Osnovne postavke populacijske genetike
Znanost koja se bavi promjenama nasljednog materijala unutar
populacije, zove se populacijska genetika. Ona je usko vezna za genotipske
promjene, a zadatak joj je objasniti rasprostranjenost genetskih varijacija, te
objašnjenje porijekla, tijeka i evolucijskog značenja takvih varijacija (Li i
Grauer, 1991).
Kvantitativno određivanje genetskih varijacija moguće je provesti
pomoću frekvencije (učestalosti) alela (p).
p = (2 (AA) + (Aa)) / 2n
Frekvencija (p) bilo kojeg alela (A) jednaka je dvostrukom broju
homozigotnih genotipova tog alela (AA), budući da svaki homozigot nosi iste
dvije kopije alela, uvećanom za broj heterozigotnih genotipova koji sadrže
ovaj alel (Aa), podijeljen sa brojem uzoraka (n), (Nicholas, 1996).
Iz alela nastaju različiti genotipovi, frekvencija genotipova predstavlja
njihovu učestalost. Mjera genetske varijabilnosti je udio heterozigota u nekoj
populaciji. Učestalost alela a označava se kao q, stoga je u populaciji sa dva
alela ukupna suma frekvencija jednaka p + q = 1, jer učestalost alela u
populaciji slijedi binomnu raspodjelu.
Osnovni teorem populacijske genetike je Hardy-Weinbergov zakon
ravnoteže. Početkom prošloga stoljeća (1908. godine), engleski matematičar
Godfrey Hardy i njemački liječnik Wilhelm Weinberg, neovisno jedan o
drugome, objavili su teorijski ogled kojim se mogu predvidjeti učestalosti
genotipova na određenom lokusu. Matematički opisi nastali iz ovih postavki
poznati su pod nazivom Hardy-Weinbergov zakon ravnoteže. Ovaj zakon
predstavlja uvjet pod kojim su učestalosti alela i genotipova u diploidnim
organizmima, iz generacije u generaciju, jednake produktu učestalosti
uočenih alela, a matematički je izražavamo sljedećim odnosom:
Σ pi2 AiAi + Σ 2pipi Ai Aj
i i<j
48
Da bi Hardy-Weinbergov zakon ravnoteže bio valjan slijedeći uvjeti
trebaju biti zadovoljeni: postojanje dovoljno velike populacije, nasumično
sparivanje unutar populacije, isključiti postojanje mutacije, selekcije i
migracije.
Najčešće korišteni test u populacijskoj genetici je χ2 test (Hi kvadrat
test). Njega dobivamo iz podataka o uočenoj (obs) i očekivanoj (exp)
učestalosti genotipova.
χ 2 = S (obs – exp)2 / exp
Hardy-Weinbergov zakon testira se χ 2 testom, nakon određivanja
udjela homozigota (Hom) i heterozigota (Het) prema formuli:
χ 2 = (Homobs – Homexp)2 / Homexp + (Hetobs – Hetexp)
2 / Hetexp
1.1.4.1. Promjene genetskog materijala
Uzrok genetičkim varijacijama su mutacije. Mogućnost nastavljanja
evolucije ovisna je o novonastalim mutacijama koje se uspiju održati u
populaciji, odnosno o tome da svi potomci u narednim generacijama naslijede
mutirani gen. Bez porasta učestalosti, mutacija će imati mali značaj za
evolucijsku povijest neke vrste. Da bi se povećala učestalost mutiranom alelu,
osim same mutacije, moraju se razmotriti i drugi mogući čimbenici, kao što je
prirodna selekcija, genetički "drift", rekombinacija i migracije.
Stabilnost i varijabilnost genetskog materijala tijekom reprodukcije
osiguravaju postojanost vrste, dugoročnu prilagodljivost populacija i biološku
evoluciju. Maksimalna genetička stabilnost prednost je u populacijama koje su
dobro prilagođene na uvijete okoline, no prilagodba na nove selektivne uvijete
zahtijeva određeni stupanj genetičke varijabilnosti u populaciji. Svaka
promjena redoslijeda nukleotida u DNA ili strukture ili broja kromosoma u
stanici naziva se mutacijom. Neke mutacija uzrokuju smrt stanice, dok se
druge ustaljuju i stabilno nasljeđuju iz generacije u generaciju. Takve mutacije
49
mogu ili ostati prikrivene ili uzrokovati vidljive promjene fenotipa, odnosno
organizma. S obzirom na obujam genoma zahvaćenog promjenom, mutacije
mogu biti genske, kromosomske i genomske.
Mutacije mogu uzrokovati različite promijene:
• supstitucije – zamjene jednog nukleotida drugim. Zamjene
nukelotida mogu se podijeliti na tranzicije i transverzije. Pod
tranzicijom se smatra zamjena pirimidinske baze drugom
pirimidinskom bazom ili jednog purina drugim purinom, dok se pod
transverzijom podrazumijeva zamjena pirimidinske baze purinskom
ili purinske pirimidinskom bazom;
• delecije – uklanjanje jednog ili više nukleotida iz molekule DNA;
• insercije - umetanje jednog ili više nukleotida;
• inverzije – rotacija dvolančanog dijela DNA, duljine dvaju ili više
parova baza za 180o.
Prirodna selekcija je proces kod kojeg genetičke varijacije stvaraju
razlike između organizama u njihovoj sposobnosti preživljavanja i uspješnosti
reprodukcije. Genetički drift (engl. random genetic drift) ima važnu ulogu u
evoluciji, no njegov je utjecaj znakovit tek na molekularnoj razini. Slučajni
genetički dirft predstavlja kolebljivost u učestalosti alela (iz generacije u
generaciju) uzrokovanu slučajnim događajima poput slučajnog uzorkovanja
gameta. Stoga i kada bi sve jedinke u populaciji imale jednaku biološku
sposobnost, mijenjanje učestalosti alela bi postojalo radi nasumičnog
združivanja gameta. Genetska struktura populacije mijenja se dolaskom
novog gena u populaciju. Taj proces zove se "tok gena" (engl. gene flow) (Li i
Grauer, 1991).
Prisutnost više alela na određenom lokusu u populaciji gdje se svaki
alel pojavljuje sa "znatnom" frekvencijom, zove se genetički polimorfizam.
"Znatna" je ona frekvencija koja je viša od one stvorene tijekom mutacijskog
procesa. Premda u prirodi svi geni mutiraju većina tih mutacija, vrlo često
nestane pa ih ne uspijemo registrirati. No, ako se promatra populacija u točno
određenom trenutku, ne mogu se otkriti svi aleli već samo oni koji se zadrže u
populaciji kroz dulji period i prisutni su sa "znatnim" frekvencijama. Brojčana
50
granica koja označava "znatnu" frekvenciju i kojom se dogovorno služe
genetičari, je 0,01. Ako se jedan alel javlja s učestalošću većom ili jednakom
0,01 tada predstavlja polimorfizam - u suprotnom ga ne smatramo
polimorfizmom (Ford-Llyoyd, 1996).
Glavni mehanizam za stvaranje polimorfizama kod mikrosatelita je
pogrešno sparivanje baza ispadom dijela sekvence. Ta se pojava događa
kada je normalno sparivanje baza dvaju komplementarnih lanaca DNA
ometeno razmicanjem ponavljajućeg niza na oba lanca, što dovodi do
pogrešnog nizanja ponavljajućih sekvenci. Ovaj se mehanizam naziva i
replikacijski ispad (engl. replication slippage) jer se zbiva tijekom replikacije
kada DNA postaje jednolančana, a svaki lanac služi kao kalup za
polimerizaciju novog komplementa.
51
2. MATERIJAL I METODE RADA
U istraživanje je uključeno 79 primjeraka pastrva: 55 mekousnih i 24
potočne pastrve iz 5 različitih populacija (Tablica 1). Na tri uzorka mekousne
pastrve izvršena su morfometrijska mjerenja. Morfometrijska mjerenja
izvršena su samo na uzorcima koji su uginuli, dva uzorka su nađena u donjem
toku rijeke, a jedan primjerak je uginuo prilikom uzorkovanja, budući da se
radi o osjetljivoj i ugroženoj vrsti.
Većina uzoraka prikupljena je iz rijeka na području Republike Hrvatske,
Jadra, Žrnovnice, Zrmanje i Krke, dok je samo 7 uzoraka mekousne pastrve
prikupljeno iz rijeke Neretve u Bosni i Hercegovini. U rijeci Jadro prikupili smo
19, u rijeci Žrnovnici 29 uzoraka mekousne pastrve. U rijeci Krki prikupljeno je
19 i u rijeci Zrmanji 5 uzoraka potočne pastrve. Sve populacije imaju
karakterističan fenotip, te ih je lako međusobno razlikovati.
Uzorkovanje je izvršeno u razdoblju između 2001. i 2003. godine.
Ribe su hvatane u gornjim tokovima rijeka električnim agregatom
"Sever". Nakon uzimanja uzoraka za molekularnu analizu i mjerenja, puštene
su natrag u vodu. Ribama smo odstranili dio podrepne peraje, oko 0,5 cm2, i
pohranili ih u 96% etanolu do daljnje analize.
52
Tablica 1: Pregled broja uzoraka s obzirom na vrstu, lokalitet i obavljene
analize; mtDNA/MS (analiza mitohondrijske i mikrosatelitske DNA), mtDNA
(analiza mitohondrijske DNA), MS (analiza mikrosatelitske DNA).
Vrsta Lokalitet Morfometrijska
mjerenja mtDNA/MS mtDNA MS Ukupno
Salmo trutta
Krka 13 19 13 45
Zrmanja 5 2 5 12
Salmothymus
obtusirostris
Jadro 3 19 19 19 60
Žrnovnica 19 29 19 67
Neretva 7 7 7 21
Ukupno 3 63 76 63
2. 1. MORFOMETRIJSKE ANALIZE
Prilikom istraživanja na rijeci Jadro, jedan primjerak mekousne pastrve je
uginuo, a dvije mekousne pastrve su nađene uginule u donjim tokovima
rijeke. Na tim uzorcima obavljene su sljedeće morfometrijske analize:
• to totalna dužina tijela. Udaljenost između vrha ustiju i linije koja
spaja krakove repne peraje.
• a1 standardna dužina tijela. Udaljenost između vrha ustiju i točke
od koje počinju žbice repne peraje.
• a dužina do vilice. Udaljenost između vrha ustiju i vrhova srednjih
žbica repne peraje.
• H najveća visina tijela
• â najmanja visina tijela
• u antenalno rastojanje
53
• m antedorzalno rastojanje
• r anteventralno rastojanje
• q udaljenost između prsnih i trbušnih peraja
• t udaljenost između trbušne i podrepne peraje
• p dužina prsne peraje
• s dužina trbušne peraje
• n dužina osnove leđne peraje
• o1 visina prednjeg dijela leđne peraje
• o2 visina zadnjeg dijela leđne peraje
• v dužina osnove podrepne peraje
• x visina podrepne peraje
• z udaljenost između podrepne i osnove repne peraje
• y udaljenost između masne i osnove repne peraje
• y1 dužina repnog stabla
• o0 dužina gornjeg dijela repne peraje
• o01 dužina donjeg dijela repne peraje
• a0 dužina srednjih žbica repne peraje
• b dužina glave. Udaljenost između vrha ustiju i prednje ivice oka.
• ch2 visina glave u zatiljku
• ch1 visina glave u očnom dijelu
• f dužina postokularnog dijela glave
• c uzdužni dijametar oka
• g širina međuočnog prostora
• h dužina gornje vilice. Udaljenost između vrha vilice i zadnje sdfas
adf a vilične točke.
• i širina gornje vilice
• k dužina donje vilice. Udaljenost između vrha donje vilice i zadnje
faasf vilične točke.
• sp.br. broj branhiospina na prvom škržnom luku
• 1.1. broj ljuski u bočnoj liniji
• 1.2. broj redova ljuski od bočne linije do leđne peraje
• 1.3. broj redova ljuski od bočne linije do trbušne peraje
54
• D broj žbica u leđnoj peraji
• V broj žbica u trbušnoj peraji
• P broj žbica u prsnoj peraji
• A broj žbica u podrepnoj peraji
• Vert. S. ukupan broj kralježaka
• Caud. V. broj kaudalnih kralježaka
• App. pyl. broj piloričkih nastavaka
Ukupan broj kralježaka određen je na osnovi rengen fotografije (Slika 14).
Slika 14: Rengen fotografija kostura mekousne pastrve iz rijeke Jadro
55
Statistička obrada morfometrijskih metoda
Za obračunavanje dobivenih morfometrijskih vrijednosti upotrebljena je
varijaciono-statistička metoda sa sljedećim elementima: srednja vrijednost i
standardna devijacija.
Da bi se usporedili s rezultatima od Janković (1961), Behnke (1968) i
Marić (2002), dobiveni podaci su stavljeni u odnos s dužinom vilice i totalnom
dužinom, a mjere na glavi s dužinom glave.
2.2. PREGLED PROBAVILA
Kod tri primjerka mekousne pastrve iz rijeke Jadro, uz morfometrijske
metode, obavili smo i pregled probavila. Pregledom krugova priraštaja (anula)
na ljuskama utvrdili smo starost primjeraka, koja je iznosila od 1 do 3 godine
(Treer i sur., 2003b).
Analiza ishrane izvršena je prema želučanom i crijevnom sadržaju.
Sadržaj probavila izdvojili smo u epruvetu s alkoholom i promatrali
stereomikroskopom.
56
2.3. MOLEKULARNO-GENETSKE ANALIZE
2.3.1. Izolacija DNA
DNA molekulu izolirali smo iz tkiva podrepne peraje na tri različita
načina. Prvi korak u svim postupcima je bio, da smo od pohranjenog dijela
podrepne peraje odrezali manji dio tkiva i oprali ga od alkohola destiliranom
vodom.
Prvi postupak koji smo primjenjivali je tzv. “brza izolacija DNA”
(Bowling i sur., 2000). Radili smo je tako da smo uzorku dodali 50 µl 0,2 M
NaOH, zagrijavali ga na 97ºC 15 minuta, a otopinu zatim smo neutralizirali
dodatkom 50 µl 0,2 M NaCl uz snažno miješanje. Da bi stabilizirali DNA
molekulu, otopini smo dodali 50 µl 1 M Tris-HCl pufera, pH 8,5.
Druga metoda izolacije koju smo koristili je metoda izolacije iz tkiva
pomoću kitova za izolaciju Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega).
Izolaciju smo vršili prema uputama proizvođača.
Treća metoda izolacije DNA molekule koju smo koristili, bila je prema
protokolu White i Densmore (1992). Mali dio tkiva stavili smo preko noći u 200
µl Lysis pufera (1M Tris-HCl, 2M MgCl2, 1M KCl, pH 8,3) i 4 µl Proteinaze K
na 370C. Nakon inkubacije dodali smo jednak volumen fenol/koloroforma u
digestoru, nakon čega je uzorak centrifugiran (14 500 x g/12 min). Gornju
frakciju, u kojoj se nalazi otopljena DNA, smo otpipetirali, pri čemu smo pazili
da ne uzmemo dio bijelog taloga u kojem su se nalazili proteini. U
odpipetiranu frakciju dodali smo jednak volumen koloroforma i ponovili
postupak. Uslijedila je precipitacija sa 2,5 volumena 96% etanola ohlađenog
na -200C, te smo uzorke ostavili pola sata na -200C. Nakon precipitacije
uzorke smo centrifugirali (10 000 x g 10 min), odstranjen je etanol i
precipitacija ponovljena sa 500 µl 70% etanola. Nakon centrifugiranja (10 000
x g 7 min) odstranili smo etanol, a sadržaj posušili do voskaste konzistencije
(do ishlapljenja etanola). Posušenim uzorcima dodali smo 30 µl Milli Q vode,
pri čemu smo otopili DNA. Uzorke smo do analize pohranili na 40C.
57
2.3.2. Provjera uspješnosti izolacije DNA
Uspješnost izolacije DNA provjerili smo na 1% agaroznom gelu u 0,5 x
TBE puferskom sustavu. Na gel smo nanijeli 1,5 µl otopljene DNA. Uzorke
smo vizualizirali pomoću Macrouve UV transilluminatora.
Slika 15: Izolirana DNA iz uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro
2.3.3. Analiza mikrosatelitske DNA
2.3.3.1. Izbor mikrosatelita i začetnih nukleotida
Za populacijsku studiju mekousne pastrve odabrali smo osam
mikrosatelita iz genetske knjižnice salmonidnih vrsta BFRO 001 (Snoj i sur.,
1997; U90327), BFRO 002 (Susnik i sur., 1997; AF005074), Ssa 197 (O’Reilly
i sur., 1996; U43694), SsoSL438 (Slettan, 1995; Z49134), Strutta-24 i Strutta-
58 (Poteaux i sur., 1999; U60225 i U60223), Str591INRA (Presa i Guyomard,
1996; AB001064) i OmyFgt1TUF (Sakamoto i sur., 1994). Naknadno je
odabran i mikrosatelitski lokus nađen u četvrtom intronu LDH-C1* gena
StMS-LDH4, to je lokus koji se pokazao specifičnim za mekousnu pastrvu iz
rijeke Neretve. Začetni nukleotidi korišteni za njegovu amplifikaciju su LDH1-
MSf (5’-TCA TCA AAC ACT CCC CCA ACT GC-3’) i LDH1R (McMeel i sur.,
2001).
58
Tablica 2: Pregled upotrebljenih mikrosatelitskih lokusa. Ime lokusa,
ponavljajuća mu jedinica, broj alela, njihova dužina i nukleotidni slijed
začetnog nukleotida.
Ime lokusa Ponavljajući
motiv
Broj
alela
Veličina
alela
(bp)
Nukleotidni slijed začetnog nukleotida
BFRO 001(1)
(TG)13(AG)4(TG)2-
CATGTGCGAC-
(TG)12
22 200-256 5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’
5’ CTTACAGCCACCTTTATGCG 3’
BFRO 002(2) (TG)14 3 116-124 5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’
5’GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3’
Ssa 197(3) (GTGA)+(GT) 18 107-177 5’ GGGTTGAGTAGGGAGGCTTA 3’
5’ TGGCAGGGATTTGACATAAC 3’
Strutta 58(4) GT 38 102-190
5’ AACAATGACTTTCTCTGAC 3’
5’ AAGGACTTGAAGGACGAC 3’
Str 591 INRA(5) CT 22 146-198
5’ CTGGTGGCAGGATTTGA 3’
5’ CACTGTCTTTCGTTCTT 3’
Strutta 24(6) GT 20 171-237
5’ ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3’
5’GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3’
OmyFgt1TUF(7) GT 27 187-263
5'-AGATTTACCCAGCCAGGTAG-3'
5'-CATAGTCTGAACAGGGACAG-3'
SsoSL438(8) GT 7 103-115
5’ GACAACACACAACCAAGGCAC 3’
5’ TTATGCTAGGTCTTTATGCATTGT 3’
(1) Snoj i sur., 1997
(2) Sušnik i sur., 1997
(3) O’Reilly i sur., 1996
(4) Poteaux, 1995
(5) Presa i Guyomard, 1996
(6) Poteaux i sur., 1999
(7) Sakamoto i sur., 1994
(8) Slettan, 1995
59
Fluorescentno označene začetne nukleotide upotrijebili smo za
određivanje dužine mikrosatelitskih lokusa na aparatu ABI PRISMTM 310
(Parkin Elmer). S različitim bojama smo označili po jedan od para začetnih
nukleotida. Istraživanje smo vršili u dvije skupine u prvoj je kao standard
korišten Rox, a začetni nukleotidi su nosili sljedeće boje: BFRO 001 Fam, Str
591 INRA i SsoSL438 Joe, a OmyFgt1TUF i Strutta 58 Tamru. U drugoj
skupini standard je bio Tamra, a začetni nukleotidi su nosili sljedeće boje: Str
24 i LDH Fam, Ssa 197 Tet, a BFRO 002 Hex.
2.3.3.2. Lančana reakcija polimerazom (PCR)
Lančanom reakcijom polimeraze umnožili smo odsječke na molekuli
DNA. Reakcija se odvijala u tri stupnja na različitim temperaturama. U prvom
stupnju pri visokoj temperaturi došlo je do denaturacije dvolančane molekule
DNA. Pri snižavanju temperature začetni nukleotidi su prilegli uz
komplementarna mjesta na molekuli, a uz prisustvo enzima polimeraze došlo
je do sinteze komplementarnog lanca DNA.
U lančanoj reakciji polimeraze za svaki mikrosatelitski lokus pripremili
smo reakcijsku smjesu od 10 µl, sljedećeg sastava:
50 ng genomske DNA
0,5 µM svakog začetnog nukleotida od para
0,2 mM dNTP-a (smjesa četiri nukleotida)
1,5 mM MgCl2
20 mM Tris-HCl
50 mM KCl
0,5 U/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)
Reakcija je provedena u termostatu PTC-100TM Programmable
Thermal Contoller (MJ Research, Inc.). Nakon 3 minute početne denaturacije
pri 95ºC slijedilo je 30 ciklusa jednog od dvaju temperaturnih profila:
60
Za lokuse BFRO 001, Strutta 58, Str 591 INRA, SsoSL438,
OmyFgt1TUF, Strutta 58, Str 24, LDH i Ssa 197
denaturacija 940C, 30 sekunda
prilijeganje 520C, 15 sekunda
Za lokus BFRO 002:
denaturacija 940C, 45 sekunda
prilijeganje 600C, 25 sekunda
Sinteza DNA lanca događala se pri 720C, a reakciju smo završili
hlađenjem na 140C.
2.3.3.3. Elektroforeza na agaroznom gelu
Za određivanje dužine PCR produkata, te za njihovu naknadnu
izolaciju, koristili smo elektroforezu na agaroznom gelu. Koristili smo gelove
različite veličine u različitim elektroforetskim jedinicama (Biorad, LKB-
Pharmacia). Dužina fragmenata, dobivenih nakon PCR reakcije, određena je
uz pomoć DNA markera znanih veličina, od 100 do 10 000 bp (100 bp DNA
ladder i 1 kb DNA ladder, Gibco BRL). Kao pufer korišten je 0,5xTBE (50 mM
Tris, 50 mM borna kiselina, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Agarozni gel napravili smo zagrijavanjem određene količine agaroze
(SeaKem LE, Biozym) u 0,5xTBE puferu. Koncentracija agaroznog gela
ovisila je o dužini dobivenih fragmenata. Duži fragmenti se teže kreću kroz
agarozni gel, te su zahtijevali gelove niže koncentracije. Nakon što se smjesa
za gel ohladila na oko 500C dodali smo etidijev bromid u koncentraciji od 0,5
µg/ml, te ga ulili u kalup za gel.
Da bismo pratili kretanje uzoraka u gelu, uzorcima smo prije nanošenja
u gel dodali pufer u odnosu 10:1. Pufer se sastojao od bromfenol modrila
(0,25%), ksilen cianola (0,25%) i 30% glicerola.
61
Elektroforeza se odvijala pri sobnoj temperaturi oko pola sata pri
početnom naponu od 9 V/cm, koji smo kasnije pojačali na 12 V/cm.
Fragmente smo promatrali pod transiluminantnim svjetlom valne dužine 302
nm.
Slika 16: Fragmenti mikrosatelita OmyFgt1TUF na 1,5% agaroznom gelu.
2.3.3.4. Analiza mikrosatelitskih lokusa na ABI PRISMTM 310
Mikrosatelitske lokuse analizirali smo na automatskom sekvenceru ABI
PRISMTM 310 (Perkin Elmer), koji omogućuje automatsko određivanje
nukleotidnih jedinica kao i određivanje dužine i količine fragmenata DNA
molekule.
Uzorke smo pripremili umnožavanjem na PCR-u, gdje smo po jedan
začetni nukelotid od para označili sa fluorescentnom bojom (Fam, Hex,
Tamra, Joe ili Tet). Na jedan µl PCR produkta dodali smo 12 µl deioniziranog
formamida i 0,7 µl standarde veličine, Tamra 350 ili Rox 350. Podizanjem
temperature na 950C došlo je do denaturacije, nakon čega smo uzorke
ohladili na ledu. Denaturirane uzorke smo stavili na ABI PRISMTM 310. Do
elektroforetskog razdvajanja fragmenata došlo je u 47 cm dugoj kapilari sa
gelom POP-4 (Performance Optimized Polymers). Razdvajanje fragmenata
teklo je po principu kapilarne elektroforeze. Laser u aparatu uzbudio je emisiju
fluorescentnih boja, a detektor ih je očitao. Dobiveni podaci su obrađeni na
kompjutoru programom GeneScan 2.1.
62
2.3.3.5. Statistička analiza mikrosatelitskih podataka
Kompjutorski programi GENETIX (Belkhir i sur. 1998) i Fstat (Goudet,
1995) korišteni su pri statističkoj analizi mikosatelitskih podataka. Statističkim
metodama obrađeni su odnosi između jedinki, odnosi jedinki unutar populacija
i odnosi između različitih populacija.
• Za ispitivanje odnosa između pojedinih jedinki služili smo se analizom
glavnih koordinata (engl. correspondence analyses). Jedinke smo prvo
svrstali s obzirom na prisutnost različitih alela. S vrijednošću 0
označena je ona jedinka koja nije imala promatrani alel; s vrijednošću 1
ona jedinka koja je imala prisutan promatrani alel u heterozigotnom
obliku, dok je sa 2 označena ona jedinka kod koje je promatrani alel bio
prisutan u homozigotnom obliku. Daljnjim izračunavanjem veza između
alela pomoću analize glanih kooridanta dobili smo podatke u
višedimenzionalnoj strukturi.
• Za proučavanje jedinki unutar populacije koristili smo dva parametra:
stupanj polimorfizma i ravnotežu genotipova unutar populacije.
Genetski polimorfizam kod svake populacije odredili smo s obzirom na
broj alela na lokusu, stvarnu i očekivanu heterozigotnost.
o stupanj polimorfizma unutar populacije
Izračunali smo frekvencije alela i udio heterozigotnosti.
Očekivanu heterozigotnost smo izračunali iz broja pojedinačnih
alela u populaciji s obzirom na Hardy-Weinbergov zakon
ravnoteže (Nei, 1972). Stvarnu heterozigotnost smo izračunali iz
stvarnog udjela heterozigota u populaciji.
o ravnoteža unutar populacije
Pri ocjeni ravnoteže unutar populacije služili smo se F-
statistikom koja ocjenjuje odstupanje od Hardy-Weinbergovog
zakona ravnoteže (Wright, 1951). Panmiksiju smo mjerili s
63
parametrom FIS (Weir i Cockerham, 1984). Negativna FIS
vrijednost ukazuje na to da je u populaciji stvarna
heterozigotnost manja od očekivane.
• Odnosi između populacija
Razlike između populacija izračunali smo pomoću parametra θ (Wei i
Coockerham, 1984). Parametar θ je ocjena za FST. Prilagođen malim i
nejednako velikim populacijama ili manjem broju populacija.
2.3.4. Analiza LDH gena
2.3.4.1. Sekvencioniranje LDH gena
Začetni nukelotidi Ldhxon3F i Ldhxon4R (McMeel i sur., 2001) su
korišteni za amplifikaciju 440 bp dugog fragmenta gena laktat dehidrogenaze.
Gen laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* sastoji se od egzona 3, dugog 43 bp,
egzona 4, dugog 3,77 bp i introna 3, varijabilne dužine.
Amplifikacija je provedena na termostatu PTC-100TM Programmable
Thermal Contoller (MJ Research, Inc.). Ukupan volumen reakcijske smjese od
20 µl sadržavao je:
100 ng genomske DNA
1 µM svakog začetnog nukleotida od para
0,2 mM dNTP-a (smjesa četiri nukleotida)
1,5 mM MgCl2
20 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 U/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)
64
Uzorci su amplificirani po sljedećem vremensko-temperaturnom okviru:
početnu denaturaciju od 950C, koja je trajala 3 minute, slijedilo je 30 ciklusa
od denaturacije (940C, 30 sekunda), prilijeganja začetnih nukleotida (620C, 30
sekunda) i produženja DNA lanca (720C, 1 minutu).
Amplificirani DNA fragmenti promatrani su na 1,5 % agaroznom gelu, iz
kojeg su izolirani sa QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN), prema uputama
proizvođača.
Reakcije za sekvencioniranje su pripremljene sa BigDye Terminator
Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems), prema uputama proizvođača.
Za sekvencioniranje gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* korišten je začetni
nukleotid Ldhxon3R (McMeel i sur., 2001). Lančana reakcija polimeraze
provedena je na termostatu PTC-100TM Programmable Thermal Contoller (MJ
Research, Inc.) po sljedećem vremensko-temperaturnom okviru: 30
ponavljajućih ciklusa sastojalo se od denaturacije na 960C koja je trajala 10
sekundi, prilijeganja začetnih nukleotida na 500C od 5 sekunda i produžavanje
lanca na 600C od 4 minute.
Nakon sekvencijske reakcije, neupotrebljene fluorescentno označene
dideoksinukleotide i začetne nukleotide, odstranili smo precipitacijom s
natrijevim acetatom. Ukupnom volumenu sekvencijske reakcije dodali smo 2
µl 3 M natrijevog acetata i 50 µl 96 % etanola. Slijedila je inkubacija na ledu,
te centrifugiranje od 20.000 x g 25 minuta. Sediment koji je sadržavao
percipitirane fragmente sekvencijske reakcije oprali smo u 70 % etanolu, te
zatim centrifugirali 5 minuta. Talog smo osušili u vakumskoj centrifugi, te smo
ga zatim razrijedili sa 12 µl TRS (Template Suppression reagent, PE Applied
Biosystem). Uzorke smo denaturirali 2 minute na 950C i ohladili ih na ledu.
Uzorci su sekvencionirani na ABI Prism 310 automatskom sekvenceru. Za
analizu sekvencioniranja upotrebljen je programski paket DNA Sequencing
Analysis Software 3.0.
65
2.3.4.2. Analiza odsječaka LDH, DNA molekule sa tehnikom RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymophism)
Sekvencioniranjem smo pronašli dijagnostičnu mutaciju na intronu 3
koja je specifična za mekousnu pastrvu, i koju je bilo moguće otkriti s
restrikcijskim enzimom Rsal. Sve uzorke testirali smo sa RFLP analizom i na
taj način razlikovali uzorke koji su imali sekvencu značajnu za mekousnu
pastrvu.
Na umnoženom dijelu nuklearne DNA, LDH dijelu, provjerili smo
polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaje restrikcijski enzim Rsa I.
Restrikcijska endonukleaza Rsa I cijepa produkte na prepoznatljivoj sekvenci
gt/ac.
Restrikcijska smjesa od 15 µl sastojala se od:
300 ng PCR produkta
2 µl 10 X restrikcijskog pufera
10 U restrikcijskog enzima
Reakcijske smjese stavili smo na inkubaciju od 2 sata pri 370C.
66
2.3.5. Analiza mitohondrijske DNA
2.3.5.1. Umnožavanje odsjeka mtDNA s lančanom reakcijom polimeraze
(PCR)
Pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR-a) umnožili smo dio
mitohondrijalne DNA molekule dužine 1200 bp, kontrolnu ili D-loop regiju i
područje citokorma b.
Pri amplifikaciji kontrolne regije mtDNA koristili smo začetne nukleotide:
28r 5’-CACCTTAACTCCCAAAGCTAAG-3’, (Snoj i sur., 2002a)
HN20 5’-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3’, (Bernachez i Danzmann,
1993)
Pri amplifikaciji citokroma b koristili smo začetne nukleotide:
C-Glu 5’-TGACTTGAAAAACCACCGTTGTTA-3’, (Cronin i sur., 1993)
28r 5’-CACCTTAACTCCCAAAGCTAAG-3’, (Snoj i sur., 2002a)
Slika 17: Raspored gena i restrikcijskih mjesta na mitohondrijskoj DNA
molekuli, dužine 166 666 bp, vrste Salmo salar (Hurst i sur., 1999).
67
Reakcijska smjesa od 20 µl sadržavala je :
100 ng genomske DNA
1 µM svakog začetnog nukleotida od para
0,2 mM dNTP-a (smjesa četiri nukleotida)
1,5 mM MgCl2
20 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 U/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)
PCR reakcija je rađena na MJ Research PTC-100 termostatu po
sljedećem vremensko-temperaturnom okviru: početnoj 3 minutnoj denaturaciji
na 940C slijedilo je 30 ciklusa sastavljenih od: denaturacije od 45 sekundi na
940C, prilijeganja začetnih nukleotida od 30 sekundi na 530C i produženja
lanca u vremenu od 1 minute na 720C.
Umnoženi dio DNA molekule promatrali smo na 1,5% agaroznom gelu.
Fragmente iz gela očistili smo koristeći komplet QIAEX II Gel Extaction Kit
(QIAGEN), prema uputama proizvođača.
2.3.5.2. Analiza odsječaka mtDNA molekule sa tehnikom RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymophism)
Na umnoženom dijelu mtDNA, kontrolnoj regiji, provjerili smo
polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaju restrikcijski enzimi.
Upotrijebili smo restrikcijske enzime Alu I i Eco 130 I. Restrikcijska
endonukleaza Alu I cijepa produkte na prepoznatljivoj sekvenci ag/ct, a Eco
130 I na sekvenci c/cttgg. Restrikcijske smjese od 15 µl sadržavale su :
300 ng PCR produkta
2 µl 10 X restrikcijskog pufera
10 U restrikcijskog enzima
Reakcijske smjese stavili smo na inkubaciju od 3 sata pri 370C.
68
2.3.5.3. Sekvencioniranje dijela gena za citokrom b i dijela kontrolne regije
mtDNA molekule
Sekvencioniranje je izvršeno na dva odsječka mtDNA, koja su
prethodno umnožena lančanom reakcijom polimeraze: na 5- kraju gena za
citokrom b i na 5- kraju kontrolne regije.
Za sekvencioniranje smo upotrijebili komplet ABI PRISM dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystem).
Sekvencijska reakcija imala je volumen od 15 µl, a sastav je imala prema
uputama proizvođača. Sekvencijska reakcija izvedena je na termostatu
GeneAmp PCR 2400 (PE Applied Biosystem), a imala je 35 ciklusa sa
sljedećim vremensko-temperaturnim profilom: 30 sekundi na 950C, 15
sekundi na 500C i 4 minute na 600C. Nakon sekvencijske reakcije,
neupotrebljene fluorescentno označene dideoksinukleotide i začetne
nukleotide, odstranili smo precipitacijom s natrijevim acetatom. Za analizu
sekvencioniranja upotrebljen je programski paket DNA Sequencing Analysis
Software 3.0.
2.3.5.4. Analiza produkata sekvencioniranja
Populacijska analiza obavljena je na osnovi frekvencijskog rasporeda
haplotipova pomoću kompjutorskih programa ClustalX (Thompson i sur.,
1994), Mega (Ver. 2.100), (Kumar i sur. 2001) i ARLEQUIN (Ver. 2.000),
(Schneider i sur., 2000).
69
3. REZULTATI
3.1. MORFOLOŠKA OBILJEŽJA MEKOUSNE PASTRVE (S. o.
salonitana)
Vrijednosti morfoloških osobina mekousne pastrve iz rijeke Jadro
prikazane su u tablici 3. Za obračunavanje dobivenih morfometrijskih
vrijednosti upotrebljena je varijaciono-statistička metoda sa sljedećim
elementima: srednja vrijednost i standardna devijacija. Morfološka obilježja
prikazali smo kao proporciju s dužinom vilice i dužinom glave (Janković,
1961).
Tablica 3. Morfometrijska i meristička obilježja mekousne pastrve
(Salmothymus obtusirostis salonitana) iz rijeke Jadro.
Oznake
proporcija
obilježja
x±sd
a1/a 91,29±0,93
u/a 69,44±0,7
m/a 42,41±0,43
r/a 48,23±0,47
q/a 27,48±0,29
t/a 25,19±0,34
p/a 15,25±0,13
s/a 12,64±0,12
n/a 12,04±0,12
o1/a 14,95±0,13
o2/a 6,87±0,07
v/a 12,5±0,17
x/a 12,64±0,18
70
z/a 19,64±0,24
y/a 10,99±0,12
y1/a 32,98±0,37
H/a 22.58±0,33
â/a 8,84±0,08
o0/a 16,76±0,16
o01/a 17,4±0,17
a0/a 8,24±0,09
b/a 21,53±0,19
f/a 11,26±0,1
c/a 4,26±0,01
h/a 8,7±0,08
i/a 7,14±0,06
k/a 10,99±0,06
g/a 6,23±0,01
ch2/a 19,94±0,16
ch1/a 12,36±0,11
â/b 41,06±0,45
a0/b 38,93±0,46
f/b 52,34±0,54
c/b 14,98±0,09
h/b 17,02±0,43
i/b 33,19±0,31
k/b 33,93±0,33
g/b 26,8±0,06
ch2/b 78,72±0,11
ch1/b 57,44±0,59
sp. br. 23,66±0,57
ll 106,66±6,65
D 13±0
71
P 12,66±1,15
V 9±0
A 12±1
Vert. S. 57±0
Caud. V. 23±0
App. pyl. 70±7
Kod tri analizirana primjerka mekousne pastrve ustanovili smo da su
svi mužjaci. Dužina tijela analiziranih primjeraka kretala se od 9,9 do 30,6 cm,
a težina tijela od 4,4 do 290 g. Najveća varijabilnost bila je prisutna u broju
piloričkih nastavaka od 63 do 77.
U tablici 4 prikazane su morformetrijske osobina kod mekousne pastrve
solinke iz rijeke Jadro (S. o. salonitana) i mekousne pastrve iz rijeke Neretve
(S. o. oxyrhynchus). Vrijednosti su prikazane u postotcima u osnosu na
dužinu glave te dužinu tijela, gdje je promatrana dužina vilice kako bi se
podatci usporedili sa onima od Janković (1961).
Tablica 4: Morfometijske osobine kod dviju podvrsta mekousne pastrve
S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus.
S. o. salonitana S. o. oxyrhynchus
Dužina glave u dužini tijela 21-24% 18-24%
Dužina gornje vilice u dužini glave 8% 36-39%
Dužina gornje vilice u dužini tijela 5-11% 24-36%
Širina gornje vilice u dužini tijela 7-8% 2-4%
Širina gornje vilice u dužini glave 34-36% 11-20%
Dužina donje vilice u dužini tijela 7-11% 7-15%
Dužina donje vilice u dužini glave 36-45% 41-64%
Uzdužni dijametar oka u dužini tijela 4-8% 4-9%
Uzdužni dijametar oka u dužini glave 18-32% 21-46%
72
Postkaudalno rastojanje glave prema
dužini tijela 11-12% 8-16%
Postkaudalno rastojanje glave prema
dužini glave 50-52% 43-66%
Antedorzalno rastojanje glave prema
dužini tijela 40-42% 38-49%
Osnova leđene peraje prema dužini tijela 11-12% 9-14%
Osnova podrepne peraje prema dužini
tijela 5-14% 5-9%
Dužina prsne peraje prema dužini tijela 15-17% 15-20%
Dužina trbušne peraje prema dužini tijela 13% 12-15%
Najveća visina tijela prema dužini tijela 21-23% 18-24%
Najmanja visina tijela prema dužini tijela 9% 7-10%
Broj žbica u perajama D III-10 P I-12(14) V I-8
A II(I)-10(11)
D IV-12(10) P I-12 V II-8
A IV-9
Broj ljuski u bočnoj liniji 101-104 102-123
Broj branhiospina na prvom škržnom
luku 23-24 16-31
Broj kralježaka 57 53-70
Broj kaudalnih kralježaka 22-23 21-34
U tablici 5 prikazane su morfometijske osobine mekousne pastrve iz rijeke
Jadro (S. o. salonitana), potočne pastrve (Salmo trutta) (Marić, 2002) i
enemskog salmonida iz Turske Platysalmo platycephalus (Behnke, 1968).
Morfometijske osobine su promatrane kao proporcije sa dužinom glave i sa
totalnom dužinom tijela.
73
Tablica 5: Morfometijske osobine kod mekousne pastrve (S. o.
salonitana), potočne pastrve (Salmo trutta) i Platysalmo platycephalus.
S. o. salonitana Salmo trutta
Platysalmo
platycephalus
Udio standardne dužine
prema dužini tijela 86,91±0,09 89,46±0,95 83,83±0,93
Dužina gornje vilice u
totalnoj dužini tijela 8,28±0,08 11,15±0,15 11,11±0,11
Dužina gornje vilice prema
dužini glave 17,02±0,34 46,71±0,32
Dužina donje vilice prema
totalnoj dužini 7,98±0,05 11,58±0,16
Najveća visina tijela 21,5±0,23 20,93±0,23
Dužina prsne peraje prema
totalnoj dužni tijela 14,52±0,13 15,7±0,05
Dužina trbušne peraje prema
totalnoj dužni tijela 12,03±0,12 12,48±0,03
Dužina leđne peraje prema
totalnoj dužni tijela 11,46±0,12 11,29±0,19
Dužina osnove podrepne
peraje prema totalnoj dužni
tijela
11,9±0,17 8,72±0,13
Dužina glave prema totalnoj
dužini tijela 20,49±0,19 23,78±0,34
Broj branhiospina na prvom
škržnom luku 23,66±0,57 23,33±0,57
Broj ljuski u bočnoj liniji 106,66±6,65 109,66±0,57
Broj redova ljuski od bočne
linije do trbuše peraje 17,33±1,52 17,66±0,57
Broj redova ljuski od bočne
linije do leđne peraje 17±2,64 28,33±0,57
Broj kaudalnih kralježaka 57 58±1
Broj piloričkih nastavaka 57 15,66±0,5
74
3.2. ANALIZA PREHRANE MEKOUSNE PASTRVE (S. o.
salonitana)
Analizu prehrane izvršili smo na tri primjerka mekousne pastrve iz
rijeke Jadro od kojih su dva nađena uginula u donjem toku rijeke, a jedan je
uginuo prilikom uzorkovanja. Vizualno smo utvrdili da se radi o praznom
probavilu kod sva tri primjerka, no unatoč tome, sadržaj probavila je izdvojen
u epruvetu sa alkoholom, i promatran stereomikroskopom. Analizom
želučanog i crijevnog sadržaja ustanovili smo da sva tri primjerka imaju
potpuno prazno probavilo.
75
3.3. ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA
3.3.1. Analiza kontrolne regije mtDNA s tehnikom RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymophism)
Stupanj polimorfizma približno 1200 bp dugog dijela mitohondrijske
DNA koji obuhvaća kontrolnu regiju, proučili smo korištenjem tehnike RFLP.
Izabrane uzorke analizirali smo sa restrikcijskim enzimom Alu I koji je
omogućio nastajanje polimorfnih restrikcijskih fragmenata, te na taj način
prvotno razlikovanje populacija mekousne i potočne pastrve. Uzorkovanje
smo proveli na 7 uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Neretve, 7 uzoraka
mekousne pastrve iz rijeke Jadro, 6 uzoraka mekousne pastrve iz rijeke
Žrnovnice, 5 uzoraka potočne pastrve iz rijeke Krke i 5 uzoraka potočne
pastrve iz rijeke Zrmanje.
Restrikcijski enzim Alu I rezao je uzorke iz populacije mekousne
pastrve iz rijeke Neretve na tri mjesta, stvarajući pri tome četiri odsječka duga
464, 252, 129 i 37 bp, dok je populacije potočne pastrve iz rijeka Krke i
Zrmanje (Jadranska linija), te mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice,
rezao na dva mjesta, stvarajući odsječke dužine 563, 464 i 37 bp (Slika 18).
Slika 18: Restrikcija kontrolne regije mtDNA sa restrikcijskim enzimom Alu I,
uzorak 1 - mekousna pastrva iz rijeke Jadro, 2 – mekousna pastrva iz rijeke
Žrnovnice, 3 – potočna pastrva iz rijeke Krke, 4 – potočna pastrva iz rijeke
Zrmanje, 5 – mekousna pastrva iz rijeke Neretve, 6 - 100 kb DNA ladder,
Gibco BRL.
76
3.3.2. Analiza sekvencioniranja mitohondrijalne DNA
3.3.2.1. Sekvencioniranje dijela kontrolne regije
Sekvencioniranje kontrolne regije smo napravili na 12 uzoraka
mekousne pastrve iz rijeke Žrnovnice (ZRN) i 3 iz Jadra (ZRN), na 1 uzorku
potočne pastrve iz rijeke Krke (Krka) i na 2 uzorka potočne pastrve iz rijeke
Zrmanje (ZRM1 i ZRM2AD4). Sekvencionirana kontrolna regija kod populacija
mekousne pastrve iz rijeka Jadra i Žrnovnice bila je jednaka. Na 540 bp
dugom odsječku pronašli smo 1 varijabilno mjesto na osnovu kojeg smo
populaciji mekousne pastrve iz Žrnovnice pripisali novi haplotip, koji smo
nazvali ZRN. Na osnovi polimorfnog mjesta u kontrolnoj regiji mtDNA pronašli
smo novi restrikcijski enzim pomoću kojeg možemo razlikovati populaciju
mekousne pastrve iz Žrnovnice i Jadra (S. o. salonitana) od ostalih populacija.
Analizirane uzorke usporedili smo s populacijama čije se sekvence
nalaze u Gen banci (Tablica 6). Kod potočne pastrve iz rijeke Zrmanje uočili
smo ranije prikazan haplotip Ad4, kojega smo prikazali kao ZRM2AD4.
Na osnovu polimorfizma uočenog pri sekvencioniranju odredili smo
restrikcijski enzim Eco 130 I s kojim specifično određujemo haplotip
mekousne pastrve "solinke". Uzorci mekousne pastrve iz rijeka Jadro i
Žrnovnice imali su jednak, novi haplotip. Uzorke smo izrezali s restrikcijskim
enzimom te smo još jednom potvrdili njihovu različitost od ostalih uzoraka.
Slika 19: Restrikcija kontrolne regije mtDNA restrikcijskim enzimom Eco 130 I.
Linije 1 su uzorci mekousne pastrve iz rijeke Jadro, linije 2 su uzorci
mekousne pastrve iz rijeke Žrnovnice, linije 3 su uzorci potočne pastrve iz
rijeke Krke, linije 4 su uzorci potočne pastrve iz rijeke Zrmanje, linije 5 su
uzorci mekousne pastrve iz rijeke Neretve i linije pod brojem 6 su fragmenti
DNA poznatih veličina (1 kb DNA ladder, Gibco BRL).
77
Tablica 6: Imena vrsta te pristupni brojevi u Gen banci za kontrolnu regiju
mtDNA i gen za citokrom b.
Vrsta/populacija Kontrolna regija mtDNA Gen za citokrom b
Broj u Gen banci
Acantholingua ohridana
(Bell) AF488536 AAF25872
Salmo salar U12143 X76253
Salmothymus
obtusirostris (soxy) AF488535 AF488534
Salmo trutta
Dunavska (Da1) AY260524S1 X7625
Dunavska (Da2) AY185570
Dunavska (Dal1) AY185569
Mediteranska (Me1) AF2347 STMTCTB1
Mediteranska (Me2) STU63890
Atlantska (At) AF498757 X76254
Jadranska (Ad1) AF498756 X76251
Jadranska (Ad3) AY260518S1 STMTCYB4
Jadranska (Ad4) AY260520
Salmo marmoratus (Ma) AF498755 X76251
78
Slika 20: Nukleotidna sekvenca 412 bp dugog segmenta kontrolne regije
mtDNA. Polimorfna mjesta su obojena crvenom bojom i označena brojem.
1 ZRMl TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC ZRM2AD4 TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC Krka TTTTTCAGCTATGTACAATAACAATTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC ŽRN TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC Soxy TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC ************************ *********************************** 2 3 ZRMl TATGTATAATATTACATACTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT ZRM2AD4 TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT Krka TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT ŽRN TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT Soxy TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATGGCATG-TGAGTAGT ****************** ************************** ************** 4 ZRMl ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA ZRM2AD4 ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA Krka ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA ŽRN ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACCCAA Soxy ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA ********************************************************.*** ZRMl GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT ZRM2AD4 GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT Krka GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT ŽRN GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT Soxy GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT ************************************************************ 5 6 7 8 ZRMl GTTATATCAATAAAACTCCACCCAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA ZRM2AD4 GTTATATCAATAAAACTCCACCCAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA Krka GTTATATCAATAAAACTCCACCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA ŽRN GTTATATCAATAAAACTCCATCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA Soxy GTTATATCAATAAACCTCGAGCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA ************** *** * * ************************************* 9 ZRMl TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT ZRM2AD4 TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT Krka TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT ŽRN TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT Soxy TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATTTATCAGTAGGCATACTCTTATT ************************************* ********************** 10 11 12 13 ZRMl GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG ZRM2AD4 GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG Krka GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG ŽRN GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG Soxy GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTA-GCTGCATCTAGTGAACTATTCCTGG ************************** * ****** ***************
79
Tablica 7: Polimorfna mjesta na 5' kraju kontrolne regije mtDNA, koja se odnose na
sekvencionirane uzorke. Brojevi označavaju mjesta u nukleotidnoj sekvenci koja se
odnose na Sliku 20, sa crvenom bojom su označene transverzije.
varijabilna mjesta
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ZRM1 C C A T A C C C A G T C C
ZRM2AD4 T
Krka T T T
ZRN T C T T
Soxy T G C G G T T - C T A
Odnos između tranzicija i transverzija u kontrolnoj regiji kod haplotipova
mekousne pastrve iz Jadra, potočne pastrve iz Krke i Zrmanje je 4:2. Dok je taj
odnos kod mekousne pastrve iz Neretve 7:5. Srodni odnos između pojedinih
haploptipova određivali smo na osnovu usporedbi haplotipova prema Kimura
dvoparametarskog modela gdje je odnos tranzicija/transverzija jednak 2. Vrijednosti
udaljenosti haplotipova su se kretale od 1,6 do 2,5 (prosječno 0,016 % ± 0,0083).
Vrijednosti udaljenosti haplotipova, te broj polimorfnih mjesta između njih, prikazani
su u Tablici 8.
Tablica 8: Vrijednosti razlika između haplotipova u postotcima, te broj polimorfnih
mjesta između njih u kontrolnoj regiji mtDNA.
haplotip Da1 Da2 Dall soxy Bell At1 ZRM1 ZRM2AD4 Ad3 Ad1 Krka Ma1 ZRN Me1 S.salar
Da1 1 1 10 7 5 7 6 6 5 5 6 6 7 27
Da2 0,2 0 12 9 6 8 7 6 5 5 6 7 8 28
Dall 0,2 0,5 10 6 6 8 7 6 5 5 6 7 8 26
soxy 2,7 3,0 3,0 10 9 12 13 10 9 10 10 11 10 30
Bell 1,7 2,0 1,5 1,7 6 9 6 5 4 3 5 6 7 28
At1 1,2 1,5 1,5 1,7 1,5 7 6 5 3 3 5 6 7 27
ZRM1 1,7 2,0 2,0 2,5 1,7 1,7 1 4 3 4 4 6 6 29
ZRM2AD4 1,5 1,7 1,7 2,2 1,5 1,5 0,2 3 2 3 3 4 5 29
Ad3 1,5 1,7 1,7 2,2 1,5 1,5 0,7 0,5 1 2 2 3 3 28
Ad1 1,2 1,5 1,5 2,0 1,2 1,2 0,5 0,2 0,2 1 1 2 3 27
Krka 1,2 1,5 1,5 2,2 1,0 1,0 0,7 0,5 0,5 0,2 2 3 4 27
Ma1 1,2 1,5 1,5 2,0 1,2 1,2 0,7 0,5 0,5 0,2 0,5 3 4 28
ZRN 1,5 1,7 1,7 2,2 1,5 1,5 1,0 0,7 0,7 0,5 0,7 0,5 5 26
Me1 1,7 2,0 2,0 2,0 1,7 1,7 1,5 1,2 1,2 1,0 1,2 1,0 1,2 30
S. salar 6,7 7,0 6,4 7,2 6,4 7,0 7,2 7,0 7,0 6,7 6,7 6,4 6,4 7,5
80
Kod analiziranih uzoraka na 412 bp dugom odsječku našli smo 33 polimorfna
mjesta, na osnovu kojih smo razlučili različite haplotipove. Uočen je nov
haplotip kod mekousne pastrve iz rijeke Jadro, s mutacijom na mjestu 17,
specifičnoj za taj haplotip (Slika 21).
1 2 3 4 5 6 7 8 TTTTTCAGCT ATGTACAATA ACAACTGTTG TACCTTGCTA ACCCAATGTT ATACTACATC 60 9 10 11 12 TATGTATAAT ATTACATATT ATGTATTTAC CCATATATAT AATATAGCAT G-TGAGTAGT 120 13 14 15 16 17 ACATCATATG TATTATCAAC ATTAGTGAAT TTAACCCCTC ATACATCAGC ACTAACCCAA 180 18 19 20 GGTTTACATA AAGCAAAACA CGTGATAATA ACCAACTAAG TTGTCTTAAC CCGATTAATT 240
21 22 23 24∗ 25 26 GTTATATCAA TAAAACTCCA TCTAACACGG GCTCCGTCTT TACCCACCAA CT-TTCAGCA 300 27 28 29 30 TCAGTCCTGC TTAATGTAGT AAGAACCGAC CAACGATATA TCAGTAGGCA TACTCTTATT 360 31 32 33 34 GATGGTCAGG GACAGATATC GTATTAGGTC GCATCTCGTG AACTATTCCT GG 412
Slika 21: Nukleotidna sekvenca 412 bp dugog fragmenta kontrolne regije
mtDNA mekousne pastrve iz rijeke Jadro. Polimorfna mjesta su obojena
crvenom bojom i označena brojem. Novo polimorfno mjesto prema kojemu
opisujemo novi haplotip je podcrtan i označen zvjezdicom. Mjesto koje reže
restrikcijski enzim Eco 130I označeno je plavom bojom.
Srodne odnose između haplotipova prikazali smo u obliku filogenetskih
stabala. Prvo drvo napravljeno je po metodi "Neighbour-Joining" (NJ). Metoda
izrade filogenetskog drva "Neighbour-Joining" (NJ) temelji se na
udaljenostima (Slika 22). Ova metoda predstavlja pojednostavljenu metodu
"Minimum evolution". Filogenetska drva napravili smo i pomoću metoda
"Minimum evolution" (ME) i s "Maximum parisimony" (MP), koja se temelji na
nukleotidnim mjestima. Međutim, dobivena filogenetska drva se nisu bitno
razlikovala.
81
ZRMl
ZRM2AD4
Ad3
Adl
Krka
Ma1
ZRN
Me1
Soxy
Atl
bell
Dall
Dal
Da2
S.salar
77
84
70
31
30
16
40
20
39
49
53
0.005
Slika 22: Srodni odnosi između haplotipova uključenih u istraživanje prema
kontrolnoj regiji mtDNA, filogenetsko drvo je prikazano s "Neighbour-Joining"
(NJ) metodom (program MEGA). Brojevi uz grananja predstavljaju postotne
vrijednosti grananja od 10 000 ponavljanja.
Pri usporedbi odnosa tranzicija i transverzija mekousne pastrve iz Neretve
(Soxy) i ostalih, uočavamo nepravilnost tog odnosa. Uz nizak bootstrap od 31.
Kontrolna regija je informativna pri odnosima unutar vrsta i nižih taksonomskih
jedinica (npr. unutar roda Salmo), no pri unošenju viših taksomonsih jednica
dolazi do nepravilnosti koje se uočavaju na filogenetskom stablu (položaj
Soxy).
3.3.2.2. Sekvencioniranje dijela gena za citokrom b
Radi mogućih povratnih mutacija u području kontrolne regije mtDNA
kod mekousne pastrve iz Neretve, odnose između istraživanih haplotipova
istražili smo i na osnovu sekvencioniranja gena za citokrom b. Sekvencirali
smo i 276 bp dug segment gena za citokrom b kod jednog uzorka mekousne
pastrve iz rijeke Jadro (ZRN) i kod jednog uzorka mekousne pastrve iz rijeke
Neretve (soxy), te smo ih usporedili sa sekvencama iz genske banke (Tablica
6).
82
Slika 23: Nukleotidna sekvenca 276 bp dugog segmenta gena za citokrom b.
Polimorfna mjesta su obojena crvenom bojom i označena brojem. 1 2 3 Soxy CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTGTGTTTAGCCACCCAAATTCTTACCGGGCTCTTCCTAGC zrn CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTGTGTCTAGCCACCCAAATTCTTACCGGACTCTTCCTAGC Ad1 CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTATGTCTAGCCACCCAAATTCTTACCGGACTCTTCCTAGC ********************* *** ********************** *********** 4 5 Soxy CATACACTACACCTCCGACATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTCTGCCACATTTGCCGAGA zrn CATACACTACACCTCCGATATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTTTGCCACATTTGCCGAGA Ad1 CATACACTACACCTCCGATATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTTTGCCACATTTGCCGAGA ****************** *********************** ***************** 6 Soxy TGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT zrn CGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT Ad1 CGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT *********************************************************** Soxy CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC zrn CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC Ad1 CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC ************************************************************ 7 8 Soxy CTGAAACATCGGAGTCGTACTACTACTTCTCACTAT zrn CTGAAATATCGGAGTCGTACTGCTACTTCTCACTAT Ad1 CTGAAATATCGGAGTCGTACTGCTACTTCTCACTAT ****** ************** **************
Tablica 9: Polimorfna mjesta na genu za citokrom b mtDNA. Brojevi
označavaju mjesta u nukleotidnoj sekvenci koja se odnose na Sliku 23.
varijabilna mjesta
1 2 3 4 5 6 7 8
Soxy G T G C C T C A
ZRN C A T T C T G
Ad1 A C A T T C T G
Odnos između tranzicija i transverzija u sekvenci gena za citokrom b je
5:0 između haplotipova mekousne pastrve iz Jadra, Neretve i potočne pastrve
iz Krke i Zrmanje. Srodni odnos između pojedinih haploptipova određivali smo
na osnovi usporedbi haplotipova prema Kimura dvoparametarskog modela
gdje je odnos tranzicija/transverzija jednak 2. Vrijednosti udaljenosti
haplotipova su se kretale od 0,4 do 3,4 (prosječno 0,018 % ± 0,0012).
Vrijednosti udaljenosti haplotipova, te broj polimorfnih mjesta između njih,
prikazani su u tablici 10.
83
Tablica 10: Vrijednosti razlika između haplotipova u postotcima, te broj
polimorfnih mjesta između njih u genu za citokrom b mtDNA.
Soxy Bel Da1,
Da2
Da ZRN Me2 Me1 Ad34Ma Ad1 At Ssa
Soxy 2 9 9 7 8 9 8 8 7 17
Bel 0,7 11 11 9 10 11 10 10 9 19
Da1,Da2 3,4 4,1 0 2 3 4 3 3 3 15
Da 3,4 4,1 0,0 2 3 4 3 3 3 15
ZRN 2,6 3,4 0,7 0,7 1 2 1 1 2 14
Me2 3,0 3,7 1,1 1,1 0,4 1 2 2 2 13
Me1 3,4 4,1 1,5 1,5 0,7 0,4 3 3 3 14
Ad34Ma 3,0 3,7 1,1 1,1 0,4 0,7 1,1 0 1 13
Ad1 3,0 3,7 1,1 1,1 0,4 0,7 1,1 0,0 1 13
At 2,6 3,4 1,5 1,5 0,7 1,1 1,5 0,4 0,4 12
Ssa 6,5 7,3 6,1 6,1 5,7 5,3 5,7 5,3 5,3 4,9
Kod analiziranih uzoraka na 276 bp dugom odsječku našli smo 23
polimorfna mjesta, na osnovu kojih smo razlučili različite haplotipove. Haplotip
mekousne pastrve iz rijeke Žrnovnice prikazali smo na Slici 24.
1 2 3 4 5 6 CTTTGGCTCA CTCTTAGGCT TGTGTCTAGC CACCCAAATT CTTACCGGAC TCTTCCTAGC 60 7 8 9 10 11 12 CATACACTAC ACCTCCGATA TCTCAACAGC CTTTTCCTCT GTTTGCCACA TTTGCCGAGA 120 13 14 15 16 CGTTAGCTAC GGCTGACTCA TCCGAAACAT TCACGCTAAC GGAGCATCTT TCTTCTTTAT 180 17 18 19 20 CTGTATTTAT ATACATATCG CCCGAGGACT CTACTATGGT TCCTACCTAT ATAAAGAAAC 240 21 22 23 CTGAAATATC GGAGTCGTAC TGCTACTTCT CACTAT 276
Slika 24: Nukleotidna sekvenca 276 bp dugog fragmenta gena za citokrom b
mekousne pastrve iz rijeke Jadro. Polimorfna mjesta su obojena crvenom
bojom i označena brojem.
84
Da1, Da2
Da
zrn
Me2
Me1
Ad34Ma
Ad1
At
Soxy
Bel
Ssa
99
89
73
53
56
45
48
41
0.005
Slika 25: Srodni odnosi između haplotipova uključenih u istraživanje prema
genu za citokrom b, filogenetsko drvo je prikazano sa "Neighbour-Joining"
(NJ) metodom (program MEGA).
3.3.2.3. Zajednička analiza kontrolne regije mtDNA i gena za citokrom b
Sekvence kontrolne regije i gena za citokrom b mtDNA analizirali smo
zajedno. Nakon analize "Neighbour-Joining" (NJ) metodom dobili smo
filogenetsko drvo (program MEGA) (Slika 26).
Slika 26: Srodni odnosi između haplotipova uključenih u istraživanje prema
kontrolnoj regiji mtDNA i genu za citokrom b. Filogenetsko drvo je prikazano
sa "Neighbour-Joining" (NJ) metodom (program MEGA).
ZRM1
ZRM2AD4
ad3
Ad1
Ma1
zRN
Me1
Da1
Da2
At1
Soxy
bel1
Salmo
98
99
70
52
68
59
44
80
73
0.005
85
Filogenetsko drvo dobiveno spajanjem sekvenci kontrolne regije i gena
za citokrom b prikazuje sličan genetički odnos s onim koji je dobiven prema
sekvenci kontrolne regije. Kod obje analize zasebno, pa tako i kod njihova
udruživanja, vidljivo je da potočna pastrva iz Zrmanje (ZRM1 i ZRM2) ulazi s
ranije istraženim haplotipovima (Ad1 i Ad3) u jadransku liniju pastrva.
Mekousna pastrva iz Žrnovnice S. o. salonitana (ZRN) je znatno bliža
potočnoj, nego mekousnoj pastrvi iz rijeke Neretve (Soxy). Prema kontrolnoj
regiji mekousna pastrva iz Žrnovnice čini poseban ogranak između potočnih
pastrva, a prema citokormu b ona ulazi isti ogranak sa potočnim pastrvama
dunavske linije (Da1, Da2, Da). Udruživanjem obaju istraživanih sekvenci
solinka (ZRN), zauzima poseban ogranak unutar filogenetskih linija potočne
pastrve. Istom analizom mekousna pastrva iz Neretve ulazi u ogranak sa
belvicom Acantholingua ohridana (bel), dok je posve suprotan slučaj kada
njeno mjesto promatramo samo analizom kontrolne regije. Pri analizi
kontrolne regije u populaciji mekousne pastrve iz Neretve odnos između
tranzicija i transverzija odstupao je od uobičajnih, zabilježen je povećan broj
transverzija, stoga analizu te regije na smatramo informativnom pri
istraživanjima između rodova. Za odnose između rodova informativniji prikaz
u filogenetskom stablu daje kombinacija sekvenci kontrolne regije i gena za
citokrom b.
86
3.4. ANALIZA MIKROSATELITSKE DNA
3.4.1. Određivanje veličine mikrosatelita na ABI PRISMTM 310
Pomoću automatskog sekvencera ABI PRISMTM 310 automatski smo
odredili veličinu alela mikrosatelitskih lokusa.
Slika 27: Alelni polimorfizam na lokusima BFRO 001, Str 591 INRA, Strutta 58
i OmyFgt1TUF.
Plavi vrhovi prikazuju alele karakteristične za lokus BFRO 001, zeleni vrhovi
prikazuju alele karakteristične za lokus Str 591 INRA, crni vrhovi prikazuju
alele karakteristične za lokuse Strutta58 i OmyFgt1TUF kod jedinki iz rijeke
Jadro (J15) i rijeke Krke (K8), dok crveni vrhovi prikazuju fragmente DNA
poznate veličine (Tamra 350, Perkin Elmer).
87
3.4.2. Statistička analiza mikrosatelitskih podataka
Kompjutorski program GENETIX (Belkhir i sur. 1998) korišten je pri
statističkoj analizi mikrosatelitskih podataka. Kompjutorski program Fstat
(Goudet, 1995) korišten je za izračunavanje faktora "bogatstva alela", (engl.
allelic richness).
U ovom istraživanju proučili smo 9 mikrosatelitskih lokusa. Alele koje
smo uočili kod proučavanih populacija naveli smo u prilogu 1. U istraživanim
populacijama na lokusu BFRO 001 ima 12 različitih alela, na lokusu BFRO002
ima 8 različitih alela, na lokusu Ssa197 ima 18 različitih alela, na lokusu
Strutta58 ima 17 različitih alela, na lokusu Str591INRA ima 8 različitih alela,
na lokusu Strutta24 ima 15 različitih alela, na lokusu OmyFgt1TUF ima 7
različitih alela, na lokusu SsoSL438 ima 14 različitih alela i na lokusu StMS-
LDH4 ima 7 različitih alela.
Tablica 11: Proučeni lokusi, aleli i njihova prisutnost kod proučavanih
populacija.
Jadro
mekousna
Žrnovnica
mekousna
Neretva
mekousna
Krka
potočna
Zrmanja
potočna
BFRO001
198 0,9211 1,00 0 0 0
202 0,0526 0 0 0 0
206 0 0 1,00 0 0
214 0,0263 0 0 0,0455 0
222 0 0 0 0,3182 0
226 0 0 0 0 0,3000
230 0 0 0 0 0,2000
238 0 0 0 0,0909 0
242 0 0 0 0,3636 0,3000
244 0 0 0 0,0455 0
246 0 0 0 0,1364 0
256 0 0 0 0 0,1000
258 0 0 0 0 0,1000
88
Broj alela 3 1 1 6 5
Faktor
bogatstva alela 1,307 1,000 1,000 2,848 3,133
H exp. 0,1482 0 0 0,7355 0,7600
H n. b. 0,1522 0 0 0,7706 0,8444
H obs. 0,1579 0 0 0,8182 0,8000
Fis -0,0429 -0,0381 -0,0488 -0,0155 -0,0627
BFRO002
116 0 0 0 1,0000 1,0000
125 0,0588 0 0 0 0
131 0 0 0,2143 0 0
133 0 0 0,2143 0 0
135 0 0 0,4286 0 0
137 0 0 0,1429 0 0
140 0,8824 1,0000 0 0 0
145 0,0588 0 0 0 0
Broj alela 3 1 4 1 1
Faktor
bogatstva alela 1.449 1,000 2,776 1,000 1,000
H exp. 0,2145 0 0,7041 0 0
H n. b. 0,2210 0 0,7582 0 0
H obs. 0,1176 0 0,4286 0 0
Fis 0,43284 0,45950 0,48289 0,45223 0,44823
Ssa197
132 0,526 0 0 0,2917 0
136 0 0 0 0,0833 0
137 0 0 0 0 0,2000
141 0,3947 0,4211 0 0 0
145 0,5263 0,5789 0,0714 0 0
150 0 0 0 0,0417 0
154 0 0 0 0,3750 0
155 0 0 0,0714 0,0417 0
158 0 0 0 0,0417 0
159 0 0 0,0714 0 0,3000
163 0 0 0 0 0,3000
167 0 0 0 0 0,1000
171 0 0 0,0714 0 0,1000
175 0 0 0,2857 0 0
179 0 0 0,2857 0 0
89
183 0 0 0,1429 0 0
211 0 0 0 0,0833 0
215 0 0 0 0,0417 0
Broj alela 3 2 7 8 5
Faktor
bogatstva alela 2.146 1,876 3,229 2,937 3,133
H exp. 0,5637 0,4875 0,7959 0,7535 0,7600
H n. b. 0,5789 0,5007 0,8571 0,7862 0,8444
H obs. 0,6316 0,5263 1,0000 0,9167 1,0000
Fis -0,14494 -0,15451 -0,12098 -0,11774 -0,12084
Strutta24
102 0,0263 0 0 0 0
172 0 0 0,0714 0 0
176 0 0 0,6429 0 0
178 0 0 0,2143 0 0
180 0 0 0 0,0833 0
192 0,0263 0 0 0 0
196 0 0 0,0714 0 0
200 0 0 0 0 0,7500
202 0,8684 0,9474 0 0 0
206 0,0789 0,0526 0 0,0417 0
208 0 0 0 0,0417 0
212 0 0 0 0,1250 0
214 0 0 0 0,1667 0,2500
218 0 0 0 0,0417 0
220 0 0 0 0,0833 0
222 0 0 0 0,0417 0
224 0 0 0 0,3750 0
Broj alela 4 2 4 9 2
Faktor
bogatstva alela 1.501 1,202 2,237 3,142 1,786
H exp. 0,2382 0,0997 0,5306 0,7951 0,3750
H n. b. 0,2447 0,1024 0,5714 0,8297 0,4286
H obs. 0,1579 0,1053 0,2857 0,5833 0,5000
Fis 0,26633 0,31957 0,23496 0,26648 0,32150
Strutta58
91 0 0 0,1667 0 0
93 0 0 0,7500 0 0
95 0 0 0,0833 0 0
90
104 0 0 0 0,1364 0
145 0 0 0 0,0455 0
146 0 0 0 0,0455 0
147 0,9474 1,0000 0 0 0
150 0 0 0 0,0455 0
151 0,0263 0 0 0 0
158 0 0 0 0,1364 0
165 0 0 0 0,0455 0
166 0 0 0 0,3636 0
168 0 0 0 0,0455 0
170 0 0 0 0,0909 0
175 0,0263 0 0 0,0455 0
181 0 0 0 0 0,5000
187 0 0 0 0 0,5000
Broj alela 3 1 3 10 2
Faktor
bogatstva alela 1.211 1,000 1,909 3,232 2,000
H exp. 0,1011 0 0,4028 0,8099 0,5000
H n. b. 0,1038 0 0,4394 0,8485 0,6667
H obs. 0,1053 0 0,3333 0,9091 0
Fis 0,08186 0,07281 0,02647 0,29274 -0,01916
Str591INRA
149 0,0556 0 0 0,0417 0
159 0 0 0,1429 0,6250 0
169 0,0278 0 0 0 0
171 0,7778 0,8889 0,7857 0,0833 0
173 0,1389 0,1111 0,0714 0 0
183 0 0 0 0,2083 0
189 0 0 0 0 1,0000
193 0 0 0 0,0417 0
Broj alela 4 2 3 5 1
Faktor
bogatstva alela 1.788 1,390 1,791 2,268 1,000
H exp. 0,3719 0,1975 0,3571 0,5556 0
H n. b. 0,3825 0,2032 0,3846 0,5797 0
H obs. 0,4444 0,2222 0,4286 0,5833 0
Fis -0,05069 -0,08543 -0,08434 -0,13402 -0,09579
OmyFgt1TUF
204 0 0 0 0 0
91
206 1,0000 1,0000 1,0000 0,1250 0
218 0 0 0 0 0
226 0 0 0 0,2500 0
241 0 0 0 0 0,6000
245 0 0 0 0 0,4000
246 0 0 0 0,1250 0
Broj alela 1 1 1 3 2
Faktor
bogatstva alela 1.000 1,000 1,000 2,590 1,924
H exp. 0 0 0 0,6563 0,4800
H n. b. 0 0 0 0,7000 0,5333
H obs. 0 0 0 0,2500 0,4000
Fis 0,51892 0,52009 0,50868 0,20863 0,64360
SsoSL438
96 0 0 0 0,0455 0
98 0 0 0 0,0455 0
104 0 0 0 0,1818 0,1,0000
106 0 0 0 0,5000 0
109 0,0333 0 0 0 0
110 0 0 0 0,0909 0
111 0,0333 0,4000 0,0833 0 0
114 0 0 0 0,1364 0
115 0 0 0,1667 0 0
116 0 0 0,2500 0 0
117 0 0 0,0833 0 0
118 0 0 0,0833 0 0
120 0 0 0,3333 0 0
123 0,6667 0,3667 0 0 0
125 0,2667 0,2333 0 0 0
Broj alela 4 3 6 6 1
Faktor
bogatstva alela 1.992 2,424 3,180 2,780 1,000
H exp. 0,4822 0,6511 0,7778 0,6860 0
H n. b. 0,4989 0,6736 0,8485 0,7186 0
H obs. 0,3333 0,6000 1,0000 0,9091 0
Fis -0,08095 -0,02291 0,06761 0,12770 0,01749
Faktor
bogatstva alela 1.992 2,424 3,180 2,780 1,000
StMSLDH4
92
237 0,9375 1,0000 0,5833 0 0
245 0 0 0,4167 0 0
247 0 0 0 0,1250 0,6000
253 0 0 0 0,5833 0
264 0 0 0 0,0417 0
265 0 0 0 0,2500 0,4000
276 0,0625 0 0 0 0
Broj alela 2 1 2 4 2
Faktor
bogatstva alela 1.238 1,000 1,919 2,296 1,924
H exp. 0,1172 0 0,4861 0,5799 0,4800
H n. b. 0,1210 0 0,5303 0,6051 0,5333
H obs. 0,1250 0 0,5000 0,7500 0,8000
Fis -0,25737 -0,22129 -0,29933 -0,20838 -0,15343
Ukupna H
exp. 0,2486 0,1595 0,4505 0,6191 0,3728
Ukupna H n.
b. 0,2295 0,16454 0,4877 0,6487 0,4279
Ukupna H
obs. 0,2303 0,1615 0,4418 0,6355 0,3889
Ukupna F is 0,10296 0,01846 0,10118 0,02296 0,15493
Prosječan br.
alela po
populaciji
3 1,5 3,4 5,8 2,3
H exp. – očekivana heterozigotnost
H n.b. – očekivana heterozigotnost prilagođena za manje populacije
H obs. – uočena heterozigonost
Udio proučavanih alela po populacijama prikazali smo i grafički (Grafovi
1 do 9).
Na mikrosatelitskom lokusu BFRO001 ima 12 različitih alela (Graf 1).
Alel 198 karakterističan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i
Žrnovnici. Jedino kod uzorka J13 nalazi se alel 214 koji je značajan za
potočnu pastrvu u Krki, a kod uzoraka J15 i J17 nalazimo alel 202. Aleli 214,
222, 238, 242, 244 i 246 značajni su za populaciju potočne pastrve u Krki, a
aleli 226, 230 i 242 su značajni za populaciju potočne pastrve u Zrmanji. Alel
206 značajan je za mekousnu pastrvu u Neretvi. Kod mekousne pastrve se ne
pojavljuju aleli duži od 212.
93
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
1
198
202
212
222
230
242
246
258
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 1: Alelni polimorfizam na lokusu BFRO001
Na lokus BFRO002 ima 8 različitih alela (Graf 2), od kojih su
prevladavali aleli 116 i 142. Alel 140 značajan je za populaciju mekousne
pastrve u Žrnovnici i Jadru, gdje se osim tog alela nalaze i aleli 125 (uzorci
J13 i J17) i 145. Za potočne pastrve u Zrmanji i Krki značajan je alel 116. Za
mekousnu pastrvu u Neretvi značajni su aleli 131, 133, 135 i 137.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,9
1
116 125 131 133 135 137 140 145
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 2: Alelni polimorfizam na lokusu BFRO002
94
Na lokusu Ssa197 ima 18 različitih alela (Graf 3). Za populacije
mekousne pastrve u rijekama Jadru i Žrnovnici značajni su aleli 141 i 145.
Kod uzoraka J15 i J17 u Jadru naišli smo na alel 132, koji je značajan za
potočnu pastrvu u Krki. Za potočnu pastrvu u rijeci Krki značajni su još aleli
137, 154, 159, 183, 211 i 215, a za potočnu pastrvu u rijeci Zrmanji aleli 137,
159, 163, 167 i 171. Aleli 175 i 179 karakteristični su za mekousnu pastrvu u
rijeci Neretvi.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
132
137
145
154
156
159
167
175
183
215
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 3: Alelni polimorfizam na lokusu Ssa197
Na lokusu Strutta24 otkrili smo 15 različitih alela (Graf 4). Alel 202
značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici. Kod tri
uzorka u rijeci Jadro pojavili su se aleli 192 (J15) i 206 (J12, J15 i J17). Kod
populacije potočne pastrve u rijeci Krki, lokus Strutta24 pokazao se vrlo
varijabilnim, s većim brojem različitih alela (180, 206, 208, 212. 214, 218,
220), a s nešto većim postotkom bio je prisutan alel 224). U populaciji potočne
pastrve u Zrmanji, značajni su aleli 200 i 214, dok su za mekousnu pastrvu u
Neretvi, karakteristični aleli 172, 178, 180 i 196.
95
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
1
172
178
192
200
206
212
218
222
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 4: Alelni polimorfizam na lokusu Strutta24
Na lokusu Strutta58 otkrili smo 17 različitih alela (Graf 5). Alel 147
značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici. Aleli 151
(J15) i 175 (J17) su se pojavili u dva uzorka u rijeci Jadro. Kod populacije
potočne pastrve u rijeci Krki lokus Strutta58 pokazao se vrlo varijabilnim, s
većim brojem različitih alela: 104, 147, 158, 166, 168 i 170. U populaciji
potočne pastrve u Zrmanji značajni su aleli 181 i 187, dok su za mekousnu
pastrvu u Neretvi karakteristični aleli 91, 93 i 95.
0
0,10,20,3
0,40,5
0,60,70,8
0,91
91 95 145
150
158
166
170
181
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 5: Alelni polimorfizam na lokusu Strutta58
96
Na lokusu Str591INRA otkrili smo 8 različitih alela (Graf 6). Alel 171
značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru, Žrnovnici te u Neretvi,
gdje se uz njega pojavljuju i aleli 190 i 173. Alel 149 se pojavio u dva uzorka
kod mekousne pastrve u rijeci Jadro (J13 i J15). Za potočnu pastrvu u Krki
značajni su aleli 149, 171, 183 i 193, a za potočnu pastrvu u Zrmanji alel 189.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
149 159 169 171 173 183 189 193
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 6: Alelni polimorfizam na lokusu Str591INRA
Na lokusu OmyFgt1TUF otkrili smo 7 različitih alela (Graf 7). Alel 206
značajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru, Žrnovnici te u Neretvi.
Za potočnu pastrvu u Krki značajni su aleli 204, 218, 226 i 245, a za potočnu
pastrvu u Zrmanji aleli 241 i 245. Kod mekousne pastrve se ne pojavljuju aleli
duži od 206.
97
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,9
1
204 206 218 226 241 245 246
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 7: Alelni polimorfizam na lokusu OmyFgt1TUF
Na lokusu SsoSL438 otkrili smo 14 različitih alela (Graf 8). Kod
populacije mekousne pastrve u rijeci Jadro značajni su aleli 123 i 125, a
pojavljuju se i aleli 109 (J13) i 111. Za populaciju mekousne pastrve u
Žrnovnici značajni su aleli 123 i 125, a također se pojavljuje alel 111. Za
populaciju mekousne pastrve u Neretvi značajni su aleli 116 i 120, a pojavljuju
se aleli 111 i 118. Za populaciju potočne pastrve u rijeci Zrmanji značajan je
alel 104, dok se također pojavljuje i alel 106. Aleli 96, 98, 104, 111 i 114 se
pojavljuju u populaciji potočne pastrve u Krki, za nju je značajan i alel 106.
00,1
0,20,30,4
0,50,6
0,70,8
0,91
96 104
109
111
115
117
120
125
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 8: Alelni polimorfizam na lokusu SsoSL438
98
Na lokusu StMSLDH4 otkrili smo 7 različitih alela (Graf 9). Alel 237
značajan je za populacije mekousne pastrve u rijekama Jadro, Žrnovnica i
Neretve, gdje je još prisutan i alel 245. Za potočnu pastrvu u rijeci Zrmanji
značajni su aleli 247 i 265. Ti aleli su značajni i za potočnu pastrvu u rijeci Krki
gdje se uz njih, u većem postotku još pojavljuje i alel 253. Alel 276 pojavljuje
se samo kod uzoraka J13 i J15 u populaciji mekousne pastrve u rijeci Jadro.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,9
1
237 245 247 253 264 265 276
veličina alela
udio
u p
opula
ciji
Jadro mekousna
Žrnovnica mekousna
Krka potočna
Zrmanja potočna
Neretva mekousna
Graf 9: Alelni polimorfizam na lokusu StMSLDH4
99
3.4.2.1. Varijabilnost mikrosatelitskih lokusa kod proučavanih populacija
Prosječan broj alela po lokusu kod pojedinih populacija kretao se od
1,55 kod populacije mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici do 5,88 u populaciji
potočne pastrve u rijeci Krki. U populaciji mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici
našli smo najmanji broj alela. To objašnjavamo s načinom nastanka te
populacije. Populacija mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici nastala je prije 25
godina odvajanjem tridesetak jedinki iz Jadra.
Uočena heterozigotnost po pojedinom lokusu se bitno razlikuje (Tablica
8). Najmanja vrijednost uočene heterozigotnosti (Ho=0,000) nađena je na
većem broju lokusa: na lokusu BFRO001 kod populacija mekousne pastrve iz
rijeka Žrnovnice i Neretve, na lokusu BFRO002 kod populacija mekousne
pastrve iz rijeka Žrnovnice i potočne pastrve iz Krke i Zrmanje, na lokusu
OmyFgt1TUF kod populacija mekousne pastrve iz rijeka Žrnovnice, Jadro i
Neretve i na lokusu StMSLDH4 kod populacije mekousne pastrve iz rijeke
Žrnovnice. Najveća vrijednost uočene heterozigotnosti nađena je na lokusu
Ssa197 kod populacija mekousne pastrve iz rijeke Neretve (Ho=1,000) i
potočne pastrve iz rijeke Zrmanje (Ho=1,000), te na lokusu SsoSL438 u
populaciji mekousne pastrve iz Neretve (Ho=1,000) i potočne pastrve iz Krke
(Ho=0,909).
Pri određivanju odstupanja stvarnih od očekivanih frekvencija
genotipova u populaciji, koji su Hardy-Wenbergovoj ravnoteži potrebno je
naglasiti da je u većini populacija istražen mali broj uzorka.
Pri analizi udjela alela po populacijama uočavamo da se kod tri uzorka
u populaciji mekousne pastrve u rijeci Jadro (J13, J15 i J17), javljaju specifićni
aleli, bliski onima koje nalazimo kod potočne pastrve. Takova pojava navodi
nas da je kod tih uzoraka došlo do mješanja genetskog materijala sa
potočnom pastrvom, odnosno za te uzorke smatramo da su hibridi mekousne
pastrve sa potočnom.
100
3.4.2.2. Analiza glavnih koordinata
Predstavnici svih proučavanih populacija bili su uključeni u analizu
glavnih koordinata. Iz rezultata multivarijantne analize dobili smo matricu s
rasporedom jedinki po osi, iz koje je napravljen dvodimenzionalni graf (Graf
10).
Graf 10: Analiza glavnih koordinata jedinki koje pripadaju različitim
populacijama.
Iz grafa analize glavnih koordinata je vidljivo da jedinke čine dvije
zasebne skupine: u jednu skupinu ulaze populacije mekousnih pastrva, a u
drugu, populacije potočnih pastrva. Tri uzorka mekousne pastrve iz rijeke
Jadro (J13, 15 i J17) pomaknuta su prema potočnoj pastrvi, smatramo da su ti
uzorci hibridi.
U tablici 12 prikazali smo alele pojedinih lokusa koji se javljaju kao
zajednički u populacijama mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici te u
populaciji potočne pastrve u rijeci Krki. U tablici 13 prikazali smo alele koje
dijele populacije mekousne pastrve iz rijeka Jadra, Žrnovnice i Neretve.
101
Tablica 12: Udio pojavljivanja zajedničkih alela u postotcima kod populacija
mekousne pastrve u Jadru i Žrnovnici i u populaciji potočne pastrve u rijeci
Krki.
Jadro mekousna Žrnovnica mekousna Krka potočna
BFRO001 alel 214 0,0263 0 0,0455
Ssa197 alel 132 0,526 0 0,2917
Strutta24 alel 206 0,0789 0,0526 0,0417
Strutta58 alel 175 0,0263 0 0,0455
Str591INRA alel 149 0,0556 0 0,0417
Str591INRA alel 171 0,7778 0,8889 0,0833
OmyFgt1TUF alel
206 1,0000 1,0000 0,1250
Tablica 13: Udio pojavljivanja zajedničkih alela u postotcima za populacije
mekousne pastrve iz rijeka Jadra, Žrnovnice i Neretve.
Jadro mekousna Žrnovnica mekousna Neretva mekousna
Ssa 197 alel 145 0,5263 0,5789 0,0714
Str591INRA alel 171 0,7778 0,8889 0,7857
Str591INRA alel 173 0,1389 0,1111 0,0714
OmyFgt1TUF alel
206 1,0000 1,0000 1,0000
SsoSL438 alel 111 0,0333 0,4000 0,0833
StMSLDH4 alel 237 0,9375 1,0000 0,5833
102
3.4.2.3. Izračunavanje vrijednosti FST
Pomoću kompjutorskog programa GENETIX izračunali smo parametar
θ, gdje je FST vrijednost prilagođena po Weir i Coockerham (1984). Izračunate
FST vrijednosti prikazane su u tablicama 14a i 14b.
Tablica 14a: Vrijednosti FST parametra u istraživanim populacijama.
Žrnovnica
mekousna Krka potočna
Zrmanja
potočna
Neretva
mekousna
Jadro mekousna 0,04626 0,58461 0,71070 0,55623
Žrnovnica
mekousna 0,63975 0,77979 0,62983
Krka potočna 0,32426 0,41067
Zrmanja
potočna 0,53516
Tablica 14b: Vrijednosti FST parametra u istraživanim populacijama, pri čemu
uzorci J13, J15 i J17 nisu bili uvršteni u istraživanje.
Žrnovnica
mekousna Krka potočna
Zrmanja
potočna
Neretva
mekousna
Jadro mekousna 0,04364 0,61893 0,76681 0,61218
Žrnovnica
mekousna 0,63975 0,77979 0,62983
Krka potočna 0,33023 0,41370
Zrmanja
potočna 0,53516
103
3.5. ANALIZA SEKVENCIONIRANJA NUKELARNE DNA
Sekvencioniranjem uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke
Neretve, uočili smo da nema varijabilnih mjesta u sekvenci gena laktat
dehidrogenaze (LDH)-C1* između njih. Analizirane sekvence gena laktat
dehidrogenaze (LDH)-C1*, dužne 440 bp prikazane su na slici 28.
Jadro me_ TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT Neret me_ TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT jadranska_ TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT ************************************************************ Jadro me_ CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT Neret me_ CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT jadranska_ CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT ************************************************************ Jadro me_ CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTAGGATTTCAGAAATTGCTTT Neret me_ CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTAGGATTTCAGAAATTGCTTT jadranska_ CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTGGGATTTCAGAAATTGCTTT **************************************** ******************* Jadro me_ GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCCTTTTCCCCCCCATCTCCCTTTCATACA Neret me_ GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCCTTTTCCCCCCCATCTCCCTTTCATACA jadranska_ GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCC------CCCCCATCTCCCTTTCATACA ********************************* ********************* Jadro me_ CTTCCCCTCTCAGAGAGACTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT Neret me_ CTTCCCCTCTCAGAGAGACTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT jadranska_ CTTCCCCTCTCAGAGAGAGTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT ****************** ***************************************** Jadro me_ CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC Neret me_ CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC jadranska_ CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC ************************************************************ Jadro me_ TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA Neret me_ TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA jadranska_ TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA *********************
Slika 28: Sekvence gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod mekousne
pastrve iz rijeke Jadro (Jadro me), rijeke Neretve (Neret me) i jadranske linije
potočne pastrve. Crvenom bojom su označena varijabilna mjesta. Plavom
bojom su označena mjesta koja prepoznaje restrikcijski enzim Rsa I.
104
3.5.1. Analiza odsječaka gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1*,
DNA molekule s tehnikom RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymophism)
Na umnoženom dijelu nuklearne DNA, genu laktat dehidrogenaze
(LDH)-C1*, provjerili smo polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaje
restrikcijski enzim Rsa I. Restrikcijska endonukleaza Rsa I cijepa produkte na
prepoznatljivoj sekvenci gt/ac (Slika 29).
Potočnu pastrvu (Jadranski oblik) restrikcijski enzim reže na 2 mjesta, na 74
bp i na 240 bp, pri čemu stvara tri odsječka različite dužine: 74, 135 i 166 bp.
Mekousne pastrve restrikcijski enzim Rsa I reže na jednom mjestu, na 74 bp,
pri čemu stvara dva odsječka dužine 74 i 300 bp.
Slika 29: Restrikcija gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* s restrikcijskim
enzimom Rsa I, uzorci 1 i 5 su potočna pastrva, a 2, 3 su mekousna pastrva
iz Jadra, a uzorak 4 je mekousna pastrva iz rijeke Neretve
105
4. RASPRAVA
U području Mediterana obitava veliki broj endemskih slatkovodnih ribljih
vrsta. U zapadnoj Europi riblje populacije su vrlo dobro istražene što nije
slučaj u ovom dijelu Europe. Ovdje nalazimo brojne riblje vrste koje su slabo
opisane, sa sistematikom koja je nedovoljno definirana, a i njihova distribucije
nije sasvim poznata. Stoga je potrebno je napraviti reviziju sistematike brojnih
vrsta i podvrsta riba.
U rijekama jadranskog sliva obitavaju četiri izdvojene populacije
mekousne pastrve, koje se međusobno morfološki razlikuju. Predmet našeg
istraživanja bila je podvrsta mekousne pastrve koja obitava u rijekama Jadru i
Žrnovnici (S. o. salonitana). Opisali smo je i usporedili s podvrstama
mekousne pastrve iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), kao i potočnim
pastrvama (Salmo trutta) iz rijeka Krke i Zrmanje.
Osnovni cilj našeg rada je pronaći i opisati genetske razlike između
mekousnih pastrva S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus i potočne pastrve
(Salmo trutta). Stoga smo prikupili uzorke od tri populacije mekousne pastrve
koje obitavaju u rijekama jadranskog sliva, te od dvije populacije potočne
pastrve, koje pripadaju jadranskim linijama pastrva (Bernatchez, 2001). U
ovom radu željeli smo napraviti i usporedbu s podvrstom mekousne pastrve iz
rijeke Krke (S. o. krkensis), ali prilikom uzorkovanja nismo uočili niti jedan
primjerak.
Sadašnje populacije mekousnih pastrva su vrlo male i neprestano
bivaju ugrožene s mnogo čimbenika stoga je analiziran mali broj uzoraka.
Svjesni smo da zaključci izvedeni nakon analize malog broja uzoraka nisu
statistički opravdani, no unatoč tome, oni su zanimljivi i temelj su novim
raspravama i istraživanjima. Dobivene rezultate stavili smo u odnos s ranije
istraženim linijama i vrstama pastrva, u oblik filogenetskog stabla.
106
4.1. Morfološke analize
Jedna od osnovnih karakteristika Salmonida je fenotipska plastičnost.
Njihove predstavnike nalazimo u velikom broju varijacija boje tijela, merističkih
obilježja, izbora hrane, rasta, ponašanja i razmnožavanja. Te varijacije su
najčešće ekološki uvjetovane, kao što je slučaj kod ekoloških oblika potočne
pastrve S. trutta gdje razlikujemo potočni, jezerski i morski oblik. No, one
mogu biti i rezultat životne specijacije ili mogu biti genetski uvjetovane.
Genetski uvjetovane morfološke razlike uočene su kod nekih predstavnika
roda Salmo, kod S. marmoratus, S. carpio, S. ferox (Kottelat, 1997).
Na osnovu morfoloških i morfometrijskih obilježja mekousne pastrve su
podijeljene u četiri podvrste, pa smo naše istraživanje započeli usporedbom
morfoloških obilježja mekousne pastrve iz rijeke Jadro (S. o. salonitana) i
mekousne pastrve iz rijeke Bune (S. o. oxyrhynchus), sa potočnom pastrvom
jadranskog sliva (S. trutta).
Na osnovu morfometrijskih izmjera tri primjerka mekousne pastrve iz
rijeke Jadro (S. o. salonitana), možemo dati njezin kratak opis.
Oblik tijela mekousne pastrve iz rijeke Jadro vrlo je sličan potočnoj
pastrvi. Masna peraja postoji, repna peraja je u sredini dosta usječena sa
izraženim vrhovima. Na tijelu se nalaze crne pjege nepravilnog oblika koje su
raspoređene uglavnom sa bočne strane i to na prostoru od glave do kraja
leđne peraje. Crvene pjege su rjeđe, no one su veće i protežu se često po
čitavom tijelu. Peraje nisu pigmentirane, osim leđne peraje na kojoj nalazimo
tragove crvenih i crnih točaka.
Mekousna pastrva ime je dobila po karakterističnom izgledu glave,
odnosno usta, karakterizira je zaobljena njuška, mala i mesnata usta, a
gornjovilične kosti su joj kratke i široke.
Morfološka obilježja mekousne pastrve iz rijeke Jadro (S. o. salonitana)
usporedili smo s mjerenjima koja su obavljena na mekousnoj pastrvi iz rijeke
Neretve (S. o. oxyrhynchus), (Janković, 1961).
Morfometrijske oznake koje su imale vrlo slične vrijednosti kod dviju
podvrsta mekousne pastrve S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus su: dužina
107
glave, dužina donje vilice, uzdužni dijametar oka, dužina osnove leđene i
podrepne peraje, dužina prsne i trbušne peraje, zatim najveća i najmanja
visina tijela. Izuzetnu sličnost u nekim morfološkim osobinama objašnjavamo
sličnim uvjetima staništa u kojima obitavaju obje podvrste, stoga se i
parametri u kojima su S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus bliske odnose na
one osobine na koje najveći utjecaj ima njihov način života (obje vrste
obitavaju u brzim tekućicama).
Međutim u nekim morfometijskim oznakama postoje signifikantne
razlike između dviju promatranih podvrsta, a to su ponajprije dužina i širina
gornje vilice. Gornja vilica koja prelazi preko donje je karakteristika podvrste
mekousne pastrve S. o. oxyrhynchus, dok su jako zaobljene vilice značajka
mekousne pastrve S. o. salonitana. Mnogo veća razlika kod promatranih
podvrsta uočena je pregledom merističkih osobina. Merističke osobine se
znatno slabije mijenjaju u nekoj populaciji pod utjecajem različitih ekoloških
uvjeta, odnosno posjeduju veći heritabilitet (Treer i sur., 1995). Na promjenu
merističkih osobina utjecaj ima genetski faktor. Bitnu razliku između S. o.
salonitana i S. o. oxyrhynchus uočili smo u broju žbica u perajama, broju ljuski
u bočnoj liniji, broju branhiospina na prvom škržnom luku te broju kaudalnih
kralježaka. Stoga možemo pretpostaviti da su ove dvije podvrste nekada bile
u znatno bližem srodstvu, no uslijed duge geografske izolacije i
prilagođavanja na specifične uvijete staništa, te radi utjecaja hibridizacije sa
potočnom pastrvom dobile su posebne morfološke i ekološke osobine koje ih
danas jasno razlikuju.
Morfološke vrijednosti kod S. o. salonitana prikazali smo i u odnosu na
totalnu dužinu tijela, da bismo je mogli usporediti sa potočnom pastrvom
jadranske linije S. trutta (Marić, 2002) i sa endemskim salmonidom
Platysalmo platycephalus iz Turske (Behnke, 1968).
Dužina i širina vilica su morfometrijske oznake koje su u najvećoj mjeri
odstupale kod dviju podvrsta mekousne pastrve između S. o. salonitana i S.
o. oxyrhynchus, no te su vrijednosti vrlo slične kod S. o. salonitana i potočne
pastrve S. trutta. Potočna pastva je relativno mlada vrsta na ovim prostorima,
činjenica što S. o. salonitana dijeli sa njom neke fizičke osobine vodi nas
prema zaključcima o njihovoj mogućoj povezanosti tijekom evolucije.
108
Platysalmo platycephalus je endemski salmonid sa uskim staništem na
jugu Turske. Sa mekusnom pastrvom S. o. salonitana dijeli neke sličnosti kao
npr. najveća visina tijela, dužina prsne, trbušne, leđne i podrepne peraje. Kod
nekih merističkih osobina veliki sličnost pokazuju u broju branhiospina na
prvom škržnom luku, broju ljuski u bočnoj liniji, broju redova ljuski od bočne
linije do trbuše peraje te broju kaudalnih kralježaka, no signifikantno se
razlikuju u broju piloričkih nastavaka (P. platycephalus (15,66±0,57),
mekousna pastrva (57)).
Morfološku različitost podvrsta roda Salmothymus koji obitavaju u
rijekama jadranskog sliva, možemo usporediti s primjerom različitih ekotipova
vrste Coregonus clupeaformis koja obitava u jezerima bazena rijeke St. John
u Sjevernoj Americi (Lu i sur., 2001). Postojanje različitih ekotipova kod tih
populacija, može biti rezultat od oboje; sekundarnog kontakta između rodova
udaljenih kroz ledeno doba ili početnog razvoja kod jedne populacije
(Bernatchez i Dodson, 1991). Lu i Bernatchez (1999) smatraju da su razlike
između staništa, jezera, bitno utjecale na morfološku specijaciju ekotipova.
Stoga smatraju da stanišne razlike između različitih jezera imaju gotovo
jednako važnu ulogu u nastanku različitih ekotipova i njihovog stupnja
različitosti, kao i sekundarni kontakt između udaljenih evolucijskih linija.
Pronalazak jezera koja su u ledeno doba nastanile dvije različite linije, iako
danas u njima nalazimo samo jedan ekotip, predstavljaju hibridnu populaciju.
Radi dugotrajne izoliranosti u različitim staništima, procesom
specijacije došlo je do nastajanja različitih morfoloških oblika mekousne
pastrve, koju smo danas odvojili kao podvrste. S. o. salonitana morfološki se
znatno razlikuje od S. o. oxyrhynchus, a više je slična potočnoj pastrvi.
Međutim obje podvrste imaju isto razdoblje mrijesta (proljetni mrijest), što ih
razlikuje od potočne pastrve koja ima zimski mrijest. S obzirom na njenu
sličnost sa oboje S. o. oxyrhynchus i S. trutta bilo je interesantno istražiti i
njihov odnos na molekularnoj razini.
109
4.2. Prehrana mekousne pastrve iz rijeke Jadro
Analizu prehrane izvršili smo na tri primjerka mekousne pastrve iz
rijeke Jadro od kojih su dva nađena uginula u donjem toku rijeke, a jedan je
uginuo prilikom uzorkovanja. Analizom želučanog i crijevnog sadržaja
ustanovili smo da sva tri primjerka imaju potpuno prazno probavilo. Prazno
probavilo kod ovih primjeraka je razumljivo jer se ribe često prestaju hraniti
ako postoji neki zdravstveni problem.
4.3. Analiza molekularno-genetskih podataka
Analizirali smo varijabilnost dviju regija mitohondrijske DNA,
nekodirajuće kontrolne regije i kodirajuće regije gena za citokrom b.
Analizu mitohondrijske DNA započeli smo restrikcijom kontrolne regije
s restrikcijskim enzimom Alu I. Rezanje 1200 bp dugog segmenta omogućilo
je nastajanje polimorfnih restrikcijskih fragmenata, što je omogućilo prvotno
razlikovanje populacija mekousne i potočne pastrve. Analizom sa
restrikcijskim enzimom uočili smo razliku između podvrste S. o. oxyrhynchus i
ostalih, podvrste S. o. salonitana i vrste S. trutta. Kako ne postoji restrikcijski
enzim koji bi prepoznao populaciju S. o. salonitana, za tipiziranje iste, koristili
smo složeniju metodu sekvencioniranja.
Daljnju analizu proveli smo sekvencioniranjem dijela kontrolne regije od
540 bp. Unutar sekvencioniranog dijela našli smo 13 varijabilnih mjesta, što
znači da na svaka 41,5 nukleotida dolazi jedno varijabilno mjesto. Osim
podataka o zastupljenosti pojedinih mutacija koje smo dobili od naših
uzoraka, također smo koristili i podatke iz literature (GenBanka), pomoću kojih
smo željeli približiti što realnijem broju postojećih genetskih varijanti. Osim
naših uzoraka mekousne pastrve i potočne pastrve jadranskog tipa, prikazali
smo i Salmo salar, Acantholingua ohridana te potočne pastrve dunavskog,
mediteranskog i atlantskog tipa. Kad smo u analizu uključili ranije analizirane
haplotipove iz literature (Tablica 6), varijabilnost se znatno povećala. Uočili
110
smo 35 varijabilnih mjesta, što znači da na svaka 15,4 nukleotida dolazi jedno
varijabilno mjesto.
Prilikom sekvencioniranja kontrolne regije uočili smo 5 različitih
haplotipova (Zrm1, Zrm2Ad4, Krka, ZRN, Soxy), a pri sekvencioniranju gena
za citokrom mtDNA b 3 haplotipa (Ad1, ZRN i Soxy). Uzrok većeg broja
haplotipova pri sekvencioniranju kontrolne regije je veća varijabilnost te
sekvence u odnosu na gen za citokrom b. Analiziranjem istog područja kod
potočnih pastrva iz rijeka Krke i Zrmanje uočili smo da one pripadaju haplotipu
pastrva jadranske filogenetske linije (Bernatchez i sur., 1992). Sekvence
potočne pastrve iz rijeke Zrmanje su se međusobno razlikovale u 1 bp, te smo
kod njih opisali dva različita haplotipa Zrm1 i Zrm2Ad4, koji su se međusobno
razlikovali radi tranzicije između timina i citozina. To polimorfno mjesto
vjerojatno predstavlja jednu od vrućih točaka (engl. hot spot), pa su istovrsne
tranzicije prisutne na više haplotipova, bez obzira na njihov geografski izvor.
Pri sekvencioniranju gena za citokrom b kod tih uzoraka nisu uočene
varijabilnosti.
Sekvencioniranjem uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i Žrnovnice
ustanovili smo da uzorci dijele isti haplotip. Populacija mekousne pastve u
rijeci Žrnovnici je nastala odvajanjem dijela jedinki iz Jadra prije 25 godina,
stoga nas nije iznenadilo što te populacije imaju jednak haplotip. Haplotip koji
smo opisali kod ovih populacija nazvali smo ZRN. Haplotip ZRN je prvi
genetski marker koji opisuje populaciju mekousne pastrve iz rijeka Jadro i
Žrnovnice. Novi haplotip se razlikuje od ostalih po dodatnoj tranziciji T→C na
261 bp sekvencioniranog dijela.
Sekvencioniranjem dijela kontrolne regije mtDNA kod mekousne
pastrve iz Neretve (S. o. oxyrhynchus), uočili smo ranije opisan haplotip –
soxy (Snoj i sur., 2002b). Iako su supstitucije tipa G↔C transverzija poprilično
rijetke, takve dvije supstitucije su prisutne kod haplotipa soxy u kontrolnoj
regiji. Radi složenosti nastanka takovih supstitucija, većina ih je vjerojatno
posljedica mnogostrukih supstitucija jednom mjestu (npr. G→A→C). Za
haplotip soxy na kontrolnoj regiji su značajne još tri transverzije: A→G, A→T i
C→A, dok kod gena za citokrom b, transverzije nisu prisutne.
111
Kontrolna regija je vrlo varijabilna kod pastrvskih populacija.
Bernatchez i suradnici (1992) su kod 24 istražene populacije uočili 12 različitih
haplotipova, gdje je prosječan broj supstitucija iznosio 2,4%. Prosječan broj
supstitucija nukleotida između haplotipova mekousne pastrve iz Neretve i
Jadra iznosio je 2,2%. U kontrolnoj regiji kod mekousne pastrve (S. o.
salonitana) nismo uočili delecije i insercije koje su značajne za neke
haplotipove u kontrolnoj regiji kod mekousne pastrve iz Neretve (S. o.
oxyrhynchus) (Snoj, 1997). Haplotip soxy karakterizira delecija gvanina u
kontrolnoj regiji.
Kod vrsta koje pripadaju istom rodu, uočili smo manji broj tranzicija s
obzirom na transverzije. Točkaste delecije unutar vrsta nismo opazili, no našli
smo ih između rodova (jednu između S. o. oxyrhynchus i potočne pastrve), te
između porodica unutar podreda Salmonoidae (jednu između atlantskog
lososa i pastrve).
Berantchez i suradnici (1992) uočavaju da postoje razlike između
prirode nukleotidnih supstitucija kod potočne pastrve i sisavaca na mtDNA.
Opće je poznato da tranzicije uvelike nadmašuju transverzije (10:1) u
kontrolnoj regiji sisavaca, no u njihovoj studiji taj odnos je bio znatno manji.
Na osnovu toga, oni zaključuju da postoje bitne razlike u procesu mutacija
između sisavaca i riba.
Odnos između tranzicija i transverzija u kontrolnoj regiji mtDNA iznosio
je 4:2, taj odnos je za salmonide sličan; za lipljena (Sušnik, 2001) je 14:7, za
pastrvu (Bernatchez i sur., 1992) 17:6. Međutim kod većine kralježnjaka u tom
odnosu tranzicije prevladavaju u mnogo većem postotku, čak do 32 puta pred
transverzijama (Moritz i sur., 1987).
Velika varijabilnost značajna je za 5'-kraj gena za citokrom b kod
promatranih populacija, gdje smo na 276 bp dugom odsječku pronašli 8
varijabilnih mjesta, što prosječno iznosi jedno varijabilno mjesto na svakih
34,5 nukleotida. Između podvrsta mekousne pastrve broj supstitucija na
nukleotidu između para haplotipova iznosio je 0,026, što je mnogo više nego
što su uočili drugi autori (0,015 kod lipljena (Sušnik. 2001)). Svih 8 varijabilnih
mjesta na genu za citokrom b kod sekvencioniranih jedinki su transverzije.
Broj tranzicija i transverzija između dvaju nukleotida ovisi o srodnosti
organizama kojima nukleotidne sekvence pripadaju. Što su organizmi u užoj
112
vezi to su razlike između sekvenci manje, a prilikom supstitucije prevladavaju
tranzicije nad transverzijama. Kod viših taksonomskih skupina odnos između
tranzicija i transverzija se smanjuje.
Mutacije koje nalazimo na nekodirajućem dijelu mtDNA, kontrolnoj
regiji, pripadaju većinom točkastim mutacijama, koje nastaju kao rezultat
supstitucije, delecije ili insercije. Razlog takvim mutacijama je proces
pogrešnog spajanja nukleotida prilikom replikacije. Mehanizam za uklanjanje
pogrešno sparenih nukleotida zaslužan je za popravljanje takovih mjesta u
molekuli, on prepoznaje i izrezuje nukleotide prilikom polimerizacije i ligacije
novog lanca (Lewin, 2000). Međutim, postojeći mehanizmi nisu uvijek
uspješni, pa se neke mutacije zadrže u genomu i dalje prenose na potomstvo.
Kod greški koje nastaju prilikom pogrešnog sparivanja nukleotida,
prevladavaju supstitucije, npr. na adenin se umjesto timina (pirimidin) veže
citozin (pirimidin), ili gvanin ili adenin (purin), no zamjena pirimidina
pirimidinom uzrokuje manju steričku konformaciju nego druge zamjene. Kod
nekodirajućih regija DNA tranzicijske supstitucije prevladavaju nad
transverzijskima. Supstitucije su češće od delecija ili insercija, a među
supstitucijama tranzicije su teoretski dva puta češće od transverzija. Unutar
tranzicija prevladavaju supstitucija C→T. Stoga je pri ocjenjivanju različitosti
nekog para u sekvenci DNA potrebno ocijeniti određeni tip mutacija (Irwin i
sur., 1991). Osim ocjene tipa mutacija potrebno je imati u vidu da li se redi o
pojedinačnoj, višekratnoj, usporednoj, istovremenoj, konvergentnoj ili
povratnoj supstituciji. Što je stupanj različitosti između dvije nukleotidne
sekvence manji, mogućnost da dođe na određenom mjestu do više
supstitucija je gotovo zanemariva, broj uočenih supstitucija između takovih
dviju sekvenci bi trebao koincidirati sa stvarnim brojem supstitucija. Suprotan
je slučaj kad postoji velika razlika između sekvenci, uočeni broj razlika je
manji od stvarnog broja, što je posljedica višekratnih supstitucija na istom
mjestu (Snoj, 1997).
113
Za filogenetsku analizu prikazali smo odnose na osnovu kontrolne
regije, gena za citokrom b, te zajednički prikaz udruženih sekvenci kontrolne
regije i gena za citokrom b.
Filogenetsko drvo dobiveno spajanjem sekvenci kontrolne regije i gena
za citokrom b prikazuje sličan genetički odnos s onim koji je dobiven prema
sekvenci kontrolne regije. Potočna pastrva iz Zrmanje (ZRM1 i ZRM2) ulazi u
isti ogranak s ranije istraženim haplotipovima Ad1 i Ad3 u jadransku liniju
pastrva. Mekousna pastrva iz Žrnovnice S. o. salonitana (ZRN) se pokazala
znatno bliža potočnoj, nego mekousnoj pastrvi iz rijeke Neretve (Soxy).
Prema kontrolnoj regiji mekousna pastrva iz Žrnovnice čini poseban ogranak
između potočnih pastrva, a prema citokormu b ona ulazi isti ogranak sa
potočnim pastrvama dunavske linije (Da1, Da2, Da). Udruživanjem obaju
istraživanih sekvenci, solinka (ZRN), zauzima poseban ogranak unutar
filogenetskih linija potočne pastrve. Istom analizom mekousna pastrva iz
Neretve ulazi u ogranak sa belvicom (bel), dok je posve suprotan slučaj kada
njeno mjesto promatramo samo analizom kontrolne regije. Pri analizi
kontrolne regije u populaciji mekousne pastrve iz Neretve odnos između
tranzicija i transverzija odstupao je od uobičajnih, zabilježen je povećan broj
transverzija, stoga analizu te regije na smatramo informativnom pri
istraživanjima između rodova. Za odnose između rodova informativniji prikaz
u filogenetskom stablu daje kombinacija sekvenci kontrolne regije i gena za
citokrom b.
Na osnovu podataka od citokroma b i kontrolne regije, podvrste S. o.
salonitana i S. o. oxyrhynchus, znatno se razlikuju, no sa druge strane S. o.
salonitana pokazuje izuzetnu sličnost sa populacijom S. trutta (Jadranske
filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. Sa obzirom na
te rezultate S. o. salonitana bila bi smještena sa S. trutta kao njezina posebna
linija. Sekvencioniranjem gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod uzoraka
mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke Neretve, uočili smo da nema
varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci između njih, odnosno nađena je
100% identičnost nukleotida. Takav konflikt između podataka dobivenih od
mtDNA i nuklearne DNA je ranije zabilježen kod salmonidnih riba (Bernatchez
i sur., 1995; Wilson i Hebert, 1993), što je moguće da u ovom slučaju ukazuje
na polifiletsko porijeklo podvrste S. o. salonitana.
114
Filogenetsko drvo pokazuje grananja populacija s obzirom na
geografsko mjesto. Uočili smo grupiranje populacija iz istog poriječja. Potočne
pastrve iz Krke pripadaju pastrvama jadranske linije, što se može objasniti
njihovom vezom u prošlosti.
Današnja raširenost slatkovodnih riba povezana je s paleogeografskim
događajima u zemljinoj prošlosti, koji su utjecali na hidrografske sustave. Za
vrijeme mlađeg i srednjeg miocena, prvotno more Tethys se razdijelilo na dva
morska bazena: na Sredozemno more i Paratethys more. Djelovanjem
geoloških događaja došlo je do otvaranja Gibraltarskih vrata i ulaska slane
vode, te Sredozemno i Paratethys more postaju slana mora. Taj događaj bio
je poguban za slatkovodne ribe, koje su živjele u Paratethys moru još od
razdoblja srednjeg miocena. U kratkom vremenu došlo je do nestanka,
vjerojatno, jedne od najbogatijih slatkovodnih fauna. Razdoblje pleistocena
označava više ledenih doba, čije su se posljedice osjetile i u kolebanju razine
oceana. Najveće sniženje razine Sredozemnog mora dogodilo se u zadnjem
Würmskom ledenom dobu prije 15000 do 18000 godina. Posljedica sniženja
razine mora je povećanje Padskog porječja sve do rijeke Krke. Sve zemlje
centralne Europe bile su prožete mrežom riječnih sustava (Sušnik, 2001).
U to vrijeme većinu područja koje danas zauzima Jadransko more,
prekrivalo je kopno. Upravo tada, postojala je veza između slivova rijeka
talijanskog područja sa rijekama Jadranskog poriječja (Apostolidis i sur.,
1996). Za vrijeme pleistocena došlo je do otapanja velike količine leda,
zaostalog iz ledenog doba, koje je doprinijelo znatnoj promjeni zemljine
površine na prostoru današnjeg Jadranskog mora (Steinenger i Rogl, 1984).
Pod utjecajem geoloških promjena došlo je i do mijenjanja staništa u kojima
su obitavale tadašnje populacije pastrva. Geološki procesi su doveli do
odvajanja prvotnih populacija u staništa koja su međusobno razdvojena
nepremostivim barijerama. Različiti uvjeti u novim staništima doveli su do
njihove diferencijacije i do stvaranja skupina koje postoje i danas.
Potočna pastrva jadranske linije (Ad haplotip) opisana je prema obliku
pastrva koje naseljavaju Ohridsko jezero i neke talijanske i francuske rijeke
koje se ulijevaju u Jadransko more (Bernactchez i sur., 1992). Potočna
pastrva danas zauzima ista staništa kao i mekousna, no ona je zauzela ove
prostore znatno kasnije. Stoga smatramo da je podvrsta S. o. salonitana
115
nastala kao posljedica davne hibridizacije početnog oblika S. o. oxyrhynchus i
naprednije S. trutta, koja je kolonizirala rijeke Jadranskog sliva mnogo kasnije.
Takva introgresija, karakterizirana sa zapljenom mtDNA je rijedak, ali
već opisan fenomen kod nekih salmonida. On je dio prirodnog evolucijskog
procesa. Zaštitu takve vrste nipošto ne treba isključiti radi toga što je nastala
takovom vrstom hibridizacije (Allendorf i sur., 2001)
Radi ispitivanja podudaranja evolucijske dinamike mitohondrijske i
nuklearne DNA, genetsku strukturu populacija odredili smo i pomoću
koeficijenta Fst koji se temelji na frekvencijskoj distribuciji alela. Pomoću te
vrijednosti uočili smo da se neke proučavane populacije međusobno znatno
ne razlikuju. To se posebno odnosi na populaciju mekousne pastrve "solinke"
koja je translokacijom iz rijeke Jadro zauzela novo stanište u rijeci Žrnovnici.
Stoga je niska Fst vrijednost od 0.04626 između populacija mekousne pastrve
iz rijeka Jadro i Žrnovnice bila za očekivati. Manja razlika između populacija je
posljedica razlika u frekvencijskoj distribuciji alela. Analizirane populacije
karakterizira sličnost njihova staništa, sve žive u uskom životnom prostoru u
kojem vrlo lako, slučajnim tokom gena, dolazi do fiksacije određenih alela u
populaciji. Ta pojava vodi ka monomorfnosti genotipova iz koje proizlazi efekt
uskog grla. U ribljim populacijama koje žive na uskom životnom prostoru,
efekt uskog grla je vrlo česta pojava. Za populaciju mekousne pastrve u rijeci
Žrnovnici značajan je i mali broj alela po pojedinom mikosatelitskom lokusu,
pa je na čak pet alela (BFRO001, BFRO002, Strutta58, OmyFgt1TUF i
StMSLDH4) cijela populacija monomorfna. Mali genetski polimorfizam ove
populacije stoga je vjerojatno je posljedica višekratnog efekta uskog grla.
Mala heterozigotnost nas je navela na zaključak da ta populacija nije u
ravnoteži. Razlog neravnoteže te populacije ne vidimo u migraciji jedinki,
budući da kod te populacije nismo našli veći udio tuđih alela, poput populacije
mekousne pastrve iz Jadra. Uzrok neravnoteže moguć je u tome što je u tom
specifičnom okruženju, u procesu selekcije, došlo do favoriziranja
homozigota. Budući da se radi o malom staništu u kojem boravi mala riblja
populacija, prilikom izlova obuhvatili smo čitavo stanište. Stoga razlog
neravnoteže ne vidimo u obuhvaćanju samo dijela uzorka. Smatramo da je
116
manjak polimorfizma u populaciji mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici
posljedica rekolonizacije sa populacijom male efektivne veličine.
Razlog za veliku monomorfnost unutar pojedinih populacija i relativno
veliku polimorfnost između nekih populacija je mali broj jedinki u uzorku i
izoliranost između populacija. Broj jedinki u populaciji u prirodnom staništu je
bio izuzetno nizak, izuzev populacije mekosne pastrve u rijeci Neretvi i
njezinim pritocima. Kako su promatrane populacije živjele u različitim
okolišima, na njih su djelovali različiti selekcijski događaji i slučajni tokovi
gena, sve je to dovelo do veće razlike između njih.
Pratili smo introgresiju, s obzirom na proučavane lokuse, potočne
pastrve i mekousne pastrve iz Neretve na populacije mekousnih pastrva u
rijekama Jadro i Žrnovnica. Rezultate analize glavnih koordinata prikazali smo
grafički. Istraživane populacije razdvojile su se na dvije strane: na jednoj
strani su bile mekousne, a na drugoj potočne pastrve. Populacije mekousnih
pastrva iz Jadra i Žrnovnice su se uvelike preklapale. Pregledom njihovih
alela, uočili smo da te populacije imaju znatan broj zajedničkih alela. Da
bismo utvrdili vezu mekousne pastrve iz Jadra, odnosno Žrnovnice i potočne
pastrve iz Krke, promatrali smo njihove zajedničke alele. Uočili smo da one
dijele 8 alela na 5 različitih lokusa (Tablica 12). Većina od tih zajedničkih alela
bila je prisutna samo kod populacije mekousne pastrve iz rijeke Jadro.
Pregledom grafičkog rezultata analize glavnih kooridnati (Graf 10) mogu se
jasno uočiti 3 uzorka mekousne pastrve iz rijeke Jadro koja su pomaknuta
prema populaciji potočne pastrve iz rijeke Krke. Upravo ti uzorci, (J13, J15,
J17) smatramo da su hibridi između mekousne i potočne pastrve. Ti uzorci
imali su jedan alel od solinke, a drugi alel od potočne pastrve, koji su bili
raspoređeni na osam od devet analiziranih mikrosatelitskih lokusa. Radi
specifične distribucije hibridnih genotipova prema kojima je preostali dio
analizirane populacije solinke iz Jadra i Žrnovnice homogen, dokaz je da ta tri
uzorka predstavljaju posljedicu nedavnog križanja solinke sa potočnom
pastrvom. Smatramo da u ovom staništu solinka ima prednost u opstanku
pred potočnom pastrvom i njihovim hibridima, kao u prilog tome navodimo
podatak o električnom ribolovu 1998. godine (Aničić, usmeno priopćenje)
kada su u rijeci Jadro zabilježena 3 primjerka potočne pastrve, a 2003. godine
nije nađen niti jedan primjerak potočne pastrve. Mogućnost fiziološke
117
hibridizacije potvrdio je i Kosorić (usmeno priopćenje), on je na pastrvskom
uzgajalištu vršio hibridizacijske pokuse mekousne S. o. oxyrhynchus i potočne
pastrve koji su rezultirali tvorbom hibrida, danas znanih od lokalnog
stanovništva pod imenom kosor. Taj podatak govori nam da ne postoji jaka
barijera koja bi spriječila križanje mekousne i potočne pastrve. Ovo je
izuzetno bitan podatak pri planiranju zaštite solinke, stoga smatramo da je za
uspješnu rehabilitaciju ove ugrožene vrste potrebno hitno zaustaviti svako
unošenje potočne pastrve u njena staništa.
Analizom Fst vrijednosti između istraživanih populacija, kada smo
izuzeli 3 uzorka za koje smatramo da su hibridi populacije mekousne pastrve
iz Jadra i Žrnovnice pokazale su se još bližima 0,04364. Najveću udaljenost
pokazale su populacije mekousne pastrve iz Jadra i Žrnovnice s potočnom
pastrvom Fst=0.76681, odnosno 0.77979. Koeficijent Fst je pokazivao manju
vrijednost između populacija potočnih pastrva iz Krke i Zrmanje Fst=0.32426,
a njegova vrijednost iznosila je 0.41067 između populacija mekousne pastrve
iz Neretve i potočne iz Krke, odnosno 0.53516 s potočnom iz Zrmanje.
Mekousna pastrva iz rijeke Jadro dijeli s mekousnom pastrvom iz rijeke
Neretve 6 alela na 5 različitih lokusa, a s potočnom pastrvom također dijeli 7
alela na 6 različitih lokusa. To nam također ukazuje na to da je S. o.
salonitana polifiletska vrsta, nastala kao produkt introgresije između S. o.
oxyrhynchus iz rijeke Neretve i potočne pastrve autohtone za jadranski riječni
sustav. Zajedničke alele kod tih populacija tumačimo kao posljedicu
istosmjernih mutacija, te kao ostatak zajedničkog davnog polimorfizma.
Razliku između istraživanih populacija, odnosno intrapopulacijski
polimorfizam, prikazali smo i ocjenom heterozigotnosti. S obzirom na općenito
izuzetno veliku heterozigotnost kod mikrosatelitskih lokusa, heterozigotnost
mikrosatelitskih lokusa kod populacija mekousne pastrve, bila je razmjerno
niska, dok je kod populacija potočne pastrve ona bila ipak nešto viša (Tablica
12). Odnos očekivane i stvarne heterozigotnosti po lokusu kod pojedinih
populacija (mekousna pastrva u Jadru i Žrnovnici) ukazuje na znatan broj
homozigota u tim populacijama. Pomanjkanje heterozigotnosti kod tih
populacija objašnjavamo efektom uskog grla i sa parenjem u srodstvu.
Vjerujemo da je mali broj uzoraka kod pojedinih populacija utjecao na
118
frekvencijsku distribuciju alela, naročito radi moguće prisutnosti rijetkih alela
koje radi malog uzorka nismo mogli uočiti ili smo njihovu frekvenciju
precijenili.
Radi visokog stupnja mutacije mikrosatelita, interpretacija rezultata
analize mikrosatelitskih lokusa ne može biti apsolutno sigurna. Rezultati
analize ukazuju na upotrebljivost mikrosatelitskih lokusa pri analizi
razlikovanja populacija i otkivanju hibrida kod pastrvskih populacija.
Prilikom vrednovanja mitohondrijskih genotipova treba imati na umu
princip njihova nasljeđivanja. Čitav mitohondrijski genom nasljeđuje se po
majci, te stoga ništa ne govori o porijeklu oca. Prilikom unosa potočne pastrve
u novo stanište, njezin potpuni utjecaj na postojeću populaciju može se vidjeti
preko nuklearne DNA, preko mikrosatelita, dok mtDNA ima manji utjecaj, što
se naročito odražava prilikom unosa mužjaka potočne pastrve.
119
5. ZAKLJUČCI
Osnovne zaključke našeg rada iznosimo u nekoliko glavnih točaka.
Rijeke Jadro i Žrnovnica stanište su endemske mekousne pastrve (S.
o. salonitana), koja se odlikuje nizom morfoloških obilježja, među kojima se
ističu zaobljena njuška, mala i mesnata usta, te kratke i široke gornjovilične
kosti.
Uspoređujući morfološka obilježja mekousne pastrve iz rijeke Jadro s
mekousnom pastrvom iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), uočili smo mnoge
zajednička obilježja, ali i niz vidljivih razlika koje ukazuju na njihovo zajedničko
srodstvo i na posljedice prostorne i ekološke izolacije. Prilikom usporedbi
morfoloških obilježja uočili smo bitne razlike u dužini vilice, koja je izraženija i
duža kod S. o. oxyrhynchus, a kod S. o. salonitana gornja vilica je šira.
Samtramo da su ove dvije podvrste nekada bile u znatno bližem srodstvu, no
uslijed duge geografske izolacije i prilagođavanja na specifićne uvijete
staništa dobile su posebne morfološke i ekološke osobine koje ih danas jasno
razlikuju.
Potočna pastva je relativno mlada vrsta na ovim prostorima, činjenica
što S. o. salonitana dijeli sa njom neke fizičke osobine vodi nas prema
zaključcima o njihovoj mogućoj povezanosti tijekom evolucije.
Prilikom usporedbe morfoloških osobina sa endemskim salmonidom
Platysalmo platycephalus iz Turske (Behnke, 1968), jasno je izražena razlika
u promatranim morfometrijskim osobinama, posebno u broju piloričkih
nastavaka. Sve to ukazuje na činjenicu da mekousna pastrva i Platysalmo
platycephalus iz Turske predstavljaju posebne vrste endemičnih salmonida.
120
Pomoću genetskih markera pokušali smo definirati strukturu populacije
endemske mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice (S. o. salonitana).
Analizom uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i Žrnovnice ustanovili smo
da uzorci dijele isti haplotip (ZRN), što nije neobično budući da je populacija
mekousne pastve u rijeci Žrnovnici je nastala odvajanjem dijela jedinki iz
Jadra prije 25 godina. Haplotip ZRN je prvi genetski marker koji opisuje
populaciju mekousne pastrve solinke iz rijeka Jadro i Žrnovnice.
Genetsku strukturu populacija odredili smo pomoću koeficijenta Fst.
Pomoću te vrijednosti uočili smo da se populacije iz rijeka Jadro i Žrnovnice
međusobno znatno ne razlikuju. Manja razlika između populacija je posljedica
razlika u frekvencijskoj distribuciji alela. Uzrok neravnoteže vidimo u tome što
je u tom specifičnom okruženju u procesu selekcije došlo do favoriziranja
homozigota. Stoga smatramo da je manjak polimorfizma u populaciji
mekousne pastrve u rijeci Žrnovnici posljedica rekolonizacije s populacijom
male efektivne veličine.
Analizom mikrosatelitiskih lokusa uočeno je da populacije mekousnih
pastrva iz Jadra i Žrnovnice imaju određen broj zajedničkih alela s potočnom
pastrvom. Analizom su utvrđena tri uzorka mekousne pastrve (J13, J15 i J17)
iz rijeke Jadro koja dijele zajedničke alele s potočnom pastrvom. Smatramo
da su upravo ti uzorci hibridi između mekousne i potočne pastrve. Radi
specifične distribucije hibridnih genotipova prema kojima je preostali dio
analizirane populacije solinke iz Jadra i Žrnovnice homogen, smatramo da ta
tri uzorka predstavljaju posljedicu nedavnog križanja solinke sa potočnom
pastrvom.
Postojanje hibrida govori nam da ne postoji jaka reprodukcijska barijera
koja bi spriječila križanje mekousne i potočne pastrve što je izuzetno bitnan
podatak pri planiranju zaštite mekousne pastrve solinke. Smatramo da je za
uspješnu rehabilitaciju ove ugrožene vrste potrebno hitno zaustaviti svako
unošenje potočne pastrve u njena staništa, u protivnom je moguće da dođe
do izumiranja ove reliktne vrste.
Aleli koji su značajni za populacije mekousne pastrve u Jadru i
Žrnovnici pronašli smo u populaciji mekousne pastrve u rijeci Neretvi.
121
Zajedničke alele kod tih populacija tumačimo kao posljedicu davne
introgresije.
Analizirajući podvrstu S. o. salonitana, rezultati bazirani na
mitohondrijskoj DNA razlikuju se od onih dobivenih analizom nuklearne DNA.
Na osnovi podataka sekvencioniranja od citokroma b i kontrolne regije,
podvrste S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus znatno se razlikuju. S druge
strane, S. o. salonitana pokazuje izuzetnu sličnost s populacijom S. trutta
(jadranske filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. S
obzirom na te rezultate, S. o. salonitana bi bila smještena s S. trutta kao
njezina posebna linija.
Analizom nuklearne DNA, sekvencioniranjem gena laktat
dehidrogenaze (LDH)-C1*, kod uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz
rijeke Neretve uočili smo da nema varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci,
odnosno, nađena je 100% identičnost nukleotida.
Takav konflikt između podataka dobivenih od mtDNA i nuklearne DNA
je ranije zabilježen kod salmonidnih riba (Bernatchez i sur., 1995; Wilson i
Hebert, 1993), što bi u ovom slučaju moglo ukazivati na polifiletsko porijeklo
podvrste S. o. salonitana. Stoga smatramo da je solinka prirodna hibridna
vrsta, koja je nastala kao posljedica davne hibridizacije izvornog oblika
mekousne pastrve (S. obtusirostris oxyrhynchus) s naprednijom potočnom
pastrvom, koja je mnogo kasnije kolonizirala rijeke jadranskog sliva.
122
6. LITERATURA
1. Aganović, M. (1979): Salmonidne vrste riba i njihov uzgoj. IGKRO
Svjetlost, Sarajevo.
2. Alegria Hernandez V. (1985): A contribution to the study of
heterogeneity of the Adriatic sardine (Sardina pilchardus Walb.)
population. Acta Adriatica, 26: 109-122.
3. Aliah R. S., Sato S., Taniguchi N. (2000): An Evaluation fo Genetic
Variability in Nishikigoi, Cyprinus carpio, Stocks from Niigata
Prefecture, Based on Microsatellite DNA Markers. Suisanzishoku.
48(1): 25-31.
4. Allendorf, F. W., Leary, R. F. (1988): Conservation and distribution of
genetic variation in a polytypic species: the cutthroat trout.
Conservation Biology, 2: 170-184.
5. Allendorf, F. W., Leary, R. F., Spruell, P., Wenburg, J. K. (2001): The
problems with hybrids: setting conservation guidelines. Trends in
Ecology and Evolution, 16 (11): 613-622.
6. Allendorf, F. W., Thorgaard, G. H. (1984): Tetraploidy and the evolution
of salmonid fishes. Evolutionary Genetics of Fishes, B. J. Turner,
Plenum Press, New York, str.: 1-53.
7. Apostolidis, A., Karakousis, Y., Rryantaphyllidis, C. (1996): Genetic
divergence and phylogenetic relationships among Salmo trutta L.
(brown trout) populations from Greece and other European countries.
Heredity, 76: 551-560.
8. Avise, J. C. (1994): Molecular markers, natural history and evoluton.
Chapman & Hall, Inc., New York.
9. Avise, J. C. (2000): Phylogeography. The History and Formation of
Species. Harvard University Press, Cambridge, MA.
10. Avise, J. C., Saunders, N. C. (1984): Hybridization and introgression
among species of sunfish (Lepomis): analysis by mitochondrial DNA
and allozyme markers. Genetics, 108: 237-255.
11. Barton, N. H., Hewitt, G. M. (1989): Adaptation, speciation and hybrid
zones. Nature, 341: 497-503.
123
12. Beaumont, M. A., Bruford, M. W. (1999): Microsatellites in conservation
genetics. U: Microsatellites: Evolution and Applications. (Goldstein, D.
B., Schlötterer, C., urednici). Oxford University Press. str.: 165 – 182.
13. Behnke, R. J. (1968): A new subgenus and species of truout:
Platysalmo platycephalus from southcentral Turkey with comments on
the classification of the subfamily Salmoninae. Mitt. Hmbg. Zool. Mus.
Inst., 66: 1 – 15.
14. Behnke, R. J. (1986): Brown trout. Trout, 27: 42 – 47.
15. Belkhir, K., Borsa, P., Goudet, J., Chikhi, L., Bonhomme, F. (1998):
GENETIX, logiciel sous Wimdows TM pour la genetique des
populations. Laboratoire Genome et Populations, CNRS UPR 9060,
University Montpellier II.
16. Berg, L. S. (1908) Vorläufige Bemerkungen über die europäisch-
asiatischen Samoniden, insvesondere die Gattung Thymallus.
Annuaire du Musée Uoologieque de l'Academie Imperiale des
Sciences de St. Petersbourg 12: 500 – 514.
17. Bernatcherz, L., Guyomard, R., Bonhomme, F. (1992): DNA sequence
variation of the mitochondrial control region among geographically and
morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations.
Molecular Ecology 1: 161 – 173.
18. Bernatchez, L. (2001) The evolutionary history of brown trout (Salmo
trutta L.) interred from phlylogenetic, nested clade, and mismatch
analyses of mitochondrial DNA variation, Evolution, 55 (2): 351 – 379.
19. Bernatchez, L., Danzmann, R. G. (1993): Congruence in control-region
sequence and restriction-site variation in mitochondrial DNA of brook
charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Molecular Biology and Evolution,
10: 1002 – 1014.
20. Bernatchez, L., Dodson, J. J. (1991): Phylogeographic structure in
mitochondrial DNA of the Lake whitefish (Coregonus clupeaformis) and
its relation to Pleistocene glaciations. Evolution, 45: 1016-1035.
21. Bernatchez, L., Glemet, H., Wilson, C.,C., Danzmann, R.,G. (1995):
Introgression and fixation of arctic char (Salvelinus alpinus)
mitochondrial genome in an allopatric population of brook trout
124
(Salvelinus fontinalis). Canadian Journal of Fisheries & Aquatic
Sciences 52, 1: 179-185.
22. Bernatchez, L., Wilson,C. C. (1998): Comparative phylogeography of
Neoarctic and Paleoarctic fish. Molecular ecology, 7: 431-452.
23. Berrebi, P., Duguid, A., Garcia-Marin, J. L., Guyomard, R., Ferguson
A., Hansen, M. M., Hindar, K., Koljonene, M. L., Laikre, L., Largiarder,
C., Martinez, P., Nielsen, E. E., Palm, S., Ruzzante, D., Ryman, N.,
Trianaphyllidis, C. (1999): Conservation genetic management of brown
trout (Salmo trutta) in Europe. (Second draft).
24. Berrebi, P., Povž, M., Jesenšek, D., Cattaneo-Berrebi, G., Crivelli, A. J.
(2000): The genetic diversity of native, stocked and hybrid populations
of marble trout in the Soča river, Slovenia. Heredity, 85 (3): 277-287.
25. Bianco, P. G. (1990): Potential role of the palaeohistory of the
Mediterranean and Paratethys basins on the early dispersal of Euro-
Mediterranean freshwater fishes. Ichtyoi. Explor. Freshwaters, 1 (2):
167 – 184.
26. Bianco, P. G., Knežević, B. (1987): The Leuciscus cephalus complex
(Pisces, Cyprinideae) in western Balcanic area. Proc. V Congr. Eur.
Ichthyol., Stockholm 1985, 49 – 55.
27. Bonacci, O., Kerovec, M., Roje Bonacci, T., Mrakovčić, M., Plenković
Moraj, A. (1998): Ecologically acceptable flows definition for the
Žrnovnica river (Croatia). Regulated Rivers - Research & Management,
14: 245-356.
28. Bowling, A. T., Del Valle, A., Bowling, M. (2000). A pedigree-based
study of mitochondiral D-loop DNA sequence variation among Arabian
horses. Animal Genetics, 31: 1 – 7.
29. Brown, W. M., George, M. J., Wilson, A. C. (1979): Rapid evolution of
animal mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy od
Scinces, USA, 76: 1967 – 1971.
30. Brown, W. M., Prager, E. M:, Wang, A., Wilson, A. C. (1982):
Mitochondrial DNA sequences of primates: Tempo and mode of
evolution. Jurnal of Molecular Evolution, 18: 225 – 239.
125
31. Bruford, M. W., Ciofi, C., Funk., S. M. (1998): Characteristics of
Microsatellites. U: Molecular Tools for Screening Biodiversity (Karp, A.,
Isaac, P. G., Ingram, D. S., urednici). Chapman & Hall, str.: 202 – 205.
32. Brunner P. C., Douglas M. R., Bernatchez L. (1998). Microsatellite and
mitochondrial DNA assessment of population structure and stocking
effects in Arctic charr Salvelinus alpinous (Teleostei, Salmomidae) from
Central Alpine lakes. Molecular Ecology. 7: 209-223.
33. Cables, L. (2001): Mitochondria. Horsepower. alsalkjlkjčlkjčlkjčlkjsalkjlj
http://homepages.ihug.co.nz/~lcables/mitochondria.htm
34. Campton, D. E. (1987): Natural hybridization and introgression in
fishes: Methods of detection and genetic interpretations. U: Population
Genetics and Fishery Management (Ryman, N., Utter, F., urednici).
Universety of Washington Press, Inc. Ann Arbor, MI: 242-258.
35. Carvalho, G. R. (1993): Evolutionary aspects of fish distribution:
genetic variability and adaptation. J. Fish Biol., 43: 53-73.
36. Carvalho, G. R., Hauser, L. (1998): Advances in the molecular analysis
of fish population structure. Ital. J. Zool., 65: 21-33
37. Chakraborty, R., Kimmel, M., Stivers, D. N., Davison, L. J., Deka, R.
(1997): Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide
microsatellite loci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1041 – 1046.
38. Constable, J. J., Packer, C., Collins, D. A., Pusey, A. E. (1995):
Nuclear DNA from primate dung. Nature: 373 - 393.
39. Crivelli A., Poizat G., Berrebi P., Jesensek D., Rubin J. F. (2000).
Conservation biology applied to fish: The example of a project for
rehabilitating the marble trout (Salmo marmoratus) in Slovenia.
Cybium. 24(3): 211-230.
40. Crivelli, A. J. (1996): The freshwater fish enedmic to the northern
Mediterranean region. Le Sambuc, Arles, France.
41. Cronin, M. A., Spearman, W. J., Wilmot, R. L. (1993): Mitochondrial
variation in Chinook (Oncorhynchus tsawytscha) and Chum salmon (O.
keta) detected by restriction enzyme analysis of Polymeraze Chain
Reaction (PCR) products. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic
Sciences, 50: 708 – 715.
126
42. Delling B., Crivelli A. J., Rubin J-F., Berrebi P. (2000): Morphological
variation in hybrids between Salmo marmoratus and alien Salmo
species in the Volaria stream, Soca River Basin, Slovenia. Journal of
Fish Biology. 57: 1199-1212.
43. Dirienzo, A., Peterson, A. C., Garza, J. C., Valdes, A. M., Slatkin, M.,
Freimer, N. B. (1994): Mutational processes of simple-sequence repeat
loci in human populations. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 91(8): 3166-3170.
44. Domanico, M. J., Phillip, R. B., Oakley, T. H. (1997): Phylogenetic
analysis of the Pacific salmon (genus Oncorhynchus) using nuclear
and mitochondrial DNA sequences. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 54:
1865–1872.
45. Dowling, T. E., Moritz., C., Palmer, J. D. (1990): Nucleic acids. II.
Restriction site analysis. U: Molecular Systematics, (Heillis,D. M.,
Moritz, C, urednici), Sinauer Associates, Sunderland, MA, str.: 25–317.
46. Dowling, T. E., Secor, C. L. (1997): The role of hybridization and
introgression in the diversification of animals. Annu. Rev. Ecol. Syst.,
28: 593 – 619.
47. Drofejeva, E. A. (1989): The basic principles of classification and
phylogeny of the salmonid fishes (Salmoniformes: Salmonoidesi:
Salmonidae). Biology and phylogeny of fishes, St. Perersburg, USSR
Academy od Sciences: 5 – 16.
48. Economidis P. S., Banarescu P. M. (1991). The Distribution and Origin
of Freshwater Fishes on the Balkan Peninsula, Especially in Greece.
Int. Revue. Ges. Hydrobiol. 76: 257 – 283.
49. Estoup A., Presa P., Krieg F., Vaiman D., Guyomard R. (1993). (CT)n
and (GT)n microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo
trutta L. (brown trout). Heredity. 71: 488 - 496.
50. Ford-Llyoyd, G. (1996): Measuring genetic variation using molecular
markers. University of Birmingham, Kevin Painting, IPGRI, Rome.
51. Gavin P., Taggart J., Ferguson A., O’Farrell M., Cross T. (1996).
Population genetics of Atalntic salmon (Salmo salar) in the River
Shannon system in Ireland. Canadian Jounal of Fisheries Sciences.
53: 1933-1942.
127
52. Giuffra, E., Guyomard, R., Forneris, G. (1996): Phylogenetic
relationships and introgression patterns between incipient parapatric
species of Italian Brown trout (Salmo trutta l. complex). Molecular
Ecology, 5 (2): 207-220.
53. Glubokovsky, M. K. (1995) Evolutionary Biology of Salmonid Fishes.
Nauka, Moscow.
54. Goudet, J. (1995): FSTAT (vers. 1.2): a computer program to calculate
F-statistic. J. Hered.: 485-486.
55. Hadžišće, S. (1962): Ka poznavanju roda Salmothymus Berg. Izdanija,
T. III, 2, Specijalno izdanje, Skoplje.
56. Hansen, M. M., Ruzzante, D. E., Nielsen, E. E., Mansberg, K. L. D.
(2001): Brown trout (Salmo trutta) stocking impact assessment using
microsatellite DNA markers. Ecological Appliocations, 11 (1): 148 –
160.
57. Harrison, G. (1989): Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in
population and evolution biology. Tree, 4 (1): 6 – 12.
58. Harrison, R. G. (1993): Hybrid zones and the evolutionary process.
Oxford University Press, New York.
59. Heckel, J. J. (1851): Bericht einer ichtyologischen Reise. II. Beiträge zr
den Gattungen Salmo, Fario, Salar, Coregonus, Chondrostoma und
Telestes. Sitzungsbarrichte der Akademie der Wissenschoften. Wien:
347 – 390.
60. Heckel, J., Kner, R. (1857): Die Süsswasserfische der
Österreichischen Monarchie. Wien.
61. Hening, W. (1966): Phylogenetic systematics. Univ. Illinois Pres,
Urbana, str.: 263.
62. Hurst, C. D., Bartlett, S. E., Davidson, W. S., Bruce, I. J. (1999): The
complete mitochondrial sequence of the Atlantic salmon, Salmo salar.
Gene, 239: 237 – 242.
63. Hutchinson W. F., Carvalho G. R., Rogers F. I. (1999): A non–
destuctive technique for the recovery of DNA from dried fish otoliths for
subsequent molecular genetic analysis. Molecular Ecology, 8: 893 -
894.
128
64. Irwin, D. M., Kocher, T. D., Wilson, A. C. (1991): Evolution of the
cytochrome b gene of mammals. J. Fish Biol., 35: 687-701.
65. Janković, D. (1961): Taksonomska i ekološka ispitivanja na mekousnoj
pastrmci iz reke Bune. Biološki institut NR Srbije. Zbornik radova,
Knjiga 5. Beograd, Naučno delo: 3 – 31.
66. Jarne, P., Lagoda, P. J. L. (1996): Microsatellites, from molecules to
populations and beck. Trends in Ecology and Evolution. 11/10: 424 –
429.
67. Johnson, G. D., Patterson, C. (1996): Relationship of lower
euteleostean fishes. U: Interrelations of Fishes (Stiassny, M. L. J.,
Parenti, L. R., Johnson, G. D., urednici). Academic Press, San Diego:
251-332.
68. Jordan, W. C., Verspoor, E. (1993): Incidence of natural hybrids
produce gynogens and triploids when backcrossed to male Atlantic
salmon. Aquaculture, 57: 245-358.
69. Karaman, M. (1966): Beitrag zur Kenntnis der Salmoniden
Südeuropas. Hydrobiologia, XXVIII, Fasc.1.
70. Karaman, S. (1927): Salmonidi Balkana. Glasnik Skopskog Naučnog
Društva, Skoplje.
71. Kendall, A. W., Behnke, R. J. (1984): Salmonidae: Development and
relationship. U: Ontogeny and Systematics of Fishes (urednik: Moser,
H. G.). Am. Soc. Ichthyol. Herpetol. Spec. Publ. 1, str.: 142-149.
72. Kosorić, Đ., Vuković, T. (1969): Ispitivanje mogućnosti hibridizacije
salmonidnih vrsta sliva Neretve. Ichtylogia, vol. 1, 1, Beograd.
73. Kumar, S., Tamura, K., Jakobsen, I. B., Nei, M. (2001) MEGA2:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics.
74. Lewin, B. (2000): Genes VII. Oxford University Press, University of
Oxford, Oxford, United Kindom.
75. Li, W. H., Grauer, D. (1991): Fundamentals of Molecular Evolutin.
Sinauer Associates, Sunderland, MA.
76. Lu, G., Basley, D. J., Bernatchez, L. (2001): Contrasting patterns of
mitochondrial DNA and microsatellite introgresive hybridization
129
between lineages of lake whitefish (Coregonus clupeaformis);
relevance for speciatin. Molecular Ecology, 10: 965-985.
77. Lu, G., Bernatchez, L. (1999): Correlated trophic specialization and
genetic divergence in sympatic lake whitefish ecotypes (Coregonus
clupeaformis): support for the ecological speciation hypothesis.
Evolution, 53: 1491-1505.
78. Magoulas, A., Zouros, E. (1993): Restriction-site heteroplasmy in
anchovy (Engraulis encrasiocholus) indicates incidental biparental
inheritance of mitochondrial DNA. Mol. Biol. Evol. 10 (2): 319 – 325.
79. Maitland, P. S. (1995): The conservation of freshwater fish: past and
present experience. Biological Conservation, 72: 259-270.
80. Marić, D. (1995): Endemic fish species of Montenegro. Biological
Conservation 72: 187 - 194.
81. Marić, S. (2002): Morfološki varijabiliteti pastrmki (subfamilija
Salmoninae) – značaj za biološku konzervaciju. Magistarski rad,
Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.
82. Mayr, E. (1963): Animal species and evolution. Harward University
Press, Cambridge.
83. McMeel, O. M., Hoey, E. M., Ferguson, A. (2001): Partial nucleotide
sequences, and routine typing by polymerase chain reaction-restriction
fragment length polymorphism, of the brown trout (Salmo trutta) lactate
dehydrogenase, LDH-C1 *90 and *100 alleles. Molecular Ecology, 10:
29 – 34.
84. McMillan, M., Wilcove, D. (1994): Gone but not forgotten: Why have
species protected by Endangered Species Act become extinct?
Endangered Species Update, 11: 5-6.
85. Meffe, G. K. (1986): Conservation genetics and the management of
endangered fishes. Fisheries, 11: 14-23.
86. Miller, L. M., Kapuscinski, A R. (1996): Microsatellite DNA Markers
Reveal New Levels of Genetic Variation in Northen Pike. Transactions
of the American Fisheries Society, 125: 971 - 977.
130
87. Moritz, C. (1994): Applications of mitochondrial DNA analysis in
conservation: a critical review. Molecular Ecology, 3: 401-411.
88. Moritz, C., Dowling, T. E., Brown, W. M. (1987): Evolution of animal
mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics.
Annu. Rev. Ecol. Syst., 18: 269-292.
89. Moritz, C., Hillis, D. M. (1996): Molecular Systematics: Context and
Controverses. U: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, str. 1-
13.
90. Mrakovčić, M., Kerovec, M. (1997): Slatkovodne ribe i kružnouste
Hrvatske. Športski ribolov, 2: 14-16.
91. Mrakovčić, M., Mišetić, S., (1989): Status, distribution and conservation
of the salmonid Salmothymus obtusirostris (Heckel) and the cyprind
Aulopyge hugeli (Heckel) in Yugoslavia. Journal of fish biology, 37A:
241 – 242.
92. Mrakovčić, M., Mišetić, S., Povž, M. (1995): Status od freshwater fish in
Croatian Adriatic river system. Biological Conservation, 72: 179 – 185.
93. Neave, F. (1958): The orgin and speciation of Oncorhynchus.
Transactions of the Royal Society of Canada, Series 3, 52, (5): 25 –
49.
94. Nei, M. (1972): Genetic distance between populations. American
Naturalist, 106: 283-292.
95. Nei, M. (1987): Molecular Evolutionary Genetic. Columbia University
Press, New York.
96. Nei, M., Tajima, F. (1981): DNA polymorphism detectable by restriction
endonucleases. Genetics, 105: 207-217.
97. Nicholas, F. W. (1996): Introduction to Veterinary Genetics. Oxford
University Press.
98. Norden, C. R. (1961): Comparative osteology of representative
salmonid fishes, with particular reference to the grayling (Thymallus
arcticus) and its phylogeny. J. Fish. Res. Bd. Can., 8: 679-791.
99. O’Reilly, P. T., Hamilton, L. C., McConnell, S. K., Wright, J. M. (1996).
Rapid analysis of gnenetic variation in Atlantic salmon (Salmo salar) by
131
PCR mutiplexing of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites.
Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 53: 2292-2298.
100. Oakley, T. H., Phillips, R. B. (1999): Phylogeny of salmonine fishes
based on growth hormone introns: Atlantic (Salmo) and Pacific
(Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetics
and Evolution, 11: 381 – 393.
101. Ohno, S. (1970): Evolution by Gene Duplication. Springer Verlang,
Berlin
102. Ohno, S. (1974): Chordata 1: Protochordata. Cyclostomata, and
Pisces. Animal Cytogenetics, Gebruder – Borntrage, Berlin, 4: 1 – 92.
103. Osinov, A. G. (1999): Salmonid fishes of the genera Salmo, Parasalmo
and Oncorhynchus: genetic divergence, phylogeny, and classification.
Journal of Ichthyology, 39: 571 – 587.
104. Osinov, A. G., Lebedev, V. S. (2000): Genetic divergece and
phylogeny of the Salmoninae based on allozyme data. Journal of Fish
Biology, 57: 354-381.
105. Oxnard, C. E. (1078): One biologist’s view of morphometrics. Ann. Rev.
Ecol. Syst., 9: 219-214.
106. Page, R. D. M., Holmes, E. C. (1998): Molecular evolution, A
Phylogenetic Approach. Blackwell Science, Oxford.
107. Palumbi, S. R., Baker, C. S. (1994): Contrasting population structure
form nuclear intron sequences and mtDNA of humpback whales.
Molecular Biology and Evolution, 11: 426-435.
108. Park, L. K:, Morgan, P. (1994): Developments in molecular genetic
technique in fisheries. Review of Fish Biology and Fisheries, 4: 272 –
279.
109. Perez, J., Martinez, J. L., Moran, P., Beall, E., Garcia-Vazquez, E.
(1999): Indentification of Atlantic salmon x brown trout hybrids with a
nuclear marker useful for evolutionary studies. Journal of Fish Biology,
54: 460-464.
110. Phillips, R. P., Oakley, T. H. (1997): Phylogenic relationship among the
Salmonidae Based on Nuclear and Mitochondrial DNA Sequences.
132
Molecular systematics of fishes, San Diego, Academic Press: 145 –
162.
111. Phillips, R.,B., Matsuoka, M., P., Konon, I., Reed, K, M. (2000):
Phylogenetic analysis of mitochondrial and nuclear sequences
supports inclusion of Acantholingua ohridana in the genus Salmo.
Copeia, 2: 546-550.
112. Pipas, J. C., Bulow, F. J. (1998): Hybridization between redeye bass
and smallmouth bass in Tennessee Streams. Tran. Am. Fish. Soc,
127: 141-146.
113. Popović, J. (1985): Zaštitimo naše endemične vrste riba. Ribarstvo
Jugoslavije, 40: 92-93.
114. Poteaux, C. (1995): Interactions Genetiques entre formes sauvages et
formes domestiques chez la truite commune (Salmo trutta fario L.).
Dokt. Dis, Universite Montpellier II, Montpellier: 110.
115. Poteaux, C., Bonhomme, F., Berrebi, P. (1999): Microsatellite
polymorphism and genetic impact of restocking in Mediterranean
brown trout (Salmo trutta L.). Heredity, 82 (6): 645-653.
116. Povž, M., Jesenšek, D., Berrebi, P., Crivelli, A. J. (1996): Soška pastrv
Salmo trutta marmoratus, Cuvier 1817, v porečju Soče v Sloveniji.
Zaštitni nacrt.
117. Presa, P. i Guyomard, R. (1996): Conservation of microsatellites in
three species of salmonids. Journal of Fish Biology, 49: 1326 – 1329.
118. Queller, D. C., Strassmann, J. E., Hughes, C. R. (1993): Microsatellites
and kinship. Trends in Ecology and Evolution, 8/8: 285 – 288.
119. Razpet, A., Jug, T., Sušnik, S., Dovč, P., Snoj, A. (2003): Molecular
evidence of natural hybridisation between Salmo obtusirostirs and
Salmo trutta in the river Neretva. 3rd congress of the genetic society of
Slovenia, Bled, 31. svibanj – 4. lipanj, 2003, Zbornik sažetaka: 54-55.
120. Rhymer, J. M., Simberloff, D. (1993): Hiybids and hybrid zones:
historical perspective. U: Hybrid Zones and the Evolutionary Process
(Harrison, R. G., urednik). Oxford University Press, str.: 3-12.
121. Rice, W. R. (1989): Analyzing tables of statistical tests. Evolution, 43:
223-225.
133
122. Rieseberg, L, H. (1998): Moelcular ecology of hybridization. U:
Advances in Molecular Ecology (urednik: Carvalho, G. R.). IOS Press,
Amsterdam, str.: 243-265.
123. Sakamoto, T., Okamoto, N., Ikeda, Y., Nakamura, Y., Sato, T. (1994):
Dinucleotide-repeat polymorphism in DNA of rainbow trout and its
application in fisheries science. Journal of Fish Biology, 44: 1093-1096.
124. Saunders, R. L., Schom, C. B. (1985): Importance of the vaiation in the
life history parameters of atlantic salmon (Salmo salar). Canadian
Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 42: 625-618.
125. Schlötterer, C. (1998): Microsatellites. U: Molecular Genetic Analysis of
Populations, 2. izd. (Hoelzel, A. R., urednik). Oxford University Press.
str.: 237 – 261.
126. Schlötterer, C., Pemberton, J. (1994): Molecular Ecology and
Evolution: Approaches and Applications, Birkhauer Verlag Basel,
Switzerland, str.: 203 – 113.
127. Schlötterer, C., Tautz, D. (1992): Slippage synthesis of simple
sequence DNA. Nucleic Acids Research 20: 211 – 215.
128. Schmidt, D. Y. (1947): Migrations of Fishes. USSR Academy of
Sciences, Leningrad.
129. Schneider, S., Roessli, D., Excoffier, L. (2000): Arlequin ver. 2.000: A
software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry
Laboratory, University of Geneva, Switzerland.
130. Shaposhnikova, G. C. (1975): Systematics relation of some
representatives of the familiy Salmonidae. Ichthyologia, 7 (1): 61-70.
131. Shedlock, A. M., Parker, J. D., Crispin, D. A., Pietsch, T. W., Burmer,
G. C. (1992): Evolution of the salmonid mitochondrial control region.
Molecular phylogenetics and evolution, 1, 3: 179 – 192.
132. Simon, R. C., (1963): Chromosome morphology and species evolution
in the five North American species of Pacific salmon (Oncorhynchus).
Jour. Morphol. 112 (1): 77-95.
133. Slatkin, M. (1995): A measure of population subdivision based on
microsatellite allele frequencies. Genetics, 139 (3): 1463.
134. Slettan, A. (1995): GenBank Acc. no. Z49134.
134
135. Smith, G. R. (1992): Introgression in fishes – significance for
paleontology, cladistics, and evolutionary rates. Syst. Biol., 41: 41-57.
136. Smith, G. R., Swirydczuk, K., Kimmel, P. G., Wilkinson, B. H. (1982):
Fish biostratiography of late Miocene to Pleistocene sediments of the
western Snake River plain, Idaho. Cenizoc Geology of Idaho. IBMG
Bulletin 26, str.: 519 – 541.
137. Snoj, A. (1997): Molekularno biološka karakterizacija soške postrvi
(Salmo marmoratus, Cuvier 1817). Dokt. Dis, Domžale, Oddelek za
zootehniko: 7 – 9.
138. Snoj, A. (2001): Preservation biology: a case of preserving Marble
trout. Winter School in Molecular Genetics, Lecture notes.
139. Snoj, A. (2003): Molecular phylogeny of "arhaic trouts" and their
taxonomic classification. 3rd congress of the genetic society of
Slovenia, Bled, 31. svibanj – 4. lipanj, 2003, Zbornik sažetaka: 73-74.
140. Snoj, A., Marčeta, B., Sušnik ,S., Melkič, E., Meglič, V., Dovč, P.
(2002a): The taxonomic status of the sea trout from the north Adriatic
Sea, as revealed by mitochondrial and nuclear DNA analysis. Journal
of Biogeography, 29: 1179-1185.
141. Snoj, A., Melkič, E., Sušnik, S., Muhamedagić, S., Dovč, P. (2002b):
DNA phylogeny supports revised classification of Salmothymus
obtusirostris. Biological Journal of the Linnean Society, 77: 399 – 411.
142. Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1996): A set of new microstellite DNA
markers for Salmo marmoratus (Cuvire, 1817). Procedding of the 3rd
International Conference, Life Sciences 1996, Slovenija: 93-94.
143. Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1997): The first microsattelite DNA
marker for marble trout, BFRO001. Journal of Animal Sciences, 75:
1983.
144. Štambuk-Giljanovic, N. (2002.): Vode Cetine i njezina porječja.
Biblioteka Zavoda za javno zdravstvo Županije splitsko-dalmatinske,
Split.
145. Stanković, S. (1960): The Balkan lake Ohrid and its living world.
Monographiae biologicaea, 9, Den Haag.
135
146. Stearley, R. F., Smith, G. R. (1993): Phylogeny of the pacific trout and
salmons (Oncorhynchus) and genera of the family Salmonidae.
Transaction of the American Ficheries Society, 122: 1 – 33.
147. Stefanović, D. (1948): Rasna i ekološka ispitivanja na ohridskim
salmonidima. Srpska Akad. Nauka. Kn. CXXXIX. Beograd.
148. Steindachner, F. (1882): Ichthyologische Beiträge (XII). Akad. Der
Wissenschaften, LXXXVI, Band I, Heft II: 75-78. Wien.
149. Stepien, C. A., Kocher, T. D. (1997): Molecul and morphology in studes
of fish evolution. U: Molecular systematics of fishes, (Kocher, T. D.,
Stepien, C. A., urednici), Academic Press, str.: 1 – 11.
150. Strachan, T., Read, A. P. (1996): Human Molecular Genetics. Bios
Scientific Publication, Oxford.
151. Stryer, L. (1995): Biochemistry, 4 th Ed Rerrman, New York.
152. Sušnik, S. (2001): Polimorfize kromosomske in mitohondrijske DNA
lipna (Thymallus thymallus) in filogenetski odnosi med njegovimi
geografsko ločenim populacijami. Dokt. Dis, Domžale, Oddelek za
zootehniko: 13–15.
153. Sušnik, S., Snoj, A., Dovč, P. (2001): Evolutionary distinctness of
grayling (Thymallus thymallus) inhabiting the Adriatic river system, as
based on mtDNA variation. Biological Journal of the Linnean Society,
74: 375-385.
154. Sušnik, S., Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1997): The microsatellite
marker (BFRO002) characteristic for different geographically remote
brown trout, Salmo trutta L., populations. Animal Genetics, 28: 370-
383.
155. Svärdson, G. (1945): Chromosome studies on Salmonidae. Report of
the institute of Freshwater Fisheries Research, Drottningholm 23: 1 –
151.
156. Taberlet, P. (1999): Noninvasive genetic sampling: look before you
leap. Trend Ecol. Evol., 14: 323-327.
157. Taler, Z. (1951): Mekousne. Slatkovodno ribarstvo Jugoslavije, 3: 60 -
64.
158. Taler, Z. (1952): Problem reke Bune. Ribarstvo Jugoslavije. 7: 11-12.
136
159. Taler, Z. (1953): Znamenite i osobite ribe u Bosni i Hercegovini.
Ribarski list, 28: 4.
160. Taler, Z. (1954): Mekousna. Ribarski list, 29: 1.
161. Tave D. (1993): Genetics for Fish Hatchery Managers. AVI Book, New
York, str.: 415.
162. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins,
D. G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for
multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic
Acids Research, 24: 4876-4882.
163. Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003a): Note on the
growth of endemic soft-muzzled trout Salmothymus obtusirostris
translocated into a Dalmatian river. Biologia, Bratislava, Section
Zoology, 58 (5): 999-1001.
164. Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003b): Growth and
condition of endemic trout Salmothymus obutusirostris in a Dalmatian
river Jadro. 4th World Fisheries Conference, Vancouver.
165. Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Kolak, A., Dražić, M. (2000):
Morphological variation among four strains of common carp Cyprinus
carpio in Croatia. Folia Zoologica 49 (1): 69 – 74.
166. Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Lovrinov, M. (1995): Ribarstvo,
Nakladni zavod Globus, Zagreb.
167. Utter, F. M., Seeb, J. E. (1990): Genetic marking of fishes: overview
focusing on protein variation. American Fisheries Society Symposium,
7: 426 – 438.
168. Verspoor, E. (1988): Widespread hybridization between Atlantic
salmon, Salmo salar and brown trout, Salmo trutta, in eastern
Newfoundland. Journal of Fish Biology, 32: 327-334.
169. Vida, G. (1994): Global issues of genetic diversity. U: Conservation
genetics (urednici: Loeschecke, V., Tomiukm J., Jain, S. K.).
Birkhauser Verlag.
170. Vladykov, V. D. (1963): A review of salmonid genera and their broad
geographical distribution. Transactions of the Royal Society of Canada,
Series IV, Section III, 1: 459 – 504.
137
171. Vuković, T., Ivanović, B. (1971): Slatkovodne ribe Jugoslavije
(Freshwater fish of Yugoslavia). Zemaljski muzej BIH, Sarajevo, str.:
115.
172. Waples, R. S. (1991): Genetic risk associated with supplementation of
Pacific salmonids: Captive brodstock programs. Canadian Journal of
Fisheries and Aquatic Sciences, 51: 310-329.
173. Weir, B. S., Cockerham, C. C. (1984): Estimating F-statistics for the
analysis of population structure. Evolution, 38: 1358-1370.
174. Wheeler, A. (1992): Freshwater fishes of Britain and Europe. Rainbow
Books, London: 54 - 55.
175. White, P. S., Densmore, III L. D. (1992): Mitochondrial DNA isolation.
V: A molecular genetic analysis of population. A practical approach.
New York, Oxford University press, str.: 37 – 43.
176. Wilson, C. C., Hebert, P. D. N. (1993): Natural hybridization between
arctic charr (Salvelinus alpinus) and lake trout (S. namaycush) in the
canadian arctic. Canadian Journal of Fisheries & Aquatic Sciences, 50,
12: 2652-2658.
177. Wright, S. (1951): The genetical structure of populations. Annals of
Eugenics, 15: 323-354.
178. Zhang, D., Hewitt, G. (1996): Nuclear integrations: challenges for
mitochondrial DNA markers. Tree, 11, 6: 247 – 252.
138
7. SAŽETAK
Mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostris salonitana) je endemska
pastrva sa izvornim staništem u rijeci Jadro, pokraj Splita. Dio populacije
naknadno je prebačen i u rijeku Žrnovnicu, gdje i danas obitava. Pripada u
porodicu Salmonidae. Kao i ostale podvrste roda Salmothymus, ograničena je
na usko područje rasprostranjenja, te i najmanji utjecaji na njeno stanište
imaju veliko djelovanje na malu populaciju.
Budući da je osnovni cilj našeg rada bio pronaći i opisati genetske
razlike između mekousnih pastrva S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus i
potočne pastrve (Salmo trutta), prikupili smo uzorke triju populacija mekousne
pastrve koje obitavaju u rijekama jadranskog sliva (Jadro, Žrnovnica i
Neretva), te dviju populacija potočne pastrve, koje pripadaju jadranskim
linijama pastrva (Krka i Zrmanja).
Sadašnje populacije mekousnih pastrva su vrlo male i neprestano
bivaju ugrožene od mnogih faktora. Zbog toga smo mogli analizirati mali broj
uzoraka. Svjesni smo da zaključci izvedeni nakon analize malog broja
uzoraka nisu statistički opravdani, no unatoč tome, oni su zanimljivi i temelj su
za nove rasprave i istraživanja. Dobivene rezultate stavili smo u odnos s
ranije istraženim linijama i vrstama pastrva, u oblik filogenetskog stabla.
Na području gdje zajedno žive često je postojanje hibrida između
potočne i mekousne pastrve. Prepoznati hibride vrlo je teško, stoga su uz
morfološke, korištene i molekularne metode razlikovanja populacija.
Uspoređujući morfološke osobine mekousne pastrve iz rijeke Jadro s
mekousnom pastrvom iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), uočili smo mnoge
zajedničke osobine i niz vidnih razlika. To ukazuje na njihovo zajedničko
srodstvo, kao i na posljedice prostorne i ekološke izolacije.
139
Pomoću genetskih markera i statističke analize pokušali smo definirati
strukturu populacije endemske mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice
(S. o. salonitana).
Razlikovanje genetske varijabilnosti provedeno je na nivou
deoksiribonukleinske kiseline (DNA), pri čemu su upotrebljena dva različita
genetska sistema: mitohondrijska DNA, koja je jedan od najprimjenjenijih
alata za molekularno genetske i populacijske studije, te mikrosatelitska DNA,
koja zbog svoje lokusne specifične hipervarijabilnosti predstavlja odličan
molekularni alat, sa kojim je moguće utvrditi razlike na nivou roda, ali i nižih
taksonomskih jedinca.
Analizom uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i Žrnovnice, ustanovili smo
da uzorci dijele isti haplotip (ZRN), što je razumljivo budući da je populacija
mekousne pastve u rijeci Žrnovnici nastala odvajanjem dijela jedinki iz Jadra
prije 25 godina. Haplotip ZRN je prvi genetski marker koji opisuje populaciju
mekousne pastrve iz rijeka Jadro i Žrnovnice.
Populacije iz rijeka Jadro i Žrnovnice međusobno se znatno ne
razlikuju, a manjak polimorfizma u populaciji mekousne pastrve u rijeci
Žrnovnici posljedica je rekolonizacije s populacijom male efektivne veličine.
Analizom mikrosatelitiskih lokusa uočeno je da populacije mekousnih
pastrva iz Jadra i Žrnovnice imaju određen broj zajedničkih alela s potočnom
pastrvom. Analizom su utvrđena tri uzorka mekousne pastrve iz rijeke Jadro,
koja dijele zajedničke alele s potočnom pastrvom. Upravo ti uzorci smatramo
da su hibridi između mekousne i potočne pastrve.
Alele koji su značajni za populacije mekousne pastrve u Jadru i
Žrnovnici pronašli smo u populaciji mekousne pastrve u rijeci Neretvi.
Zajedničke alele kod tih populacija tumačimo kao posljedicu istosmjernih
mutacija, te kao ostatak zajedničkog, davnog polimorfizma.
Analizirajući podvrstu S. o. salonitana, rezultati bazirani na
mitohondrijskoj DNA razlikuju se od onih dobivenih analizom nuklearne DNA.
140
Na osnovu podataka sekvencioniranja od citokroma b i kontrolne regije,
podvrste S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus, znatno se razlikuju, no sa druge
strane S. o. salonitana pokazuje izuzetnu sličnost sa populacijom S. trutta
(jadranske filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. Sa
obzirom na te rezultate S. o. salonitana bila bi smještena sa S. trutta kao
njezina posebna linija.
Sekvencioniranjem gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod uzoraka
mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke Neretve, uočili smo da nema
varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci između njih, odnosno nađena je
100% identičnost nukleotida. Takav konflikt između podataka dobivenih od
mtDNA i nuklearne DNA je ranije zabilježen kod salmonidnih riba, što je
moguće da u ovom slučaju ukazuje na polifiletsko porijeklo podvrste S. o.
salonitana. Smatramo da je podvrsta S. o. salonitana vjerojatno nastala kao
posljedica davne hibridizacije početnog oblika S. o. oxyrhynchus i naprednije
S. trutta, koja je kolonizirala rijeke Jadranskog sliva mnogo kasnije.
141
8. SUMMARY
Endemic soft-muzzled trout (Salmothymus obtusirostris salonitana) inhabit
the Jadro River, near Split. Part of the population has been translocated to the
Žrnovnica River and belongs to the Salmonidae family, genus Salmothymus.
It has a very restricted distribution, so any interference with its habitat has a
negative influence on this small population.
The objective of our work was to find and describe genetic differences
between soft-muzzled trout (S. o. salonitana and S. o. oxyrhynchus) and
brown trout (Salmo trutta). Therefore, we collected samples of three
populations of soft-muzzled trout that inhabit the Adriatic rivers (Jadro,
Žrnovnica and Neretva), and two populations of brown trout (Krka and
Zrmanja).
Because the populations of soft-muzzled trout are very small and are
endangered by many factors, we were able to analyze only a small number of
samples. Hence, we are aware that our conclusions are not statistically
significant, but despite that, the results are interesting and may serve as a
base for new discussions and research. We have compared our results with
literature data from other authors in the phylogenetic tree form.
Hybrids are common in the area where brown and soft-muzzled trout
live together. It is very difficult to recognize them, so in addition to
morphological methods we have also used molecular methods to distinguish
populations.
In comparing morphological characteristics of soft-muzzled trout from
the Jadro River and soft-muzzled trout from the Neretva River (S. o.
oxyrhynchus), we have found many similarities but also many differences.
This is the result of their mutual relationship and also the result of the area
they cover in terms of space and ecological isolation.
We used genetic markers and statistical analysis to define the
population structure of soft-muzzled trout (S. o. salonitana) found in the Jadro
and Žrnovnica Rivers.
Distinction of genetic variability has been done at the DNA level. We
have used two different genetic systems: mitochondrial DNA (one of the most
142
useful tools for molecular-genetic and population studies), and microsatellite
DNA, (which, because of its locus specific hyper variability is an excellent
molecular tool for determining differences at the general level as well as on
smaller taxon units).
In analyzing S. o. salonitana samples from the Jadro and Žrnovnica
Rivers we have learned that those samples share the same haplotype (ZRN).
This is understandable because soft-muzzled trout populations from the
Žrnovnica River are the result of separation from a part of the population from
the Jadro River 25 years ago. Haplotype ZRN is the first genetic marker that
describes the population of soft-muzzled trout population from the Jadro and
Žrnovnica Rivers.
There are no significant differences between the populations of soft-
muzzled trout from the Jadro River and those from the Žrnovnica River. The
lack of polymorphism in soft-muzzled trout populations from the Žrnovnica
River is the result of recolonization with small-sized but effective populations.
By analyzing microsatellite locuses, we have determined the number of
shared alleles between the soft-muzzled trout populations from the Jadro and
Žrnovnica Rivers and the brown trout population. The samples with shared
alleles are the hybrids between the soft-muzzled and the brown trout. We
concluded that the presence of mutual alleles was the result of an crossing
between these two species and of mutual mutation.
The important alleles for soft-muzzled trout populations from the Jadro
and Žrnovnica Rivers have also been found in soft-muzzled trout populations
from the Neretva River. We believe the shared alleles from those populations
result from mutual mutations and from the remains of mutual, ancient
polymorphism.
While analyzing the subspecies S. o. salonitana, the results based on
mitochondrial DNA proved to be different from those obtained from nuclear
DNA.
The results of cytochrome b gene and control region of mtDNA
sequencing showed that there are many differences between the subspecies
S. o. salonitana and S. o. oxyrhynchus. On the other hand, S. o. salonitana
shows great similarity with S. trutta population (Adriatic phylogenetic line)
which as Salmothymus, inhabits the same river.
143
Those results taken into consideration, S. o. salonitana should be
positioned with S. trutta as its special line.
Sequencing (LDH)-C1* gene in the samples from the Jadro and
Neretva Rivers, the analyzed sequence showed no variable spots; moreover,
a 100% nucleotide identity was found.
This data conflict between mtDNA and nuclear DNA was documented
previously with salmonid fishes. It is possible that in this case it reflects the
polyphyletic origin of subspecies S. o. salonitana. We think that the
subspecies S. o. salonitana was the result of an ancient hybridisation of the
initial form of S. o. oxyrhynchus and advanced S. trutta that colonized the
Adriatic rivers much later.
144
9. ŽIVOTOPIS
Tea Odak rođena je 28. 12. 1974. godine u Splitu, gdje je završila osnovnu
i srednju školu. Godine 1993. upisala se na Agronomski fakultet u Zagrebu,
gdje je 2000. obranila diplomski rad.
Od 2000. stalno je zaposlena na Zavodu za ribarstvo, pčelarstvo i
specijalnu zoologiju pri Agronomskom fakultetu, gdje upisuje i poslijediplomski
studij iz Ribarstva.
Kao asistent aktivno sudjeluje u nastavi na predmetima zoologije,
hidroekologije, ihtiologije, ribarstva i lovstva.
Posjetila je mnoge znanstvene institucije u Češkoj, Mađarskoj, Poljskoj,
Sloveniji i Kini, sudjelovala je na stručnim i znanstvenim skupovima.
145
Popis radova:
Odak, T., Treer, T. (2000): Pregled istraživanja vodenih makrofita u
Hrvatskoj. Ribarstvo, 58 (3), 101-109.
Safner R., Treer T., Aničić M., Piria M., Odak T. (2001): Ribolovno-
gospodarska osnova ŠRU ZRD Zagreb. Agronomski fakultet, Zagreb, 38.
Piria, M., Treer, T., Safner, R., Aničić, I. & Odak, T. (2001): Metodika
istraživanja prirodne prehrane slatkovodnih riba. 37. znanstveni skup
Hrvatskih agronoma. Opatija, 19.-23. veljače, 2001. Zbornik sažetaka.
Piria, M., Treer, T., Safner, R., Aničić, I. & Odak, T. (2001): Metodika
istraživanja prirodne prehrane slatkovodnih riba. Ribarstvo, 59 (1), 9-23.
Treer, T., Odak, T., Safner, R., Aničić, I., Piria, M. & Kolak, A. (2001):
Biološka raznolikost u hrvatskom slatkovodnom ribarstvu. HAZU, Biološka
raznolikost u stočarstvu republike Hrvatske, 18.-19. rujna, Zbornik radova,
131-139.
Odak, T., Treer, T., Aničić, I., Safner, R. & Piria, M. (2002): The use of
molecular methods in fisheries. I. Hrvatski kongres za molekularne
bioznanosti uz međunarodno sudjelovanje, 9.-13 June, Opatija, Zbornik
sažetaka.
Odak, T., Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Piria, M. (2002): Primjena
molekularnih metoda u ribarstvu. Ribarstvo, 60 (3), 116-126.
Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Piria, M. & Odak, T. (2002): The introduction
of the fish from the Danube area into the Mediterranean Vransko lake,
Croatia. EIFAC, Symposium on inland fisheries management and the
aquatic environment “The Effect of Fisheries Management on Freshwater
Ecosystems”. Windermere, United Kingdom, 12-15 June.
Debeljak, Lj., Fašaić, K., Odak, T. (2002): Djelovanje vodnih makrofita na
proizvodnju šarana. III. Nacionalno znanstveno-stručno savjetovanje s
međunarodnim sudjelovanjem, 20.-21. lipnja, 2002., Bizovac, Zbornik
sažetaka.
146
Snoj, A., Sušnik, S., Odak, T., Safner, R., Dovč, P. (2003): Phylogenetic
relationship between two subspecies of soft-mouth trout: Salmothymus
obtusirostris oxyrhynchus and S. obtusirostris salonitana. Plant and
genomes XI conference, 11.-15. Siječanj, 2003., San Diego, CA, Zbornik
sažetaka.
Odak, T., Treer, T., Safner, R., Aničić, I., Piria, M. (2003): Mekousna pastrva
(Salmothymus obtusirostris salonitana) u rijeci Žrnovnici. 38. znanstveni
skup Hrvatskih agronoma. Opatija, 19.-21. veljače, 2001., Zbornik
sažetaka.
Treer, T., Varga, B., Safner, R., Aničić, I., Piria, M., Odak, T. (2003): Growth
of the common carp (Cyprinus carpio) introduced into the Mediterranean
Vransko Lake. J. Appl. Ichthyol., 19, 1-5.
Debeljak, Lj., Fašaić. K., Odak, T. (2003): Relations between the
developmnet of submersed macrophytes and carp production in fishponds.
Bulletin VURH Vodnany, 4, 175-180.
Bakota, R., Treer, T., Odak, T., Mrakovčić, M., Čaleta, M. (2003): Struktura i
kondicija ihtiofaune Lonjskog polja. Ribarstvo, 61 (1), 17-26.
Treer T., Aničić I., Safner R., Odak T., Piria M. (2003): Note on the growth of
endemic soft-muzzled trout Salmothymus obtusirostris translocated into a
Dalmatian river. Biologia, Bratislava, Section Zoology, 58 (5): 999-1001.
Treer, T., Aničić, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003): Growth and
condition of endemic trout Salmothymus obutusirostris in a Dalmatian river
Jadro. 4th World Fisheries Conference, Vancouver.
Treer, T., Opačak, A., Aničić, I., Safner, R., Piria, M., Odak, T. (2003): Growth
of bream, Abramis brama, in the Croatian section of the Danube. Czech J.
Anim. Sci., 48 (6), 251-256.
147
10. PRILOG
Prilog 1: Pregled mikrosatelitskih lokusa BFRO001, BFRO002, Ssa197,
Strutta24, Str591INRA, Strutta58, OmyFgt1TUF, SsoSL438 i StMS-LDH4.
Sa zvjezdicom su označeni uzorci na kojima su vršena morfometrijska
istraživanja.
BFRO001 BFRO002 Ssa197 Strutta24 Str591INRA Strutta58 OmyFgt1TUF SsoSL438
StMS-
LDH4
Jadro mekousna
J2 198/198 140/140 141/145 202/202 169/171 147/147 123/125 237/237
J3* 198/198 140/140 141/141 202/202 171/171 147/147 206/206 123/125 237/237
J4 198/198 140/140 141/141 202/202 171/171 147/147 206/206 237/237
J5 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237
J6 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 237/237
J7* 198/198 140/140 145/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123
J8 198/198 145/145 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 125/125 237/237
J9 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 237/237
J10 198/198 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/125 237/237
J11* 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237
J12 198/198 140/140 145/145 202/206 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237
J13 198/214 125/140 141/145 202/202 149/171 147/147 206/206 109/125 237/276
J14 198/198 140/140 145/145 202/202 147/147 206/206 125/125 237/237
J15 198/202 140/140 132/145 192/206 149/171 147/151 206/206 123/123 237/276
J16 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237
J17 198/202 125/140 132/145 202/206 171/171 147/175 206/206 123/123 237/237
J18 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/123 237/237
Žrnovnica mekousna
Ž1 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237
Ž4 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/123 237/237
Ž5 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 123/123 237/237
Ž6 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 111/123 237/237
Ž7 198/198 140/140 141/145 202/202 171/173 147/147 206/206 237/237
Ž9 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/111 237/237
Ž11 198/198 140/140 141/141 202/202 171/173 147/147 206/206 237/237
Ž12 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/125 237/237
Ž13 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237
Ž14 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/111 237/237
Ž15 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237
Ž17 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 123/123 237/237
Ž19 198/198 140/140 145/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237
Ž20 198/198 140/140 141/145 202/206 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237
Ž21 198/198 140/140 141/145 202/202 171/171 147/147 206/206 111/125 237/237
Ž22 198/198 140/140 145/145 202/206 171/171 147/147 206/206 125/125 237/237
Ž23 198/198 140/140 141/141 202/202 171/171 147/147 206/206 111/123 237/237 Krka potočna
K1 214/244 116/116 132/132 180/212 159/159 158/166 226/245 104/106 253/265
148
K2 238/242 116/116 132/154 208/224 159/171 166/168 104/106 253/253
K3 222/246 116/116 137/154 224/224 159/159 166/170 106/109 247/253
K4 222/242 116/116 132/154 212/218 159/183 158/166 218/226 96/106 253/253
K5 222/238 116/116 150/154 212/224 159/159 104/170 226/226 106/114 253/265
K6 242/242 116/116 154/159 224/224 171/183 166/166 226/226 247/253
K7 222/242 116/116 132/154 180/224 159/159 104/158 204/204 106/114 247/265
K8 222/246 116/116 154/211 220/220 183/193 145/166 218/226 106/109 253/265
K11 242/242 116/116 137/154 206/214 159/183 151/166 226/226 106/106 253/265
Krkic 2 222/242 116/116 132/156 214/222 149/159 145/175 104/114 253/253
Krkic 3 222/246 132/215 214/214 159/183 104/166 218/218 98/106 253/265
Zrmanja potočna
Zrm1 226/256 116/116 137/163 200/214 189/189 187/187 241/241 104/104 247/265
Zrm2 230/258 116/116 159/171 200/214 189/189 181/181 241/241 104/104 247/265
Zrm4 226/230 116/116 159/167 200/200 189/189 245/245 104/104 247/265
Zrm6 226/242 116/116 159/163 200/200 189/189 241/245 104/104 247/265
Neretva mekousna
MP3 206/206 131/131 155/175 176/176 171/171 93/93 206/206 116/120 237/237
MP6 206/206 135/135 175/179 176/176 159/171 91/95 206/206 116/120 237/245
MP8 206/206 133/137 159/179 176/196 171/173 206/206 118/120 245/245
MP9 206/206 133/137 145/175 176/176 159/171 91/93 206/206 116/120 237/245
MP12 206/206 131/133 175/183 176/176 171/171 93/93 206/206 237/237
MP13 206/206 135/135 179/183 172/178 171/171 93/93 206/206 111/116 237/245