Molekulinės Biologijos Metodai

1MOLEKULINS MOLEKULINS

BIOLOGIJOS BIOLOGIJOS

METODAIMETODAI

Makromolekuli iskyrimas, iriavimas ir

kiekio nustatymas. Blotingai. Proteomika.

Makromolekuli sudties tyrimas. DNR

sekvenavimas, Genotipavimas, DNR

klonavimas, Gen ininerija, PGR,

Mikrogardels, Metabolomika, Masi

spektrometrija, etc.

1 1 dalisdalis

Makromolekuli Makromolekuli iskyrimas, iriavimas ir iskyrimas, iriavimas ir

kiekio nustatymas.kiekio nustatymas.Blottings. Proteomika

2Paruoimasir

iskyrimas

Elektro-

forez

Irykinimas, aptikimas ir

kiekio nustatymas

Rekombinacija Kita

DNR armin liz

AgarozsAgarozsgeliogelio(retai (retai ----PAGE)PAGE)

PGRPGR+

Southern Southern analizanaliz

Restrikcijos fermentai,

Plazmids

SekvenavimasSekvenavimas((sekoskaitasekoskaita))

RNR armin liz

AgarozsAgarozsgeliogelio(retai (retai ----PAGE)PAGE)

NorthernNorthernanalizanaliz,

AtvAtv..trtr..--PGRPGR

Nereikia skaldyti Rnazmis RNR pakankamai

maos .Baltymai ChromatoChromato--

grafijagrafijaNDSNDS--PAGEPAGE

WesternWesternanalizanaliz,

ImunopreciImunopreci--pitacijapitacija

.NeatliekamaNeatliekama .

Tiriama mediaga

Sekvenavimas(sekoskaita)

Aminor. sekos nustatymas

+ MASI SPEKTROMETRIJA+ MASI SPEKTROMETRIJA

Biologini makromolekuli iskyrimo metodai

I. CHROMATOGRAFIJAI. CHROMATOGRAFIJA

II. ELEKTROFOREZ (+GELIO ANALIZ)II. ELEKTROFOREZ (+GELIO ANALIZ)

1. Baltym elektroforez1. Baltym elektroforez

3. Nukleorgi elektroforez3. Nukleorgi elektroforez

2.2. WesternWestern geli analizgeli analiz

4. 4. Southern Southern ir ir NorthernNorthern geli analizsgeli analizs

MGINIO MGINIO IIGAVIMASGAVIMAS

I.BALTYM ISKYRIMAS

3Chromatografijahttp://en.wikipedia.org/wiki/Ion_exchange_chromatography

http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC

http://en.wikipedia.org/wiki/Size_exclusion_chromatography

http://en.wikipedia.org/wiki/Affinity_chromatography

Pagrindinis baltym iskyrimo metodasPagrindinis baltym iskyrimo metodas..Ir mokslas, ir menas.Ir mokslas, ir menas.Iskiriant baltymus iuo metodu, j denatruoti daniausiai neprIskiriant baltymus iuo metodu, j denatruoti daniausiai neprireikia.ireikia.

Pagr. chromatografijos rys (vamzdelins chromatografijos rys):1. Jon main2. Gelfiltracijos3. Afinin4. Hidrofobins sveikos

Procedra/principasProcedra/principasTirpalas, kuriame yra norim tirti baltym (anglangl. . targettarget proteinsproteins), leidiamas pro vamzdelvamzdel, kuriame yra speciali matrica, sukurta baltymams sugauti arba j judjimui sultinti dl skirting baltym savybi (dydio, el.krvio, sudties).

1 Jon main chromatografija (baltym atranka pagal el. krv)

Baltymo molekuls leidiamos per prieingu el. krviu pakraut vamzdel

(kation/anion main vamzdel), kuris turi sulfonuot (e.g. SO3H, COOH, PO4) ar amonio (e.g. NH4 jei norima sudaryti teigiam krv) liekan.

Pagrindiniai jon main chromatografijos etapai:

1. Vamzdelio paruoimas: reikiamo pH buferis. Tam reikia inoti norimo

iskirti baltymo savybes (krv, izoelektrin tak).

2. Baltym (arba peptid, aminor.) tirpalo supylimas. Ne visos molekuls

ilieka vamzdelyje.

3. Isdymas: tirpalo drusk koncentracijos didinimas prie vamzdelio sieneli

prilipusi baltym iplovimui. Druskingas tirpalas, leidiamas vamzdeliu,

lemia baltym pakeitim druskomis, kadangi vamzdelio sienels labiau

linkusios jungtis su druskomis nei su baltymais. Geriausia yra laipsnikai

didinti drusk koncentracij, kad skirtingo krvio (taigi ir skirtingus) reikiamus

baltymus igauti atskirai. Galiausiai drusk koncentracija padidinama staigiai

ir smarkiai, iki 2-3 mol/L. Taip iplaunami visi, jei dar buvo lik, baltymai.

4. Drusk paalinimas (dializ).

Temperatra neturi didels takos jon main chromatografijos etap eigai,

taiau geriau yra dirbti su nedidele temperatra, kad baltymai bt stabilesni.

2 Gelfiltracijos chromatografija (baltym atranka pagal dyd)

1.1. Vamzdelis pripildomas Vamzdelis pripildomas labai smulkias poras labai smulkias poras turini ma turini ma rutuliukrutuliuk..Susidaro renginys, kurio Susidaro renginys, kurio veikimas panaus veikimas panaus kotuvo, kotuvo, taiau...prieingas.taiau...prieingas.

4Supylus i Supylus i

viraus viraus

vamzdel su vamzdel su

rutuliukais rutuliukais

skirting baltym skirting baltym

tirpal, maos tirpal, maos

molekuls molekuls

patenka patenka

rutuliuk poras, rutuliuk poras,

o didels netelpa o didels netelpa

ir iplaunamos ir iplaunamos

pro tarpus tarp pro tarpus tarp

rutuliuk rutuliuk

greiiau.greiiau.

3 Afinin chromatografija

Pats efektyviausias baltym atskyrimo metodas (vienu

ingsniu miinio grynumas padidinamas iki 1000 kart),

pagrstas dideliu biologinio tiriamo baltymo specifikumu, pvz.:

fermento substratui, antikno antigenui, receptoriaus ligandui.

Metodas remiasi tirpale esani baltym gebjimu jungtis prie

celiuliozj ar poliakrilamide montuoto ligando maos

specifins biomolekuls.

Taigi tik tiriamas baltymas isilaiko vamzdelyje.

Paskui jo molekuls ikraptomos praplaunant vamzdel tirpalu,

kuriame yra didel ligandoligando koncentracija.

Vide Vide

4 Hidrofobins sveikos chromatografija(baltym atranka pagal hidrofobines j savybes)

Hidrofobins baltym vietos jungiasi su tam tikromis

vamzdelio ar jo turinio vietomis.

Tirpale esanti didel amonio sulfato [(NH4)2SO4] koncentracija

stabilizuoja baltymus, o taip pat padidina j hidrofobins

sveikos su vamzdelio agarozs matrikso fenilo (C6H5)

grupmis tikimyb.

Toks jungimasis vyksta tik esant didelei drusk koncentracijai,

tad skirting baltym jungimasis kontroliuojamas keiiant pro

vamzdel pilamo tirpalo drusk koncentracij, arba pro

vamzdel leidiam tirpal praskiediant.

5Kt. chromatografijos rys (smulkesnms nei baltymai molekulms tirti):

adsorbcijos (stationary phase nonspecific absorbent, such as silica gel, porous polymers, or charcoal)duj (sample, dissolved in a solvent, is vaporized and carried by the innert gas through a column packed with sorbent)didelio skysio slgio (kartu su adsorbcijos, gelfiltracijos, jon main ar kt.)popieriausplono sluoksniosluoksnin (skystis skystis)

Kokybins (nenustato kiekio).Naudoja kapiliar princip

Dujskysio (maoms molekulms, daugiausia chemijoje, nes didels degraduoja auktoje T, kurios reikia iam metodui)

1. Baltym elektroforez ir gelio 1. Baltym elektroforez ir gelio ((WesternWestern) analiz) analiz

II. Elektroforez ir geli analiz

NNDSDS--PAGEPAGENDS-PAGE (SDS-PAGE) tinkama maesnms nei DNR molekuls sijoti.

NDS-PAGE reikia NNatrio DDodecyl (lauril) SSulfato-PPoliAAkrilamido GGelio EElelekktrotroforezforez.

NDS yra ploviklis (jo yra ampne, muile, dant pastoje, ...). Jis reikalingas baltymams

denatruoti ir suteikti vienod krv prie leidim per gel. NDS turi hidrofobin

uodeg, kuria ir jungiasi prie baltymo: kuo daugiau baltyme a.r., tuo daugiau NDS

molekuli prilips prie jo. Kadangi kiekviena NDS molekul turi dvigub neigiam krv,

bet koks baltymas tampa labai neigiamas.

PAGE atskiria baltymo molekules pagal dydpagal dyd. PAG yra panaus daugiasluoksn

tinkl, kuriame ir stringa link anodoanodo migruojanios molekuls.

Po kurio laiko pasiskirsiusios molekuls upilamos 25% acto rgties vandeninio

tirpalu: taip baltymai fiksuojami gelyje ir ilaikomi denatruoti. Po to jie perkeliami,

daomi, rykinami, tiriama j aminorgi seka, ir pan.

NDS-PAGE naudojama:

Baltymo dydiui nustatytiBaltymui identifikuotiMginio grynumui (purity) vertintiDisulfidiniams ryiams aptiktiBaltym kiekiui vertintiWestern blotting (Western analizs) paruoimui

6Pieno svarbaPieno svarba

Kadangi antiknai taip pat yra baltymai, jie irgi link lipti prie popieriaus.... Tad prie upilant pirmo antikno, reikia j panardinti Carnationlies pien.

Western blotting (Western analiz)Western analiz iskiria vien norim baltym i baltym miinio

naudojant specifin antigen. Metodas leidia nustatyti, kiek tiriamo

baltymo yra tam tikru momentu, taiau neleidia sprsti apie to baltymo

sintezs greit, ir jis netinka, kai baltymas labai greitai suyra (abiem

atvejais reikt atlikti imunoprecipitacijimunoprecipitacij).).

1. Baltym iskyrimas pagal dyd 1. Baltym iskyrimas pagal dyd NDSNDSPAGE.PAGE.

2. Ant PAG udjus 2. Ant PAG udjus nitroceliuliozsnitroceliuliozs membran, baltymai ant jos membran, baltymai ant jos perkeliami naudojant elektroforez. Nitroceliuliozs membranos perkeliami naudojant elektroforez. Nitroceliuliozs membranos pusje turi bti teigiamas krvis, o gelyje yra neigiamas, tad pusje turi bti teigiamas krvis, o gelyje yra neigiamas, tad neigiamai krauti baltymai migruoja ant membranos.neigiamai krauti baltymai migruoja ant membranos.pH turi bti maas, tarp nitroceliuliozs ir gelio neturi susidaryti oro burbuliuk.

3. Upilti pirminio antikno ant membranos (susidaro baltymo3. Upilti pirminio antikno ant membranos (susidaro baltymoantikno kompleksas).antikno kompleksas).

4. Upilti antrinio (pirminiam) antikno. is antiknas turi bt4. Upilti antrinio (pirminiam) antikno. is antiknas turi bti i prisijungs ferment, kuris padeda irykinti vis kompleks.prisijungs ferment, kuris padeda irykinti vis kompleks.

5. Tam, kad pamatytume, kiek ferment yra ant membranos, ant 5. Tam, kad pamatytume, kiek ferment yra ant membranos, ant jos dar reikia upilti tam fermentui veikti btino miinio su jojos dar reikia upilti tam fermentui veikti btino miinio su jospecifiniu substratu.specifiniu substratu.

6. Rentgenografikai (udedant speciali plvel) irykinama 6. Rentgenografikai (udedant speciali plvel) irykinama reakcija. Ji vyksta apie valand, matoma kaip viesa.reakcija. Ji vyksta apie valand, matoma kaip viesa.

7. Atliekama nuotraukos densitometrija.7. Atliekama nuotraukos densitometrija.

Antrinis antiknas gali bti ymimas ne fermentu, bet vytinia mediaga.

Kartais, kai reikia didelio jautrumo, pvz., tiriant labai maas baltym koncentracijas, naudojamas tretinis antiknas, turintis ferment, atskeliant Pi nuo H3PO4 arminje terpje.

8AKF I/D PGR

Magistrant molekulins biologijos laboratoriniai darbaiMagistrant molekulins biologijos laboratoriniai darbai

I dalis I dalis Organ ir audini preparavimas, isaugojimas ir paruoimas tyriOrgan ir audini preparavimas, isaugojimas ir paruoimas tyrimui (2 val.) mui (2 val.)

Eutanazija natrio pentobarbitaliu, raumen disekcija, stimuliavimas spec. vonelje registruojant jg, galingum ir pan., ualdymas skystame azote.

II dalis II dalis Baltym ekstrakcija ir igryninimas, baltym tirpalo paruoimasBaltym ekstrakcija ir igryninimas, baltym tirpalo paruoimas (4 val.)(4 val.)

Ultrahomogenizavimas, ekstrakcija tirpalais, centrifugavimas, baltym kiekio matavimas spektrofotometru, denatravimas NDS

III dalis III dalis Konkrei baltym kiekio matavimasKonkrei baltym kiekio matavimas Western blot Western blot analize (2 x 4 val.)analize (2 x 4 val.)

a} Geli pagaminimas, elektroforezs aparato ir elektroforezs tirpalo paruoimas, elektroforezs atlikimas, baltym pernaa ant membranos, membranos blokavimas pieno tirpalo milteliais, membranos merkimas tirpal su pirminiu antiknu bent pernakt.

b} Membranos merkimas tirpal su antriniu antiknu su fermentu, membrana pervieiama Rentgeno spinduliais, irykinama juosta, aptariami gauti skirting baltym kiekio (koncentracijos) tyrimo rezultatai.

2. Nukleorgi (DNR ir RNR) 2. Nukleorgi (DNR ir RNR) iskyrimas iriskyrimas ir elektroforezelektroforez


9Distiliuotas vanduo, vairs buferiniai tirpalai, NaOHNaOH

vairus maiymas, centrifugavimas

Fermentai (lizocimas,...)

Temperatra (kartis, altis (+liquid nitrogen))

Detergentai, denatratoriai (NDSNDS, etanolis, ...)

Nukleorgi (DNR ir RNR) iskyrimasNukleorgi (DNR ir RNR) iskyrimas

Labai vairiai atliekama Labai vairiai atliekama

procedra: priklauso nuo procedra: priklauso nuo

organizmo, jo audinio, organizmo, jo audinio,

reikiamo NR kiekio, ,

norimo iskyrimo greiio, norimo iskyrimo greiio,

laboratorijos, tyrjolaboratorijos, tyrjo

Automatizuoti DNR ekstrakcijos metodai

NR gryninimo automatin sistema QiuckGene-81.

10

NR gryninimo su QiuckGene-810 schema.

NR gryninimo, amplifikacijos ir nukleotid sekos analizs automatin sistema COBAS COBAS AmpliPrepAmpliPrep

Southern ir Northern analiz


11

io dao molekul siterpia tarp dvigrands DNR bazi, DNR spiral isiveja dl prisijungusio dao sukeliamos tampos. iedin DNR, kuri negali taip smarkiai deformuotis, prijungia maiauetidium-bromido ir nusidao ne taip rykiai.

Etidium-bromidas gali lengvai patekti mogaus lsteles, ir kadangi mogaus DNR yra linijin, ji smarkiai isivynioja jungdamasi su iuo dau. Todl su ia mediaga reikia dirbti labai atsargiai.

Agarozs gelio elektroforez

DNR molekul sukarpius RE fragmentus, jie atskiriami pagal dyd agarozs gelio

elektroforeze. RNR skaidyti nereikia.

AgarozsAgarozs gelis yra polisacharid gelis yra polisacharid matriksasmatriksas, sugaunantis juo dl elektrinio lauko

veikimo link anodo migruojanias molekules (poli- ar oligo-nukleotidus),

DNR fosfato molekuls turi stipr neigiam krv, tad migruoja link anodo. Paskui DNR

fragmentai irykinami, pvz, Etidium-bromidu ir paskui sekania xx--RayRay...

Edward M. Southern,Edinburgh Universitetas,1970-1980 m.

Southern analiz skirta nustatyti tam tikr DNR sek miinyje, pvz., surasti tam tikr gen (pvz., sukeliant lig, klonuot) genome.Optimaliomis slygomis galima aptikti ir tok maa kiek kaip 0,1 pg iekomos DNR.

Southern analiz (Southern blotting)

ATPATP ymjimasymjimas 3232PPPaveik us dsDNR, kur i norime p adaryt i yminija, n edideliu kiek iu DNazs, ike rpam i dvigra nds DN R fragm enta i.

dedama 32P, dATP ir kit dNTP, taip pat DN R po lim erazs I, tu rinios 5 3 p olimerazinio ir 5 3 egzonuk leazin io aktyv umo.

segus

Nick translation occurs a nd as the nick is tra nslate d down the DN A stra nd, th e po lymer ase activity co ntinues to nick wh ile th e exo nucle ase activity cont inues to fil l in t he nick. As this ha ppe ns, 32P becomes inco rpo rated into, a nd thus labe ls, the DN A. Heat th e DNA t o mak e it sing le stra nde d, the n imm ediately place it on ice to keep the two stra nds from re annealing to each ot her. (If the DN A is o n ice, th e DNA p asses through the anne aling tem per atur e too quickly fo r the DN A to rehy bridize int o do uble-stra nde d DNA.)

1. DNR sukarpoma specialiomis RE. 2. DNR fragmentai leidiami per agarozs gel.3. a) DNR denatruojama (bdama vis dar ant gelioant gelio), pvz., 0,5 mol/L NaOH, kuris

suskaido dsDNR iki ssDNR: tik ssDNR gali bti perneama ant membranos.b) Neprivalomas purino alinimo etapas. Atliekamas, jei DNR fragmentai yra didesni kaip 15 kb(p). 0,2 mol/L HCl per 15 min paalina purinus (A ir G). Taiau HCl reikia naudoti atsargiai, nes per mai fragmentai taip pat neperneami.Po io etapo neumirti normalizuoti tirpalo pH.

4. ssDNR pernaa ant nitroceliuliozs ar nailonins (dar smarkiau rianios ssDNR) membranos. Pernaa utikrinama kapiliar (kempins) poveikiu, buferiui keliaujant per gel ant membranos, kuri suria ssDNR. Procesas trunka kelias valandas. Kartais vietoj kapiliarinio poveikio pritaikomas greitesnis (procedra trunka apie 1 val.) vakuuminis. Po ssDNR pernaos ant membranos ji paveikiama UV, kad ssDNR kovalentikai susijungt su membrana. Taip pat galima nitroceliulioz kaitinti 80C temperatroje kelias valandas, taiau reikia bti atsargiems ji labai degi (kitaip dar vadinama piropiroksilinu).

5. Membranos paveikimas ymta ssDNR hibridizacija. ymta ssDNR komplementariai jungiasi su tiriama ssDNR. ymima daniausiai 32P paymtu ATP, biotinu/streptavidinu, arba bioluminescencine yme. Prie hibridizacij reikia atlikti priehibridizacij dti nespecifins ssDNR (daniausiai tam naudojama lai spermatozoid DNR), kad bt ublokuojamos nespecifins membranos vietos ir ymta ssDNR neprilipt bet kurioj membranos vietoj. Hibridizuojant naudojamas tas pats buferis, taiau j dar pridedama ymtos ssDNR.

6. ymtos ssDNR irykinimas. Jei buvo naudota 32P ym (daniausiai), irykinama atliekant rentgenografij; jei ymta buvo biotinu/streptavidinu, atpainimui taikoma kolorimetrija; o bioluminescencija matoma kaip vytjimas.

Southern analiz

12

SouthernSouthern blottingublottingu

nustatomas tam tikr nukleotid sek (gen) buvimas ir kiekis.

13

Northern analiz (Northern blotting)

E. Southern sukurt DNR sekos radimo metod pavadinus jo vardu.

Tie, kurie tyr RNR sek, ironizuodami pavadino j Northern analize

(kartais gal iek tiek sunkiai suprantamo mokslinink jumoras...).

Metodas taip pat vadinamas Northern hibridizacija arba RNR

hibridizacija.Metodo esm ta pati kaip Southern analizs, tik tiriama ne DNR, o RNR.

Agarozs gelis RNR itiesina (padaro linijin).

RNR (transkripto) buvimas ir jos kiekis parodo, kaip intensyviai tuo tuo

metu ir toje vietojemetu ir toje vietoje nuraoma tiriama genetin informacija.

Nukleorgi (ypa DNR) tyrimo metodais plaiai naudojamasi

ne tik mokslinse, bet ir teismo medicinos laboratorijose.

Pakrautos nailono membranos panaudojimas Northern analizs metu

Documents

Molekulinės Biologijos Metodai