ENSAYO DE MTT: VIABILIDAD CELULAR- Añadir solución de MTT (5mg/mL) en una cantidad igual al 10% de volumen

del cultivo celular.- Incubar por un tiempo de 1 a 4 horas a temperatura apropiada para el tipo

de línea celular. a) En caso de que las células se adhieran firmemente a la superficie

del recipiente de cultivo, se retira el medio de cultivo y se añade la misma cantidad pero de isopropanol acético

b) En caso de que las células estén libres en el recipiente del cultivo celular, se añade directamente isopropanol acético en una cantidad igual al del volumen de cultivo original

- Dentro de una hora (todos los cristales deben de disolverse, si no, se debe de reducir el tiempo de incubación con MTT) después de la adición de isopropanol acético se leerá la absorbancia a 570 nm y se resta la absorbancia del background tomada a 690 nm.

MOSMAN 1983: ENSAYO DE MTT

- El MTT se disuelve en PBS 5 mg/mL y se filtra para esterilizar y remover las pequeñas cantidades de residuos insolubles.

- La solución stock de MTT (10 µl por 100 µl de medio) se añade a todos los pocillos de la placa, y las placas se incuban a 37°C por 4 horas.

- Se añade ácido isopropanol (100 µl de 0.04 N HCl en isopropanol) en cada pocillo y se mezclan bien hasta disolver los cristales azul oscuro

- Pasados unos minutos, en una habitación a temperatura ambiente, se verifica que los cristales se hayan disuelto, posteriormente las placas se leyeron en un lector de Micro Elisa, utilizando una longitud de onda de 570 nm, y una longitud de onda de referencia de 630 nm y con una calibración de 1.99 ( o 1.00 si las muestras fueron fuertemente coloreadas)

CONTEO CELULAR CON CAMARA DE NEUBAUERCreated by E. Ramsay, 1998. Last printed 22.10.03 Filename-

HEMOCYTEl hemocitometro es una manera accesible y económica para el conteo de células. El hemocitometro es prácticamente un portaobjetos de microscopio que consiste en una cámara plana. El cubreobjetos que se coloca en la superficie de la cámara determina su profundidad. Un volumen conocido de la suspensión homogénea de las células se introduce en la cámara mediante la acción de la capilaridad.

Posterior el microscopio se centra en un área de la cuadricula definida de dimensión de 1 mm2 y se procede a contar el número de células en el área de conteo.

Para lograr un conteo celular preciso es necesario que las células suspendidas estén homogéneas y no se encuentren en agregados celulares. También es importante que al momento de transportar las células de la punta Gilson a la cámara se haga de manera rápida, debido a que en la punta las células se pueden adherir.

El número ideal de células debe de estar entre 100 a 300/mm2 con el fin de proporcionar un grado razonable de precisión. Cuanto mayor es el número de células, mejor.

El conteo de ambas cámaras debe tomarse y se realiza un promedio de lo calculado. El número de células se calcula utilizando la formula siguiente.

c=n/v

Dónde:

c: concentración celular ( células/ mL)n: número de células contadasv: volumen contado (mL)

Empleando la cámara de Neubauer, que tiene una profundiad de 0.1 mm. Por lo tanto la zona de recuento de 1 mm2 nos da un volumen de 0.1 mm3 (o 10-4cm3). Reorganizando la formula anterior con esta nueva información, la ecuación nos queda asi:

c= n x 104

Por lo tanto si se tiene un número de células medio (n) de 200, la concentración celular será de 200 x 104 que equivale a 2.000.000 de células/mL. Para calcular el número total de células presentes, simplemente basta con multiplicar “c” por el volumen original de células en suspensión.

Materiales

- Cámara de Neubauer y cubre objetos - Tripsina- EDTA 1x - PBS libre de Ca y Mg- Medio de cultivo ( DMEM/10% FBS)- Tubos de centrifuga de 15 ml- 20 µl de gilsen - Puntillas amarillas esteriles - Contador

Método

1. Limpiar la cama de Neubauer con alcohol al 70%2. Limpiar el cubreobjetos (cubre hematimetro )3. Humedecer los bordes del cubreobjetos 4. Suave, pero firme colocar el cubreobjetos sobre el área de conteo de la

cámara 5. Cuando se visualice la apariencia de anillos de arcoíris (como cuando el

aceite se intenta mezclar con el aceite) indica que el cubreobjetos se ha sellado herméticamente y asegurado la profundidad de 0.1 mm

6. Tipsinisar una monocapa de células de interés como se describe previamente

7. Desde la suspensión homogénea de células se extrae una alícuota de 10µl8. Inmediatamente transferir la alícuota a la cámara de Nuebauer 9. Coloque la punta de la pipeta a la orilla en un lado de la cámara de

Neubauer 10.Por la acción de la capilaridad, el líquido irá entrando debajo del

cubreobjetos 11.El líquido debe correr solamente a los bordes de las ranuras 12.Repetir los pasos del 7-11 en el otro lado de la cámara 13.Ahora tenemos el volumen total de 20 µl de suspensión celular, 10 µl por

cada una de las rejillas 14. Retirar cualquier exceso de líquido de la superficie, sin retirar liquido de

debajo del cubreobjetos15. Observar en el microscopio con el objetivo de 10X16. Esto debería permitir que el área de conteo ocupe la totalidad del campo

de visión 17. La zona de 1 mm2 es el área más grande y se puede identificar debido a

que esta bordeada por tres líneas paralelas 18. Se debe de asegurar que exista una distribución igual de células entre las

dos cámaras 19.Se debe comprobar que no existan grandes grupos de células, esto causa

errores en el conteo20.Contar las células que están dentro del área, también deben incluirse las

células que están en la parte superior izquierda y las que tocan la línea media del cuadro, pero no se deben considerar las que están en la parte inferior derecha

21.Repita el procedimiento para la segunda cámara 22.Se realiza el promedio de las dos cámaras 23.Calcular las células/ml y el número total de células con las ecuaciones

correspondientes