ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_______________________

Trần Thanh Hà

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỘC CHI POLYGONUM, HỌ RAU RĂM (POLYGONACEAE)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2016

Công trình được hoàn thành tại: khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu.

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Đậu

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án

tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

vào hồi giờ ngày tháng năm 20...

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề

Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước và con người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Hệ thực vật ở Việt Nam ước tính có khoảng 13.000 loài với khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Tính đến nay đã có hơn 3800 loài thực vật bậc cao và bậc thấp được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền nhằm kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm nhiễm, chống ung thư, điều hòa miễn dịch, chữa các bệnh liên quan đến tim mạch, diệt côn trùng.

Chi Polygonum (họ rau Răm, Polygonaceae) có khoảng 230 loài phân bố chủ yếu ở phía bắc bán cầu trong đó có Việt Nam. Nhiều loài trong chi này được sử dụng trong y học dân gian với công dụng kháng viêm, lưu thông máu, chữa lỵ, lợi tiểu. Theo các nghiên cứu đã công bố thành phần hóa học của các loài thuộc chi Polygonum bao gồm flavonoid, anthraquinon, coumarin, lignan, napthaquinon, polyphenol, tecpenoid với nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý như chống khối u, chống oxy hóa, chống viêm, chống HIV, chống suy giảm miễn dịch và chống côn trùng.

Cả ba loài cây thuộc chi Polygonum là cây mễ tử liễu (Polygonum plebeium R. Br.), cây thồm lồm gai (Polygonum perfoliatum L.), cây nghể trắng (Polygonum barbatum L.) tuy đã được nghiên cứu trên thế giới nhưng ở Việt Nam hầu như chưa có công bố nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài cây này tại Việt Nam, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần sáng tỏ công dụng chữa bệnh của các dược liệu này, chúng tôi lựa chọn đề tài:: “Nghiên cứu thành phần hóa học một số loài cây thuộc chi Polygonum, họ Rau răm (Polygonaceae)”.

2. Đối tượng nghiên cứu của luận án

Đối tượng nghiên cứu của luận án cụ thể là cây Polygonum perfoliatum L. (thồm lồm gai), Polygonum barbatum L. (nghể trắng), Polygonum plebeium R.Br. (mễ tử liễu, rau đắng),.

3. Những đóng góp mới của luận án

3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thồm lồm gai (P. perfoliatum L.), nghể trắng (P. barbatum L.) và mễ tử liễu (P. plebeium R.Br.) ở Việt nam. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với các phương pháp quang phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 24 hợp chất từ thân rễ cây thồm lồm gai, 17 hợp chất từ thân rễ cây nghể trắng, 20 hợp chất từ toàn cây mễ tử liễu. Trong đó, có hai hợp chất thuộc lớp chất sphingoglycolipid lần đầu tiên được công bố trong tài liệu khoa học, 9 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Polygonum, 12 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P. perfoliatum L., 15 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P. barbatum L., 12 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P. plebeium R.Br. 3.2. Đã đánh giá hoạt tính độc tế bào của 11 cặn chiết (etanol, metanol, nước) từ các bộ phận khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu trên 5 dòng tế bào ung thư: khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela). Kết quả cho thấy cả 11 mẫu cặn chiết đều cho tác dụng độc tế bào với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL. 3.3. Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH, ABTS của ba mẫu: cặn chiết etanol 90% thân rễ P. perfoliatum L., cặn chiết etanol 90% thân rễ P. barbatum L., cặn chiết etanol 90% toàn cây P. plebeium R.Br. Trong đó, cặn chiết etanol 90% thân rễ P. barbatum L. cho tác dụng loại gốc DPPH cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml.

2

3.4. Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH của 14 hợp chất tinh khiết được chọn lọc từ các hợp chất phân lập. Kết quả cho thấy 5 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ, chống tác nhân oxi hóa DPPH tốt là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1), acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic (TLE5), ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3), isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6), quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2) với giá trị EC50 <128 µg/ml. Trong số 5 chất có hoạt tính, hợp chất TLE1.1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ EC50 =3,2 (µg/ml), mạnh hơn rất nhiều so với chất đối chứng là quercetin EC50 =10,82 (µg/ml).

4. Bố cục của luận án

Luận án gồm: 196 trang chưa kể 5 phụ lục, trong đó có 8 bảng số liệu, 10 sơ đồ, 13 hình vẽ, 166 tài liệu tham khảo. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang); Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (7 trang); Chương 3: Thực nghiệm (54 trang); Chương 4: Kết quả và Thảo luận (80 trang); Kết luận (4 trang); Các công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (15 trang); Phụ lục (90 trang).

II. NỘI DUNG LUẬN ÁN

MỞ ĐẦU

Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.

Chương 1: TỔNG QUAN

Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:

- Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của chi Polygonum;

- Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Polygonum;

- Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Polygonum;

- Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của ba loài thồm lồm gai (P. perfoliatum L.), nghể trắng (P. barbatum L.) và mễ tử liễu (P. plebeium R.Br.)

Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Sử dụng các phương pháp chiết lỏng-rắn và lỏng- lỏng để chiết xuất các chất ra khỏi nguyên liệu thực vật và phân đoạn các lớp chất có độ phân cực khác nhau.

2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH

Sử dụng chủ yếu phương pháp sắc ký như lớp mỏng để phân tích các phần chiết, kiểm tra độ tinh khiết của các chất; Sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau để phân lập các chất. Bên cạnh đó luận án cũng sử dụng phương pháp kết tinh lại tách và làm sạch các chất.

2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý: điểm chảy, năng suất quay cực và các phương pháp phổ: phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1DNMR): 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT, và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY.

2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.4.1. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro

3

Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính của các cặn chiết trên 5 dòng tế bào ung thư: khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela).

2.4.2. Thử tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của ba mẫu cặn chiết cồn 90% của các đối tượng theo phương pháp quét gốc DPPH, định lượng ABTS+.. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của 14 hợp chất tinh khiết phân lập được theo phương pháp quét gốc DPPH

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis, Excel và phần mềm thống kê GraphPad Prism 6.0 phù hợp tùy theo mỗi phép thử để có kết quả chính xác, đáng tin cậy.

Chương 3: THỰC NGHIỆM

3.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

3.1.1. Thiết bị

Phần này trình bày cụ thể về các thiết bị được sử dụng trong luận án với chỉ tiêu kỹ thuật và địa chỉ thực hiện .

3.1.2. Hóa chất

Phần này trình bày cụ thể các hóa chất được sử dụng trong luận án về xuất xứ, nguồn gốc, mục đích.

3.2. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Phần này trình bày cụ thể về nơi thu mẫu, người thu, giám định tên khoa học, nơi lưu mẫu tiêu bản của mẫu nguyên liệu thực vật được sử dụng trong luận án

3.3. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT

Phần này trình bày cụ thể cách tiến hành định tính nhóm chất từ các đối tượng nghiên cứu bằng phản ứng hóa học

3.4. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu dùng để điều chế các phần chiết là thân rễ của cây thồm lồm gai (P. perfoliatum L.), thân rễ của cây nghể trắng (P. barbatum L.), toàn bộ cây mễ tử liễu (P. plebeium R.Br) được sấy khô ở 50oC, sau đó xay thành bột.

3.4.2. Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật

2,5 kg nguyên liệu được ngâm với cồn 90% ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 4 ngày). Các dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng. Cặn chiết này được phân bố lại lần lượt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat, n-butanol; cất loại hết dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cặn chiết tương ứng n-hexan, etyl axetat, n-butanol. Cất kiệt dịch nước còn lại dưới áp suất giảm ở 80°C cho phần chiết nước.

3.5. PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

Phần này trình bày phân tích các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n-butanol của ba đối tượng nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng nhằm định hướng cho quá trình phân lập các chất.

4

3.6. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHẦN CHIẾT

Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n-butanol của ba đối tượng nghiên cứu.

3.6.1. Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai

3.6.1.1. Phân tách phần chiết n-hexan (TLH)

Phần chiết n-hexan (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 100/1, 20/1, 10/1, 9/1, 4/1, 3/1 và 2/1 (v/v).

3.6.1.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (TLE)

Phần chiết etyl axetat (TLE) (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 100/1, 20/1, 15/1, 10/1, 4/1 và 2/1 (v/v).

3.6.1.3. Phân tách phần chiết n-butanol (TLB)

Phần chiết chiết n-butanol (50 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với điclometan và hệ dung môi gradient gradient điclometan/metanol/nước với tỷ lệ 9/1/0,1 và 3/1/0,1 (v/v).

3.6.2. Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng

3.6.2.1. Phân tách phần chiết n-hexan (NTH)

Phần chiết n-hexan (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 20/1, 10/1, 8/1, 5/1, 3/1 và 1/1 (v/v)

3.6.2.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (NTE)

Phần chiết etyl axetat (NTE) (50 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 20/1, 9/1, 8/1, 5/1, (v/v)

3.6.2.3. Phân tách phần chiết n-butanol (NTB)

Phần chiết n-butanol (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với hệ dung môi gradient điclometan/metanol/H2O với các tỷ lệ (9/1/0,1; 6/1/0,1; 3/1/0,1; v/v; 1/1/0,1

3.6.3. Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu

3.6.3.1. Phân tách phần chiết n-hexan (MTH)

Phần chiết n-hexan (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 99/1, 20/1, 9/1, 7/1, 5/1, 3/1 và 2/1 (v/v)

3.6.3.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (MTE)

Phần chiết etyl axetat (MTE) (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 99/1, 9/1, 8/1, 5/1, 1/1 (v/v)

3.6.3.3. Phân tách phần chiết n-butanol (MTB)

5

Phần chiết n- butanol (MTB) (40 g) được phân tách bằng sắc ký cột (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô. Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol/nước 99/1/0,11, 9/1/0,1, 8/1/0,1, 5/1/0,1, 1/1/0,1 (v/v)

3.7. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT

Phần này trình bày chi tiết các đặc trưng vật lý, các dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ ba đối tượng nghiên cứu. Dưới đây chỉ đưa ra hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất tiêu biểu:

3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9)- Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài thồm lồm gai

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLH9. Tinh thể hình kim màu trắng, đnc. 123-125°C

Rf = 0,51 (TLC, silica gel, n-hexan/etyl axetat 3/1), hiện màu tím đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,28 (1H, m, H-3), 1,73 (3H, s, H-18), 0,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J=4,0Hz, H-19b), 0,97 (6H, s, H-21& H-28), 4,10 (1H, t, J=7,5Hz, H-24), 4,83 (1H, s, H-26a), 4,93 (1H, d, J=5,5 Hz, H-19b), 0,87 (3H, s, H-27), 0,80 (3H, s, H-29), 0,89 (3H, s, H-30), 2,17 (3H, s, 3-COCH3). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 31,9 (C-1), 30,4 (C-2), 78,9 (C-3), 40,5 (C-4), 47,2 (C-5), 21,1 (C-6), 26,0 (C-7), 47,9 (C-8), 20,0 (C-9), 26,1 (C-10), 26,5 (C-11), 32,9 (C-12), 45,3 (C-13), 48,9 (C-14), 35,6 (C-15), 28,1 (C-16), 52,2 (C-17), 18,0 (C-18), 29,9 (C-19), 35,9 (C-20), 18,3 (C-21), 31,9 (C-22), 31,7 (C-23), 76,4 (C-24), 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26), 17,6 (C-27), 25,5 (C-28), 14,0 (C-29), 19,3(C-30), 170,0 (C=O), 21,4 (C-COCH3).

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (TLH23)- Hợp chất chưa có công bố trong tài liệu khoa học.

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLH23. Tinh thể hình kim màu trắng, đnc. 216-218°C.

Rf = 0,35 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 10/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°.

LC/ESI-MS/MS: m/z 962 [M+Na]+, 800 [M+Na-Glc]+. M=939 đvC, C55H105NO10 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 4,08 (1H, dd, J= 4,0; 10,5 Hz, H-1a), 3,82 (1H, dt, J= 2,0; 4,0; 10,5 Hz, H-1b), 4,27 (1H, m, H-2), 3,62 (1H, t, J=6,0 Hz, H-3), 3,53 (1H, m, H-4), 1,66 (1H, m, H-5a), 1,43 (1H, m, H-5b), 1,60 (2H, m, H-6), 1,99 (2H, m, H-7), 5,44 (1H, m, H-8), 5,44 (1H, m, H-9), 1,99 (2H, m, H-10), 1,31 (18x2H, m, H-11→H-28), 0,92 (3H, t, J= 6,5 Hz, H-29). 4,04 (1H, m, H-2'),1,78 (1H, H-3'a), 1,62 (1H, H-3'b), 1,44 (2H, H-4'), 1,31 (4x2H, H-5'→8'), 2,08 (2H, m, H-9'), 5,38 (1H, m, H-10'), 5,38 (1H, m, H-11'), 2,08 (2H, m, H-12'), 1,31 (7x2H, m, H-13'→19'), 0,92 (3H, t, J= 6,5 Hz, H-20'); Glc: 4,30 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1''), 3,20 (1H, quartet, J= 8,0 Hz, H-2''), 3,38 (1H, m, H-3''), 3,29 (1H, m, H-4''), 3,30 (1H, m, H-5''), 3,89 (1H, d, J= 11,5, H-6''a), 3,68 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6''b). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 69,9 (C-1), 51,7 (C-2), 75,6 (C-3), 72,9 (C-4), 32,9 (C-5), 27,2 (C-6), 33,8 (C-7), 131,5 (C-8), 131,4 (C-9), 33,7 (C-10), 30,3-30,9 (C-11→C-26), 33,1 (C-27), 23,7 (C-28), 14,5 (C-29), 177,1 (C-1'), 72,9 (C-2'), 35,7 (C-3'), 26,1 (C-4'), 30,3-30,9 (C-5'→C-8'), 28,3 (C-9'), 130,8 (C-10'),130,9 (C-11'), 28,4 (C-12'), 30,3-30,9 (C-13'→C-17'), 33,1 (C-18'), 23,7 (C-19'), 14,5 (C-20'); Glc: 104,7 (C-1''), 75,0 (C-2''), 77,9 (C-3''), 71,6 (C-4''), 78,0 (C-5''), 62,7 (C-6'').

3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1)- Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLE1. Chất rắn màu trắng, đnc. 296-298°C.

Rf = 0,51 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 20/1), hiện màu hồng với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 6,39 (2H, s, H-3a), 7,535 (1H, s, H-5), 7,533 (1H, s, H-5'), 4,05

6

(3H, s, 3'-OCH3). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 112,7 (C-1), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 104,3 (C-3a), 150,0 (C-4), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6), 158,3 (C-6a), 110,9 (C-1'), 141,6 (C-2'), 140,2 (C-3'), 150,0 (C-4'), 112,1 (C-5'), 116,0 (C-6'), 157,6 (C-6'a), 60,9 (3'-OCH3).

N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)-Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLE5. Tinh thể hình trụ, màu hồng nhạt, đnc. 244-246ºC.

Rf = 0,53 (TLC, silica gel, điclometan/metanol/nước 4/1/0,1, v/v/v), hiện màu hồng đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%.

EI-MS (%) m/z: 158 (m/z, 5), 141 (10), 130 (58), 115 (32), 87 (98), 44 (100); CTPT: C4H5N3O4. 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 10,52 (1H, s, O-H), 8,04 (1H, s, N1-H), 6,87 (1H, d, J=8,0 Hz, N6- H), 5,24 (1H, d, J= 8,0 Hz, C4-H), 5,77 (1H, s, N3-H). 13C- NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 173,6 (C-7), 157,3 (C-5), 156,7 (C-2), 62,3 (C-4)

Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4)- Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLB4. Chất rắn màu vàng, đnc. 188-190oC.

Rf = 0,33 (TLC, silica gel, toluent/acid axetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%

ESI-MS: pos 595 [M+H]+, neg 593 [M-H]ˉ. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,22 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8), 8,10 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2' & 6'), 6,90 (2H, d, J=9,0 Hz, H-3'& 5'), glc: 5,05 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1''), 3,33 (1H, s, H-2''), 3,63 (1H, m, H-3''), 3,81 (1H, s, H-4''), 3,55 (1H, m, H-5''), 3,41 (1H, m, Ha-6''), 3,74 (1H, m, Hb-6''); Rha: 4,55(1H, s, H-1'''), 3,63 (1H, m, H-2'''), 3,55 (1H, m, H-3'''), 3,82 (1H, m, H-4'''), 3,54 (1H, m, H-5'''), 1,20 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6'''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 158,5 (C-2), 135,7 (C-3), 179,6 (C-4), 162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,0 (C-7), 94,9 (C-8), 161,6 (C-9), 105,5 (C-10), 122,6 (C-1'), 132,5 (C-2'), 116,1 (C-3'), 159,4 (C-4'), 116,1 (C-5'), 132,5 (C-6'), 105,6 (C-1''), 73,9 (C-2''), 75,4 (C-3''), 70,1 (C-4''), 75,1 (C-5''), 67,4 (C-6''), 101,9 (C-1'''), 72,1 (C-2'''), 72,3 (C-3'''), 72,9 (C-4'''), 69,7 (C-5'''), 17,9 (C-6''')

1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol (NTH24.2)- chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học

Được phân lập từ nhóm phân đoạn NTH24. Chất vô định hình màu trắng.

Rf = 0,64 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 9/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%.

LC/ESI-MS/MS: (m/z): 972 [M+NH4]+, 902 [M+3H-3HOH]+, 792[M+H-Gal]+, 472 [M+H-Gal-C23H45]+•. M=953, CTPT: C56H107NO10. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3& CD3OD), δ (ppm): 4,09 (1H, dd, J = 6,0; 10,5 Hz, H-1a), 3,80 (1H, dt, J = 2,0; 5,5; 10,5 Hz, H-1b), 4,23 (1H, m, H-2), 3,61 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-3), 3,55 (1H, m, H-4), 1,66 (1H, m, H-5a), 1,43 (1H, m, H-5b), 1,59 (2H, m, H-6), 2,03 (2H, m, H-7), 5,41 (1H, m, H-8), 5,41(1H, m, H-9), 2,04 (2H, m, H-10), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-18), 4,04 (1H, m, H-2'), 1,76 (1H, H-3'a), 1,60 (1H, 3'b), 1,39 (2H, m, H-4'), 5,36 (1H, m, H-10'), 5,36 (1H, m, H-11'), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-22'); galc: 4,32 (1H, d, J =8,0 Hz, H-1''), 3,24 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-2''), 3,62 (1H, t, J =5,0 Hz, H-3''), 3,38 (1H, m, H-4''), 3,35 (1H, m, H-5''), 3,85 (1H, d, J = 12 Hz, H-6''a), 3,71 (1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, H-6''b). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3& CD3OD), δ (ppm): 68,6 (C-1), 50,1 (C-2), 76,7 (C-3), 72,0 (C-4), 32,2 (C-5), 26,9 (C-6), 32,3 (C-7), 130,4 (C-8), 129,9 (C-9), 32,2 (C-10), 29,4-28,9 (C-11→ C-15), 31,6 (C-16), 22,3 (C-17), 14,3 (C-18), 222,4 (C-1'), 72,9 (C-2'), 34,2 (C-3'), 24,9 (C-4'), 29,4-29,0 (C-5'→C-8'), 28,9 (C-9'),

7

129,6 (C-10'), 129,1 (C-11'), 28,9 (C-12'), 29,4-29,0 (C-13'→C-19'), 32,3 (C-20'), 25,6 (C-21'), 14,3 (C-22'), galc: 102,8 (C-1''), 73,3 (C-2''), 74,1 (C-3''), 69,8 (C-4''), 76,1 (C-5''), 61,3 (C-6'').

Isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn MTB6. Chất rắn màu vàng, đnc. 185-188oC.

Rf = 0,25 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%.

ESI-MS m/z 793,1 [M+Na]+ , 769,1 [M-H]- , CTPT: C34H42O20. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm):

6,21 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,96 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,93 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5'), 7,60 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 3,99 (3H, s, O-CH3), glc: 5,75 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,64 (1H, m, H-2''), 3,58 (1H, m, H-3''), 3,62(1H, s, H-4''), 3,41 (1H, m, H-5''), 3,85(1H, m, H-6a''), 3,43(1H, m, H-6b''); rham: 4,56 (1H, s, H-1''' ), 3,79 (1H, dd, J= 9,5; 3,0 Hz H-2'''), 3,49 (1H, s H-3'''), 3,24 (1H, m H-4'''), 4,05 (1H, q, H-5'''), 1,09 (3H, d, J=6,5Hz, H-6'''); rham: 5,21(1H, s, H-1''''), 4,02 (1H, s, H-2''''), 3,49 (1H, s, H-3''''), 3,35 (1H, m, H-4''''), 3,42 (1H, m, H-5''''), 0,94 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6''''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 158,4 (C-2), 134,3 (C-3), 179,2 (C-4), 163,1 (C-5), 99,8 (C-6), 165,7 (C-7), 94,7 (C-8), 158,6 (C-9), 105,9 (C-10), 123,7 (C-1'), 114,5 (C-2'), 148,4 (C-3'), 150,6 (C-4'), 116,1 (C-1'), 123,4 (C-6'), 57,0 (O-CH3); glc: 100,5 (C-1''), 80,1 (C-2''), 78,8 (C-3''), 72,0 (C-4''), 77,2 (C-5''), 68,2 (C-6''); rham: 102,3 (C-1'''), 72,3 (C-2'''), 72,1 (C-3'''), 73,8 (C-4'''), 69,9 (C-5'''), 17,8 (C-6'''); rham: 102,7 (C-1''''), 72,4 (C-2''''), 72,1 (C-3''''), 73,9 (C-4''''), 69,7 (C-5''''), 17,5 (C-6'''')

Quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2) - chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ phân đoạn MTB10. Chất rắn màu vàng, đnc. 191-193°C.

Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%.

ESI-MS: pos, m/z: 795,2 [M+Na]+, M=772 đvC, CTPT: C33H40O21.1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ

(ppm): 6,23 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,41 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,68 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,95 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5'), 7,56 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'); β-glc: 5,30 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,33 (1H, m, H-2''), 3,77 (1H, s, H-3''), 3,44(1H, m, H-4''), 3,42 (1H, m, H-5''), 3,83 (1H, dd, J= 1,5; 2,0 Hz, Hb-6′′′), 3,74 (1H, dd, J= 11,5, 5,0 Hz, Ha-6′′′); β-glc: 4,78 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1'''), 3,42 (1H, m, H-2'''), 3,35 (1H, m, H-3'''), 3,33 (1H, m, H-4'''), 3,60 (1H, m, H-5'''), 3,37 (1H, s, Ha-6′′), 3,80 (1H, m , Hb-6′′); α-rham: 4,51(1H, d, J=1,0 Hz, H-1''''), 3,50 (1H, dd, J= 9,5; 3,5 Hz, H-2''''), 3,60 (1H, m, H-3''''), 3,27 (1H, t, J=9,5 Hz, H-4''''), 3,45 (1H, m, H-5''''), 1,11 (3H, d, J=6,5 Hz , H-6''''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 158,5 (C-2), 134,9 (C-3), 179,6 (C-4), 163,1 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,9 (C-8), 159,2(C-9), 105,7 (C-10), 123,23 (C-1'), 116,2 (C-2'), 145,9 (C-3'), 149,8 (C-4'), 117,7 (C-1'), 123,17 (C-6'); β-glc: 101,2 (C-1''), 76,99 (C-2''), 82,6 (C-3''), 71,1 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,4 (C-6''), β-glc: 104,8 (C-1'''), 75,5 (C-2'''), 78,2 (C-3'''), 71,3 (C-4'''), 77,9 (C-5'''), 68,1 (C-6'''); α- rham: 102,2 (C-1''''), 72,3 (C-2''''), 72,1 (C-3''''), 73,9 (C-4''''), 69,7 (C-5''''), 17,8 (C-6'''')

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này trình bày kết quả định tính các lớp chất có mặt trong ba đối tượng nghiên cứu, biện giải cấu trúc của các hợp chất phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các cặn chiết và một số chất tinh khiết.

4.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

8

Kết quả định tính sơ bộ thành cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cả ba đối tượng là các flavonoid, phytosterol, acid hữu cơ, chất béo.

4.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAO CHIẾT

4.2.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các mẫu cặn chiết

Bảng 4.2. Hiệu suất của các cặn chiết khác nhau

STT Cây Bộ phận Dung môi Hiệu suất (%) 1 P. barbatum thân rễ MeOH 5,1 2 P. barbatum thân rễ EtOH 90% 6,9 3 P. barbatum thân rễ H2O 7,2 4 P. barbatum lá MeOH 3,2 5 P. perfoliatum thân rễ MeOH 9,3 6 P .perfoliatum thân rễ EtOH 90% 19,3 7 P. perfoliatum thân rễ H2O 20,7 8 P. perfoliatum lá MeOH 13,2 9 P. plebeium toàn cây MeOH 8,7 10 P. plebeium toàn cây EtOH 90% 11,6 11 P. plebeium toàn cây H2O 6,6

Theo tiêu chuẩn của U.S. National Cancer Institute một dịch chiết được xem có khả năng độc tế bào in vitro khi giá trị IC50 nhỏ hơn 20 μg/mL, trong khi với chất tinh khiết, giá trị này được tính là nhỏ hơn 10 μg/mL. Qua bảng 4.3. kết quả thử hoạt tính độc tế bào có thể nhận thấy toàn bộ 11 cặn chiết từ ba loài cây nghiên cứu đều cho tác dụng độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm HT-1080, MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR và Hela với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL.

Bảng 4.3. Kết quả thử độc tế bào của các mẫu cao chiết trên 5 dòng tế bào ung thư

IC50 (µg/mL) STT Mẫu HT-1080 MDA-MB 231 MCF-7/adr MCF-7/TAMR Hela

1 8.5 ± 0.3 5.5 ± 0.3 7.8 ± 0.2 8.1 ± 0.4 7.1 ± 0.5 2 5.1 ± 0.7 6.6 ± 0.5 5.9 ± 0.3 5.4 ± 0.3 7.2 ± 0.4 3 7.4 ± 0.5 8.2 ± 0.4 9.2 ± 0.4 7.1 ± 0.6 9.4 ± 0.5 4 11.5 ± 0.4 12.6 ± 0.5 12.5 ± 0.5 14.2 ± 0.6 13.2 ± 0.4 5 12.8 ± 0.6 13.7 ± 0.3 18.2 ± 0.7 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.4 6 12.9 ± 0.3 13.4 ± 0.4 14.5 ± 0.7 15.4 ± 0.5 15.4 ± 0.6 7 17.5 ± 0.4 16.4 ± 0.5 17.2 ± 0.3 19.9 ± 0.4 13.8 ± 0.5 8 11.1 ± 0.5 10.6 ± 0.4 11.9 ± 0.7 12.4 ± 0.9 10.3 ± 0.4 9 12.6 ± 0.9 10.2 ± 0.4 11.7 ± 0.3 11.5 ± 0.4 10.4 ± 0.6

10 14.3 ± 0.2 13.5 ± 0.3 12.6 ± 0.4 11.8 ± 0.6 10.9 ± 0.5 11 11.9 ± 0.8 9.1 ± 0.5 12.4 ± 0.4 11.9 ± 0.6 12.4 ± 0.5

Tamoxifen** - 12.4 ± 0.8 10.9 ± 1.1 11.1 ± 0.8 -

* Kết quả được lấy trung bình của 3 lần thí nghiệm khác nhau; ** chứng dương; - Không thử

Trong số các mẫu này, bốn cặn chiết từ cây P. barbatum (1-4) thể hiện khả năng gây độc tế bào trên năm dòng tế bào kể trên mạnh hơn cả với các giá trị IC50 chỉ từ 5,1 – 9,4 µg/mL, bốn mẫu P. perfoliatum (5-

9

8) và ba mẫu P. plebeium (9-11) thể hiện tác dụng này yếu hơn với IC50 từ 9,1 -19,9 µg/mL. Các cao chiết EtOH 90% bộ phận thân rễ của P. perfoliatum, P. barbatum và P. plebeium, đều thể hiện tác dụng độc tế bào mạnh hơn các cao chiết metanol, nước của cùng một cây cũng như phụ thuộc vào từng dòng tế bào. Đây cũng là một cơ sở để định hướng cho quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ ba loài cây này. Kết quả nghiên cứu tác dụng độc tế bào này của luận án lần đầu tiên được công bố.

4.2.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết

Bảng 4.4. Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của các cặn chiết

STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 107,50 ± 3,95 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 35,53 ± 2,41 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 55,60 ± 3,92 4 Acid ascorbic 34,08 ± 0,36

Trong ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu, cặn chiết từ cây nghể trắng cho tác dụng cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml.

Bảng 4. 5. Kết quả định lượng ABTS•+ của các cặn chiết

STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 48,57 ± 8,874 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 29,83 ± 6,60 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 26,50 ± 5,92 4 Trolox 9,47 ± 0,25

Nhận xét: Từ bảng 4.2. cho thấy cả ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu đều có khả năng dọn gốc tự do ABTS•+. Trong đó cây mễ tử liễu cho tác dụng cao nhất với IC50 = 26,50 ± 5,92 µg/ml, tiếp đó là cây nghể trắng với IC50 = 29,83 ± 6,60 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 48,57 ± 8,874 µg/ml với chất đối chứng Trolox IC50 =9,47 ± 0,25 µg/ml.

Qua kết quả định tính nhóm chất và kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào, chống oxy hóa của các phần chiết khác nhau từ các bộ phận khác nhau của cả ba loài nhận thấy cặn chiết etanol 90% bộ phận thân rễ của hai loài thồm lồm gai, nghể trắng và toàn cây mễ tử liễu cho thấy tác dụng độc tế bào và tác dụng quét gốc DPPH rõ rệt nhất. Hơn nữa dung môi chiết xuất etanol 90% là dung môi có thể chiết xuất được hầu hết các các nhóm chất có độ phân cực khác nhau có mặt trong cả ba loài. Vì vậy, luận án lựa chọn đối tượng nghiên cứu cụ thể cho quá trình phân lập các chất là thân rễ thồm lồm gai, thân rễ nghể trắng, toàn cây mễ tử liễu với dung môi chiết xuất là etanol 90%.

4.3. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT

Quy trình chiết được áp dụng chung cho cả ba mẫu thực vật nêu trên và được tóm tắt ở Sơ đồ 4.1

10

4.4. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHẦN CHIẾT

Phần này trình bày kết quả phân tích các phần chiết bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi dung để phân lập các chất bằng sắc ký cột.

4.5. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT

Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ các phân đoạn khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu.

4.5.1. Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai

Từ phần chiết n-hexan cây thồm lồm gai thu được các hợp chất TLH4 (30 mg), TLH5 (15 mg), TLH7 (12 mg), TLH9 (15 mg), TLH23.3 (21 mg), TLH24 (27 mg), TLH29 (13 mg). Từ phần chiết etyl axetat (TLE) thu được chất TLE 1.1 (8 mg), TLE1.1.2 (12 mg), TLE1.1.3 (14 mg) TLE 1.1.4 (11 mg), TLE1.2 (20 mg), TLE1.3 (8 mg), TLE1.4 (11 mg), TLE1.5 (11 mg), TLE1.7 (21 mg), TLE1.8 (13 mg), TLE1.9 (13 mg), TLE 2.1 (13mg), TLE 2.1.3 (18 mg), TLE 2.1.4 (30 mg), TLE2.2 (12 mg), TLE2.6 (13 mg), TLE3 (16 mg), TLE5 (17 mg). Từ phần chiết n- butanol thu được chất TLB1(11 mg), TLB4 (23 mg),

Mẫu nguyên liệu (TL 2,5 kg; NT 2,5 kg, MT 2,5 kg)

Dịch nước

Dịch nước

Phần chiết n-butanol (TLB; 47,30 g, 1,89 %) (NTB; 35,76 g, 1,43 %) (MTB; 41,43 g, 1,66 %)

Phần chiết nước (TLW; 105,00 g, 4,20 %) (NTW; 76,80 g, 3,07 %) (MTW; 96,00 g, 3,84 %)

1. Hòa vào nước cất 2. Chiết bằng n-hexan 3. Cất loại kiệt n-hexan, 60 °C

Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ ba đối tượng nghiên cứu

1. Ngâm chiết với EtOH 90% (4 ngày, 3 lần) 2. Lọc, cất loại EtOH

Dịch nước Phần chiết n-hexan (TLH; 17,00 g, 0,68 %) (NTH; 40,29 g, 1,61 %) (MTH; 71,86 g, 2,87 %)

1. Chiết với EtOAc 2. Cất loại kiệt EtOAc, 60 °C

Phần chiết EtOAc (TLE; 100,00 g, 4,00 %) (NTE; 50,97 g, 2,04 %) (MTE; 71,25 g, 2,85 %)

1. Chiết với n-butanol 2. Cất loại kiệt n-butanol, 70 °C

Cất loại kiệt nước, 100 °C

Phần chiết tổng (TL; 290,00 g, 11,60 %) (NT; 207,26 g, 8,29 %) (MT; 289,85g, 11,59 %)

11

TLB7 (24 mg), TLB11 (16 mg), TLB13 (13 mg).

4.5.2. Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng

Từ phần chiết n-hexan thu được chất NTH1 (50 mg), NTH2 (140 mg), NTH6 (14 mg), NTH24.1 (13 mg), NTH24.2 (21 mg), NTH26.2 (15 mg), NTH26.3 (35 mg), NTH30 (30 mg). Từ phần chiết etyl axetat (NTE) thu được chất NTE1.1 (9 mg), NTE1.6 (14 mg), NTE2.4.2 (8 mg), NTE 2.6.1 (13 mg), NTE2.6.2 (40 mg), NTE2.7.1 (15 mg), NTE3 (15 mg), NTE 5.7 (11 mg), NTE8 (22 mg), NTE12 (14 mg). Từ phần chiết n-butanol thu được chất NTB3 (17 mg), NTB4 (20 mg), NTB8 (13 mg), NTB11 (38 mg).

4.5.3. Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu

Từ phần chiết n-hexan thu được chất MTH8.1 (31 mg), MTH10 (35 mg), MTH11 (15 mg), MTH13 (12 mg), MTH16 (17 mg), MTH 18 (205m g). Từ phần chiết etyl axetat (MTE) thu được chất MTE2.4 (17 mg), MTE2.5 (10 mg), MTE2.9 (17 mg), MTE2.9.9 (14 mg), MTE2.10.1 (13 mg), MTE2.10.2 (20 mg), MTE3.4 (11 mg), MTE3.8 (16 mg), MTE4 (30 mg), MTE5 (15 mg), MTE8.1 (7 mg). Từ phần chiết etyl axetat n- butanol thu được chất MTB4 (35 mg), MTB6 (22 mg), MTB 10.2 (56 mg).

4.6. CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP

Cấu trúc của các chất được xác định dựa vào việc phân tích các dữ kiện phổ thực nghiệm, kết hợp khảo sát các đặc trưng vật lý, kết hợp tham khảo các tài liệu. Dưới đây chỉ ra cấu trúc các chất đã được xác định, và trình bày phương pháp xác định cấu trúc của một số hợp chất điển hình từ ba loài cây.

4.6.1. Các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây thồm lồm gai

Từ các phần chiết thân rễ cây thồm lồm gai đã phân lập và xác định cấu trúc được 24 hợp chất bao gồm:

HO

17

18

19

20

22

5

24

26

27

28

29

3

β-Sitosterol (TLH4)

OHOH O1

2

345

6

78 9

10

Musizin (TLH5) Mới trong cây

OH

1

35

8910

1314

17

18

19

20

2122

2324 25

26

27

28 29

30O

H3C

3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9) -Mới trong cây

HN

OHOH

OH

HOHOOH

O

OH1

23

18

O OH 3'

1'2'

5

6

7

8

9

10

11

12

13

29

4'

5'

6'

7'

8' 10' 11'

12'

13'

20'

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (TLH23)- chất mới trong tự nhiên

10

92

345

6

7

8

1'

2'

3'

4'

10'

5'

6'

7'8'

9'

O OHOOCH3

6-Geranyl-7-hydroxy-8-methoxy coumarin (TLH29)-Mới trong chi

Polygonum

O

17

18

19

2122

5

24

26

27

28

29

3OH

HOHOOH

OH

Daucosterol (TLE1.2)

O

OOH

HO

OH

OHOH

2

346

8

10

1'

4'

6'

Quercetin (TLE1.3)

OHO

OH O

OH

OH

OH1

2

34

5

7 9

10

1'

2'3'

6'

OH

Myricetin (TLE 1.5)

12

O

O

OHO 13

6

6aO

O

1' 3'

6'

6'aO

OCH3

3a

3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic

axit (TLE1.1) Mới trong chi Polygonum

O

O

1

3

456

89

10

8a 9a

4a10a OCH3H3C

OHOH

Physcion (TLE1.1.2)

O

O

OH

OH

1

34

5

8

4-Hydroxymellein (TLE1.1.4)

Mới trong cây

O

O

OH3CO 123

45 6

7

1''2''

3''

4''5''

6''

OOH

OH

HOCH3

O

O

OCH3

H3CO

1'2' 3'

4'5'6'

7'

3,3',4-Trimethoxy 4'-O-α-L-

rhamnopyranoside ellagic acid (TLE1.4)

Mới trong cây

O

O

HO

O

OH

HO

OH

OH

OH

123

6

4 59' 8'

7'1'

2'

3'

4'5'

6'

Acid chlorogenic (TLE1.7)

O

OH

OCH3

OCH3

O

HO

OH

2

34

5

7

9

10

2'

6'

4',5,7-Trihydroxy-3',5'-

dimethoxyflavone (TLE1.8) Mới trong cây

OO

OHO

OH O

OHOH

CH3

OH

HOOH

OH1

234

5

7 9

10

1'

3'

6'1''

2'' 3'' 4''

5''

6''

Myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid

(TLE1.9)

O

OO

HO

OH

OH

2

45

79

1'

3'

1'' 5''O

HOOH

OHCOOH

2" 4"

6"

OH

H

Quercetin-3-O-β-D-glucuronid

(TLE2.1.4)

O

OH

OH

HOOH

OH

2

345

6

7

89

10

1'

2'3'

4'

5'6'

(-)- Epicatechin (TLE2.1)

OH

HOHO

OH

O

OH

OH

HOOH

OH

OH1'

4

Maltose (TLE2.1.3)

O

OOH

HO

OH

O

O

OHOH

OH

OO

OHHOHO

1''

1'''

Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4)

HN

NH

O

O

NH

O

HO 76 4

5

23

1

N-[(4R)-2,5-dioxo-4-

imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)

Mới trong chi Polygonum

O OH

O

O

O

O

OH

OH

HOHO

OH3CO

HO

O

OCH3

OH

1

23 4

5

OH

6

1''

2'' 3''

4''

5''6''

1'''

2'''3'''

4'''

5''' 6'''7'''

8'''

9'''

7''8''

9''

1'2'3'

4' 5'6'

1,3- Diferuloyl O-Z-β-D-fructofuranosyl

(1→2)-α-D-glucopyranosid (TLB11)

13

OH

OCH3

OH

H3CO

O

H3CO

HO

OCH3

13

6

78

9

1'2'6'

7'8' 9'

O

HO

OH

OH

1"5"

Lyoniside (TLB13)

O

OH

OH

HOOH

O

2

35

79

10

1'

3'

6'

O OH

OHOH

7' 9'

11'13'

8'

OH

(–)-Epigallocatechin 3-O-gallate

(TLE2.6)

O

OO

HO

OH

OH

2

45

79

1'

3'

1'' 5''O

HOOH

OH

OH

2" 4"

6"

OH

Quercetin 3-O-β-D- glucopyranosid

(TLE3)

3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9)- chất mới trong cây cây thồm lồm gai.

Phổ 1H-NMR của TLH9 cho tín hiệu singlet của các proton thuộc về bảy nhóm metyl, trong đó có 6 nhóm metyl thế ba lần ở δH 1,73 (3H, s, H-18), 0,97 (6H, s, H-21& H-28), 0,87 (3H, s, H-27), 0,80 (3H, s, H-29), 0,89 (3H, s, H-30) và một nhóm metyl cacbonyl ở δH 2,17 (3H, s, 3-COCH3); hai proton của vòng cyclopropane cho tín hiệu doublet rất đặc trưng tại δH 0,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J=4,0Hz, H-19b). Một proton metin cộng hưởng chuyển dịch về trường thấp hơn (δH 4,10) chứng tỏ nó phải liên kết với cacbon gần dị tố (ở đây là nguyên tử oxi của nhóm hydroxyl). Tín hiệu proton của một nối đôi đầu mạch δH 4,83 và 4,93. Thêm vào đó, sự có mặt của proton ở δH 3,28 (1H, m, H-3) chứng tỏ rằng TLH9 là một triterpene có khung cycloartane.

Kết hợp giữa phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy TLH9 gồm 7 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 7 C bậc 4. Tín hiệu δC 170,0 và 21,4 (C-COCH3) đặc trưng cho sự có mặt của chức acetoxy (COCH3) trong công thức cấu tạo của TLH9. Sự xuất hiện của nối đôi đầu mạch (>C=CH2) cũng được khẳng định bởi các tín hiệu tại δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26) tương ứng với hai tín hiệu proton ở δ 4,83 và 4,93. Điều đặc biệt ở đây là sự xuất hiện của các pic cacbon theo cặp đôi của C-25 và C-26 ở δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25) và 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) chứng tỏ rằng hợp chất TLH9 là một hỗn hợp epimer R/S với tỷ lệ khoảng 01:01 gây ra bởi nguyên tử carbon bất đối ở C-24. Từ việc phân tích trên, kết hợp với tham khảo tài liệu, so sánh các dữ kiện phổ đã công bố cho các hợp chất tương tự [10] cho phép kết luận về cấu trúc của TLH9 là 3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thồm lồm gai.

OH

1

35

8910

1314

17

18

19

20

2122

2324 25

26

27

28 29

30O

H3C

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (TLH23) - chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học

Hợp chất TLH23 kết tinh dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, có điểm nóng chảy ở 216-218°C. Các dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của chất TLH23 chỉ ra sự có mặt của một chức amid đặc trưng bởi một nhóm metin liên kết với nitơ ở δH 4,27 (1H, m, H-2) và tín hiệu cacbon cacbonyl ở δC 177,1 (C-1'); hai mạch cacbon béo đặc trưng bởi các tín hiệu ở δH 1,31 (60 H) và δH 0,92 (6H, t, J=6,5 Hz, H-20' & H-29), tín hiệu của hai nối đôi ở δH 5,44 (m, H-8, H-9) tương ứng với δC 131,5 (C-8), 131,4 (C-9) và 5,38 (m, H-10', H-11') tương ứng với δC 130,8 (C-10'), 130,9 (C-11'). Sự có mặt của đường glucose được đặc trưng bởi tín hiệu proton anome [δH 4,30 (d, J = 7,5 Hz, H-1'')] và cacbon anome δC 104,7 (C-1') và các tín hiệu 13C-NMR khác

14

nhau ở δC 62,7 (C-6''), 71,6 (C-4''), 75,0 (C-2''), 78,0 (C-5'') và 77,9 (C-3''). Tương tác giữa C-1 và H-1'' trên phổ HMBC cho phép khẳng định vị trí của liên kết glucosid giữa đường và amid. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết hợp chất TLH23 là một glycosphingolipid được tạo thành bởi hai hợp phần acid béo và bazơ mạch dài [117]. Phân tích tiếp phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu của ba proton hydroxymetin khác chuyển dịch về trường thấp ở δH 3,62, 3,53 , 4,04. Các tương tác COSY quan sát được của hai proton metylen (H-1) ở δH 4,08 và 3,82 với proton metin ở δH 4,27, tương tác của hai proton metin ở δH 4,27 với δH 3,62, tương tác của proton metin δH 3,62 với proton metin ở δH 3,53; đồng thời tương quan HMBC của proton ở δH 4,04 và C=O (δC 177,1) cho phép xác định vị trí liên kết chính xác của các proton này là ở C-3, C-4 và C 2'. Từ đây, cũng khẳng định về cấu trúc 1,3,4-triol của sphingolipid này

.

HN

OH

OH1

23

R2O OH

1'2'

R1RO4 R1, R2: Mach dài

R: glucose hoac galactose

Để xác định hai hợp phần này ta sử dụng phương pháp thủy phân và kết hợp khảo sát phổ ESI-MS của

sản phẩm như sau: Hợp chất TLH23 (15 mg) được hòa tan trong hỗn hợp dung môi metanol-acid HCl (5ml, 1M HCl trong 82% aq. MeOH), đun hồi lưu ở 80°C trong 18 giờ [117]. Để nguội phản ứng và chiết với n-hexan. Phần chiết n-hexan sau đó được cô loại dung môi thu được sản phẩm là metyl este của hợp phần acid béo (TLH23.1). Độ dài mạch của hợp phần TLH23.1 được xác định bởi phổ ESI-MS (neg) với píc ion m/z 339 [M-H]- cho thấy mạch acid béo phải có 20 cacbon và chứa một nối đôi. Như vậy, nối đôi còn lại thuộc về hợp phần base. Vị trí của nối đôi trong phần acid béo được xác định tại C-10'/C-11' dựa trên các phân mảnh ở phổ ESI-MS (neg) của TLH23.1: m/z 227 [M-H-C8H18]-, m/z 213 [M-H-C9H18]-, m/z 187 [M-H-C11H21]-

, , m/z 173 [M-H-C12H23]-. Cấu hình của nối đôi này là Z do sự chuyển dịch về trường cao của hai cacbon kề bên C-9 (δC 28,3) và C-12 (δC 28,4).

O

OOH

3'1'

2'4'

5'

6'

7'

8' 10' 11'

12'

13'

20'

173187

227213

m/z: 339 [M-H]- Trên phổ khối của TLH23 cho pic ion m/z 962 [M+Na]+

tương ứng với khối lượng phân tử 939 đvC và công thức phân tử C55H105NO10. Kết hợp với việc xác định được phần acid béo ở trên, ta xác định được độ dài của hợp phần base là 29 cacbon. Phân tích tỉ mỉ các tương tác COSY và HMBC xác định được vị trí của nối đôi trong mạch base là ở vị trí C-8. Cấu hình của nối đôi này được xác định là E dựa trên sự chuyển dịch về trường thấp của hai cacbon bên cạnh C-7 (δC 33,8) và C-10 (δC 33,7). Kết hợp với tài liệu tham khảo [27] cho phép kết luận cấu trúc hợp chất TLH23 là 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1,3,4-triol. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được công bố phân lập từ thiên nhiên.

HN

OH

OHO

H

HOHOOH

O

OH1

23

18

O OH 3'

1'2'

5

6

7

8

9

10

11

12

13

29

4'

5'

6'

7'

8' 10' 11'

12'

13'

20'

15

3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Phổ 1H-NMR của TLE1.1 chỉ xuất hiện 2 tín hiệu singlet tại δH 7,535 (1H, s, H-5') và 7,533 (1H, s, H-5) được xác định là hai proton của vòng benzen. Tín hiệu singlet tại δH 6,38 (2H, s, H-3a) cho thấy sự có mặt của 2 proton methylenedioxy. Ngoài ra, nhóm methoxy được xác định bởi tín hiệu ở δH 4,05 (3H, s).

Phổ 13C-NMR và DEPT của TLE1.1 cho thấy hợp chất này có 15 C trong đó 12 tín hiệu δC 110,9 (C-1'), 112,1 (C-5'), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6'), 116,0 (C-6), 112,7 (C-1), 140,2 (C-3'), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 141,6 (C-2'), 150,0 (C-4), 150,0 (C-4') thuộc về hai vòng benzen với 10 cacbon bậc 4 và 2 cacbon metin. Ngoài ra, hai tín hiệu cacbon cacbonyl xuất hiện tại δC 157,6 (C-6'a), 158,3 (C-6a), rất đặc trưng cho cặp este nội vòng trong các dẫn xuất của ellagic acid. Phổ 13C-NMR và DEPT còn cho thấy sự xuất hiện của nhóm CH2 liên kết với 2 nguyên tử O tại δC 104,3 (C-3a) và nhóm methoxy tại δC 60,9 (s, 3-OCH3).

Dựa vào dữ liệu phổ trên đồng thời so sánh với các dữ kiện phổ đã được công bố trước đó [21], [152], cấu trúc của chất TLE1.1 được xác định là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxyellagic acid. Đây là công bố đầu tiên về sự có mặt của hợp chất này trong P. perfoliatum cũng như các loài trong chi Polygonum.

O

O

OHO 13

6

6aO

O

1' 3'

6'

6'aO

OCH3

3a

N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Hợp chất TLE5 có dạng tinh thể hình trụ màu trắng. Hiện màu tím với thuốc thử ninhydrin cho giả thiết về sự có mặt của nhóm amino trong cấu trúc của TLE5. Phổ 1H và 13C- NMR (DMSO-d6) chỉ ra sự có mặt của 5 proton ở δH 10,52 (1H, s), 8,04 (1H, s), 6,87 (1H, d, J=8,0 Hz), 5,24 (1H, d, J=8,0 Hz), 5,77 (1H, s) và 4 tín hiệu cacbon (δC 173,6, 157,3, 156,7 và 62,3). Tuy nhiên trên phổ HSQC chỉ quan sát thấy duy nhất một tương tác doublet của một cacbon (δC 62,4) và proton (δH 5,24). Như vậy khung cấu trúc của hợp chất TLE5 không chỉ chứa cacbon và hydro mà còn có chứa các nguyên tử khác. Phổ HMBC chỉ ra tương tác của proton ở δH 8,04 với cacbon ở δC 62,4, 156,7, 173,6; của proton δH 6,87 với cacbon δC 62,4, 157,3, 173,6; proton ở δH 5,24 với cacbon at δC 157,3, 173,6; proton δH 5,77 và cacbon δC 62,4. Phổ MS của TLE5 không chỉ ra pic ion phân tử mà cho các phân mảnh ở m/z: 158, 141, 130, 115 và 87. Từ các dữ kiện phổ trên, kết hợp với tài liệu tham khảo [156] cho nhận định về cấu trúc của hợp chất TLE5 là 2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây thồm lồm gai và chi polygonum. Trên thế giới, cho đến nay cũng mới chỉ ghi nhận một tài liệu tham khảo về sự phân lập hợp chất này trong tự nhiên (trong cây Cistanche deserticola Y.C.ma, một loài cây thuộc họ Orabanchaceae ở Trung Quốc).

HN

NH

O

O

NH

O

HO 76 4

5

23

1

Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4) - chất mới từ chi Polygonum

Trên phổ 1H-NMR cho các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton nhân thơm với hằng số tương tác J = 1,5 Hz đặc trưng cho proton ở vị trí meta ở vòng A của 5,7-flavonol với H 6,22 (1H, H-6), 6,42 (1H, H-8). Cặp

16

hai tín hiệu doublet khác tại H 8,10 (2H, d, J = 9,0, H-2', H-6') và 6,90 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5') đặc trưng cho hai proton ở vị trí meta với nhau thuộc vòng B thế para. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết TLB4 là một flavonoid có nhân kaempferol. So sánh số nguyên tử cacbon của TLB4 với kaempferol, kết hợp phân tích các tín hiệu cộng hưởng của nhiều proton trong vùng H 3,29 - 5,06 ppm chứng tỏ TLB4 phải chứa 2 đường. Trong đó một đường là rhamnose đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng proton doublet rất mạnh ở H 1,20 ppm (3H, d, J = 6,0 Hz) của nhóm CH3. Một đường khác là glucose với proton anomer ở H 5,05 (H-l'', d, J = 8,0 Hz) gắn trực tiếp vào nhân kaempferol tại OH ở vị trí C-3 (C 135,7) và nối với rhamnose ở H-1''' (H 4,55, s) thể hiện rõ nét trên phổ HMBC qua tương tác C-3 và H-1' và C-6'' và H-1'''. Cấu trúc kaempferol glycosid của TLB4 một lần nữa được khẳng định qua các dữ liệu phổ 13C-NMR với 27 tín hiệu C, trong đó ngoài 12 tín hiệu của 2 vòng đường tại C 105,6 (C-1''), 73,9 (C-2''), 75,4 (C-3''), 70,1 (C-4''), 75,1 (C-5''), 67,4 (C-6''), 101,9 (C-1'''), 72,1 (C-2'''), 72,3 (C-3'''), 72,9 (C-4'''), 69,7 (C-5'''), 17,9 (C-6'''), 15 tín hiệu còn lại của 15 nguyên tử cabon thuộc vào khung flavon. Hai tín hiệu CH bị chập đôi tại C 132,46 và 116,13 với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu CH khác và trên phổ HSQC chúng tương ứng với 2 tín hiệu proton mà mỗi tín hiệu có cường độ tích phân là 2H cũng khẳng định rõ vòng B thế para. Kết hợp với việc phân tích các dữ kiện phổ COSY, HSQC, HMBC có thể khẳng định rằng TLB4 là một flavonoid có tên gọi kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid [18]. Hợp chất này lần đầu tiên được công bố phân lập từ cây thồm lồm gai và chi polygonum.

O

OOH

HO

OH

O

O

OHOH

OH

OO

OHHOHO

1''

1'''

O

OOH

HO

OH

O

O

OHOH

OH

OO

OHHOHO

HMBC:H C

4.6.2. Các hợp chất được phân lập từ cây nghể trắng

Từ các phần chiết thân rễ cây nghể trắng đã phân lập và xác định cấu trúc 17 hợp chất bao gồm:

O OH1

23

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Axit margaric (NTH1) Mới trong cây HO

17

18

19

20

22

5

24

26

27

28

29

3

β-Sitosterol (NTH2)

CH3

O

OHN

NH O

O

2014

1312

8

7 1

4

91016

21

17

18

19 22

25

28

31

Asperglaucide (NTH6)

Mới trong cây

COOCH3

HO

12

34 5

67

810

1112 13

14

1516

17

18

20

22

23 24

25 26

27

28

29 30

HO

31

Methyl maslinat (NTH24.1)

Mới trong cây

HN

OH

OH

OOH

OOH

HHO

OHO

OH

3'1'

2'4'

5'

6'

7'

8' 10'

1

2

3 56 8

9 1112

13

22'

18

32'

1''

11'

12'

13'

1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-

octadecaene-1, 3, 4-triol (NTH24.2)-Mới trong tự nhiên

17

HO

COOH1

34 5

67

89

10

12

1314

15

17

1819

20

22

23 24

25 26

27

29

30

28

Acid ursolic (NTH26.2)

Mới trong cây

HO

COOH1

34 5

67

89

10

12

13

14

15

17

18

19 20

22

2324

2930

28

27

25 26

Acid oleanolic (NTH26.3)

Mới trong cây

OH

O

O

OHHO

14 7

11

13

128

10

5

14

15

Zedoalactone B (NTE1.6)

Mới trong chi

O

17

18

19

2122

5

24

26

27

28

29

3OH

HOHOOH

OH

Daucosterol (NTH30)

O

OH

OH

O

OCH3

OH

HO2

34

5

89

10

1'

3'

6'

Isorhamnetin (NTE2.4.2)

Mới trong cây

OHH3CO

COOH1

234

5

6 7

8 9

Acid isoferulic (NTE2.6.1) Mới trong cây

HOOH

OH

O

H3CO

7

3

1

8

9

Ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3)

Mới trong cây

2

4

6

7COOH

OHOH

HO

Axit gallic (NTE2.6.2)

Mới trong cây HO

OH1

3 5 6

810

1112

14 16

18

1920

22

2324

25 26

27

28

29

30

Uvaol (NTE3) Mới trong cây

1

3

CH3O

OCH3OH

3-Methoxy-4-hydroxyacetophenone

(NTB4)- Mới trong cây

3OCH3

OCH3H3CO

O1'

3'

6'

O

OHHOHO

HO 1

3,4,5-Trimethoxyphenol-1-O-β-

D-glucopyranoside (NTB8) - Mới trong cây

OHOH

HO

O OH

13 5

Acid 3,4,5-trihydroxycyclohex-1-

enecarboxylic (NTB11)

1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol (NTH24.2)- chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học

Các dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của chất NTH24.2 có những nét tương đồng với hợp chất TLH23 được phân lập từ cây thồm lồm gai cho dự đoán về cấu trúc của glycosphingolipid. Phân tích chi tiết các dữ kiện phổ cho thấy, đơn vị đường liên kết với chức amid ở NTH24.2 là galactose thay vì glucose như ở TLH23. Đường galactose được đặc trưng bởi bởi tín hiệu proton anome [δH 4,32 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1'')] và cacbon anome δC 104,2 (C-1'') và các tín hiệu 13C-NMR khác nhau ở δC 61,3 (C-6''), 69,8 (C-4''), 73,3 (C-2''), 76,1 (C-5'') và 74,1 (C-3''). Tương tác giữa C-1 và H-1'' trên phổ HMBC cho phép khẳng định vị trí của liên kết glycosit giữa đường và amid. Chức amid đặc trưng bởi một nhóm metin liên kết với nitơ ở δH 4,23 (1H, m, H-2) và tín hiệu cacbon cacbonyl ở δC 222,4 (C-1'); hai mạch cacbon béo đặc trưng bởi các tín hiệu trong khoảng δH 1,27–1,34 (54 H) và δH 0,88 (6H, t J = 6,5 Hz, H-19 & H-22'), tín hiệu của hai nối đôi ở δH 5,36 (m, H-10', H-11') và 5,41 (m, H-8, H-9) tương ứng với δC 129,7 (C-10'), 129,2 (C-11'), 130,4 (C-8), 129,6 (C-9). Tiếp tục phân tích phổ 1H và 13C-NMR, HMBC ta còn thấy rõ ba proton metin khác có liên kết với nhóm hydroxy chuyển dịch về trường thấp ở δH 3,62 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-3), δH 3,55 (1H, m, H-4), δH

18

4,04 (1H, m, H-2'). Ở vùng trường thấp trên phổ 1H-NMR xuất hiện các cặp pic tín hiệu hướng về nhau theo hiệu ứng mái nhà, mỗi tín hiệu tương ứng với một proton, điều này chứng tỏ các cặp đôi này thuộc về một nhóm methylen bị phân tách tín hiệu δH 4,09 (1H, dd, J = 6,0; 10,5 Hz, H-1a); 3,80 (1H, dt, J = 2,0; 5,5; 10,5 Hz, H-1b) và δH 3,85 (1H, d, J = 12 Hz, H-6''a); 3,71 (1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, H-6''b).

Ngoài sự khác nhau về phần đường, các cấu trúc glycospingolipid khác nhau còn có đặc trưng về vị trí nối đôi trong mạch bazơ và axít béo cũng như độ dài của mỗi mạch này. Để xác định số C và vị trí của nối đôi của NTH24.2, ta tiếp tục khảo sát phổ khối lượng phân giải cao. Trên phổ LC/ESI-MS/MS cho pic ion m/z [M+NH4]+

ở 972 tương ứng với khối lượng phân tử là 953 đvC và công thức phân tử là C56H107NO10. Các phân mảnh chính ở m/z 902 [M+3H-3HOH], 792 [M+H-Gal]+ chứng tỏ sự có mặt của 3 nhóm hydroxy và phân tử đường có trong phân tử của chất NTH24.2. Phân mảnh m/z 472 [M+H-Gal-C23H45]+•, 495 [M+H-Gal-C21H43]+• xác định vị trí nối đôi ở C-10'/C-11'; Phân mảnh m/z 478 [M+H-Gal-C18H34O3NH]+, 450 [M+H-Gal-C18H34O3NH-CO]+• khẳng định có 32 nguyên tử C trong phần acid. Từ đây ta xác định được số phân tử cacbon của mạch bazơ còn lại là 18 cacbon. Vị trí của nối đôi trên mạch bazơ được xác định tại vị trí C-8/C-9 nhờ sự phân tích tỉ mỉ các tương tác C-H trên phổ HMBC. Cấu hình của các nối đôi được xác định dựa trên sự chuyển dịch về trường thấp của hai cacbon bên cạnh với C-8/C-9 là E do có C-7 (δC 32,3) và C-10 (δC 32,2); và với C-10'/C-11' là Z do có C-9' (δC 28,9) và C-12' (δC 28,9). Kết hợp với tài liệu tham khảo [27] cho phép kết luận hợp chất NTH24.2 là một cerebroside có tên gọi 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được công bố phân lập từ tự nhiên.

HN

OH

OH

OOH

OOH

HHO

OHO

OH

3'1'

2'4'

5'

6'

7'

8' 10'

1

2

3 56 8

9 1112

13

22'

18

32'

1''

11'

12'

13'

4.6.3. Các hợp chất được phân lập từ cây mễ tử liễu

Từ các phần chiết toàn bộ cây mễ tử liễu đã phân lập và xác định cấu trúc 20 hợp chất bao gồm

COOH2412

16 28

Axit montanic (MTH8.1)

- Mới trong cây

17

18

19

21 22

5

24

26

27

28

29

HO3

Stigmasterol (MTH11)

HO

17

18

19

20

22

5

24

26

27

28

29

3

β-Sitosterol (MTH10)

H3C

HO

CH3

HH

1

3 5

89

12

14 16

18

19

21

22

30

28

27

26

24 23

25

29

Lupeol (MTH13) - Mới trong cây

H3C

HO

COOH

HH

1

3 5

89

12

14 16

18

19

21

22

30

28

27

26

24 23

25

29

Acid betulinic (MTH16)

O

O

HO

OH

1

3456

7

8 1'

3'

5'

Chrysin (MTE2.4)

Mới trong cây

19

O

17

18

19

2122

5

24

26

27

28

29

3OH

HOHOOH

OH

Daucosterol (MTH18)

OHO

OH

OH O

2

34

5

1'

3'

6'

79

10 OH

Kaempferol (MTE2.9.9)

O

OOH

HO

OH

OHOH

2

346

8

10

1'

4'

6'

Quercetin (MTE2.5)

O

OO

HO

OH

OH

2

45

79

1'

3'

O OH

OHOH

1''

4''

6''

3

Kaempferol 3-O-α-L-

rhamnopyranosid (MTE2.10.1) Mới trong cây

2

45

79

1'

3'

1''4''

5''

3

O

OO

HO

OH

OHOH

OOH

OH

HO

Quercetin 3-O- β-D-arabinopyranosid

(MTE2.10.3)

O

O

HO

OHOH

OH O

2

34

5

1'

3'

6'

79

10

3''

4''

6''

1''O

OH

OHOH

CH2OH

Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid

(MTE2.9)- Mới trong cây

O

OO

HO

OH

OH

2

45

79

1'

3'

1''

5''

O

OH

OH

HO 2"3"

4"

Kaempferol 3-O-α-L-arabinofuranosid

(MTE3.4) -Mới trong cây

O

OH

O

HO

OH

O

OH

HO

HOOH

2

34105

6

7 8 9 1'

2'3'

4'

5'

6'

1''

2''

3''4''

5''

6''

Vitexin (MTE5) Mới trong cây

O

OO

HO

OHOH

OOH

OHOH

CH2O

OHOH

OHO

2

2'

6'

1''1'''

8

6

OH

Rutin (MTB4)

O

OH

OOH

2

345

6

7 91'

4'

6'

OHOHOOH

O

OH

Apigenin-7-O-β-D-glucopyranosid (MTE8.1)

O

OO

HO

OH

OH

2

45

79

1'

3'

1''O

HOOH

OHOH

2" 4"

6"

Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (MTE3.8) Mới trong cây

O

OO

HO

OCH3OH

OOH

OOH

CH2

O

OHOH

OH

O

OHOH

OH O

2

2'

6'

1''

1''''

1'''

8

6

OH

Isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinoside

(MTB6) -Mới trong chi Polygonum

O

OO

HO

OHOH

OO

OHOH

O

OHOH

OH

2

2'

6'

1''1'''

8

6

OH

OOH

OHOH1''''

O HO

Quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-

glucopyranoside (MTB10.2) -Mới trong chi Polygonum

O

OO

HO

OH

OH

2

45

79

1'

3'

1''O

HOOH

OH

OH

2" 4"

6"

OH

Quercetin 3-O--D-glucopyranosid

(MTE4) -Mới trong cây

20

Isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Hợp chất MTB6 có dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 185-188oC. Phổ ESI-MS của MTB6 chỉ ra pic ion phân tử ở m/z 793,1 [M+Na]+, 769,1 [M-H]- tương ứng với khối lượng phân tử M=770 đvC, công thức phân tử C34H42O20.

Trên phổ 1H-NMR cho các tín hiệu cộng hưởng của 5 proron vòng thơm tại H 6,21-7,96 ppm và một tín hiệu của proton metyl metoxy ở δH 3,99 ppm và tín hiệu của các proton trong ba vòng đường H 3,24-5,74 ppm. Phân tích kỹ phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu H 6, 21 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6) và H 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8) đặc trưng cho hai proton ở vị trí meta trong vòng A thế ở vị trí 5, 7 của một flavonol. Ba tín hiệu proton khác ở H 7,96 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 7,60 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6') và 6,93 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5') thuộc về vòng thơm còn lại (vòng B). Các dữ kiện trên cho ta giả thiết MTB6 là một flavonoid glycosid có nhân isorhamnetin. Nhân isorhamnetin này được khẳng định chắc chắn khi phân tích thêm phổ 13C-NMR với tín hiệu của 16 cacbon trong đó một cacbon cacbonyl ở C 175,9 (C-4), 5 nhóm metin thơm ở C 99,8 (C-6), 94,7 (C-8), 114,5 (C-2'), 116,1 (C-5'),123,4 (C-6'), 9 cacbon bậc 4 ở C 158,4 (C-2), 134,3 (C-3), 163,1 (C-5), 165,7 (C-7), 158,6 (C-9), 105,9 (C-10), 123,7 (C-1'), 148,4 (C-3'), 150,6 (C-4'). Ngoài ra tín hiệu ở C 57,0 đặc trưng cho nhóm metyl metoxy.

So sánh số nguyên tử cacbon của MTB6 (34 C) với isorhamnetin (16 C), kết hợp phân tích các tín hiệu cộng hưởng của ba proton trong vùng H 3,24 - 5,74 ppm cho thấy MTB6 phải chứa 3 đường. Trong đó hai đường được xác định là rhamnose đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng proton doublet rất mạnh ở C 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, H-6''') 0,94 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6'''') của nhóm CH3. Đường còn lại là glucose với proton anome ở C 5,75 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1'') gắn trực tiếp vào nhân isorhamnetin tại vị trí C-3 (C 134,3) và liên kết với hai đường rhamnose ở vị trí C-2'' và C- 6''. Điều này được khẳng định qua tương tác HMBC của H-6'' với C-1''' và H-1'''' với C-2''. Vị trí liên kết chính xác của các proton và cacbon trong hợp chất MTB6 được xác định bằng cách phân tích kỹ các phổ HMBC và HSQC. So sánh các dữ liệu phổ của MTB6 với tài liệu tham khảo [51] cho kết luận chất MTB6 phân lập được là isorhamnetin-3-O-[2-α-L-rhamnopyranosyl]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6))-β-D-glucopyranosid hay isorhamnetin 3-O-(2-rhamnosyl) rutinosid. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ chi Polygonum

HMBC:H C

O

OO

HO

OCH3OH

OOH

OOH

CH2

O

OHOH

OH

O

OHOH

OH O

2

2'

6'

1''

1''''

1'''

8

6

OH

O

OO

HO

OCH3OH

OOH

OOH

CH2

O

OHOH

OH

O

OHOH

OH O

2

2'

6'

1''

1''''

1'''

8

6

OH

Quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2) -chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MTB10.2 cho các đặc trưng của một flavonoid glycosid. Trong đó phần aglycon được xác định là quercetin. Khi so sánh số cacbon của hợp chất MTB10.2 với quercetin cho thấy khả năng có mặt của 3 đơn vị đường trong cấu trúc của hợp chất này. Dựa vào việc phân tích các dữ kiện phổ 1D-NMR cho phép xác định có 2 đơn vị đường β-glucose và một đường α-L-rhamnose. Vị trí liên

21

kết của các đường với nhân quercetin và giữa các đường với nhau được xác định dựa trên phổ HMBC. Trên phổ HMBC cho tương tác của proton anome của đường β-glucose ở δH 5,30 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1'') với cacbon δC 134,9 (C-3) chứng tỏ đường β–glucose này liên kết với nhân quercetin theo liên kết 3-O-glycosid. Điểm đáng chú ý trong vùng cộng hưởng cacbon của đường xuất hiện pic chuyển dịch ở δC 82,6 (C-3''), cacbon này cho tương tác với proton anome của đường glucose thứ 2 ở δH 4,78 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''') cho ta hình dung về mối liên kết (1→3)-glucosid giữa hai đường này. Tiếp tục phân tích tương quan HMBC giữa đường rhamnose với nhân quercetin và hai đường còn lại cho thấy đường này phải liên kết với glucose thứ hai theo liên kết (1→6)- glycosid bởi tương tác giữa proton δH 4,51 (1H, d, J= 1,0 Hz, H-1'''') với cacbon δC 68,1 (C-6'''). Từ các phân tích trên kết hợp với tài liệu tham khảo [154] cho phép kết luận về cấu trúc của hợp chất MTB10.2 là quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ chi Polygonum

HMBC:H C

O

OO

HO

OHOH

OO

OHOH

O

OHOH

OH

2

2'

6'

1''1'''

8

6

OH

OOH

OHOH1''''

O HO

O

OO

HO

OHOH

OO

OHOH

O

OHOH

OH

2

2'

6'

1''

8

6

OH

OOH

OHOH1''''

O HO

4.7. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ CHẤT TINH KHIẾT

14 hợp chất được lựa chọn để thử hoạt tính chống oxy hóa dựa trên tiêu chí hoặc chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng này, hoặc đại diện cho chất, dãy chất được phân lập. Kết quả cho thấy trong 14 hợp chất được nghiên cứu, có 5 hợp chất là 3′-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1), acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4-imidazolidinyl]-carbamic (TLE5), ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3), isorhamnetin-3-O-rhamnosyl-rutinosid (MTB6), quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2) thể hiện hoạt tính quét gốc DPPH với giá trị EC50 <128 µg/ml. Trong số 5 chất có hoạt tính, hợp chất TLE1.1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ EC50 3,2 (µg/ml) mạnh hơn chất đối chứng là quercetin EC50 10,82 (µg/ml)

22

Bảng 4.6. Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của các chất tinh khiết

TT Tên mẫu EC50 (µg/ml)

TT Tên mẫu EC50 (µg/ml)

1 (TLE1.1)

3′-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid 3,20 8 MTB10.2

Quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid

45,92

2 Acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic (TLE5)

31,50 9 Ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3)

39,08

3 3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9) >128 10 Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranoside (TLB4)

>128

4 6-Geranyl-7-hydroxy-8-methoxy-coumarin (TLH29)

>128 11 Isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6) 50,40

5 Methyl maslinat (NTH24.1) >128 12 Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (MTE3.8) >128

6 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2′-hydroxyditriaconta- 10′-enoylamino]-8-octadecaene-1, 3, 4-triol (NTH24.2)

>128 13 3-methoxy-4-hydroxyacetophenone (NTB4) >128

7 Zedoalacton B (NTE1.6) >128 14 1, 3-diferuloyl O-Z-β-D-fructofuranosyl (1→2)-α-D-glucopyranosid (TLB11)

>128

chất tham khảo: Quercetin 10,82

23

KẾT LUẬN

Luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học một số loài cây thuộc chi Polygonum, họ Rau răm (Polygonaceae)” đã thu được các kết quả chính sau:

1. Đã xây dựng được quy trình chiết để phân bố các hợp chất hữu cơ từ bộ phận thân rễ của thân rễ của cây thồm lồm gai (Polygonum perfoliatum L.), cây nghể trắng (Polygonum barbatum L.) và toàn bộ cây mễ tử liễu (Polygonum plebeium R.Br) theo độ phân cực tăng dần vào các phần chiết n-hexan (TLH- 0,68%, NTH - 1,61%, MTH - 2,87%), etyl axetat (TLE - 4,00%, NTE - 2,04%, MTE - 2,85%), n-butanol (TLB - 1,89%, NTB - 1,43%, MTB - 1,66%) và nước (TLW - 4,20%, NTW -3,07%, MTW - 3,84%).

2. Đã định tính sự có mặt của các nhóm chất bằng phản ứng hóa học trong các bộ phận khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu và cho thấy các hợp chất phytosterol, phenolic, flavonoid là lớp chất có mặt chủ yếu ở ba cây này.

3. Đã phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết nhận được để xác định các điều kiện sắc ký định tính các phần chiết này và các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột các phần chiết.

4. Bằng các kỹ thuật sắc ký điều chế đã phân lập được 72 hợp chất, trong đó có 30 hợp chất từ các phần chiết (TLH, TLE, TLB) thân rễ cây thồm lồm gai, 22 hợp chất từ các phần chiết (NTH, NTE, NTB) thân rễ cây nghể trắng, 20 hợp chất từ các phần chiết (MTH, MTE, MTB) cây mễ tử liễu.

5. Đã xác định được cấu trúc của 61 hợp chất trong đó 24 hợp chất từ cây thồm lồm gai, 17 hợp chất từ cây nghể trắng, 20 hợp chất từ cây mễ tử liễu dựa trên các tính chất vật lý, hóa học, các dữ kiện quang phổ thực nghiệm (EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, và các chất đối chiếu. Cụ thể:

Từ các phần chiết thân rễ cây thồm lồm gai đã phân lập được các hợp chất: β-sitosterol (TLH4), musizin (TLH5), 3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9), 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1,3,4-triol (TLH23), 6-geranyl-7-hydroxy-8-methoxy-coumarin (TLH29), 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1), physcion (TLE1.1.2), trans-4-hydroxymellein (TLE1.1.4), daucosterol (TLE1.2), quercetin (TLE1.3), 3,3′,4-trimethoxy 4'-O--L-rhamnopyranosid ellagic acid (TLE1.4), myricetin (TLE1.5), acid chlorogenic (TLE1.7), 4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavone (TLE1.8), myricetin-3-α-L-rhamnosid (TLE 1.9), (-)-epicatechin (TLE2.1), maltose (TLE2.1.3), quercetin-3-O- β-D-glucuronid (TLE2.1.4), (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (TLE2.6), quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid (TLE3), acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic (TLE5), kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4), 1-3-diferuloyl O-Z-β-D-fructofuranosyl (1→2)-α-D-glucopyranosid (TLB11), lyoniside (TLB13).

Từ các phần chiết thân rễ cây nghể trắng đã phân lập được các hợp chất: Acid margaric (NTH1), β-sitosterol (NTH2), asperglaucide (NTH6), methyl maslinat (NTH24.1), 1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol (NTH24.2), acid ursolic (NTH26.2), acid oleanolic (NTH26.3), daucosterol (NTH30), zedoalactone B (NTE1.6), isorhamnetin (NTE2.4.2), acid isoferulic (NTE2.6.1), acid gallic (NTE2.6.2), acid benzoic (NTE2.7.1), uvaol (NTE3), ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3), 3-methoxy-4-hydroxyacetophenone (NTB4), 3,4,5-trimethoxyphenol-1-O-β-D-glucopyranosid (NTB8), acid 3,4,5-trihydroxycyclohex-1-enecarboxylic (NTB11).

Từ các phần chiết toàn bộ cây mễ tử liễu đã phân lập được các hợp chất: acid montanic (MTH8.1), β-sitosterol (MTH10), stigmasterol (MTH11), lupeol (MTH13), acid betulinic (MTH16), daucosterol (MTH18), chrysin (MTE2.4), quercetin (MTE2.5), quercetin 3-O-galactopyranosid (MTE2.9), kaempferol

24

(MTE2.9.9), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosid (MTE2.10.1), quercetin 3-O- β-D-arabinopyranosid (MTE2.10.3), kaempferol-3-α-L-arabinofuranosid (MTE3.4), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (MTE3.8), quercetin 3-O--D- glucopyranosid (MTE4), vitexin (MTE5), apigenin-7-O-glucopyranosid (MTE8.1), rutin (MTB4), isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6), quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2)

Trong số các hợp chất phân lập được hợp chất TLH23, NTH24.2 thuộc lớp chất sphingoglycolipid chưa có công bố trên tạp chí khoa học. Hợp chất TLH23, TLH29, TLE1.1, TLE5, TLB4, NTH24.2, NTE1.6, NTB8, MTB6, MTB10.2 lần đầu tiên được công bố phân lập từ chi Polygonum.

Chất NTH24.1, TLH5, TLH9, TLH29, TLE1.1, TLE1.1.4, TLE5, TLB4, TLB11, TLB13 lần đầu tiên được công bố phân lập từ cây thồm lồm gai.

Chất NTH1, NTH6, NTH24.1, NTH26.2, NTH26.3, NTE1.6, NTE2.4.2, NTE2.6.1, NTE2.6.2, NTE2.7.1, NTE3, NTB3, NTB4, NTB8, NTB11 được công bố phân lập từ cây nghể trắng.

Chất MTH8.1, MTE2.4, MTE2.9, MTE2.10.1, MTE3.4, MTE3.8, MTE4, MTE5, MTE8.1, MTB6, MTB10.2 lần đầu tiên được công bố phân lập từ cây mễ tử liễu.

6. Luận án đã tiến hành thử tác dụng độc tế bào (invitro) của các cao chiết metanol, EtOH 90%, nước từ bộ phận khác nhau ba đối tượng nghiên cứu trên các dòng tế bào khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela). Kết quả cho thấy các cao chiết EtOH 90% của cả ba đối tượng nghiên cứu đều thể hiện tác dụng độc tế bào mạnh hơn các cao chiết còn lại của cùng một cây cũng như phụ thuộc vào từng dòng tế bào. Kết quả nghiên cứu này lần đầu tiên được công bố trong luận án này.

7. Luận án đã tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa của các cặn chiết và một số hợp chất được chọn trong số các chất phân lập được. Kết quả cho thấy cả ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu đều có khả năng dọn gốc tự do DPPH và ABTS+•. Trong đó cây nghể trắng cho tác dụng loại DPPH cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml, tiếp đó là cây mễ tử liễu với IC50 = 55,60 ± 3,92 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 107,50 ± 3,95 µg/ml. Cây mễ tử liễu cho tác dụng quét gốc ABTS+• cao nhất với IC50 = 26,50 ± 5,92 µg/ml, tiếp đó là cây nghể trắng với IC50 = 29,83 ± 6,60 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 48,57 ± 8,874 µg/ml với chất đối chứng Trolox IC50 =9,47 ± 0,25 µg/ml

Trong 14 hợp chất được nghiên cứu, có 5 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ, chống tác nhân oxi hóa DPPH tốt là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1), acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic (TLE5), ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3), isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinoside (MTB6), quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranoside (MTB10.2) với giá trị EC50 <128 µg/ml. Trong số 05 các chất có hoạt tính, hợp chất TLE1.1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ EC50 3,2 (µg/ml), mạnh hơn rất nhiều so với chất đối chứng là quercetin EC50 10,82 (µg/ml).

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Văn Đậu, Trần Thanh Hà, Đới Thị Hồng (2014), “Nghiên cứu ban đầu về

thành phần hóa học cây thồm lồm gai (Polygonum perfoliatum L.)”, Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tập 30, số 5S, 53-58.

2. Tran Thanh Ha, Nguyen Van Dau, Nguyen Thi Dung, Nguyen Minh Khoi (2014),

“Preliminary study on the chemical constituents from the rhizome of Polygonum barbatum L. in

Vietnam”, Journal of Medicinal Materials, 19 (3), pp 309-312.

3. Nguyễn Văn Đậu, Trần Thanh Hà, Đặng Thị Chín, Nguyễn Thị Hà (2015), “Flavonoid

phân lập từ cặn chiết etyl axetat cây mễ tử liễu”, Tạp chí Hóa học, tập 53 (4e2), tr.160-165.

4, Trần Thanh Hà Nguyễn Văn Đậu, Nguyễn Minh Khởi, Đỗ Thị Hà (2015),

“Phytosterol và triterpen phân lập từ cặn n-hexan cây mễ tử liễu”, Tạp chí dược liệu- 20 (4), 231-

235.

5, Trần Thanh Hà, Nguyễn Văn Đậu, Nguyễn Thị Dung (2015), Nghiên cứu thành phần

hóa học của cây nghể trắng (Polygonum barbatum L.), Tạp chí Hóa học, tập 53(6e1,2), tr 27-32.

6. Trần Thanh Hà, Nguyễn Văn Đậu, Đỗ Thị Hà (2016), Dẫn xuất kaempferol phân lập

từ cây Mễ tử liễu (Polygonum plebeium R.Br)", Tạp chí Nghiên cứu dược và thông tin thuốc,

7(1), trang 31-35.

7. Tran Thanh Ha, Nguyen Van Dau, Nguyen Thi Minh Nguyet, Do Thi Ha, Nguyen

Dinh Tuan (2016), Chemical Constituents from n-butanol Extract of Polygonum barbatum L.

Collected in Vietnam, Journal of Medicinal Materials, 21(3), pp.189 -193.

8. Tran Thanh Ha, Nguyen Van Dau, Do Thi Ha, Tran Thi Hien (2016), “Screening for

cytotoxicity activity of three Polygonum species”, Journal of Medicinal Materials, 21(5), pp.325

-329.