ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Trần Minh Hải

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO NANO BẠC ỨNG

DỤNG TRONG SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

Ngành: Vật lý kỹ thuật

HÀ NỘI - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Trần Minh Hải

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO NANO BẠC ỨNG

DỤNG TRONG SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

Ngành: Vật lý kỹ thuật

Cán bộ hướng dẫn: TS. Trần Đăng Khoa

HÀ NỘI - 2011

Lời cảm ơn

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Đăng Khoa đã tận tình chỉ

bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để thực hiện khóa luận tốt

nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Viện Vi sinh vật và Công

nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, đã nhận xét, góp ý cho khóa luận của tôi.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Phạm Thị Bích Đào, Viện Vi sinh vật và

Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. CN. Nguyễn Thị Hòa, Khoa Vật lý kỹ

thuật và Công nghệ nano, Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã hướng dẫn,

tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tập thể các Thầy, Cô giáo và cán bộ của Khoa Vật lý

kỹ thuật và Công nghệ nano, Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cung cấp

các kiến thức tiền đề để tôi hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi rất

nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.

Tóm tắt nội dung

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hạt nano rất được quan tâm bởi những

tính chất đặc biệt và lý thú của nó. Trong số các loại hạt nano được nghiên cứu, ứng

dụng thì hạt nano bạc đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vượt trội.

Trên thế giới nano bạc đã được nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng trong rất nhiều các sản

phẩm gần gũi với đời sống như: tẩm trên băng cứu thương, phủ lên các loại sợi vải, sử

dụng để chống nhiễm khuẩn nước sinh hoạt, các đồ dùng cho trẻ em... Ở Việt Nam, việc

nghiên cứu, chế tạo vật liệu nano nói chung, nano bạc nói riêng vẫn còn khá mới mẻ và

mới được tiến hành trong thời gian gần đây.

Với mục đích nghiên cứu những tính chất lý thú của keo nano bạc, tôi đã thực

hiện chế tạo hạt nano bạc bằng phương pháp hóa khử bọc PVP và PEG. Nghiên cứu,

khảo sát tính chất của hạt nano bạc bằng UV-vis và FE-SEM, tiến hành thử nghiệm khả

năng kháng khuẩn và tương tác của nano bạc chế tạo với nấm mốc và vi tảo.

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, với sự hướng dẫn của

TS. Trần Đăng Khoa. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây. Những

nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các

tác phẩm, tạp chí và các trang web được liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo của

khóa luận.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2011

Sinh viên thực hiện khóa luận

Trần Minh Hải

Mục Lục

Trang\

MỞ ĐẦU.................................................................................................................1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................2

1.1. Khái quát về công nghệ nano..............................................................................2

1.1.1. Lịch sử hình thành của công nghệ nano........................................................2

1.1.2. Cơ sở khoa học..............................................................................................2

1.1.3. Các nghiên cứu về hạt nano trong và ngoài nước.........................................3

1.2. Khái quát về keo nano bạc..................................................................................4

1.2.1. Sơ lược về tính chất và đặc tính của bạc.......................................................4

1.2.2. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano bạc..................................................5

1.2.3. Cơ chế ổn định hạt bạc của PVP và PEG......................................................8

1.2.4. Ứng dụng của keo nano bạc........................................................................10

1.3. Khái quát về vi khuẩn........................................................................................12

1.3.1. Khái niệm chung về vi khuẩn......................................................................12

1.3.2. Vi khuẩn E.coli............................................................................................12

1.3.3. Vi khuẩn Staphylococcus............................................................................13

1.3.4. Tính diệt khuẩn của keo nano bạc...............................................................14

1.4. Khái quát về nấm mốc.......................................................................................16

1.5. Khái quát về tảo...................................................................................................17

1.5.1. Khái niệm chung về tảo lục.........................................................................17

1.5.2. Vi tảo Chlorella...........................................................................................17

Chương 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM. 19

2.1. Vật liệu, trang thiết bị sử dụng.........................................................................19

2.1.1. Các dụng cụ, thiết bị nghiên cứu.................................................................19

2.1.2. Các hoá chất sử dụng..................................................................................20

2.1.3. Các đối tượng nghiên cứu...........................................................................20

2.2. Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm.....................................................20

2.2.1. Chế tạo keo nano bạc..................................................................................20

2.2.2. Phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ UV-vis..........................................22

2.2.3. Phân tích hạt bằng FE-SEM........................................................................22

2.2.4. Khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc.............................................22

2.2.5. Thử nghiệm sự tương tác giữa keo nano bạc với nấm mốc........................23

2.2.6. Nuôi cấy vi tảo............................................................................................23

2.2.7. Sự tương tác giữa keo nano bạc với tảo vi tảo............................................26

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................27

3.1. Chế tạo keo nano bạc..........................................................................................27

3.2. Phân tích hạt bằng tia UV-vis...........................................................................29

3.3. Phân tích hạt bằng FE-SEM.............................................................................30

3.4. Khả năng kháng khuẩn của các dung dịch keo nano bạc..........................31

3.5. Sự tương tác giữa keo nano bạc với nấm mốc..............................................32

3.6. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi tảo..............................................................32

3.7. Sự tương tác giữa keo nano bạc với vi tảo.....................................................35

3.7.1. Đường cong chuẩn hóa giữa mật độ quang với mật độ tảo.........................35

3.7.2. Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo trong dung dịch..............36

3.7.3. Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp.....39

KẾT LUẬN...........................................................................................................41

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO..................................................................42

PHỤ LỤC..............................................................................................................43

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................47

Danh mục chữ viết tắt

Da Đơn vị khối lượng Danton

E.coli Vi khuẩn E.coli Escherichia Coli

FE-SEM Kính hiển vi trường điện tử quét Field emission scanning

electron microscopy

PVP Polyvinyl pyrrolidon

PEG polyethylene Glycol

UV - vis Quang phổ hấp thụ trắc quang UV - vis Ultraviolet-visible

spectroscopy

MỞ ĐẦU

 Khoa học, công nghệ nano là một lĩnh vực khoa học và công nghệ mới, phát

triển rất nhanh chóng. Vật liệu được chế tạo bằng công nghệ này thể hiện nhiều tính

chất mới lạ do hiệu ứng kích thước. Khoa học và công nghệ nano trên cơ sở kết hợp đa

ngành đã tạo nên cuộc cách mạng về khoa học kỹ thuật. Hiện nay, nhiều quốc gia trên

thế giới xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn để đầu tư phát triển. Ước tính tổng

đầu tư cho lĩnh vực công nghệ nano trên toàn thế giới xấp xỉ 3 tỷ đôla và đã có hàng

trăm sản phẩm của công nghệ nano được thương mại, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

như điện tử, hóa học, y sinh, môi trường….[5,10].

Trong công nghệ nano thì hạt nano là một vật liệu quan trọng. Một trong những

hạt nano được sử dụng sớm và rộng rãi nhất là hạt nano bạc. Ở kích thước nano bạc

thể hiện những tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác biệt và vô cùng quý giá, đặc

biệt là tính kháng khuẩn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano, hoạt tính

sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50.000 lần so với bạc ion [15,9]. Nhờ khả năng

kháng khuẩn tuyệt vời mà nano bạc đã được ứng dụng trong rất nhiều sản phẩm như:

tẩm trên băng cứu thương, phủ lên các loại sợi vải, sử dụng để khử trùng nước, các đồ

dùng cho trẻ em....

Trong những năm gần đây, việc gia tăng vi khuẩn siêu kháng thuốc kháng sinh,

các loại nấm gây bệnh thiếu thuốc đặc trị thì việc nghiên cứu chế tạo sản phẩm chứa

nano bạc để tiêu diệt chúng là hướng đi mới và cấp thiết [17].

Đó là lý do mà tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu và chế tạo nano bạc ứng

dụng trong sinh học”. Các nội dung của đề tại như sau:

+ Chế tạo hạt nano bạc bằng phương pháp hóa khử, sử dụng NaBH4 làm

tác nhân khử, hạt được bọc bởi PVP và PEG.

+ Nghiên cứu, khảo sát tính chất của keo bạc nano chế tạo bằng phân tích

quang phổ hấp thụ UV-vis, và chụp ảnh bằng FE-SEM.

+ Ứng dụng để nghiên cứu khả năng diệt khuẩn và khả năng tương tác với

nấm mốc, vi tảo của keo bạc nano.

1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về công nghệ nano

1.1.1. Lịch sử hình thành của công nghệ nano

Thuật ngữ công nghệ nano (nanotechnology) xuất hiện từ những năm 70 của

thế kỷ XX, chỉ việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ

thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanômét. Chúng có độ

chính xác rất cao 0,1 - 100nm, tức là chính xác đến từng lớp nguyên tử, phân tử.

Tiền tố nano xuất hiện trong tài liệu khoa học lần đầu tiên vào năm 1908, khi

Lohman sử dụng nó để chỉ các sinh vật rất nhỏ với đường kính 200nm. Năm 1974,

Tanigushi lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ công nghệ nano hàm ý sự liên kết các vật

liệu cho kỹ thuật chính xác trong tương lai. Hiện tại trong khoa học, tiền tố nano biểu

thị con số 10-9 tức kích thước 1 phần tỷ mét. Cho tới nay, vẫn chưa có được một định

nghĩa thống nhất về công nghệ nano. Theo cơ quan Hàng Không Vũ trụ Hoa Kỳ

(NASA), công nghệ nano là công nghệ chế tạo ra các cấu trúc, vật liệu, thiết bị và hệ

thống chức năng với kích thước đo bằng (khoảng từ 1 đến 100nm) và khai thác ứng

dụng các đặc tính độc đáo của những sản phẩm này. Công nghệ nano cũng có thể hiểu

là ngành công nghệ dựa trên các hiểu biết về các quy luật, hiện tượng, tính chất của

cấu trúc vật lý có kích thước đặc trưng ở thang nano [4].

Có thể nói, trong thời điểm hiện tại, tiềm năng phát triển của một công nghệ

hay kỹ thuật mới rõ nhất qua nguồn ngân sách nghiên cứu hàng năm và doanh thu đem

lại từ các sản phẩm thương mại của nó. Được toàn thế giới nghiên cứu và đầu tư phát

triển, ngân sách đầu tư cho công nghệ nano của các tổ chức thuộc chính phủ đã tăng

khoảng 7 lần từ 430 triệu năm 1997 lên 3 tỉ USD năm 2003 [12,23].

1.1.2. Cơ sở khoa học

Công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính:

+ Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: khác với vật liệu

khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử được thể hiện rất rõ ràng. Vì vậy

khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần tính tới các thăng giáng ngẫu nhiên. Càng ở

kích thước nhỏ thì các tính chất lượng tử càng thể hiện một cách rõ ràng hơn. Ví dụ

2

một chấm lượng tử có thể được coi như một đại nguyên tử, nó có các mức năng lượng

giống như một nguyên tử [25].

+ Hiệu ứng bề mặt: Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano

chúng có diện tích bề mặt lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối. Điều này,

có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả

năng tiếp xúc bề mặt của vật liệu, như trong các ứng dụng vật liệu nano làm chất diệt

khuẩn. Đây là một tính chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu có kích thước

nanomet so với vật liệu ở dạng khối [8].

+ Kích thước tới hạn: Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ

nguyên các tính chất về vật lý, hóa học khi ở dạng khối. Nếu kích thước vật liệu mà

nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi. Nếu ta giảm kích

thước của vật liệu đến kích cỡ nhỏ hơn bước sóng của vùng ánh sáng thấy được (400 -

700 nm), theo Mie hiện tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt" xảy ra và ánh sáng quan

sát được sẽ thay đổi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng xảy ra hiện tượng cộng hưởng.

Hay như tính dẫn điện của vật liệu khi tới kích thước tới hạn thì không tuân theo định

luật Ohm nữa. Mà lúc này điện trở của chúng sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử. Mỗi

vật liệu đều có những kích thước tới hạn khác nhau và bạn thân trong một vật liệu

cũng có nhiều kích thước tới hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng. Bởi vậy

khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì.

Chính nhờ những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên công nghệ nano

có ý nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu [24].

1.1.3. Các nghiên cứu về hạt nano trong và ngoài nước

Tình hình nghiên cứu trong nước:

Tại Việt Nam trong những năm gần đây công nghệ nano bắt đầu được đầu tư và

thu hút sự chú ý của các nhà khoa học. Tuy nhiên cho đến nay số lượng công trình

nghiên cứu về kim loại nano được công bố trên tạp trí khoa học trong nước còn rất hạn

chế. Đề tài nghiên cứu về vàng và platin nano để xúc tác chuyển hóa CO thành CO2

được tác giả Nguyễn Thiết Dũng Viện khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện khoa học và

công nghệ Việt Nam thực hiện (2009 – 2010). Về bạc, nhóm tác giả Nguyễn Đức

Nghĩa, Hoàng Mai Hà công bố trên Tạp chí hóa học (2001) đã chế tạo được hạt nano

bạc bằng phương pháp khử các ion bạc sử dụng tác nhân oleate trong polyme ổn định,

thu được các hạt bạc có kích thước từ 4 – 7nm.

3

Các nhà khoa học Việt Nam cũng bắt đầu triển khai ứng dụng công nghệ nano

trong chế tạo thuốc hướng đích và kết hoạch nghiên cứu ứng dụng của các hạt nano

trong y - sinh học để chẩn đoán và chữa bệnh. Bài báo “chế tạo và ứng dụng hạt nano

từ tính trong y sinh học” của nhóm tác giả Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoài Hà, Trần

Mậu Danh Bộ môn Vật liệu và Linh kiện từ tính nano, khoa Vật lý kỹ thuật và Công

nghệ nano, trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Trung tâm Khoa

học Vật liệu, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội báo cáo tại

hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI (2005). Tuy nhiên, công nghệ nano vẫn là một

điều gì đó mới lạ ở Việt Nam. Nói chung, công nghệ nano tại Việt Nam hiện chỉ mới

đang đặt những viên gạch móng đầu tiên.

Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Phương pháp chế tạo hạt kim loại nano nói chung và chế tạo nano bạc nói riêng

đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Phương pháp thường được sử

dụng chủ yếu là: điện hóa, khử hóa học, khử nhiệt, sinh học, khử do bức xạ ion hóa…

Nguyên tắc chung của các phương pháp này là khử ion kim loại trong dung dịch thành

nguyên tử kim loại, sau đó các nguyên tử liên kết với nhau thành tập hợp rồi phát triển

kích thước thành các hạt nano và sử dụng polyme để ổn định hạt. Hướng nghiên cứu

ứng dụng chính của nano bạc tập trung vào khả năng kháng lại các loại vi khuẩn, virut,

các ứng dụng trong các thiết bị y tế và trong các thiết bị diệt khuẩn, lọc nước.v.v

Theo nhận định của nhiều chuyên gia, công nghệ nano sẽ tạo nên một cuộc cách

mạng đột phá trong nhiều ngành khoa học và đời sống, tạo tiền đề cho một “thế giới

nhỏ hơn và thông minh hơn” [7].

1.2. Khái quát về keo nano bạc

1.2.1. Sơ lược về tính chất và đặc tính của bạc

Từ thời Alexander Đại Đế (năm 356-323 trước công nguyên), con người đã biết

sử dụng các dụng cụ bằng bạc để đựng thức ăn và đồ uống góp phần làm giảm nguy cơ

gây độc. Qua thời gian những đặc tính quý giá của bạc đã được con người khai thác và

sử dụng tạo ra nhiều sản phẩm hữu ích.

Tính chất vật lý:

+ Bạc là kim loại chuyển tiếp, màu trắng, sáng, dễ dàng dát mỏng, có tính dẫn điện

và dẫn nhiệt cao nhất và điện trở thấp nhất trong các kim loại.

4

+ Nhiệt độ nóng chảy là 961.930C [18].

Tính chất hóa học:

+ Bạc có ký hiệu là Ag, số nguyên tử 47 thuộc phân nhóm IB trong bảng tuần

hoàn các nguyên tố hóa học, bạc có khối lượng phân tử là 107.868 (đơn vị C).

+ Cấu hình electron [Kr]4d105s1 , có số oxi hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng

thái oxi hóa +1.

+ Trong tự nhiên, bạc tồn tại hai dạng đồng vị bền là Ag-107(52%) và Ag-

109(48%). Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan

trong một số axit mạnh như axit nitric, sufuric đặc nóng .v.v.

Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi chúng

được chế tạo bằng công nghệ nano. Và trên thị trường cũng đã xuất hiện nhiều sản

phẩm chứa nano bạc như băng gạc y tế, nước tẩy trùng bề mặt, hay hiện diện ngay

trong gia đình bạn như tủ lạnh, máy gặt .v.v.

1.2.2. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano bạc

Có 2 phương pháp để điều chế hạt nano kim loại bạc: phương pháp từ dưới lên

và phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên “bottom-up” là phương pháp

tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau. Phương pháp từ trên

xuống “top-down” là phương pháp tạo các hạt nano từ vật liệu khối ban đầu. Đối với

hạt nano bạc, người ta thường điều chế bằng phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là

khử ion Ag+ thành Ag. Các ion này sau đó liên kết với nhau tạo thành hạt nano và các

hạt nano này sẽ được bọc bởi các chất ổn định như PVP, PVE, chitosan.v.v. Các

phương pháp từ trên xuống ít được sử dụng vì nano bạc chế tạo bằng phương pháp này

thường có kích thước hạt lớn và không đồng đều. Hiện nay các vật liệu kim loại nano

như vàng (Au), Sắt (Fe), đồng (Cu), bạc (Ag) dưới dạng bột hay dung dịch keo được

chế tạo chủ yếu bằng các phương pháp sau:

Phương pháp bay hơi vật lý

Bay hơi vật lý là phương pháp từ trên xuống, đó là một công cụ góp phần cho

sự phát triển của công nghệ nano. Bay hơi vật lý bao gồm kỹ thuật ngưng tụ khí trơ,

đồng ngưng tụ và ngưng tụ dòng hơi phun trên bia bắn.

+ Kỹ thuật ngưng tụ khí trơ: cho hóa hơi sợi dây bạc tinh khiết ở nhiệt độ

cao trong điều kiện chân không, sau đó dòng hơi bạc nguyên tử quá bão hòa được

5

ngưng tụ và phát triển thành hạt bạc khi tiếp xúc với khí heli và được làm lạnh bởi nitơ

lỏng.

+ Kỹ thuật đồng ngưng tụ: tương tự như ngưng tụ khí trơ nhưng quá trình

hình thành và phát triển hạt xảy ra trên lớp bằng dung môi thích hợp.

Kỹ thuật ngưng tụ khí trơ và đồng ngưng tụ được thực hiện ở nhiệt độ cao

(>2.0000C), sản phẩm tạo ra có độ tinh khiết cao, kích thước hạt nano bạc trung bình

75nm(phương pháp ngưng tụ khí trơ), 12nm (phương pháp đồng ngưng tụ) [9].

Phương pháp ăn mòn laze

Đây là phương pháp từ trên xuống. Vật liệu ban đầu là một tấm bạc được đặt

trong một dung dịch có chứa chất hoạt hóa bề mặt. Một chùm laser dạng xung có buớc

sóng 532 nm, độ rộng xung là 10 ns, tần số 10Hz, năng lượng mỗi xung là 90mJ,

đường kính vùng kim loại bị tác dụng từ 1nm - 3nm. Dưới tác dụng của chùm laser

xung, các hạt nano có kích thước khoảng 10 nm được hình thành và được bao phủ bởi

chất hoạt hóa bề mặt CnH2n+1SO4Na (với n = 8, 10, 12, 14) nồng độ từ 0,001 đến 0,1 M

[16].

Phương pháp khử hóa học

Khử hóa học là một phương pháp được sử dụng phổ biến để chế tạo nano bạc

theo phương thức từ dưới lên.

+ Cơ chế của quá trình khử hóa học:

Phương pháp khử hóa học là dùng các tác nhân hóa học để khử ion bạc thành

bạc kim loại. Thông thường, phản ứng được thực hiện trong dung dịch lỏng nên còn

gọi là phản ứng hóa ướt.

Ag+ + e- → Ag0

Thông thường, nguồn cung cấp ion Ag+ là các muối của bạc như AgNO3. Các

tác nhân khử thường dùng là: natri bohydrua, focmandehyt, xitrat, etylen glyxerol,

NaBH4, ethanol,…. Gần đây có một số công trình nghiên cứu chế tạo keo nano bạc và

bột nano bạc từ bạc nitrat nhưng sản phẩm trung gian là oxit bạc (Ag2O) rồi từ Ag2O

tiếp tục khử về Ag0 nhằm thu được keo bạc có nồng độ cao. Để các hạt nano bạc phân

tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta bao phủ hạt nano bạc

bằng một lớp polyme, điều này giúp cho các hạt được bảo vệ tốt hơn tránh hiện tượng

6

kết tủa, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có tính chất cần

thiết.

+ Các tác nhân khử:

Tác nhân khử Sodium citrate “C6H5O7Na3” Trong quá trình khử, bề mặt của hạt

nano bạc hấp thụ các ion Ag+ tạo ra lớp ion dương trên bề mặt. Tiếp đó các ion âm

citrate có nghiệm vụ bám xung quanh các hạt nano bằng lực hút tĩnh điện ngăn không

cho chúng kết hợp lại với nhau. Nhờ vậy mà bề mặt của hạt nano bạc có một lớp keo

citrate giúp chúng lơ lửng và phân tán đều trong dung dịch. Citrate trong quá trình vừa

đóng vai trò làm tác nhân khử ion Ag+ để tạo thành hạt nano bạc, vừa đóng vai trò làm

chất ổn định cho hạt nano bạc.

Tác nhân khử NaBH4 khác với phương pháp sử dụng Sodium citrate, ở phương

pháp này sau khi kết thúc phản ứng khử, người ta sử dụng các polyme như PVP, PVA,

PEG, Chitosan…, làm tác nhân ổn định. Các polyme này bao bọc hạt nano bạc, ngăn

chúng kết tụ với nhau, vì vậy mà hạt nano được bảo vệ tốt và tránh kết tủa.

Phương pháp hóa siêu âm

Phương pháp hóa siêu âm là các phản ứng hóa học được hỗ trợ bởi sóng siêu

âm cũng được dùng để tạo hạt nano. Hóa siêu âm là một chuyên ngành của hóa học,

trong đó các phản ứng hóa học xảy ra dưới tác dụng của sóng siêu âm như một dạng

xúc tác. Sóng siêu âm là sóng dọc, là quá trình truyền sự co lại và giãn nở của chất

lỏng. Tần số thường sử dụng trong các máy siêu âm là 20 kHz cao hơn ngưỡng nhận

biết của tai người (từ vài Hz đến 16 kHz). Khi sóng siêu âm đi qua một chất lỏng, sự

giãn nở do siêu âm gây ra áp suất âm trong chất lỏng kéo các phân tử chất lỏng ra xa

nhau. Nếu cường độ siêu âm đủ mạnh thì sự giãn nở này sẽ tạo ra những lỗ hổng trong

chất lỏng. Sự phát triển của các lỗ hổng phụ thuộc vào cường độ siêu âm. Khi cường

độ siêu âm cao, các lỗ hổng nhỏ có thể phát triển rất nhanh. Sự giãn nở của các lỗ

hổng đủ nhanh trong nửa đầu chu kì của một chu kì sóng siêu âm, nên đến nửa sau chu

kì thì nó không có đủ thời gian để co lại nữa. Dưới các điều kiện này, kích thước của

một lỗ hổng sẽ dao động theo các chu kì giãn nở và co lại. Trong khi dao động như thế

lượng khí hoặc hơi khuyếch tán vào hoặc ra khỏi lỗ hổng phụ thuộc vào diện tích bề

mặt. Diện tích bề mặt sẽ lớn hơn trong quá trình giãn nở và nhỏ hơn trong quá trình co

lại. Do đó, sự phát triển của lỗ hổng trong quá trình giãn nở sẽ lớn hơn trong quá trình

co lại. Sau nhiều chu kì siêu âm, lỗ hổng sẽ phát triển. Lỗ hổng có thể phát triển đến

một kích thước tới hạn mà tại kích thước đó lỗ hổng có thể hấp thụ hiệu quả năng

7

lượng của sóng siêu âm. Kích thước này gọi là kích thước cộng hưởng, nó phụ thuộc

vào tần số của sóng âm. Ví dụ, với tần số 20 kHz, kích thước này khoảng 170 mm.

Lúc này, lỗ hổng có thể phát triển rất nhanh trong một chu kì duy nhất của sóng siêu

âm. Một khi lỗ hổng đã phát triển quá mức, ngay cả trong trường hợp cường độ siêu

âm thấp hay cao, nó sẽ không thể hấp thụ năng lượng siêu âm một cách có hiệu quả

được nữa. Và khi không có năng lượng tiếp ứng, lỗ hổng không thể tồn tại lâu được.

Chất lỏng ở xung quanh sẽ đổ vào và lỗ hổng bị suy sụp. Sự suy sụp của lỗ hổng tạo ra

một môi trường đặc biệt cho các phản ứng hoá học - các điểm nóng (hot spot). Hóa

siêu âm được ứng dụng để chế tạo rất nhiều loại vật liệu nano như vật liệu nano xốp,

nano dạng lỏng, hạt nano, ống nano.

1.2.3. Cơ chế ổn định hạt bạc của PVP và PEG

Cơ chế ổn định hạt bạc của PVP

Hình 1. 1. Công thức cấu tạo PVP

PVP được tổng hợp từ phản ứng trùng hợp các vinyl pyrolidon, là các polyme

ưa nước và hòa tan trong nước, không độc, được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực y tế

[20].

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, các hạt bạc hấp thụ mạnh lên bề mặt của PVP,

chuỗi polyvinyl pyrolidon tạo ra hiệu ứng không gian, ngăn cản sự kết hợp giữa các

hạt [20]. Cơ chế ổn định hạt bạc của PVP gồm các giai đoạn:

+ Đầu tiên, PVP chuyển một cặp electron từ nguyên tử oxi và nitơ trên

mạch sang các orbital s và p các ion bạc tạo nên kiên kết phối trí với ion bạc.

+ PVP thúc đẩy sự hình thành nhân của kim loại bạc do phức ion Ag+ -

PVP dễ bị khử hơn so với ion Ag+ tự do trong dung dịch vì ion Ag+ nhận điện tử từ

PVP.

+ Chuỗi PVP ngăn cản sự kết tụ của các hạt bạc do hiệu ứng không gian.

8

Hình 1.2. Cơ chế ổn định hạt nano bạc của PVP [20]

Cơ chế ổn định hạt bạc của PEG

PEG có công thức phân tử là (C4H10O3)m, là một polymer trơ, hòa tan trong

nước, không gây độc, được tạo ra bằng cách kết nối nhiều tiểu đơn vị ethylene oxide.

PEG hòa tan trong nước, methanol, benzen, diclorometan và không hòa tan trong ete

diethyl và hexane. Nó cùng với các phân tử kỵ nước dùng để sản xuất bề mặt không

ion. Các phân tử PEG hiện có khác nhau về hình thể (ở dạng thẳng hoặc phân nhánh)

và trọng lượng phân tử. PEG có trọng lượng khác nhau sẽ khác nhau về đặc tính sinh

lý. Thí dụ như PEG ở dạng tinh khiết, không kết hợp, nhỏ là dạng đầu (như PEG 200

Da), trong khi PEG lớn hơn (như PEG 8000 Da) có dạng rắn như sáp [24].

Hình 1.3. Công thức cấu tạo PEG

PEG có nhiều ứng dụng hữu ích trong y sinh do PEG có nhiều đặc tính cốt lõi

liên quan đến những lợi ích đối với các protein sử dụng trong điều trị và còn rất nhiều

ứng dụng khác trong các lĩnh vực khác nhau. PEG được sử dụng như một chất khử cho

việc chuẩn bị các hạt kim loại ở nhiệt độ cao (>1700C) và không hoạt động để giảm

lượng Ag+ ở 800C. Đáng ngạc nhiên hơn, Ag+có thể được giảm xuống đều đặn để tạo

hạt nano bạc tại cùng một điều kiện trong PEG 2000 Da. Nghiên cứu sâu hơn đã chứng

minh rằng tỷ lệ giảm của Ag+ để tạo thành hạt nano bạc được tăng cường đáng kể với

sự gia tăng chiều dài chuỗi polymer của PEG. Kích cỡ hạt nano phụ thuộc vào nhiệt độ

9

phản ứng và nồng độ của tiền chất và sự gia tăng nhiệt độ ảnh hưởng đến sự thay đổi

của phạm vi kích thước hạt từ 10-80nm.

1.2.4. Ứng dụng của keo nano bạc

Trong dân dụng

Việc sản xuất các mặt hàng tiêu dùng bằng kim loại bạc nguyên chất hoặc phủ

chúng bằng bạc là rất đắt. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, pha các

nguyên liệu khác với hạt nano bạc là một phương pháp thích hợp để khai thác tính chất

của bạc. Các hạt nano siêu nhỏ làm cho các hạt có diện tích bề mặt lớn cân đối với

khối lượng của chúng. Trường hợp bạc ở dạng hạt nano, cho phép chúng tương tác dễ

dàng với các hạt khác và tăng hiệu quả kháng khuẩn. Hiệu quả này lớn tới mức 1 gam

hạt nano bạc có thể tạo tính chất kháng khuẩn tới hàng trăm mét vuông chất nền.

Hình 1.4. Bình sữa nano silver

Hiện nay, trên thế giới đã sản xuất nhiều sản phẩm tiêu dùng có chứa nano bạc

như hộp đồ đựng thức ăn, bình sữa trẻ em làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc, hay

các thiết bị gia đình như mấy giặt, tủ lạnh.v.v. đếu sử dụng nano bạc để diệt khuẩn.

Ứng dụng trong y tế

Trong lĩnh vực y tế nano bạc được sử dụng để tẩm vào các loại băng, gạc băng

bó vết thương nhằm tránh nhiễm trùng. Hay như việc chế tạo khẩu trang có tẩm nano

bạc dùng để diệt vi khuẩn, bảo vệ con người.

10

Hình 1.5. Khẩu trang nano bạc

Ứng dụng trong công nghiệp

Sơn kháng khuẩn: Bột nano bạc được trộn với sơn và phủ lên các phím điện

thoại di động, tường nhà và các bề mặt cần được bảo vệ. Với khả năng kháng khuẩn

tuyệt vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không bị nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt nấm

mốc làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ công trình.

Hình 1.6. Sơn nano

Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu ứng dụng nano bạc để

sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Các

thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ nano sẽ có kích thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có

tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn các thiết bị sử dụng các công nghệ truyền thống

1.3. Khái quát về vi khuẩn

1.3.1. Khái niệm chung về vi khuẩn

Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào, có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân

(Prokaryote – sinh vật nhân sơ). Vi khuẩn hiện diện ở khắp mọi nơi trong đất, nước,

11

không khí, kể cả những nơi có điều kiện sống khắc nghiệt như trên miệng núi lửa hay

trên băng tuyết.v.v. Có rất nhiều chủng vi khuẩn, và mỗi chủng vi khuẩn đều có sự

khác nhau về đặc tính và hình thái.

Vi khuẩn có nhiều hình dáng: vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau và được

gọi với tên gọi theo hình dạng của chúng như trực khuẩn (bacillus), hình cầu, xoắn

khuẩn (spirillum), hình que, cầu khuẩn (coccus)… hình dáng vi khuẩn là một đặc điểm

quan trọng để nhận dạng các chi được đặt tên theo hình dạng.

Vi khuẩn có ích hoặc có hại cho môi trường, thực vật và động vật bao gồm cả

con người. Một só tác nhân gây bệnh như bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn

(typhoid fover), giang mai (syphilis), tả (cholera), lao (tuberculosis)…

1.3.2. Vi khuẩn E.coli

Phân loại khoa học:

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria

Bộ : Enterobacteriales

Họ : Enterobacteriaceae

Chi : Escherichia

Loài: E. coli

Hình 1.7. Vi khuẩn E.coli [25]

12

Đặc điểm:

E.coli hay còn gọi là vi khuẩn đại tràng, là một trong những loài vi khuẩn chính

ký sinh trong đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng được phát hiện đầu

tiên vào năm 1885 do Escherich phát hiện, thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae.

Chúng là các trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình (2-3µm) x 0.5 µm. Trong

những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ.

1.3.3. Vi khuẩn Staphylococcus

Phân loại khoa học:

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Staphylococcaceae

Chi: Staphylococcus

Hình 1.8. Vi khuẩn Staphylococcus [11]

Đặc điểm:

Staphylococcus hay tụ cầu khuẩn là những vi khuẩn hình cầu, có đường kính từ

0.8 – 1.0 µm, và thường tập trung thành từng chùm như những chùm nho, bắt màu

Gram dương [3]. Tụ cầu khuẩn có ba loại có ý nghĩa với y học là tụ cầu vàng

(S.aureus), tụ cầu da (S. epidermidis) và S. saprophyticus. Hai trong ba loại này có thể

13

gây ra các bệnh nhiễm trùng cơ hội: S.epidermidis gây nhiễm khuẩn da và viêm nội

tâm mạc, S.saprophyticus gây nhiễm khuẩn tiết niệu. Sự cư trú trong cơ thể và môi

trường bệnh viện giữa các loại tụ cầu khuẩn tiết niệu dẫn tới sự truyền cho nhau khả

năng kháng thuốc, làm cho sự kháng kháng sinh tăng lên, nhất là trong bệnh viện, càng

làm cho việc điều trị chúng bằng kháng sinh khó khăn hơn.

1.3.4. Tính diệt khuẩn của keo nano bạc

Cơ chế diệt khuẩn của keo nano bạc

Hiện nay, do vi khuẩn ngày càng kháng thuốc kháng sinh nên các nhà khoa học

đang tập trung đi tìm các tác nhân mới để diệt chúng và bạc là một trong những chất

được tập trung nghiên cứu mạnh nhất.

Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn vì bạc là

kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Nano bạc không gây phản ứng phụ,

không gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt

khuẩn (khoảng nồng độ <100ppm) [17].

Tuy nhiên cho tới nay, cơ chế kháng vi sinh vật của nano bạc vẫn chưa được

hiểu biết rõ ràng. Bằng các kỹ thuật chụp ảnh kính hiển vi điện tử có độ phóng đại cao

(FE-SEM, FE-SEM…), kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt nano bạc bám dính với các

thành phần điện tích âm trên bề mặt tế bào vi khuẩn, virut làm thay đổi tính thấm và sự

hô hấp của màng tế bào. Đồng thời các hạt bạc có kích thước nhỏ chui vào trong tế

bào, kết hợp với các enzym hay DNA có chứa nhóm sun phua hặc phốt phát gây bất

hoạt enzym hay DNA dẫn đến gấy chết tế bào [14]. Trước sự gia tăng của dòng vi

khuẩn kháng thuốc kháng sinh điển hình là Staphylococcus aureus hay các loại vi nấm

gây bệnh thực vật thiếu thuốc đặc trị thì việc lựa chọn các chế phẩm chứa nano bạc

đang rất được quan tâm.

Thông thường nồng độ bạc sử dụng cho việc kháng khuẩn và sát trùng rất thấp,

ví dụ như khoảng 5ppm cho việc diệt vi khuẩn Esherichia Coli hiệu quả đến 999% và

khuẩn Staphylococcus aureus là hơn 99%. Vì vậy, nano bạc rất hữu ích cho việc sử

dụng làm chất diệt khuẩn, diệt nấm bệnh phục vụ cho nhu cầu cuộc sống con người.

Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn của keo nano bạc

Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng trực

tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.

14

+ Kích thước hạt nano bạc là yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt

khuẩn của chúng. Hạt nano bạc có kích thước càng nhỏ thì khả năng diệt khuẩn của

chúng càng mạnh, vì khi ở kích thước càng nhỏ thì tỉ số giữa diện tích bề mặt và thể

tích càng lớn và hạt cũng có thể dễ dàng tương tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên các

hạt có kích thước nhỏ lại có khuynh hướng liên kết với nhau trong quá trình lưu trữ

tạo thành các hạt lớn hơn gây ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn và bảo quản keo

nano bạc. Do đó trong quá trình chế tạo chúng ta phải tìm ra các phương pháp vừa tạo

ra hạt nano bạc có kích thước nhỏ vừa bền vững.

+ Các hạt nano có thể có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình que,

hình cầu, hình tam giác,… Và sự thể hiện của các hạt nano bạc với cùng nồng độ, sự

phân bố nhưng với các hình dạng khác nhau là không giống nhau. Các hạt nano bạc có

hình tam giác cụt tính kháng khuẩn cao hơn các hạt hình cầu và các hạt nano que có

tính kháng khuẩn thấp nhất.

+ Keo nano bạc có nồng độ càng cao và sự phân bố đều thì khả năng diệt

khuẩn càng tốt. Tuy nhiên khi nồng độ quá cao, do năng lượng bề mặt hạt nano lớn,

nên các hạt nano bạc sẽ va chạm vào nhau và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy chúng ta

cũng cần tìm nồng độ thích hợp để các hạt phân bố đồng đều, và tránh kết tủa.

1.4. Khái quát về nấm mốc

Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống

dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh). Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa

số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm

thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loại. Đường kính

của sợi nấm thường từ 3-5µm, chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet, Các

sợi nấm phát triển dài theo kiểu tăng trưởng ngọn. Trên môi trường đặc và trên một số

cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát

triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.

Hầu hết các loại nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng.

Nhiệt độ tối ưu để nấm mốc phát triển là 25-280C và pH tốt nhất từ 5-6.5. Nấm mốc

nói chung có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử, hoặc

sinh sản hữu tính hình thành giao tử đực và giao tử cái.

Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến đời sống con người một cách trực tiếp như làm

hư hỏng, giảm phẩm chất thực phẩm. Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo…

hay gây bệnh cho người, động vật và cây trồng. Tuy nhiên, các quy trình chế biến thực

15

phẩn có liên quan đến lên men đều cần tới sự có mặt của vi sinh vật trong đó có nấm

mốc. Nấm mốc cũng giúp tổng hợp kháng sinh, một số enzym và các hoạt chất khác

dùng trong công nghiệp thực phẩm, y dược và sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới.

Hình 1.9. Chủng nấm mốc Aspergillus niger [28]

Chủng nấm mốc được sử dụng để nghiên cứu là Aspergillus còn gọi là mốc

tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuổi

bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi có thể màu vàng

(Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger). Nấm Aspergillus oryzae là loài mốc

chính trong quá trình chế tạo tương. Hai loài không độc làm tương là Aspergillus

oryzae và  Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với 2 loài rất nguy hiểm

là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tố Aflatoxin gây bệnh

ung thư.

1.5. Khái quát về tảo

1.5.1. Khái niệm chung về tảo lục

Tảo là những thực vật bậc thấp, cơ thể chưa có sự phân hoá thành rễ, thân, lá

(những dấu hiệu của thực vật bậc cao) nên cơ thể chúng được gọi chung là tản. Cơ thể

chúng có chứa sắc tố quang hợp, chúng có khả năng quang tự dưỡng, sử dụng năng

lượng ánh sáng mặt trời, để tổng hợp nên các chất hữu cơ từ các hợp chất vô cơ đơn

giản.

Tảo lục có khoảng 6.000 loài [27]. Tảo lục phân biệt với các ngành tảo khác ở

đặc điểm đầu tiên là màu lục thuần khiết của cơ thể giống như màu lục của cây cối

xung quang chúng ta . Tảo lục gồm các tế bào sống đơn độc, các tế bào sống thành tập

16

đoàn, đa dạng. Cấu trúc tế bào vi tảo lục có tốc độ tiến hoá khác nhau. Chúng phân bố

rộng khắp từ nước ngọt nghèo dinh dưỡng đến nước lợ, nước biển. Một số bộ chỉ sống

trên vật ẩm hay sống ngay dưới mặt đất. Hình dạng cấu trúc chung của tế bào vi tảo

lục rất đa dạng, có thể có dạng đơn độc hay tập đoàn: có dạng sợi, dạng hạt, dạng ống,

dạng màng,...Phần lớn tảo lục có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình vuông, hình chữ

nhật, hay hình lưỡi liềm.

Tảo lục có vai trò quan trọng trong tự nhiên và đời sống nhân loại [6]. Tảo lục

là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng cho người và động vật, chúng có khả năng

xử lý ô nhiễm môi trường, dùng làm chất chỉ thị sinh học.v.v.

1.5.2. Vi tảo Chlorella

+ Phân loại khoa học:

Ngành: Chlorophyta

Lớp: Trebouxiophyceae

Bộ: Chlorellales

Họ: Chlorellaceae

Chi: Chlorella [21]

Hình 1.10. Vi tảo Chlorella elipsoidea [22]

+ Đặc điểm:

Vi tảo Chlorella là một chi tảo đa dạng, được Beijerinck mô tả lần đầu tiên vào

năm 1890, vi tảo Chlorella hiện có tổng cộng 38 loài. Chúng gồm các tảo tế bào đơn

bào có hình cầu hay hình ovan, không di động, đường kính không vượt quá 15 µm.

17

Màng tế bào vi tảo Chlorella mỏng chứa cellulose, tế bào chất là dịch trong suốt, chứa

thể màu hính chén chứa chlorophyll a và b, thể màu lớn, chiếm phần lớn thể tích tế bào

với một hạt tạo bột (pyrenoid). Tế bào chỉ có một nhân, thường không nhìn thấy rõ [1].

Vi tảo Chlorella có phương thức sinh sản vô tính nên tính trạng di truyền của

chúng là ổn định. Vi tảo Chlorella rất phổ biến, sinh trưởng nhanh, hệ số sử dụng năng

lượng ánh sáng cao và không đòi hỏi khắt khe về điều kiện sống [2]. Những đặc tính

này khiến cho vi tảo Chlorella được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu ứng

dụng.

Về mặt sinh lý, quá trình quang hợp của tảo vi tảo Chlorella cũng diện ra tương

tự như với các thực vật bậc cao. Vi tảo Chlorella có thể quang hợp tốt trong điều kiện

bình thường, hệ số sử dụng năng lượng mặt trời còn cao hơn cả thực vật bậc cao. Ở

Việt Nam, vi tảo Chlorella đã được nhập nội để nghiên cứu và ứng dụng từ đầu những

năm 1960 [2]. Chúng được sử dụng chủ yếu vào mục đích xử lý nước thải.

18

Chương 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. Vật liệu, trang thiết bị sử dụng

2.1.1. Các dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Sử dụng các thiết bị sẵn có tại các phòng thí nghiệm sau:

Phòng thí nghiệm micro-nano, khoa Vật lý kỹ thuật & Công nghệ nano, trường

Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội: Máy khuấy từ có gia nhiệt RCT

basic, máy đo pH để bàn sension3, máy ảnh canon power shot G10, kính hiển vi

Zeiss, tủ nuôi cấy Class II, buồng đều nhiệt có lắc Shaking Incubator, lò vi sóng

Microwave, cân phân tích GR-200, tủ ấm BD 115.

Phòng thí nghiệm quang tử, khoa Vật lý kỹ thuật & Công nghệ nano, trường

Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội: Máy đo quang phổ hấp thụ

UV/VIS/NIR V-570.

Phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật và các phòng khác thuộc

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội: Buồng

đếm Neubauer, kính hiển vi quan học (Zeiss), Máy đo pH Osi.

Máy FE-SEM 4800, tại viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Các hoá chất sử dụng

Các hóa chất sử dụng: AgNO3, NaBH4, PVP (40.000Da), PEG (4.000Da), HCl,

NaCl, nước khử ion.

Các môi trường nuôi cấy: Nuôi cấy tảo BBM, BG II, C (xem phụ lục C), nuôi

cấy khuẩn LB đặc, LB lỏng (xem phụ lục A), nuôi cấy nấm mốc Czapek (xem

phụ lục B).

2.1.3. Các đối tượng nghiên cứu

Vi tảo dùng trong nghiên cứu này là loài Chlorella elipsoidea. Được cung cấp

bởi phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia

Hà Nội.

19

Hai chủng vi khuẩn E.coli VTCCB 883, Staphylococus aureus VTCCB 484, và

chủng nấm mốc ASP.Nigger-F15. Được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh

vật học, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

2.2. Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

2.2.1. Chế tạo keo nano bạc

Chuẩn bị các hoá chất cần thiết với các nồng độ cho trước như sau:

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong chế tạo keo nano bạc

Hóa chất Nồng độ Thể tích

NaBH4 0,002M 100ml

AgNO3 0,001M 4ml

PVP (40.000Da) 0,3% 0,5ml

PEG (4.000Da) 0,3% 0,5ml

NaOH 1M 10ml

Các bước tiến hành:

+ Cho 50ml dung dịch NaBH4 0,002M vào lọ cho lên máy khuấy từ với tốc độ

1000 vòng/phút sử dụng nhiệt độ phòng.

+ Sử dụng pipet nhỏ từ từ 3,33ml dung dịch AgNO3 0,001M vào dung dịch đang

khuấy từ (1 giọt/giây). Dung dịch dần chuyển sang màu vàng tươi.

+ Tiếp tục nhỏ từ từ 0,83ml dung dịch chất bọc (PVP 0,3% hoặc PEG 0,3%) vào

dung dịch đang khuấy từ (3 giọt/giây). Ta thấy dung dịch giữ nguyên màu sắc

và có xuất hiện những bọt nhỏ trên bề mặt.

+ Sau đó dùng máy đo pH để bàn chỉnh pH dung dịch tới 7,0.

+ Kết thúc khuấy từ, cho dung dịch khấy từ xuống và cho vào ống falcon 50ml

bảo quản ở nơi khô mát, tránh ánh sáng.

Cơ chế phản ứng:

+ Trong quá trình phản ứng trên NaBH4 đóng vai trò là tác nhân khử, khử ion Ag+

thành Ag0. Phương trình phản ứng như sau:

20

2AgNO3 + 2NaBH4 = 2Ag0 + H2 + B2H6 + 2NaNO3

+ Sau khi nhỏ AgNO3 vào xảy ra hiện tượng khử các ion Ag+ thành Ag0, vì vậy

dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt, chứng tỏ có sự xuất hiện của nano bạc. Sau

khi hạt nano bạc được tạo thành, chúng ta sử dụng PVP hoặc PEG để bọc các hạt

Ag0 lại, không cho chúng liên kết lại với nhau, điều này giúp tăng khả năng bảo vệ

nano bạc, tránh xuất hiện kết tủa.

Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng hạt nano bạc:

Trong phương pháp hóa khử, tỉ lệ chất khử và nồng độ ion bạc, pH của dung

dịch, nồng độ polyme ảnh hưởng đến hiệu suất và kích thước hạt bạc. Phương pháp

hóa khử hóa học thu được hạt có kích thước 10-20nm [9].

Nồng độ AgNO3 ảnh hưởng đáng kể đến kích thước hạt. Các nghiên cứu cho

thấy, nếu tăng nồng độ AgNO3 thì tốc độ hình thành hạt nano bạc cũng nhanh hơn do

có một lượng lớn hạt nano được hình thành trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, khi

nồng độ AgNO3 tăng, các hạt nano bạc được hình thành sau đó sẽ va chạm với nhau

thường xuyên hơn (do mật độ lớn) và kết quả là chúng sẽ bị ngưng tụ lại.

Nồng độ chất bao bọc bề mặt polyme cũng ảnh hưởng trực tiếp tới kích thước

và tính chất keo nano bạc. Nếu nồng độ polyme quá lớn, các hạt nano bạc sẽ phân tán

không đều, bị kết đám và kết tủa. Nếu nồng độ polyme thấp, chúng sẽ không bao phủ

được hết lượng nano bạc vì vậy các hạt nano bạc sẽ kết tụ lại.

Độ pH ảnh hưởng trực tiếp tới cấu trúc và sự bền vững cũng như màu sắc của

hạt. Khi pH cao hoặc thấp chúng sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình phản ứng và ảnh

hưởng tới lớp polyme bao phủ làm thay đổi tính chất chất của keo nano bạc và kích

thước hạt của chúng.

2.2.2. Phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ UV-vis

Phương pháp này dựa vào việc do cường độ dòng ánh sáng còn lại sau khi đi

qua dung dịch chất phân tích. Phương pháp đo UV-vis dùng để định tính, định lượng

các chất có màu và dung dịch keo dựa vào chiều cao giá trị bước sóng hấp thụ cực đại

(λmax), mật độ quang (E) và bề rộng hấp thụ.

Với mẫu keo nano bạc chế tạo, để ổn định trong điều kiện bình thường 24 giờ,

pha loãng đi 2 lần bằng nước, đưa vào cuvet thạch anh có chiều dày 1cm, ghi phổ UV-

vis trong dải bước sóng từ 300-700nm.

21

Dựa trên kết quả cường độ hấp thụ E và bước sóng hấp thụ cực đại (λmax) của

dung dịch keo nano bạc, suy đoán sự thay đổi kích thước hạt bạc.

2.2.3. Phân tích hạt bằng FE-SEM

FE-SEM: Là loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh của bề mặt vật liệu với

độ phân giải cao, bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét lên bề mặt vật liệu.

Việc tạo ảnh của vật liệu được thực hiện qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ

phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt.

Cấu tạo: Gồm một súng phóng điện tử theo chiều từ dưới lên, ba thấu kính tĩnh

điện và hệ thống các cuộn quét điện từ đặt giữa thấu kính thứ hai và thứ 3, và ghi nhận

chùm điện tử thứ cấp bằng một ống nhân quang điện.

Nguyên lý hoạt động: Điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử, sau đó được

tăng tốc, và hội tụ thành chùm điện tử hẹp nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên

bề mặt vật liệu nhờ các cuộn quét tĩnh điện. Độ phân giải của FE-SEM được xác định

từ kích thước của chùm điện tử hội tụ, kích thước của chùm điện tử này được hạn chế

bởi quang sai, do đó FE-SEM không có được độ phân giải tốt nhất. Độ phân giải còn

phụ thuộc vào tương tác giữa bề mặt vật liệu và điện tử.

2.2.4. Khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc

Thử nghiệm hiệu quả kháng khuẩn của 2 mẫu nano bạc (bọc PEG, PVP) với hai

loại vi khuẩn E.coli và Staphylococcus được tiến hành trên đĩa LB đặc. Sử dụng 6 đĩa

LB đặc cho thí nghiệm này, 3 đĩa nuôi E.coli và 3 đĩa nuôi Staphylococcus thử nghiệm

khả năng kháng khuẩn nano bạc bằng phương pháp đục lỗ, nhỏ vào mỗi lỗ 50µl nano

bạc, và nuôi cấy sau 12 giờ ở buồng nuôi cấy, nhằm tìm ra mẫu keo nano bạc có tính

kháng khuẩn mạnh hơn, để tiếp tục sử dụng mẫu đó cho các thí nghiệm tiếp theo. Các

bước tiến hành thí nghiệm:

Cấy trải vi khuẩn

+ Sử dụng pipet cho 200 µl dịch khuẩn lên bề mặt đĩa LB agar đặc.

+ Sử dụng que cấy trải (đã khử trùng) để trải đều vi khuẩn ra toàn bộ mặt đĩa.

+ Kết thúc cấy trải.

Phương pháp đục lỗ

+ Sau khi cấy trải vi khuẩn, sử dụng dụng cụ để đục 1 lỗ nhỏ tại tâm đĩa

22

+ Dùng pipet nhỏ 50µl nano bạc vào lỗ đợi 15 phút cho nano bạc khuếch tán

ra toàn bộ mặt đĩa.

+ Cho vào tủ nuôi qua đêm ở nhiệt độ 370C.

2.2.5. Thử nghiệm sự tương tác giữa keo nano bạc với nấm mốc

Nấm mốc được sử dụng trong thí nghiệm này là chủng Aspergillus niger do

Viện vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp.

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng tương tác của nấm mốc Aspergillus

niger với mẫu nano bạc bọc PEG. Nấm mốc được nuôi trên đĩa thạch bằng môi trường

Czapek. Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa, một đĩa đối chứng và một đĩa để thử nghiệm

với nano bạc. Các bước tiến hành như sau:

+ Với mẫu đối chứng: dùng que cấy thu các bào tử nấm từ đĩa giữ giống sau

đó chấm thành 11 điểm trên đĩa nuôi cấy.

+ Với mẫu thử nghiệm với nano bạc: chuẩn bị ống eppendorf 1ml có 0.8ml

nước cất và 0.2ml keo nano bạc, dùng que cấy thu các bào tử nấm từ đĩa

giống sau đó cho vào ống eppendorf lắc đều. Đợi 30 phút để các bào tử nấm

mốc lắng xuống. Sau đó dùng que cấy trải thu các bào tử nấm mốc và chấm

thành 11 điểm trên đĩa nuôi cấy.

+ Cả hai đĩa được nuôi trong tủ giữ nhiệt ở nhiệt độ 260C.

2.2.6. Nuôi cấy vi tảo

Nguồn giống, môi trường dinh dưỡng và chế độ nuôi cấy tảo

Trong nghiên cứu, sử dụng các môi trường BG 11, C, BBM cho nuôi cấy vi tảo

Chlorella elipsoidea .

Tảo được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng dưới ánh sáng đèn neon với

cường độ sáng là 10.000-20.000 Lux theo chu kỳ quang là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ

tối.

Đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm Neubauer [29]

- Cấu tạo buồng đếm Neubauer

Buồng đếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3mm, được chia ra làm

3 phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc. Phần giữa được chia

đôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1mm, tạo ra hai ngăn đếm giống

nhau. Mỗi ngăn đếm được chia thành 9 ô vuông lớn mỗi ô có diện tích 1mm2. Mỗi

23

ngăn đếm hình vuông, được chia thành 16 ô lớn. Riêng ngăn đếm hình vuông ở chính

giữa được chia thành 16 ô trung bình, mỗi ô trung bình lại được chia thành 16 ô nhỏ.

Tổng số ô nhỏ ở ngăn đếm chính giữa là 16x16=256 ô nhỏ.

Mỗi ô nhỏ này có diện tích là 1/400mm2 , và chiều cao là 1/10mm2.

Như vậy thể tích của ô nhỏ này là:

1/400 x 1/10 = 25.10-5 mm2

Thể tích của một ngăn đếm là:

25.10-5 x 256 = 64.10-3 mm-3 (=64.10-6ml)

Mật độ tế bào trong 1ml được tính theo công thức:

D = (A/64).106

Trong đó:

D: mật độ tế bào (số tế bào/ml).

A : là số tế bào trong buồng đếm.

a

b

Hình 2.1. : Buồng đếmNeubauer

a- Buồng đếm nhìn thẳng và nhìn nghiêng

b- Buồng đếm đưới kính hiển vi

- Thao tác đếm

24

Buồng đếm và lamelle được lau sạch bằng cồn và được thấm khô trước khi cho

dịch tảo vào. Lamelle được dặt trong buồng đếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự

giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen. Đưa buồng đếm lên

kính hiển vi, thị kính 10 dùng vật kính 10 điều chỉnh đểm tìm ô đếm. Sau đó dùng

pipet hút một ít dịch tảo đã được lắc đều và chấm vào cạnh của lamelle. Dịch tảo sẽ

tràn vào buồng đếm.

Buồng đếm chứa tảo được đưa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 40, thị

kính 10. Đối với những mẫu đếm quá đặc hoặc không thể đếm chính xác thì pha loãng

trước khi đếm và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả

Lập chu kỳ sinh trưởng của tảo

Trong nuôi cấy tảo, sự gia tăng về kích thước của các tế bào là không đáng kể.

Do đó khi sử dụng từ “sinh trưởng” chúng ta sẽ hiểu đó là sự gia tăng sinh khối, chủ

yếu là do sự gia tăng về số lượng tế bào trong dung dịch.

Trong nuôi cấy tĩnh, tức là nguồn cung cấp dinh dưỡng là giới hạn, không bổ

sung thêm cũng không lấy bớt, sinh trưởng của tảo trải qua bốn pha cơ bản:

Pha thích ứng.

Pha sinh trưởng.

Pha ổn định.

Pha suy vong.

Để lập chu kỳ sinh trưởng của tảo, chúng ta sẽ tiến hành đếm mật độ tế bào tảo

bằng buồng đếm Neubauer. Bắt đầu đếm từ ngày tiến hành nuôi cấy (ngày số 0), tiến

hành đếm theo chu kỳ 2 ngày 1 lần cho tới khi mật độ tế bào tảo đạt giá trị cực đại.

Trên cơ sở dữ liệu thu được qua các ngày đếm, lập đường cong sinh trưởng bẳng cách

đặt trên trục tung chỉ số mật độ tế bào, đặt trên trục hoành chỉ số thời gian (ngày) nuôi

tảo.

2.2.7. Sự tương tác giữa keo nano bạc với tảo vi tảo

Lập đường chuẩn hóa giữa độ hấp thụ quang với mật độ vi tảo

Mật độ vi tảo Chlorella elipsoidea trong môi trường nuôi cấy tỉ lệ tuyến tính

với mật độ quan hấp thụ nên khi biết được hệ số tỷ lệ chúng ta có thể biết được mật độ

vi tảo thông qua mật độ quang hấp thụ, và ngược lại.

Để xây dựng được đường chuẩn hóa chúng ta sẽ tiến hành đo giá trị mật độ

quang hấp thụ ở bước sóng 650nm ứng với các ngày đếm mật độ. Từ đó xác định được

các điểm trên đường chuẩn hóa.

25

Tiến hành thực nghiệm

- Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo trong dung dịch

Dựa vào đường cong sinh trưởng của vi tảo Chlorella elipsoidea tiến hành thử

nghiệm khả năng tương tác của vi tảo với keo nano bạc, tại ba pha sinh trưởng của vi

tảo là pha thích ứng, pha sinh trưởng, và pha suy vong như bảng 2.1. Vi tảo được nuôi

trong 4 bình tam giác với thể tích vi tảo Chlorella elipsoidea trong mỗi bình 50ml,

dưới điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng đèn neon với cường độ sáng là 10.000-20.000

Lux, theo chu kỳ quang là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối. Ở mỗi mật độ chúng ta tiến

hành thử nghiệm khả năng tương tác với tảo của keo nano bạc với 4 hàm lượng nano

bạc khác nhau là 0ml, 0.1ml, 1ml, 5ml như bảng sau:

Bảng 2.2. Bảng thí nghiệm tương tác của các thể tích keo nano bạc

với vi tảo tại các pha sinh trưởng

Thí nghiệm Bình Thể tích nano bạc

  T1-1 0 ml

TN1T1-2 0.1ml

T1-3 1ml

  T1-4 5ml

  T2-1 0 ml

TN2T2-2 0.1ml

T2-3 1ml

  T2-4 5ml

  T3-1 0 ml

TN3T3-2 0.1ml

T3-3 1ml

  T3-4 5ml\

- Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp

26

Thấm ướt tấm màng xốp bằng 30ml keo nano bạc rồi đem sấy khô bằng tủ sấy.

Sau đó dùng 30ml dung dịch tảo với mật độ 10.5 x 106 tb/ml đô lên màng sao cho tảo

được giữ lại trên màng. Tiến hành nuôi tảo dưới điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng

đèn neon với cường độ sáng là 10000-20000 Lux theo chu kỳ quang là 10 giờ chiếu

sáng và 14 giờ tối.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Chế tạo keo nano bạc

a b

Hình 3.1. Kết quả chế tạo keo nano bạc

a - Mẫu bọc PEG

b - Mẫu bọc PVP

Kết quả chế tạo thực nghiệm mẫu keo nano bạc sử dụng NaBH4 làm tác nhân

khử bọc PVP và bọc PEG bằng phương pháp hóa khử cho thấy dung dịch keo bạc có

màu vàng tươi đồng nhất không xuất hiện kết tủa với pH=7.0 (Hình 3.1). Hạt nano bạc

được bao bọc tốt bởi PVP và PEG.

27

Sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-vis và phương pháp chụp ảnh

FE-SEM để nghiên cứu tính chất của keo nano bạc chế tạo.

3.2. Phân tích hạt bằng tia UV-vis

Hình 3.2. Kết quả đo UV-vis thực nghiệm keo nano bạc

a - Mẫu bọc PEG

b - Mẫu bọc PVP

Sử dụng máy quang phổ hấp thụ (UV/VIS) để xác định tính chất quang của

dung dịch keo nano bạc. Kết quả ở hình 3.2. cho thấy cường độ hấp thụ của keo nano

bạc được bọc bởi PEG sau khi pha loãng 2 lần có giá trị khoảng 0,72 tại bước sóng

400nm. Với mẫu keo nano bạc bọc PVP sau khi pha loãng 2 lần có giá trị thấp hơn

khoảng 0,66 tại bước sóng 413nm . Như vậy, kích thước hạt nano bạc ở mẫu bọc PVP

lớn hơn đã làm giảm mật độ quang và tăng bước sóng hấp thụ UV-vis so với dung dịch

keo bạc được bọc bởi PEG. Kết quả đo quang phổ hấp thụ UV-vis của keo nano bạc có

đỉnh hấp thụ cực đại trong khoảng 400-413nm phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã

được công bố. Từ kết quả này có thể nhận định hạt nano bạc được bao bọc bởi PEG có

kích thước hạt nhỏ hơn và phân tán tốt hơn so với hạt nano bạc bọc bởi PVP.

28

3.3. Phân tích hạt bằng FE-SEM

a

b

Hình 3.3. Kết quả chụp ảnh FESEM mẫu nano bạc

a - Mẫu bọc PEG

b - Mẫu bọc PVP

Kết quả ở chụp FESEM ở hình 3.3 cho thấy kích thước hạt nano bạc bọc PVP

khoảng 25-50nm (Hình 3.3.-b). Hạt nano bạc phân tán tốt trong dung dịch. Với hình

29

3.3.-a mẫu nano bạc bọc PEG ta ta có thể xác định được kích thước của hạt nano bạc

khoảng 15-50nm. Hạt tương đối đồng đều và phân tán tốt trong dung dịch.

3.4. Khả năng kháng khuẩn của các dung dịch keo nano bạc

a b c

30

d e f

Hình 3.4. Kết quả thí nghịêm kháng khuẩn với dung dịch nano bạc

a - E.coli cho nano bạc bọc PEG

b - E.coli cho nano bạc bọc PVP

c - E.coli không cho nano bạc

d - Staphylococcus cho nano bạc bọc PVG

e - Staphylococcus cho nano bạc bọc PVP

f - Staphylococcus không cho nano bạc

Từ kết quả thử nghiệm kháng khuẩn ở hình 3.4 của keo nano bạc đối với

Staphylococcus và E.coli ta thấy cả hai mẫu nano bạc bọc PVP và PEG đều cho kết

quả kháng khuẩn với cả hai loại vi khuẩn. Tuy nhiên mẫu nano bạc bọc PEG thể hiện

khả năng kháng khuẩn tốt hơn mẫu nano bạc bọc PVP. Sau một đêm nuôi cấy với mẫu

nano bạc bọc PEG tạo vòng kháng khuẩn khoảng 2.2cm với E.coli và khoảng 2.0cm

với Staphylococcus. Mẫu nano bạc bọc PVP tạo vòng kháng khuẩn tương ứng là

1.5cm với E.coli và 1.3cm với Staphylococcus. Từ thử nghiệm này, chúng tôi sử dụng

mẫu keo nano bạc bọc PEG cho các thí nghiệm tiếp theo về khảo sát khả năng tương

tác của nano bạc với nấm mốc và tảo.

31

3.5. Sự tương tác giữa keo nano bạc với nấm mốc

a b

Hình 3.5. Kết quả thí nghịêm kháng khuẩn với dung dịch nano bạc sau 4 ngày nuôi cấy

a – Mẫu không có nano bạc

b – Mẫu có nano bạc

Qua hình 3.5 ta thấy với mẫu thí nghiệm không có nano bạc nấm phát triển tốt

đều khắp bề mặt đĩa. Với mẫu có nano bạc nấm mốc bị ức chế và phát triển rất chậm.

Kết quả này chứng tỏ khả năng tương tác của nano bạc với nâm mốc.

3.6. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi tảo

Một trong những yếu tố hàng đầu ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của

vi tảo là môi trường dinh dưỡng. Mặc dù là sinh vật quang tự dưỡng, nhu cầu chất dinh

dưỡng không phải quá khắt khe, đặc biệt là dinh dưỡng hữu cơ, song do đặc tính sinh

lý của vi tảo dễ thay đổi theo sự thay đổi của môi trường. Chính vì vậy trong nuôi cấy

vi tảo việc chọn lựa môi trường phù hợp nhất cho sinh trưởng và phá triển của tảo là

rất cần thiết.

Trong nghiên cứu này, tiến hành nuôi tĩnh vi tảo Chlorella elipsoidea trên ba

môi trường: BG 11, C, BBM với mật độ ban đầu là 1.35 x 106 tb/ml. Kết quả thu được

ở bảng 3.1. và hình 3.6.

Bảng 3.1. Bảng kết quả đếm thực nghiệm

32

Thời gianMật độ tế bào (x 106/ml) trên các nuôi trên bốn môi trường

nuôi cấy khác nhau (ngày)

BG II C BBM0

1.35 1.35 1.352

1.3 1.35 1.254

2.05 1.75 1.956

3.35 2.85 3.18

4.95 3.4 3.7510

6.3 4.2 5.2512

8.2 5 6.3514

10.5 7.4 916

15.45 10.8 13.1518

21.15 14.5 17.4520

27.15 19.05 21.6522

35 26.35 29.924

43.8 34.65 38.826

53.05 40.2 44.6528

58.35 37.45 48.3530

55.3 34.8 43.8532

52.4 33.55 41.55

33

Hình 3.6. Đồ thị kết quả đếm vi tảo Chlorella elipsoidea

Từ kết quả bảng 3.1 và hình 3.6 Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, thời gian nuôi

cấy đạt tới đỉnh sinh trưởng là tương đối dài (sau 26-28 ngày). Sinh trưởng của vi tảo

Chlorella elipsoidea trong các môi trường dinh dưỡng khác biệt nhau một cách đáng

kể, vi tảo sinh trưởng tốt nhất trong môi trường BG II, mật độ tại đỉnh sinh trưởng đạt

58.35 x 106 tb/ml, với môi trường BBM mật độ này đạt 48.35 x 106 tb/ml, còn trong

môi trường C mật độ này là thấp nhất 40.2 x 106 tb/ml. Tảo Chlorella elipsoidea ở cả 3

môi trường đều sinh trưởng mạnh khi bước vào ngày thứ 6, ở đó có sự phân biệt rõ rệt

giữa các môi trường mật độ vi tảo trong các môi trường BG 11, BBM, C lần lượt là

3.35 x 106 tb/ml, 3.1 x 106 tb/ml và 2.85 x 106 tb/ml. Từ kết quả này chúng tôi sử dụng

môi trường BG 11 để nuôi vi tảo Chlorella elipsoidea cho các thí nghiệm tiếp theo.

a b c

Hình 3.7. Tảo Vi tảo Chlorella elipsoidea nuôi ở ngày thứ 22

a – Môi trường BG11 b – Môi trường C c – Môi trường BBM

34

3.7. Sự tương tác giữa keo nano bạc với vi tảo

3.7.1. Đường cong chuẩn hóa giữa mật độ quang với mật độ tảo

Bảng 3.2. Bảng tương quan giữa mật độ vi tảo và giá trị OD650nm qua các ngày

OD650nm Mật độ6.80 58.35

5.97 53.50

4.99 43.80

4.12 35

2.97 27.15

2.58 21.15

1.82 15.45

1.36 10.50

0.77 6.30

0.58 4.95

0.38 3.35

0.24 2.05

0.15 1.35

0.00 0.00

Hình 3.8. Đường chuẩn hóa mật độ tảo và mật độ quang hấp thụ tại các pha sinh trưởng của

vi tảo Chlorella elipsoidea

35

Từ số liệu đo giá trị mật độ quang hấp thụ tại các pha sinh trưởng của vi tảo

Chlorella elipsoidea.Ta xây dựng được đường chuẩn hóa giữa mật độ tế bào với

OD650nm tương ứng của vi tảo trong các pha của vi tảo Chlorella elipsoidea.

3.7.2. Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo trong dung dịch

Bảng 3.3. Bảng thực nghiệm đo OD650nm của vi tảo

Ngày

T1

(Pha thích ứng)

T2

(Pha sinh trưởng)

T3

(Pha suy vong)

T1-10ml

T1-20.5ml

T1-31ml

T1-45ml

T2-10ml

T2-20.5ml

T2-31ml

T2-45ml

T3-10ml

T3-20.5ml

T3-31ml

T3-45ml

0 0.17 0.18 0.17 0.16 0.95 0.92 0.97 0.91 6.55 6.52 6.50 6.56

2 0.16 0.14 0.12 0.08 1.21 1.16 1.09 0.84 6.08 5.77 5.25 4.49

4 0.25 0.19 0.09 0.04 1.77 1.68 1.46 0.77 5.80 5.31 4.68 3.02

6 0.40 0.30 0.12 0.02 2.43 2.31 1.77 0.58 5.72 5.08 4.12 1.87

8 0.57 0.42 0.14 0.01 3.12 2.98 2.19 0.51 5.57 4.49 3.61 1.09

Hình 3.9. Khả năng tương tác các nồng độ Nano bạc với vi tảo tại pha thích ứng

Qua bảng 3.3 và hình 3.9 ta thấy với thí nghiệm T1-1 không có nano bạc trong

môi trường nuôi, vi tảo phát triển theo đúng đường cong sinh trưởng, sau 8 ngày nuôi

cấy mật độ vi tảo tăng từ 1,48 x 106tb/ml lên 4,96 x 106tb/ml. Với thí nghiệm T1-4 cho

5ml nano bạc ta thấy giá trị OD650nm giảm mạnh qua các ngày và ở ngày thứ 8 nuôi cấy

giá trị này là 0,014 tương ứng với mật độ vi tảo khoảng 0,12 x 106tb/ml. Còn với hai

36

thí nghiệm T1-2 và T1-3 cho tương ứng 0,5ml và 1ml nano bạc đường giá trị mật độ

quang hấp thụ thấp hơn so với thí nghiệm T1-1, sau 8 ngày nuôi cấy mật độ vi tảo ở thí

nghiệm T1-2 khoảng 4,42 x 106tb/ml, và ở thí nghiệm T1-3 khoảng 2,00 x 106tb/ml.

Hình 3.10. Khả năng tương tác các nồng độ nano bạc với vi tảo tại pha sinh trưởng

Qua bảng 3.3 và hình 3.10 ta thấy sự tương tác của nano bạc ở thí nghiệm T2

khi vi tảo ở pha sinh trưởng có sự khác biệt với T1 khi tảo ở pha thích ứng. Với mẫu

thí nghiệm T2-4 cho 5ml nano bạc ta thấy giá trị OD650nm giảm qua các ngày (từ 0,91

xuống 0,51), tuy nhiên tỷ lệ giảm không nhanh như ở T1-4 thể hiện qua độ dốc của đồ

thị. Và sau 8 ngày nuôi cấy mật độ vi tảo ở thí nghiệm T2-4 khoảng 4,44 x 106tb/ml.

Hình 3.11. Khả năng tương tác các nồng độ nano bạc với vi tảo tại pha thích ứng

37

Qua bảng 3.3 và hình 3.11 ta thấy thí nghiệm T3 khi vi tảo ở pha suy vong vì

vậy ở thí nghiệm T3-1 không cho nano bạc giá trị OD650nm giảm sau 8 ngày (từ 6,55

xuống 5,57), tương ứng mật độ vi tảo giảm từ 57,13 x 106tb/ml xuống 48,52 x

106tb/ml. Với các thí nghiệm T3-4 tốc độ giảm là nhanh nhất mật độ vi tảo giảm từ

57,14 x 106tb/ml xuống 9,5 x 106tb/ml. Ở hai mẫu thí nghiệm còn lại ta thấy tốc độ

giảm mật độ vi tảo chậm hơn so với thí nghiệm T3-4, ở thí nghiệm T3-2 giảm từ 56,78

x 106tb/ml xuống 39,11 x 106tb/ml và T3-3 mật độ vi tảo giảm từ 56,61 x 106tb/ml

xuống 31,44 x 106tb/ml.

Như vậy ở cả ba thí nghiệm T1, T2 và T3 ta thấy có sự tương tác giữa nano bạc

với vi tảo làm mật độ vi tảo giảm thấp hơn so với mẫu không cho nano bạc. Sự tương

tác này nhận thấy rõ rệt nhất với lượng nano bạc là 5ml. Với hàm lượng này ở cả ba

giai đoạn sinh trưởng đều có sự suy giảm đáng kể về mật độ vi tảo so với thời điểm bắt

đầu cho nano bạc. Tuy nhiên sự suy giảm này ở các pha khác nhau là không giống

nhau. Sự giảm mật độ vi tảo diễn ra nhanh nhất với thí nghiệm T3 khi vi tảo đang ở

pha suy vong và diễn ra chậm hơn với thí nghiệm T2 khi vi tảo ở pha sinh trưởng.

a b

Hình 3.12. Ảnh tảo Chlorella elipsoidea ở mẫu thí nghiệm T1-4 trước và sau khi

cho nano bạc 8 ngày (vật kính 40)

a - Bình không cho nano bạc

b - Bình cho 5ml keo nano bạc

Hình 3.12 cho ta thấy sau khi cho nano bạc vào trong môi trương nuôi tảo, các

hạt nano bạc đã tương tác với tảo làm tế bào vi tảo mất màu chất diệp lục chlorophyll

từ đó ức chế quá trình quang hợp của tảo. Tuy nhiên hình dạng của tế bào vi tảo không

bị phá vỡ như vi khuẩn.

38

3.7.3. Khả năng tương tác của keo nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp

a b

Hình 3.13. Khả năng tương tác của nano bạc với vi tảo khi tẩm lên màng xốp

a- Ngày thứ 0

b- Ngày thứ 6

Qua hình 3.13 ta thấy nano bạc thể hiện khả năng tương tác với vi tảo khi tẩm

vào màng xốp. Sau 6 ngày nuôi cấy ta thấy vi tảo vẫn sống trên miếng xốp không có

nano bạc thể hiện qua máu xanh diệp lục trong khi đó với miếng xốp tẩm nano bạc

chúng ta không còn nhìn thấy màu xanh trên miếng xốp. Như vậy nano bạc được cố

định trên sợi của màng xốp đã tác động trự tiếp tới sự phát triển của vi tảo.

39

KẾT LUẬN

Đã chế tạo được keo nano bạc bằng phương pháp hóa khử, sử dụng PVP và

PEG làm chất bọc.

Đã khảo sát được các tính chất của keo nano bạc bằng phân tích quang phổ hấp

thụ UV-vis và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử FESEM.

Keo nano bạc bọc PVP và PEG cho thấy khả năng kháng khuẩn như vi khuẩn

E.coli và vi khuẩn Staphylococcus.

Kết quả thử nghiệm khả năng tương tác của keo nano bạc với nấm mốc

Aspergillus niger cho thấy nano bạc có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm mốc.

Kết quả thử nghiệm khả năng tương tác của keo bạc nano với vi tảo Chlorella

elipsoidea cho thấy nano bạc đã ảnh hưởng tới sự phát triển của vi tảo.

40

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Cần tiếp tục hoàn thiện các phương pháp chế tạo hạt nano bạc để thu được các

hạt nano bạc nhỏ hơn, đồng đều hơn.

Tiếp tục nghiên cứu cơ chế ảnh hưởng của nano bạc ở mức độ phân tử.

Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm mốc và tảo của nano bạc

trong điều kiện thực tế.

41

PHỤ LỤC

A. Phụ lục 1: Thành phần các môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn

STT Hóa chất Hàm lượng/l1 Peptone 10g2 Yeast extract 5g3 Sodium citrate 10g4 Nước cất 1L5 Bổ xung thêm 15g Agar với môi trường LB đặc

B.Phụ lục 1: Thành phần các môi trường nuôi cấy nấm mốc

STT Hóa chất Hàm lượng/l1 Saccroza 30g2 NaNO3 3g3 K2HPO4 1g4 MgSO4 0.5g5 KCl 0.5g6 FeSO4.7H2O 0.05g7 Thạch 15g8 Nước cất 1l9 pH 6.0  

42

C. Phụ lục 1: Thành phần các môi trường nuôi cấy vi tảo

Môi trường C

STT Hóa chất Hàm lượng/100ml

1 Ca(NO3)2.4H2O 15mg

2 KNO3 10mg

3 β-Na2glicerolphosphate.5H2O 5mg

4 MgSO4.7H2O 4mg

5 PIV metals 0.3ml

6 Tris (hydroximethyl) aminoethanol 50mg

7 Vitamin B12 0.01µg

8 Biotin 0.01µg

9 Thiamine HCL 1µg

10 Nước cất 99.7ml

11 pH 7.5

PIV metals

STT Hóa chất Hàm lượng/l

1 FeCl3.6H20 19.6mg

2 MnCl2.4H2O 3.6mg

3 ZnSO4.7H2O 2.2mg

4 CoCl2.6H2O 0.4mg

5 Na2MoO4.2H2O 0.25mg

6 Na2EDTA.2H2O 100mg

7 Nước cất 100ml 100ml

43

Môi trường BBM

STT Hóa chất Hàm lượng/100l

1 NaNO325mg

2 KH2PO417.5mg

3 K2HPO410mg

4 MgSO4.7H2O7.5ml

5 CaCl2.2 H2O2.5mg

6 NaCl 2.5mg

7 KOH 31mg

8 FeSO4.7H2O 0.498mg

9 H3BO31.142mg

10 ZnSO4.7H2O0.882mg

11 MnCl2.7H2O0.144mg

12 MoO30.071mg

13 CuSO4.5H2O0.157mg

14 Co(NO3)2.6H2O0.049mg

15 Na2EDTA5mg

16 Distilled water 100ml

44

Môi trương BG11

STT Hóa chất Hàm lượng/100ml

1 NaNO3 150mg

2 K2HPO4.3H2O 4mg

3 MgSO4.7H2O 7.5mg

4 CaCl2.2 H2O 3.6mg

5 Citric acid 0.6mg

6 Ferric ammonium citrate 0.6mg

7 Na2ETDA.Mg 0.1mg

8 Na2CO3 2mg

9 Trace metal mix A5 + Co 0.1ml

10 Distilled water 99.9ml

11 pH 7.4

Trace metal mix A5 + Co

STT Hóa chất Hàm lượng/l

1 H3BO3 2.86g

2 MnCl2 1.81g

3 ZnSO4 0.222g

4 Na2MoO4 0.4mg

5 Na2MoO4.2H2O 0.079g

6 Na2EDTA 0.049g

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] Dương Đức Tiến, Võ Hành, Tảo nước ngọt Việt Nam-Phân loại bộ tảo lục

(chlorococcales), NXB nông nghiệp, 1998.

[2] Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, Công nghệ sinh học vi tảo, NXB

Nông nghiệp, 1998.

[3] Lê Huy Chính(chủ biên), Vi sinh y học, Nxb y học, 2003.

[4] Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Bài tổng quân công nghệ sinh

học nano, Tạp chí công nghệ sinh học 2(2), 2004, Tr. 133-148.

[5] Nguyễn Đức Nghĩa , hóa học nano-Công nghệ nền và vật liệu nguồn, NXB

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, 2007.

[6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà, Vi tảo (Microalgae), 2006

[7] Uldrich.J và Newberry.D, Công nghệ nano-Đầu tư & đầu tư mạo hiểm, Sách

dịch, NXB Trẻ, 2006.

[8] Vũ Đình Cự, Nguyễn Xuân Chánh, Công nghệ nano điều khiển đến từng

nguyên tử, phân tử, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật, 2004.

Tiếng Anh

[9] Badr.Y, mahmoud.M.A. Enhancement of the optical propertied of poly vinyl

alcohol by doping with silver nanoparticles, J. Appl. Polym. Sci, 99, 2006,

pp.3068-3614.

[10] Chmielewski A.G, “Worldwide developments in the field of radiation

processing of materials in the down of 21st century”, Nukleotika,

51(supplement 1): S3-S9, 2006

[11] Liuchia-I, ph.D, Wen-Yih Jeng, Ph.D, and Andrew H.-j. Wang, ph.D, Mary E.

Hensler, Ph.D, and Yongcheng Song, Ph.D, and Fenglin Yin, Ph.D, Novel

Approach Strips Staphylococcus aureus of Virulence, National Institute of

General Medical Sciences.

[12] Mihail.C, Roco, “Converging science and technology at the nanoscale

opportunities for education and training”, Nuture biotechnology volume 21,

2003, pp.1247-1249.

46

[13] Pavel Pribyl & Vladislav Cepak, Chromium influences growth and cell

morphology but itself does not induce gametogenesis in three scenedesmus

obliquus strains, Czech phycology, 5, 2005, pp.91-100

[14] Shrivastava. S, et al, “Characterization of enhanced antibacterial effects of

novel silver nanoparticles”, nanotechnology, 18, 2007, pp.225103/1-225103/9.

[15] Singh. M,et al “Nanotechnology in medicine and antibacterial efect of silver

nanoparticles”, Digest journal of Nanomaterials and Biostructures,

carbohydrate Polymers,2008.

[16] Taneja. B, Ayyub. B, Chandra. R, Size dependence of the optical spectrum in

nanocrytalline silver, Physical Review B, Vol. 65, 2002, pp.245412.1-6.

[17] Tiwari. DK, Behary. J, Sen. P, “Time and dose-dependent antimicrobial

potential Ag nanoparticles synthesized by top-dow approach”, Current Science,

95(5), 2008, pp.647-655.

[18] Weast, R.C, J.A. Spadaro, R.O.Becker, et al, ”Handbook of Chemistry and

Physics”, 69th edu CRC press, Inc, Boca Raton, FL, 1988-1989, pp.127-128.

[19] William Dunn, “Application of nanoparticles in biology and medicine”, Journal

of Nanobiotechnology, Ivol.16, 2004, pp.38-42.

[20] Yu. H, et al, “Preparation and antibacterial effects of PVA_PVP hydrogels

containing silver nanoparticles”, J. Appl. Polym. Sci, 103, 2007, pp.125-133.

Internet

[21] http://www.catalogueoflife.org/details/species/id/19266

[22] http://plantphys.info/plant_biology/labaids/zygnemophyceae.shtml

[23] http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ công _nghệ_sinh_học_nano

[24] http://www.drthuthuy.com/reseach/PEG _Tothon.html

[25] http://vi.wikipedia.org/wiki/ công_nghệ _nano

[26] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADp_tin:EscherichiaColi_NIAID.jpg

[27] http://vi.wikipedia.org/wiki/Tao_luc

[28] WWW.pgodoy.com

[29] http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html

47