Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng LC MS trên MS

8/20/2019 Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng LC MS trên MS

http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-xac-dinh-du-luong-mot-so-khang-sinh-quinolon-trong 1/67

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨ U XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢ NG

MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONGNƯỚ C THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢ C

BẰNG LC- MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC

HÀ NỘI 2015

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

óng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨ U XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢ NGMỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG

NƯỚ C THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢ CBẰNG LC- MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤTMÃ SỐ : 60720410

Ngườ i hướ ng dẫn khoa học:PGS. TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015







LỜ I C Ả M Ơ N

Em xin bày tỏ lòng kính tr ọng và biết ơ n sâu sắc tớ i PGS.TS. Nguyễn Thị

Kiều Anh, ngườ i đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong

suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Em xin gửi lờ i cảm ơ n chân thành tớ i các thầy cô, các anh chị k ỹ thuật viên

Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Tr ườ ng Đại học Dượ c Hà Nội, Viện

Công nghệ Dượ c phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong thờ i gian

thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơ n quỹ Nafosted đã tài tr ợ một phần kinh

phí để em thực hiện đề tài này.

Cuối cùng, em xin gửi lờ i cảm ơ n tớ i gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ,

động viên em hoàn thành luận văn.

Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng khôngtrách khỏi những thiếu sót, em kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí

thầy cô.

Em xin chân thành cảm ơ n!

Hà N ội, tháng 8 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh







MỤC LỤC

LỜ I CẢM Ơ N

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

CHƯƠ NG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3

1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon.............................................. 31.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon.................................................3

1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu............................................5

1.2. K ỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ ............................6

1.2.1. Sắc ký lỏng ......................................................................................... 6

1.2.2. Khối phổ .............................................................................................7

1.2.3. Một số k ỹ thuật ghi phổ.................................................................... 11

1.2.4. Ứ ng dụng của sắc ký lỏng 2 lần khối phổ ......................................... 12

1.2.5. K ỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký.....................................12

1.3. Một số nghiên cứu xác định hàm lượ ng Quinolon trong nướ c thải.....13

CHƯƠ NG 2. ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U.........15

2.1. Đối tượ ng nghiên cứ u............................................................................. 15

2.2. Phươ ng tiện nghiên cứ u.........................................................................15

2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn...................................................... 15

2.2.2. Thiết bị - dụng cụ ..............................................................................16

2.3. Phươ ng pháp nghiên cứ u....................................................................... 16

2.3.1. Phươ ng pháp thu thậ p và xử lý sơ bộ mẫu thử..................................16

2.3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký...........................................17

2.3.3. Khảo sát phươ ng pháp xử lý mẫu...................................................... 18







2.3.4. Thẩm định phươ ng pháp ...................................................................18

2.3.5. Ứ ng dụng phân tích mẫu thực ...........................................................20

2.3.6. Phươ ng pháp xử lý số liệu................................................................. 20CHƯƠ NG 3. K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U.................................................... 21

3.1. Xây dự ng quy trình phân tích...............................................................21

3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo khối phổ................................................... 21

3.1.2. Khảo sát các điều kiện của sắc ký ..................................................... 23

3.1.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ..........................................................29

3.1.4. Quy trình phân tích............................................................................33

3.2. Đánh giá phươ ng pháp ..........................................................................35

3.2.1. Độ thích hợ p của hệ thống................................................................. 35

3.2.2. Tính đặc hiệu của phươ ng pháp ........................................................ 36

3.2.3. Độ tuyến tính ..................................................................................... 39

3.2.4. Độ đúng và độ lặ p lại của phươ ng pháp............................................40

3.2.5. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn đ ịnh lượ ng.......................................43

3.3. Ứ ng dụng quy trình, xác định dư lượ ng kháng sinh có trong nướ c

thải công nghiệp dượ c ...................................................................................46

CHƯƠ NG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 48

4.1. Về phươ ng pháp xử lý mẫu .................................................................. 48

4.2. Về phươ ng pháp phân tích.................................................................... 48

4.3. Về thẩm định phươ ng pháp ................................................................. 50

4.4. Về ứ ng dụng phươ ng pháp ................................................................... 51

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC







DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

MeOH

MOXI

OFLO

CIP

NOR

Methanol

Moxifloxacin

Ofloxacin

Ciprofloxacin

Norfloxacin

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)

HPLC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (High performance liquid chromatography

–Mas Spectrometry)

tR Thờ i gian lưu

S Diện tích pic

TB Trung bình

RSD Độ lệch chuẩn tươ ng đối

IS Chuẩn nội (Internal Standard)

LOD Giớ i hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giớ i hạn định lượ ng (Limit of quantitation)

AOAC Association of Official Agricultủal Chemists

PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

API Ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization)

ESI Ion hóa tia điện (Electrospray Ionizaton)

APCI Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure

Chemical Ionization)

APPI Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (AtmosphericPressure Photoionization)

USP 38 Dượ c điển Mỹ 38 (The United States Pharmacopoeia) (bản

online)







DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon ...48

Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu ……5

Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu ..15

Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS ......................23

Bảng 3.2 : Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích chiết .......................31

Bảng 3.3: Hiệu suất chiết các kháng sinh khi dùng các dung môi r ửa giải

khác nhau ......................................................................................32

Bảng 3.4 : K ết quả xác định độ thích hợ p hệ thống ...................................36

Bảng 3.5 : K ết quả khảo sát độ tuyến tính của phươ ng pháp ......................39

Bảng 3.6.a : K ết quả khảo sát độ đúng của phươ ng pháp (mức LQC) ........41

Bảng 3.6.b : K ết quả khảo sát độ đúng của phươ ng pháp (mức MQC) ......42

Bảng 3.6.c : K ết quả khảo sát độ đúng của phươ ng pháp (mức HQC) .......43

Bảng 3.7 : K ết quả giá tr ị LOD, LOQ của phươ ng pháp ..............................45

Bảng 3.8 : K ết quả phân tích mẫu nướ c thải ở một số cơ sở sản xuất ..........46







DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống LC- MS ..................................................................6

Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dươ ng bằng nguồn ESI .............................................9

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ k ế tứ cực kiểu chậ p ba ........................10

Hình 3.1: Phổ đồ của các chất phân tích .......................................................22

Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột SB- C18 vớ i

các thể tích tiêm mẫu 1, 5, 10 µl ..................................................24

Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột Eclipse- C18

vớ i các thể tích tiêm mẫu 5, 10, 20 µl .........................................25

Hình 3.4: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khảo sát các tốc độ dòng 0,3;

0,5; 0,6 ml/phút ............................................................................27

Hình 3.5: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát pha động ...........29

Hình 3.6: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát thể tích chiết .....31

Hình 3.7: Biểu đồ hiệu suất chiết của các dung môi r ửa giải ........................ 33

Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu ...................................................... 38

Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định giá tr ị LOD, LOQ của phươ ng pháp ..............44







1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thực tr ạng kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu,

đặc biệt ở các nướ c đang phát triển như Việt Nam vớ i gánh nặng về các bệnh

nhiễm khuẩn và chi phí bắt buộc cho việc thay đổi kháng sinh cũ bằng kháng

sinh mớ i. Trong khi các kháng sinh mớ i ra đờ i ngày càng ít, thì việc kháng

các kháng sinh phổ r ộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế

hệ mớ i ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con ngườ i. Nguyên nhân do

trình độ dân trí còn hạn chế, lạm dụng kháng sinh liều cao, kháng sinh mạnh,

sử dụng kháng sinh mà không có chỉ định của bác s ĩ làm gia tăng tỷ lệ khángkháng sinh. Ngoài ra, lượ ng kháng sinh tồn dư trong nướ c thải sinh hoạt, bệnh

viện hay từ các công ty sản xuất dượ c phẩm cũng là nguyên nhân quan tr ọng

dẫn tớ i sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn [7]. Theo k ết quả nghiên cứu

ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng (2009- 2010)

về tình tr ạng kháng thuốc kháng sinh, tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm

cephalosporin thế hệ 3,4 là 66-83%, fluoroquinolon 60%, imipenem 35% [9].Theo qui định của cục Quản lý Dượ c hiện nay, các công ty sản xuất

thuốc nói chung và các công ty sản xuất kháng sinh nói riêng muốn sản xuất

kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP vớ i hệ thống xử lý nướ c thải. Tính từ

năm 2009 đến tháng 7/2014, theo số liệu của Cục quản lý Dượ c Việt Nam, số

kháng sinh sản xuất trong nướ c nhóm quinolon đượ c cấ p số đăng ký chiếm tỷ

lệ tươ ng đối so vớ i các kháng sinh nhóm khác. Nếu như kháng sinhCiprofloxacin có 49 lượ t, Ofloxacin có 31 lượ t cấ p phép đăng kí sản xuất thì

Cefadroxil có 27 lượ t, Metronidazol 37 lượ t đượ c cấ p số đăng kí. Tuy vậy,

theo quy định hiện hành về quy chuẩn k ỹ thuật quốc gia về môi tr ườ ng của

Bộ Tài nguyên và Môi tr ườ ng năm 2011, lại chưa có quy định giớ i hạn mức

hàm lượ ng cụ thể của kháng sinh trong nướ c thải [3]. Trong khi đó, chỉ một

lượ ng nhỏ tồn dư kháng sinh trong môi tr ườ ng tích tụ lâu ngày sẽ làm biến







2

đổi gen của các vi sinh vật. Nguyên nhân này góp phần làm gia tăng tỷ lệ

kháng kháng sinh ở nướ c ta. Vì vậy, vấn đề cấ p thiết đặt ra là phải có phươ ng

pháp xác định dư lượ ng kháng sinh trong nướ c thải của các công ty sản xuấtnhằm hạn chế sự phát tán của kháng sinh trong môi tr ườ ng.

Ở Việt Nam, đã có một vài nghiên cứu xây dựng phươ ng pháp xác định

dư lượ ng kháng sinh trong nướ c thải sinh hoạt, bệnh viện hay công ty dượ c.

Các nghiên cứu này tậ p trung phân tích, định lượ ng hàm lượ ng của một kháng

sinh cụ thể hoặc hỗn hợ p nhiều kháng sinh. Tuy nhiên, chưa có đề tài nào về

xác định hàm lượ ng nhóm kháng sinh quinolon trong nướ c thải từ các cơ sở

sản xuất dượ c phẩm trong khi đây là nhóm kháng sinh đượ c sử dụng và sản

xuất khá r ộng rãi ở nướ c ta. Vì vậy, cần thiết phải xây dựng đượ c một phươ ng

pháp xác định giúp phát hiện sự có mặt, vớ i dư lượ ng kháng sinh ở hàm lượ ng

thấ p trong nướ c thải công nghiệ p dượ c góp phần giảm thiểu nguy cơ phát tán

kháng sinh ra ngoài môi tr ườ ng, từ đó, làm giảm khả năng kháng kháng sinh.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứ u

xác định dư lượ ng một số kháng sinh Quinolon trong nướ c thải công

nghiệp Dượ c bằng LC- MS/MS” vớ i các mục tiêu chính như sau:

1. Xây dựng đượ c phươ ng pháp xác định dư lượ ng một số kháng sinh

nhóm quinolon (Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin) có

trong nướ c thải từ cơ sở sản xuất Dượ c bằng LC- MS/MS ở nồng độ ppb.

2. Ứ ng dụng phươ ng pháp xây dựng đượ c để xác định dư lượ ng của

một số kháng sinh quinolon có trong nướ c thải từ cơ sở sản xuất Dượ c trong

nướ c.







3

CHƯƠ NG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH NHÓM QUINOLON

1.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon [6], [11]* Nguồn gốc

Không giống như một số thuốc kháng sinh đầu tiên đượ c phát hiện

trong thế k ỷ tr ướ c, các kháng sinh quinolon không phân lậ p từ các sinh vật

sống, mà đượ c tổng hợ p bở i các nhà hóa học.

* Công thứ c cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

Công thức cấu tạo chung

Phân loại và phổ tác dụng: có nhiều cách phân loại quinolon như phân loại

dựa trên phổ tác dụng và công dụng, dựa vào phân tử có hoặc không có fluor. Ngày nay, các quinolon đượ c phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:







4

Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon

Quinolon Phổ tác dụng Công dụng

Thế hệ IAcid nalidixic

Cinoxacin

Enoxacin

Flumequin

Nhạy cảm vớ i các vi khuẩn Gram (-),đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đườ ng tiếtniệu Enterobacter , Không tác dụngtrên P.aeruginosa

T1/2 ngắn, bài tiết qua nướ c tiểu

Nhiễm khuẩn tiếtniệu chưa biến chứng

Thế hệ II

CiprofloxacinOfloxacin

Norfloxacin

Lomefloxacin

Phổ r ộng vớ i Gram (-), cả P.aeruginosa.Tác dụng trên một số Gram (+), baogồm cả Staphylococcus pneumoniae,tr ừ Streptococcus pneumonia.T1/2 dài hơ n.

Nhiễm khuẩn tiếtniệu, nhiễm khuẩn bểthận, sinh dục, tiềnliệt tuyến, da và mômềm

Thế hệ III

Levofloxacin

MoxifloxacinGemifloxacin

Gatifloxacin

Phổ r ộng vớ i Gram (-), một số cả trên

P.aeruginosa; Phổ mở r ộng trênGram (+), cả S. pneumoniae và các vikhuẩn đã kháng penicillin.

Một số có thờ i gian bán thải dài hơ n.

Đợ t cấ p của viêm phế

quản mạn tính, viêm phổi mắc phải ở cộngđồng, nhiễm khuẩnmô mềm, xươ ng

Thế hệ IV

Grepafloxacin

Trovafloxacin

Alatrovafloxacin

Như thế hệ III. Phổ mở r ộng vớ i cácvi khuẩn k ỵ khí và vi khuẩn khôngđiển hình.

Một số có thờ i gian bán thải dài hơ n.

Như thế hệ I, II, III(tr ừ nhiễm khuẩnniệu phức tạ p), nhiễm

khuẩn đườ ng hô hấ p,ổ bụng, vùng chậu

* Cơ chế tác dụng

Các quinolon đều ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN,

giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợ p ADN của vi

khuẩn. Ngoài ra còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợ p protein vi

khuẩn. Các quinolon đều là thuốc diệt khuẩn.







5

1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứ u [8], [21]

HIện nay, các kháng sinh quinolon thế hệ I ít sản xuất, kháng sinh thế

hệ IV ít hoặc hầu như chưa sản xuất ở Việt Nam. Các kháng sinh thế hệ II và

III đượ c sản xuất khá phổ biến. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số

kháng sinh quinolon nhóm II và III, các chất này có công thức hóa học và tính

chất lý hóa như sau:

Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu

Quinolon CTHH Tính chất

Moxifloxacin

C21H24FN3O4, MW: 401.431

Bột hay tinh thể màu vàng

hoặc vàng nhạt. Tan trongnướ c, ít tan trong EtOH.

pK a1 = 5,69; pK a2 = 9,42

Ciprofloxacin

C17H18FN3O3 , MW: 367.80

Bột k ết tinh màu hơ i vàng.

Tan trong nướ c, khó tan

trong MeOH, EtOH.

pK a1 = 5,76; pK a2 = 8,68

Norfloxacin

C16H18FN3O3 ; 319.34

Bột k ết tinh màu tr ắng ngà

đến ánh vàng.

pK a1 = 5,77 ; pK a2 = 8,68

Ofloxacin

C18H20FN3O4, 361.38

Tinh thể hình kim không

màu. Ít tan trong H2O hoặc

EtOH

pK a1 = 5,45; pK a2 = 6,2





https://en.wikipedia.org/wiki/Carbon


https://en.wikipedia.org/wiki/Hydrogen



https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorine


https://en.wikipedia.org/wiki/Oxygen










6

1.2. K ỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Phươ ng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ là phươ ng

pháp phân tích đượ c sử dụng r ộng rãi hiện nay để nghiên cứu các chất vớ i khả

năng xác định hàm lượ ng vết chất phân tích và ứng dụng trong quá trình nhận

biết, phân tích cấu trúc phân tử của các chất hữu cơ .

Về cơ bản, đây là phươ ng pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ.

Hình 1.1 : Sơ đồ hệ thống LC- MS

1.2.1. Sắc ký lỏng [1], [12]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách vớ i pha t ĩ nh là chất

r ắn đượ c nhồi trên cột và pha động là chất lỏng. Mẫu phân tích đượ c đưa lên

cột tách dướ i dạng dung dịch. Khi tiến hành sắc ký, các chất phân tích đượ c

phân bố liên tục giữa pha động và pha t ĩ nh. Trong hỗn hợ p các chất phân tích,

do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau nên khả năng

tươ ng tác của chúng vớ i pha t ĩ nh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di

chuyển vớ i tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

a. Pha t ĩ nh

Trong HPLC, pha t ĩ nh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ lưu giữ chất phân tích. Đó là những chất r ắn, xố p và kích thướ c hạt r ất nhỏ từ 3-7 μm.

Trong phần tổng quan này, chúng tôi trình bày về k ỹ thuật sắc ký phân bố là

loại k ỹ thuật phổ biến nhất và cũng là k ỹ thuật đượ c sử dụng trong nghiên

cứu. Tùy theo bản chất của pha t ĩ nh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân bố

đượ c chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

* Sắc ký lỏng pha đảo: Pha t ĩ nh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn







7

các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol như cột C8, C18, cột

Phenyl...

* Sắc ký lỏng pha thuận: Pha t ĩ nh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắncác nhóm chức phân cực bở i sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân

cực như gốc Cyano, Amino... ví dụ như cột Silica, Cyano, Amino, ...

b. Pha động

Trong HPLC, pha động là các dung môi hoặc hỗn hợ p dung môi hữu cơ

hoặc dung dịch đệm đượ c hòa tan vào nhau để có khả năng tách vớ i độ phân

giải phù hợ p.

Yêu cầu:

- Độ tinh khiết cao.

- Không phản ứng vớ i chất phân tích và pha t ĩ nh.

- Không có bọt khí, không có tiểu phân (siêu âm, lọc).

Có 2 cách dùng pha động để r ửa giải:

- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá

trình sắc ký.

- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợ p dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc

ký. Chế độ gradient này phù hợ p vớ i mẫu phân tích chứa nhiều thành phần

vớ i khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thờ i gian phân tích, tăng độ

phân giải.

Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà

còn góp phần vào khả năng ion hóa của chất. Chúng có những yêu cầu cao

hơ n về độ tinh khiết, hàm lượ ng các tạ p chất. Có những dung môi đượ c sản

xuất riêng cho LC-MS/MS.

1.2.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) [1], [12], [22]

Đầu dò MS đượ c nối vớ i đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ

(phân tích “tỉ lệ khối lượ ng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá







8

các phân tử hợ p chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích

hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượ ng

cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion...).1.2.2.1 Nguyên tắc

Sau khi đượ c tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi

qua một ống d ẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong

buồng ion hóa áp suất khí quyển (API- Atmospheric Pressure Ionization) vớ i

kiểu ion hóa tia điện (ESI- Electrospray Ionizaton), ion hoá hoá học ở áp suất

khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization- APCI), hoặc ion hóa

bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization-

APPI). Ion sinh ra đượ c tậ p trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa

vào bộ phân tích khối, tạo ra tín hiệu đặc tr ưng tại bộ phận phát hiện ion. Từ

đó, xác định các chất.

1.2.2.2. Cấu tạo bộ phận phân tích khối phổ

a. Nguồn ion

Có 3 k ỹ thuật ion hóa đượ c sử d ụng là ion hóa tia điện (ESI), ion hoá

hoá học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí

quyển (APPI).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng máy phân tích vớ i bộ phận

ion hóa bằng k ỹ thuật ESI để ion hoá các phân tử trung hoà thành các ion

phân tử, các mảnh ion hoặc các gốc mang điện tích. Đây là k ỹ thuật ion hóa

đượ c ứng dụng cho những hợ p chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượ ng

phân tử lớ n và đượ c xem là k ỹ thuật ion hóa “êm d ịu” hơ n APCI, thích hợ p

cho phân tích các hợ p chất sinh học như protein hoặc các polyme công nghiệ p

như polyethylen glycol.

Vớ i k ỹ thuật ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dướ i ảnh hưở ng của điện

thế cao và sự hỗ tr ợ của khí mang, mẫu đượ c phun thành những hạt sươ ng

nhỏ mang điện tích tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng







9

làm bay hơ i dung môi ra khỏi giọt sươ ng. Đến một giớ i hạn, các hạt sươ ng bị

phân chia thành những hạt nhỏ hơ n vì lực đẩy lúc này lớ n hơ n sức căng bề

mặt. Quá trình này

đượ c l

ặ p l

ại nhi

ều l

ầnđể

hình thành nhữ

ng hạt r

ất nh

ỏ.

Sau đó, các ion phân tích đượ c chuyển thành thể khí bở i lực đẩy t ĩ nh điện sau

r ồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.

Trong ESI, các ion đượ c hình thành như sau:

Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion d ươ ng bằng nguồn ESI

b. Bộ phận phân tích khối (Mass analyzer)

Các ion hình thành ở nguồn ion hoá sẽ đi vào bộ phận phân tích khối.

Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau

thành từng phần riêng biệt nhờ tác d ụng của từ tr ườ ng, điện tr ườ ng tr ướ c khi

đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.

Các k ỹ thuật phân tích khối đượ c sử d ụng phổ biến là bộ phận phân tích

tứ cực, bẫy ion (ion trap), thờ i gian bay (time of flight- TOF). Bộ phân tích

khối tứ cực chậ p ba đượ c sử d ụng phổ biến trong k ỹ thuật LC-MS/MS và đây

cũng là k ỹ thuật đượ c chúng tôi sử d ụng trong nghiên cứu này.

Tứ cực đượ c cấu tạo bở i 4 thanh điện cực song song tạo thành một

khoảng tr ống để các ion bay qua, đượ c đóng vai trò như bộ lọc khối. Khi một

tr ườ ng điện từ đượ c tạo ra bằng sự k ết hợ p giữa dòng một chiều (DC) và điện

thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào







10

tỉ số m/z và tr ườ ng RF. Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợ p mớ i có thể đi

qua đượ c bộ lọc này.

Bộ phân tích khối tứ cực chậ p ba gồm ba tứ cực đượ c ghép nối vớ inhau. Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion

mẹ vớ i m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực

thứ 2 (Q2) vớ i áp suất cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm vớ i khí tr ơ

có mặt như khí N2, Ar, He. Sau đó tất cả các ion con đượ c chuyển qua bộ tách

Q3 có nhiệm vụ tách các ion đượ c chuyển từ Q2 để tớ i bộ phận phát hiện.

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ k ế tứ cực kiểu chậ p ba

c. Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion đượ c đưa tớ i phần

cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Có hai loại bộ phận phát

hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (electron multiplier) và bộ

phận phát hiện nhân quang (photomultiplier). Bộ phận phát hiện nhân electron

là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đậ p vào

bề mặt dinod làm bật ra các electron. Các electron thứ cấ p sau đó đượ c d ẫn tớ i

các dinod tiế p theo và sẽ tạo ra electron thứ cấ p nhiều hơ n nữa, tạo thành

dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị

nhân electron, các ion ban đầu đậ p vào một dinod tạo ra dòng các electron.

Khác vớ i detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đậ p vào một màn

chắn phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này đượ c phát hiện bở i

một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ư u điểm của phươ ng







11

pháp này là các ống nhân quang đượ c đặt trong chân không nên loại bỏ đượ c

các khả năng nhiễm bẩn.

1.2.3. Một số k ỹ thuật ghi phổMột số k ỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :

* Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác vớ i chế độ scan, detector sẽ nhận đượ c tất cả các mảnh ion

để cho khối phổ toàn ion đối vớ i tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.

Thườ ng dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ

lớ n. Đối vớ i đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thườ ng đượ c lựa chọn

để khảo sát ion mẹ.

* Chế độ chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring: SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion

đặc tr ưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã

đượ c lựa chọn tr ướ c đó. Đối vớ i đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM

thườ ng đượ c lựa chọn để khảo sát năng lượ ng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.* SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction

Monitoring)

Đối vớ i khối phổ ba tứ cực, 2 k ỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thườ ng

đượ c sử d ụng là SRM và MRM.

SRM: cô lậ p ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lậ p đó, trong các

mảnh ion sinh ra, cô lậ p 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để

phát hiện.

MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt k ỹ thuật đối vớ i phân tích vi

lượ ng nên các ion con cần quan tâm thườ ng từ 2 tr ở lên, do vậy k ỹ thuật ghi

phổ MRM thông d ụng hơ n SRM. Đầu tiên, cô lậ p ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ

cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lậ p đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va

chạm) thu đượ c các ion con, cô lậ p 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ







12

cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

1.2.4. Ứ ng dụng của LC-MS/MS

- Nghiên cứu hợ p chất mớ i, đặc biệt là nghiên cứu phát triển thuốc.- Nghiên cứu, xác định hợ p chất sinh học phức tạ p, định dạng protein.

- Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng tr ưở ng.

- Phân tích, định lượ ng thuốc trong dịch sinh học: theo dõi thông số dượ c

động học, sinh khả dụng, theo dõi điều tr ị.

- Phân tích, định lượ ng thuốc trong các mẫu nướ c thải bệnh viện, nướ c thải

của các nhà máy sản xuất dượ c phẩm, các mẫu nướ c tự nhiên.

1.2.5. K ỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Các mẫu sinh học, mẫu môi tr ườ ng thườ ng có thành phần r ất phức

tạ p, hàm lượ ng chất cần phân tích khá thấ p nên không tươ ng thích cho việc

phân tích tr ực tiế p trên hệ sắc ký. Do vậy, tr ướ c khi phân tích mẫu chúng ta

cần phải tách, làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích. Có r ất nhiều

phươ ng pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơ i, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng,sắc ký cột, chiết Soxhlet, chiết pha r ắn (Solid Phase Extraction– SPE)....

nhưng tất cả các phươ ng pháp này đều phải đáp ứng đượ c các tiêu chí:

- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.

- Cô đặc mẫu

- Lượ ng mẫu không cần nhiều.

- Lượ ng dung môi tiêu thụ ít.

- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu.

- Đơ n giản, nhanh.

Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu mà

chúng tôi chọn phươ ng pháp SPE để xử lý mẫu.

Có 6 bướ c chính trong quá trình chiết pha r ắn:

Bướ c 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tươ ng tác đượ c







13

vớ i chất hấ p phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải đượ c lọc hoặc ly tâm tr ướ c khi

cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột.

Bướ c 2. Hoạt hóa cột: làm ướ t pha r ắn, tạo môi tr ườ ng thích hợ p cho việc hấ pthu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất

hấ p phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơ n thể tích quy định này sẽ làm

tăng nguy cơ pha r ắn không đượ c solvat hóa hoàn toàn, k ết quả độ thu hồi của

mẫu thấ p.

Bướ c 3. Cân bằng cột: Tr ướ c khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tươ ng

đươ ng vớ i điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi

có điều kiện tươ ng đươ ng dung môi chứa mẫu.

Bướ c 4. Nạ p mẫu: mẫu đượ c cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua

cột khoảng 0,5 – 1 ml/phút.

Bướ c 5. R ửa pha r ắn: dùng dung môi thích hợ p để loại các tạ p chất ra khỏi cột

nhưng vẫn giữ lại đượ c chất cần phân tích.

Bướ c 6. R ửa giải: sử dụng dung môi thích hợ p để tách chất cần phân tích ra

khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi r ửa giải không đượ c quá nhanh. Tốc độ này

phụ thuộc vào đườ ng kính cột và khối lượ ng chất hấ p phụ, ngườ i ta thườ ng

r ửa vớ i tốc độ khoảng 1ml/phút.

1.3. Một số nghiên cứ u xác định hàm lượ ng Quinolon trong nướ c thải ở

Việt Nam và trên thế giớ i

Các kháng sinh quinolon có phổ tác dụng r ộng, hoạt lực mạnh, đượ c sử

dụng trong nhiều tr ườ ng hợ p, nên đây là những kháng sinh đượ c quan tâm

nghiên cứu nhiều vớ i nền mẫu phong phú như: trong chế phẩm, dịch sinh học,

các nguồn nướ c tự nhiên đến nướ c thải sinh hoạt, bệnh viện, công ty dượ c.

Phươ ng pháp định tính, định lượ ng cũng đa dạng từ phươ ng pháp vi sinh,

quang học, HPLC detector huỳnh quang vớ i độ nhạy và tính chọn lọc cao,

nhưng lại khó có thể phân tích các nhóm kháng sinh có trong nướ c thải vớ i

mức giớ i hạn cho phép thấ p (ppb). Các nghiên cứu sử dụng trên thống HPLC-







14

MS/MS trên nền mẫu nướ c thải cũng đượ c thế giớ i nghiên cứu, nhưng chưa

đượ c áp dụng vớ i nướ c thải công nghiệ p dượ c ở Việt Nam. Một số nghiên

cứu xác định dư lượ ng một số kháng sinh quinolon như sau:- Dươ ng Hồng Anh và cộng sự (2007) đã phân tích lượ ng vết một số kháng

sinh họ Floquinolon trong nướ c thải bệnh viện dựa trên hai giai đoan chiết

tách và làm giàu bằng phươ ng pháp chiết pha r ắn sử dụng cột chiết cation hỗn

hợ p, định tính, định lượ ng bằng HPLC vớ i detectơ huỳnh quang. Quy trình có

hiệu suất thu hồi cao (trung bình 84 - 101%), giớ i hạn định lượ ng 0,5 - 1 μg/L

[2].

- Jay E.Renew và Ching Hua Huang (2004) đã định lượ ng đồng thờ i các

kháng sinh fluoroquinolon trong nướ c thải bằng phươ ng pháp LC- MS sử

dụng cột C18, tốc độ 0,25 ml/phút, chươ ng trình gradient: pha động A (1mM

CH3COONH4; 0,007 % acid acetic băng; 10% ACN), pha động B (100%

ACN). Phươ ng pháp có độ thu hồi trên 90% vớ i 1 µg/L vớ i các chất phân

tích, giớ i hạn phát hiện trong khoảng 20 – 50 ng/L [24].

- Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và đánh giá dư lượ ng của 7

kháng sinh, trong đó có ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin

trong nướ c thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ. Nghiên cứu đã sử dụng k ỹ

thuật chiết pha r ắn và phươ ng pháp LC-MS/MS vớ i LOD của phươ ng pháp từ

0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh [31].

- N. Dorival – Garcia và cộng sự (2013) đã xây dựng phươ ng pháp phát hiện

13 kháng sinh quinolon trong nướ c thải sử dụng chiết pha r ắn và hệ thống

HPLC- MS/MS sử dụng cột UPLC. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp

trong khoảng 0,02 – 0,04 ng/ml, giớ i hạn định lượ ng trong khoảng 0,07 – 0,15

ng/ml, độ thu hồi từ 98,5% - 103,9% tùy thuộc vào mỗi kháng sinh [29].









16

2.2.2. Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ gồm c ó :

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC-

MS/MS (Mỹ)

- Cột Agilent SB C18 (1,8 μm; 2,1 x 50mm) ; Cột Agilent Eclipse XDB-

C18 (3,5μm; 3,0 x 150mm).

- Cột chiết pha r ắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, Oasis

(Mỹ)

- Máy lắc siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn quốc)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 (chính xác đến 0,1mg) (Thụy Sỹ)

- Cân Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg) (Thụy Sỹ)

- Máy lọc hút chân không

- Màng lọc 0,45 μm và 0,2 μm Cellulose acetat, Sartorius (Đức)

- Máy lọc nướ c siêu tinh khiết

- Tủ lạnh

- Dụng cụ thủy tinh các loại: bình định mức 10 ml, pipet chính xác, các

dụng cụ thủy tinh, micro pipet, vial...

2.3. PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.3.1. Phươ ng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử

Thờ i gian lấy mẫu: 1/8 – 17/08.

Vị trí lấy mẫu: lấy mẫu tại bể nướ c thải tr ướ c khi đổ ra môi tr ườ ng củacác công ty sản xuất dượ c phẩm.

Lọc, điều chỉnh đến pH = 2.

Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2- 80C nếu phân tích ngay trong 24 giờ hoặc

bảo quản ở tủ lạnh sâu – 300C trong vòng 1 tháng.







17

2.3.2. Khảo sát, lự a chọn các điều kiện sắc ký

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn của từng kháng sinh, IS và hỗn hợ p

các kháng sinh vớ i IS pha trong dung môi pha động.

* Khảo sát điều kiện khối phổ: Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa,

điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn mảnh ion con có cườ ng độ

lớ n nhất dùng để định lượ ng.

* Khảo sát các thông số sắc ký

- Cột: Để lựa chọn cột phân tích, sử dụng cột Agilent SB C18 (1,8µm;

2,1x50mm) và cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5µm; 3,0 x 150mm) phân

tích dung dịch chuẩn của các kháng sinh ở nồng độ 100ppb và tiến hành kiểm

tra khả năng tách và thờ i gian lưu. Lựa chọn cột có khả năng tách, pic chất

phân tích trong sắc ký đồ không bị chậ p vớ i các pic nhiễu khác, khả năng tách

rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thờ i gian lưu không đượ c quá dài.

- Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thờ i gian phân tích không quá dài, đáp

ứng của chuẩn nội tốt. Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là

Ciprofloxacin 13C3. Đây là đồng vị carbon C13 của Ciprofloxacin, không có

sẵn trong tự nhiên.

- Chươ ng trình pha động: Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát

pha động ACN (0,1% HCOOH) : H2O (0,1% HCOOH) vớ i tỷ lệ thể tích / thể

tích khác nhau và chạy chế độ gradient khác nhau. Pha động đượ c chọn phải

đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chậ p vớ i các pic nhiễu

khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thờ i gian lưu không đượ c quá dài.

- Tốc độ dòng: Khảo sát lần lượ t các tốc độ 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút để xác định

tốc độ phù hợ p. Chọn tốc độ cho pic cân đối, ít doãng và thờ i gian lưu ngắn.

- Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi thể tích tiêm 1, 5, 10, 20μl để xác định thể tích

tiêm phù hợ p cho sắc ký đồ đẹ p, diện tích pic và độ đáp ứng cao.







18

2.3.3. Khảo sát phươ ng pháp xử lý mẫu

- Mục đích: tìm đượ c loại dung môi, thể tích mẫu chiết để xử lý mẫu có

độ thu hồi cao, loại đượ c nhiều tạ p chất.- Tiến hành xử lý mẫu thử bằng các cách khác nhau. Định lượ ng hoạt

chất theo quy trình đã lựa chọn. Đánh giá và tìm ra cách xử lý phù hợ p.

2.3.4. Thẩm định phươ ng pháp

Xử lý các mẫu nghiên cứu theo phươ ng pháp đã xây dựng, tiến hành sắc

ký các dung dịch thu đượ c theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phươ ng pháp

dựa trên các chỉ tiêu:

* Tính thích hợ p của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thờ i

gian lưu và diện tích pic khi tiêm lặ p lại 6 lần liên tiế p dung dịch chuẩn hỗn

hợ p các kháng sinh và IS .

Yêu cầu: RSD về thờ i gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn nội và kháng

sinh < 5%.

* Độ đặc hiệu: độ đặc hiệu đượ c đánh giá thông qua phân tích các dung dịch

chuẩn, mẫu tr ắng và mẫu tự tạo. Tiến hành như sau:

- Dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết.

- Mẫu tr ắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo quy trình đã xây dựng.

- Mẫu tự tạo là mẫu tr ắng thêm một lượ ng chính xác các kháng sinh và chất

chuẩn nội đã biết nồng độ.

Tiến hành xử lý và phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu tr ắng, mẫu tự

tạo theo các điều kiện đã chọn.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, mẫu tr ắng phải không xuất hiện pic có thờ i gian lưu

tươ ng ứng vớ i thờ i gian lưu của các mảnh khối phổ tươ ng ứng vớ i số khối của

chất phân tích trong mẫu chuẩn và mẫu chuẩn nội. Mỗi chất đượ c xác định

bở i 3 ion vớ i số điểm IP = 4 bao gồm: 1 ion mẹ (1 điểm) và 2 ion con (mỗi

ion con là 1,5 điểm).

* Khoảng tuyến tính:







19

Khoảng tuyến tính của phươ ng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượ ng đo đượ c và nồng độ chất phân tích.

Để xác định khoảng tuyến tính của phươ ng pháp, thực hiện sắc ký dãychuẩn vớ i 7 mức nồng độ của mỗi chất từ 0,5 ppb đến 50 ppb và nồng độ

chuẩn nội cố định là 20 ppb. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.

Xây dựng đồ thị và phươ ng trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan

hệ giữa tỷ lệ diện tích pic của kháng sinh và diện tích pic của chuẩn nội vớ i

nồng độ kháng sinh.

Tính hệ số tươ ng quan r giữa nồng độ và tỷ lệ giữa diện tích píc của chất

phân tích và diện tích píc của chuẩn nội.

Yêu cầu: r ≥ 0,99.

* Độ đúng, độ lặp lại

Độ đúng là sự đồng nhất giữa giá tr ị tìm thấy vớ i giá tr ị thực hoặc giá tr ị

đối chiếu đượ c chấ p nhận. Độ lặ p lại là độ chụm của các k ết quả đo đượ c

trong cùng điều kiện thí nghiệm.

Tiến hành thêm một lượ ng chất chuẩn xác định vào mẫu tr ắng trên 3

mức nồng độ: nồng độ thấ p LQC (bằng khoảng 2 - 3 lần LLOQ), nồng độ

trung bình MQC (khoảng 40 - 60% ULOQ) và nồng độ cao HQC (khoảng 80

- 90% ULOQ). Tính RSD để xác định độ lặ p lại của phươ ng pháp. Tính tỉ lệ

chuẩn thu hồi lại đượ c và lượ ng chuẩn thêm vào để có đượ c độ đúng của phươ ng

pháp.

Yêu cầu: Độ thu hồi từ 60 – 115 %, RSD ≤ 21%.

* Giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích có trong mẫu thử mà

ta có thể định lượ ng đượ c vớ i độ đúng và độ chính xác thích hợ p. LOQ

đượ c chấ p nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải gấ p ít nhất 10 lần đáp

ứng của mẫu tr ắng.

Giớ i hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong







20

mẫu có thể phát hiện đượ c nhưng chưa thể định lượ ng đượ c.

LOD đượ c coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp

ứng 3 l

ần so v

ớ i

đáp

ứng tín hi

ệu c

ủa m

ẫu tr

ắng (S/N = 3).

LOD đượ c tính theo công thức

LOQLOD = ----------

3,3

Cách xác định: tiến hành xử lý mẫu chuẩn của các kháng sinh có nồng

độ thấ p dần và tiến hành phân tích đến khi thu đượ c S/N = 10 (thu đượ c

LOQ) hoặc S/N = 3 (thu đượ c LOD).2.3.5. Ứ ng dụng phân tích mẫu thự c

Áp dụng phươ ng pháp xây dựng đượ c để phân tích mẫu thực. K ết quả

đượ c tính theo đườ ng hồi quy tuyến tính hoặc theo điểm chuẩn.

2.3.6. Phươ ng pháp xử lý số liệu

Các k ết quả thống kê đượ c tính dựa vào các hàm trong Microsoft Excel

2010.







21

CHƯƠ NG 3. K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U

3.1. XÂY DỰ NG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo khối phổQua tham khảo một số tài liệu, tiến hành khảo sát xác định các kháng

sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin bằng k ỹ thuật phun

điện tử ESI vớ i:

- Nguồn ion hóa: ESI (+)

- Nhiệt độ khí phun: 3000C

- Tốc độ khí phun: 11 l/min

- Áp suất đầu phun: 25 psi

- Thế nguồn ion hóa: 4000 V

Để xác định điều kiện khối phổ, tiến hành pha riêng r ẽ từng chất chuẩn

Moxifloxacin, Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin trong hỗn hợ p dung môi

MeOH : H2O (1:1) có nồng độ 1 mg/ml và Ciprofloxacin 13C3 (IS) trong

MeOH có nồng độ 0,5 μg/ml. Tiêm lần lượ t các dung dịch trên vào hệ thống

khối phổ không qua cột sắc ký vớ i tốc độ 0,3 ml/min. Tiến hành khảo sát bắn

phá ion mẹ và lựa chọn ion con.

Detector sử dụng trong nghiên cứu là hệ khối phổ 2 lần, vì vậy, việc lựa

chọn ion con cũng như các điều kiện phân mảnh r ất quan tr ọng. Để thu đượ c

mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn đượ c mức năng lượ ng bắn phá

phù hợ p. Mảnh ion con có m/z có cườ ng độ lớ n nhất đượ c dùng để định

lượ ng, mảnh ion con thứ 2 có cườ ng độ thấ p hơ n dùng để định tính. Đối vớ i

chất chuẩn nội, lựa chọn một ion con đặc tr ưng

Sau khi tiến hành tối ưu hóa điều kiện phân mảnh của các dung dịch

kháng sinh và IS, tiến hành khảo sát lại các điều kiện, k ết quả thu đượ c như

sau:







22

Hình 3.1: Phổ đồ của các chất phân tích

MOXI

CIP

NOR

OFLO

IS







23

Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS

STT Chất phân tích

Ion mẹ(m/z)

Ion con(m/z)

ColissionEnergy

(V)

Thế đầuvào

(V)1 MOXI 402,1 384 364 25 130

2 OFLO 362 318 261 20 140

3 CIP 332,1 314 288 19 110

4 NOR 320 302 276 18 110

5 IS 336,1 318 291 20 110

* Nhận xét:

Để phân tích các chất bằng phươ ng pháp khối phổ, phải lựa chọn đượ c

thông số thế đầu vào để cho đáp ứng ion mẹ cao nhất và năng lượ ng bắn phá

(CE) phù hợ p để thu đượ c đáp ứng ion con cao nhất. Mỗi chất có 1 ion mẹ và

2 ion con, trong đó, mảnh ion con có cườ ng độ lớ n nhất dùng để định lượ ng,

mảnh thứ 2 có cườ ng độ thấ p hơ n dùng để định tính. K ết quả ở hình 3.1 và

bảng 3.1 cho thấy, đã lựa chọn đượ c các thông số và mảnh ion cụ thể của từng

chất.

3.1.2. Khảo sát các điều kiện của sắc ký

* C ột

Trong nghiên cứu này, qua tham khảo tài liệu và điều kiện thực tế, lựa

chọn Cột Agilent SB- C18 (1,8µm; 2,1x50mm) và cột Agilent Eclipse XDB-

C18 (3,5µm; 3,0 x 150mm) để phân tích kháng sinh. Tiến hành sắc ký bằng 2

cột này ở các thể tích tiêm 1, 5, 10, 20 μl. K ết quả thu đượ c như sau:







24

MOXI

OFLO

IS

CIP

NOR

(a) (b) (c)

Hình 3.2 : Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột SB- C18 vớ icác thể tích tiêm

(a) Thể tích tiêm 1 µl

(b) Thể tích tiêm 5 µl

(c) Thể tích tiêm 10µl







25

MOXI

OFLO

IS

CIP

NOR

(a) (b) (c)

Hình 3.3 : Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột Eclipse

XDB- C18 ở các thể tích tiêm

(a) Thể tích tiêm 5 µl

(b) Thể tích tiêm 10 µl

(c) Thể tích tiêm 20µl

Nhận xét:

Khi dùng cột SB- C18 và Eclipse XDB- C18, vớ i thể tích tiêm mẫu nhỏ,

đáp ứng của chất phân tích kém, vớ i thể tích tiêm mẫu lớ n hơ n, đáp ứng cũng

tr ở nên tốt hơ n; tuy nhiên, thể tích tiêm lớ n có thể ảnh hưở ng đến hiệu lực cột

khi phân tích trong thờ i gian dài.Thờ i gian lưu của các kháng sinh khi sử dụng cột SB- C18 gần bằng

nhau và ngắn hơ n không đáng k ể so vớ i khi dùng cột Eclipse XDB- C18. Như

vậy, có thể sử dụng 2 cột này để phân tích. Nhưng khi thể tích tiêm mẫu càng

lớ n, sử dụng cột SB- C18 làm các pic chất phân tích bị doãng, không cân

xứng, đáp ứng kém hơ n khi dùng cột Eclipse XDB- C18. Nguyên nhân có thể

do cột SB- C18 ngắn hơ n nên dung lượ ng của cột kém hơ n so vớ i cột Eclipse









27

(b)

(c)

Hình 3.4 : Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khi khảo sát tốc độ dòng

(a)Tốc độ dòng 0,3 ml/min

(b)Tốc độ dòng 0,5 ml/min

(c)Tốc độ dòng 0,6 ml/min

Nhận xét:

Tại tốc độ 0,3ml/phút, thờ i gian phân tích lâu hơ n, pic bị doãng chân.

Tốc độ 0,6 ml/phút, sắc ký đồ xuất hiện nhiều tạ p. Nguyên nhân do tốc độ

dòng cao nên tốc độ khí cung cấ p cho nguồn ion hóa để bay hơ i dung môi ảnh

MOXI

MOXI

OFLO

OFLO

IS

IS

CIP

CIP

NOR

NOR







28

hưở ng đến khả năng chuyển mẫu vào bộ phận khối phổ, vì vậy, ảnh hưở ng

đến khả năng ion hóa. Tại tốc độ 0,5 ml/phút, các pic cân xứng, thờ i gian lưu

tách rõ ràng, thờ i gian phân tích ngắn.Vì vậy, chúng tôi chọn tốc độ 0,5 ml/phút để tiến hành phân tích.

* Khảo sát chươ ng trình pha động

Qua tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát ở 2 chế độ: gradient 1 và gradient 2

vớ i các tỷ lệ dung môi như sau:

- Chế độ Gradient 1:

Thờ i gian(phút) Tỷ lệ (%) thành phần pha độngH2O +

0,1 % acid formic

ACN +

0,1 % acid formic

0 100 0

1 100 0

5 0 100

8 0 100

9 100 0

- Chế độ Gradient 2:

Thờ i gian(phút)

Tỷ lệ (%) thành phần pha động

H2O +

0,1 % acid formic

ACN +

0,1 % acid formic

0 95 5

1 95 5

5 0 100

8 0 100

9 95 5

Thờ i gian phân tích: 9 phút, postrun: 5 phút.

K ết quả như sau:







29

(a) Sắc ký đồ khi chạy gradient 1

(b) sắc ký đồ khi chạy gradient 2

Hình 3.5: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn pha động

Nhận xét:

K ết quả ở hình 3.5 cho thấy chế độ sắc ký gradient 1 cho pic sắc kýnhiều tạ p hơ n chế độ gradient 2. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn chế độ gradient 2

để phân tích các kháng sinh.

3.1.3. Xây dự ng quy trình xử lý mẫu

Mẫu nướ c thải của các công ty sản xuất dượ c thườ ng có thành phần

r ất phức tạ p, hàm lượ ng chất cần phân tích khá thấ p, không tươ ng thích

cho việc phân tích tr ực tiế p trên hệ sắc ký. Do vậy, tr ướ c khi phân tích

mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợ p phần của mẫu cần phân

MOXI

OFLO

IS

NOR

CIP

MOXI

OFLO

IS

CIP

NOR







30

tích. Có r ất nhiều phươ ng pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơ i, làm khô, ly

tâm, chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, vi sóng....

Qua tham khảo tài liệu, vớ i những ưu điểm của phươ ng pháp chiết

pha r ắn SPE, chúng tôi lựa chọn phươ ng pháp này để xử lý mẫu.

Chúng tôi tiến hành khảo sát thể tích chiết, dung môi r ửa giải như sau:

* Khảo sát, lự a chọn thể tích mẫu chiết

Tiến hành chiết qua cột vớ i 100 ml và 200 ml mẫu thử có thêm dung

dịch chuẩn hỗn hợ p nồng độ 50 ppb. Sau đó, tiến hành sắc ký vớ i các điều

kiện đã đượ c khảo sát ở mục 3.1.1 và 3.1.2 như trên, thu đượ c sắc ký đồ như

sau:

(a)

NOR

MOXI

OFLO

IS

CIP







31

(b)

Hình 3.6: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát thể tích mẫu chiết

(a) 100ml mẫu thử

(b) 200ml mẫu thử

Hiệu suất chiết ở từng điều kiện như sau:

Bảng 3.2: Hiệu suất chiết các kháng sinh quinolon ở 2 thể tích chiết

100 ml và 200 ml

Kháng

sinh

S pic ở nồng

độ 50ppb

V chiết 100 ml V chiết 200 ml

S Hiệu suất

(%)

S Hiệu suất

(%)

MOXI 1924 1312 75,85 126 35,78

OFLO 6544 3589 61,01 289 23,9

CIP 1245 1146 102,4 169 41,98

NOR 484 502 115,38 453 52,61

IS 188 169 213

NOR

MOXI

OFLO

IS

CIP







32

Nhận xét:

Vớ i thể tích chiết 100 ml, sắc ký đồ cho pic rõ nét và ít tạ p hơ n so vớ i

khi chiết 200 ml. Ngoài ra, hiệu suất chiết cao hơ n hẳn so vớ i khi chiết 200 mldịch. Có thể do vớ i thể tích chiết lớ n, vượ t quá dung lượ ng cột, vì vậy, hiệu

suất chiết của cột giảm. Do đó, chúng tôi chọn thể tích chiết 100 ml để xử lý

mẫu.

* Khảo sát dung môi rử a giải

Sau khi chiết 100 ml dung dịch mẫu thử có nồng độ kháng sinh 50ppb

qua cột, tiến hành khảo sát dung môi r ửa giải vớ i 3 dung môi MeOH, ACN và

5%TEA/ MeOH, thể tích r ửa giải là 10 ml. K ết quả hiệu suất chiết như sau:

Bảng 3.3: Hiệu suất chiết các kháng sinh quinolon khi dùng

các dung môi r ửa giải khác nhau

Kháng sinh Dung môi ACN Dung môi

5%TEA/MeOH

Dung môi MeOH

S Hiệu suất(%)

S Hiệu suất(%)

S Hiệu suất(%)

MOXI 1216 71,15 1032 65,91 1312 75,85

OFLO 3048 52,43 3136 58,88 3589 68,01

CIP 895 80,93 719 70,96 1146 102,4

NOR 332 77,22 326 82,76 502 115,38

IS 167 153 169









34

độ 1 mg/ml. Sau đó, pha loãng dung dịch này bằng hỗn hợ p MeOH : H2O

(1:1) để thu đượ c dung dịch chuẩn hỗn hợ p các kháng sinh có nồng độ chính

xác khoảng 500 ppb.

- Dãy dung dịch chuẩn: Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn từ dung dịch

chuẩn gốc hỗn hợ p các kháng sinh để có nồng độ trong khoảng 0,5 – 50 ppb

và nồng độ chất chuẩn nội là 20 ppb vớ i dung môi là mẫu tr ắng, đã chiết qua

cột chiết pha r ắn. Tiến hành lọc các dung dịch thử trên qua màng lọc 0,2 µm.

v Quy trình xử lý mẫu

- Tiến hành xử lý vớ i 100 ml nướ c thải như sau:

- Lọc nướ c thải 2 lần qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm để xử lý sơ bộ để

loại tạ p

- Acid hóa dịch lọc đến pH = 2 bằng dung dịch HCl 10%

- Thêm 5ml dung dịch Na2EDTA 5% để loại tạ p.

- Hoạt hóa cột bằng 5ml MeOH → 5 ml H2O → 5ml H2O đã điều

chỉnh pH = 2 bằng dung dịch HCl 10%

- Đưa mẫu lên cột: tốc độ 0,5- 1 ml/phút.

- R ửa cột: 10 ml H2O, làm khô cột trong 10 phút.

- R ửa giải bằng 10ml MeOH.

- Cô cạn bằng khí tr ơ N2 đến khi thu đượ c cắn, hòa tan cắn bằng 1ml hỗn

hợ p dung môi MeOH : H2O (1:1) r ồi mang đi phân tích.

v Điều kiện sắc ký

Cột: Cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5 µm; 3,0 x 150mm)

Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

Tốc độ dòng: 0,5 ml/min

Pha động- chươ ng trình gradient:







35

Thờ i gian(phút)

Tỷ lệ (%) thành phần pha động

0,1 % HCOOH/H2O 0,1 % HCOOH/ACN0 95 5

1 95 5

5 0 100

8 0 100

9 95 5

v Điều kiện khối phổ

Nguồn ion hóa: ESI (+)

Nhiệt độ khí phun: 300OC

Tốc độ khí phun: 11 l/min

Áp suất đầu phun: 25 psi

Thế nguồn ion hóa: 4000 V

STT Chất phân tích

Ion mẹ(m/z)

Ion con(m/z)

ColissionEnergy

(V)

Thếđầu vào

(V)

1 Moxifloxacin 402,1 384 364 25 130

2 Ofloxacin 362 318 261 20 140

3 Ciprofloxacin 332,1 314 288 19 110

4 Norfloxacin 320 302 276 18 110

5 IS 336,1 318 291 20 110

3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠ NG PHÁP

3.2.1. Độ thích hợ p của hệ thống

Từ dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn nội chuẩn bị như mục 3.1.4,

tiến hành pha để có dung dịch chuẩn hỗn hợ p chứa đồng thờ i các kháng sinh

có nồng độ 30 ppb và chuẩn nội có nồng độ là 20 ppb. Tiến hành sắc ký mẫu







36

này 6 lần liên tiế p theo điều kiện sắc ký đã chọn như mục 3.1.4. K ết quả đượ c

trình bày ở Bảng 3.4 như sau:

Bảng 3.4: K ết quả xác định độ thích hợ p hệ thống

Tên chất L1 L2 L3 L4 L5 L6 TB RSD

MOXI Spic 1154 1148 1193 1200 1158 1092 1158 3,34

tR (phút) 4,849 4,846 4,847 4,847 4,848 4,849 4,848 0,02

OFLO Spic 4076 4137 4133 4167 4261 4184 4160 1,49

tR (phút) 4,617 4,616 4,617 4,616 4,617 4,617 4,617 0,01

CIP Spic 763 770 739 779 762 799 769 2,59

tR (phút) 4,634 4,633 4,635 4,633 4,633 4,634 4,634 0,02

NOR Spic 340 333 342 376 340 349 347 4,40

tR (phút) 4,605 4,602 4,604 4,604 4,604 4,604 4,604 0,02

IS Spic 193 201 194 210 197 196 199 3,17

tR (phút) 4,632 4,632 4,633 4,632 4,631 4,633 4,632 0,02

Nhận xét:

K ết quả cho thấy RSD của thờ i gian lưu của chuẩn nội và các kháng sinh

đều < 1% và RSD của diện tích píc của các kháng sinh và của chuẩn nội

<15%. Như vậy, hệ thống đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượ ng các

kháng sinh trong mẫu nướ c thải.

3.2.2. Tính đặc hiệu của phươ ng pháp

Độ đặc hiệu đượ c đánh giá qua phân tích các dung dịch chuẩn, dung dịch

mẫu tr ắng, dung dịch mẫu tr ắng thêm các kháng sinh







37

Theo quy định của châu Âu (2002/657/EC) về phân tích dư lượ ng,

phươ ng pháp đạt yêu cầu khi có ít nhất 4 điểm IP. Ở phươ ng pháp LC- MS

này, khi tiến hành phân tích, phải có 1 ion mẹ và 2 ion con vớ i mỗi chất. Như vậy, phươ ng pháp đã xây dựng đạt yêu cầu.

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu tr ắng (placebo) và dung

dịch mẫu tự tạo như sau:

- Mẫu tr ắng: Nướ c thải đã xử lý như mục 3.1.4

- Mẫu dung dịch chuẩn hỗn hợ p: pha loãng dung dịch hỗn hợ p chuẩn gốc

và dung dịch chuẩn nội vớ i dung môi MeOH : H2O (1:1) để có dung dịch

chuẩn hỗn hợ p kháng sinh nồng độ 100 ppb và chuẩn nội 20 ppb.

- Mẫu tr ắng thêm chuẩn: pha loãng dung dịch hỗn hợ p chuẩn gốc và

dung dịch chuẩn nội trong nướ c thải đã xử lý sơ bộ như mục 3.1.4 để có dung

dịch chuẩn hỗn hợ p kháng sinh nồng độ 100 ppb và chuẩn nội 20 ppb, lọc qua

màng lọc 0,2 μm.

Tiến hành sắc ký các dung dịch này theo điều kiện sắc ký đã xác định. K ết

quả sắc ký thu đượ c như sau:

(a) Mẫu tr ắng

IS

MOXI

OFLO

CIP

NOR







38

(b) Mẫu dung dịch chuẩn

(c) Mẫu tr ắng thêm chuẩn

Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phươ ng pháp

Nhận xét:

- Trên sắc ký đồ mẫu tr ắng không xuất hiện pic lạ có cùng thờ i gian lưu vớ icác kháng sinh và IS.

- Trên sắc ký đồ của mẫu tr ắng thêm chuẩn hỗn hợ p các kháng sinh và IS xuất

hiện pic đẹ p, cân xứng, có cùng thờ i gian lưu vớ i mẫu dung dịch chuẩn hỗn

hợ p.

Như vậy, phươ ng pháp có độ đặc hiệu tốt, đáp ứng đượ c yêu cầu phân tích.

NOR

CIP

IS

NOR

MOXI

IS

OFLO

OFLO

CIP

MOXI







39

3.2.3. Khoảng tuyến tính

Từ dung dịch chuẩn hỗn hợ p các kháng sinh và dung dịch chuẩn nội gốc

đượ c chuẩn bị như phần 3.1.4, pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợ p kháng

sinh có nồng độ 0,5-50 ppb và nồng độ chuẩn nội là 20 ppb, dung môi là mẫu

tr ắng đượ c chiết qua cột chiết pha r ắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành

sắc ký theo điều kiện đã chọn như mục 3.1.4, k ết quả thu đượ c như sau:

Bảng 3.5. K ết quả khảo sát độ tuyến tính của phươ ng pháp

STT IS MOXI OFLO

Spic Nồng độ

(ppb)

Spic Tỷ số Nồng độ

(ppb)

Spic Tỷ số

1 158 0,511 29 0,1835 0,52 124 0,7848

2 160 5,105 277 1,731 5,199 957 5,981

3 175 10,21 445 2,543 10,398 1550 8,857

4 196 20,42 847 4,321 20,796 2849 14,536

5 193 30,63 1158 6,000 31,194 4261 22,078

6 187 40,84 1516 8,107 41,592 5032 26,909

7 188 51,05 1924 10,234 51,99 6544 34,809

Phươ ng trình hồi quy

y = 0,1896x + 0,4316

Hệ số tươ ng quan r = 0,9978


y = 0,6303x + 1,7198








40

STT IS CIPRO NOR

Spic Nồng độ(ppb) Spic Tỷ số Nồng độ(ppb) Spic Tỷ số

1 158 1,102 62 0,392 1,026 135 0,854

2 160 5,51 205 1,281 5,13 182 1,138

3 175 11,02 318 1,817 10,26 216 1,234

4 196 22,04 561 2,862 20,52 305 1,556

5 193 33,06 762 3,948 30,78 362 1,8766 187 44,08 1011 5,406 41,04 424 2,267

7 188 55,10 1245 6,622 51,30 484 2,574


y = 0,1109x + 0,4672



y = 0,033x + 0,888


Trong đó:

x là nồng độ của kháng sinh trong mẫu tr ắng (ppb);

y là tỷ số diện tích pic của kháng sinh và chuẩn nội

Nhận xét:

Đườ ng hồi quy thẳng và có hệ số tươ ng quan r > 0,995 trong khoảng

nồng độ khảo sát, chứng tỏ có sự tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân

tích vớ i tỷ số diện tích pic của các chất phân tích vớ i chuẩn nội. Dựa vào

phươ ng trình hồi quy, có thể tính toán k ết quả định lượ ng vớ i độ tin cậy cao.

3.2.4. Độ đúng và độ lặp lại của phươ ng pháp

Độ đúng của phươ ng pháp đượ c tiến hành theo quy trình phân tích trên

mẫu tự tạo chứa lượ ng hoạt chất đã biết. Chúng tôi lựa chọn 3 nồng độ để

khảo sát là nồng độ thấ p LQC (khoảng 15 ng/ml), nồng độ trung bình MQC

(khoảng 25 ng/ml) và nồng độ cao HQC (khoảng 45 ng/ml).







41

Từ mẫu chuẩn gốc 500 ppb chuẩn bị như mục 3.1.4 thêm vào mẫu tr ắng

để đượ c các mẫu thử có nồng độ lần lượ t là 15 ppb, 25 ppb, 45 ppb. Tiến hành

xử lý mẫu và phân tích theo quy trình đã lựa chọn như phần 3.1.4.

Tính lượ ng chuẩn thu hồi đượ c theo phươ ng trình hồi quy đã xây dựng

và so sánh vớ i lượ ng chuẩn thêm vào. K ết quả thu đượ c như Bảng 3.6.

Bảng 3.6.a: K ết quả khảo sát độ đúng của phươ ng pháp (mức LQC)

Nồng độ 15ppb Tỷ số

SKS/ SIS

Lượ ng chuẩn

tìm lại (ppb)

Tỷ lệ

thu hồi (%)

TB RSD

(%)

Moxifloxacin

y = 0,1896x + 0,4316

2,685 11,885 79,23

86,77 10,463,186 14,527 96,85

2,827 12,634 84,23

Ofloxacin

y= 0,6303x + 1,7198

9,406 12,195 81,30

84,62 10,6410,684 14,222 94,81

9,071 11,663 77,75

Ciprofloxacin

y = 0,1109x + 0,4672

1,964 13,497 89,98

105,69 12,942,379 17,239 114,93

2,333 16,824 112,16

Norfloxacin

y= 0,033x + 0,888

1,358 14,242 94,95

92,79 9,571,299 12,455 83,03

1,385 15,06 100,40







42

Bảng 3.6.b: K ết quả khảo sát độ đúng của phươ ng pháp (mức MQC)

Nồng độ25ppb

Tỷ sốSKS/ SIS

Lượ ng chuẩntìm lại (ng/ml)

Tỷ lệ thu hồi(%)

TB RSD(%)

Moxifloxacin 5,344 25,91 103,64

104,08 5,445,643 27,486 109,95

5,108 24,665 98,66

Ofloxacin 18,067 25,936 103,74

100,06 3,3717,024 24,281 97,12

17,369 24,828 99,31

Ciprofloxacin 3,628 28,501 114,00

106,01 10,903,552 27,816 111,26

3,039 23,190 92,76

Norfloxacin 1,800 27,636 110,55

105,29 7,671,790 27,333 109,33

1,680 24,00 96,00







43

Bảng 3.6.c: K ết quả khảo sát độ đúng của phươ ng pháp (mức HQC)

Nồng độ45ppb Tỷ sốSKS/ SIS

Lượ ng chuẩntìm lại (ng/ml)

Tỷ lệ thu hồi(%)

TB RSD(%)

Moxifloxacin 8,127 40,588 90,20

88,99 3,387,732 38,504 85,57

8,214 41,046 91,21

Ofloxacin 27,923 41,573 92,38

90,01 3,4026,268 38,947 86,5527,560 40,997 91,10

Ciprofloxacin 5,635 46,599 103,55

100,11 4,395,216 42,21 95,16

5,538 45,724 101,61

Norfloxacin 2,586 51,455 114,34

106,31 8,162,484 48,364 107,48

2,330 43,697 97,10

Nhận xét:

Theo qui định của FDA, AOAC thì khi phân tích dư lượ ng kháng sinh

trong nướ c thải, % tìm lại tại khoảng nồng độ 10ppb - 100ppb đạt trong

khoảng 60% - 115% (RSD < 15%). K ết quả thu đượ c có độ đúng từ 77,75 –

114,93%, RSD tại mỗi mức nồng độ <15% chứng tỏ phươ ng pháp có độ đúng

cao, thích hợ p để định lượ ng các kháng sinh này trong nướ c thải.

3.2.5. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng

Để xác định LOD, LOQ của phươ ng pháp, tiến hành pha loãng dung

dịch chuẩn hỗn hợ p các kháng sinh và phân tích cho đến khi không còn đáp

ứng. Tiến hành phân tích các dung dịch này thu đượ c sắc ký đồ như sau:









45

Nhận xét:

Phân tích vớ i mẫu có nồng độ 0,2 ppb Ofloxacin cho đáp ứng S/N = 19,7

nên xác định LOQ của Ofloxacin khoảng 0,1ppb. Dung dịch Moxifloxacin và

Ciprofloxacin 0,5ppb cho đáp ứng S/N = 13,2 và 13,6; xấ p xỉ 10 nên xác định

LOQ của Moxifloxacin và Ciprofloxacin khoảng 0,5ppb. Vớ i mẫu có nồng độ

0,2 ppb của Norfloxacin cho đáp ứng S/N = 3,1 nên LOD của kháng sinh này

là khoảng 0,2 ppb.

LOD và LOQ đượ c tính theo công thức:

LOD = LOQ/3,3

K ết quả giá tr ị LOD, LOQ của từng kháng sinh là:

Bảng 3.7 : K ết quả giá tr ị LOD, LOQ của phươ ng pháp

Kháng sinh LOD (ppb) LOQ (ppb)

Moxifloxacin 0,15 0,5

Ofloxacin 0,03 0,1

Ciprofloxacin 0,15 0,5

Norfloxacin 0,2 0,66

Như vậy, chúng tôi đã xây dựng đượ c phươ ng pháp xác định dư lượ ng

các kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin bằng

phươ ng pháp LC- MS/MS vớ i sử dụng cột Agilent Eclipse XDB- C18

(3,5µm; 3,0 x 150mm), vớ i chươ ng trình gradient hỗn hợ p 2 dung môi ACN +

0,1% HCOOC và H2O + 0,1 % HCOOH. Phươ ng pháp có độ đúng, độ chínhxác từ 72,08% - 114,78%, giớ i hạn phát hiện từ 0,03 – 0,2 ppb và giớ i hạn

định lượ ng từ 0,1 – 0,66 ppb.







46

3.3. Ứ NG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰ NG ĐƯỢ C ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ

LƯỢ NG KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚ C THẢI CÔNG NGHIỆP

DƯỢ CTrong giai đoạn nghiên cứu, chúng tôi tiến hành lấy mẫu nướ c thải của

các cơ sở sản xuất dượ c phẩm vào thờ i điểm bất k ỳ. Mẫu đượ c lấy tại bể xử lý

nướ c thải cuối cùng của nhà máy, tr ướ c khi đổ ra môi tr ườ ng. Xử lý mẫu, lọc

loại tạ p và chiết qua cột theo quy trình đã khảo sát và tiến hành sắc ký. Thu

đượ c k ết quả như bảng sau:

Bảng 3.8. K ết quả phân tích mẫu nướ c thải của một số công ty dượ c phẩm

Kháng sinh

Mẫu

phân tích

Moxifloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin Norfloxacin

Tỷ lệSKS/SIS

Hàmlượ ng

(ppb)

Tỷ lệSKS/SIS

Hàm

lượ ng

(ppb)

Tỷ lệSKS/SIS

Hàm

lượ ng

(ppb)

03.08.1.S.01a - - - - - - -

05.08.2.T.02a - - - - - - -

06.08.3.S.03a - - - - - - -

06.08.4.C.04a - - - - - - -

07.08.5.T.05 b - 1,01 1,34 0,26 0,73 - -

10.08.5.T.02 b - 1,76 2,33 0,48 1,35 - -

10.08.5.C.03 b - 0,81 1,07 0,15 0,42 - -

13.08.5.S.04 b - 0,39 0,52 - - - -

13.08.5.C.05 b - 0,33 0,44 - - - -

14.08.6.S.01 b - 0,48 0,64 0,52 1,46 0,18 0,22

17.08.6S.02 b - 0,42 0,56 0,72 2,02 - -

Chú thích:

- : không phát hiện hoặc dướ i giớ i hạn phát hiện







47

Các mẫu đượ c mã hóa theo định dạng dd.mm.C.t.T vớ i

dd: ngày lấy mẫu

mm: tháng lấy mẫu

C: công ty

t: thờ i gian lấy mẫu trong ngày vớ i S: lấy mẫu buổi sáng, T: lấy mẫu buổi tr ưa,

C: lấy mẫu buổi chiều

T: thứ tự mẫu lấy

a: mẫu đã đượ c làm giàu

b: mẫu không đượ c làm giàu

Nhận xét:

Sau khi lấy mẫu nướ c thải của các công ty sản xuất dượ c phẩm, chúng

tôi xử lý, lọc loại tạ p và chỉ chiết qua cột để làm sạch nền mẫu và tiến hành

sắc ký. K ết quả cho thấy, có 7 mẫu xuất hiện kháng sinh. Vớ i 4 mẫu còn lại,không thấy có mặt kháng sinh; tiến hành chiết và làm giàu mẫu theo đúng quy

trình xử lý mẫu đã khảo sát; sắc ký các mẫu này cũng không thấy xuất hiện

kháng sinh. Trong số các mẫu nướ c thải này, hàm lượ ng của kháng sinh

Moxifloxacin dướ i nồng độ phát hiện của phươ ng pháp. Đã phát hiện kháng

sinh Ofloxacin trong 7 mẫu vớ i khoảng nồng độ phát hiện là 0,44 – 2,33 ppb

và Ciprofloxacin xuất hiện trong 5 mẫu nướ c thải vớ i khoảng nồng độ phát

hiện là 0,42 – 2,02 ppb. Norfloxacin phát hiện đượ c trong 1 mẫu vớ i nồng độ

0,22 ppb. Như vậy, phươ ng pháp xây dựng đượ c có tính khả thi, ứng dụng để

phân tích các kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và

Norfloxacin trong nướ c thải công nghiệ p dượ c.







48

CHƯƠ NG 4. BÀN LUẬN

4.1. VỀ PHƯƠ NG PHÁP XỬ LÝ MẪU

Trong số nhiều phươ ng pháp xử lý mẫu, lựa chọn phươ ng pháp chiết pha

r ắn để xử lý mẫu. Đây là phươ ng pháp xử lý loại bỏ đượ c nhiều tạ p chất và

làm giàu mẫu trong nền mẫu nướ c thải phức tạ p vớ i hàm lượ ng các chất phân

tích thấ p và hiệu suất thu hồi của các kháng sinh cao (77,75 – 114,93%). Việc

khảo sát chiết pha r ắn cho nền mẫu nướ c thải công nghiệ p dượ c cũng r ất khó

khăn do nền mẫu có nhiều chất có cấu trúc tươ ng tự nhau, do đó dễ bị hấ p phụ

cạnh tranh lên cột chiết pha r ắn nên r ất dễ giảm hiệu suất chiết. Ở Việt Nam,vớ i nghiên cứu xác định dư lượ ng kháng sinh trong nướ c thải công nghiệ p, lại

chưa có nghiên cứu nào sử dụng phươ ng pháp này. Nếu như nghiên cứu của

Tr ần Thị Huế, năm 2013, xác định dư lượ ng cefixim trong nướ c thải công

nghiệ p dượ c sử dụng phươ ng pháp chiết lỏng – lỏng để xử lý mẫu, thì đến

nghiên cứu của Nguyễn Văn Thuận năm 2014 đã bắt đầu sử dụng cột chiết

pha r ắn. Tuy nhiên, hiệu suất chiết vẫn còn thấ p, từ 40- 80% [15]. Trên thếgiớ i, các nghiên cứu sử dụng phươ ng pháp chiết pha r ắn để xử lý khá nhiều.

N. Dorival- Garcia và cộng sự (2013) cũng sử dụng cột Oasis HLB vớ i thể

tích mẫu chiết 100ml, r ửa giải bằng 8ml MeOH, độ thu hồi từ 98,5 – 103,9 %

[29]. Jay E Renew và cộng sự (2004) chiết 1000ml dung dịch mẫu chiết qua

cột HLB (Waters, Taunton, MA), r ửa giải bằng 10ml 95%MeOH/ 5%

4,38mM H3PO4. Độ thu hồi trung bình của các kháng sinh quinolon trên 90%[24]. Như vậy, phươ ng pháp chiết pha r ắn trong nghiên cứu này đã đáp ứng

đượ c yêu cầu xử lý mẫu và thu đượ c hiệu suất chiết cao.

4.2. VỀ PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH

Trên thế giớ i, các nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối

phổ để phân tích dư lượ ng kháng sinh trong nướ c thải như Jay E Renew và

cộng sự (2004) sử dụng cột Zorbax SB- C18 (5µm; 2,1 x 150 mm), tốc độ







49

dòng 0,25 ml/phút, gradient pha động của kênh A: 1mM amonia acetat,

0,007% (tt/tt) acid acetic băng và 10%ACN, kênh B: 100%ACN; detector

mảng diod và detector khối phổ [24]. Urszula Hubicka và cộng sự (2013) sửdụng cột Acquity UPLC BEH C18 (1,7µm; 2,1 x 100 mm); gradient pha động

của 0,1% acid formic trong nướ c và 0,1% acid formic trong ACN; detector

PDA [30]. Trong khi đó, nghiên cứu trong nướ c về xác định dư lượ ng kháng

sinh quinolon trong nướ c thải mớ i chỉ dừng lại ở sắc ký lỏng hiệu năng cao,

detector huỳnh quang, như trong nghiên cứu của Dươ ng Hồng Anh và cộng

sự (2007) vớ i 2 bướ c sóng kích thích 278 nm, bướ c sóng phát xạ 445nm [2].

Các nghiên cứu trong nướ c hiện nay đa số chỉ dừng lại ở các phươ ng

pháp như đo quang hay HPLC nên giớ i hạn phát hiện của các phươ ng pháp

này hạn chế so vớ i phươ ng pháp phân tích khối phổ có độ chính xác và giớ i

hạn phát hiện dư lượ ng các kháng sinh trong nướ c thải r ất thấ p.

Ngoài ra, nếu các nghiên cứu tr ướ c đây chỉ sử dụng các chất trong cùng

nhóm nghiên cứu để làm chuẩn nội thì trong nghiên cứu này, chúng tôi sử

dụng đồng vị của kháng sinh là Ciprofloxacin 13C3 làm chất chuẩn nội. Đây

là điểm đổi mớ i so vớ i các nghiên cứu tr ướ c. Khi sử dụng các chất đồng vị

làm chuẩn nội, phươ ng pháp sẽ có độ chính xác cao hơ n vì đồng vị là các chất

không có trong tự nhiên nên sẽ không bị nhiễm vào mẫu nghiên cứu.

LC-MS/MS là một trong những trang thiết bị phân tích có độ đặc hiệu và

độ nhạy cao nhất hiện nay. Xây dựng phươ ng pháp bằng LC-MS/MS đảm bảotốt đượ c độ đặc hiệu nhưng hạn chế là thiết bị đắt tiền, chưa đượ c trang bị

r ộng rãi tại các trung tâm kiểm nghiệm. Ngoài ra, các điều kiện tiến hành

phân tích cũng đòi hỏi những yêu cầu r ất ngặt nghèo về điều kiện môi tr ườ ng,

hóa chất dụng cụ... do r ất dễ bị nhiễm chéo. Vì vậy, việc triển khai ứng dụng

phươ ng pháp phân tích bằng LC-MS/MS trong ngành Y, Dượ c còn hạn chế.







50

4.3. VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠ NG PHÁP

Sau khi tiến hành khảo sát và tối ưu các điều kiện khác như thể tích

tiêm mẫu, chươ ng trình gradient pha động... cho thấy: có mối tươ ng quan

trong tuyến tính chặt chẽ giữa tỉ số diện tích pic của kháng sinh so vớ i chuẩn

nội và nồng độ trong khoảng khảo sát 0,5 - 50 ppb vớ i r > 0,995, phươ ng

pháp có độ đúng cao (Phần tr ăm tìm lại nằm trong khoảng 77,75 - 114,93 %),

hệ thống có tính thích hợ p tốt (RSD của thờ i gian lưu < 2%; diện tích pic của

kháng sinh và chuẩn nội đều nhỏ hơ n < 5%) do đó hoàn toàn thích hợ p ứng

dụng xác định dư lượ ng các kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin,Ciprofloxacin và Norfloxacin trong nướ c thải.

Phươ ng pháp có độ nhạy cao, giớ i hạn phát hiện, giớ i hạn định lượ ng

đến nồng độ ppb (từ 0,66 ng/ml- 0,5 ng/ml) trong nướ c. Một nghiên cứu khác

của Dươ ng Hồng Anh và cộng sự (2007) sử dụng quy trình chiết pha r ắn và

HPLC vớ i detector huỳnh quang để xác định dư lượ ng của một số kháng sinh

thuộc họ quinolon trong bệnh viện cũng thu đượ c giớ i hạn phát hiện ở ppb(0,5 – 1,0 ppb). Tuy nhiên, không thể phủ nhận LC-MS/MS có khả năng phân

tích chất có nồng độ vết dướ i ppb r ất thích hợ p để định lượ ng sự tồn dư kháng

sinh trong nướ c.

Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi cũng đã tiến hành thẩm định phươ ng

pháp xây dựng đượ c và cho k ết quả tốt. Chúng tôi đã chứng minh đượ c

phươ ng pháp có tính chọn lọc cao vớ i độ đúng và độ chính xác tốt (so vớ i cáctiêu chuẩn của AOAC). Ngoài ra, khoảng tuyến tính của chúng tôi xây dựng

đượ c ở nồng độ thấ p (từ 0,5 đến 50ppb) thích hợ p để xác định dư lượ ng

kháng sinh trong nướ c thải vì nồng độ các kháng sinh đã khảo sát thườ ng r ất

nhỏ.







51

4.4. VỀ Ứ NG DỤNG PHƯƠ NG PHÁP

Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về xác định dư lượ ng kháng sinh

Quinolon trong nướ c thải công nghiệ p dượ c. So vớ i các nghiên cứu tr ướ c đâyvề xác định hàm lượ ng kháng sinh trong huyết thanh hay xác định dư lượ ng

kháng sinh trong thực phẩm hay nướ c thải bệnh viện thì đây là một hướ ng

nghiên cứu mớ i.

Phươ ng pháp đã xây dựng có khả năng định lượ ng một số kháng sinh

quinolon trong mẫu nướ c thải. Trong đó, dư lượ ng kháng sinh Ofloxacin

trong khoảng 0,44 – 2,33 ppb và Ciprofloxacin trong khoảng 0,42 – 2,02 ppb,

phát hiện đượ c dư lượ ng Norfloxacin trong 1 mẫu vớ i nồng độ 0,22 ppb và

không có mặt Moxifloxacin. Do vậy phươ ng pháp có thể áp dụng cho mẫu

nướ c thải của nhiều nhà máy khác nhau.

Ảnh hưở ng của các thuốc nói chung và các kháng sinh nói riêng có mặt

trong các nguồn nướ c tự nhiên đang là một vấn đề r ất quan tr ọng hiện nay.

Tuy chỉ tồn tại một lượ ng r ất nhỏ kháng sinh trong nguồn nướ c tự nhiên, vi

khuẩn cũng có thể phát triển các gen gây kháng kháng sinh, đây một mối đe

doạ r ất lớ n đối vớ i toàn bộ cộng đồng. Vớ i chi phí cao trong nghiên cứu, phát

triển kháng sinh mớ i và trong thờ i gian khá dài, vì vậy, vấn đề đặt ra là giảm

đượ c càng nhiều tình tr ạng kháng kháng sinh càng tốt. Tuy nhiên, vấn đề dư

lượ ng kháng sinh trong nướ c thải chưa đượ c quan tâm đúng mức. Dư lượ ng

kháng sinh trong nướ c thải chưa đượ c quy định cụ thể. Trong khi đó, vớ i

ngành công nghiệ p dượ c đang phát triển mạnh mẽ nhiều nhà máy sản xuất

kháng sinh đượ c ra đờ i. Nếu các nhà máy này xả nướ c thải chưa xử lý vào

môi tr ườ ng vớ i dư lượ ng kháng sinh cao sẽ dẫn đến sự tồn tại của chúng trong

nướ c bề mặt, nướ c ngầm và cuối cùng là nướ c uống. Từ đó, có thể làm cho vi

sinh vật thích ứng nhiều hơ n và nhiều chủng kháng thuốc phát triển trong

vùng nướ c tự nhiên. Mặc dù vậy, ở Việt Nam lại chưa có một nghiên cứu nào







52

đưa ra mức nồng độ cụ thể của kháng sinh trong nướ c thải có thể gây kháng

thuốc trên vi khuẩn.

Nghiên cứu đã xây dựng đượ c phươ ng pháp xác định dư lượ ng khángsinh vớ i độ chính xác cao, góp một công cụ mớ i để có thể đánh giá hàm lượ ng

kháng sinh trong nướ c thải. Từ đó, nâng cao ý thức xử lý nướ c thải có chứa

kháng sinh của các công ty dượ c phẩm.







53

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

K ẾT LUẬN

Từ k ết quả thực nghiệm thu đượ c, chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đề

ra là xây dựng phươ ng pháp xác định Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin

và Norfloxacin trong nướ c thải bằng sắc ký lỏng khối phổ. Cụ thể là:

* Đã xây dự ng đượ c phươ ng pháp định lượ ng các kháng sinh quinolon

(Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin) trong nướ c thải ở

các cơ sở sản xuất dượ c. Cụ thể là:

Quy trình xử lý mẫu

Lọc 100 ml nướ c thải qua giấy lọc và màng lọc 0,45µm; Acid hóa dịch

lọc đến pH = 2; Thêm 5ml dung dịch Na2EDTA 5% để loại tạ p. Chiết mẫu

qua cột SPE, tốc độ 0,5- 1 ml/phút. R ửa cột bằng 10 ml H2O và làm khô

cột trong 10 phút. R ửa giải bằng 10ml MeOH. Đối vớ i mẫu có nồng độ

kháng sinh cao, có thể lọc loại tạ p, xử lý, chiết qua cột để làm sạch mẫu và

tiến hành sắc ký.

Điều kiện sắc ký:

Sử dụng cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5 µm; 3,0mm x 150 mm),

thể tích tiêm mẫu 10 µl, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, chươ ng trình gradient pha

động có 2 kênh trong đó kênh A: H2O (0,1 % HCOOH), kênh B: ACN (0.1%

HCOOH).

Điều kiện khối phổ: Chế độ phát hiện MRM

Lựa chọn ion mẹ, năng lượ ng bắn phá ion mẹ để thu đượ c ion con, lựa

chọn đượ c các ion con phù hợ p cho quá trình phân tích định tính, định lượ ng

phù hợ p vớ i tiêu chuẩn Châu Âu 2002/657/EC. Trong đó, mảnh có cườ ng độ

lớ n nhất đượ c dùng để định lượ ng, mảnh có cườ ng độ thấ p hơ n đượ c dùng để

định tính.







54

STT Chất

phân tích

Ion mẹ

(m/z)

Ion con

(m/z)

ColissionEnergy

(V)

Thế

đầu vào

(V)1 Moxifloxacin 402,1 384 364 25 130

2 Ofloxacin 362 318 261 20 140

3 Ciprofloxacin 332,1 314 288 19 110

4 Norfloxacin 320 302 276 18 110

5 IS 336,1 318 291 20 110

* Thẩm định đượ c quy trình định lượ ng các kháng sinh trong nướ c thảiở các cơ sản xuất dượ c.

Đã thẩm định đượ c phươ ng pháp có tính đặc hiệu, có thể phân tích

đồng thờ i 4 kháng sinh trong nướ c thải. Đã xây dựng đượ c khoảng tuyến tính

từ khoảng 0,5 ppb – 50 ppb hoặc 1 ppb – 50 ppb tùy kháng sinh vớ i hệ số

tươ ng quan r ất chặt chẽ r > 0,995 đối vớ i tất cả các chất. Phươ ng pháp có độ

nhạy cao, giớ i hạn phát hiện, giớ i hạn định lượ ng đến nồng độ ppb (từ 0,66 -0,5 ppb), chứng tỏ phươ ng pháp này r ất khả thi để ứng dụng phát hiện dư

lượ ng kháng sinh trong môi tr ườ ng. Độ đúng của phươ ng pháp cao nằm trong

khoảng qui định AOAC, FDA.

Như vậy chúng tôi đã xây dựng đượ c phươ ng pháp xác định đồng thờ i

dư lượ ng các kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Cipofloxacin và

Nofloxacin trong nướ c.* Đã áp dụng phươ ng pháp phân tích xây dự ng đươ c trên 11 mẫu thự c

của 06 cơ sở sản xuất:

Đã áp dụng quy trình xây dựng đượ c vào phân tích mẫu nướ c thải của

06 cơ sở sản xuất dượ c phẩm và không thấy xuất hiện Moxifloxacin, phát

hiện đượ c Norfloxacin trong 1 mẫu vớ i nồng độ 0,22 ppb; dư lượ ng kháng

sinh Ofloxacin phát hiện đượ c trong 7 mẫu vớ i nồng độ 0,44 – 2,33ppb và







55

Ciprofloxacin phát hiện đượ c trong 05 mẫu vớ i khoảng nồng độ là 0,42 – 2,02

ppb. Quy trình xây dựng đượ c có tính khả thi để xác định dư lượ ng của

Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin trong nướ c thải côngnghiệ p dượ c.

KIẾN NGHỊ

Do thờ i gian nghiên cứu ngắn nên chúng tôi chỉ phân tích dư lượ ng 4

kháng sinh quinolon vớ i số mẫu thực ít (11 mẫu). Vì vậy, trong thờ i gian tớ i,

chúng tôi mong muốn có thể phát triển phươ ng pháp để định lượ ng đồng thờ i

nhiều kháng sinh hơ n và thẩm định trên nhiều mẫu thực tế hơ n. Đồng thờ i sosánh vớ i các phươ ng pháp khác như phươ ng pháp vi sinh vật để đánh giá toàn

diện hơ n sự liên quan giữa dư lượ ng kháng sinh và sự đề kháng, biến đổi của

vi sinh vật trong nướ c thải. Từ đó, góp phần kiểm soát dư lượ ng kháng sinh

trong nướ c thải và hạn chế tình tr ạng kháng kháng sinh.









1

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Tr ần Tử An (2007), Kiể m nghiệm d ượ c phẩ m, tr. 84- 110, Nhà xuất bản yhọc, Hà Nội

2. Dươ ng Hồng Anh và cộng sự (2007), Phát triể n phươ ng pháp phân tích

l ượ ng vế t kháng sinh họ Floquinolon trong nướ c thải bệnh viện bằ ng k ỹ thuật

chiế t pha r ắ n sử d ụng cột silicagel t ự chế t ạo và phát hiện bằ ng sắ c ký l ỏng

hiệu năng cao vớ i detect ơ hu ỳnh quang , Tạ p chí Phân tích Hóa, Lý và Sinh

học 12 (1), 3-7

3. Bộ Tài nguyên và môi tr ườ ng (2011), Thông t ư quy định quy chuẩ n k ỹ

thuật quố c gia về môi tr ườ ng.

4. Bộ môn dượ c lâm sàng, tr ườ ng Đại học Dượ c Hà Nội (2001), Dượ c lâm

sàng và đ iề u tr ị, Nhà xuất bản y học Hà Nội.

5. BộY tế (2009), Dượ c đ iể n Việt Nam IV , nhà xuất bản Y học

6. BộY tế (2009), Dượ c thư quố c gia Việt Nam, nhà xuất bản Y học

7. Cục khám chữa bệnh Việt Nam, Khảo sát tình tr ạng sử d ụng kháng sinh và

kháng kháng sinh ở Việt Nam.

8. Tr ần Đức Hậu (2006), Hóa d ượ c, tậ p 2, tr. 78- 84, tr ườ ng Đại học Dượ c Hà

Nội.

9. Nguyễn Văn Kính và nhóm nghiên cứu quốc gia của GARP- Việt Nam

(2010), Phân tích thự c tr ạng: S ử d ụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt

Nam.

10. Bùi Thị Luyến (2014), Xây d ự ng quy trình xác định d ư l ượ ng một số chấ t

nhóm quinolon trong thự c phẩ m bằ ng k ỹ thuật LC- MS/MS , Luận văn thạc sỹ

dượ c học, Tr ườ ng Đại học Dượ c Hà Nội, Hà Nội.

11. Nguyễn Hải Nam (2011), Liên quan cấ u trúc và tác d ụng sinh học, tr.

132, Bộ Y tế.

12. Hồ Viết Quý (2007), Các phươ ng pháp phân tích công cụ trong hóa học

hiện đại, trang 397, 542, Nhà xuất bản đại học sư phạm.

13. Tr ần Cao Sơ n (2010), Thẩ m định phươ ng pháp trong phân tích hóa học

và vi sinh vật , Nhà xuất bản khoa học và k ỹ thuật.







2

14. Vũ Thị Trâm (2007), Dượ c lý học, tậ p 2, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.

15. Nguyễn Văn Thuận (2014), Nghiên cứ u xác định d ư l ượ ng một số kháng

sinh Cephalosporin trong nướ c thải nhà máy d ượ c phẩ m bằ ng LC- MS/MS,

Luận văn thạc sỹ dượ c học, Tr ườ ng Đại học Dượ c Hà Nội, Hà Nội.

TIẾNG ANH

16. AOAC International (2007), Validation and Qualification in Analytical

Laboratories, Second Edition.

17. Ashutosh Kar. (2005), Pharmaceutical Drug Analysis. 2nd ed. New Age

International (P) Ltd Publishers; New Delhi.

18. Beesley T.E, Buglio B., Scott R.P.W. (2001) Quantitative

Chromatographic Analysis, Marcel Dekker, Inc., New York.

19. Connor K.A. (1982), A textbook of Pharmaceutical Analysis, 3th Edition,

Wiley Interscience Publication.

20. E. Braunwald et al. (2001), Harison’s priciples of internal medicine, 15th

ed.; McGraw-Hill, Medical Publishing Division, New York.

21. Harry G. Brittain (2009), Profile of Drug substances, excipients, and

Related Mothodology, Volume 34, Burlington: Academic Press, pp. 265.22. Heigher D. (2000), High Performance capillary electrophoreris, an

introduction, Agilent Technologies.

23. Imma Ferrer, E Michael Thurman, Jerry Zweigenbaum (2008), EPA

1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water Soil, Sediment,

and Biosolids by HPLC/MS/MS , Application Technologies publication 5989-

9665EN.

24. Jay E.Renew, Ching Hua Huang (2004), Simultaneous determination offluoroquinolon, sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater

using tandem solid phase extrction and liquid chromatography- electrospray

mass spectrometry , Journal of Chromatography A, 1042 (2004) 113- 121.

25. Jaewon Choi (2008), Development of multi- residual analytical methods

for pharmaceuticals, perfluorinated compounds, nitrosamines, hormones and

POPs in water, Reports on the International Collaborative research, volume

1, pp 1- 30, 47- 66.







26. J. G. Hardman et al.(1996): Goodman and Gilman’s the pharmacological

Basic of therapeutic. 9th. Ed; McGraw- Hill; New York.

27. N. Dorival- Garcia, A. Zafra- Gomez (2013), Analysis of quinolone

antibiotic derivatives in sewage sludge samples by liquid chromatography-

tandem mass spectrometry: Comparison of the efficiency of three extraction

techniques, Talanta 106.

28. M.T.Meyer (2007), Evaluation of offline Tandem and online solid phase

extraction with liquid chromatography/ electrospray ionization- mass

spectrometry for analysis of antibiotics in ambient water and comparison to

an independent method, Scientific Investigations Report 2007- 5021.

29. N. Dorival- Garcia, A. Zafra- Gomez (2013), Simultaneuos determinationof 13 quinolone antibiotic derivatives in wastewater samples using solid-

phase extraction and ultra performance liquid chromatography- tandem mass

spectrometry, Microchemical journal 106.

30. Urszula Hubicka, Pawel Zmudzki et al (2013), Photodegradation

assessment of ciprofloxacin, moxifloxacin, norfloxacin and ofloxacin in the

presence of excipients from tablets by UPLC- MS/MS and DSC, Chemistry

Central Journal.

31. Vishal Diwan et al (2010), Antibiotics and antibiotic-resistant bacteria in

waters associated with a hospital in Ujjain, India, BMC Public Health,

10.1186/1471-2458-10-414.

32. Xiao, Y., Chang, H., Jia, A., Hu, J.Y., (2008), Trace analysis of quinolone

and fluoroquinolone antibiotics from wastewaters by liquid chromatography-

electrospray tandem mass spectrometry, J. Chromatogr . A 1214, 100e108

33. Ye, Z.Q., Weinberg, H.S., Meyer, M.T., (2007), Trace analysis oftrimethoprim and sulfonamide, macrolide, quinolone, and tetracycline

antibiotics in chlorinated drinking water using liquid chromatography

electrospray tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 1135e1144.

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHONWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Vishal+Diwan%22

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20626873



http://link.springer.com/search?facet-author=%22Vishal+Diwan%22

Documents

Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng LC MS trên MS