Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC MS và MS

8/20/2019 Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC MS và MS

http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-du-luong-mot-so-chat-nhom-quinolon 1/78

B GIÁO D#C VÀ %ÀO T&O B Y T(

TR ! NG $%I H(C D* C HÀ N+I

BÙI TH, LUY.N

XÂY D1 NG QUY TRÌNH XÁC $,NH

D L* NG M+T S2 CH3T NHÓM

QUINOLON TRONG TH1 C PH4M B6NGK 7 THU:T LC-MS/MS

LU:N V;N TH%C S= D* C H(C

HÀ N+I 2014

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



B GIÁO D#C VÀ %ÀO T&O B Y T(

TR ! NG $%I H(C D* C HÀ N+I

BÙI TH, LUY.N

XÂY D1 NG QUY TRÌNH XÁC $,NHD L* NG M+T S2 CH3T NHÓM QUINOLON

TRONG TH1 C PH4M B6NG K 7 THU:T LC-MS/MS

LU:N V;N TH%C S= D* C H(C

CHUYÊN NGÀNH: KI+M NGHI-M THU.C – %C CH/T

MÃ S.: 60720410

Ng01 i h04 ng d6n khoa h:c:

1. PGS.TS Nguy>n TBC ng Vy

2. Ths. NCS Cao Công Khánh

HÀ N+I 2014





L! I CEM " N

%< có th< hoàn thành lu?n v@n, tôi Bã nh?n B0C c sD h04 ng d6n và giúp BE vG m:i

mHt tI các thJy cô, BKng nghiL p, gia Bình và bMn bè.

Nhân dN p này, tôi xin bày tP lòng kính tr :ng và biRt 2 n sâu sTc t4 i:PGS.TS. Nguy>n TBC ng Vy – Phó TrBG ng Phòng S$H- $H DBI c Hà NJi

Th.S NCS Cao Công Khánh – ViLn KN ATVSTPQG

Bã t?n tình giúp BE tôi trong suUt quá trình thDc hiLn và hoàn thành BG tài này.

%Kng th1 i tôi xin cVm 2 n các cán bW ViLn Ki<m NghiLm An toàn vL sinh thDc

phXm QuUc gia Bã luôn sYn lòng giúp BE và tMo m:i BiGu kiLn thu?n lC i cho tôi trong

quá trình thDc nghiLm.

CuUi cùng tôi xin gZi l1 i cVm 2 n t4 i nh[ng ng01 i thân trong gia Bình và bMn bè Bã

luôn BWng viên và nhiLt tình giúp BE tôi trong quá trình thDc hiLn BG tài.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 nm 2014

Tác gi#

Bùi ThM LuyOn





MQC LQC

CÁC KÝ HISU VI.T TTT

DANH MQC CÁC BENG

DANH MQC CÁC HÌNH$Ut vWn XY ..................................................................................................................1

ChBD ng 1. TZNG QUAN...........................................................................................1

1.1. Vài nét vY Quinolon.............................................................................................3

1.1.1. C\u tMo chung.....................................................................................................3

1.1.2. Phân loMi ............................................................................................................3

1.1.3. C2 chR tác d]ng..................................................................................................3

1.1.4. Tác d]ng ph] ................................................................................................... 3

1.1.5. %Hc tính c_a các quinolon nghiên cù ................................................................4

1.2. T[ng quan vY s]c ký l^ng hiLu n_ng cao và chu`n bM mau cho phân tích s]c

ký ...............................................................................................................................5

1.3. Nghiên cb u vY tdn dB quinolon trong the c ph`m............................................12

1.3.1. Tình hình sZ d]ng kháng sinh trong ch@n nuôi ................................................12

1.3.2. Các nghiên cù vG tKn d0 quinolon trong thDc phXm a trong n04 c ..................131.3.3. Các nghiên cù vG tKn d0 quinolon trong thDc phXm a ngoài n04 c...................14

1.3.4. MWt sU quy BNnh vG gi4 i hMn tKn d0 quinolon trong thDc phXm.........................16

ChBD ng 2. $2I T* NG VÀ PH" NG PHÁP NGHIÊN Cf U

2.1. $gi tBI ng nghiên cb u cha XY tài .......................................................................20

2.2. ThiOt bM, djng cj, hoá chWt................................................................................20

2.2.1. ThiRt bN, d]ng c]...............................................................................................20

2.2.2. ThuUc thZ, hóa ch\t ..........................................................................................20

2.3. NJi dung và phBD ng pháp nghiên cb u .............................................................20

2.3.1. Nghiên cù các BiGu kiLn LC-MS/MS..............................................................20

2.3.2. Nghiên cù và lDa ch:n quy trình xZ lý m6u ...................................................22

2.3.3. ThXm BNnh lMi ph02 ng pháp Bã xây dDng..........................................................24

2.3.4. ThDc nghiLm xác BNnh quinolon trên m6u thNt, cá ............................................24

2.4. Tính toán k Ot quk, xl lí sg liLu .........................................................................25





ChBD ng 3. K .T QUE NGHIÊN Cf U

3.1. K Ot quk khko sát và le a chmn các thông sg cho LC-MS ..................................27

3.1.1. Xác BNnh các thông sU c_a detector khUi phb (MS ............................................27

3.1.2. Xác BNnh các thông sU c_a phJn LC B< tách các ch\t nhóm Quinolon...............283.2. Xác XMnh k n thupt xl lý mau.............................................................................29

3.2.1. Quy trình tách chiRt các ch\t cJn phân tích khPi nGn m6u.................................29

3.2.2. Quy trình làm sMch và làm giàu m6u qua SPE...................................................31

3.2.3. Quy trình xZ lí m6u B0C c lDa ch:n ...................................................................33

3.3. Th`m XMnh phBD ng pháp Xã xây de ng.............................................................34

3.3.1. Tính thích hC p c_a hL thUng ............................................................................34

3.3.2. %W BHc hiLu/BW ch:n l:c ..................................................................................35

3.3.3. KhoVng tuyRn tính và B01 ng chuXn .................................................................35

3.3.4. Gi4 i hMn phát hiLn (LOD) và gi4 i hMn BNnh l0C ng (LOQ).................................39

3.3.5. %W lH p lMi và BW thu hKi c_a ph02 ng pháp.........................................................39

3.4. Phân tích trên mau the c nghiLm ......................................................................44

ChBD ng 4. BÀN LU:N

4.1. Xây de ng quy trình k n thupt ............................................................................46

4.1.1. Các BiGu kiLn phân tích trên hL thUng LC-MS/MS............................................46

4.1.2. %iGu kiLn xZ lý m6u .........................................................................................47

4.2. Th`m XMnh quy trình Xã xây de ng...................................................................47

K Ot lupn ...................................................................................................................50

KiOn nghM .................................................................................................................52

TÀI LISU THAM KHEO





DANH MQC CÁC KÝ HISU, CHq VI.T TTT

Chr viOt t]t TiOng Anh TiOng ViLt

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

STc ký lPng hiLu n@ng cao

LC-MS/MS Liquid Chromatograph

Tandem Mass Spectrometer

STc ký lPng ghép 2 lJn khUi

phb

LOD Limit of Detection Gi4 i hMn phát hiLn

LOQ Limit of Quantitative Gi4 i hMn BNnh l0C ngSPE Solid phase extraction ChiRt pha r TnCE Capillary electrophoresis

%iLn di mao quVn

ESI Electrospray ionizationIon hóa phun BiLn tZ

EU European UnionLiên minh Châu Âu

APCIAtmospheric pressure chemicalionization

ion hoá hoá h:c áp su\t khíquy<n

AOACAssociation of Official Analytical.

Chemists

HiL p hWi các nhà hoá phân tích

IS Internal Standard NWi chuXn

M6u PT M6u phân tích

TL ThNt lC n

TG ThNt gà

C01 Cá 01

RSD Relative Standard Deviation %W lLch chuXn t02 ng BUi

Ppb Part per billion PhJn tc

Ppm Part per million PhJn triLu





DANH MQC CÁC BENG

BVng 1.1: Gi4 i hMn tKn d0 tUi Ba c_a các quinolone theo quyRt BNnh sU 2377/90/EC c_a

ey ban Châu Âu……………………………………………………….…………...…15BVng 1.2 : Danh m]c các quinolone hMn chR sZ d]ng trong sVn xu\t kinh doanh th_y

sVn..………………………………...…………………………………...….………….16

BVng 3.1. Thông sU chung c_a detector khUi phb…………...........................………..27

BVng 3.2 Thông sU chi tiRt c_a 4 Quinolon………………………...…………………27

BVng 3.3 Gradient pha BWng khi sZ d]ng cWt Symmetry……………….…...……….28

BVng 3.4 Gradient pha BWng khi sZ d]ng cWt Xbridge………...……………….....…..28

BVng 3.5: K Rt quV thZ nghiLm dung môi chiRt m6u khi phân tích Norfloxacin……....29BVng 3.6: K Rt quV thZ nghiLm dung môi chiRt m6u khi phân tích Ciprofloxacin….....30

BVng 3.7: K Rt quV thZ nghiLm dung môi chiRt m6u khi phân tích Enrofloxacin......…30

BVng 3.8: K Rt quV thZ nghiLm dung môi chiRt m6u khi phân tích Flumequin.…...….30

BVng 3.9: K Rt quV thZ nghiLm cWt SPE khi phân tích Norfloxacin………......……….31

BVng 3.10: K Rt quV thZ nghiLm cWt SPE khi phân tích Ciprofloxacin……...….……..32

BVng 3.11: K Rt quV thZ nghiLm cWt SPE khi phân tích Enrofloxacin………...………32

BVng 3.12: K Rt quV thZ nghiLm cWt SPE khi phân tích Flumequin..…………...……..33

BVng 3.13. K Rt quV phân tích tính thích hC p c_a hL thUng………..…………………..34

BVng 3.14: K Rt quV phân tích dãy chuXn Norfloxacin………………….……………..36

BVng 3.15: K Rt quV phân tích dãy chuXn Ciprofloxacin………………...……………37

BVng 3.16: K Rt quV phân tích dãy chuXn Enrofloxacin………..…………………...…37

BVng 3.17: K Rt quV phân tích dãy chuXn Flumequin…………………………….……38

BVng 3.18: LOD và LOQ c_a các ch\t phân tích tính trên nGn m6u thNt………...……39BVng 3.19: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE HLB c_a Norfloxacin………..……40

BVng 3.20: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE HLB c_a Ciprofloxacin……..…….40

BVng 3.21: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE HLB c_a Enrofloxacin………...….41

BVng 3.22: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE HLB c_a Flumequin..……….…….41

BVng 3.23: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE C18 c_a Norfloxacin…….………..42

BVng 3.24: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE C18-E c_a Ciprofloxacin…………42

BVng 3.25: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE C18-E c_a Enrofloxacin…….…….41





BVng 3.26: %W lH p lMi và BW thu hKi trên cWt SPE C18-E c_a Flumequin.……..…….41

BVng 3.27 : K Rt quV phân tích 20 m6u thNt gà (B2 n vN là µg/kg)……...…………..…44

BVng 3.28: K Rt quV phân tích 20 m6u thNt lC n (B2 n vN là µg/kg)………………..….....44

BVng 3.29: K Rt quV phân tích 20 m6u cá n04 c ng:t (B2 n vN là µg/kg)…………….....44





DANH MQC CÁC HÌNH

Hình 1.1 C\u trúc c2 bVn c_a nhóm quinolon ..………………………………… …….3

Hình 1.2. Công th`c c\u tMo c_a Ciprofloxacin ………………..……………………...4Hình 1.3. Công th`c c\u tMo c_a Enrofloxacin ……….………….…….……..……….5

Hình 1.4. Công th`c c\u tMo c_a Norfloxacin ….……………………………………..5

Hình 1.5. Công th`c c\u tMo c_a Flumequin …….……………………………………5

Hình 3.1: STc ký BK thZ nghiLm dung môi chiRt m6u khi phân tích norfloxacin……..29

Hình 3.2: STc ký BK thZ nghiLm cWt SPE khi phân tích Norfloxacin…………………32

Hình 3.3: STc ký BK khi phân tích tính thích hC p c_a hL thUng………………..….35

Hình 3.4: %K thN B01 ng chuXn c_a Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phVi)……….36

Hình 3.5: STc ký BK khi xây dDng B01 ng chuXn c_a norfloxacin…………………….37

Hình 3.6: %K thN B01 ng chuXn c_a Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phVi)…..……..38

Hình 3.7: sTc ký BK c_a norfloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE HLB …………….....40

Hình 3.8: STc ký BK c_a m6u thDc tR có (hoHc không có) norfloxacin………………..45





1

$sT V3N $t

An toàn vL sinh thDc phXm luôn B0C c BHt lên hàng BJu trong công tác bVo vL

s`c khof con ng01 i. Trong ch@n nuôi hiLn nay, v\n BG sZ d]ng thuUc kháng sinh(trong th`c @n, BiGu tr N bLnh gia súc, gia cJm) là r \t phb biRn và B0C c coi là mWt tiRn

bW c_a công nghL sinh h:c. Tuy nhiên, viLc lMm d]ng thuUc kháng sinh nói chung

và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có th< làm nguKn thDc phXm cung c\ p cho con

ng01 i còn chà mWt l0C ng nhP ch\t kháng sinh, ng01 i sZ d]ng loMi thDc phXm này

trong th1 i gian dài có th< gây nguy hMi cho s`c khof.

Trong tiRn trình gia nh? p WTO, thN tr 01 ng hàng hoá c_a ViLt nam B0C c ma

r Wng, BHc biLt trong l g nh vDc xu\t khXu các mHt hàng nông sVn, thuc sVn. Tuy nhiên,do viLc ki<m soát d0 l0C ng hoá ch\t kháng sinh có hMi BRn s`c khof ng01 i tiêu

dùng ch0a B0C c thDc hiLn nghiêm túc nên mWt sU lô hàng bN thN tr 01 ng xu\t nh? p

khXu phát hiLn kháng sinh có hMi v6n còn cao. Tình tr Mng trên không chi gây thiLt

hMi l4 n vG kinh tR cho các doanh nghiL p mà còn Vnh h0a ng nghiêm tr :ng BRn uy tín

ch\t l0C ng hàng ViLt nam trên thN tr 01 ng thR gi4 i và s`c khPe ng01 i tiêu dùng.

Quinolon có phb tác d]ng diLt khuXn r Wng, hiLu quV cao nên chúng B0C c sZ

d]ng r Wng rãi B< ch[a bLnh cho ng01 i, gia cJm và th_y sVn trong công nghiL p.

Trong quá trình nuôi d0E ng, nRu không tuân th_ vG th1 i gian dùng thuUc và th1 i

gian sVn xu\t hoHc chR biRn thì sj d6n BRn l0C ng Quinolon còn lMi trong thNt gia cJm

hay th_y sVn. %iGu này sj gây r \t nhiGu mUi nguy hi<m. %Hc biLt là gây ra hiLn

t0C ng kháng thuUc c_a mWt sU vi khuXn nh0: Salmonella, Campylobacter spp,

Escherichia coli,... H?u quV là giVm hiLu quV c_a Quinolon BUi v4 i các ch_ng vi

khuXn trên, gây khó kh@n và tUn kém trong BiGu tr N cho con ng01 i.%< bVo vL quyGn lC i c_a ng01 i tiêu dùng, a châu Âu, tb ch`c EU Bã thiRt l? p

gi4 i hMn l4 n nh\t (MRLs) BUi v4 i d0 l0C ng thuUc trong nguKn thDc phXm khi cung

c\ p cho con ng01 i vào n@m 1990. Theo sD ki<m tra và BNnh h04 ng c_a các chuyên

gia phòng thí nghiLm, EU Bã công bU “Council directive 96/23/EC in 1996” [23] ,

trong Bó quy BNnh rõ hàm l0C ng kháng sinh theo tIng loMi thDc phXm và tIng loMi

thuUc, ví d] nh0 v4 i enrofloxacin trong c2 , gan, th?n c_a bò, lC n, gia cJm (gà, vNt)

là 30µg/kg; trong s[a bò là 100 µg/kg; k châu Mm, Hoa k n và các n04 c BTc Mm Bã





2

c\m sZ d]ng kháng sinh h: Fluoroquinolon. BW Th_y sVn Bã ra quyRt BNnh sU

07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy BNnh danh m]c 17 loMi kháng sinh

c\m sZ d]ng và danh m]c 34 loMi hMn chR sZ d]ng trong Bó có nhóm Quinolon [10]

và QuyRt BNnh sU 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bb sung nhómQuinolon vào danh m]c c\m sZ d]ng trong sVn xu\t, kinh doanh th_y sVn xu\t khXu

vào thN tr 01 ng BTc Mm và Hoa K n [11].

Vì v?y chúng tôi thDc hiLn BG tài: “Xây de ng quy trình xác XMnh dB lBI ng mJt

sg chWt nhóm Quinolon trong the c ph̀ m bung k n thupt LC-MS/MS”, v4 i 2 m]c tiêu

chính nh0 sau:

1. Xây dDng quy trình xác BNnh d0 l0C ng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin ,

flumequin trong thDc phXm bong k m thu?t sTc ký lPng ghép 2 lJn khbi phb LC-MS/MS.

2. p ng d]ng quy trình Bã xây dDng B< s2 bW khVo sát d0 l0C ng Quinolon trong mWt

sU loMi thDc phXm (ThNt, cá) trên thN tr 01 ng Hà NWi.





3

ChBD ng 1. TZNG QUAN1.1. Vài nét vY Quinolon [5]

1.1.1. CWu tvo chung

%ôi khi a vN trí 8 là N. V?y Ba sU chúng là d6n ch\t c_a acid 1,4-dihydro-4-oxo-quinolein-3-carboxylic.

Hình 1.1 C % u trúc c( b#n c)a nhóm quinolon

1.1.2. Phân lovi- Quinolon thR hL I: GKm các ch\t không gTn F (tr I flumequin), hiLn nay hJu nh0

chi dùng acid nalidixic.

- Quinolon thR hL II: %0C c dùng tI n@m 1985, gKm các ch\t có gTn F (ít nh\t là a vN

trí 6) hay các fluoroquinolon có phb r Wng trên cV vi khuXn gram (-) và gram (+), v4 i

hoMt tính mMnh:

+ Tác d]ng trên cV vi khuXn gram (-) Bã kháng acid nalidixic, tr Dc khuXn m_ xanh,

nhiGu vi khuXn gram (-) khó tr N khác.

+ Trên các vi khuXn gram (+) thì BHc biLt là t] cJu vàng, S.epidermitis Bã kháng

gentamycin, liên cJu, cJu khuXn ruWt (Enterococus) và các vi khuXn k r khí.

+ Trên các vi khuXn phát tri<n trong tR bào, và mWt sU loMi vi khuXn BHc biLt nguy

hi<m (nh0 Legionella, Chlamydia, Ureoplasma, Mycoplasma, các vi khuXn kháng

alcol...)

1.1.3. CD chO tác djngTheo mWt hoHc hai c2 chR sau và BGu cho tác d]ng diLt khuXn:

- p c chR ADN-gyrase, là enzym tham gia vào quá trình tbng hC p acid nhân.

- TMo ph`c v4 i kim loMi hóa tr N hai c_a các protein chà các kim loMi này, BKng th1 i

ph`c Bó ion hóa thành ion ph`c có hoMt tính cao v4 i các enzym chuy<n hóa

1.1.4. Tác djng phj

Tác d]ng ph] c_a thuUc ch_ yRu là lên dM dày - ruWt, thJn kinh trung 02 ng và da.

- Tiêu hóa: BuKn nôn, nôn, ia chVy, Bau b]ng, r Ui loMn tiêu hoá

N

OCOOH

R

R2

R1

1 2

345

6

78





4

- Da: Nbi ban, ngà, viêm t g nh mMch nông.

- C2 x02 ng: Ðau a các kh4 p, s0ng kh4 p. Ðau c2 , viêm gân (gân gót) và mô bao

quanh. Có mWt vài tr 01 ng hC p bN B`t gân, BHc biLt là a ng01 i cao tubi khi dùng phUi

hC p v4 i corticosteroid.- ThJn kinh trung 02 ng: C2 n co gi?t, lú l6n, r Ui loMn tâm thJn, hoang t0a ng, m\t

ng_, tr Jm cVm, loMn cVm ngoMi vi, r Ui loMn thN giác k < cV Vo giác, r Ui loMn thính giác,

ù tai, r Ui loMn vN giác và khù giác, t@ng áp lDc nWi s:.

- Da: HWi ch`ng da - niêm mMc, viêm mMch, hWi ch`ng Lyell, ban BP da thành nUt,

ban BP Ba dMng tiRt dNch.

- Gan: Ðã có báo cáo vG mWt vài tr 01 ng hC p bN hoMi tZ tR bào gan, viêm gan, vàng

da ` m?t.

- TiRt niLu - sinh d]c: Có tinh th< niLu khi n04 c ti<u kiGm tính, Bái ra máu, suy th?n

c\ p, viêm th?n k j.

- Khác: NhMy cVm v4 i ánh sáng khi ph2 i nTng, phù thanh quVn hoHc phù phbi, khó

tha , co thTt phR quVn.

1.1.5. $Uc tính cha các quinolon nghiên cb u

Ciprofloxacin

Tên g:i: 1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-3-quinolinecarboxylic

acid

Công th`c hóa h:c: C17H18FN3 O3

Tr :ng l0C ng phân tZ: 331.35 g/mol

NhiLt BW nóng chVy: 318-3200 C

Hình 1.2. Công th+ c c% u t .o c)a CiprofloxacinTính ch\t: là bWt k Rt tinh màu vàng nhMt, tan mWt phJn trong n04 c, tan r \t ít trong ethanol,

methylen chlorid. Tan tUt trong dung dNch acid acetic loãng, có hai giá tr N pKa là 6.0 và 8.8

Enrofloxacin

Enrofloxacin là kháng sinh thuWc nhóm fluoroquinolone, loMi PQ, có th< chUng vi

khuXn gram d02 ng và gram âm.

N

O

COOHF

HN

N





5

Tên g:i: acid 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-

3-quinolinecarboxylic.

Công th`c hóa h:c: C19H22FN3O3

Tr :ng l0C ng phân tZ: 359.4 g/mol NhiLt BW nóng chVy: 219-2210C

Hình 1.3. Công th+ c c% u t .o c)a EnrofloxacinTính ch\t: là tinh th< màu vàng nhMt, tan nhs mWt phJn trong n04 c a pH = 7,

có hai giá tr N pKa: khoVng 5 và 8-9

Norfloxacin

Tên g:i: acid 1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4-dihydroquinolin-3-carboxylic

Công th`c hóa h:c C16H18FN3O3

Tr :ng l0C ng phân tZ: 319,3

Hình 1.4. Công th+ c c% u t .o c)a Norfloxacin

Tính ch\t : BWt k Rt tinh màu tr Tng hoHc vàng nhMt, dt hút Xm, nhMy cVm v4 i ánhsáng. R \t khó tan trong n04 c, khó tan trong aceton và ethanol 96%.

Flumequin

Tên g:i: acid 9-Fluoro-5-methyl-1-oxo-6,

7-dihydro-1H,5H-benzoquinolizin-2-carboxylic

Công th`c hóa h:c: C14H12FNO3

Tr :ng l0C ng phân tZ: 261,3 Hình 1.5. Công th+ c c% u t .o c)a Flumequin

Tính ch\t: BWt tr Tng, không tan trong n04 c, ít tan trong methylen chlorid, r \t

ít tan trong methanol, dt tan trong kiGm

1.2. T[ng quan vY s]c ký l^ng hiLu n_ng cao và chu`n bM mau cho phân tích s]c ký

[2], [7]

Quá trình tách trong k m thu?t HPLC là do quá trình v?n chuy<n và phân bU

c_a các ch\t tan gi[a hai pha khác nhau (pha BWng, pha t g nh). Dung dNch các ch\t

N

O

COOHF

N

N

H3C

N

OF COOH

CH3

H





6

phân tích khi vào cWt sj B0C c h\ p th] hay liên k Rt v4 i pha t g nh tùy thuWc vào bVn

ch\t c_a cWt và c_a ch\t cJn phân tích. Khi pha BWng dNch chuy<n v4 i mWt tUc BW

nh\t BNnh qua cWt sTc ký sj BXy các ch\t tan bN pha t g nh l0u gi[ ra khPi cWt. Tùy theo

bVn ch\t c_a pha t g nh, bVn ch\t c_a ch\t tan, bVn ch\t c_a dung môi mà quá trìnhr Za giVi tách B0C c các ch\t ra khPi nhau. Các ch\t sau khi ra khPi cWt sj B0C c phát

hiLn ba i detector và B0C c chuy<n qua bW xZ lý k Rt quV. K Rt quV cuUi cùng B0C c B0a

ra máy in hoHc hi<n thN trên màn hình. NRu ghi quá trình tách sTc ký c_a hun hC p

nhiGu thành phJn, ta sj có mWt sTc BK gKm nhiGu pic. Quá trình tách sTc ký tUt thì

hun hC p có bao nhiêu thành phJn thì sj có b\y nhiêu pic riêng biLt trên sTc BK.

1.2.1. K Ot ngi s]c ký l^ng hiLu n_ng cao (HPLC) vw i ph[ khgi lBI ng (MS) Trong nhiGu quá trình phân tích, các hC p ch\t quan tâm th01 ng nom trong

mWt hun hC p ph`c tM p, và vai trò c_a k m thu?t sTc ký là thiRt l? p sD tách các thành

phJn c_a hun hC p, cho phép BNnh tính hoHc BNnh l0C ng chúng. VG mHt BNnh tính,

nh0C c Bi<m chính c_a k m thu?t sTc ký trong quá trình tách là không có khV n@ng

cung c\ p thông tin vG BNnh tính mWt cách rõ ràng cho các hC p phJn m6u, th?m chí cV

trong tr 01 ng hC p chúng B0C c tách hoàn toàn khPi nhau. ViLc BNnh tính B0C c dDa

trên c2 sa so sánh các BHc tính l0u gi[, mà B2 n giVn nh\t là th1 i gian l0u c_a mWt

ch\t ch0a biRt v4 i các ch\t so sánh B0C c xác BNnh trong cùng mWt BiGu kiLn thí

nghiLm. Tuy nhiên, trên thDc tR r \t nhiGu tr 01 ng hC p th?m chí có cùng các BHc tính

l0u gi[ c_a c\u tZ ch0a biRt và v?t liLu so sánh, trong gi4 i hMn sai sU thDc nghiLm,

BNnh tính, ng01 i phân tích cvng không th< k Rt lu?n mWt cách tuyLt BUi hai hC p ch\t

này là giUng nhau. MHc dù các BiGu kiLn sTc ký t02 ng BUi ma r Wng cho các nhà

phân tích, nh0ng không phVi lúc nào cvng có th< thDc hiLn B0C c quá trình tách t\tcV các c\u tZ c_a mWt hun hC p m6u và BiGu này có th< Vnh h0a ng BRn BW Búng, BW

chính xác trong quá trình phân tích BNnh l0C ng c_a các ch\t cJn quan tâm.

KhV n@ng c_a thiRt bN sTc ký - khUi phb trên thDc tR ph] thuWc vào phb khUi

l0C ng c_a nhiGu ch\t mà các ch\t này Bã có BJy B_ các phb (th0 viLn phb). %iGu này

cho phép viLc nh?n dMng chúng mWt cách dt dàng v4 i BW tin c?y cao, mHc dù nhiGu

khi không hoàn toàn nh0 v?y. NRu ch\t phân tích nom trong mWt phJn c_a hun hC p





7

thì phb khUi l0C ng nh?n B0C c sj chà các ion tI t\t cV các ch\t có mHt. Trong

tr 01 ng hC p BHc biLt, nRu ch\t phân tích là mWt hun hC p c_a các thành phJn l0C ng

nhP thì viLc nh?n dMng sj tr a nên khó kh@n và d01 ng nh0 không th<. SD k Rt hC p khV

n@ng tách c_a ph02 ng pháp sTc ký cho phép các ch\t tinh khiRt B0C c B0a vào máy phb khUi. KhV n@ng nh?n dMng c_a máy phb khUi r \t rõ ràng, vì thR có thu?n lC i và

BHc biLt cho các ch\t t02 ng tD nhau hoHc giUng hLt nhau vG các BHc tr 0ng l0u,

nh0ng có phb khUi l0C ng hoàn toàn khác nhau và có th< phân biLt B0C c các ch\t

này. Ngoài ra, phb khUi l0C ng còn cho phép BNnh l0C ng v4 i BW chính xác ph] thuWc

vào m`c BW ph`c tM p c_a hun hC p m6u và bVn ch\t c_a mui thành phJn trong hun

hC p. Công viLc này nRu chi riêng phép sTc ký thôi thì không th< thDc hiLn B0C c. Ph,( ng pháp s0 c ký

- Là ph02 ng pháp tách dành cho hun hC p m6u.

- Nh?n dMng các m6u dDa trên th1 i gian l0u.

- Cho phép phân tích BNnh tính và BNnh l0C ng.

- Phân l? p và tinh chR ch\t.

Ph,( ng pháp ph1 kh4 i l ,5 ng

- Là ph02 ng pháp nh?n dMng các l0C ng m6u nhP.

- Cung c\ p phb khUi l0C ng c_a các hun hC p ph`c tM p.

SD k Rt hC p c_a HPLC và phb khUi l0C ng vì thR cho phép nh?n dMng rõ ràng và xác BNnh

sU l0C ng c_a các hC p ch\t mà ph02 ng pháp sTc ký không phân tích BJy B_ B0C c.

1.2.2. SD Xd thiOt bM s]c ký l^ng - khgi ph[

MWt máy sTc ký lPng khUi phb bao gKm 3 bW ph?n chính (hình 1.1).

- ThiRt bN sTc ký lPng ( LC, Liquid Chromatography): thông th01 ng sZ d]ng máy

sTc ký lPng hiLu n@ng cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography),

hiLn BMi h2 n là máy sTc ký lPng siêu hiLu n@ng (UPLC – Ultra Performance Liquid

Chromatography)

- BW k Rt nUi (Interface): có nhiLm v] loMi dung môi r Za giVi và B0a m6u ch\t vào

buKng ion hoá c_a máy phb khUi. %ây là bW ph?n r \t quan tr :ng và là chìa khoá c_a

ph02 ng pháp LC-MS.





8

- ThiRt bN phb khUi l0C ng ( MS, Mass Spectrometry).

Hình 1.6. S ( 67 h8 th4 ng máy s0 c ký l :ng kh4 i ph1 BW ph?n k Rt nUi (interface) a Bây Bóng vai trò quan tr :ng vì nó là k m thu?t

chìa khoá c_a mWt máy sTc ký lPng - khUi phb. Ch`c n@ng c_a bW k Rt nUi là loMidung môi r Za giVi và B0a m6u ch\t vào buKng ion hóa c_a máy khUi phb. BW k RtnUi bao gKm nhiGu loMi khác nhau và ra B1 i a các th1 i Bi<m khác nhau nh0:

- BW k Rt nUi b@ng chuyGn (Moving Belt Interface): 1977.

- BW k Rt nUi nM p ch\t lPng tr Dc tiR p (DLI, Direct Liquid Introduction Interface):

1980

- BW k Rt nUi phun nhiLt (Thermospray Interface): 1983

- BW k Rt nUi bTn phá nguyên tZ nhanh dòng liên t]c (CF-FBA, Continuous Flow

Fast Atom Bombardment Interface): 1985/1986.

- BW k Rt nUi ion hoá hoá h:c áp su\t khí quy<n (APCI, Atmospheric-Pressure

Chemical Ionization Interface): 1986.

- BW k Rt nUi ion hóa phun BiLn ( ESI, Electrospray Ionization Interface): 1988.

1.2.3. PhBD ng pháp ph[ khgi lBI ng (MS)Ph02 ng pháp phb khUi l0C ng là mWt trong nh[ng ph02 ng pháp phân tích

công c] quan tr :ng. Phb khUi l0C ng cung c\ p các thông tin vG phân tích BNnh tính,

BNnh l0C ng các nguyên tU, thành phJn và c\u trúc c_a các hC p ch\t vô c2 và h[u c2 .

a. Nguyên t]c chung cha phBD ng pháp

C2 sa c_a ph02 ng pháp phb khUi l0C ng BUi v4 i các hC p ch\t h[u c2 là sD

bTn phá các phân tZ hC p ch\t h[u c2 trung hoà thành ion phân tZ mang BiLn tích

Dungmôi

BD m cao ápC t s]c k

BJ tiêmmau

BJ k Otngi

Ngudnion

BJ phântích khgi

BJ pháthiLn

BD m chân không

S]c k l^n B k Ot ngi Khgi h[

Máy tính XiYu khixn và phân tích sg liLu





9

d02 ng hoHc phá vE thành các mVnh ion, các gUc theo s2 BK sau bong các phJn tZ

mang n@ng l0C ng cao:

SD hình thành các ion mang BiLn tích +1 chiRm h2 n 95%, còn lMi các ion

mang BiLn tích +2 hoHc ion âm (-). N@ng l0C ng bTn phá các phân tZ thành ion phân

tZ khoVng 10 ev. Nh0ng v4 i n@ng l0C ng cao thì ion phân tZ có th< phá vE thành

mVnh ion d02 ng (+), hoHc các ion gUc, các gUc hoHc các phân tZ trung hoà nhP h2 n:

SD phá vE này ph] thuWc vào c\u tMo ch\t, ph02 ng pháp bTn phá và n@ng

l0C ng bTnphá. Quá trình này g:i là quá trình ion hóa.

Ion phân tZ và các ion mVnh là các phJn tZ có khUi l0C ng. NRu g:i khUi

l0C ng c_a mWt ion là m và BiLn tích c_a nó là e thì tc sU z=m/e B0C c g:i là sU khUi.

Hi<n nhiên các ion có khUi l0C ng là m, 2m, 3m… và BiLn tích t02 ng `ng bong e, 2e,

3e, … có sU khUi z bong nhau. Ion phân tZ có sU khUi ký hiLu là M+..

b. ThiOt bM khgi ph[

ThiRt bN phb khUi BJu tiên B0C c chR tMo ba i J. Thomspon (1912) và F. W.

Aston (1919). ThiRt bN hoàn thiLn B0C c chR tMo n@m 1932.





10

1.2.4. K n thupt chu`n bM mau cho phân tích s]c ký

Trong các m6u sinh h:c, m6u môi tr 01 ng th01 ng có thành phJn r \t ph`c tM p,

hàm l0C ng ch\t cJn phân tích khá th\ p nên không t02 ng thích cho viLc phân tích

tr Dc tiR p trên hL sTc ký. Do v?y, tr 04 c khi phân tích m6u chúng ta cJn phVi tách, làm

giàu các hC p phJn c_a m6u cJn phân tích. Có r \t nhiGu ph02 ng pháp xZ lý m6u nh0:

l:c, bay h2 i, làm khô, ly tâm, chiRt lPng-lPng, sTc ký cWt, chiRt Soxhlet, SPE, xung

siêu âm, vi sóng.... nh0ng t\t cV các ph02 ng pháp này BGu phVi Báp `ng B0C c các

tiêu chí:

- Làm sMch m6u mWt cách ch:n l:c.- T@ng nKng BW lên nhiGu lJn.

- L0C ng m6u không cJn nhiGu.

- L0C ng dung môi cJn ít.

- %W thu hKi cao, không gây nhitu.

- %2 n giVn, nhanh, giá thành th\ p.

DDa trên các mUi liên hL gi[a BW ch:n l:c, BWc tính dung môi, giá thành, th1 i

gian... mà chúng ta ch:n ph02 ng pháp chiRt m6u sao cho hiLu quV nh\t.

a. ChiOt l^ng - l^ng

Ph02 ng pháp chiRt lPng - lPng là ph02 ng pháp làm sMch m6u thông d]ng,

d]ng c] thiRt bN khá B2 n giVn nh0ng hiLu quV chiRt khá cao. Quá trình chiRt lPng -

lPng dDa trên BNnh lu?t phân bU Nernst: b\t c` mWt hC p phJn trung tính nào cvng sj

phân bU gi[a hai dung môi không tr Wn l6n v4 i tc sU nKng BW trong hai pha là mWt

hong sU.





11

[ ]

[ ]n

hc A A

A K =

K A: hong sU phân bU

[Ahc]: nKng BW c_a ch\t A trong pha h[u c2 .[An]: nKng BW c_a ch\t A trong pha n04 c.

b. ChiOt pha r]n SPE

Ngày nay, B< làm sMch m6u trong k m thu?t sTc ký ng01 i ta th01 ng sZ d]ng

ph02 ng pháp chiRt pha r Tn SPE (chiRm h2 n 50% các ph02 ng pháp làm sMch m6u).

Ph02 ng pháp chiRt pha r Tn `ng d]ng cho nhiGu nGn m6u (matrix) nh0 các loMi

m6u môi tr 01 ng, các loMi m6u d0C c phXm, m6u sinh hóa, m6u h[u c2 và m6u thDc

phXm. Có 6 b04 c chính trong quá trình chiRt pha r Tn:B04 c 1. ChuXn bN dNch m6u: M6u phVi a dMng dung dNch và t02 ng tác B0C c

v4 i ch\t h\ p ph]. DNch m6u khi cJn thiRt phVi B0C c l:c hoHc ly tâm tr 04 c khi cho

vào cWt SPE B< tránh làm tTc cWt.

B04 c 2. HoMt hóa cWt: làm 04 t pha r Tn, tMo môi tr 01 ng thích hC p cho viLc

h\ p ph] ch\t phân tích. Th< tích dung môi cJn sZ d]ng khoVng 1mL/100mg ch\t

h\ p ph]. NRu th< tích dung môi sZ d]ng ít h2 n th< tích quy BNnh này sj làm t@ng

nguy c2 pha r Tn không B0C c solvat hóa hoàn toàn, k Rt quV BW thu hKi c_a m6u

th\ p.

B04 c 3. Cân bong cWt: Tr 04 c khi cho m6u vào, cWt phVi có BiGu kiLn t02 ng

B02 ng v4 i BiGu kiLn chMy c_a m6u (ví d]: pH) bong cách cho thêm dung môi có

BiGu kiLn t02 ng B02 ng dung môi chà m6u.

B04 c 4. NM p m6u: m6u B0C c cho qua cWt SPE. TUc BW dòng chVy c_a m6u

qua cWt khoVng 3ml/phút.B04 c 5. R Za pha r Tn: dùng dung môi thích hC p B< loMi các tM p ch\t ra khPi

cWt nh0ng v6n gi[ lMi B0C c ch\t cJn phân tích.

B04 c 6. R Za giVi: sZ d]ng dung môi thích hC p B< tách ch\t cJn phân tích ra

khPi cWt, tUc BW dòng chVy khi r Za giVi không B0C c quá nhanh. TUc BW này ph]

thuWc vào B01 ng kính cWt và khUi l0C ng ch\t h\ p ph], ng01 i ta th01 ng r Za v4 i tUc

BW khoVng 1ml/phút.





12

NhiGu k m thu?t xZ lý m6u có th< B0C c sZ d]ng B< phân tích tKn d0 kháng

sinh trong các nGn m6u khác nhau. Hai k m thu?t phb biRn B0C c sZ d]ng trên thR gi4 i

và ViLt Nam là k m thu?t chiRt lPng-lPng và k m thu?t chiRt pha r Tn. Các nGn m6u

trong nghiên cù là các thDc phXm (ch_ yRu là thNt và nWi tMng BWng v?t) và th`c @nch@n nuôi, Bây là nGn m6u khá ph`c tM p nên th01 ng phVi sZ d]ng phUi hC p nhiGu k m

thu?t xZ lý m6u B< BMt hiLu quV cao. C@n c` vào các tài liLu tham khVo chúng tôi

cJn phân tích và tìm ra nh[ng 0u Bi<m c_a các nghiên cù khác nhau vG các k m

thu?t xZ lý m6u v4 i các BUi t0C ng khác nhau và các k m thu?t phân tích trên các loMi

hiRt bN khác nhau nhom xây dDng B0C c quy trình k m thu?t xác BNnh d0 l0C ng kháng

sinh nhóm Quinolon trong thDc phXm phù hC p v4 i BiGu kiLn ViLt Nam.

1.3. Nghiên cb u vY tdn dB quinolon trong the c ph`m

1.3.1. Tình hình sl djng kháng sinh trong ch_n nuôi

Trong nh[ng n@m gJn Bây, kháng sinh B0C c sZ d]ng nhiGu trong l g nh vDc nông

nghiL p BHc biLt là ch@n nuôi. Theo sU liLu c_a Ghislain Follet, trong n@m 1997 tbng

l0C ng kháng sinh dùng trong dân y và ch@n nuôi a các n04 c châu Âu là 10500 t\n (qui

theo m`c 100% tinh khiRt c_a các thành phJn hoMt tính), trong Bó 52% sZ d]ng trong

dân y, 33% trong BiGu tr N thú y và 15% nh0 ch\t bb sung trong th`c @n ch@n nuôi. Trong

Bó, tc lL các loMi kháng sinh B0C c sZ d]ng trong ch@n nuôi: penicillin (9%); tetracycline

(66%); macrolid (12%); Aminoglycosid (4%); Fluoroquinolon (1%); Trimethomprim

/sulphamid (2%) và các kháng sinh khác (6%) [24].

k ViLt Nam, theo nghiên cù c_a mWt sU tác giV, kháng sinh B0C c sZ d]ng tràn lan

trong th`c @n cho v?t nuôi và tình tr Mng tKn d0 kháng sinh trong thNt là phb biRn. Các

nghiên cù BGu cho r ong hJu hRt các c2 sa ch@n nuôi sZ d]ng kháng sinh không hC p lý

tI Bó d6n BRn tình tr Mng tKn d0 kháng sinh trong sVn phXm cao g\ p hàng ch]c t4 i hàngngàn lJn so v4 i tiêu chuXn quUc tR. HiLn nay, viLc ki<m soát d0 l0C ng kháng sinh gH p r \t

nhiGu khó kh@n do thiRu kinh phí, thiRu trang thiRt bN, thiRu hi<u biRt c_a ng01 i sZ d]ng.

K Rt quV BiGu tra “Tình hình sZ d]ng kháng sinh và d0 l0C ng kháng sinh trong thNt

gà tMi các c2 sa ch@n nuôi gà công nghiL p c_a thành phU HK Chí Minh” c_a Võ ThN Trà

An cho th\y có 8 loMi kháng sinh B0C c sZ d]ng phb biRn trong ch@n nuôi gà thNt công

nghiL p trên BNa bàn thành phU HK Chí Minh: colistin (15,83%), enrofloxacin, diaveridin

(7,74%), sulfadimidin (6,72%), trimethoprim (6,38%), norfloxacin (5,79%),





13

oxytetracyclin (4,93%), gentamycin (4,51%) và acid oxolinic (4%). Có 32,61% c2 sa sZ

d]ng kháng sinh không hC p lý, trong Bó sai vG liGu l0C ng chiRm ti lL cao nh\t (23,3%).

SU c2 sa không ng0ng thuUc Búng qui BNnh chiRm 44,54%. Ki<m tra 70 m6u thNt gà tMi

các c2 sa sZ d]ng không hC p lý phát hiLn 42 (60%) m6u thNt có tKn d0 v4 i các loMi khángsinh: enrofloxacin, norfloxacin, tylosin, tetracyclin, sulfadimidin, sulfadiazin,

sulfaquinoxalin. Có mUi liên quan gi[a viLc ng0ng thuUc không Búng qui BNnh v4 i tình

tr Mng tKn d0 kháng sinh. 35,71% m6u thNt gà có tKn d0 v0C t quá gi4 i hMn tI 2 – 400 lJn

so v4 i tiêu chuXn c_a Malaysia [1].

Trong các loMi kháng sinh dùng cho ch@n nuôi trên thN tr 01 ng không ít loMi không

BVm bVo hàm l0C ng và ch\t l0C ng nên khi sZ d]ng chúng sj có ít hiLu quV. Ng01 i ch@n

nuôi th01 ng phVi dùng k Rt hC p nhiGu loMi kháng sinh khác nhau B< phòng và ch[a bLnh.Do Bó Bã gây nên hiLn t0C ng tKn d0 kháng sinh trong sVn phXm BWng v?t nh0 : thNt , s[a ,

tr ̀ ng... %iGu này gây nguy hMi l4 n cho s`c khPe cWng BKng. Con ng01 i sj bN nhitm vi

khuXn kháng thuUc khi @n phVi thNt nhitm khuXn. %Hc biLt là sD kháng thuUc c_a nhiGu

l:ai vi khuXn gây bLnh nguy hi<m.

1.3.2. Các nghiên cb u vY tdn dB quinolon trong the c ph`m G trong nBw c

PhMm Kim %@ng và BKng sD “ p ng d]ng ph02 ng pháp Elisa B< phân tích tKn d0

kháng sinh nhóm quinolon trong Tôm tMi mWt sU ven bi<n khu vDc phía bTc” cho th\y:Tình hình tKn d0 quinolon trong tôm Bã B0C c Bánh giá thông qua viLc phân tích 90 m6u

tôm B0C c l\y a 4 BNa ph02 ng BMi diLn (Hà NWi, QuVng Ninh, Nam %Nnh, NghL An) bong

ph02 ng pháp ELISA và khwng BNnh bong ph02 ng pháp STc ký lPng ghép khUi phb (LC-

MS/MS). K Rt quV phân tích Bánh giá tình hình tKn d0 phát hiLn 5 quinolon

(enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin và acid oxolinic) trong 9 m6u

nhitm (tc lL nhitm 10%) v4 i nKng BW dao BWng tI 0,4 BRn 145 ppb. Trong Bó, có 4 m6u

nhitm a nKng BW cao h2 n gi4 i hMn tKn d0 cho phép theo NghN BNnh 2377/90 CE c_a Uc ban Châu Âu [4].

MWt sU k Rt quV khVo sát tình hình sZ d]ng thuUc kháng sinh trong ch@n nuôi gà và

tKn d0 kháng sinh trong thNt, tr ̀ ng gà trên BNa bàn Hà NWi c_a Lê ThN Ng:c DiL p th\y

r ong: Ki<m tra tKn d0 kháng sinh theo ph02 ng pháp vi sinh v?t (theo D0C c Bi<n ViLt

Nam 3, t? p II, 1994). M6u d02 ng tính là m6u có B01 ng kính vòng vô khuXn > 8mm.

Kháng sinh B0C c sZ d]ng trong ch@n nuôi gà tMi các huyLn ngoMi thành Hà NWi là các

nhóm beta- lactamin (46,58%), aminoglycosid (50,96%), quinolon (78,14%), macrolid





14

(86,89%), tetracycline (46,58%), sulfamid (54,92%) và polypeptide (22,27%). Các

kháng sinh khác có tc lL sZ d]ng th\ p, chiRm 10,11% [3].

Tác giV Nguytn Thanh Nga trong nghiên cù xác BNnh d0 l0C ng kháng sinh

ciprofloxacin và enrofloxacin trong thDc phXm cvng lDa ch:n ph02 ng phápLC/MS/MS. CWt B0C c sZ d]ng là cWt XDB-C18 (50mm x 4,6mm; 3,5xm;) v4 i pha

BWng gKm acetonitril và acid formic 0,1%. Các BiGu kiLn khUi phb B0C c tUi 0u hóa

nh0 sau: K m thu?t ion phun hóa BiLn EIS v4 i chR BW bTn ion d02 ng, tUc BW dòng:

0,5 ml/phút, nhiLt BW cWt: 300C, nhiLt BW MS1 (MS1 Heater) và MS2 (MS2 Heater):

100oC, nhiLt BW dòng khí (gas temp): 350oC, tUc BW dòng khí (gas flow): 8,0l/min,

thR áp vào Ung mao quVn (capillary): 3840V, c01 ng BW dòng BiLn c_a buKng

(chamber current): 1.66xA, c01 ng BW dòng BiLn tMi Ung mao quVn (capillarycurrent): 74nA, áp su\t dòng khí N2 cho hL phun s02 ng (nebulizer): 40.0psi. Gi4 i

hMn phát hiLn c_a ciprofloxacin và enrofloxacin t02 ng `ng là 0.426ppb và 0,391ppb

[6].

%< Bánh giá tKn d0 enrofloxacin trên cá tra, tác giV Tr Jn Minh Phú Bã sZ

d]ng ph02 ng pháp sTc ký lPng cao áp k Rt hC p v4 i BJu dò khUi phb. Ph02 ng pháp có

gi4 i hMn BNnh l0C ng 2ppb. Các BiGu kiLn sTc ký Bã B0C c tUi 0u hóa: sZ d]ng cWt C18

(150 mm x 3mm; 3,0xm), Pha BWng chMy sTc ký là acetonitril và n04 c B0C c BiGuchinh BRn pH BMt 2,5 bong axit formic. Th< tích tiêm m6u 20xl, tUc BW dòng

500xl/phút, nhiLt BW cWt: 250C, nhiLt BW nguKn 4500C [8].

1.3.3. Các nghiên cb u vY tdn dB quinolon trong the c ph`m G ngoài nBw c

Trên thR gi4 i hiLn nay có r \t nhiGu các nghiên cù xác BNnh d0 l0C ng c_a các

kháng sinh nói chung và quinolon nói riêng trên các nGn m6u khác nhau. MWt sU

ph02 ng pháp Bang B0C c sZ d]ng nh0: ph02 ng pháp mitn dNch enzym (ELISA) [4];

ph02 ng pháp vi sinh v?t (test vi sinh v?t h:c), ph02 ng pháp lý hóa. Mui ph02 ng pháp có 0u nh0C c Bi<m riêng. V4 i nhóm quinolon, có th< nh?n th\y, ph02 ng pháp

B0C c sZ d]ng phb biRn hiLn nay là sTc ký lPng hiLu n@ng cao (HPLC) do có BW

chính xác cao, phát hiLn B0C c mWt l0C ng nhP kháng sinh tKn d0 trong thDc phXm.

Các detector B0C c sZ d]ng nhiGu nh\t là detector UV [19], detector hunnh

quang[19], [26], [34] và detector khUi phb [13]…[22]…[41].





15

%< xác BNnh tKn d0 kháng sinh cJn phVi tr Vi qua quá trình tách chiRt

l\y ch\t cJn phân tích ra khPi nGn m6u, sau Bó B0C c làm sMch và làm giJu sZ d]ng

bong các k m thu?t hiLn BMi B< phát hiLn và BNnh l0C ng.

NhiGu k m thu?t xZ lý m6u có th< B0C c sZ d]ng B< phân tích tKn d0 khángsinh trong các nGn m6u khác nhau. Nguyên tTc chung c_a quá trình này là k Rt t_a

protein trong m6u sZ d]ng dung môi thích hC p B< chiRt B0C c ch\t phân tích, sau Bó

B0C c làm sMch và/hoHc làm giàu m6u tr 04 c khi Bem Bi phân tích. Dung môi B0C c sZ

d]ng ch_ yRu là acetonitril [13], [14]...[21], [30]….[41] hoHc hun hC p acetonitril:

acid phosphoric 0,3%, hun hC p acetonitril : acid formic [13]. MWt sU nghiên cù

cvng sZ d]ng hun hC p acid acetic/ethanol hoHc acid formic/ethyl acetate B< chiRt

m6u cho k Rt quV tUt. Giai BoMn này th01 ng B0C c k Rt hC p v4 i k m thu?t rung siêu âm,lTc Vortex cho BKng nh\t và ly tâm B< phân tách l4 p tUt h2 n. Giai BoMn chiRt B0C c

lH p lMi nhiGu lJn B< chiRt B0C c tUi Ba ch\t phân tích. DNch chiRt B0C c loMi ch\t béo

bong k m thu?t chiRt lPng – lPng (n-hexan) hoHc làm sMch m6u sZ d]ng k m thu?t chiRt

pha r Tn SPE, sau Bó cô cMn làm giàu m6u, hòa cHn và Bem Bi phân tích [20].

Trong k m thu?t chiRt pha r Tn, phân tích tKn d0 kháng sinh th01 ng sZ d]ng 2

loMi cWt chính là cWt SPE Oasis HLB Waters và cWt SPE C18 [14], [15]…[22],

[38]….[41]. %ây là k m thu?t B0C c Ba sU các nghiên cù sZ d]ng B< làm sMch m6u,sZ d]ng ít dung môi, cho hiLu quV cao. Ngoài vai trò loMi các tM p ch\t, k m thu?t chiRt

pha r Tn còn có vai trò làm giàu m6u, t@ng c01 ng khV n@ng phân tích m6u.

STc ký lPng là k m thu?t B0C c sZ d]ng phb biRn B< phân tích tKn d0 kháng

sinh. K m thu?t này BGu có nhiGu Bi<m thu?n lC i B< xây dDng mWt ph02 ng pháp phân

tích Ba d0 l0C ng kháng sinh trong thDc phXm nói chung..

Ngay tI khi B0C c bTt BJu `ng d]ng trong phân tích, sTc ký lPng Bã B0C c

nghiên cù phát tri<n B< xác BNnh r \t nhiGu hC p ch\t. V4 i khV n@ng k Rt hC p v4 inhiGu loMi detector khác nhau nên phMm vi `ng d]ng c_a sTc ký lPng r \t r Wng rãi và

phong phú. %< xác BNnh tKn d0 kháng sinh, trong th1 i gian BJu, detector UV và

detector hunnh quang B0C c sZ d]ng phb biRn trong các nghiên cù, BHc biLt là

detector hunnh quang (do có BW nhMy cao). Trong nghiên cù c_a Verdon sZ d]ng

detector hunnh quang có LOD khoVng 4-11 mcg/kg và LOQ khoVng 13-36 mcg/kg

[41]. Th1 i gian gJn Bây, k m thu?t khUi phb phát tri<n mMnh mj và BMt B0C c nhiGu





16

b04 c tiRn v0C t b?c. STc ký lPng ghép nUi v4 i detector khUi phb có BW nhMy và tính

BHc hiLu r \t cao, Báp `ng B0C c yêu cJu ngày càng khTt khe c_a thR gi4 i vG phân tích

d0 l0C ng.

Ngoài k m thu?t sTc ký lPng, mWt sU tác giV cvng Bã nghiên cù phát tri<n phân tích d0 l0C ng kháng sinh sZ d]ng k m thu?t: BiLn di mao quVn (CE). GJn Bây,

ph02 ng pháp CE B0C c sZ d]ng do tính ch\t 0u viLt vG hiLu quV tách cao, th1 i gian

tách ngTn, l0C ng m6u tiêu tUn ít. Ph02 ng pháp này B0C c D. Barrón sZ d]ng v4 i

detector PAD B< phân tích flumequin và acid oxolinic. Các BiGu kiLn BiLn di gKm:

dung dNch BiLn di là dung dNch acid phosphoric 40mM BiGu chinh pH 8,02 bong

NaOH, thR BiLn di 18kV, nhiLt BW mao quVn duy trì a 250C, b04 c sóng phát hiLn là

250nm. Ph02 ng pháp có gi4 i hMn phát hiLn và gi4 i hMn BNnh l0C ng cho acid oxolinic

và flumequine t02 ng `ng là 15 và 48ppb và 10 và 30ppb [20]. Tuy nhiên do BW

nhMy không tUt và BW tin c?y không cao nên ph02 ng pháp BiLn di mao quVn ít B0C c

áp d]ng.

1.3.4. MJt sg quy XMnh vY giw i hvn tdn dB quinolon trong the c ph`m

EU Bã ban hành quyRt BNnh sU 2377/90/EC quy BNnh qui BNnh gi4 i hMn cho phép

thuUc thú y trong sVn phXm BWng v?t, theo Bó các sVn phXm có nguKn gUc tI BWngv?t phVi B0C c ki<m soát d0 l0C ng tuân th_ qui trình c_a Chi thN sU 96/23 EC (EU,

1996). %Hc biLt các ph02 ng pháp phân tích B0C c công nh?n và áp d]ng trong chiRn

l0C c ki<m soát d0 l0C ng phVi chuXn hoá theo quyRt BNnh sU 2002/657/CE (CE,

2002). Trong Bó, quy BNnh vG gi4 i hMn tKn d0 tUi Ba c_a các quinolon trong nghiên

cù c] th< nh0 sau.

B ng 1.1: Gi; i h.n t 7n d , t 4 i 6 a c)a các quinolone theo quy< t 6=nh s4

2377/90/EC c)a ? y ban Châu Âu [22]

HoMt ch\t%Nnh l0C ngch\t tKn d0

Loài C2 quanGi4 i hMn tKn d0

tUi Ba (MRL)(µg/kg)

Danofloxacin Danofloxacin

Bò, cIu, dê,lC n

ThNtME GanTh?nS[a

ThNt

20010040040030

200





17

Gia cJm

Các loài khác

Da và mE GanTh?nThNtME GanTh?n

10040040010050

200200

Difloxacin Difloxacin

Bò, cIu, dê

LC n

Gia cJm

Các loài khác

ThNtME GanTh?nThNt

Da và mE GanTh?nThNt

Da và mE GanTh?nThNtDa

GanTh?n

40010014008004001008008003004001900600300100800600

Enrofloxacin

Tbng c_aEnrofloxacin

vàCiprofloxacin

CIu, bò, dê

LC n, thP

Gia cJm

Các loài khác

ThNtME GanTh?nThNtME GanTh?nThNtME GanTh?nThNtME GanTh?n

100100300200100100200300100100200300100100200200

Flumequin Flumequin

Bò, cIu, dê,lC n

Gia cJm

ThNtME GanTh?nS[a

ThNt

200300500150050

400





18

Cá thu

Khác

ME GanTh?n

Da và thNtThNtME GanTh?n

2508001000600200

2505001000

Acid oxolinic Acid oxolinic

LC n

Gà

Cá thu

ThNtDa và mE

GanTh?nThNt

Da và mE GanTh?n

Da và thNt

10050

15015010050

150150100

Sarafloxacin SarafloxacinGà

Cá hKi

Da và mE Gan

Da và thNt

1010030

BW Th_y sVn Bã ra quyRt BNnh 07/2005/Q%-BTS ban hành ngày 24 tháng 02 n@m

2005 quy BNnh danh m]c 17 kháng sinh c\m sZ d]ng và danh m]c 34 loMi hMn chR

sZ d]ng, trong Bó có nhóm flouroquinolon và quyRt BNnh 26/2005/Q%-BTS banhành ngày 18/8/2005 bb sung nhóm kháng sinh fluoroquinolon c\m sZ d]ng trong

sVn xu\t, kinh doanh th_y sVn xu\t khXu vào thN tr 01 ng Mm và BTc Mm. Các QuyRt

BNnh này B0C c thay thR ba i Thông t0 sU 15/2009/TT-BNN ban hành ngày

17/03/2009 c_a BW Nông nghiL p và phát tri<n nông thôn, quy BNnh danh m]c thuUc,

hóa ch\t, kháng sinh c\m sZ d]ng và hMn chR sZ d]ng. Fluoroquinolon v6n bN c\m

sZ d]ng trong sVn xu\t, kinh doanh th_y sVn xu\t khXu vào thN tr 01 ng Mm và BTc

Mm. Các kháng sinh enrofloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin bN c\m sZ d]ng trong thú

y. MWt sU kháng sinh quinolone nom trong danh m]c các kháng sinh hMn chR sZ

d]ng trong sVn xu\t kinh doanh th_y sVn.





19

B ng 1.2 : Danh mAc các quinolone h.n ch< sB d Ang trong s#n xu% tkinh doanh th) y s#n

Tên hoMt ch\t, kháng sinh D0 l0C ng tUi Ba (MRL) (ppb)Danofloxacin 100

Difloxacin 300Enrofloxacin + Ciprofloxacin 100

Acid oxolinic 100Sarafloxacin 30Flumequine 600

M4 i Bây, ngày 16/01/2012, BW Nông nghiL p và phát tri<n nông thôn ban hành

thông t0 sU 03/2012/TT-BNNPTNT, trong Bó quy BNnh B0a enrofloxacin ra khPi

Danh m]c hoá ch\t, kháng sinh hMn chR sZ d]ng trong sVn xu\t, kinh doanh thuc

sVn, và bb sung vào enfloxacin vào Danh m]c các hóa ch\t, kháng sinh c\m sZ

d]ng trong sVn xu\t, kinh doanh th_y sVn ]9].





20

ChBD ng 2. $2I T* NG VÀ PH" NG PHÁP NGHIÊN Cf U

2.1. $gi tBI ng nghiên cb u cha XY tài

- Các ch\t phân tích: Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Norfloxacin , Flumequin

- %Ui t0C ng phân tích: tKn d0 quinilon trong thDc phXm- %Ui t0C ng nghiên cù: thNt gà, thNt lC n, cá

Các m6u thNt, cá B0C c l\y ng6u nhiên tMi mWt sU chC trên thN tr 01 ng Hà NWi

2.2. ThiOt bM, djng cj, hoá chWt

2.2.1. ThiOt bM, djng cj

- Máy sTc ký lPng khUi phb ba t` cDc (UPLC-MS/MS): v4 i phJn UPLC 20A c_a

Shimazdu và detector MS/MS TripleQuad API 5500 c_a ABSciex- CWt sTc ký C18 Xbrigde (150mm x 2,1mm x 3,5 mcm) và tiGn cWt C18 t02 ng

`ng c_a Waters.

- CWt sTc ký C18 Symmetry (250mm x 4,6mm x 5 mcm) và tiGn cWt C18 t02 ng

`ng c_a Waters.

- Máy ly tâm lMnh Hermle (%`c)

- Máy lTc xoáy Vortex;

- CWt SPE Sep-Pak C18-E : (500mg, 3ml) c_a Waters

- CWt SPE Oasis HLB (200mg, 6ml) c_a Waters

- BW c\t quay chân không Eyela

- D]ng c] th_y tinh các loMi.

- .ng ly tâm nhDa 50ml có nT p kín

2.2.2. Thugc thl , hóa chWt

T\t cV các hóa ch\t thuUc thZ phVi BMt tiêu chuXn dùng cho phân tích

- ChuXn ciprofloxacin, norfloxacin, enrofloxacin và flumequin c_a Fluka

- N04 c tinh khiRt dùng cho HPLC (n04 c c\t 2 lJn l:c qua màng l:c 0,45 mcm)

- Acetonitril, Methanol, Acid acetic, acid formic.. loMi dùng cho HPLC (Merck).

2.3. NJi dung và phBD ng pháp nghiên cb u

2.3.1. Nghiên cb u các XiYu kiLn LC-MS/MS

a. Khko sát và le a chmn các XiYu kiLn MS Xx xác XMnh các chWt phân tích





21

SZ d]ng các dung dNch chuXn c_a các ch\t nghiên cù có nKng BW thích hC p

B< phân tích trên detector MS/MS và lDa ch:n B0C c các thông sU tUi 0u:

- ChR BW hóa h2 i: APCI hay ESI và lDa ch:n ion (+) hay ion (-)

- ChR BW theo dõi ion: MRM, SIM, TIC,......- Các ion ms (procusor ion) và ion con (product ion),....

- Các thông sU vG n@ng l0C ng bTn phá theo tIng ch\t

- NhiLt BW nguKn ion hóa và thR ion hóa

- NhiLt BW và tUc BW c_a khí mang

- ThR phân mVnh cho tIng cH p ion

- MWt sU thông sU khác: khí loMi tM p, well time,....

b. Khko sát và le a chmn các XiYu kiLn LC Xx tách các chWt phân tích

- ChuXn bN d]ng c] và máy móc

+ ThiRt bN LC-MS/MS B0C c hiLu chuXn theo BNnh k n B< BVm bVo BW chính xác

+ CWt sTc ký B0C c ki<m tra Bánh giá hiLu lDc cWt BNnh k n.

+ Các d]ng c] thí nghiLm B0C c BVm bVo sMch sj tr 04 c khi sZ d]ng.

- ChuXn bN dung môi BWng

Pha dung môi BWng B0C c pha chR chính xác và sZ d]ng trong mWt khoVng th1 i giannh\t BNnh. L:c dung môi sau khi pha chR (BHc biLt là các dung dNch BLm) qua màng

l:c 0,45 µm, Bubi khí bong cách chMy siêu âm.

- ChuXn bN m6u Bo LC-MS/MS

+ M6u thZ: xZ lý theo qui trình nghiên cù, cuUi cùng qua màng l:c 0,45 µm.

+ M6u chuXn: Pha dung dNch chuXn c_a các ch\t phân tích trong các loMi dung

môi thích hC p, pha loãng (nRu cJn) B< có B0C c các nKng BW thích hC p.- Phân tích thZ nghiLm và lDa ch:n các BiGu kiLn sTc kí lPng (LC):

DDa vào bVn ch\t c_a các ch\t cJn phân tích, trên c2 sa nghiên cù các tài liLu

tham khVo, tiRn hành thZ nghiLm và lDa ch:n các thông sU sau:

+ Pha t g nh: bVn ch\t pha t g nh, các thông sU c_a pha t g nh.

+ Pha BWng: B< phân tích BKng th1 i nhiGu ch\t nên sZ d]ng chR BW gradient:

Dung môi h[u c2 : Acetonitril, methanol,... hay hun hC p dung môi khác





22

Dung môi phân cDc: dung dNch acid (formic, acetic,...) hoHc dung dNch BLm

TUc BW pha BWng

+ Các thông sU khác: nhiLt BW buKng cWt, th< tích tiêm m6u, .....

2.3.2. Nghiên cb u và le a chmn quy trình xl lý maua. Nghiên cb u và le a chmn các XiYu kiLn chiOt mau

SZ d]ng các nGn m6u tr Tng có thêm chuXn a nKng BW xác BNnh và các BiGu

kiLn phân tích bong LC-MS/MS Bã lDa ch:n B0C c a trên, tiRn hành thZ nghiLm và

xác BNnh B0C c quy trình và các BiGu kiLn chiRt m6u phù hC p v4 i tIng BUi t0C ng

m6u:

- ThZ nghiLm k m thu?t chiRt: lPng-lPng, r Tn–lPng, ....

- ThZ nghiLm và lDa ch:n dung môi chiRt m6u, sU lJn chiRt m6u,....

- Nghiên cù các yRu tU Vnh h0a ng: nhiLt BW, BW Xm, ánh sáng,...

- Các k m thu?t ph] tr C : lTc vortex, siêu âm, lTc ngang,.....và các thông sU Bi kèm:

th1 i gian, tUc BW, cách th`c,....

DDa vào bVn ch\t c_a các ch\t phân tích, bVn ch\t c_a BUi t0C ng m6u cvng

nh0 tham khVo mWt sU tài liLu [18], [35], [39], chúng tôi tiRn hành nghiên cù và

thZ nghiLm mWt sU quy trình, BiGu kiLn chiRt m6u nh0 sau:

+ Test 1: ChiRt v4 i Acetonitril, chiRt 02 lJn, có rung siêu âm hu tr C . Cân khoVng 2g

m6u Bã BKng nh\t cho vào Ung ly tâm 50ml có nT p kín. Thêm chính xác 0,2ml dung

dNch chuXn hun hC p các Quinolon 500ppb, lTc BGu, B< yên khoVng 1h. Thêm khoVng

30ml ACN, lTc BGu, Bem rung siêu âm 15 phút. Sau Bó Bem ly tâm 6000 vòng/phút

trong 5 phút, l\y ra gMn phJn dNch trong cho vào bình cô quay 100ml. ChiRt lMi lJn 2

v4 i 15ml ACN. GW p dNch chiRt thu B0C c, Bem cô quay chân không BRn cMn. Hòa cHntrong 2ml ACN, l:c qua màng 0,45mcm và phân tích trên LC-MS/MS.

+ Test 2: TiRn hành các giai BoMn chiRt m6u t02 ng tD nh0 Test 1 nh0ng thay ACN

bong hun hC p ACN/TCA 4% trong n04 c c\t (70/30).

+ Test 3: TiRn hành các giai BoMn chiRt m6u t02 ng tD nh0 Test 1 nh0ng thay ACN

bong hun hC p ACN/NaOH 0,1N trong n04 c c\t (70/30).





23

b. Nghiên cb u và le a chmn các XiYu kiLn làm svch mau

SZ d]ng các nGn m6u tr Tng có thêm chuXn a nKng BW xác BNnh và các BiGu

kiLn phân tích bong LC-MS/MS Bã lDa ch:n B0C c a trên, tiRn hành thZ nghiLm và

xác BNnh B0C c quy trình và các BiGu kiLn làm sMch và làm giàu m6u:- LDa ch:n B0C c loMi cWt SPE: HLB, C18-E, và các thông sU cWt t02 ng `ng

- LDa ch:n tIng quy trình qua tIng loMi cWt SPE t02 ng `ng:

+ Các giai BoMn qua cWt: hoMt hóa, nM p m6u, r Za tM p và r Za giVi

+ Các loMi dung môi tùy theo tIng giai BoMn qua tIng loMi cWt

+ Th< tích và sU lJn qua cWt c_a các loMi dung môi

+ MWt sU nh?n xét trong quá trình qua cWt SPE- DDa vào bVn ch\t c_a các ch\t phân tích, bVn ch\t c_a BUi t0C ng m6u cvng

nh0 tham khVo mWt sU tài liLu, chúng tôi tiRn hành nghiên cù và thZ ghiLm mWt

sU quy trình, BiGu kiLn làm sMch và làm giàu m6u nh0 sau:

+ CWt SPE Sep-Pak C18-E : (500mg, 3ml) c_a Waters:

HoMt hóa cWt SPE: 6ml methanol, 6ml n04 c c\t.

NM p m6u v4 i tUc BW không quá 2ml/phút.

LoMi tM p bong 3ml n04 c c\t, 3ml MeOH 10%/n04 c c\t

R Za giVi l\y ch\t phân tích bong 2 x 2ml acetonitril.

+ CWt SPE Oasis HLB (200mg, 6ml) c_a Waters:

HoMt hóa cWt SPE: 6ml methanol, 6ml n04 c c\t.


LoMi tM p bong 3ml n04 c c\t, 3ml MeOH 10%/n04 c c\t

R Za giVi l\y ch\t phân tích bong 2 x 2ml acetonitril.

+ CWt SPE Strata SCX (500mg, 3ml) c_a Phenomenex

HoMt hóa cWt SPE: 6ml methanol, 6ml dung dNch HCl 0,1N.


LoMi tM p bong 3ml n04 c c\t, 3ml methanol.

R Za giVi l\y ch\t phân tích bong 2 x 2ml NH3 5%/ACN.





24

2.3.3. Th`m XMnh lvi phBD ng pháp Xã xây de ng

a. Xác XMnh XJ chmn lmc/XJ XUc hiLu

Trên hL thUng LC-MS/MS, v4 i mui ch\t phân tích lDa ch:n B0C c ít nh\t 01ion ms và 02 ion con, mWt ion con B< BNnh l0C ng, mWt ion con B< BNnh tính.

TiRn hành phân tích m6u tr Tng, m6u dung dNch chuXn và m6u tr Tng thêm

chuXn theo các BiGu kiLn LC-MS/MS Bã lDa ch:n B0C c. K Rt quV phVi BMt nh0 sau:

- Trên sTc BK m6u tr Tng không xu\t hiLn các pic có cùng th1 i gian l0u v4 i pic

c_a các ch\t phân tích trên sTc BK m6u dung dNch chuXn và m6u tr Tng thêm chuXn.

- Trên sTc BK m6u tr Tng thêm chuXn có các pic có th1 i gian l0u t02 ng tD nh0 trên sTc BK c_a dung dNch chuXn.

b. Xác XMnh tính thích hI p cha hL thgng

TiRn hành phân tích lH p lMi ít nh\t 06 lJn dung dNch chuXn trên hL thUng LC-

MS/MS theo các BiGu kiLn Bã lDa ch:n B0C c nh0 trên. Tính toán BW lLch chuXn

t02 ng BUi (RSD %) c_a các giá tr N th1 i gian l0u (tR ) và diLn tích pic (ti lL diLn tích

píc nRu sZ d]ng nWi chuXn). Các giá tr N RSD phVi nhP h2 n 2%.

c. Khko sát khokng tuyOn tính

%< xác BNnh khoVng tuyRn tính c_a ph02 ng pháp, thDc hiLn phân tích dãy

chuXn v4 i ít nh\t 5 nKng BW pha tI 1ppb BRn 500ppb. NRu BK thN tuyRn tính trong

khoVng nKng BW này (R 2 y 0,995) thì ch\ p nh?n dãy nKng BW này, nRu không phVi

tiRn hành phân tích lMi dãy chuXn hoHc thu hs p dVi nKng BW cho BRn khi R 2 y 0,995.

d. Giw i hvn phát hiLn LOD và giw i hvn XMnh lBI ng LOQ

- Gi4 i hMn phát hiLn (LOD) là nKng BW nhP nh\t trong dãy chuXn có chiGu cao pictrung bình cao ít nh\t g\ p 3 lJn chiGu cao pic c_a m6u tr Tng. Gi4 i hMn BNnh l0C ng

(LOQ) là nKng BW nhP nh\t trong dãy chuXn có chiGu cao pic trung bình cao g\ p 10

lJn chiGu cao pic c_a m6u tr Tng, ngh g a là LOQ z 3,3LOD

e. $J lUp lvi cha phBD ng pháp

%< thZ nghiLm BW lH p lMi c_a ph02 ng pháp, tiRn hành phân tích m6u theo các

BiGu kiLn LC-MS/MS và quy trình xZ lí m6u Bã lDa ch:n B0C c a trên. SZ d]ng m6u





25

tr Tng thêm chuXn a nKng BW xác BNnh, tiRn hành phân tích BKng th1 i ít nh\t là 06

lJn. Tính toán BW lH p lMi c_a k Rt quV k Rt quV thu B0C c thông qua BW lLch chuXn SD

và BW lLch chuXn t02 ng BUi RSD theo các công th`c sau:

( ) 2

1−

−= ∑

n

X XiSD 100(%) ×=

X

SD RSD

Trong Bó: SD: BW lLch chuXn ; Xi: k Rt quV thu B0C c trên m6u th` i

X là k Rt quV trung bình c_a n lJn

f. $J thu hdi cha phBD ng pháp

%< thZ nghiLm BW lH p lMi c_a ph02 ng pháp, tiRn hành phân tích m6u theo các

BiGu kiLn LC-MS/MS và quy trình xZ lí m6u Bã lDa ch:n B0C c a trên. SZ d]ng m6utr Tng thêm chuXn a nKng BW xác BNnh, tiRn hành phân tích BKng th1 i ít nh\t là 06 lJn

Tính toán k Rt quV thu B0C c c_a BW thu hKi theo công th`c nh0 sau:

100×=Spike X X R

Trong Bó: {R : BW thu hKi trung bình ; X là k Rt quV trung bình c_a n lJn

XSpike: nKng BW c_a dung dNch m6u thêm chuXn.

2.3.4. The c nghiLm xác XMnh quinolon trên mau thMt, cáTiRn hành thu th? p m6u ng6u nhiên tMi mWt sU chC trên BNa bàn Hà NWi và xZ

lí m6u theo các quy trình Bã B0C c nghiên cù, lDa ch:n a trên. Phân tích các m6u

trên hL thUng LC-MS/MS v4 i các BiGu kiLn xác BNnh.

Tính toán k Rt quV phân tích B0C c B0a ra các nh?n xét, Bánh giá s2 bW vG

ph02 ng pháp phân tích và tình hình tKn d0 mWt sU ch\t nhóm Quinolon trong thDc

phXm trên thN tr 01 ng Hà NWi.

2.4. Tính toán k Ot quk, xl lí sg liLu

SZ d]ng phJn mGm Analyst 1.5.1 Bi kèm theo thiRt bN LC-MS/MS B< thu B0C c

các sTc BK, tính toán diLn tích pic,…..

SZ d]ng phJn mGm Microsoft Excel trong máy tính : l? p B01 ng hKi quy tuyRn

tính, tính ti lL thu hKi, BW lLch chuXn t02 ng BUi,…..

- MWt sU cách tính k Rt quV :

DC a vào di8n tích pic





26

- Áp d]ng khi: + DiLn tích và nKng BW ch\t Bó có sD t02 ng quan tuyRn tính.

+ %W phân giVi BVm bVo nh0ng hL sU dung l0C ng k' thay Bbi.

+ Xác BNnh B0C c Bi<m BJu, Bi<m cuUi c_a pic.

- Không áp d]ng: Khi pic quá cao hoHc quá doãng, không BUi x`ng, B01 ng nGnnhitu.

DC a vào chiD u cao pic

Khi pic có dMng không Bbi thì chiGu cao pic là mWt BMi l0C ng tc lL v4 i diLn tích

vì v?y trong các tr 01 ng hC p không tính theo diLn tích pic B0C c thì có th< tính k Rt

quV theo chiGu cao pic nh0ng v4 i BiGu kiLn là hL sU dung l0C ng k' hong BNnh.

Ph,( ng pháp dùng ngo.i chuE n

Có th< dùng 1 chuXn nRu BW lH p lMi tUt.

Có th< dùng B01 ng chuXn thiRt l? p bong nhiGu chuXn có nKng BW khác nhau, nKng

BW dung dNch thZ B0C c tính theo tc lL thu?n gi[a diLn tích pic hoHc chiGu cao pic

c_a dung dNch thZ và dung dNch chuXn.

Ph,( ng pháp dùng nFi chuE n

%< giVm sai sU và t@ng BW lH p lMi, ng01 i ta th01 ng dùng mWt chuXn th` 2 thêm

vào m6u thZ và m6u chuXn. Ch\t thêm vào này g:i là nWi chuXn. Trong cùng BiGu

kiLn sTc ký nó có th1 i gian l0u gJn v4 i th1 i gian l0u c_a ch\t phân tích nh0ng B0C c

tách hoàn toàn và có nKng BW t02 ng B02 ng và c\u trúc hoá h:c t02 ng tD.

Ph,( ng pháp thêm chuE n

Áp d]ng trong tr 01 ng hC p ch\t chuXn có nKng BW quá nhP hoHc bN Vnh h0a ng

ba i các ch\t khác.

Ph,( ng pháp tính theo % di8n tích pic

Áp d]ng trong tr 01 ng hC p cJn biRt hàm l0C ng tính theo chR phXm khô c_anguyên liLu hoHc tc lL tM p ch\t mà ta không có ch\t chuXn. K Rt quV chi là t02 ng BUi

vì nó Bòi hPi m:i c\u tZ trong hun hC p BGu phVi B0C c r Za giVi và B0C c phát hiLn

nh0 nhau





27

ChBD ng 3. K .T QUE NGHIÊN Cf U

3.1. K Ot quk khko sát và le a chmn các thông sg cho LC-MS

3.1.1. Xác XMnh các thông sg cha detector khgi ph[ (MS)

- %< Báp `ng yêu cJu c_a châu Âu (2002/657/EC) vG phân tích d0 l0C ng cácch\t kháng sinh trong thDc phXm, chúng tôi lDa ch:n chR BW MRM, v4 i mui ch\t sj

có 1 ion ms (precursor ion) và 2 ion con (product ion).

- ThZ nghiLm khVo sát cV hai ki<u ion hóa ESI và APCI cvng nh0 a cV chR BW

thu ion d02 ng (M+H)+ và ion âm (M-H)+. K Rt quV cho th\y: chR BW ESI (+) cho

c01 ng BW tín hiLu c_a các ch\t là tUt nh\t. Vì v?y chúng tôi lDa ch:n chR BW ESI (+).

- TiRn hành thZ nghiLm lJn l0C t v4 i tIng dung dNch ch\t phân tích (có nKng BW 50ppb)và thZ nghiLm v4 i hun hC p c_a chúng trên hL thUng LC-MS/MS. K Rt quV thu B0C c:

+ Các thông sU chung:

B#ng 3.1. Thông s4 chung c)a detector kh4 i ph1

Khí màn (Curtain gas) 15 (áp su\t/ th< tích)Khí va chMm (Collision gas ) 7 (áp su\t/ th< tích)ThR phun BiLn tZ (Ionspray voltage ) 5000 (volt)

NhiLt BW mao quVn (TEM) 4500C

Khí nguKn ion 1 (Ion source gas 1) 20Khí nguKn ion 2 (Ion source gas 2) 20ThR BJu vào (Entrance potential) 10 (volt)

+ Các thông sU chi tiRt cho tIng ch\t

B#ng 3.2 Thông s4 chi ti< t c)a 4 Quinolon

Ion con 1 Ion con 2Ch\t phân tích

(M+H)+ m/z

DP(volt) m/z CE (volt) CXP m/z CE (volt) CXP

Ciprofloxacin 332 91 314 27 34 288 23 22

Norfloxacin 320 96 276 23 26 302 25 14Enrofloxacin 360 41 316 25 18 342 27 20Flumequin 262 106 202 43 26 244 25 28

Ciprofloxacin d8 340 96 322 25 34 296 34 38

(Trong Bó: DP-declustering potential; CE-collistion energy; CXP-collision cell exit potential).

Nh?n xét: Các thông sU thu B0C c trong quá trình tUi 0u hóa detector MS theo

tIng ch\t phân tích và hun hC p các ch\t này sj B0C c sZ d]ng B< khVo sát các BiGu

kiLn khác c_a ph02 ng pháp.





28

3.1.2. Xác XMnh các thông sg cha phyn LC Xx tách các chWt nhóm Quinolon

DDa vào bVn ch\t c_a các ch\t phân tích, bVn ch\t c_a BUi t0C ng m6u cvng nh0

tham khVo mWt sU tài liLu, chúng tôi nghiên cù mWt sU BiGu kiLn nh0 sau:

- Pha t g nh: tiRn hành thZ nghiLm trên hai cWt sTc ký BGu có bVn ch\t C18 pha ng0C c

+ CWt Symmetry (250mm x 4,6mm; 5,0 µm) và tiGn cWt t02 ng `ng (Waters).

+ CWt XBridge (150mm x 2,1mm; 3,5 µm) và tiGn cWt t02 ng `ng (Waters).

- Pha BWng: sZ d]ng gradient gi[a dung môi h[u c2 và dung dNch acid h[u c2

+ Dung môi h[u c2 : thZ nghiLm Acetonitril và Methanol.

+ Dung dNch acid h[u c2 : thZ nghiLm n04 c c\t có chà 0,1% các acid: acid

acetic (AA) , acid formic (FA) , acid trichloacetic (TCA) và acid trifloacetic (TFA)

- MWt sU thUng sU HPLC khác B0C c lDa ch:n:+ Th< tích tiêm m6u 20µl, nhiLt BW buKng cWt 350C

+ TUc BW dòng 0,5 ml/phút cho cWt XBridge và 1,0 ml/phút cho cWt

Symmetry.

- K Rt quV sau khi tiRn hành khVo sát, thZ nghiLm và lDa chon B0C c nh0 sau:

+ Gradient pha BWng khi sZ d]ng cWt Symmetry:

B#ng 3.3 Gradient pha 6Fng khi sB d Ang cFt Symmetry

Th1 i gian (phút) Acetonitril (FA 0,1%) H2O (FA 0,1%)BTt BJu 20% 80%

1,0 20% 80%7,0 50% 50%7,5 100% 0%8,5 100% 0%9,0 20% 80%

12,0 20% 80%

+ Gradient pha BWng khi sZ d]ng cWt XBridge:

B#ng 3.4 Gradient pha 6Fng khi sB d Ang cFt XBridgeTh1 i gian (phút) Acetonitril (FA 0,1%) H2O (FA 0,1%)

BTt BJu 20% 80%1,0 50% 50%7,0 70% 30%7,5 20% 80%10,0 20% 80%

- Nh?n xét: CWt Symmetry là loMi cWt thông d]ng, B0C c sZ d]ng nhiGu trong các

phòng thí nghiLm còn cWt XBridge Bang B0C c `ng d]ng trong các thR hL máy





29

sTc ký m4 i. Chúng tôi Bã xác BNnh BiGu kiLn phân tích trên cV 2 loMi cWt này B<

thu?n lC i h2 n cho viLc tri<n khai ph02 ng pháp vG sau.

3.2. Xác XMnh k n thupt xl lý mau

3.2.1. Quy trình tách chiOt các chWt cyn phân tích khî nYn mauTiRn hành khVo sát các quy trình chiRt m6u khác nhau, mui test làm

04 lJn, sZ d]ng các m6u tr Tng cho thêm mWt l0C ng chuXn xác BNnh :

B#ng 3.5: K < t qu# thB nghi8m dung môi chi< t mG u khi phân tích Norfloxacin

Dung môi chiRtC thêm vào -

(ng/l)Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) TB

100 1,990 69,2100 1,991 69,6

100 1,190 66,2

Acetonitril

100 2,169 75,8

70,2

100 2,654 92,7100 2,688 93,6100 2,361 82,5

Acetonitril/TCA

100 2,893 99,9

92,2

100 2,181 76,4100 1,888 65,7100 2,252 78,2

Acetonitril/NaOH

100 2,109 73,3

73,4

Hình 3.1: S 0 c ký 67 thB nghi8m dung môi chi< t mG u khi phân tích norfloxacin





30

B#ng 3.6: K < t qu# thB nghi8m dung môi chi< t mG u khi phân tích Ciprofloxacin

Dung môi chiRt C thêm vào (ng/l) Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) TB100 0,629 73,6100 0,623 73,5

100 0,587 69,1Acetonitril

100 0,643 75,5

72,9

100 0,806 95,1100 0,764 89,7100 0,734 86,2

Acetonitril/TCA

100 0,845 99,1

92,5

100 0,630 74,4100 0,513 60,2100 0,622 73,1

Acetonitril/NaOH

100 0,605 71,0

69,8

B#ng 3.7: K < t qu# thB nghi8m dung môi chi< t mG u khi phân tích Enrofloxacin

Dung môi chiRt C thêm vào (ng/l) Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) TB

100 5,942 67,5100 5,477 62,7100 5,601 63,8

Acetonitril

100 6,262 71,5

66,4

100 7,654 91,1100 7,902 93,6100 7,243 87,9Acetonitril/TCA100 8,923 104

94,2

100 6,209 71,2100 4,820 64,9100 6,951 79,1

Acetonitril/NaOH

100 5,971 67,9

70,8

B#ng 3.8: K < t qu# thB nghi8m dung môi chi< t mG u khi phân tích Flumequin

Dung môi chiRt Cthêm vào (ng/l) Area Std/IS Cthu B0C c (ng/l) TB

100 5,631 68,5100 5,477 72,6100 5,340 70,4

Acetonitril

100 7,146 84,3

74,0

100 8,010 106100 8,625 113100 7,722 102

Acetonitril/TCA

100 8,641 114

108

Acetonitril/NaOH 100 6,619 90,9 85,1





31

100 5,565 75,8100 6,738 91,4100 6,234 82,2

Nh?n xét: tI các k Rt quV thu B0C c trong các bVng trên, nh?n th\y: sI d]ng

dung môi acetonitril/TCA 4% trong n04 c c\t (70/30) cho hiLu quV chiRt các ch\t

cJn phân tích cao nh\t. Các dung môi nh0 Acetonitril và acetonitril/NaOH 0,1N

trong n04 c c\t (70/30) cho hiLu quV kém h2 n. Vì v?y chúng tôi lDa ch:n hun hC p

acetonitril/TCA 4% trong n04 c c\t (70/30) làm dung môi chiRt m6u khi phân tích

d0 l0C ng các ch\t Norfloxacin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin và Flumequin trong

thDc phXm.3.2.2. Quy trình làm svch và làm giàu mau qua SPE

TiRn hành thZ nghiLm quá trình làm sMch và làm giàu ch\t phân tích trên các

loMi cWt SPE khác nhau (mui loMi cWt làm 04 lJn song song) sZ d]ng các tr Tng là

m6u thNt, cho thêm mWt l0C ng chuXn xác BNnh.

K Rt quV thu B0C c nh0 sau:

B#ng 3.9: K < t qu# thB nghi8m cFt SPE khi phân tích NorfloxacinCWt SPE C thêm vào (ng/l) Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) R (%) TB

50 0,992 35,7 71,450 1,056 36,7 73,450 1,089 37,8 75,6

HLB

50 0,914 36,2 72,4

73,0

50 1,139 38,1 76,250 0,938 34,5 69,050 0,955 35,3 70,6

C18-E

50 1,077 37,6 75,2

72,8

50 0,401 14,8 29,750 0,430 15,9 31,850 0,377 13,9 28,0

SCX

50 0,357 12,8 25,8

28,8





32

Hình 3.2: S 0 c ký 67 thB nghi8m cFt SPE khi phân tích Norfloxacin

B#ng 3.10: K < t qu# thB nghi8m cFt SPE khi phân tích Ciprofloxacin

CWt SPE C thêm vào (ng/l) Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) R (%) TB50 0,274 36,1 72,250 0,319 39,4 78,850 0,301 38,5 77,0

HLB

50 0,294 35,5 71,1

74,8

50 0,327 39,6 79,250 0,338 40,8 81,650 0,255 34,1 68,2

C18-E

50 0,268 35,6 71,2

75,1

50 0,163 19,9 39,850 0,116 17,2 34,450 0,113 16,9 33,8

SCX

50 0,151 19,2 38,4

36,6

B#ng 3.11: K < t qu# thB nghi8m cFt SPE khi phân tích Enrofloxacin

CWt SPE C thêm vào (ng/l) Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) R (%) TB100 7,308 89,5 89,5100 8,428 99,4 99,4100 7,087 88,3 88,3HLB100 6,961 87,1 87,1

91,1

50 2,405 35,9 71,850 2,898 39,9 79,850 2,042 34,3 68,6

C18-E

50 2,828 40,6 81,2

75,4

50 3,522 43,8 87,650 4,159 45,1 90,250 3,416 39,9 79,8

SCX

50 3,670 42,9 85,8

85,8





33

B#ng 3.12: K < t qu# thB nghi8m cFt SPE khi phân tích Flumequin

CWt SPE C thêm vào (ng/l) Area Std/IS C thu B0C c (ng/l) R (%) TB

100 7,457 90,3 90,3

100 7,751 91,8 91,8100 7,261 88,1 88,1

HLB

100 7,375 90,1 90,1

91,1

100 6,055 77,7 77,7100 5,996 76,9 76,9100 4,861 75,6 75,6

C18-E

100 4,708 72,7 72,7

75,7

100 2,872 41,5 41,5100 3,172 46,5 46,5

100 2,795 39,5 39,5SCX100 2,784 39,2 39,2

41,7

Nh?n xét: tI các k Rt quV thu B0C c trong các bVng trên, nh?n th\y: sI d]ng

cWt SPE HLB và cWt SPE C18-E cho hiLu quV tUt cho cV 04 ch\t phân tích. CWt SPE

SCX chi hiLu quV khi phân tích Enrofloxacin và Flumequin, nh0ng lMi r \t kém khi

phân tích Norfloxacin và Ciprofloxacin.. Vì v?y chúng tôi lDa ch:n cWt SPE HLB

và SPE C18-E B< làm sMch m6u khi phân tích BKng th1 i d0 l0C ng các ch\t

Norfloxacin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin và Flumequin trong thDc phXm.

3.2.3. Quy trình xl lí mau XBI c le a chmn

Cân khoVng 2g m6u Bã BKng nh\t cho vào Ung ly tâm 50ml có nT p kín. Thêm

khoVng 30ml acetonitril/TCA 4% trong n04 c c\t (70/30), lTc BGu, Bem rung siêu

âm 15 phút. Sau Bó Bem ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, l\y ra gMn phJn dNch

trong cho vào bình cô quay 100ml. ChiRt lMi lJn 2 v4 i 15ml acetonitril/TCA 4%

trong n04 c c\t (70/30). GW p dNch chiRt thu B0C c, Bem cô quay chân không BRn khi

còn khoVng 10ml. Thêm khoVng 20ml n04 c c\t, lTc BGu, làm sMch qua cWt SPE.

Các giai BoMn làm sMch m6u qua cWt SPE HLB và cWt SPE C18-E:

- HoMt hóa cWt SPE: 6ml methanol, 6ml n04 c c\t.

- NM p m6u v4 i tUc BW không quá 2ml/phút.

- LoMi tM p bong 3ml n04 c c\t, 3ml MeOH 10%/n04 c c\t

- R Za giVi l\y ch\t phân tích bong 2lJn x 2ml/lJn acetonitril.





34

DNch r Za giVi B0C c l:c qua màng l:c 0,45µm cho vào vial 1,8ml và B0C c Bem

phân tích trên hL thUng LC-MS/MS.

3.3. Th`m XMnh phBD ng pháp Xã xây de ng

3.3.1. Tính thích hI p cha hL thgngTiRn hành phân tích lH p lMi 09 lJn dung dNch chuXn hun hC p các ch\t phân

tích có nKng BW xác BNnh trên hL thUng LC-MS/MS v4 i các BiGu kiLn Bã lDa ch:n

B0C c a trên. Xác BNnh RSD (%) vG th1 i gian l0u (tR ) và ti lL diLn tích píc chuXn/diLn

tích pic nWi chuXn (Std/IS) c_a tIng ch\t phân tích. K Rt quV thu B0C c nh0 sau:

B#ng 3.13. K < t qu# phân tích tính thích h5 p c)a h8 th4 ng

Norfloxacin Ciprofloxacin Enrofloxacin Flumequin

tR Std/IS tR Std/IS tR Std/IS tR Std/ISTest 1 4,83 0,696 5,03 0,185 5,14 1,132 8,13 13,59Test 2 4,83 0,677 5,01 0,189 5,14 1,118 8,11 13,27Test 3 4,83 0,686 5,03 0,183 5,14 1,138 8,09 13,69Test 4 4,82 0,698 5,00 0,184 5,14 1,138 8,13 13,10Test 5 4,83 0,679 5,03 0,181 5,14 1,114 8,13 13,41Test 6 4,87 0,674 5,04 0,185 5,17 1,131 8,14 13,28Test 7 4,86 0,701 5,04 0,187 5,16 1,129 8,14 13,48Test 8 4,82 0,699 5,01 0,186 5,14 1,106 8,09 13,18Test 9 4,86 0,690 5,03 0,181 5,14 1,141 8,13 13,10

TB 4,841 0,689 5,024 0,185 5,146 1,127 8,121 13,34SD 0,019 0,010 0,014 0,003 0,011 0,012 0,020 0,210

RSD(%) 0,39 1,50 0,28 1,46 0,22 1,07 0,24 1,57

Nh?n xét: TI nh[ng k Rt quV a bVng trên nh?n th\y cV 04 ch\t phân tích BGu có

giá tr N RSD c_a th1 i gian l0u và ti lL diLn tích pic chuXn/diLn tích pic nWi chuXn nhP

h2 n 2% (trong khoVng tI 0,24% BRn 1,57%). Nh0 v?y, hL thUng LC-MS/MS phù

hC p B< phân tích các ch\t Norfloxacin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin và Flumequin.





35

Hình 3.3: S 0 c ký 67 khi phân tích tính thích h5 p c)a h8 th4 ng

3.3.2. $J XUc hiLu/XJ chmn lmc

- Theo quy BNnh c_a châu Âu (2002/657/EC) vG phân tích d0 l0C ng, các ph02 ng pháp phVi BMt yêu cJu có ít nh\t 4 Bi<m IP (Identification Point). Ph02 ng pháp c_a

chúng tôi có 1 ion ms (precursor ion = 1 IP) và 2 ion con (product ion = 1,5 IP) v4 i

mui ch\t. Nh0 v?y, ph02 ng pháp Bã xây dDng BMt yêu cJu vG BW BHc hiLu c_a châu

Âu.

- TiRn hành phân tích m6u tr Tng, m6u dung dNch chuXn hun hC p các ch\t và m6u

tr Tng thêm chuXn trên hL thUng LC-MS/MS. K Rt quV thu B0C c nh0 sau:

+ Trên sTc BK m6u tr Tng không xu\t hiLn pic nào có cùng th1 i gian l0u v4 i các

ch\t phân tích trên sTc BK m6u dung dNch chuXn và m6u tr Tng thêm chuXn.

+ Trên sTc BK m6u dung dNch chuXn hun hC p, các ch\t phân tích có cùng th1 i

gian l0u trên cV 02MRM c_a sTc BK m6u tr Tng thêm chuXn.

Nh0 v?y ph02 ng pháp Bã xây dDng BMt yêu cJu vG BW BHc hiLu, BW ch:n l:c khi

phân tích BKng th1 i 04 ch\t nhóm Quinolon là: Norfloxacin, Ciprofloxacin,

Enrofloxacin và Flumequin.

3.3.3. Khokng tuyOn tính và XBC ng chu`n

TiRn hành pha dãy dung dNch chuXn hun hC p các ch\t phân tích có các nKng BW

tI 1ppb BRn 500ppb. Phân tích dãy dung dNch chuXn trên hL thUng LC-MS/MS, tMi

mui Bi<m nKng BW phân tích lH p lMi 02 lJn. Xây dDng BK thN bi<u thN mUi t02 ng quan

tuyRn tính gi[a ti lL diLn tích pic chuXn/diLn tích pic nWi chuXn v4 i nKng BW ch\t

phân tích t02 ng `ng. K Rt quV thu B0C c nh0 sau:





36

B#ng 3.14: K < t qu# phân tích dãy chuE n Norfloxacin

C (ppb) Std/IS Bias (%) C (ppb) Std/IS Bias (%)500 3,988 -0,39 500 4,020 0,42200 1,632 0,40 200 1,609 -1,03

100 0,851 2,28 100 0,831 -0,2950 0,433 -1,07 50 0,438 0,2925 0,240 0,80 25 0,236 -1,3910 0,121 1,70 10 0,120 0,605 0,079 -2,07 5 0,077 -9,392 0,070 86,3 2 0,048 -52,5

Nh?n xét: TI các k Rt quV a bVng trên cho th\y: Norfloxacin có khoVng tuyRn

tính tI 2ppb BRn 500ppb. Tuy nhiên, k Rt quV ki<m tra lMi B01 ng chuXn thông qua

Bánh giá giá tr N bias (%) cho th\y tMi Bi<m nKng BW 2ppb có các giá tr N này l4 n h2 n ±20% nên không BMt yêu cJu. Vì v?y B01 ng chuXn c_a Norfloxacin B0C c l? p trong

khoVng nKng BW là 5ppb BRn 500ppb thì ph02 ng trình hKi qui tuyRn tính có giá tr N

R2 > 0,995 và các giá tr N bias < 15% BMt yêu cJu B< phân tích.

y = 0.0079x + 0.0406

R2

= 0.9999

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 100 200 300 400 500 600

y = 0.0022x + 0.0116

R2 = 0.9999

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 100 200 300 400 500 600

Hình 3.4: I7 th= 6,K ng chuE n c)a Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (ph#i)





37

Hình 3.5: s0 c ký 67 khi xây d C ng 6,K ng chuE n c)a norfloxacin

B#ng 3.15: K < t qu# phân tích dãy chuE n Ciprofloxacin

C (ppb) Std/IS Bias (%) C (ppb) Std/IS Bias (%)500 1,106 0,14 500 1,101 -0,28200 0,452 0,77 200 0,446 -0,57100 0,230 -0,03 100 0,240 4,3050 0,1156 -4,96 50 0,1187 -2,1025 0,0674 1,76 25 0,0685 3,7610 0,0321 -6,83 10 0,0328 -3,645 0,0201 -6,13 5 0,0217 -9,132 0,025 218 2 0,009 -151

Nh?n xét: TI các k Rt quV a bVng trên cho th\y: Ciprofloxacin có khoVng tuyRn


Bánh giá giá tr N bias (%) cho th\y tMi Bi<m nKng BW 2ppb có các giá tr N này l4 n h2 n ±

20% nên không BMt yêu cJu. Vì v?y B01 ng chuXn c_a Ciprofloxacin B0C c l? p trong

khoVng nKng BW là 5ppb BRn 500ppb thì ph02 ng trình hKi qui tuyRn tính có giá tr N R

2

> 0,995 và các giá tr N bias < 15% BMt yêu cJu B< phân tích.

B#ng 3.16: K < t qu# phân tích dãy chuE n Enrofloxacin

C (ppb) Std/IS Bias (%) C (ppb) Std/IS Bias (%)500 5,336 0,02 500 5,327 -0,16200 2,172 0,42 200 2,197 1,59100 1,080 -2,43 100 1,091 -1,4350 0,585 1,54 50 0,562 -2,9125 0,312 -0,55 25 0,324 4,31

10 0,157 2,04 10 0,153 -1,53





38

5 0,102 0,68 5 0,105 6,642 0,063 -32,3 2 0,064 -29,3

Nh?n xét: TI các k Rt quV a bVng trên cho th\y: Enrofloxacin có khoVng tuyRn


Bánh giá giá tr N bias (%) cho th\y tMi Bi<m nKng BW 2ppb có các giá tr N này l4 n h2 n ±

20% nên không BMt yêu cJu. Vì v?y B01 ng chuXn c_a Enrofloxacin B0C c l? p trong

khoVng nKng BW là 5ppb BRn 500ppb thì ph02 ng trình hKi qui tuyRn tính có giá tr N R 2

> 0,995 và các giá tr N bias < 15% BMt yêu cJu B< phân tích.

y = 0.0106x + 0.0487

R2 = 0.9999

0

1

2

3

4

5

6

0 100 200 300 400 500 600

y = 0.0472x + 0.2867

R2 = 0.9999

0

5

10

15

20

25

30

0 100 200 300 400 500 600

Hình 3.6: I7 th= 6,K ng chuE n c)a Enrofloxacin (trái) và Flumequin (ph#i)

B#ng 3.17: K < t qu# phân tích dãy chuE n Flumequin

C (ppb) Std/IS Bias (%) C (ppb) Std/IS Bias (%)500 23,77 -0,50 500 24,02 0,56200 9,676 -0,53 200 9,799 0,76100 5,027 0,44 100 4,800 -4,3850 2,700 2,26 50 2,700 2,2725 1,479 1,01 25 1,491 2,0610 0,775 3,38 10 0,755 -0,775 0,521 -0,82 5 0,540 7,312 0,371 -11,8 2 0,370 -11,5

1 0,232 -215 1 0,158 -238

Nh?n xét: TI các k Rt quV a bVng trên cho th\y: Flumequin có khoVng tuyRn tính

tI 1ppb BRn 500ppb. Tuy nhiên, k Rt quV ki<m tra lMi B01 ng chuXn thông qua Bánh

giá giá tr N bias (%) cho th\y tMi Bi<m nKng BW 1ppb có các giá tr N này l4 n h2 n ± 20%

nên không BMt yêu cJu. Vì v?y B01 ng chuXn c_a Flumequin B0C c l? p trong khoVng

nKng BW là 2ppb BRn 500ppb thì ph02 ng trình hKi qui tuyRn tính có giá tr N R 2 >

0,995 và các giá tr N bias < 15% BMt yêu cJu B< phân tích.





39

3.3.4. Giw i hvn phát hiLn (LOD) và giw i hvn XMnh lBI ng (LOQ)

TI nh[ng k Rt quV thu B0C c khi xây dDng B01 ng chuXn th< hiLn mUi t02 ng quan

tuyRn tính gi[a nKng BW ch\t phân tích và ti lL diLn tích pic chuXn t02 ng `ng/diLn

tích pic nWi chuXn chúng tôi nh?n th\y:- %i<m nKng BW th\ p nh\t trong B01 ng chuXn c_a Norfloxacin, Ciprofloxacin ,

Enrofloxacin là 5ppb và c_a Flumequin là 2ppb. Vì v?y, chúng tôi xác BNnh Bây

chính là gi4 i hMn BNnh l0C ng c_a ph02 ng pháp phân tích các ch\t này.

- Trong khi Bó LOQ = 3,3 x LOD nên LOD = LOQ/3,3. Nh0 v?y, gi4 i hMn phát

hiLn c_a ph02 ng pháp là khoVng 1,5ppb BUi v4 i Norfloxacin, Ciprofloxacin ,

Enrofloxacin và khoVng 0,6ppb BUi v4 i Flumequin.- K Rt quV phân tích thZ nghiLm m6u tr Tng thêm chuXn a nKng BW th\ p cho th\y

khi thêm chuXn Norfloxacin, Ciprofloxacin , Enrofloxacin 1,5ppb và Flumequin 0,5

ppb cvng có th< xác BNnh B0C c pic c_a các ch\t phân tích.

Gi4 i hMn phát hiLn và gi4 i hMn BNnh l0C ng tính trên nGn m6u thNt sj là:

B#ng 3.18: LOD và LOQ c)a các ch% t phân tích tính trên nD n mG u th=t

Norfloxacin Ciprofloxacin Enrofloxacin FlumequineLOD (µg/kg) 3,0 3,0 3,0 1,2LOQ (µg/kg) 10 10 10 4,0

Nh?n xét: Gi4 i hMn phát hiLn và gi4 i hMn BNnh l0C ng c_a ph02 ng pháp th\ p h2 n

r \t nhiGu so v4 i m`c gi4 i hMn tKn d0 tUi Ba cho phép (MRL) c_a các ch\t phân tích

trong thDc phXm. Vì v?y ph02 ng pháp BMt yêu cJu vG BW nhMy B< phân tích BKng

th1 i d0 l0C ng c_a Norfloxacin, Ciprofloxacin , Enrofloxacin và Flumequin trong

thDc phXm.3.3.5. $J lUp lvi và XJ thu hdi cha phBD ng pháp

a. Quy trình làm svch qua cJt SPE HLB

TiRn hành thêm chuXn Norfloxacin 50ppb, Ciprofloxacin 50ppb, enrofloxacin

100ppb, Flumequin 100ppb vào m6u tr Tng và xZ lí m6u theo quy trình sZ d]ng cWt

SPE HLB Bã lDa ch:n a trên. Phân tích lH p lMi 10 lJn thu B0C c k Rt quV sau:





40

B#ng 3.19: IF l M p l .i và 6F thu h7i trên cFt SPE HLB c)a Norfloxacin

Test C thu B0C c (ng/ml) C lí thuyRt (ng/ml) R (%) %W lH p lMi1 35,3 50,0 70,62 39,5 50,0 79,0

3 40,8 50,0 81,64 35,9 50,0 71,85 40,1 50,0 80,26 38,9 50,0 77,87 35,7 50,0 71,48 36,7 50,0 73,49 37,8 50,0 75,6

10 36,2 50,0 72,4

TB = 75,4%RSD = 5,33%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Norfloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE HLB trong

khoVng tI 70,6% BRn 80,2% (trung bình là 75,4%). %W lH p lMi c_a ph02 ng pháp nàykhi phân tích Norfloxacin có giá tr N RSD là 5,33%.

Hình 3.7: s0 c ký 67 c)a norfloxacin khi xB lí mG u qua cFt SPE HLB

B#ng 3.20: IF l M p l .i và 6F thu h7i trên cFt SPE HLB c)a Ciprofloxacin

Test C thu B0C c (ng/ml) C lí thuyRt (ng/ml) R (%) %W lH p lMi1 37,3 50,0 74,6

2 39,6 50,0 79,23 36,3 50,0 72,64 38,1 50,0 76,25 42,3 50,0 84,66 41,1 50,0 82,27 36,1 50,0 72,28 39,4 50,0 78,89 38,5 50,0 77,0

10 35,5 50,0 71,0

TB = 76,8%RSD = 5,78%





41

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Ciprofloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE HLB trongkhoVng tI 72,2% BRn 84,6% (trung bình là 76,8%). %W lH p lMi c_a ph02 ng pháp nàykhi phân tích Ciprofloxacin có giá tr N RSD là 5,78%.

B#ng 3.21: IF l M p l .i và 6F thu h7i trên cFt SPE HLB c)a Enrofloxacin

Test C thu B0C c (ng/ml) C lí thuyRt (ng/ml) R (%) %W lH p lMi1 88,6 100,0 88,62 97,8 100,0 97,83 98,7 100,0 98,74 93,2 100,0 93,25 89,1 100,0 89,16 99,2 100,0 99,27 91,2 100,0 91,28 88,5 100,0 88,59 89,5 100,0 89,5

10 99,4 100, 99,4

TB = 93,5%RSD = 5,07%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Enrofloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE HLB trongkhoVng tI 88,5% BRn 99,4% (trung bình là 93,5%). %W lH p lMi c_a ph02 ng pháp nàykhi phân tích Enrofloxacin có giá tr N RSD là 5,07%.

B#ng 3.22: IF l M p l .i và 6F thu h7i trên cFt SPE HLB c)a Flumequin

Test C thu B0C c (ng/ml) C lí thuyRt (ng/ml) R (%) %W lH p lMi1 96,1 100,0 96,12 95,6 100,0 95,63 98,3 100,0 98,34 99,5 100,0 99,55 97,1 100,0 97,16 96,6 100,0 96,67 90,4 100,0 90,48 90,9 100,0 90,99 96,1 100,0 96,1

10 93.6 100.0 93.6

TB = 95,4%RSD = 3,11%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Flumequin khi xZ lí m6u qua cWt SPE HLB trong

khoVng tI 90,4% BRn 99,5% (trung bình là 95,4%). %W lH p lMi c_a ph02 ng pháp nàykhi phân tích Flumequin có giá tr N RSD là 3,11%.

b. Quy trình làm svch qua cJt SPE C18-E

TiRn hành thêm chuXn Norfloxacin 50ppb, Ciprofloxacin 50ppb, Enrofloxacin

50ppb, Flumequin 100ppb vào m6u tr Tng và xZ lí m6u theo quy trình sZ d]ng cWt

SPE C18-E Bã lDa ch:n a trên. Phân tích lH p lMi 07 lJn thu B0C c k Rt quV sau:





42

B#ng 3.23: IF l M p l .i và 6F thu h7i (R%) trên cFt SPE C18 c)a Norfloxacin


3 38,6 50,0 77,24 39,5 50,0 79,05 34,9 50,0 69,86 37,1 50,0 74,27 39,2 50,0 78,4

TB = 74,5%RSD = 5,04%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Norfloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE C18-E trong

khoVng tI 69,8% BRn 79,0% (trung bình là 74,5%). %W lH p lMi c_a ph02 ng pháp này

khi phân tích Norfloxacin có giá tr N RSD là 5,04%.

B#ng 3.24: IF l M p l .i và 6F thu h7i (R%) trên cFt SPE C18-E c)a Ciprofloxacin

Test Cthu B0C c (ng/ml) Clí thuyRt (ng/ml) R (%) %W lH p lMi

1 36,7 50,0 73,42 37,8 50,0 75,63 40,1 50,0 80,24 39,9 50,0 79,85 38,5 50,0 77,06 39,6 50,0 79,2

7 40,8 50,0 81,6

TB = 78,1%RSD = 3,71%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Ciprofloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE C18-E trong


khi phân tích Ciprofloxacin có giá tr N RSD là 3,71%.





43

B#ng 3.25: IF l M p l .i và 6F thu h7i (R%) trên cFt SPE C18-E c)a Enrofloxacin


3 39,5 50,0 79,04 41,9 50,0 83,85 35,9 50,0 71,86 39,9 50,0 79,87 40,6 50,0 81,2

TB = 77,0%RSD = 6,72%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Enrofloxacin khi xZ lí m6u qua cWt SPE C18-E trong


khi phân tích Enrofloxacin có giá tr N RSD là 6,72%.

B#ng 3.26: IF l M p l .i và 6F thu h7i (R%) trên cFt SPE C18-E c)a Flumequin

Test C thu B0C c (ng/ml) C lí thuyRt (ng/ml) R (%) %W lH p lMi

1 80,6 100,0 80,62 82,4 100,0 82,43 90,1 100,0 90,14 79,7 100,0 79,75 75,9 100,0 75,96 77,7 100,0 77,77 76,9 100,0 76,9

TB = 80,5%

RSD = 5,97%

Nh?n xét: %W thu hKi c_a Flumequin khi xZ lí m6u qua cWt SPE C18-E trong


khi phân tích Flumequin có giá tr N RSD là 5,97%.

c. Bàn lupn vY XJ thu hdi và XJ lUp lvi cha phBD ng pháp

Theo quy BNnh c_a FDA [40] và AOAC [12] thì khi phân tích d0 l0C ng thuUc thú y

trong thDc phXm các ph02 ng pháp phVi có BW thu hKi tMi khoVng nKng BW tI 10µg/kg BRn

100µg/kg BMt trong khoVng tI 70% BRn 110% và BW lH p lMi phVi có RSD < 15%.

TI các k Rt quV trên cho th\y ph02 ng pháp phân tích d0 l0C ng c_a Norfloxacin,Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Flumequin trong thNt B0C c thXm BNnh BMt yêu cJu c_a

FDA, AOAC vG BW thu hKi và BW lH p lMi.

Trong quá trình xZ lí m6u, chúng tôi sZ d]ng cV 02 loMi cWt SPE HLB và SPE

C18E B< làm sMch và làm giàu m6u. K Rt quV cho th\y nRu khi phân tích

Norfloxacin, Ciprofloxacin thì 02 loMi cWt SPE này cho hiLu su\t thu hKi gJn t02 ng

B02 ng nhau và sZ d]ng cWt SPE C18-E cho BW bn BNnh (BW lH p lMi) nhinh h2 n mWt

chút. Tuy nhiên B< phân tích Enrofloxacin và Flumequin thì sZ d]ng cWt SPE HLB

cho hiLu quV và BW bn BNnh cao h2 n hwn so v4 i cWt SPE C18-E.





44

3.4. Phân tích trên mau the c nghiLm

Các m6u thDc phXm B0C c l\y ng6u nhiên tMi các chC trên BNa bàn Hà NWi. Các m6u

nghiên cù B0C c tiRn hành xZ lí m6u theo quy trình Bã lDa ch:n B0C c a trên và phân

tích trên hL thUng LC-MS/MS. K Rt quV thu B0C c nh0 sau:

B#ng 3.27 : K < t qu# phân tích 20 mG u th=t gà ( 6( n v= là µg/kg)

Mau PT TG01 TG02 TG03 TG04 TG05 TG06 TG07 TG08 TG09 TG10

Norfloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Ciprofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Enrofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Flumequin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Mau PT TG11 TG12 TG13 TG14 TG15 TG16 TG17 TG18 TG19 TG20

Norfloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Ciprofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Enrofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Flumequin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

B#ng 3.28: K < t qu# phân tích 20 mG u th=t l 5 n ( 6( n v= là µg/kg)

Mau PT TL01 TL02 TL03 TL04 TL05 TL06 TL07 TL08 TL09 TL10

Norfloxacin (-) (-) (-) (-) (-) 39,6 (-) 164 (-) 19,8Ciprofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) 40,7 (-) 125 (-) (-)Enrofloxacin 49,1 (-) 75,0 (-) (-) 441 (-) 923 (-) (-)Flumequin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Mau PT TL11 TL12 TL13 TL14 TL15 TL16 TL17 TL18 TL19 TL20

Norfloxacin (-) (-) 58,7 (-) 201 (-) 23,5 (-) (-) 71,1Ciprofloxacin (-) (-) (-) (-) 193 (-) (-) (-) (-) 62,2Enrofloxacin (-) (-) 204 (-) 141 (-) 94,6 (-) (-) 286Flumequin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

BVng 3.29: K Rt quV phân tích 20 m6u cá n04 c ng:t (B2 n vN là µg/kg)

Mau PT C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 C08 C09 C10

Norfloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Ciprofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Enrofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Flumequin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Mau PT C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20

Norfloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Ciprofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Enrofloxacin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)Flumequin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

(-) Không phát hiLn hoHc d04 i ng0E ng phát hiLn c_a ph02 ng pháp





45

Hình 3.8: S 0 c ký 67 c)a mG u thC c t < không có norfloxacin

Nh0 v?y: Sau khi phân tích 20 m6u thNt gà, 20 m6u thNt l2 n, 20 m6u cá chúng tôi

thu B0C c k Rt quV sau: Trong m6u thNt gà và cá Bem phân tích không m6u nào có d0

l0C ng 4 loMi quinolon trên; mWt sU m6u c_a thNt lC n có chà 3 loMi quinolon là

ciprofloxacin, norfloxacin và enrofloxacin, không có m6u nào chà flumequin.

So sánh v4 i k Rt quV thu B0C c v4 i sU liLu bVng 1.1 (Gi4 i hMn tKn d0 tUi Ba c_a các

quinolon theo quyRt BNnh sU 2377/90/EC c_a ey ban Châu Âu [22] chúng tôi th\y

r ong: mWt sU m6u thNt l2 n có tKn d0 norfloxacin và enrofloxacin, mWt sU m6u tKn d0

cV 3 loMi quinolon. Vì norfloxacin a n04 c ta ch0a có quy BNnh vG gi4 i hMn tUi Ba cho phép trong thNt nên chúng tôi chi B0a ra k Rt lu?n là m6u thNt lC n Bó có chà

norfloxacin, còn trong th_y sXn thì theo quyRt BNnh c_a BW th_y sVn Fluoroquinolon

v6n bN c\m sZ d]ng trong sVn xu\t, kinh doanh th_y sVn xu\t khXu vào thN tr 01 ng

Mm và BTc Mm. Vì enrofloxacin là sVn phXm chuy<n hóa c_a ciprofloxacin nên

trong quy BNnh sj tính tKn d0 enrofloxacin là tbng c_a enrofloxacin + ciprofloxacin.

Gi4 i hMn tKn d0 tUi Ba trong thNt c_a enrofloxacin + ciprofloxacin là 100 µg/kg nên

chúng tôi có th< k Rt lu?n m6u TL1, TL3, TL17 BGu có d0 l0C ng ciprofloxacin và

enrofloxacin nh0ng trong gi4 i hMn cho phép; m6u TL6,TL8,TL13,TL20, TL15 có

chà enrofloxacin và ciprofloxacin v0C t m`c gi4 i hMn cho phép.





46

ChBD ng 4. BÀN LU:N

4.1. Xây de ng quy trình k n thupt

4.1.1. Các XiYu kiLn phân tích trên hL thgng LC-MS/MS

Trong quá trình nghiên cù xây dDng quy trình xác BNnh d0 l0C ng 4 loMi

quinolon (ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, flumequin trong thDc phXm),

thông qua các k Rt quV thZ nghiLm, k Rt hC p v4 i tham khVo mWt sU tài liLu [18], [35],

[39], chúng tôi Bã lDa ch:n B0C c các thông sU chMy máy quan tr :ng nh0 sau: th<

tích tiêm m6u 20µl, cWt sTc ký Symmetry và tiGn cWt t02 ng `ng , cWt XBridge và

tiGn cWt t02 ng `ng; nhiLt BW buKng cWt 350C ; tUc BW dòng 0,5 ml/phút cho cWt

XBridge và 1,0 ml/phút cho cWt Symmetry; gradient pha BWng BiGu chinh phù hC p

v4 i tIng loMi cWt. CWt Symmetry có 0u Bi<m là hiLn nay B0C c dùng ch_ yRu trong

các phòng thí nghiLm, giá thành r f h2 n cWt Xbridge nên tiLn tri<n khai sZ d]ng

trong các phòng thí nghiLm a ViLt Nam; cWt Xbridge có 0u Bi<m là tiRt kiLm dung

môi và th1 i gian, cho hiLu quV tách tUt h2 n nh0ng nh0C c Bi<m là BTt tiGn, phVi có hL

thUng UPLC Bi kèm do Bó chúng tôi phát tri<n song song cV 2 loMi cWt này, tùy theo

BiGu kiLn phòng thí nghiLm mà áp d]ng loMi cWt nào.Xác BNnh B0C c các thông sU chung c_a detector MS cho 4 ch\t, xác BNnh B0C c

các thông sU tUi 0u cho tIng ch\t phân tích; detector MS cho tín hiLu tUt và có BW

bn BNnh cao, có BW ch:n l:c, BW BHc hiLu tin c?y B< xác BNnh d0 l0C ng 4 ch\t nhóm

Quinolon. Nh[ng k Rt quV B0C c lDa ch:n trên cvng giUng v4 i mWt sU nghiên cù:

[13], [14], …[19]. %i<m khác biLt a Bây là chúng tôi Bã sZ d]ng sTc ký lPng ghép 2

lJn khUi phb, chúng khTc ph]c B0C c nh0C c Bi<m c_a ghép 1 lJn khUi phb (không

nghiên cù B0C c c2 chR phân mVnh, xác BNnh thêm chi tiRt c\u trúc hoá h:c, do k m

thu?t ion hoá nhs nên khUi phb BK chi cho th\y ion phân tZ…) BKng th1 i t@ng thêm

BW nhMy, BW chính xác. Theo chi thN c_a cWng BKng Châu Âu 2002/657/EC [22], B<

BNnh danh hay khwng BNnh các ch\t bN c\m, các ch\t BWc trong các m6u phân tích,

ph02 ng pháp ki<m nghi<m phVi BMt B0C c ít nh\t là 4 Bi<m nh?n danh (identification

point kí hiLu là IP) và chi B0C c quyGn k Rt hC p tUi Ba ba k m thu?t. %iGu này có ngh g a

là bTt buWc phVi dùng ph02 ng pháp khUi phb B< phân tích khwng BNnh các ch\t bN





47

c\m, các hóa ch\t bVo vL thDc v?t và tKn d0 kháng sinh, hormon trong thDc phXm.

HiLn nay, các phòng thí nghiLm thR gi4 i Bang t? p trung nghiên cù phát tri<n hai k m

thu?t chính B< phân tích các ch\t này là LC-MS/MS và GC-MS/MS [20] do Bó

ph02 ng pháp nghiên cù c_a chúng tôi phù hC p v4 i yêu cJu và xu h04 ng vG k m thu?t c_a thR gi4 i.

4.1.2. $iYu kiLn xl lý mau

XZ lý m6u trong phân tích thDc phXm là khâu hRt s`c quan tr :ng, mWt trong

nh[ng yRu tU Vnh h0a ng BRn BW chính xác c_a k Rt quV phân tích. Tun tIng BUi

t0C ng m6u, tun tIng chi tiêu phân tích mà phVi có cách xZ lý khác nhau, bVo quVn

m6u sau xZ lý khác nhau. Khi tiRn hành phân tích d0 l0C ng mWt sU ch\t nhómQuinolon trong thDc phXm cJn phVi tiRn hành xZ lý m6u qua 02 giai BoMn chính là

chiRt tách các ch\t cJn phân tích ra khPi nGn m6u và tiRn hành làm sMch, loMi tM p k Rt

hC p làm giàu m6u. Hàm l0C ng các ch\t cJn phân tích r \t nhP (chi khoVng vài ch]c

ppb) nên 02 giai BoMn trên là cJn thiRt. NhiGu k m thu?t xZ lý m6u có th< B0C c sZ

d]ng B< phân tích tKn d0 kháng sinh trong các nGn m6u khác nhau. Hai k m thu?t phb

biRn B0C c sZ d]ng trên thR gi4 i và ViLt Nam là k m thu?t chiRt lPng-lPng và k m thu?t

chiRt pha r Tn. Các nGn m6u trong nghiên cù là các thDc phXm (ch_ yRu là thNt và

nWi tMng BWng v?t) Bây là nGn m6u khá ph`c tM p nên th01 ng phVi sZ dung phUi hC p

nhiGu k m thu?t xZ lý m6u B< BMt hiLu quV cao. Dung môi B0C c sZ d]ng ch_ yRu là

acetonitril [13], [14]...[22] hoHc hun hC p acetonitril: acid phosphoric 0,3%, hun hC p

acetonitril : acid formic [13]. MWt sU nghiên cù cvng sZ d]ng hun hC p acid

acetic/ethanol hoHc acid formic/ethyl acetate B< chiRt m6u cho k Rt quV tUt.. Qua

nghiên cù và thZ nghiLm chúng tôi nh?n th\y chiRt m6u bong dung môi

acetonitril/TCA 4% trong n04 c c\t (70/30) k Rt hC p v4 i qua cWt chiRt pha r Tn SPE

C18-E và SPE HLB sj cho hiLu quV xZ lý m6u tôt, BMt yêu cJu .

4.2. Th`m XMnh quy trình Xã xây de ng

Trong nghiên cù này, chúng tôi sZ d]ng hL thUng LC-MS/MS hiLn BMi B0C c

trang bN phJn mGm tính toán BW tinh khiRt pic sTc ký. K Rt hC p v4 i các thông sU chMy





48

máy Bã lDa ch:n a trên giúp phân biêt sTc ký BK c_a 4 loMi quinolon. Ph02 ng pháp

xác BNnh BKng th1 i 4 loMi quinolon trong thDc phXm BMt yêu cJu vG BW ch:n l:c.

Ph02 ng pháp c_a chúng tôi có khoVng tuyRn tính c_a ciprofloxacin,

enrofloxacin, norfloxacin là 5ppb-500ppb; flumequin là tI 2ppb BRn 500ppb. So

sánh k Rt quV trên v4 i nghiên cù c_a tác giV Jonas Augusto Rizzto Paschoal và

cWng sD [29] cho th\y nghiên cù c_a chúng tôi có khoVng tuyRn tính c_a

ciprofloxacin và enrofloxacin r Wng h2 n (ciprofloxacin tuyRn tính trong khoVng

17ppb-300ppb, enrofloxacin tuyRn tính trong khVng 21ppb-300ppb); so v4 i nghiên

cù c_a A. Pena và công sD [13] (có c_a ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là

6,25 ppb BRn 125ppb) thì nghiên c_a chúng tôi có khoVng tuyRn tính c_a 3 loMiquinolon này r Wng h2 n r \t nhiGu.

Gi4 i hMn xác BNnh và gi4 i hMn BNnh l0C ng trong nghiên cù này B0C c xác BNnh

c_a ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 3ppb và 10ppb và flumequin là 1,2

ppb và 4 ppb. So sánh v4 i ph02 ng pháp khác, ph02 ng pháp này có k Rt quV th\ p h2 n

so v4 i k Rt quV nghiên cù c_a Jonas Augusto Rizzato Paschoal và cWng sD [29]

(ciprofloxacin 4ppb và 17 ppb, enrofloxacin 6ppb và 21ppb, flumequin 5ppb và

18ppb); và có k Rt quV t02 ng B02 ng so v4 i k Rt quV nghiên cù c_a Cun Li và cWng

sD [19] (ciprofloxacin 3ppb và 10 ppb, enrofloxacin 3ppb và 10ppb) . Trong nghiên

cù c_a Verdon và cWng sD [41] sZ d]ng detector hunnh quang có LOD khoVng 4-

11 mcg/kg và LOQ khoVng 13-36 mcg/kg. Nh0 v?y sTc ký lPng ghép nUi v4 i

detector khUi phb có BW nhMy và tính BHc hiLu r \t cao, Báp `ng B0C c yêu cJu ngày

càng khTt khe c_a thR gi4 i vG phân tích d0 l0C ng.

TI các k Rt quV thDc nghiLm thu B0C c a trên cho chúng ta th\y: khi xZ lí m6u

qua cWt SPE HLB :Norfloxacin có giá tr N RSD là 5,33%, Ciprofloxacin có giá tr N

RSD là 5,78%, Enrofloxacin có giá tr N RSD là 5,07%, Flumequin có giá tr N RSD là

3,11%. Khi xZ lí m6u qua cWt SPE C18-E : Norfloxacin có giá tr N RSD là 5,04%,

Ciprofloxacin có giá tr N RSD là 3,71%, Enrofloxacin có giá tr N RSD là 6,72%,

Flumequin có giá tr N RSD là 5,97%. K Rt quV này có th< so sánh B0C c v4 i BW lH p lMi

thu B0C c trong nghiên cù c_a tác giV O. Ballesteros và cWng sD [37] giá tr N RSD





49

khoVng 4,9 %-7,5%; BW lH p lMi thu B0C c trong nghiên cù c_a tác giV E. Rodriguez

và cWng sD [21] Ciprofloxacin có giá tr N RSD là 7%, Enrofloxacin có giá tr N RSD là

5% và BW lH p lMi thu B0C c trong nghiên cù c_a tác giV A. Pena và cWng sD [13] là

:Norfloxacin có giá tr N RSD là 7%, Ciprofloxacin có giá tr N RSD là 6,5%,Enrofloxacin có giá tr N RSD là 8,7% . Nh0 v?y ph02 ng pháp c_a chúng tôi có BW lH p

lMi tUt h2 n. Ngoài ra k Rt quV c_a nghiên cù cvng BMt theo yêu cJu c_a AOAC [12]

Nghiên cù c_a chúng tôi còn cho th\y: BW thu hKi trung bình khi xZ lí m6u qua cWt

SPE HLB c_a Norfloxacin là 75,4%, Ciprofloxacin là 76,8%, Enrofloxacin là

93,5%, Fumequin là 95,4%; BW thu hKi trung bình khi xZ lí m6u qua cWt SPE C18-E

c_a Norfloxacin là 74,5%, Ciprofloxacin là 78,1%, Enrofloxacin là 77,0%,Flumequin là 80,5%). K Rt quV trên c_a ph02 ng pháp gJn t02 ng B02 ng v4 i k Rt quV

nghiên cù c_a tác giV Cun li và công sD [19] vG BW thu hKi c_a enrofloxacin 95%

và c_a tác giV A.pena và công sD [13] (có BW thu hKi trung bình c_a norfloxacin là

76%, ciprofloxacin là 75,8%. K Rt quV c_a nghiên cù BMt theo yêu cJu c_a AOAC

[12]





50

K .T LU:N

Sau khi hoàn thành nghiên cù này, trên c2 sa các k Rt quV phân tích thDc

nghiLm B< xác BNnh d0 l0C ng 4 loMi quinolon (ciprofloxacin, enrofloxacin,

norfloxacin, flumequin) trong thDc phXm bong k m thu?t LC-MS/MS, chúng tôi thuB0C c các k Rt quV sau:

* Xây dDng B0C c ph02 ng pháp BNnh l0C ng BKng th1 i 4 loMi quinolon trong thDc

phXm t02 ng `ng v4 i 2 giai BoMn:

- XZ lý m6u: M6u B0C c chiRt bong hun hC p acetonitril/TCA 4% trong n04 c c\t

(70/30) ) k Rt hC p v4 i qua cWt chiRt pha r Tn SPE C18-E và SPE HLB sj cho hiLu

quV xZ lý m6u tôt, BMt yêu cJu.

- Phân tích bong LC-MS/MS:

Thông sU c_a detector khUi phb

+ ChR BW ESI (+) cho c01 ng BW tín hiLu c_a các ch\t là tUt nh\t.

+ Các thông sU chung:

Khí màn (Curtain gas) 15Khí va chMm (Collision gas ) 7ThR phun BiLn tZ (Ionspray voltage ) 5000

NhiLt BW mao quVn (TEM) 4500CKhí nguKn ion 1 (Ion source gas 1) 20Khí nguKn ion 1 (Ion source gas 2) 20ThR BJu vào (Entrance potential) 10

+ Các thông sU chi tiRt cho tIng ch\t

Ion con 1 Ion con 2Ch\t phân tích

(M+H)+m/z

DP(volt) m/z CE CXP m/z CE

CXP

Ciprofloxacin 332 91 314 27 34 288 23 22 Norfloxacin 320 96 276 23 26 302 25 14Enrofloxacin 360 41 316 25 18 342 27 20Flumequin 262 106 202 43 26 244 25 28

Thông sU c_a phJn LC

+ SZ d]ng cWt C18

CWt Symmetry (250mm x 4,6mm; 5,0 µm) và tiGn cWt t02 ng `ng (Waters).





51

CWt XBridge (150mm x 2,1mm; 3,5 µm) và tiGn cWt t02 ng `ng (Waters).

+ Dung môi h[u c2 : Acetonitril và H2O thay Bbi theo gradient.

+ Dung dNch acid h[u c2 : n04 c c\t có chà 0,1% acid formic (FA)

+ Th< tích tiêm m6u 20µl, nhiLt BW buKng cWt 350

C+ TUc BW dòng 0,5 ml/phút cho cWt XBridge và 1,0 ml/phút cho cWt Symmetry.

* Ph02 ng pháp Bã xây dDng B0C c thXm BNnh cho th\y có tính ch:n l:c, có BW bn

BNnh cao, có BW lH p lMi và thu hKi tUt, có th< áp d]ng vào thDc tR.

- KhoVng tuyRn tính r Wng:

+ Ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 5ppb BRn 500ppb

+ Flumequin là tI 2ppb BRn 500ppb- Gi4 i hMn phát hiLn :

+ Ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 3ppb

+ Flumequin là 1,2 ppb

- Gi4 i hMn BNnh l0C ng :

+ Ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 10ppb

+ Flumequin là 4 ppb

- %W thu hKi và BW lH p lMi c_a ph02 ng pháp Báp `ng theo yêu cJu c_a AOAC

* Áp d]ng quy trình phân tích Bã xây dDng a trên, chúng tôi Bã phân tích 60 m6u

thDc phXm tMi các chC khác nhau trên BNa bàn Hà nWi B< xác BNnh d0 l0C ng

quinolon. K Rt quV thu B0C c là m6u thNt gà và cá không có chà d0 l0C ng 4 loMi

quinolon trên trên. MWt sU m6u thNt lC n có chà d0 l0C ng c_a 3 quinolon là

(ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin) trong Bó có m6u thì BMt gi4 i hMn cho phép vG

d0 l0C ng quinolon, có m6u v0C t quá gi4 i hMn cho phép vG d0 l0C ng quinolon.





52

KI.N NGH,

Trong khuôn khb lu?n v@n, v4 i th1 i gian và BiGu kiLn hMn hs p nên chúng

tôi m4 i chi nghiên cù trong phMm vi là xác BNnh d0 l0C ng 4 ch\t nhóm quinolon

(ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, flumequin) và `ng d]ng quy trình Bã xây dDng phân tích ng6u nhiên trên 60 m6u thNt và cá. Vì v?y mong muUn c_a chúng tôi là trong

th1 i gian sT p t4 i phVi ma r Wng nghiên cù ph02 ng pháp này thành ph02 ng pháp chung

có th< áp d]ng phân tích BKng th1 i các ch\t khác thuWc nhóm quinolon và các nhóm

kháng sinh khác n[a; BKng th1 i `ng d]ng quy trình Bã xây dDng phân tích trên nhiGu

loMi BUi t0C ng thDc phXm khác v4 i sU l0C ng m6u l4 n h2 n.





TÀI LIU THAM KH#OTi&ng vi*t

1. Võ ThN Trà An (2001): “Tình hình sB d Ang kháng sinh và d , l ,5 ng kháng sinh

trong th=t gà t .i các c( sN chn nuôi gà công nghi8 p c)a thành ph4 H 7 Chí Minh”,

lu?nv@n thMc sm, %H Nông Lâm TP HCM.

2. BW y tR (2009), “Hóa phân tích”, Nhà xu\t bVn Y h:c.

3. Lê ThN Ng:c DiL p (2001): “ M Ft s4 k < t qu# kh#o sát tình hình sB d Ang thu4 c kháng

sinh trong chn nuôi gà và t 7n d , kháng sinh trong th=t, tr + ng gà trên 6=a bàn Hà

N Fi”, tr 01 ng %Mi h:c Nông nghiL p Hà NWi.

4. PhMm Kim %@ng và công sD (2008): “p ng d]ng ph02 ng pháp ELISA B< phân tích

tKn d0 kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tMi mWt sU tinh ven bi<n khu vDc BTcBW”, T . p chí Khoa hOc và phát triP n, T? p VI, sU 3, tr 01 ng %H Nông nghiL p HN.

5. %Mi h:c d0C c Hà NWi (2004), Hóa d ,5 c t Q p 2, NXB Y h:c Hà NWi.

6. Nguytn ThN Thanh Nga (2011), “ Nghiên c+ u quy trình xác 6=nh d , l ,5 ng

ciprofloxacin và enprofloxacin trong thC c phE m bR ng ph,( ng pháp HPLC-MS/MS ”,

lu?n v@n thMc sm, %Mi h:c KHTN, Thành phU HK Chí Minh.

7. Thái Phan Qunnh Nh0 (2005): Ph02 ng pháp phân tích bong sTc ký lPng hiLu n@ng

cao, ViLn Ki<m nghiLm- BW Y tR.

8. Tr Jn Minh Phú và cWng sD (2008): “Xác BNnh th1 i gian tKn l0u Enrofloxacin trên

các tra”, t . p chí khoa hOc 215 -218, tr 01 ng %Mi h:c CJn Th2 .

9. BW Nông nghiL p (2009) Thông t , 03/2012/TT-BNNPTNT ngày 16/01/2011 sB a 61 i,

b1 sung Thông t , s4 15/2009/TT-BNN ngày 17/3/2009 c)a BF Nông nghi8 p và Phát

triP n nông thôn ban hành Danh mAc thu4 c, hoá ch% t, kháng sinh c% m sB d Ang, h.n ch<

sB d Ang10. BW thuc sVn (2005), Quy< t 6=nh s4 07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005

quy 6=nh danh mAc 17 lo.i kháng sinh c% m sB d Ang và danh mAc 34 lo.i h.n ch< sB

d Ang trong 6 ó có nhóm Quinolon

11. BW thuc sVn (2005), Quy< t 6=nh s4 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 b1

sung nhóm Quinolon vào danh mAc c% m sB d Ang trong s#n xu% t, kinh doanh th) y s#n

xu% t khE u vào th= tr ,K ng B0 c M S và Hoa K V.





Ti&ng anh

12. AOAC International (2007): Validation and Qualification in Analytical

Laboratories, Second Edition.13. A. Pena, L. J. G. Silva, A. Pereira & L. Meisel, C. M. Lino (2010), “Determination

of fluoroquinolone residues in poultry muscle in Portugal”, Analytical and

Bioanalytical Chemistry, 397, pp. 2615–2621.

14. Alexandra Junza, Rameshwari Amatya, Rafael Pérez-burgos, Gultekin Gokce,

Edyta Grzelak, Dolores Barrón, José Barbosa (2010), “Residues of |-lactams and

quinolones in tissues and milk samples. Confirmatory analysis by liquid

chromatography–mass spectrometry”, Ovidius University Annals of Chemistry, 21(2),

pp. 109-122.

15. B. Delepine, D. Hurtaud-Pessel, P. Sanders (1998), “Simultaneous determination

of six quinolones in pig muscle by liquid chromatography-atmospheric pressure

chemical ionisation mass spectrometry”, The Analyst , 123, pp. 2743-2747.

16. Chui-Shiang Chang, Wei-Hsien Wang, Chin-En Tsai (2008), “Simultaneous

determination of eleven quinolones antibacterial residues in marine products and

animal tissues by Liquid chromatography with Fluorescence detection”, Journal of

Food and Drug Analysis, 16(6), pp. 87-96.

17. Chui-Shiang Chang, Wei-Hsien Wang, Chin-En Tsai (2010), “Simultaneous

determination of 18 quinolone residues in marine and livestock products by liquid

chromatography/tandem mass spectrometry”, Journal of Food and Drug Analysis,

18(2), pp. 87-97.

18.

Chung-Wei Tsai, Chan-Shing Lin, Wei-Hsien Wang (2012), “Multi-residuedetermination of sulfonamide and quinolone residues in fish tissues by High

performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)”,

Journal of Food and Drug Analysis, 20(3), pp. 674-680.

19. Cun Li (2008), “Simultaneous determination of fluoroquinolones and

sulfonamides in chicken muscle by LC with fluorescence and uv detection”,

Chromatographia, 68, pp. 117-121.





20. D. Barrón, E. Jiménez-Lozano, S. Bailac, J. Barbosa (2003), “Simultaneous

determination of flumequine and oxolinic acid in chicken tissues by solid phase

extraction and capillary electrophoresis”, Analytica Chimica Acta, 477, pp. 21–27.

21.

E. Rodriguez, M.C. Moreno-Bondi, M.D. Marazuela (2008), “Development andvalidation of a solid-phase extraction method coupled to liquid chromatography with

fluorescence detection for the determination of fluoroquinolone residues in powdered

infant formulae Application to the analysis of samples from the Spanish and Latin

American market”, Journal of Chromatography A, 1209, pp. 136–144.

22. European Commission (2002) “Commission decision 2377/90/EC ”

23. European Commission (1996) “Council directive 96/23/EC ”

24.

Ghislain Follet, (1997), Antibiotic resistance in the EU Science, Politics and

Policy. Number 3&3. 2000, p.148-155

25. Fatima Tamtam, Fabien Mercier, Joëlle Eurin, Marc Chevreuil, Barbara Le Bot

(2009), “Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

performance evaluation for analysis of antibiotics in natural waters”, Analytical and

Bioanalytical Chemistry, 393, pp. 1709-1718.

26. Florentina Cañada-Cañada, Anunciacion Espinosa-Mans illa, Ana Jiménez Girón

and Arsenio Muñoz de la Peña (2012), “Simultaneous determination of the residues of

fourteen quinolones and fluoroquinolones in fish samples using Liquid

chromatography with Photometric and Fluorescence detection”, Czech J. Food Sci.,

30(1), pp. 74-82.

27. Francisco J. Lara (2006), “Multiresidue method for the determination of quinolone

antibiotics in bovine raw milk by capillary electrophoresis-tandem massspectrometry”,

Analytical Chemistry, 78(22), pp. 7665-7673.28. Habib Amjad, Javed Iqbal and Muhammad Naeem (2006), “Estimation of selected

residual antibiotics in muscle, kidney, liver, and egg of layer chicken”, Proc. Pakistan

Acad. Sci, 43(1), pp. 29-37.

29. Jonas Augusto Rizzato Paschoal, Felix Guillermo Reyes Reyes, Susanne Rath

(2009), “Quantitation and identity confirmation of residues of quinolones in tilapia





fillets by LC-ESI-MS-MS QToF”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 394, pp.

2213-2221.

30. J.C. Yorke, P. Froc (2000), “Quantitation of nine quinolones in chicken tissues by

high-performance liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal ofChromatography A, 882, pp. 63-77.

31. Marni S., Mustafa A.M., Marzura M.R. (2011), “Analysis of quinolones in poultry

muscles using liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Malaysian Journal

of Veterinary Research, 2(1), pp. 1-15.

32. Martin D. Rose, John Bygrave, George W. F. Stubbings (1998), “Extension of

multi-residue methodology to include thedetermination of quinolones in food”, The

Analyst , 123, pp. 2789–2796.

33. Muhammad Naeem, Khalida Khanand Samra Rafiq (2006), “Determination of

Residues of Quinolones in Poultry Products by High Pressure Liquid

Chromatography”, Journal of Applied Science, 6(2), pp. 373-379.

34. M.K. Hassouan, O. Ballesteros, J. Taoufiki, J.L. Vílchez, M. Cabrera-Aguilera, A.

Navalón (2007), “Multiresidue determination of quinolone antibacterials in eggs of

laying hens by liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of

Chromatography B, 852, pp. 625-630.

35. Nájla Mohamad Kassab, Anil Kumar Singh, Erika Rosa Maria Kedor-Hackmam,

Maria Inês Rocha Miritello Santoro (2005), “Quantitative determination of

ciprofloxacin and norfloxacin in pharmaceutical preparations by high performance

liquid chromatography”, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 41(4), pp.

507-513.

36.

N. Stoilova, M. Petkova (2010), “Developing and validation of method fordetection of quinolone residues in poultry meat”, Trakia Journal of Sciences, 8(1), pp.

64-69.

37. O. Ballesteros, V. Sanz-Nebot, A. Navalón, J. L. Vílchez, J. Barbosa (2004),

“Determination of a series of quinolone antibiotic using Liquid chromatography-

Mass-spectrometry”, Chromatographia,59, pp. 543-550.





38. Sherri B. Turnipseed, José E. Roybal, Allen P. Pfenning (2003), “Confirmation of

fluoroquinolone residues in salmon and shrimp tissue by LC/MS: Evaluation of single

quadrupole and ion trap instruments”, Food and drug administration, USA.

39.

Susan B. Clark, Joseph M. Storey, Sherri B. Turnipseed (2008), “Optimizationand Validation of Multi-class, Multi-residue LC-MS/MS Screening and

Confirmation Method for Drug Residues in Milk ”, Food and drug administration,

USA.

40. US Food and Drug Administration (May 2001), Bionalytical method validation,

Guidance for industry.

41. Verdon E, Couedor P, Roudaut B, Sanders P (2005) “Multiresidue method for

simultaneous determination of ten quinolone antibacterial residues in

multimatrix/multispecies animal tissues by liquid chromatography with

fluorescence detection: single laboratory validation study”. JAOAC Int, 88:1179-

1192.

42. Yang Xiao, Hong Chang, Ai Jia, Jianying Hu (2008), “Trace analysis of quinolone

and fluoroquinolone antibiotics from wastewaters by liquid chromatography–

electrospray tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1214, pp.100-108.





PHQ LQC

Cách pha dung dMch chu`n

- Dung dNch chuXn gUc: cân chính xác khoVng 10mg các ch\t chuXn cho vào

trong các bình BNnh m`c 100ml, hòa tan và BNnh m`c bong Acetonitril thu B0C ccác dung dNch chuXn gUc 100ppm. BVo quVn a -40C, tránh ánh sáng.

- Dung dNch chuXn trung gian: L\y chính xác 1ml các dung dNch chuXn gUc

cho vào bình BNnh m`c 100ml, BNnh m`c bong Acetonitril, lTc BGu thu B0C c

dung dNch chuXn trung gian hun hC p 1ppm (C01). V4 i nWi chuXn (IS)

Ciprofloxacin d8 pha dung dung nWi chuXn trung gian 1ppm riêng (C0IS). BVo

quVn a 4-80C.

- Dung dNch chuXn hun hC p 50ppb: L\y chính xác 1ml dung dNch chuXn

trung gian hun hC p 1ppm cho vào bình BNnh m`c 20ml, BNnh m`c bong

Acetonitril thu B0C c dung dNch chuXn hun hC p 50ppb (C02).

- Pha dãy chuXn làm viLc:

Cách pha dãy chuE n làm vi8c

ChuXn (ppb) C01 (ml) C02 (ml) C0IS (ml)Acetonitril

(ml)

500 5,0 0 1,0 4,0200 2,0 0 1,0 7,0

100 1,0 0 1,0 8,0

50 0,5 0 1,0 8,5

25 0 5,0 1,0 4,0

10 0 2,0 1,0 7,0

5 0 1,0 1,0 8,0

2 0 0,4 1,0 8,6

1 0 0,2 1,0 8,8

Các dung dNch làm viLc B0C c pha m4 i mui ngày.





Quy trình k n thupt xác XMnh dB lBI ng 4 chWt nhóm quinolon





X I C o f + M R M (

3 0 p a i r s ) : 2 6 2 . 0 0 0 / 2 4 4 . 0 0 0 D a

f r o m S a m p l e 4 4 ( S t d - M i x Q u i n o l o n - 2 0 0 p p b 0

1 ) o f D a t a . w i f f ( T u r b o S p r a y )

M a x . 1 . 7 e 6 c p s .

0 . 0

0 . 5

1 . 0

1 . 5

2 . 0

2 . 5

3 . 0

3 . 5

4 . 0

4 . 5

5 . 0

5 . 5

6 . 0

6 . 5

7 . 0

7 . 5

8 . 0

8 . 5

9 . 0

9 . 5

T i m e , m i n

0 . 0

1 . 0 e 5

2 . 0 e 5

3 . 0 e 5

4 . 0 e 5

5 . 0 e 5

6 . 0 e 5

7 . 0 e 5

8 . 0 e 5

9 . 0 e 5

1 . 0 e 6

1 . 1 e 6

1 . 2 e 6

1 . 3 e 6

1 . 4 e 6

1 . 5 e 6

1 . 6 e 6

1 . 7 e 6

1 . 8 e 6

1 . 9 e 6

I n t e n s i t y , c p s

6 . 6 1

5 . 4 6

A c q .

T i m e : 1 8 : 2 0

A c q .

D a t e : S u n d a y , M a y 2 5 , 2 0 1 4

S T c B K

p h â n t í c h c á c c h \ t

n h ó m Q

u i n o l o n t r ê n c W t X

B r i g d e





X I C

o f + M R M (

3 0 p a i r s ) : 2 6 2 . 0 0 0 / 2 4 4 . 0

0 0 D a

f r o m S a m p l e 2 7 ( S t d - M i x Q u i n o l o n - 2 0 0 p

p b 0 1 ) o f D a t a . w i f f ( T u r b o S p r a y )

M a x . 8 . 3 e 5 c p s .

0 . 0

0 . 5

1 . 0

1 . 5

2

. 0

2 . 5

3 . 0

3 . 5

4 . 0

4 . 5

5 . 0

5 . 5

6 . 0

6 . 5

7 . 0

7 . 5

8 . 0

8 . 5

9 . 0

9 . 5

1 0 . 0

1 0 . 5

1 1 . 0

1 1 . 5

T i m e , m i n

0 . 0 0

5 . 0 0 e 4

1 . 0 0 e 5

1 . 5 0 e 5

2 . 0 0 e 5

2 . 5 0 e 5

3 . 0 0 e 5

3 . 5 0 e 5

4 . 0 0 e 5

4 . 5 0 e 5

5 . 0 0 e 5

5 . 5 0 e 5

6 . 0 0 e 5

6 . 5 0 e 5

7 . 0 0 e 5

7 . 5 0 e 5

8 . 0 0 e 5

8 . 5 0 e 5

9 . 0 0 e 5

9 . 5 0 e 5

1 . 0 0 e 6

1 . 0 5 e 6


8 . 1 5

6 . 7 7

A c q . T i m e :

0 2 : 4 6

A c q . D a t e : M o n d a y ,

M a y

2 6 ,

2 0 1 4

S T c B K

p h â n t í c h c á c c h \ t n

h ó m Q

u i n o l o n t r ê n c W t X B r i g d

e





+ M S 2 ( 3 6 0 . 1 4 ) C E ( 4 7 ) : 2 6 M C A s c a n s f r o m

S a m p l e 1 ( T u n e S a m p l e N a m e ) o f E N R_ I n

i t P r o d u c t_ P o s . w i f f ( T u r b o S p r a y )

M a x . 6 . 3 e 6 c p s .

1 5 0

1 6 0

1 7 0

1 8 0

1 9 0

2 0 0

2 1 0

2 2 0

2 3 0

2

4 0

2 5 0

2 6 0

2 7 0

2 8 0

2 9

0

3 0 0

3 1 0

3 2 0

3 3 0

3 4 0

3 5 0

3 6 0

m / z , D a

0 . 0

5 . 0 e 5

1 . 0 e 6

1 . 5 e 6

2 . 0 e 6

2 . 5 e 6

3 . 0 e 6

3 . 5 e 6

4 . 0 e 6

4 . 5 e 6

5 . 0 e 6

5 . 5 e 6

6 . 0 e 6

6 . 3 e 6


3 6 0 . 2

3 1 6 . 2

2 4 5 . 2

3 4

2 . 2

2 0 3 . 2

1 8 9 . 0

3 1 4 . 2

2 1 7 . 2

2 3 1 . 0

1 6 2 . 2

1 7 6 . 0

2 0 2 . 2

A c q .

T i m e :

1 3 : 3 1

A c q .

D a t e :

S u n d a y ,

A u g u s t

0 5 ,

2 0 1 2

P h b

B K

E n r o f l o x a c i n ( I o n m s : 3 6 0 m / z ,

i o n c o n B N n h l 0 C n g : 3 1 6 m / z ,

i o n c o n 3 4 2





+ M S 2 ( 2 6 2 . 1 0 ) C E ( 4 7 ) : 2 6 M C A s c a

n s f r o m S a m p l e 1 ( T u n e S a m p l e N a m e ) o f F L U_

I n i t P r o d u c t_ P o s . w i f f ( T u r b o S p r a y )

M a x . 9 . 2 e 6 c p s .

7 0

8 0

9 0

1 0 0

1 1 0

1 2 0

1 3 0

1 4 0

1 5 0

1 6 0

1 7 0

1 8 0

1 9 0

2 0 0

2 1 0

2 2 0

2 3 0

2 4 0

2 5 0

2 6 0

m / z , D a

0 . 0

5 . 0 e 5

1 . 0 e 6

1 . 5 e 6

2 . 0 e 6

2 . 5 e 6

3 . 0 e 6

3 . 5 e 6

4 . 0 e 6

4 . 5 e 6

5 . 0 e 6

5 . 5 e 6

6 . 0 e 6

6 . 5 e 6

7 . 0 e 6

7 . 5 e 6

8 . 0 e 6

8 . 5 e 6

9 . 0 e 6

9 . 2 e 6


2 4 4

. 2

2 6 2 . 2

2 0 2 . 0

1 2 6 . 2

9 9 . 0

9 8 . 0

1 7 4 . 0

1 0 0 . 0

1 4 6 . 0

1 1 9 . 0

7 5 . 0

A c q . T i m e :

1 0 : 1 6

A c q . D a t e :

S u n d a y , A u g u s t

0 5 ,

2 0 1 2

P h b

B K

F l u m e q u

i n e ( I o n m s : 2 6 2 m / z ,

i o n c o n B N n h l 0 C n g : 2 0 2 m / z , i o n c o n 2 4 4 m / z )





+ M S 2 ( 3 2 0 . 1 5 ) C E ( 4 7 ) : 2 6 M C A s c a n s f r o m

S a m p l e 1 ( T u n e S a m p l e N a m e ) o f N O R_ I n

i t P r o d u c t_ P o s . w i f f ( T u r b o S p r a y )

M a x . 2 . 5 e 5 c p s .

1 5 0

1 6 0

1 7 0

1 8

0

1 9 0

2 0 0

2 1 0

2 2 0

2 3 0

2 4 0

2 5 0

2 6 0

2 7 0

2 8 0

2 9 0

3 0 0

3 1 0

3 2 0

m / z , D a

0 . 0

1 . 0 e 4

2 . 0 e 4

3 . 0 e 4

4 . 0 e 4

5 . 0 e 4

6 . 0 e 4

7 . 0 e 4

8 . 0 e 4

9 . 0 e 4

1 . 0 e 5

1 . 1 e 5

1 . 2 e 5

1 . 3 e 5

1 . 4 e 5

1 . 5 e 5

1 . 6 e 5

1 . 7 e 5

1 . 8 e 5

1 . 9 e 5

2 . 0 e 5

2 . 1 e 5

2 . 2 e 5

2 . 3 e 5

2 . 4 e 5


3 0 2 . 2

2 7 6 . 4

3 2 0 . 0

2 1 9 . 2

2 0 5 . 0

2 3 3 . 0

2 5 6 . 2

1 6 4 . 2

2 2 6 . 2

1 6 1 . 0

2 3 1 . 2

2 0 3 . 2

1 6 2 . 0

1 8 5 . 0

1 7 6 . 0

1 9 1 . 2

2 2 5 . 2

1 5 6 . 0

1 6 0 . 2

1 9 8 . 2

1 7 4 . 0

2 1 5 . 2

2 8 2 . 0

2 0 6 . 0

1 9 2 . 2

1 8 3 . 8

1 7 3 . 4

2 2 8 . 0

1 5 1 . 4

2 0 0 . 8

1 6 8 . 0

2 3 8 . 2

2 1 7 . 0

A c q .

T i m e :

1 2 : 2 5

A c q .

D a t e :

S u n d a y ,

A u g u s t

0 5 ,

2 0 1 2

P h b

B K

N o r f l o x a c i n ( I o n m s : 3 2 0 m / z ,

i o n c o n B N n h l 0 C n g : 2 7 6 m / z , i o n c o n 3 0 2 m / z )





+ M S 2 ( 3 4 0 . 1 5 ) C E ( 4 7 ) : 2 6 M C A s c a n

s f r o m S a m p l e 1 ( T u n e S a m p l e N a m e ) o f I S - D 8

_ I n i t P r o d u c t_ P o s . w i f f ( T u r b o S p r a y )

M a x . 9 . 3 e 5 c p s .

1 5 0

1 6 0

1 7 0

1 8

0

1 9 0

2 0 0

2 1 0

2 2 0

2 3 0

2 4 0

2 5 0

2 6 0

2 7 0

2 8 0

2 9 0

3 0 0

3 1 0

3 2 0

3 3 0

3 4 0

m / z , D a

0 . 0

5 . 0 e 4

1 . 0 e 5

1 . 5 e 5

2 . 0 e 5

2 . 5 e 5

3 . 0 e 5

3 . 5 e 5

4 . 0 e 5

4 . 5 e 5

5 . 0 e 5

5 . 5 e 5

6 . 0 e 5

6 . 5 e 5

7 . 0 e 5

7 . 5 e 5

8 . 0 e 5

8 . 5 e 5

9 . 0 e 5

9 . 3 e 5


3 4 0 . 2

3 2 2 . 2

2 9 6 . 4

2 3 5 . 0

2 4 9 . 2

2 0 9 . 2

1 9 0 . 0

2 0 6 . 2

1 8 0

. 2

2 0 7 . 2

2 4 8 . 4

1 6 2 . 2

2 3 3 . 0

1 5 1 . 0

2 1 8 . 4

3 0 2 . 2

A c q . T i m e : 1 4 : 2 1

A c q . D a t e : S u n d a y , A u g u s t

0 5 ,

2 0 1 2

P h b

B K

C i p r o f l o x a c i n - D 8 ( I o n m

s : 3 4 0 m / z ,

i o n c o n B N n h l 0 C n g : 3 2 2 m / z ,

i o n c o n





STc ký BK khi xây dDng B01 ng chuXn c_a ciprofloxacin

STc ký BK thZ nghiLm dung môi chiRt m6u khi phân tích

ciprofloxacin





S 0 c ký 67 thB nghi8m cFt SPE khi phân tích ciprofloxacin

STc ký BK phân tích tính thích hC p c_a hL thUng khi phân tích enrofloxacin





STc ký BK khi xZ lí m6u qua cWt SPE HLB c_a flumequin

STc ký BK khi xZ lí m6u qua cWt SPE C-18 c_a enrofloxacin





STc ký BK c_a m6u thDc tR không có ciprofloxacin

STc ký BK c_a m6u thDc tR có enrofloxacin


Documents

Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC MS và MS