Norovirus e molluschi bivalve: dati epidemiologici e attività di ricerca

Dott.ssa Iole Ventrone

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI ‘FEDERICO II’

FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA

SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN

“ISPEZIONE DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE”

Napoli, 18 Maggio 2013

LE MALATTIE TRASMESSE DA ALIMENTI

COSTITUISCONO

UN DIFFUSISSIMO PROBLEMA

PER LA SALUTE PUBBLICA

Le malattie legate ad alimenti contaminati sono forse il più diffuso

problema di salute pubblica nel mondo contemporaneo ed

un’importante causa di riduzione della produttività.

Esiste un’elevata sottostima

Malattie che si manifestano in seguito all’ingestione di alimenti che contengono agenti patogeni

Sintomi

vomito

nausea

diarrea

Le M.T.A. si manifestano con maggiore gravità nelle popolazioni più sensibili

MALATTIE TRASMESSE DA ALIMENTI

solitamente gastroenterici

bambini

anziani

donne gravide

immunodepressi

Agenti patogeni responsabili di

MTA

Esistono oggi al mondo più di 250 MTA che si manifestano con differenti sintomi e sono causate da diversi agenti patogeni.

•Batteri

•Muffe

•Virus

•Parassiti

Spesso si vedono (es.: frutta ammuffita)

Oppure si vedono gli effetti della loro attività

(es.: carni alterate)

Sono meno evidenti: siamo consapevoli

dei loro effetti quando incorriamo in una

infezione

Virus trasmessi da alimenti Gli alimenti possono rappresentare una causa di trasmissione all’uomo di patogeni

di varia natura. II virus, differentemente dai batteri, non si moltiplicano e non producono tossine negli alimenti ma possono

essere semplicemente veicolati da questi al momento dell’ingestione.

Dati epidemiologici e clinici indicano una crescente importanza dei virus come

causa di malattie trasmesse con gli alimenti, il cui numero è ancora sottostimato.

Veicolo di patogeni

Virus enterici

Ingestione di alimenti contaminati

I virus inducono focolai di infezione

a livello di tessuti dell’intestino tenue

si replicano a livello della mucosa intestinale

vengono eliminati con le cellule infettate nel lume intestinale (passano attraverso il colon

con il chimo)

eliminati con le feci (108-109 virus/g)

Virus enterici: infezione

Vomito 20-30 milioni di particelle virali

Virus enterici

Appartengono a 6-8 famiglie diverse

Virus che causano gastroenteriti: Rotavirus, Astrovirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV)

Virus dell’epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV

Virus che si replicano nell’intestino umano, ma che causano malattia dopo essere migrati in altri organi, come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus

Norovirus

• Sono considerati una delle maggiori cause di gastroenteriti di origine non batterica

• Solo negli Stati Uniti sono responsabili di 23 milioni di casi

di malattia all’anno, pari a circa l’85% di tutti i casi di gastroenterite

• Analoghe percentuali sono state riscontrate in Giappone e Australia dove l’impatto dei Norovirus risulta superiore a quello di qualsiasi agente di natura batterica, compresa Salmonella spp..

• In Europa sono responsabili del 40% delle gastroenteriti non

batteriche di cui il 52% è riconducibile al consumo di molluschi bivalvi

Precedentemente conosciuti come “Norwalk-like virus”, dalla città omonima nell’Ohio (USA), dove nel 1968 si ebbe il primo episodio di

infezione nell’uomo

Norwalk virus

Norwalk –like virus

SRSVs

• SRSVs (Small Round Structured Viruses)

• Piccoli virus (27-35 nm)

Gastroenteritis viruses A = Rotavirus B = Adenovirus C = Norovirus D = Astrovirus Le particelle virali sono riportate allo stesso ingrandimento.

Filogenesi basata sulla proteina capsidica

Famiglia Caliciviridae – Lagovirus (Rabbit hemorrhagic disease virus, European brown hare syndrome virus)

- Vesivirus (Canine calicivirus, Feline calicivirus, Vesicular exanthema of swine virus)

- Sapovirus (Sapporo virus)

Norovirus spp.

Norovirus spp.: generalità

• Privi di involucro esterno

• Capside icosaedrico con depressioni superficiali a forma di calice

• Capside formato da 180 molecole (90 dimeri)

della proteina virale capsidica VP1 (55–60 kDa circa)

• Proteina capsidica organizzata in 2 domini

Genoma

•Singolo filamento di RNA (ssRNA) a polarità positiva ( ~7,5 Kb)

• Tipico dei virus della famiglia Caliciviridae

• Genoma contiene 3 aree maggiori (ORFs)

•ORF 1 (~ 1700 aa) codifica per un precursore poliproteico non strutturale poi convertito dalla viral 3C-like protease (3CL). Tale poliproteina include RdRp (regione altamente conservata usata per la diagnosi di Norovirus)

•ORF 2 (~ 550 aa) codifica per la proteina maggiore del capside (VP1)

•ORF 3 codifica per la proteina strutturale minore del capside (VP2) con proprietà attualmente non ancora conosciute.

•

Il sub-dominio P2, più esterno, è il più soggetto a mutazioni e quindi responsabile dell’elevata variabilità genetica del genere Norovirus P2 contiene i siti recettoriali, quindi riconosce gli antigeni dei gruppi sanguigni e si lega ad essi.

La proteina VP1 forma due domini : P (protundente, P1 e P2) e S (capsidico).

Norovirus

• Si distinguono geneticamente 5 genogruppi (GI, GII, GIII, GIV e GV), che a loro volta sono divisi in diversi clusters o genotipi

• GI, GII e GIV infettano

l’uomo il GIII il bovino, il GV è stato isolato dal topo

• Il GII (il più diffuso tra i

genogruppi umani) contiene 19 genotipi

Gastroenterite da Norovirus: Cenni clinici

Periodo di incubazione : •1-3 giorni •La malattia ha decorso acuto ed è considerata essere autolimitante Sintomi: • febbre, vomito, diarrea e nausea.

Sono più lievi nei bambini, a differenza delle altre gastroenteriti virali.

•La loro risoluzione si verifica generalmente entro 2-3 giorni.

In uno studio epidemiologico condotto in Olanda > 20% delle persone che aveva avuto la malattia riportava sintomi anche dopo due settimane (Rockx, 2002)

Norovirus: trasmissione e resistenza

• Trasmissione principalmente oro-fecale

• E’ descritta anche la trasmissione per via aerea, a seguito di

formazione di particelle di aerosol a partire da episodi di vomito ‘a getto’

• Oltre 30 milioni di particelle virali espulse con il vomito possono contaminare superfici in una larga area: ci sono evidenze di una sopravvivenza lunga di tali virus sulle superfici contaminate

• L’elevata infettività dei NoV è ulteriormente potenziata dalla resistenza all’azione della temperatura e dei comuni disinfettanti, rendendo estremamente difficoltosa la loro eliminazione da superfici e alimenti contaminati

Norovirus Infettività

• Elevata infettività: 10 particelle virali sufficienti a provocare la malattia

• Inizialmente detta “malattia invernale da vomito” • Attualmente in aumento anche in mesi primaverili ed

estivi (Regno Unito)

Diffusione dei Norovirus • Bassa dose infettiva : consente al virus di diffondersi attraverso

aereosol, vomito, contatti interpersonali e contaminazione dell’ambiente (livello di reinfezione del 30% o più tra contatti stretti e familiari)

• La liberazione virale precede l’esordio della malattia nel 30% circa delle persone esposte e può continuare a lungo dopo la malattia aumentando il rischio potenziale di una reinfezione

• Virus resistente ad un ampio spettro di temperature (dal congelamento a 60°C), sopravvive sulle superfici ambientali, nell’acqua delle fontane e da bere, e in numerosi cibi mangiati crudi

• Grande varietà dei norovirus e mancanza di una completa protezione crociata e di una immunità duratura (le reinfezioni possono avvenire per tutta la vita)

• Genoma che facilmente va incontro a mutazioni che causano cambiamenti antigenici e ricombinazioni, che determinano l’evoluzione in nuovi ceppi capaci di infettare soggetti sensibili.

Gastroenteriti da NoV (2000-2008)

I CDC (Centers for Disease Control and Prevention) americani stimano che

siano almeno 23 milioni ogni anno i casi di gastroenteriti acute dovute ad

infezione da Norovirus e che, nel complesso, questi agenti siano responsabili

del 50% del totale delle gastroenteriti.

Gastroenteriti da NoV in UE

• The most commonly reported settings for the virus outbreaks were restaurant, café, pub, bar or hotel (39 outbreaks), but also other settings were identified, including specific communities, such as residential institutions, hospitals or home care establishments.

• Several contributory factors were reported, either alone or in combination, for 59 outbreaks; among the most common were infected food handlers (33 outbreaks) and unprocessed contaminated ingredients (19 outbreaks).

• Four waterborne outbreaks attributable to calicivirus (including norovirus) were also reported.

• Regno Unito: il 15,7 % di tutti di infezioni legate al consumo di vegetali e frutta sono dovute alla contaminazione da Norovirus.

• Danimarca: (estate 2005) sono stati notificati più di 1100 casi di gastroenterite dovuti al consumo di una fornitura di lamponi contaminati con genotipi diversi di norovirus.

• Svezia: (giugno-agosto 2006) si sono verificati 3 episodi:

– 15 persone coinvolte dopo consumo in una festa privata di un dolce a base di crema e lamponi. Gli esami effettuati sui campioni di feci hanno evidenziato la presenza di Norovirus

– 10 persone si sono ammalate con sintomatologia riferibile a Norovirus dopo consumo di un cheesecake con lamponi . La segnalazione tardiva della tossinfezione non ha consentito il prelievo di campioni ma durante le indagini è emerso che i lamponi utilizzati per il cheesecake erano della stessa marca di quelli trovati nell’episodio precedente.

– 12 bambini a seguito del consumo di una bevanda a base di lamponi; 9 persone dopo consumo di un dolce ai lamponi.

Gastroenteriti da NoV in UE

Gastroenteriti da NoV in UE

2006 • Danimarca: 2 epidemie collegate ad ostriche (coinvolte 46

persone in un party), provenienza UK e Francia • Italia: 2 epidemie collegate ad ostriche, provenienza Francia,(6

persone USSL12 Veneziana e 12 persone SIAN Trento). • Olanda: epidemia collegata ad ostriche, provenienza Francia (3

casi)

2007 • Malta: 71 casi accertati, alimento sospetto ostriche

(provenienza Francia via Italia); presenza di GGI e GGII 2008 • Francia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Spagna • Olanda : casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Francia • Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K. • Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K.

Casi di GE da Norovirus in Italia

• Estate 2003 – Villaggio turistico del centro Italia

183 persone coinvolte (169 ospiti e 14 impiegati)

Norovirus in acqua di mare e acqua di falda non potabile (docce, piscine e servizi igienici)

• Dicembre 2005 – Ristorante in provincia di Udine 184 soggetti coinvolti Antipasto di pesce contaminato da Norovirus • 2007 – Provincia di Bari Più di 1000 persone coinvolte Acqua potabile contaminata da Norovirus

Norovirus: “virus da crociera”

• Novembre 2003 – Nave da crociera Aurora (P&O Cruises)

Gastroenteriti da NoV e crociere

Gennaio 2005: - epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi

- epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida

Motivi

•I focolai epidemici vengono individuati e denunciati più rapidamente su una nave da crociera che sulla terraferma. • La vicinanza degli alloggi potrebbe accrescere le occasioni di contatto di gruppo. • L’arrivo di altri passeggeri potrebbe causare il contagio dei passeggeri già presenti e dei membri dell’equipaggio

Ottobre 2003: epidemia a bordo di una

nave da crociera nel Mediterraneo

Luglio- Novembre 2002: epidemie a bordo

di navi da crociera della stessa compagnia

Alimenti coinvolti

Molluschi bivalvi Frutta e verdure

ACQUA

CONTAMINATA

Fonti di contaminazione primaria di Norovirus

Molluschi e Norovirus Diffusi su tutti i fondali Animali scavatori sessili Mediante meccanismo di

filtrazione si nutrono di piccole particelle alimentari presenti nell’acqua o nei sedimenti

Metabolismo molto attivo Trattengono nel loro

organismo il plancton necessario al nutrimento, ma anche batteri e virus eventualmente presenti nelle acque

Molluschi bivalvi alimenti ad alto rischio

18 20 Ostrica Americana

12 15 Ostrica Europea

1,5 14 Mitilo

Litri/ora °C

36-432 litri/giorno

Network europeo per la

rapida individuazione delle

tossinfezioni virali derivate

dagli alimenti

I.S.S.

ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’

• Laboratorio Nazionale di Riferimento (LNR) scelto nel

2002 dal Ministero della Salute per il controllo delle contaminazioni virali dei molluschi bivalvi

• Collabora e diffonde le informazioni provenienti dal

Laboratorio Comunitario di Riferimento, il "Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science " (CEFAS) - Weymouth - United Kingdom

Reg CE 2073/2005 (1441/2007) sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari

Criteri di sicurezza

Alimento Microrganismo Piano campionamento(1)

n c

Limiti(2)

Molluschi bivalvi vivi

Salmonella

E.coli

5 0

1 0

Assente in 25g

230MPN/100g

Consideranda : (12) Gli indicatori fecali convenzionali non sono affidabili (…) e non è pratica sicura basarsi sulla rimozione degli indicatori batterici fecali per determinare i tempi di depurazione dei frutti di mare. (23) È opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d’analisi sono stati sufficientemente messi a punto. (27) Si ribadisce la necessità dello sviluppo di metodi di analisi per virus enterici

(1) n= numero di unità che formano il campione c= numero di unità campionarie i cui valori si situano tra m ed M (2) Si applica l’ultima edizione della norma

Regolamenti 853-854/2004

Classificazione delle aree di produzione/stabulazione dei molluschi

bivalvi vivi

Classificazione A,B e C basata sul numero di E.coli:

- A <230 E.coli/100g;

- B < 4600 E.coli/100g (Tolleranza analitica del 10% )

- C <46000 E.coli/100g

Molluschi provenienti da area B: devono essere sottoposti a depurazione presso Centri autorizzati (854 e 853/2004 part C)

Molluschi provenienti da area C: stabulazione di lunga durata, almeno due mesi (854 e 853/2004 part C)

2006 :AUMENTO DEI CASI DA NOROVIRUS IN EUROPA

Al programma FBVE partecipano 13 nazioni, 12 hanno risposto al quesito

9 nazioni hanno confermato un aumento della frequenza di focolai/casi rispetto allo stesso periodo del 2004

L’ Italia non ha comunicato le informazioni prima della pubblicazione dei dati. I soli 4 casi indicati suggeriscono una marcata sottostima della situazione nazionale.

Raccomandazione 20/04/2007

• La mancanza di un sistema di monitoraggio adatto a registrare tutti i casi di tossinfezioni virali ha spinto il Ministero della salute a emanare nel 2007 una raccomandazione nella quale esorta le Regioni a delegare i laboratori ufficiali per studiare metodiche standardizzate al fine di rendere più efficaci i controlli ufficiali.

• I.S.S. partecipa all’istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4

“Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR”

coordinatore dr. David Lee (CEFAS)

• Necessità di definire metodi di riferimento (standardizzati ed internazionalmente riconosciuti) per NV (GGI e GGII) e HAV:

Superfici Frutta e vegetali Acqua Molluschi bivalve

Metodi classici

• Microscopia elettronica Scarsa sensibilità

• Saggi immunoenzimatici (ELISA) Cross reattività

• Colture cellulari

• Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE

Virus difficilmente o affatto coltivabili

Tecniche molecolari

Natura complessa e non omogenea della matrice alimentare

Basso numero di virus presenti

Hanno evidenziato la più alta sensibilità nell’individuare i Norovirus

Protocollo sperimentale

1. Estrazione e concentrazione del virus dalla matrice alimentare

2. Estrazione e purificazione dell’RNA per rimuovere gli inibenti

3. Retrotrascrizione a cDNA tramite l’enzima trascrittasi inversa

4. Amplificazione con Real Time PCR

Estrazione di Boom (NucliSENS® MiniMag - bioMerieux)

Liberazione e stabilizzazione degli acidi nucleici

Legame degli acidi nucleici

Purificazione degli acidi nucleici, rimozione degli inibitori

Recupero degli acidi nucleici in un piccolo volume

Real-Time PCR

ORF 3 AAA3’ 5’VPG ORF 2 ORF 1

Real-Time PCR Primers & Probes

NOROVIRUS GI

QNIF4 (FW): CGC TGG ATG CGN TTC CAT (Costafreda et al. 2006) NV1LCR (REV): CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC (da Silva et al. 2007)

NVGG1p (PROBE): TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT (da Silva et al. 2007) NOROVIRUS GII QNIF2 (FW): ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA (Furhman et al. 2005) COG2R (REV): TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA (De Medici et al. 2004) QNIFS (PROBE): AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG (Furhman et al. 2005)

Protocollo Real-Time PCR

• Mix RT-PCR (kit Platinum Quantitative

RT-PCR ThermoScript One-Step System – INVITROGEN)

2x Thermoscript reaction

mix Primer 1 (12,5 μM) Primer 2 (22,5 μM) Probe (6,5 μM) ROX (50x) ThermoScript Plus /

Platinum Taq Acqua RNA

Profilo termico:

Step description

Temperature and time

Number of cycles

RT 55°C

1 h

1

Preheating 95°C

5 min

1

Amplification

Denaturation

95°C

15 sec

45

Annealing-

extention

60°C 1 min

65°C 1 min

Estrazione acidi nucleici e PCR

• Mengovirus : controllo di processo (efficienza della procedura di

concentrazione del virus ed estrazione degli acidi nucleici)

• amplificazione del virus tal quale

• amplificazione del virus estratto dal campione

• cDNA di Norovirus : controllo interno (efficienza della reazione di PCR)

• amplificazione di RNA di sintesi

• amplificazione dell’RNA di sintesi insieme al campione

RISULTATO

Nota del DGSAN del 24/11/2009

• L’ISS, in qualità di LRN, ha diramato agli IZZSS un metodo quantitativo per la determinazione di Norovirus e HAV in molluschi bivalve mediante Real Time PCR.

• Il citato metodo è stato sottoposto a validazione interna e risulta dotato dei requisiti di efficacia

RISULTATO

1. MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL TIME PER L’IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE

2. RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE CAMPANIA

Disegno sperimentale

Campionamento

15 allevamenti (7 area A - 8 area B)

46 prelievi al dettaglio

N-O N-E

S-E S-O

117 pools di Mytilus galloprovincialis

Specie analizzate

35

Mytilus galloprovincialis

4

Ensis minor

3

Chamelea gallina

2

Tapes philippinarum

1

Ostrea edulis

1

Glycymeris glycymeris

Acquistati presso punti vendita (19 autorizzati e 16 ambulanti abusivi)

Materiali e metodi

Lavaggio per rimuovere fango e

detriti dalla superficie esterna

delle valve

Arrivo dei molluschi in laboratorio

Materiali e metodi

Selezione di 20-25 esemplari per pool

Apertura delle valve con lama pulita in

condizioni di sterilità

Dissezione del tessuto digestivo con bisturi, pinzette

e forbicine sterili

Sminuzzamento con bisturi sterile

Estrazione e concentrazione dell’RNA virale dalla matrice alimentare

Fase di denaturazione

Fase di annealing

Fase di extension

Retrotrascrizione

Retrotrascrizione a cDNA Amplificazione con Real Time PCR

Lettura dei risultati della Real Time PCR

Disegno sperimentale

Risultati – Allevamenti

Prelievi: pool delle tre profondità di ciascun filare

Allevamenti 1ºcampionamento

Luglio 2007 / Maggio 2008 2ºcampionamento

Settembre 2008 / Giugno 2009 3ºcampionamento

Novembre 2009 / Marzo 2010

Zona A NO NE SO SE C NO NE SO SE C NO NE SO SE C

1 - - - - - - - - - - NC

2 - - - - - - NC - - + +

3 + + + + NC - - - - - NC

4 - - - + - NC NC

5 - - - - - - - - - NC

6 - - + - - NC NC

7 - - - - - + + + + + NC

Zona B NO NE SO SE C NO NE SO SE C NO NE SO SE C

8 + - - + + + + + + + + - + + +

9 - - - + - + + + + + NC

10 + + + + NC + +

11 + + + + NC + +

12 + + + + NC NC NC

13 NC + NC + NC + +

14 - - - - - NC + + +

15 + + + + NC + +

Positivi 13 allevamenti campionati (86,6%) in almeno uno dei prelievi

Risultati – Prelievi al dettaglio

Campioni

positivi

73%

Campioni

negativi

27%

Positività in 33 dei 45

prelievi effettuati presso i

punti vendita

Il campione di Glycymeris glycymeris sequestrato in un ristorante della provincia di Napoli contaminato da Norovirus appartenenti ad entrambi i genogruppi.

Prelievi al dettaglio Positività per NoVs

NoV GII NoV GI + NoV GII

35 Mytilus galloprovincialis

27 15

4 Ensis minor 0 0

3 Chamelea gallina 3 2

2 Tapes philippinarum 2 1

1 Ostrea edulis 1 0

1 Glycymeris glycymeris

1 1

Tot campioni positivi 34 19

• Dei n. 35 punti vendita della Regione Campania nei quali sono stati acquistati i campioni di Mytilus galloprovincialis, sono risultati positivi :

10 dei 16 rivenditori ambulanti abusivi che vendevano il prodotto sfuso

17 dei 19 punti vendita regolarmente registrati

Risultati per i punti vendita di Mytilus galloprovincialis

1. MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL TIME PER L’IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE

2. RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE CAMPANIA

3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS

Disegno sperimentale

3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS

IFREMER ( Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer )

Centro di Nantes (Francia) Sezione di Virologia (Laboratorio di Microbiologia - MIC)

Dicembre 2009 - Maggio 2010

È stata studiata l’attività metabolica di bioaccumulo nelle

ostriche dei due più comuni genotipi virali di Norovirus :

• NoVs GI.1 • NoVs GII.3

BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CAMPIONI DI CRASSOSTEA GIGAS

• Gli esemplari di Crassostea gigas provenivano da allevamenti siti lungo le coste della Bretagna.

• Un grosso lotto di ostriche è stato prelevato e posto in un’ area lungo le coste della baia di Brest.

• Le ostriche sono state trasportate in cassette di legno tramite automezzi refrigerati presso i laboratori di ricerca dell’IFREMER di Nantes.

• I campioni sono stati stoccati in camera fredda termostatata all’interno di vasche contenenti acqua di mare pulita, entro 24 ore dalla raccolta.

• Temperature della camera e dell’acqua sono state

preimpostate a 9°C

• Lo stoccaggio dei campioni è durata 24 ore per permettere ai molluschi di reidratarsi, rivitalizzarsi e adattarsi alle nuove condizioni ambientali.

• L’acqua di mare, proveniente da cisterne interne dell’IFREMER, era pulita e non contaminata da virus.

Stoccaggio dei campioni

Preparazione dei Norovirus utilizzati negli esperimenti di bioaccumulo

• Sospensioni virali di Norovirus GI. 1 e Norovirus GII. 3 (106 virus / g di feci)

• Virus estratto da feci diarroiche provenienti da pazienti ospedalizzati

• I campioni di feci hanno evidenziato la presenza di NoVs GI.1 e NoVs GII.3

• Le soluzioni virali preparate per i test di bioaccumulo sono state stoccate in frigo a 4°C

• No. 8 esperimenti

Il bioaccumulo dei due singoli genotipi è stato testato in 3

repliche

Il bioaccumulo del cocktail contenente i due genotipi è stato

testato in 2 repliche

• Ogni esperimento: – durata complessiva di dieci giorni (da 0 a 9)

– utilizzo di tre vasche (A, B, C), più una quarta vasca contenente i campioni di Crassostea gigas utilizzati come controllo negativo

– l’acqua delle vasche (300 mL per campione) e’ stata cambiata ogni 24 h con acqua di mare pulita

– controllo quotidiano dei parametri ambientali prefissati e della vitalità degli esemplari di Crassostea gigas

Esperimenti di bioaccumulo

Giorno 0 vasca A : 32 campioni e soluzione NoVs vasche B e C : 8 campioni rispettivamente

A B C

Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9) singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3

Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3

Giorno 0

vasca A : 32 campioni e soluzione di NoVs

Vasca A : • Aggiunta di NoVs ogni 24h • Prelievo di 8 campioni per valutare il bioaccumulo i giorni 1 106virus/g feci 3 3x106virus/g feci 6 6x106virus/g feci 9 9x106virus/g feci

A B C

Giorno 0 vasche B e C : 8 campioni rispettivamente

A B C

Vasca B : • Aggiunta di una soluzione di NoVs 106 virus/g di feci il giorno 8 NoVs il giorno 8 • I campioni sono stati analizzati il giorno 9 dopo 24 h dall’aggiunta della soluzione virale. • Verifica dei parametri di vitalità e attività di filtrazione delle ostriche

Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3

Giorno 0 vasche B e C : 8 campioni rispettivamente.

A B C

Vasca C : • Aggiunta di una soluzione di NoVs 9 x 106 virus/g di feci il giorno 8 • I campioni sono stati analizzati il giorno 9 dopo 24 h dall’aggiunta della soluzione virale

• Differenze dose-dipendenti dell’attività di bioaccumulo di Crassostea gigas.

Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3

Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3

A B C

Giorno 0 vasche A, B e C : 16 campioni rispettivamente Vasca A : •Aggiunta ogni 24h di cocktail di NoVs

Vasca B : •Aggiunta ogni 24h di NoVs GI.1

Vasca C : •Aggiunta ogni 24h di NoVs GII.3

• Vasca A analisi del bioaccumulo del cocktail virale.

• Vasche B e C controllo per evidenziare competizione nell’attività di bioaccumulo tra i due genotipi virali

Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3

A B C

Vasche A, B e C : • Prelievo di 8 campioni rispettivamente i giorni:

1 106virus/g feci dopo 24 h di bioaccumulo

e

9 9x106virus/g feci dopo 9 gg di bioaccumulo

1,5g tessuto digestivo sminuzzato

Eluizione dei virus: •glycine pH 9,5 •chloroforme-butanol •cat floc T

Concentrazione dei virus: •PEG •agitation 1h; 4°C

Lisi dei virus: (Nuclisens Lysis Buffer, Biomérieux®)

Purificazione degli acidi nucleici (Minimag Biomérieux ®)

100 µL

Eluizione degli acidi nucleici

10µL mengo

Estrazione acidi nucleici

Dissezione del tessuto digestivo

Protocollo Real-Time PCR

• Mix RT-PCR (kit Platinum Quantitative

RT-PCR ThermoScript One-Step System – INVITROGEN)

2x Thermoscript reaction

mix Primer 1 (12,5 μM) Primer 2 (22,5 μM) Probe (6,5 μM) ROX (50x) ThermoScript Plus /

Platinum Taq Acqua RNA

Profilo termico:

Step description

Temperature and time

Number of cycles

RT 55°C

1 h

1

Preheating 95°C

5 min

1

Amplification

Denaturation

95°C

15 sec

45

Annealing-

extention

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NoVs GI.1

106/g stool 10/03/2010 13/04/2010 27/04/2010

Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C

D1 1,8x103 9,5x103

8,5x103

D3 7,5x103 9,1x103

4,5x104

D6

3,5x104 4,5x104 7,1x104

D9 6,5x104 4,5x103 3,9x104 3,5x104 5,4x104 7,7x104 9,5x104 1,0x104 2,0x105

NoVs GI.1 concentrato 106/ grammo di feci

Vasca A : I risultati nei giorni 1, 3, 6 e 9 si discostano di poco nelle tre repliche, variando tra loro di meno di un logaritmo. La concentrazione virale nell’arco dei nove giorni ha seguito un trend positivo

3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS

RISULTATI

NoVs II.3

106/g stool 16/02/2010 10/03/2010 13/04/2010

Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C

D1 1,3x106 1,2x104

5,2x104

D3 2,8x106 1,3x105

3,3x105

D6 3,2x106 1,4x105 6,0x105

D9 9,6x106 1,1x106 1,7x107 3,4x105 2,1x105 7,0x105 4,9x105 6,1x104 8,5x105

Vasca A : La concentrazione virale nell’arco dei nove giorni è costantemente in crescita in tutte e tre le prove Concentrazioni di virus più alte sono state evidenziate nella prima prova (mese di febbraio).

NoVs GII.3 concentrato 106/ grammo di feci

RISULTATI

RISULTATI

NoVs GI.1

106/g feci 10/03/2010 13/04/2010 27/04/2010

Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C

D1 1,8x103 9,5x103 8,5x103

D3 7,5x103 9,1x103 4,5x104

D6 3,5x104 4,5x104 7,1x104

D9 6,5x104 4,5x103 3,9x104 3,5x104 5,4x104 7,7x104 9,5x104 1,0x104 2,0x105

NoVs GI.1 concentrato 106/ grammo di feci

Vasca B La capacità di filtrazione permane immodificata fino all’ultimo giorno della sperimentazione, le condizioni ambientali erano ottimali, bioaccumulo maggiore di quello osservato nelle ostriche in vasca A il giorno 1.

Vasca C Le ostriche hanno bioaccumulato in 24h una quantità di virus pari o di poco superiore a quanto evidenziato nella vasca A

• Nelle stesse condizioni di sperimentazione e a parità di concentrazione virale, i campioni di Crassostea gigas tendono a bioaccumulare maggiormente NoVs GII.3. • La differenza tra i risultati di bioaccumulo è infatti di circa un logaritmo.

RISULTATI

NoVs GI.1 (106/ grammo di feci)

NoVs GII.3 (106/ grammo di feci)

NoVs

GI.1+GII.3

106/g stool 27/04/2010 18/05/2010

Vasca A Vasca B Vasca C

Vasca A Vasca B Vasca C

GI.1 GII.3 GI.1 GII.3

D1 1,0x104 2,5x104 8,5x103 8,1x104 1,1x104 9,5x104 5,0x103 6,4x105

D9 2,0x105 1,4x105 9,5x104 4,0x105 3,2x105 2,7x106 6,0x105 1,5x106

RISULTATI

Cocktail (NoVs GI.1 + NoVs GII.3) concentrato 106/ grammo di feci

• Riconfermata la maggiore capacità di bioaccumulo di NoVs GII. 3 sia se miscelato nel cocktail, sia se aggiunto singolarmente.

CONCLUSIONI

• Metodica Real Time RT PCR efficace per la ricerca dei Norovirus (Nota MinSan 24/11/2009)

• Vasta circolazione di Norovirus in molluschi bivalve raccolti e commercializzati nella Regione Campania (57% di positività)

• Presenza di Norovirus appartenenti ai genogruppo II in tutti i campioni positivi

• Presenza di Norovirus in allevamenti di area A

• Più del 50% di positività in campioni provenienti da punti vendita

autorizzati

• I campioni di Crassostea gigas hanno bioaccumulato una quantità di virus costantemente in crescita

• Il genotipo GII. 3 è il patotipo del genere Norovirus più stabile nel tessuto digestivo dei molluschi filtratori

• In compresenza di Norovirus GI. 1 e GII. 3, i campioni di Crassostea gigas hanno bioaccumulato entrambi i genotipi virali

(non esiste immunità crociata per NoVs)