ẢNH HƯỞNG CỦA ABA ẢNH HƯỞNG CỦA ABA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẠO CHỒI TRỰC TIẾP CẤY TẠO CHỒI TRỰC TIẾP TỪ MÔ SẸO CỦA LÁ CÂY TỪ MÔ SẸO CỦA LÁ CÂY

CHÈ ( CAMELLIA SINENSIS CHÈ ( CAMELLIA SINENSIS (L.))(L.))

M C L CỤ ỤGIỚI THIỆU:NỘI DUNG:

Tổng quan về sinh học của cây chèVật liệu Phương pháp tiến hành

Sự khởi đầu nuôi cấy mô sẹoTái sinh rễ in vitro và chuyển cây con ra vườn ươmPhân tích thống kê

Kết quảSự hình thành mô sẹo và tái sinh chồiSự tái sinh rễ in vitro và chuyển cây ra vườn ươmNghiên cứu cơ quan khí khổng

KẾT LUẬN:TÀI LIỆU THAM KHẢO:

GIỚI THIỆU:

Chè là một trong những cây công nghiệp quan trọng và tạo ra nhiều việc làm ở tất cả các vùng trồng chè trên thế giới. Bên cạnh vai trò là một loại thức uống phổ biến, chè ngày càng được ưa chuộng bởi đặc tính kháng ung thư và chống lão hóa (Jankul et al. 1997)

Trước đây, chỉ có một công bố về sự phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ các mô lá dòng chè Assamica-SRL 73,(Kato, 1996) và sự tái sinh chồi gián tiếp từ lá thông qua rễ bất định có nguồn gốc callus (Sandal et al. 2005).

Tổng quan về sinh học của cây chè Camellia sinensis

• C.sinensis có nguồn gốc ở khu vực Đông Nam Á, ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới(NĐ và CNĐ). Nó là loại cây xanh lâu năm mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thường được xén tỉa thấp hơn 2 m, được trồng lấy lá.

• Hoa: màu trắng ánh vàng. • Hạt:có thể ép để lấy dầu. • Lá: dài 4–15 cm và rộng 2–5 cm. Lá tươi

chứa khoảng 4% caffein. .

Cây chè C.sinensisCây chè C.sinensis

• Chè xanh, chè ô long và chè đen tất cả đều được chế biến từ loài này, nhưng được chế biến ở các mức độ oxi hóa khác nhau.

• Lá dài từ 4–15 cm,rộng từ 2–5 cm. Lá tươi chứa khoảng 4% cafein. Lá non và các lá màu xanh lục nhạt được thu hoach để sản xuất chè

Một số các biến thể khác nhau của C. sinensis được trồng ở Việt Nam:

– Biến thể Trung Quốc (C. sinensis sinensis)– Biến thể Cam pu chia (C. sinensis parvifolia)– Biến thể Assam (C. sinensis assamica hay

C. assamica). • Phần lớn chè được sản xuất từ biến thể này Nó

là loại cây nhỏ (thân đơn) với lá to. Như đã nói ở mục giới thiệu thì những công bố đầu tiên trên thế giới về cây chè in vitro của Kato(1996), Sandal và cộng sự(2005) cũng đều chỉ thực hiện trên biến thể chè này.

Vì vậy mà khi lặp lại các công bố của Kato và Sandal đối với các giống chè cao sản đang tiêu thụ tại Việt Nam, như giống Oo-Long, đã gặp phải nhiều khó khăn.

VẬT LIỆU

• Các đoạn chồi nách những cây chè trưởng thành Camellia sinensis var.,

• Môi trường nuôi cấy MS, MS1, MS2,MS3,…là những tổ hợp các chất sinh trưởng thực vật (IBA, BA, ABA ) theo liều lượng khác nhau.

Abscisic acid( ABA)

Năm 1961 F.Addicott và cộng sự tách từ quả bông già khô chất kích thích rụng lá. Năm 1963 từ quả bông non cũng vậy, ông gọi là absixin (từ tiếng latinh abscidere - tách ra, rơi rụng). Cũng 1963 Waring tách từ lá bạch dương chất gây ngủ chồi.Năm 1964 tách chất tương tự từ lá cây ngô đồng và tinh thể hoá gọi là dormin Năm 1967 gọi chất đó là a.Abscisic (ABA).

• ABA là một chất 15 cacbon, có cấu trúc hoá học giống với phần đầu của các chất nhóm carotenoid.

ABA – một chất điều hòa sinh trưởng thực vật vừa có vai trò ức chế, vừa có vai trò kích thích sự phát triển đối với một quá trình sinh học như: kiểm soát sự rụng lá, cảm ứng trạng thái ngủ của chồi và hạt vào mùa thu để đợi đến mùa xuân, giúp đóng các khí khổng khi cây chịu hạn.Vận chuyển không phân cực, chủ yếu qua mô libe.

Chính vai trò rất đặc biệt này của Chính vai trò rất đặc biệt này của ABA mà người ta đã nghiên cứu tìm ABA mà người ta đã nghiên cứu tìm ra cơ chế tương tác thích hợp giữa ra cơ chế tương tác thích hợp giữa mô và các giai đoạn phát sinh hình mô và các giai đoạn phát sinh hình thái nhằm kích thích sự tái sinh thái nhằm kích thích sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá chè.chồi từ mô sẹo lá chè.

Phương pháp tiến hành

1)Sự khởi đầu nuôi cấy mô sẹo

• Quá trình vô trùng vào mẫu được tiến hành trong erlen 100 ml có bổ sung 20 ml môi trường MS với 8 g.l-1 agar, 1 g.l-1 TDZ (Thidiaruzon) và 30 g.l-1 đường sucrose.

• Các lá thứ 3 tính từ đỉnh cây xuống được cắt thành mẫu cấy có kích thước (5,0x1,0 mm2 ) được dùng làm vật liệu thí nghiệm.

• Sau đó, các phản ứng phát sinh hình thái mô được thử nghiệm trên môi trường MS1 có bổ sung 30g.l-1sucrose và các nồng độ khác nhau của tổ hợp giữa IBA và BA.

THÍ NGHIỆM 1

Tạo callus trên môi trường MS1

Bảng 1. Ảnh hưởng của các nồng độ IBA và BA lên sự cảm ứng mô sẹo từ nuôi cấy lá

THÍ NGHIỆM 2

• Các mô sẹo được hình thành sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1được chuyển sang môi trường MS2 có bổ sung các nồng độ khác nhau của ABA và tổ hợp của BA và IBA để tái sinh chồi.(bảng 2)

Tái sinh chồi trong môi trường MS2

Tạo cụm chồi

CV=0.01 và LSD=1.456

2) Tái sinh rễ in vitro và chuyển cây con ra vườn ươm

THÍ NGHIỆM 3

Các chồi được tái sinh từ mô sẹo lá được tách ra và tiến hành nuôi cấy trên các môi trường MS3, MS4 nhằm kích thích cây tạo rễ.(sử dụng hộp nhựa )

Các chồi cao khoảng 4-5cm với bộ rễ khoẻ mạnh được chuyển ra trồng thử nghiệm ngoài vườn ươm.

Phân tích TN3

Cây chè được chuyển ra vườn ươm

Kết quả1) Sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi(TN1,2)

Sau 14 ngày nuôi cấy trên các nồng độ khác nhau của IBA và BA(hình a)

Tuy nhiên, mô sẹo đã không cho thấy bất kì phản ứng phát sinh hình thái khác trong suốt quá trình nuôi cấy trên cùng môi trường MS1 cũng như cấy truyền sang môi trường có cùng đặc tính. Mặc dù mô sẹo được phát sinh ở tất cả các nồng độ giữa IBA và BA nhưng cho đến khi được đưa vào MS2 thì quá trình tái sinh chồi mới diễn ra(hình b)

Sự tái sinh chồi

• Nghiệm thức L14 có sự khác biệt có ý nghĩa với tất cả các nghiệm thức còn lại: số chồi/mô đạt cao nhất(hình b). Điều này khuyến cáo áp dụng L14 sẽ có hiệu quả kinh tế nhất.

• Sự tái sinh chồi bất định thông qua mô sẹo từ nuôi cấy in vitro được báo cáo lần đầu tiên và duy nhất cho đến nay bởi Sandal và cộng sự(2005).

Trong nghiên cứu đó, Sandal dùng 2.4-D làm chất ĐHSTTV duy nhất trong quá trình tái sinh chồi bất định đạt kết quả tối ưu(14±1,6 chồi/mô) sau 24 tuần nuôi cấy.

Tuy nhiên, ông sử dụng nồng độ 2.4-D quá cao và trong thời gian quá dài, còn trong TN này chỉ mất 10 tuần mà đạt kết quả không chênh lệch bao nhiêu và nồng độ chất ĐHSTTV thấp hơn nhiều.

Nghiên cứu cơ quan khí khẩu cây chè

Hình thái khí khổng trong 3 môi trường khác nhau dưới KHV độ phóng đại 600 lần

• Hình a: lá ngoài tự nhiên

• Hình b: lá in vitro môi trường rắn

• Hình c: lá in vitro trong môi trường lỏng

Các lá in vitro có lượng khí khổng nhiều hơn các lá ex vitro, nhưng ngược lại thì sức sống kém hơn do có nhiều nước hơn và không có lớp biểu bì sáp bao bên ngoài.

Trong nghiên cứu này, có lẽ ABA đa ức chế sự tăng sinh khối mô sẹo khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nhưng đồng thời cũng kích thích sự phát triển các phát thể chồi từ mô sẹo.

KẾT LUẬN

Từ công bố này ta có được một mô hình chung về nồng độ ABA cần thiết trong quá trình nuôi cấy mô lá cây chè để đạt hiệu quả tái sinh chồi cao nhất. Điều này có một ý nghĩa lớn lao trong ngành công nghiệp chè nói riêng và trong nền kinh tế nước nhà nói riêng. Hy vọng là trong thời gian tới, kĩ thuật trồng chè bằng công nghệ vô tính sẽ được áp dụng rộng rãi trong cả nước.

Phụ lục

• MS:Môi trường MS MS:Môi trường MS (Murashige and Skoog)(Murashige and Skoog)Môi trường được pha thành 7 dung dịch mẹ như sau:A.Đa lượng (g/l)KNO3 19.0NH4NO3 16.5CaCl2.2H2O 4.4MgSO4.7H2O 3.7B.Phosphat (g/l)KH2PO4 1.7NaH2PO4 1.7C.Vi lượng1 (g/l)H3BO3 0.62MnSO4.H2O 1.69ZnSO4.2H2O 0.86

• D.Vi lượng 2 (g/l)KI (Kali iodua) 0.83Na2MoO4.2H2O 0.25E.Vi lượng 3 (g/l)CuSO4.5H2O 0.25CoCl2.6H2O 0.25F.Sắt/EDTA (g/100ml)Na2EDTA 0.372FeSO4.7H2O 0.278G.Vitamin (mg/100ml)Glycin 200Nicotinic acid 50Pyridoxin-HCl 50Thiamin-HCl 10Myo-inositol 10.000

Muốn có 1 lít môi trường làm việc MS dùng trong NCM

-Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước cất-Thêm 100ml A và 100ml B-Thêm 10ml C và 10ml F-Thêm 1ml D và 1ml G-Thêm 0,1ml E-Thêm nước cất cho đủ 1 lít.

Tài liệu tham khảo

• Tài liệu chính dựa trên nghiên cứu của Th.s Nguyễn Thanh Mai và SV Nguyễn Sĩ Tuấn( ĐH Mở TP.HCM).

• Kato M (1996) Somatic embroygenesis from immature leaves of in vitro grown tea shoots. Plant Cell Rep. 15: 920-923.

• Nghiên cứu vai trò ABA trong việc tăng cường khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo(Liu và cộng sư, 1997, Modal và cs, 2004, Peterson và Smith, 2004, …).etc..

THE END