Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat

7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat

http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 1/24

CHƯƠ NG 2:

ĐẠI CƯƠ NG VỀ MÔI TRƯỜ NG DINH DƯỠ NG – GENERAL

ABOUT NUTRITIONAL MEDIUMMôi trườ ng là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưở ng và phát triển của mô tế

bào, là nguồn cung cấp các dưỡ ng chất cần thiết nhằm duy trì sự sống, sinh trưở ng

và phát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy. Sở d ĩ Haberlandt, ngườ i đầu tiên

đề xướ ng phươ ng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (1902), không thành công

trong các thí nghiệm của mình vì lúc bấy giờ những hiểu biết về nhu cầu dinh

dưỡ ng khoáng của tế bào thực vật còn hạn chế và đặc biệt là vai trò của các chất

điều khiển sinh trưở ng đối vớ i quá trình phân chia và phân hóa của tế bào còn chưa

đượ c biết đầy đủ. Đến nay, theo thống kê các k ết quả nghiên cứu thì hầu hết các

môi trườ ng dinh dưỡ ng nhân tạo đượ c sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật

đều bao gồm những thành phần sau:

2.1. Các nguyên tố muối khoáng (mineral element)

Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần thiết cho đờ i sống thực

vật đượ c cung cấp dướ i dạng đa lượ ng và vi lượ ng. Các nguyên tố đa lượ ng là các

nguyên tố đượ c sử dụng ở nồng độ lớ n hơ n 0,5 mmol/L, còn các nguyên tố vi

lượ ng là các nguyên tố đượ c sử dụng ở nồng độ nhỏ hơ n 0,05 mmol/L. Khi các

muối khoáng đượ c hòa tan trong nướ c, chúng trải qua quá trình phân ly

(dissociation) và ion hóa (ionisation). Trong môi trườ ng dinh dưỡ ng, một loại ion

có thể đượ c tạo ra bở i một hoặc nhiều loại muối khác nhau. Ví dụ: trong môi

trườ ng MS, ion đượ c k ết hợ p bở i KNO3 và NH4NO3, ion K+ bở i KNO3 và

KH2PO4. Do đó, đây là điều quan trọng để so sánh các môi trườ ng khác nhau bằng

cách đánh giá nồng độ tổng số của các ion hiện diện trong chúng nhằm có đượ c



một ý tưở ng về sự thích hợ p của môi trườ ng cho các mô hoặc các hệ thống nuôi

cấy đặc biệt.

2.1.1. Các nguyên tố đa lượ ng

Các chất dinh dưỡ ng đa lượ ng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N),

phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn

tại dướ i dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trườ ng dinh dưỡ ng khác

nhau. Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưở ng của mô và tế bào

thực vật. Môi trườ ng nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium.

Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi

trườ ng dướ i cả 2 dạng nitrate và ammonium (2-20 mmol/L) là tốt hơ n cả. Trong

trườ ng hợ p chỉ dùng ammonium, thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch

vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như:

citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưở ng độc do nồng độ của

ammonium vượ t quá 8 mmol/L trong môi trườ ng đượ c giảm bớ t. Khi các ion

nitrate và cùng hiện diện trong môi trườ ng nuôi cấy, thì ion ammonium đượ c sử

dụng nhanh hơ n. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thườ ng

dùng trong khoảng 1-3 mmol/L.

2.1.2. Các nguyên tố vi lượ ng

Các nguyên tố vô cơ cần một lượ ng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh

trưở ng của mô và tế bào thực vật đượ c gọi là các nguyên tố vi lượ ng (nồng độ sử

dụng nhỏ hơ n 0,05 mmol/L). Đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn),

boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo). Fe dườ ng như thích hợ p hơ n khi

đượ c cung cấp dướ i dạng chelate Fe, và Zn đượ c dùng bình thườ ng trong các môi

trườ ng nuôi cấy. Các dạng muối tatrate và citrate Fe khó hòa tan và thườ ng hay k ết

tủa trong môi trườ ng. Vấn đề này có thể khắc phục bằng cách dùng



diaminetetraacetic acid (EDTA)-chelate Fe thay cho citrate Fe, đặc biệt đối vớ i quá

trình tạo phôi. Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong

môi trườ ng nuôi cấy dạng lỏng.

Một số môi trườ ng nuôi cấy đượ c làm giàu bằng cobalt (Co), iodine (I) và

sodium (Na), nhưng các yêu cầu nghiêm ngặt về các nguyên tố này cho sinh

trưở ng của tế bào đã không đượ c thiết lập. Nói chung, nồng độ thườ ng đượ c sử

dụng đối vớ i Cu và Co là 0,1 µmol/L, Fe và Mo là 1 µmol/L, I là 5 µmol/L, Zn là

5-30 µmol/L, Mn là 20-90 µmol/L và B là 2-5100 µmol/L đượ c bổ sung vào môi

trườ ng nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm.

Nhu cầu của cây đối vớ i nguyên tố vi lượ ng là rất thấp. Do vậy những

nguyên tố này cũng có mặt trong môi trườ ng ở các nồng độ tươ ng ứng. Hầu hết các

nguyên tố vi lượ ng sử dụng ở lượ ng nmol. Một số nguyên tố vi lượ ng có nhu cầu

nhỏ hơ n có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các

thành phần của môi trườ ng như agar, các chất bổ sung như nướ c dừa, dịch chiết

nấm men (yeast extract), các muối và nướ c. Tầm quan trọng của một số nguyên tố

vi lượ ng trong thành phần môi trườ ng còn chưa đượ c hiểu một cách rõ ràng. Co,

Al, Ni... có thể có lợ i đối vớ i thực vật nhưng cũng có thể là không cần thiết. Trong

thực tế, hầu hết các nguyên tố vi lượ ng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là

quan trọng, còn vai trò các anion có thể là không cần thiết

2.2. Nguồn cacbon (Cacbon source)

Do cấu trúc không hoàn chỉnh như cá thể thực vật trong tự nhiên nên hầu hết

các mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phươ ng thức dị

dưỡ ng, mặc dù ở nhiều trườ ng hợ p chúng có thể sống bán dị dưỡ ng nhờ điều kiện

ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợ p. Vì vậy, việc đưa vào môi

trườ ng nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc để cung cấp năng lượ ng.



Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dướ i các điều kiện

đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡ ng carbon. Việc bổ sung

nguồn carbon bên ngoài vào môi trườ ng làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các

chồi xanh.

Nguồn carbon thông dụng nhất đã đượ c kiểm chứng là sucrose, nồng độ

thích hợ p phổ biến là 2-5%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà

thay đổi có khi giảm xuống tớ i 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm

ứng stress nướ c). Sự thủy phân từng phần sucrose xuất hiện khi môi trườ ng đượ c

khử trùng. Các tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưở ng trên môi trườ ng có sucrose

đượ c khử trùng bằng autoclave tốt hơ n trên môi trườ ng có sucrose đượ c khử trùng

bằng màng lọc (filter). Điều này cho thấy các tế bào thích hợ p vớ i nguồn dự trữ có

sẳn của glucose và fructose do thủy phân sucrose khi khử trùng bằng autoclave.

Glucose cũng thườ ng đượ c bổ sung vào môi trườ ng nuôi cấy và cho

hiệu quả tươ ng đươ ng sucrose (glucose thườ ng dùng cho nuôi cấy

protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơ n. Sucrose, trong khi khử trùng

môi trườ ng, bị biến đổi thành glucose và fructose. Trong quá trình sống cảu

tế bào, đầu tiên glucose sẽ đượ c sử dụng và sau đó là fructose. Các

carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,

melibiose và trehalose cũng đã đượ c thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả

và chỉ đượ c dùng trong những trườ ng hợ p đặc biệt.

Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể

dùng cho nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào đượ c nuôi trên môi trườ ng có

chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng

thủy phân thông qua các enzyme chẳng hạn như amylase. Trong thực tế, có

những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trườ ng chứa tinh bột khá



nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trườ ng chỉ chứa sucrose lượ ng

amylase thải ra sẽ giảm ngay.

Glycerin cũng có thể đượ c tế bào sử dụng. Mannitol hoặc sorbitol hoàn

toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng đượ c

sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast vớ i chức

năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu, hoặc tươ ng tự sucrose chúng cũng

đượ c dùng để cảm ứng stress nướ c. Các loại rượ u như ethanol, methanol ít

hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc.

Acid hữu cơ thườ ng không phải là nguồn carbon thích hợ p cho tế bàonuôi cấy. Thí nghiệm vớ i các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric

chỉ đạt 15% sinh trưở ng so vớ i sucrose.

2.3. Các vitamin (vitamines)

Thực vật tự tổng hợ p các vitamin và chúng đượ c sử dụng như những

chất xúc tác trong các quá trình trao đổi chất khác nhau. Khi các tế bào và mô

thực vật sinh trưở ng trong điều kiện in vitro, một số vitamin không thể thay

thế đượ c tổng hợ p nhưng thườ ng không đủ về lượ ng, do đó phải bổ sung

thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B (B1, B2, B6).

2.3.1 Vitamin B1 (Thiamin)

Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưở ng của tất cả

các tế bào. Thiamin thườ ng đượ c sử dụng vớ i nồng độ biến thiên từ 0,1-10

mg/l. Là một chất bổ sung rất cần cho môi trườ ng nuôi cấy. Khi khử trùng

bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol

là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợ p lại



chúng thành phân tử vit B1. Vì vậy có thể khử trùng môi trườ ng chứa vit B1

bằng autoclauve.

2.3.2. Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin)

Có thể khử trùng bằng nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ. Đối vớ i

nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối vớ i nuôi cấy trong tối có

thể tăng lên 10-50 ppm.

2.3.3. Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin)

Pyridoxine thườ ng đượ c bổ sung vào môi trườ ng nuôi cấy nhưng cũng

không cần thiết cho sự tăng trưở ng của tế bào nhiều loài thực vật. Là tiền chất

của pyridoxal-phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và

transaminase. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau:

Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate

2.3.4. Myo-Inositol (Bios I)

Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó đã đượ c

chứng minh có tác dụng kích thích cho sự tăng trưở ng của tế bào đa số loài

thực vật. Ngườ i ta cho rằng myo-inositol đượ c phân tách ra thành acid

ascorbic và peptine và đượ c đồng hóa thành phosphoinositide và

phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia và tổng hợ p

thành tế bào tế bào. Myo-inositol thườ ng đượ c sử dụng trong môi trườ ng nuôi

cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l. Inosit là chất bền vững

khi khử trùng. Myo-inositol thườ ng đượ c pha chung vớ i dung dịch mẹ của

vitamin. Khi phân tích thành phần của nướ c dừa ngườ i ta thấy sự có mặt của

phân tử inosit.



2.3.5. Biotin (Bios II)

Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô. Chỉ sử dụng ở nồng độ rất

thấp từ 0,001-0,01 ppm.

2.3.6. Acid pantothenic (Bios III, Vit B5)

Đượ c tế bào thực vật sử dụng trong thành phần của coenzyme A. Trong nuôi

cấy một số tế bào thì việc bổ sung vit B5 là không cần thiết.

2.3.7. Các vitamin khác

Nicotinic acid và pyridoxine thườ ng đượ c bổ sung vào môi trườ ng nuôi cấy

nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưở ng của tế bào ở nhiều

loài. Các vitamin khác như folic acid, ascorbic acid, vitamin E (tocophenol), và ρ-

aminobenzoic acid cũng đượ c sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào, đặc biệt khi tế

bào sinh trưở ng ở mật độ quần thể rất thấp. Nói chung, các vitamin này đượ c bổ

sung trong khoảng 0,1-10,0 ppm.

2.4. Các chất hữ u cơ bổ sung (additional organics)

2.4.1. Các amino acid

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợ p tất cả các amino acid cần thiết

nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trườ ng nuôi cấy là để kích thích sự

tăng trưở ng của tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế

bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trườ ng nuôi cấy

tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vậtnguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này

đượ c tế bào hấp thu nhanh hơ n nitrogen vô cơ .



Các nguồn nitrogen hữu cơ thườ ng sử dụng trong môi trườ ng nuôi cấy

tế bào thực vật là hỗn hợ p amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine,

L-asparagine và adenine. Khi amino acid đượ c cung cấp riêng rẽ thì cần phải

cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưở ng của tế bào. Một ví dụ về amino

acid trong môi trườ ng nuôi cấy làm tăng sự tăng trưở ng của tế bào là glysine

2 mg/l, glutamine đến 8 mM, asparagine 100 mg/l, L-arginine và cysteine 10

mg/l và L-tyrosine 100 mg/l. Tyrosine cũng đượ c sử dụng để kích thích sự

phát sinh hình thái trong nuôi cấy tế bào nhưng chỉ nên sử dụng trong môi

trườ ng có agar. Cung cấp adenine sulfate vào môi trườ ng nuôi cấy có thể kích

sự tăng trưở ng của tế bào nuôi cấy và kích thích mạnh sự tạo chồi.

Dựa vào những k ết quả phân tích các hỗn hợ p chất tự nhiên nói trên

nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợ p amino acid nhân tạo

để bổ sung vào môi trườ ng dinh dưỡ ng. Kết quả sử dụng các hỗn hợ p này còn

rất khác nhau, có thể do yêu cầu amino acid của từng loại tế bào là không

giống nhau. Trong môi trườ ng lỏng để nuôi callus lúa và môi trườ ng tái sinh

cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng

2.4.2. Các chất hữu cơ bổ sung có thành phần không xác định (undetermined)

a/ Nướ c dừ a

Công bố đầu tiên về sử dụng nướ c dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van

Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941,1942). Sau đó, tác dụng tích

cực của nướ c dừa trong môi trườ ng nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã đượ c

nhiều tác giả ghi nhận. Nướ c dừa đã đượ c xác định là rất giàu các hợ p chất

hữu cơ , chất khoáng và chất kích thích sinh trưở ng (George, 1993; George,

1996). Nướ c dừa đã đượ c sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi



ở nhiều loài cây. Nướ c dừa thườ ng đượ c lấy từ quả của các giống và cây

chọn lọc để sử dụng tươ i hoặc sau bảo quản. Nướ c dừa đượ c một số công ty

hoá chất bán dướ i dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông thườ ng

nướ c dừa đượ c xử lý để loại trừ các protein, sau đó đượ c lọc qua màng lọc để

khử trùng trướ c khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nướ c dừa không gây

ảnh hưở ng đến sinh trưở ng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tớ i

k ết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể đượ c lọc bỏ hoặc để

lắng dướ i đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn.

Phân tích thành phần của nướ c dừa từ non đến già cho thấy trong nướ c

dừa có:

- Amino acid tự do từ 190,5-685,0 ppm trong nướ c dừa từ non

đến già. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao còn lại khoảng 70 ppm.

- Amino acid trong protein.

- Acid hữu cơ .

- Đườ ng.

- RNA và DNA .

Ngoài ra, nướ c dừa còn chứa các hợ p chất quan trọng đối vớ i tế

bào nuôi phân lập như:

- myo-inositol.

- Các hợ p chất có hoạt tính auxin.

- Các cytokinin dạng glycoside.

Nướ c dừa thườ ng đượ c sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v).

b/ Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)



Vớ i dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua

trong ống nghiệm kéo dài vô thờ i hạn. Thành phần hóa học của dịch nấm men ít

đượ c chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đườ ng, nucleic acid, amino acid, vitamin,

auxin, muối khoáng. Tác dụng của YE vớ i rễ rất tốt nhưng vớ i callus thì không

rõ ràng.

c/ Bột chuối

Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh đượ c sử dụng trong

nuôi cấy mô một số cây trồng như phong lan, dứa. Hàm lượ ng sử dụng vào

khoảng 40g bột khô/l. Để tránh đóng cục, cần bổ sung bột vào dung dịch một

cách từ từ rồi khuấy đều. Nướ c chiết từ khoảng 100 g thịt quả chuối xanh

cũng đượ c sử dụng bổ sung vào môi trườ ng.

d/ Một số hỗn hợ p dinh dưỡ ng hữ u cơ phứ c tạp khác

Nướ c cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha,

casein thuỷ phân (casein hydrolysate, thườ ng đượ c sử dụng vớ i nồng độ 0,05-

0,1%) cũng đượ c sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan

nuôi cấy. Ảnh hưở ng rõ rệt của các hợ p chất này tùy thuộc vào đối tượ ng.

2.4.3. Than hoạt tính (active choral)

Than hoạt tính nói chung ảnh hưở ng trên 3 mặt: hút các hợ p chất độc,

hút các chất điều hòa sinh trưở ng hoặc tạo độ tối cho môi trườ ng. Ngườ i ta

cho rằng tác dụng cản sự tăng trưở ng của mô cấy khi có sự hiện diện của than

hoạt tính trong môi trườ ng là do nó hút chất điều hòa sinh trưở ng có trong

môi trườ ng. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP liên k ết vớ i than hoạt tính. Khả

năng kích thích sự tăng trưở ng của than hoạt tính là do nó k ết hợ p vớ i các



hợ p chất phenol độc tiết ra trong thờ i gian nuôi cấy. Than hoạt tính thườ ng

đượ c bổ sung vào môi trườ ng vớ i nồng độ 0,5-3% (w/v). Bổ sung AC vào

môi trườ ng nuôi cấy đã kích thích sinh trưở ng và phân hóa ở các loài hoa lan,

cà rốt, dây thườ ng xuân và cà chua. Tuy nhiên, nó lại gây ức chế ở thuốc lá,

đậu tươ ng và các loài thuộc chi Camellia. Nói chung AC đượ c rửa acid và

trung hòa trướ c khi bổ sung vào môi trườ ng.

2.4.4. Chất làm rắn môi trườ ng (soliding)

Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel đượ c sử dụng phổ biến để chuẩn bị

các môi trườ ng nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid).Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trườ ng và chết do

thiếu oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưở ng trong điều kiện t ĩ nh

(static conditions). Điều thuận lợ i khi làm việc vớ i các hợ p chất tạo gel nhân

tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tươ ng đối thấp (1,25-2,5 g/L)

và nó có thể giúp phát hiện sự nhiễm bẩn đượ c phát triển trong suốt thờ i gian

nuôi cấy. Các mẫu vật sinh trưở ng tốt hơ n trên agar hoặc các tác nhân tạo giá

thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau.

Agar là một loại polysaccharide thu đượ c từ một số loài tảo (ngành tảo

đỏ-Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơ n các tác nhân tạo gel khác. Trướ c

tiên, gel của agar không phản ứng vớ i các thành phần của môi trườ ng. Thứ

hai, chúng không bị thủy phân bở i các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định

ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy đượ c tiến hành. Bình thườ ng, từ 0,5-1% agar

đượ c dùng trong môi trườ ng để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi

trườ ng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh

dưỡ ng, việc sử dụng agar đượ c tránh bở i vì agar thươ ng phẩm không sạch do



có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy

nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể đượ c loại bỏ bằng cách rửa agar vớ i

nướ c cất hai lần ít nhất là 24 giờ , tráng trong cồn và làm khô ở 60oC trong 24

giờ . Nói chung, ở 80oC agar ngậm nướ c chuyển sang trạng thái sol và ở 40oC

trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nướ c của agar cao từ 6-12 g/L nướ c.

Gelatin ở nồng độ cao (8-10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn

chế sử dụng bở i vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC). Các hợ p chất khác

đã đượ c thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-

rite. Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một loại agarose đượ c tinh

sạch cao gọi là Sea Plaque(k), loại này có thể đượ c dùng để phục hồi các

protoplast đơ n (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ

(perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter

paper wick), bọt polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester

(polyester fleece) là các phươ ng thức thay đổi giá thể đượ c dùng trong môi

trườ ng nuôi cấy mô hoặc tế bào.

2.4.5. Các chất kháng sinh (antibiotics)

Bổ sung các kháng sinh vào môi trườ ng nuôi cấy nói chung thườ ng

đượ c tránh do sự hiện diện của chúng trong môi trườ ng làm chậm sinh trưở ng

của mô và tế bào. Tuy nhiên, một số tế bào thực vật bị nhiễm một cách hệ

Cellophane đục lỗ Gelatin thươ ng mại Agar thươ ng mại



thống các vi sinh vật. Để ngăn chặn sinh trưở ng của bọn vi sinh vật này, điều

không thể thay thế là làm giàu môi trườ ng bằng kháng sinh. Streptomycin

hoặc kanamycin ở nồng độ thấp kiểm soát hiệu quả hiện tượ ng nhiễm có tính

hệ thống và môi trườ ng đượ c bổ sung các kháng sinh này không gây bất lợ i

cho sự sinh trưở ng của tế bào nuôi cấy.

2.5. Các chất điều khiển sinh trưở ng thự c vật (Plant growth regular)

Trong môi trườ ng nuôi cấy mô và tế bào thực vật thành phần phụ gia

quan trọng nhất quyết định k ết quả nuôi cấy là các chất điều khiển sinh

trưở ng. Có bốn nhóm chất điều khiển sinh trưở ng chung đó là auxin,cytokinin, gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng

trong nuôi cấy mô. Sự sinh trưở ng, phân hóa và phát sinh cơ quan của mô

nuôi cấy trở nên thuận lợ i chỉ khi bổ sung một hoặc một số chất thuộc bốn

nhóm trên vào môi trườ ng nuôi cấy. Tuy vậy, yêu cầu đối vớ i những chất này

thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượ ng chất điều hòa sinh trưở ng

nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưở ng thực vật đượ c chia thànhcác nhóm chính sau đây:

2.5.1. Auxin (hormone sinh trưở ng)

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưở ng thực vật đượ c sử dụng thườ ng

xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các auxin khác nhau thườ ng sử

dụng trong nuôi cấy mô tế bào là: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-

naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là

auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các

auxin nhân tạo, thườ ng thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơ n vì do



đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase)

không có tác dụng. Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào

thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic

acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-

chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid

(picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba).

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia và kéo dài tế bào.

Đối vớ i nuôi cấy mô tế bào, auxin đã đượ c sử dụng cho việc phân chia, phân

hóa tế bào và phân hóa rễ. Trong số các auxin, IAA, IBA và NAA chủ yếu sử

dụng cho môi trườ ng ra rễ và phối hợ p vớ i cytokinin sử dụng cho môi trườ ng

ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối vớ i môi trườ ng tạo và phát triển

callus, phát sinh phôi vô tính.

Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn

chưa đượ c biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã

cung cấp những k ết quả mớ i thú vị. Trong những năm qua, một số gen mã

hóa cho các protein liên k ết auxin (auxin binding proteins) đã đượ c tạo dòng

(cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mớ i về gen cảm

ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu đượ c. Auxin có tác dụng hoạt

hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưở ng lên các

enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào

trong phản ứng vớ i áp suất trươ ng. Auxin cũng có ảnh hưở ng ở mức độ biểu

hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ.

Việc quyết định sử dụng loại và nồng độ auxin trong môi trườ ng nuôi

cấy phụ thuộc vào:



- Kiểu tăng trưở ng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượ ng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợ p auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin

Nói chung, các auxin đượ c hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong

NaOH loãng.

2.5.2. Cytokin (hormone phân bào)

Cytokinin là các dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan

chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi

trong nuôi cấy mô. Các cytokinin đượ c sử dụng thườ ng xuyên nhất là 6-

benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6---dimethyl-

aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-

(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là

các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Một số

hợ p chất đượ c phát hiện trong thờ i gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin

là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl

urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea. Cytokinin liên quan

tớ i sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v…

Trong môi trườ ng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào

và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, tạo chồi bất định, gây tạo

phôi vô tính, tăng cườ ng phát sinh chồi phụ, ức chế sự hình thành rễ,…Cơ

chế hoạt động của cytokinin là chưa đượ c biết rõ ràng mặc dù có một số k ết



quả về sự có mặt của các hợ p chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận

chuyển (transfer RNA). Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợ p RNA, tăng

hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định.

Tươ ng tự như auxin, việc bố sung cytokine vào môi trườ ng nuôi cấy phụ

thuộc vào: kiểu tăng trưở ng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượ ng auxin nội

sinh của mẫu cấy, khả năng tổng hợ p auxin tự nhiên của mẫu cấy, sự tác động qua

lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh, đặc tính của auxin. Tuy nhiên, cần chú

ý tỉ lệ cytokin/auxin. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối vớ i sự phát sinh hình

thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. Đối vớ i sự phát sinh phôi

(embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trườ ng hợ p ngượ c lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn đề quan trọng

không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưở ng này. Chẳng hạn

2,4-D cùng vớ i BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis

nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2

trườ ng hợ p tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1.

Đặc tính của một số cytokine thườ ng sử dụng:

Điều khiển nuôi cấy in vitro



- Kinetin đượ c phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mớ i sau

khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống không có kinetin

tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy,

nhưng nếu phối hợ p xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợ p thì sẽ kích thích

quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa.

- Tươ ng tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin.

Letham là ngườ i đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho k ết tinh thành công

hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Trong

thực tiễn nuôi cấy mô ngườ i ta chỉ dùng zeatin trong những trườ ng hợ p đặc biệt

vì giá thành rất đắt, thườ ng thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm

tổng hợ p nhân tạo khác.

- 6-Benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-Benzylamino (BAP): Hoạt lực của

BAP cao hơ n nhiều so vớ i kinetin và bản thân BAP bền vững hơ n zeatin dướ i

tác động của nhiệt độ cao. BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm

thứ cấp và tăng kích thướ c của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của

hạt và quá trình trao đổi chất. Nồng độ thườ ng sử dụng (0.5-10mg/l) cho các

mục đích khác nhau.

2.5.3. Giberillin

Gibberellin đượ c phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện

nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi ngườ i Nhật nói về bệnh lúa von. Năm

1926, xác định đượ c bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến

những năm 30, mớ i phân lập và tinh chế đượ c hoạt chất, đượ c gọi là

gibberellin. Mãi sau chiến tranh thế giớ i thứ II năm 1950, ngườ i Anh và

ngườ i Mỹ mớ i biết đến công trình này của ngườ i Nhật. Tớ i nay, ngườ i ta đã



Ảnh hưở ng kéo dài chồi của Gebberellin

phát hiện đượ c trên 120 loại thuộc nhóm gibberellic acid, nhưng chỉ có một

số loại gibberellic acid là có hoạt tính sinh lí như: GA1, GA3, GA4, GA7

Trong đờ i sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối

vớ i nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát

triển của hoa, làm tăng sinh trưở ng chiều dài của thực vật. Trong nuôi cấy mô

và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác

giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi

trườ ng chuyên dụng nào đó. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của

phôi vô tính. So vớ i auxin và cytokinin, gibberellin ít khi đượ c sử dụng hơ n.

GA3 có tính hoà tan trong nướ c.

Leaf buds of Japanese pear were collected in early June and early

November and regarded as summer and winter dormant buds, respectively.

Bud explants with and without scales were prepared from each of them, and

cultured in vitro for 75 days at 25°C with 14 h photoperiod, on a medium



either without growth regulators, or supplied with BA and GAs (GA3 and

GA4+7), singly or in combination.

When either BA or GA4+7 was contained in the medium, bud

expansion occurred. Thereafter, summer dormant buds grew into shoots in

the presence of BA, while winter dormant buds, although they swelled

profusely, remained in a rosette. In the presence of BA, GA4+7 markedly

stimulated shoot elongation of summer dormant buds, but GA3 did not. In

winter dormant buds, GA4+7 not only failed to stimulate shoot elongation,

but also interfered with the BA-induced swelling described above.

The presence of bud scales delayed expansion of summer dormant

buds, while it had little effect on winter dormant buds. The delaying effect of

scales on expansion of summer buds was effectively removed by application

of GA4+7 to the medium.( Teruhisa Yotsuya1 et al, Department of

Agriculture, Kobe University, Kobe, Japan.

2.5.5. Absicis acid

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưở ng tự nhiên gây ra sự ngủ

nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng.

ABA còn có tác dụng tăng cườ ng khả năng chống chịu của tế bào thực vật

đối vớ i điều kiện ngoại cảnh bất lợ i, vì vậy ABA đượ c đưa vào môi trườ ng

nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định. Trong một số nghiên cứu, khi bổ

sung ABA vào môi trườ ng nuôi cấy mô và tế bào, ngườ i ta nhận thấy rằng

ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự

phát sinh chồi ở nhiều loài thực vât.



Abscisic acid (ABA) inhibits in vitro growth of cotton (Gossypium

hirsutum L.) fiber and is effective only when applied during the first four

days of culture started on the day of anthesis. Abscisic acid causes a small

increase in potassium uptake by the ovules and also enhances leakage of

potassium from them. During their period of rapid growth, fibers produced by

ABA-treated ovules have a higher potassium content and a lower malate

content as compared to fibers on untreated control ovules. Results are

discussed in the light of earlier reports on the in vitro growth of cotton fiber

and effects of abscisic acid on other plant tissues. It is suggested that ABA

inhibits fiber growth, in part, by interfering with malate metabolism.( R. S.

Dhindsa et al)

2.6. Độ pH của môi trườ ng

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưở ng và phát triển trong

nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trườ ng, pH có thể đượ c điều chỉnh đến giá trị cần

thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưở ng đến sự độ linh động của các ion và ảnhhưở ng trực tiếp tớ i quá trình thu nhận các chất dinh dưỡ ng từ môi trườ ng vào tế

bào. Đối vớ i hầu hết các môi trườ ng nuôi cấy pH = 5,0-6,0 trướ c khi khử trùng

đượ c xem là tối ưu. Độ pH cao hơ n sẽ làm cho môi trườ ng rất rắn trong khi pH

thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trườ ng nuôi cấy nghèo

đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự dao động này có thể gây bất lợ i cho

thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưở ng của các tế bào đơ n hoặc các quần

thể tế bào ở mật độ thấp. Nuôi cấy callus của nhiều loài cây, pH ban đầu thườ ng là

5,5-6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt đượ c giá trị từ 6,0-6,5. Đặc biệt khi sử dụng các

loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định

phải phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trườ ng về từ 5,5-6,5.



Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơ n hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH

là bắt buộc.

2.7. Một số loại môi trườ ng cơ bản

Thành phần cơ bản của một số loại môi trườ ng nuôi cấy mô và tế bào thực

vật đượ c trình bày trong bảng 2.1. Môi trườ ng Murashige-Skoog (MS) là một trong

những loại môi trườ ng đượ c sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào

thực vật. Môi trườ ng MS thích hợ p cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm.

Tớ i nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trườ ng MS trên cơ sở công thức gốc

do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trườ ng B5 đượ c thiết k ế đầu tiên

cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó đượ c cải tiến và

trở thành môi trườ ng thích hợ p cho nuôi cấy protoplast. Môi trườ ng này cũng đượ c

sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trườ ng Chu (N6) là loại môi trườ ng rất

hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, đượ c phát triển đặc biệt cho nuôi cấy

bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi

trườ ng đượ c phát minh bở i Nitsch (1969) vẫn đượ c dùng phổ biến hơ n. Môi trườ ng

Nitsch ngày càng thích hợ p và phổ biến trong nuôi cấy cây đậu tươ ng, cỏ ba lá đỏ

(red clover) và các loài legume khác. Thành phần dinh dưỡ ng của môi trườ ng này

đã giúp tăng sinh trưở ng của tế bào trong quá trình phát sinh phôi và nuôi cấy

protoplast.

Thành phần hoá học của môi trườ ng đóng vai trò quyết định đối vớ i thành

công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các

kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn,

hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trườ ng. Khi bắt đầu

nuôi cấy mô một loài mớ i hoặc một giống mớ i, cần phải lựa chọn cho đối tượ ng

nghiên cứu một loại môi trườ ng cơ bản phù hợ p. Cho đến nay, các nhà khoa học đã

tạo ra một số lượ ng rất lớ n các môi trườ ng thích hợ p vớ i từng đối tượ ng và mục



tiêu nghiên cứu. Để thuận tiện cho việc sử dụng môi trườ ng trong nuôi cấy, căn cứ

trên nguồn gốc khoáng dinh dưỡ ng ngườ i ta chia môi trườ ng nuôi cấy thành 3

nhóm: giàu dinh dươ ng, dinh dưỡ ng trung bình và nghèo dinh dưỡ ng. Đối vớ i các

nuôi cấy khở i đầu cho các đối tượ ng mớ i thì lờ i khuyên đượ c đưa ra là nên lựa

chọn môi trườ ng giàu dinh dưỡ ng.

Bảng….: M ột số môi tr ườ ng cơ bản thườ ng đượ c sử d ụng trong nuôi cấ y mô và t ế

bào thự c vật.

Thành phần Murashige

& Skoog

(1962)

White

(1963)

Gamborg

(1968)

Nitsch

(1951)

Heller

(1953)

Schenk

&

Hildeb

(1972)

Nitsch

&

Nitsch

(1967)

Kohlenb

ach &

Schmidt

(1975)

Knop

(1865)

(NH4)

2SO

4 - - 134 - - - - - -

MgSO4.7H2O 370 720 500 250 250 400 125 185 250

Na2SO

4 - 200 - - - - - - -

KC1 - 65 - 1,500 750 - - - -

CaC122H

2O 440 - 150 25 75 200 - 166 -

NaNO3 - - - - 600 - - - -

KNO3 1,900 80 3,000 2,000 - 2,500 125 950 250

Ca(NO3)

2.4H

2O - 300 - - - - 500 - 1,000

NH4NO

3 1,650 - - - - - - 720 -

NaH2PO

4.1H

2O - 16.5 150 250 125 - - - -

NH4H

2PO

4 - - - - - 300 - - -

KH2PO

4 170 - - - _ - 125 68 250

FeSO4.7H

20) 27.8 - 27.8 - - 15 27.85 27.85 -

Na2EDTA 1 - 37.3 - - 20 37.25 37.25 -



MnSO4.4H

2O 22.3 7 10 (1 H

2O) 3 0.1 10 25 25 -

ZnSO4ì

7H2O 8.6 3 2 0.5 1 0.1 10 10 -

CuSO4ì

5H2O 0.025 - 0.025 0.025 0.03 0.2 0.025 0.025 -

H2SO

4 - - - 0.5 - - - - -

Fe2(SO

4)3 - 2.5 - - - - - - -

NiC12ì

6H2O - - - - 0.03 - - - -

CoC12ì

6H2O 0.025 - 0.025 - - 0.1 0.025 - -

A1C13 - - - - 0.03 - - - -

FeC13ì

6H2

O - - - - 1 - - - -

FeC6O

5H

7ì5H

2O - - - 10 - - - - -

K1 0.83 0.75 0.75 0.5 0.01 1.0 - - -

H3BO

3 6.2 1.5 3 0.5 1 5 10 10 -

Na2M

0O

4ì2H

2O 0.25 - 0.25 0.25 - 0.1 0.25 0.25 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Nguyễ n Đứ c Thành, 2000, Nuôi cấ y mô tế bào thự c vậ t nghiên cứ u và ứ ng

d ụ ng , Nhà xuấ t bản nông nghiệ p Hà N ội

2. Lê V ăn Hoàng, 2005. Công nghệ nuôi cấ y mô tế bào thự c vậ t , Nhà xuấ t bản

Khoa học k ĩ thuật Hà N ội



3. Hobbie L, Timpte C, Estelle M. 1994. Molecular Genetics of Auxin and

Cytokinin. Plant Molecular Biology, 26: 1499- 1519.

4. Razan MK. 1994. An Introduction to Plant Tissue Culture. Oxford & IBH

Publishing Co. Pvt. Ltd. New Delhi.

5. Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Plant tissue culture concepts and laboratory

exercises. CRC Press, New York.

6. T. Dennis Thomas,2008 . The role of activated charcoal in plant tissue culture ,

Research Department of Botany, St. Thomas College, Pala, Arunapuram (P.O),

PIN-686574, Kottayam (Dt), Kerala, India

7. Nguyễ n Thị Kim Thanh và cs, 2005. Giáo trình Sinh lý thự c vậ t , NXB Hà N ội

8. Blizzard, W. E., and Boyer, J. S.,1980. Comparative resistance of the

soil and the plant to water transport. Plant Physiol.

9. Bohnert, H. J., Ostrem, J. A., and Schmitt, J. M., 1989. Changes in

gene expression elicited by salt stress in Mesembryanthemum

crystallinum. In Environmental Stress in Plants, J. H. Cherry, ed.,

Springer, Berlin.

Documents

Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat