EFECTO DEL Zn2+ ,Mg2+ ,Cu2+ Y Fe2+ SOBRE LA BIOSNTESIS DE AMILOGLUCOSIDASA GENERADA POR ASPERGILLUS NIGER EN

FERMENTACIN SLIDA Y SUMERGIDA

POR: CARLOS EDUARDO DELGADO SIERRA.

LABORATORIO DE BIOQUMICA. GRUPO DE INVESTIGACIN DE BIOQUMICA E INGENIERA DE

PROTENAS.

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER BUCARAMANGA

COLOMBIA 2006

EFECTO DEL Zn2+ ,Mg2+ ,Cu2+ Y Fe2+ SOBRE LA BIOSNTESIS DE AMILOGLUCOSIDASA GENERADA POR ASPERGILLUS NIGER EN

FERMENTACIN SLIDA Y SUMERGIDA

POR: CARLOS EDUARDO DELGADO SIERRA.

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARA OPTAR AL TITULO DE QUMICO.

DIRIGIDO POR: RODRIGO GONZALO TORRES SEZ PROFESOR ESCUELA DE QUMICA.

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER BUCARAMANGA

COLOMBIA 2006

Nota de aceptacin.

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FIRMA DE DIRECTOR

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FIRMA DEL JURADO

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FIRMA DEL JURADO

DEDICATORIA

A mi madre, mi padre, y en general toda

mi familia, a todos los profesores y

amigos que estuvieron presentes en las

buenas y malas de mi proceso de

formacin profesional

AGRADECIMIENTOS

A mis padres, por todo el apoyo recibido durante estos aos de mi vida acadmica.

A los calificadores por acompaarme en el proceso de evaluacin.

A todos y cada uno de los amigos reales que con todo lo que tuvieron a su alcance

me colaboraron y apoyaron, de los cuales me llevo muy buenos recuerdos.

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIN ............................................................................................................ 1 2. MARCO TERICO ......................................................................................................... 3

2.1 MARCO DE ANTECEDENTES ............................................................................. 3 2.2 HONGOS ................................................................................................................... 4

2.2.1 ASPERGILLUS NIGER ................................................................................... 5 2.3 ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLGICOS ....................................... 6

2.3.1 LA GLUCOAMILASA (GA) ............................................................................. 9 2.3.1.1 Estructura .................................................................................................. 9 2.3.1.2 Mecanismo de accin ........................................................................... 11

2.4 SUSTRATO ............................................................................................................. 12 2.5 MODALIDADES DE CULTIVO DE A. NIGER. ................................................. 12 2.6 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES............................................................. 14 2.7 CINTICA DE CRECIMIENTO ............................................................................ 16

3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 18 3.1 Objetivo General ................................................................................................... 18 3.2 Objetivos Especficos ......................................................................................... 18

4. MATERIALES Y MTODOS ...................................................................................... 19 4.1 MATERIALES ......................................................................................................... 19

4.1.1 REACTIVOS .................................................................................................... 19 4.1.2 SUSTRATO...................................................................................................... 19 4.1.3 ENZIMAS.......................................................................................................... 19

4.2 MTODOS............................................................................................................. 19 4.2.1 METODOLOGA ............................................................................................. 19 4.2.2 PREPARACIN DEL PREINCULO ......................................................... 19 4.2.3 SOLUCIN DE ESPORAS ........................................................................... 20 4.2.4 MEDIO SLIDO .............................................................................................. 20 4.2.5 MEDIO LQUIDO ............................................................................................. 21 4.2.6 EFECTO DE LA COMBINACIN DE IONES EN LA PRODUCCIN DE GLUCOAMILASA ..................................................................................................... 22 4.2.7 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA ............................ 22 4.2.8 ANALISIS DE LA GLUCOSA....................................................................... 23 4.2.9 DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES ....................................... 23

5. RESULTADOS Y DISCUSIN................................................................................... 25 5.1 PRODUCCIN DE GLUCOAMILASA POR FERMENTACION SLIDA .... 25

5.1.1 CINTICA DE CRECIMIENTO PARA EL MEDIO SLIDO.................... 25 5.1.2 PRODUCCIN DE GLUCOAMILASA POR FERMENTACIN SUMERGIDA ............................................................................................................. 26

5.2 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA ................................... 27 5.2.1 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA PARA LA FERMENTACIN EN MEDIO SLIDO ................................................................ 27

5.2.1.1 Medio slido suplementado con Mg+2.............................................. 28

5.2.1.1.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Mg+2............................................................................................................. 28 5.2.1.1.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Mg+2............................................................................................................. 29

5.2.1.2 Medio slido suplementado con Zn+2 .............................................. 30 5.2.1.2.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Zn+2.............................................................................................................. 30 5.2.1.2.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Zn+2.............................................................................................................. 30

5.2.1.3 Medio slido suplementado con Fe+2............................................... 31 5.2.1.3.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Fe+2.............................................................................................................. 31 5.2.1.3.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Fe+2.............................................................................................................. 32

5.2.1.4 Medio slido suplementado con Cu+2 .............................................. 33 5.2.1.4.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Cu+2 ............................................................................................................. 33 5.2.1.4.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Cu+2 ............................................................................................................. 34

5.2.2 IONES Y CONCENTRACIN PTIMA PARA EL MEDIO SLIDO.... 34 5.2.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA PARA LA FERMENTACIN EN MEDIO SUMERGIDO ....................................................... 35

5.2.3.1 Medio lquido suplementado con Fe+2 ............................................. 35 5.2.3.1.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Fe+2.............................................................................................................. 35 5.2.3.1.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Fe+2.............................................................................................................. 36

5.2.3.2 Medio lquido suplementado con Cu+2............................................. 37 5.2.3.2.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Cu+2 ............................................................................................................. 37 5.2.3.2.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Cu+2 ............................................................................................................. 38

5.2.3.3 Medio lquido suplementado con Zn+2 ............................................. 38 5.2.3.3.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Zn+2.............................................................................................................. 38 5.2.3.3.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Zn+2.............................................................................................................. 39

5.2.3.4 Medio lquido suplementado con Mg+2 ............................................ 40 5.2.3.4.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Mg+2............................................................................................................. 40 5.2.3.4.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Mg+2............................................................................................................. 41

5.2.4 IONES Y CONCENTRACIN PTIMA PARA EL MEDIO LQUIDO ....... 42 5.3 MEZCLA DE IONES EN EL FERMENTADOR ................................................. 42

5.3.1 EVALUACIN DEL EFECTO DE LA MEZCLA DE IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ...................................................................................... 44 5.3.2 ACTIVIDAD ESPECFICA PARA EL MEDIO SLIDO SUPLEMENTADO CON LA MEZCLA DE IONES.............................................. 44 5.3.3 ACTIVIDAD ESPECFICA PARA EL MEDIO LQUIDO SUPLEMENTADO CON LA MEZCLA DE IONES.............................................. 45

5.4 IONES METLICOS COMO COFACTORES ENZIMTICOS....................... 46 5.5 EVALUACIN DEL EFECTO DE LA HUMEDAD PARA EL MEDIO SLIDO .......................................................................................................................... 47 5.6 PRODUCCIN DE BIOMASA EN EL FERMENTADOR LQUIDO .............. 47

6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 50 7. RECOMENDACIONES................................................................................................ 52 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................. 53 ANEXOS ............................................................................................................................. 58

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. rbol filogentico de Aspergillus (18), mostrando las 7 subfamilias de

hongos productores de la glucoamilasa............ 5

Esquema 2. Colonia de Aspegillus niger 6

Esquema 3. Postulado estructural de la glucoamilasa de Aspergillus niger...10

Esquema 4. Dominio cataltico de la glucoamilasa... 10

Esquema 5. Mecanismo de accin para la glucoamilasa................ 11

LISTADO DE FIGURAS

Figura 1. Cintica de produccin de la amiloglucosidasa por A.niger en medio slido....25 Figura 2. Cintica de produccin de la amiloglucosidasa por A.niger en medio lquido......26 Figura 3. Cintica para la produccin de biomasa en medio lquido..27 Figura 4. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger... 28 Figura 5. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo

slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger...29 Figura 6. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger .. 30 Figura 7. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger 31 Figura 8. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger .. 31 Figura 9. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger . 32 Figura 10. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger .. 33 Figura 11. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger . 34 Figura 12. Ion y concentracin optima para el medio slido.35

Figura 13. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger .36

Figura 14. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger .36

Figura 15. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger .....................................................................................37

Figura 16. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de

A.niger ......38 Figura 17. . Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo

lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger ......39 Figura 18 Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger ......39 Figura 19. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger ..40

Figura 20. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger ..41

Figura 21. Ion y concentracin optima para el medio lquido.42 Figura 22. Actividad especfica para el medio slido suplementado con la mezcla

de iones44 Figura 23. Actividad especfica para el medio lquido suplementado con la mezcla

de iones..45

Figura 24. Porcentaje de humedad para el medio slido47

Figura 25. Promedio de la produccin de biomasa en el fermentador lquido para cada ion.48

Figura 26. Curva de calibracin para la determinacin de glucosa utilizando el mtodo del DNS .58

Figura 27. Curva de calibracin para determinar la concentracin de protenas por

el mtodo de Bradford.59

LISTADO DE TABLAS

Tabla 1. Clasificacin cientfica del Aspergillus niger... 5 Tabla 2. Clasificacin de las enzimas segn su funcin.8 Tabla 3. Ion, concentracin y actividad enzimtica para la fermentacin en medio slido...43 Tabla 4. Ion, concentracin y actividad enzimtica para la fermentacin en medio lquido..43

Tabla 5. Combinacin de iones.. 43 Tabla 6. Absorbancias promedio para la extraccin del medio slido suplementado con Mg+2.. 60 Tabla 7. Absorbancias promedio para la extraccin del medio slido suplementado con Zn+2... 60 Tabla 8. Absorbancias promedio para la extraccin del medio slido suplementado con Fe+261 Tabla 9. Absorbancias promedio para la extraccin del medio slido suplementado con Cu+2.61 Tabla 10. Absorbancias promedio para la extraccin del medio lquido suplementado con Fe+2.. 62 Tabla 11. Absorbancias promedio para la extraccin del medio lquido suplementado con Cu+2... 62 Tabla 12. Absorbancias promedio para la extraccin del medio lquido suplementado con Zn+2.. 63

Tabla 13. Absorbancias promedio para la extraccin del medio lquido suplementado con Mg+2.. 63 Tabla 14. Absorbancias promedio para la extraccin del medio slido suplementado con la mezcla de iones. 64 Tabla 15. Absorbancias promedio para la extraccin del medio lquido suplementado con la mezcla de iones. 64 Tabla 16. Porcentaje de humedad para el medio slido suplementado con Mg+2.. 65 Tabla 17. Porcentaje de humedad para el medio slido suplementado con Zn+2... 65 Tabla 18. Porcentaje de humedad para el medio slido suplementado con Fe+2... 66 Tabla 19. Porcentaje de humedad para el medio slido suplementado con Cu+2.. 66 Tabla 20. Cantidad de biomasa seca producida en el cultivo lquido suplementado con Mg+2..67 Tabla 21. Cantidad de biomasa seca producida en el cultivo lquido suplementado con Zn+2...67 Tabla 22. Cantidad de biomasa seca producida en el cultivo lquido suplementado con Cu+2...68 Tabla 23. Cantidad de biomasa seca producida en el cultivo lquido suplementado con Fe+2... .68

TITULO

EFECTO DEL Zn2+ ,Mg2+ ,Cu2+ Y Fe2+ SOBRE LA BIOSNTESIS DE AMILOGLUCOSIDASA GENERADA POR ASPERGILLUS NIGER EN FERMENTACIN SLIDA Y SUMERGIDA *

Autor: Carlos Eduardo Delgado S. **

Palabras claves: Aspergillus niger, amiloglucosidasa, fermentacin slida, fermentacin sumergida

En este proyecto se recopilo evidencia cualitativa como cuantitativa sobre el efecto de 4 iones metlicos (Fe+2, Zn+2, Mg+ y Cu+2) sobre la biosntesis de la amiloglucosidasa generada por la especie Aspergillus niger utilizando fermentacin slida y sumergida.

La actividad del extracto enzimtico fue determinada con el mtodo del DNS a diferentes tiempos de reaccin. La cantidad de protena se cuantific utilizando el mtodo de BRADFORD. El porcentaje de humedad se determino utilizando el peso del medio slido hmedo y seco.

Las concentraciones ptimas para el medio slido son: Mg+2 2 ppm, Cu+2 250 ppm, Zn+2 2ppm y Fe+2 10 ppm. Para el medio lquido las condiciones ptimas son: Mg+2 250 ppm, Zn+2 2 ppm, Fe+2 250 ppm y Cu+2 10 ppm.

La adicin de mezclas de iones en los fermentadores lquido y slido desactivan la enzima producida haciendo que la actividad cataltica disminuya.

*Proyecto de grado **Facultad de ciencias. Escuela de qumica. Director: Dr. Rodrigo Torres Saez.

TITLE

Zn2+, Mg2+, Cu2+ Y Fe2+ EFFECT OVER THE BIOSYNTHESIS OF

AMILOGLUCOSIDASE GENERATED BY THE ASPERGILLUS NIGER IN SOLID AND SUBMERGED FERMENTATION.*

Author: Carlos Eduardo Delgado S. **

Keywords:

Aspergillus niger, amiloglucosidase, solid fermentation, submerged fermentation.

In this project qualitative and quantitative evidence of the four metallic ions was compiled (Fe2+, Zn2+, Mg2+ y Cu2+) over the biosynthesis of the amiloglucosidase generated by the Aspergillus niger species using solid and submerged fermentation.

The enzymatic extract activity was determined with the DNS method in different reaction times. The quantity of protein was quantized using the BRADFORD method. The humidity percentage was determined using the solid, humid and dry environment weight.

The optimums concentrations to the solid environment are: Mg2+ 2 ppm, Cu2+ 250 ppm, Zn2+ 2ppm y Fe2+ 10 ppm. The optimums concentrations to the liquid environment are: Mg+2 250 ppm, Zn2+ 2 ppm, Fe2+ 250 ppm y Cu2+ 10 ppm.

The addition of the mixing ions in the liquid and solid fermenters deactivate the enzyme produced, making the catalytic activity decrease.

* Project of degree ** Faculty of sciences. School of chemistry: Dr. Rodrigo Torres Saez.

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1. INTRODUCCIN

El Aspergillus es un gnero que comprende ms de 200 especies de hongos, de tipo filamentoso y que est compuesto de cadenas de clulas llamadas hifas. Fue catalogado por primera vez por el cientfico italiano P Micheli en 1929 [Al Mussallam, 1980]; reside habitualmente en sitios de compostaje y en el heno. En este estudio se trabaj con la especie Aspergillus niger, la cual es cultivada en general para ser utilizado en la produccin de acido glucnico, acido ctrico y de enzimas como la glucoamilasa y galactosidasa [Pandey et al., 2000].

La enzima glucoamilasa o [-(1,4)-D- glucan glucohidrolasa] fue descubierta en 1951 y es conocida a nivel industrial como amiloglucosidasa [Phillips, 1951]. Entre otras reacciones, esta enzima cataliza la hidrlisis de los enlaces -(1,4) de los azcares [Pandey, 1995], propiedad que es utilizada generalmente en procesos de la industria alimenticia y textil [Selvakumar et al, 1996].

A nivel estructural la glucoamilasa est constituida por tres dominios estructurales principales [Kramer, 1993]; un dominio cataltico donde se llevan a cabo las reacciones de gluclisis (utilizando los residuos aminocdicos del cido glutmico 147 y 400), un dominio de unin al almidn y un puente aminoltico que une ambos dominios [Jhon R, 2002]. La glucoamilasa presenta su mximo de actividad a una temperatura de 50C y un pH de 4.3 - 4.5, do nde casualmente son ms estables los productos de gluclisis del almidn como la glucosa y otros malto-oligosacridos [Gregg L.F, 2001].

En este trabajo se obtuvo la enzima cultivando el Aspergillus niger bajo dos modalidades de cultivo, fermentacin en estado slido y sumergida, cultivando el hongo bajo condiciones ptimas de temperatura y pH, y usando un medio de cultivo con fuentes de carbono, nitrgeno, agua y sales. Adems, se adicionaron los iones Zn+2, Fe+2 Cu+2 y Mg+2 en diferentes concentraciones y relaciones de

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adicin al medio de cultivo, para evaluar su efecto en la biosntesis de la enzima [Yusuka y Morita, 1996].

Se utilizaron los iones, Fe2+,Zn2+ ,Mg2+ y Cu2+, ya que en estudios previos realizados con el microorganismo Rhizopus sp A-11 (Fujio y Morita, 1996) se utilizaron 14 iones metlicos diferentes, los cuales mostraron un efecto significativo sobre la produccin de la glucoamilasa. En este caso, se espera un efecto similar sobre la especie de trabajo, A niger.

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2. MARCO TERICO

2.1 MARCO DE ANTECEDENTES Pandey, es quizs uno de los cientficos ms aventajados en lo que se refiere a pruebas de medios de cultivo con microorganismos (1994). En 1995 prob la fermentacin en medio slido usando como sustrato residuos de copra, alcanzando un 70% de la produccin de glucoamilasa, en comparacin con el salvado de trigo que es el mejor sustrato. Posteriormente en 1998 en colaboracin con los cientficos L. Ashakumary y P. Selvakumar realizaron una investigacin sobre la biosntesis de glucoamilasa utilizando fermentacin en estado slido con residuos de t como sustrato, logrando solo un 50% de la biosntesis de la amiloglucosidasa en comparacin con el sustrato salvado de trigo, pero la enzima producida resista mejor la temperatura sin desnatulalizarse.

En 1996 paralelo al trabajo de Pandey, A. los cientficos Yusuka Fujio y Horoshi Morita, trabajaron con el Rhizopus sp A-11, perteneciente al grupo de hongos que biosintetizan la glucoamilasa, verificando el resultado de la adicin de Ca+2 y Zn+2, al medio de cultivo, en concentraciones de 0 a 500 ppm, concluyendo que la presencia de Zn+2 y Ca+2 en concentraciones de 0.7 y 125 ppm respectivamente, tenan un efecto positivo sobre el crecimiento del Rhizopus y la produccin de la glucoamilasa.

En 1999 Pendersen, Beyer y Nielsen evaluaron la influencia de las fuentes de carbono y nitrgeno en la produccin por lotes de glucoamilasa, concluyendo que con el salvado de trigo como fuente de carbono, y el sulfato de amonio como fuente de nitrgeno, se pueden obtener buenos resultados en la produccin de amiloglucosidasa.

Asimismo en el 2005, Anto, Trivedi y Patel trabajaron con el Aspergillus niger en medio slido para producir la glucoamilasa, teniendo como variables la relacin de

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adicin en peso de los sustratos: hojuelas de arroz, salvado de trigo y residuos de copra, obteniendo el mximo aumento en la produccin de la amiloglucosidasa cuando se utilizaba el salvado de trigo. Otro aspecto importante en la produccin de la glucoamilasa por A. niger es el pH del medio de fermentacin, tema que fue analizado en profundidad por Gregg en el 2001, quien concluyo que el pH del medio debe estar entre 5 y 6.

Los cientficos citados constituyen una parte de la comunidad que han trabajado con el gnero Aspergillus, con el objetivo de producir glucoamilasa, cada uno variando diferentes aspectos en los medios de fermentacin.

2.2 HONGOS Los seres vivos son clasificados para su estudio en grupos grandes y bsicos llamados reinos. Los hongos se clasificaron durante muchos aos en el Reino de las Plantas. Sin embargo, los bilogos observaron que los hongos mostraban una relacin cercana a los animales, pero tambin que son organismos diferentes, lo cual permiti clasificarlos en su propio Reino. Los hongos se alimentan incorporando nutrientes a partir de material orgnico disponible. Los hongos no poseen estmagos, por lo que tienen que digerir su comida antes de que pueda pasar a travs de la pared de la clula a la hifa. La hifa secreta cidos y enzimas que biodegradan el material orgnico en compuestos de menor complejidad y fciles de digerir [Whittaker, 1978].

La mayor parte de los hongos se reproducen por esporas, las cuales son diminutas partculas de protoplasma rodeada de pared celular. [Kozakiewicz, 1989].

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2.2.1 ASPERGILLUS NIGER Las Aspergillus se dividen en las especies sealadas en el esquema 1. [Coutinho, 1997]: Esquema 1. rbol filogentico de Aspergillus (18), mostrando las 7 subfamilias de hongos productores de la glucoamilasa1.

Su clasificacin cientfica se muestra en la tabla 1: Tabla 1. Clasificacin cientfica del Aspergillus niger. [http://www.aspergillus.org.uk/]

Dominio: Eukaryota Reino: Fungi Filo: Ascomycota Subfilo: Pezizomycotina Clase: Eurotiomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Gnero: Aspergillus Especie: Aspergillus Nger

1 Handbook of food enzymology, cap 58, p 731, 2002.

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A. niger crece rpidamente sobre una gran variedad de sustratos naturales. Al inicio, se producen las colonias, que forman una base compacta de color blanca o amarilla, que con el tiempo de crecimiento, se convierten en una capa densa de color marrn oscuro [Frioni, 1999].

Esquema 2. Colonia de Aspegillus niger 2.

El Aspergillus niger se a cultivado para obtener diversos productos biotecnolgicos tales como: cido ctrico, glucnico y enzimas como: glucoamilasa, galactosidasa y lipasas [Frioni, 1999].

2.3 ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLGICOS

Desde hace cientos de aos se han venido empleando enzimas en procesos de biotransformacin tales como la fabricacin de quesos, fabricacin del pan, vino y cerveza, tal vez sin conocimiento de causa, pero fue en 1860 cuando Luis Pasteur descubri que las enzimas estaban ntimamente ligadas con la estructura vital de las clulas de la levadura. Posteriormente, en 1876, Willian Kuhne propuso el nombre de enzima, trmino que deriva de las palabras griegas en (en) y zyme (levadura). Para 1897, Eduard Buchner prob que las enzimas podan ser

2 http://www.aspergillus.org.uk/indexhome.htm?languages/index.php~main,

abril 1998.

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extradas de las clulas de las levaduras y catalizar reacciones por s mismas [O Brein, 1995]

A partir de este descubrimiento, se empezaron a utilizar diferentes sustratos para biosintetizar diferentes enzimas con multiples aplicaciones que hicieron que su empleo se extendiera a diversas ramas de la industria, tales como detergentes, fabricacin del papel, textil, tratamiento de cueros, farmacia, destilera, aceites y grasas, almidones y azcares.

Las enzimas son catalizadores biolgicos, es decir, tienen la capacidad de acelerar ciertas reacciones qumicas. Son protenas complejas que producen un cambio qumico especfico sobre otras sustancias sin que exista un cambio sobre s mismas. Las enzimas se pueden encontrar en todos los rganos del cuerpo; por ejemplo, estn presentes en la boca (saliva), estmago (jugo gstrico) e intestinos (jugo pancretico, jugo intestinal y mucosa intestinal) y pueden convertir almidones, protenas y azcares en sustancias digeribles [O Brein, 1995] .

Las enzimas como protenas, tienen estructuras tridimensionales complejas de cadenas polipeptdicas, las cuales dependen de los estados de oxidacin de los grupos amino y carboxlicos; por consiguiente, la estabilidad estructural depende del pH. La temperatura es otro factor que influye sobre la estructura de la protena, debido a que altas temperaturas pueden desnaturalizar su estructura principalmente por el rompimiento de enlaces de puente de hidrgeno que mantienen su estructura terciaria y cuaternaria. Un gran nmero de enzimas contienen constituyentes no peptdicos, como por ejemplo, cadenas con alto contenido de carbohidratos. Este tipo de enzimas no pueden funcionar por s solas, y necesitan un constituyente no peptdico llamado cofactor, el cual puede ser un in o una molcula [Sauer, 2000]. La enzimologa o ciencia encargada del estudio de las enzimas siempre es un tema de actualidad en la biotecnologa. En los ltimos aos, esta ciencia ha experimentado grandes avances al igual que sus aplicaciones en la industria

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alimentaria, farmacutica, de detergentes, panadera y papelera, entre otras. Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan ventajas frente a los catalizadores no biolgicos, [Norouzian, 2005].

Las enzimas son clasificadas segn su funcin de la siguiente forma:

Tabla 2. Clasificacin de las enzimas segn su funcin. [IUPAC comisin de enzimas].

Oxidorreductasas Reacciones de xido-reduccin.

Tranferasas Transferencia de grupos funcionales de una sustancia a otra.

Hidrolasas Hidrlisis de sustancias.

Liasas Ruptura de molculas por procesos distintos a los utilizados por la hidrolasa.

Isomerasas Interconversin de ismeros.

Ligasas Unin de compuestos.

Los procesos biocatalticos normalmente involucran el cultivo y uso de microorganismos y el uso de enzimas aisladas solubles o inmovilizadas en medios acuosos o inorgnicos que contienen compuestos orgnicos como sustrato.

La funcin principal de las enzimas de tipo hidrolasas es, entre otras, reducir el tamao de grandes polmeros en cadenas ms cortas. Estas enzimas actan principalmente sobre enlaces de tipo ster, glucosdico, peptdico y enlaces de tipo C-N. Dentro de estas se destacan: proteasas, amilasas ( y amilasa, glucoamilasas, isoamilasas o pululanasa), -D-galactosidasa, -D-galactosidasa o galactasa, invertasa, enzimas pectinolticas, celulasas, hemicelulosas y dextranasas.

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2.3.1 LA GLUCOAMILASA (GA) La Glucoamilasa es una enzima que posee 3 dominios estructurales, es una de las enzimas de tipo hidrolasa con mayor aplicacin a nivel de laboratorio e industrial, y comercialmente es conocida como amiloglucosidasa. Estas enzimas tienen su mximo de aplicacin en el campo de la alimentacin, donde son utilizadas en la produccin de jarabes de glucosa.

La glucoamilasa promueve la hidrlisis de los enlaces -(1,4), -(1,6), -(1,3) y -(1,2) glucosdicos. En presencia de altas concentraciones de almidn la GA cataliza las siguientes reacciones: -Glc-[(1,4), (1,6)]-Glcn + H2O Glc + Glcn Glc + Glc -Glc-[(1,4), (1,6), (1,1),(1,3), (1,2)]-Glcn + H2O

Estos procesos de hidrlisis son llevados a cabo en un rango de temperatura entre 50-60 C y a un pH de 4.3-4.5 donde la enzima prese nta su mayor actividad cataltica [Jhon R, 2002].

2.3.1.1 Estructura La estructura de la enzima glucoamilasa esta constituida por tres subestructuras principales [Coutinho, 1997]:

1. Dominio cataltico (CD) 2. Puente de union 3. Dominio de almidn ligado (SBD)

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Esquema 3. Postulado estructural de la GA de Aspergillus niger3.

Dominio cataltico (CD) Esquema 4. Dominio cataltico de la glucoamilasa4.

Degrada los oligosacridos unindose a sus terminaciones no reducidas, produciendo glucosa [Norouzian, 2005]. Puente de union Es el encargado de establecer un puente enlazante entre el dominio cataltico y el dominio de unin al almidn.

3 Handbook of food enzymology, cap 58, p 729, 2002.

4 Handbook of food enzymology, cap 58, p 730 2002.

Dominio cataltico

60

Puente

100

Dominio de unin a

almidn 30

11

Dominio de unin al almidn (SBD) Es el encargado de unir la enzima al almidn puro y a la pared celular. Est constituido de 8 hebras , organizados en 2 hojas formando una estructura de cilindro enrollado [Cornett, 2003].

2.3.1.2 Mecanismo de accin

La hidrlisis se produce por un mecanismo de desplazamiento donde intervienen los residuos Glu179 y Glu400 en sus estados cido y bsico, respectivamente. El residuo Glu179 dona un protn al oxgeno que pertenece al enlace glucosdico. Luego, el residuo Glu400 extrae un protn del agua del medio. El OH- liberado ataca al carbono 1 del azcar liberando dos nuevos sacridos. Al mismo tiempo, se presenta una inversin en la configuracin de los residuos del cido glucnico, asi,el que presentaba caractersticas bsicas ahora tiene caractersticas cidas y viceversa [McCarter, 1994].

Esquema 5. Mecanismo de accin para la glucoamilasa5.

5Handbook of food enzymology, cap 58, p 732, 2002.

12

2.4 SUSTRATO El almidn es el principal polisacrido de reserva de la mayora de los vegetales, y la principal fuente de caloras de la mayora de la humanidad. Lo que se llama almidn no es realmente un polisacrido, sino la mezcla de dos, la amilosa y la amilopectina. Ambos estn formados por unidades de glucosa, en el caso de la amilasa, es el producto de la condensacin de D-glucopiranosas por medio de enlaces glucosdicos -D-(1,4), que establece largas cadenas lineales con 200-2500 unidades. En el caso de la amilopectina, sta contiene ramificaciones que le dan una forma molecular parecida a la de un rbol; las ramas estn unidas al tronco central (semejante a la amilosa) por enlaces -D-(1,6), localizadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa, constituyendo alrededor del 75% de los almidones ms comunes [Buenda, 2001].

2.5 MODALIDADES DE CULTIVO DE A. NIGER. Los cultivos de hongos adoptan un modelo de crecimiento diferente cuando son cultivados en sustratos lquidos slidos. Bajo fermentacin sumergida, ellos son expuestos a fuerzas hidrodinmicas, mientras que el crecimiento en estado slido es restringido a la superficie de la matriz [Papagianni, 1999].

Fermentacin en medio slido La definicin ms general y reciente para la fermentacin en medio slido propone que, "es un proceso microbiolgico que ocurre comnmente en la superficie de materiales slidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles". Esta definicin abarca a procesos donde el soporte slido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo pueden ser sustancias solubles en agua [Viniegra, 1997].

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Fermentacin sumergida La fermentacin en medio lquido emplea grandes cantidades de agua que puede operarse en forma estril con gran facilidad. Como requisito indispensable los nutrientes utilizados en este medio deben ser solubles, para que puedan ser incorporados por los microorganismo a su metabolismo [Papagianni et al, 2001].

Los principales parmetros que intervienen en la eficiencia de la fermentacin en medio slido y lquido son: la temperatura, y pH del medio, la concentracin de los nutrientes y la aireacin.

Algunas ventajas y desventajas de la fermentacin en medio slido comparada con el cultivo sumergido se nombran a continuacin;

Ventajas: Los medios de cultivo son simples y generalmente subproductos agrcolas

que presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios. La aireacin forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que

permite una alta transferencia de oxgeno al microorganismo. La concentracin natural del sustrato permite utilizar reactores ms

pequeos en comparacin con los utilizados en otro tipo de fermentacin. Los procesos se consideran generalmente como tecnologas limpias.

Desventajas: Su aplicacin se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos

de humedad. Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusin.

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El tiempo de fermentacin es mayor debido a que generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades especficas de crecimiento.

La naturaleza slida del sustrato trae problemas al medir los parmetros de la fermentacin tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la concentracin de sustrato y productos [Doelle, 1992].

2.6 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular. Los microorganismos heterotrficos como el A.niger necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular. Los requerimientos de otros macronutrientes como P y S son suministrados en forma de iones 24HPO y 24SO . Los requerimientos de K y Mg son tambin

esenciales. Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras: a. los que son frecuentemente esenciales en el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn. b. Los que son raramente esenciales como B, Na, AL, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidos cualitativamente [Merchuk, 1994]. Aunque en ocasiones es difcil demostrar el requerimiento de un micronutriente por parte de un organismo, ya que generalmente est se encuentra presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Es importante tener en cuanta tambin que los requerimientos de estos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a stress, como por ejemplo, un aumento de la temperatura por encima del valor ptimo [Feroza et al., 1998] .

15

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados por la clula.

Cuando se habla de iones metlicos es importante tener en cuenta que su concentracin es modificada por quelacin, ya que constituyentes del medio y productos del metabolismo actan como agentes complejantes o precipitantes, como es el caso de los aminocidos, hidroxicidos, hidrxidos y los iones PO-24.

En general se puede decir que todo material insoluble en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo su concentracin efectiva [Merchuk, 1994].

La dinmica de formacin del complejo est determinada por la constante de equilibrio de formacin del complejo metal-ligando; Kf, y por la velocidad a la cual el equilibrio es alcanzado.

La constante de equilibrio para la formacin del complejo del ion metlico (M) con el ligando (L) se expresa de la siguiente forma:

El valor de K es prcticamente independiente de la naturaleza del ligando, ya que depende particularmente del ion metlico.

Los iones utilizados durante este estudio presentan valores decrecientes de la constante de equilibrio tal como se muestra a continuacin:

Cu+2 > Zn+2 > Fe+2 > Mg+2 Lo que indica que el ion Cu+2 estar en mayor proporcin en el medio formando un ion complejo.

[ML] [M] [L] K=

[ML] [M] [L] K=

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Por otro lado, la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tambin tiene una serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion como se ve a continuacin:

Zn+2 > Fe+2 > Mg+2 De la serie se puede deducir por ejemplo que el ion Mg+2 estar generalmente libre pero si est complejado se har disponible muy lentamente [Merchuk, 1994].

2.7 CINTICA DE CRECIMIENTO El crecimiento de un hongo puede iniciarse a partir de una espora o de una fraccin viable de hifa. Dicho crecimiento se da en forma polarizada o apical, porque la elongacin de la superficie se da en un punto y no en toda la clula. Esta caracterstica ocasiona que las clulas de los hongos (exceptuando las levaduras) tengan una estructura cilndrica, denominada hifa, delimitada por una pared que se extienden de manera ramificada para formar un sistema hifal conocido como micelio.

El crecimiento slo se da en la parte apical de la hifa, la cual tiene la capacidad de elongarse alejndose del centro de la colonia. El pice penetra nuevos territorios y establece nuevas fronteras [Trinci, 1969 y 1971]. Debido a esto, y segn el tamao y edad de la colonia, un hongo puede presentar de manera simultnea una zona de crecimiento, una zona de poco o nulo crecimiento e inclusive, una zona de autlisis.

El crecimiento de un hongo depende del medio de cultivo. Si es lquido y se encuentra en reposo, el crecimiento se da sobre la superficie, pero si el medio es permanentemente agitado, pueden crecer en todo el volumen. Segn las condiciones, el hongo puede o no formar pequeas esferas de micelio denominadas pelotitas.

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En medio lquido agitado, los hongos suelen presentar un desarrollo tpico, similar al presentado por otros organismos, y que consta de las siguientes fases: latencia, exponencial, declinacin, estacionaria y muerte.

Fase de latencia. Empieza inmediatamente despus de que el hongo ha sido inoculado en un medio apropiado para su crecimiento. Es una etapa de adaptacin en la que no hay crecimiento aparente, solo sntesis de los componentes celulares necesarios para iniciar la elongacin celular.

Fase exponencial. Comienza cuando un hongo crece en medio lquido, despus de que se ha adaptado al medio de cultivo y est en capacidad de aprovechar al mximo las condiciones que ste le ofrece. Durante esta etapa el hongo alcanzar la tasa de crecimiento mxima permitida por el substrato.

La fase de declinacin. Tiene lugar cuando la acumulacin de los desechos del metabolismo del hongo alcanzan niveles que inhiben el crecimiento, o cuando alguno de los nutrientes escasea o se termina. Generalmente en estas condiciones la tasa de crecimiento empieza a disminuir de manera paulatina. La importancia de esta disminucin depende de la relevancia de los factores o nutrientes agotados.

La fase estacionaria es el punto en el cual el crecimiento cesa, aunque todava prevalece un metabolismo celular de mantenimiento. Durante esta etapa an hay consumo de glucosa y otros nutrientes. El hongo en esta fase es an capaz de reiniciar crecimiento si es resembrado en un medio propicio, aunque tendr un perodo de latencia ms o menos largo segn las condiciones. Durante la fase estacionaria empiezan a aparecer diversos tipos de enzimas autolticas que conducen a la muerte del hongo [Merchuk, 1994].

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3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General Evaluar el efecto del Zn2+, Mg2+, Cu2+ y Fe2+ sobre la biosntesis de amiloglucosidasa generada por Aspergillus niger en fermentacin slida y sumergida.

3.2 Objetivos Especficos Determinar la actividad volumtrica (U/ml) y especfica (U/mg de protena) de la

glucoamilasa producida cuando al medio de cultivo slido se le adicionan soluciones de Zn+2, Fe+2, Cu2+ y Mg+2 en seis concentraciones diferentes.

Determinar la actividad volumtrica (U/ml) y especfica (U/mg de protena) de la glucoamilasa producida cuando al medio de cultivo lquido se le adicionan soluciones de Zn+2, Fe+2 Cu+2 y Mg+2 en seis concentraciones diferentes.

Determinar la actividad especfica de la glucoamilasa al variar la relacin de los iones metlicos en porciones de 1:1 para las combinaciones de Cu+2 y Fe+2, Zn+2 y Mg+2, Cu+2y Zn+2, Fe+2 y Mg+2, Cu+2 y Mg+2, Fe+2 y Zn+2 que presenten mayor actividad por separado en medio lquido y slido.

Identificar la relacin existente entre la humedad del medio slido y la actividad especifica de la enzima producida en ste.

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4. MATERIALES Y MTODOS

4.1 MATERIALES 4.1.1 REACTIVOS Todos los reactivos para elaborar las soluciones y los sustratos utilizados en esta tesis fueron de grado analtico y proporcionados por Merck y Sigma Chemical Co. 4.1.2 SUSTRATO Se utiliz almidn de papa soluble de Sigma-Aldrich Chem. Co, (St. Louis, USA)

4.1.3 ENZIMAS

Se utiliz la amiloglucosidasa proporcionada por Novozymes A/S como estndar.

4.2 MTODOS

4.2.1 METODOLOGA Se realizaron fermentaciones bajo dos modalidades de cultivo: medio lquido y slido, en las condiciones ptimas para un rpido y eficaz crecimiento del Aspergillus niger.

4.2.2 PREPARACIN DEL PREINCULO En 20 tubos de ensayo con tapa se colocaron 3mL de solucin de agar papa dextrosa Merck para microbiologa al 3.5% p/v [Feroza et al., 1998]. Posteriormente, se estereliz en un autoclave por 15 minutos a una presin de 15 psi y 120C [Asghar et al., 2000]. Con un asa metlica se hizo un barrido sobre la superficie del agar solidificado de una porcin de la cepa madre de Aspergillus niger [Marn y Salazar, 2003] para inocular los tubos esterilizados. Los tubos se taparon ligeramente para no obstruir el paso total del oxgeno. El proceso anterior se realiz en una cabina de flujo laminar para evitar la contaminacin de los tubos inoculados.

20

Los tubos fueron dejados a temperatura ambiente por 6 das. Tras la verificacin visual del crecimiento de los hongos, se almacenaron los tubos a 4C para ser utilizados en la elaboracin de la solucin de esporas.

4.2.3 SOLUCIN DE ESPORAS A cada tubo del precultivo se le adicion 2mL de una solucin buffer de acetato de sodio 0.1M y pH 4.5 previamente esterilizado. Con un asa metlica las esporas se removieron con suavidad y fueron puestas en solucin. La solucin de esporas se prepar minutos antes de ser puesta sobre el medio de cultivo, con el fin de evitar posibles contaminaciones [Anto, 2005].

4.2.4 MEDIO SLIDO En el medio slido se utiliz un medio que contenia: 20g de salvado de trigo, 2g de almidn de papa soluble, 20mL de agua desionizada, 10mL de sulfato de amonio 7.3g/L, 10mL de KH2PO4 1.5g/L y 10mL de NaCl 01g/L mas 10mL de solucin que contena uno de los siguientes iones metlicos Zn+2, Fe+2, Cu+2 y Mg+2, en concentraciones de 2, 5, 10, 15, 50 y 250 ppm. El medio de cultivo respectivo se coloc en frascos de 500mL que estaban cubiertos con un tapn de algodn y gasa que permita el paso del aire filtrado. La esterilizacin del medio se llev a cabo en un autoclave por 20 minutos a una presin de 15 psi y 120C. Posteriormente, se reali z la siembra en una cabina de flujo laminar inoculando 2 mL de la solucin de esporas sobre el medio. Los medios sembrados fueron puestos en incubacin a 30C sobre un bao termostatado, durante 7 das [Anto, 2005].

Extraccin de la glucoamilasa Tras el periodo de incubacin, el producto obtenido se mezcl para obtener una pasta homognea entre el medio y los hongos cultivados. Dos gramos de la pasta homognea se colocaron en un tubo de ensayo, al cual se le adicionaron 20mL de buffer de acetato de sodio 0.1M y pH 4.5. La mezcla resultante fue puesta en

21

agitacin por una hora a 4C. La solucin resultant e se centrifugo por 7 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante obtenido se almacen en tubos plsticos que fueron congelados, para ser utilizados posteriormente en la determinacin de la actividad enzimtica y las protenas totales.

Determinacin del porcentaje de humedad en el medio slido Dos gramos de la pasta homognea fueron puestos sobre una caja petri, y se introdujeron en un horno a 90C por 36 horas. Se pe so el material seco para determinar el porcentaje de humedad en la muestra.

4.2.5 MEDIO LQUIDO El medio lquido estaba compuesto por: 2g de almidn soluble de papa, 0.042g de cloruro de calcio, 0.2g de KH2PO4, 0.8g de sulfato de amonio, 0.2g de cloruro de potasio y 3g de salvado de trigo, todos disueltos en 150mL de agua desionizada mas 10mL de una solucin que contena uno de los siguientes iones metlicos Zn+2, Fe+2, Cu+2 y Mg+2, en concentraciones de 2, 5, 10, 15, 50 y 250 ppm [Yusuka y Morita,1996]. La solucin fue puesta en un frasco de 500mL y esterilizada en un autoclave por 15 minutos a 120C y 15 psi. A contin uacin, se adicionaron 4mL de la solucin de esporas al medio de cultivo y se dej a temperatura ambiente por 5 das, el pH se ajusto a 6.

Extraccin del medio lquido La biomasa producida sobre la superficie del lquido fue removida y puesta en un erlenmeyer de 100ml con agitacin magntica a 4C por 10 minutos con 20ml del caldo de cultivo, se centrifugo la solucin por 5 minutos a 1000 rpm, el sobrenadante fue almacenado en tubos plsticos y congelado para su posterior anlisis de actividad y determinacin de protenas.

22

4.2.6 EFECTO DE LA COMBINACIN DE IONES EN LA PRODUCCIN DE GLUCOAMILASA Despus de conocer los valores ptimos de la concentracin de cada ion, que producan los mejores resultados de la actividad especfica de la amiloglucosidasa en medio lquido y slido, se prob el efecto de las siguientes combinaciones de iones en el fermentador slido y lquido, aadiendo 10mL de cada solucin. Cu+2 y Fe+2, Zn+2 y Mg+2, Cu+2y Zn+2, Fe+2 y Mg+2, Cu+2 y Mg+2, Fe+2 y Zn+2. Los extractos enzimticos se obtuvieron siguiendo el procedimiento utilizado en para el medio lquido y slido.

4.2.7 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Se utiliz el mtodo del DNS para determinar azucares reductores. Este reactivo est compuesto de los siguientes reactivos: cido dinitrosaliclico, que acta como oxidante; sal de Rochelle (tartrato sdico-potsico) que impide la disolucin de oxigeno en el reactivo y hidrxido de sodio que genera el pH requerido para que se de la reaccin redox. Se inici por estandarizar la actividad de una glucoamilasa patrn a cuatro tiempos de reaccin, 2, 4, 6 y 10 minutos. La solucin patrn de amiloglucosidasa producida por A. oryzae tena una concentracin de 0.4g/L. En un tubo de ensayo se adicion 1mL de almidn de papa soluble al 1%(p/v). El tubo fue introducido en un termoreactor TR650 marca MERCK precalentado a 50C. Se esperaron 3 minutos para que el tubo y la solucin alcanzara el equilibrio trmico, 10L de la solucin patrn de glucoamilasa se adicionaron al almidn, tras 2 minutos de reaccin, se adicion 1mL de DNS. El tubo de ensayo fue puesto por 5 minutos en un bao de agua que estaba en ebullicin y pasado este tiempo el tubo se coloc en un bao de hielo por otros 5 minutos, y se adicionaron 10mL de agua destilada. La operacin anterior se repiti para 4, 6, y 10 minutos. Para realizar la medicin de la absorbancia se comenz por ajustar el blanco con una solucin que contena 1mL de almidn soluble de papa al 1%, 10 L de buffer

23

acetato de sodio 0.1M y pH 4.5 y 1mL de DNS, la mezcla fue calentada por 5 minutos en un bao de agua en ebullicin, seguido se pas por un bao de hielo y se le adicionaron 10mL de agua destilada. Posteriormente se midi la absorbancia a 540 nm en el espectrofotmetro marca spectronic 20 Genesis [Miller, 1959]. Para determinar la actividad de las soluciones enzimticas extradas se sigui el mismo procedimiento. La actividad se expres en U= mol de glucosa/min [Pendersen, 2000].

4.2.8 ANALISIS DE LA GLUCOSA Se realizaron soluciones patrn de glucosa de 0, 0.3, 0.5, 0.8, 1.2, 1.5, 2, y 2.5 mg/mL. Se tom 1 mL de cada solucin en un tubo de ensayo, se adicion 1mL de DNS, la mezcla fue puesta en un bao de agua a ebullicin por 5 minutos, la reaccin fue detenida al pasar el tubo por un bao de hielo un periodo de 5 minutos, se le adicionaron 10 mL de agua destilada, se agit la mezcla y se cuantific la absorbancia en un espectrofotmetro marca spectronic 20 Genesis, ajustando la longitud de onda a 540nm [Miller, 1959]. Con los valores de absorbancia obtenidos se elabor una grafica de absorbancia vs. tiempo que sirvi como curva de calibracin

4.2.9 DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES Se sigui el mtodo de BRADFORD, mtodo colorimtrico de gran sensibilidad. Para realizar la curva de calibracin se tomaron patrones de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1mg/mL de albmina. En un tubo de ensayo se tomaron 25L de la solucin de albmina, se adicionaron 2.5mL de Bradford, pasados 3 minutos de reaccin se midi la absorbancia con un espectrofotmetro marca spectronic 20 Genesis ajustando la longitud de onda a 595nm.

24

Con los datos obtenidos se realiz una curva de absorbancia Vs mg/mL de protena, que sirvi para determinar la cantidad de protena en las soluciones enzimticas extradas de los medios lquido y slido [Bradford, 1976]. Para determinar las protenas totales de las soluciones enzimticas se sigui el mismo procedimiento pero se tomaron 100 L de solucin enzimtica. El reactivo de anlisis se prepar diluyendo 100mg de colorante azul brillante de Coomassie G250 en 50mL de etanol (95% de pureza). A esta disolucin se le aadieron 100mL de cido fosfrico (85% w/v). La solucin resultante se diluy hasta un volumen final de 1L con disolucin buffer de acetato de sodio 0.05M (pH=6,0)

25

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 PRODUCCIN DE GLUCOAMILASA POR FERMENTACION SLIDA

5.1.1 CINTICA DE CRECIMIENTO PARA EL MEDIO SLIDO. Las condiciones en las que se evalu la cintica corresponden las presentadas en la metodologa seguida en la fermentacin es estado slido.

Despus de la siembra del preinoculo el periodo latente para el crecimiento del Aspergillus niger en medio slido es muy corto (menor a dos das figura 1.), ya que en las primeras 48 horas se alcanza un 37% de la produccin de la enzima. Figura 1. Cintica de produccin de la glucoamilasa por A.niger en medio slido

Asimismo se observa que durante la elaboracin de la solucin de esporas el dao al hongo fue mnimo, por consiguiente el periodo de regeneracin sobre el medio es transitorio. A continuacin del periodo de adaptacin se observa un crecimiento exponencial logrando un mximo de produccin pasados siete das de la fermentacin, que en trminos de actividad volumtrica representan 41.2 U/mL. Despus de 7 das de fermentacin hay un periodo de declive en la produccin de enzima, observndose una disminucin de un 28% a los diez das de fermentacin.

05

1015202530354045

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tiempo (das)

Activ

idad

volu

mt

rica (U

/mL)

26

La cintica para el crecimiento en medio slido del A. niger fue realizada por duplicado, al valorar los resultados obtenidos se decidi tomar 7 das cmo el periodo ptimo para el proceso de fermentacin a seguir en el desarrollo de este proyecto.

5.1.2 PRODUCCIN DE GLUCOAMILASA POR FERMENTACIN SUMERGIDA Las condiciones en las que se evalu la cintica corresponden a las presentadas en la metodologa seguida en la fermentacin es estado lquido. La fermentacin en medio lquido experimenta una cintica diferente a la fermentacin en medio slido. El periodo de adaptacin de las esporas al nuevo ambiente es ms lento, logrando solo un 16% de la produccin dos das de fermentacin, lo que representa menos de la mitad en comparacin a lo logrado en el medio slido. Figura 2. Cintica de produccin de la amiloglucosidasa por A.niger en medio lquido.

Despus del periodo latente del crecimiento se alcanza un mximo de produccin a los cinco das de fermentacin, con 24.8 unidades volumtricas, como se observa en la figura 2. Pasados cinco das, comienza un periodo de declive en la biosntesis de de la enzima. Esta disminucin no es proporcional a la produccin de la biomasa en el

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tiempo (das)

Activ

idad

volu

mt

rica (U

/mL)

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fermentador como se ve en la figura 3, donde pasados cinco das aumenta la cantidad producida en el reactor.

Figura 3. Cintica para la produccin de biomasa en medio lquido

Al igual que para el medio slido, las pruebas fueron realizadas por duplicado y se decidi tomar 5 das como el periodo optimo de fermentacin.

5.2 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

5.2.1 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA PARA LA FERMENTACIN EN MEDIO SLIDO

Las soluciones enzimticas extradas de los medios de fermentacin slidos suplementados con Zn+2, Fe+2, Cu+2 y Mg+2 en diferentes concentraciones, fueron utilizadas para evaluar la hidrlisis a la solucin sustrato de almidn de papa al 1%. Se defini como medio blanco a aquel que no se le adicion ningn ion. La glucosa producida despus de la biotransformacin del almidn fue cuantificada utilizando el mtodo del DNS pasados 2, 4, 6 y 10 minutos de reaccin, efectuando los ensayos por duplicado. Los resultados obtenidos se

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0,40,45

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (das)

B

iom

asa (m

g/m

l)

28

consignan en el anexo III y son evaluados en la curva de calibracin para la glucosa (anexo I).

Cuando la fermentacin tiene lugar en medio slido el blanco present una actividad volumtrica de 41.2 U/ml y una actividad especfica de 1435 U/mg de protena total.

5.2.1.1 Medio slido suplementado con Mg+2

5.2.1.1.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Mg+2 La figura 4, muestra el comportamiento de la actividad volumtrica para el medio slido cuando se de adicionan seis concentraciones diferentes de Mg+2.

Figura 4. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

Todos los resultados son tomados pasados 7 das de fermentacin.

La actividad volumtrica es incrementa en 28.9 U/mL despus de la adicin de Mg+2 en concentracin de 2 ppm comparado con el medio blanco. Es evidente que conforme se aumenta la concentracin del Mg+2 en el medio hay una cada en la actividad volumtrica. De una actividad mxima de 70.1 U/mL a 2ppm, se pasa a 37.9 U/mL a 250 ppm de Mg+2 en el medio.

0

20

40

60

80

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

ivid

ad

vo

lum

tri

ca U

/mL

Concentracin de Mg+2 (ppm)

0

20

40

60

80

0 5 10 15 50 100 150 200 2500

20

40

60

80

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

ivid

ad

vo

lum

tri

ca U

/mL

Concentracin de Mg+2 (ppm)

29

La adicin de Mg+2 en concentracin de 250 ppm al medio causa una disminucin de 3.3 U/mL si se compara con el medio blanco. Ademas a partir de 5 ppm permanece prcticamente constate.

5.2.1.1.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Mg+2 La figura 5, presenta una tendencia similar a la de la actividad volumtrica mostrando un mximo a 2499 U/mg de protena por la adicin de Mg+2 en concentracin de 2 ppm y un mnimo a 250 ppm de Mg+2 con 633 U/mg de protena.

Figura 5. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

ste fenmeno se puede atribuir a que el Mg+2 generalmente esta libre en el medio facilitando su absorcin por el Aspergillus niger y no es necesario la inclusin de grandes cantidades en el fermentador Se pude deducir tambin que la adicin de concentraciones superiores a 5ppm de Mg+2 al medio hace que se alcance estabilidad en la actividad especfica en torno a 633 U/mg de protena. Todas las concentraciones superiores a 5 ppm de Mg+2 adicionadas al medio causan una disminucin en la biosntesis de amiloglucosidasa en comparacin con el medio blanco.

0500

10001500200025003000

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

ivid

ad

espe

cfic

a U

/mg

de pr

ote

na

Concentracin de Mg+2 (ppm)

0500

10001500200025003000

0 5 10 15 50 100 150 200 2500

50010001500200025003000

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

ivid

ad

espe

cfic

a U

/mg

de pr

ote

na

Concentracin de Mg+2 (ppm)

30

5.2.1.2 Medio slido suplementado con Zn+2

5.2.1.2.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Zn+2 Al igual que para el medio slido suplementado con Mg+2 el medio suplementado con Zn+2 presenta su mximo de actividad volumtrica si el Zn+2 se adiciona en una concentracin de 2 ppm con 47.6 U/mL. Para este caso el aumento en la actividad volumtrica es de 6.4 U/mL ms que el medio blanco.

Figura 6. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

La adicin de soluciones de Zn+2 en concentraciones iguales y superiores a 5 ppm hacen que la actividad volumtrica se mantenga en torno a 35.9 U/mL, 5.3 unidades menos si se compara con el medio blanco. Si se compara la actividad enzimtica al incorporar Zn+2 al medio en concentracin de 5 ppm es equivalente a tener un medio blanco.

5.2.1.2.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Zn+2

La adicin de soluciones de Zn+2 en concentraciones superiores a 5 ppm causa una disminucin en la actividad especfica de la amiloglucosidasa. La actividad

01020304050

0 5 10 15 50 100 150 200 250

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Concentracin de Zn+2 (ppm)

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0 5 10 15 50 100 150 200 2500

1020304050

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

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ad

vo

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ca U

/mL

Concentracin de Zn+2 (ppm)

31

especfica toma su valor maximo de 2567 U/mg de P con la adicin de Zn+2 al medio en concentracin de 2 ppm.

Figura 7. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

.El Zn+2 esta en el medio principalmente como ion haciendo ms fcil la absorcin por parte del hongo. La adicin de una solucin de Zn+2 de 5 ppm al medio de fermentacin hace que la amiloglucosidasa biosintetizada tenga la mima actividad que la que se produce en medio blanco.

5.2.1.3 Medio slido suplementado con Fe+2

5.2.1.3.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Fe+2 Figura 8. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

0500

10001500200025003000

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Concentracin de Zn+2 (ppm)

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0500

10001500200025003000

0 5 10 15 50 100 150 200 2500

50010001500200025003000

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Concentracin de Zn+2 (ppm)

Activ

ida

d es

pec

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pr

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0 5 10 15 50 100 150 200 250Concentracin de Fe+2 (ppm)Ac

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20

40

60

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0 5 10 15 50 100 150 200 250Concentracin de Fe+2 (ppm)Ac

tivid

ad

vo

lum

tri

ca U

/mL

32

A diferencia de las curvas de tendencia para la actividad volumtrica en medio slido suplementado con Zn+2 y Mg+2 el comportamiento de la actividad volumtrica cuando se adiciona Fe+2 al medio es menos predecible, ya que oscila en torno a 56.9 7.21 U/mL cuando se aumenta la concentracin del ion de 10 a 250 ppm. El de A. volumtrica se alcanza a 5ppm siendo este 68.9 U/mL, 27.7 U/mL ms que lo registrado por el medio slido blanco. El medio slido tiene su mximo de actividad a 5 ppm a diferencia del medio suplementado con Zn+2 y Mg+2 donde se encontraba a 2 ppm. 5.2.1.3.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Fe+2

Figura 9. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

El mximo de actividad especfica se alcanza al adicionar al medio slido una solucin de Fe+2 de 10ppm. En comparacin con el medio slido blanco, la adicin de Fe+2 en concentracin de 10ppm causa un aumento de la A. especfica en 2209 U/mg de protena lo que representa un incremento del 39%. El medio suplementado con Fe+2 muestra un comportamiento particular si se compara con los medios donde se adicion Zn+2 y Mg+2 que presentan una tendencia definida. Cuando se incorpora el Fe+2 al medio slido se debe tener en cuenta que ste ion por estabilidad se encontrar en un equilibrio Fe+2 + L FeL desplazado un

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Concentracin de Fe+2 (ppm)

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4000

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Act

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espe

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U/m

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Concentracin de Fe+2 (ppm)

33

poco a la izquierda, de all la necesidad de incorporar el ion en una concentracin mayor a la utilizada para el Mg+2 y Zn+2. La adicin de Fe+2 en concentracin de 10 ppm provoca el aumento de la actividad especfica alcanzndose 3644 U/mg de protena.

5.2.1.4 Medio slido suplementado con Cu+2

5.2.1.4.1 Actividad volumtrica para el medio slido suplementado con Cu+2 Para el medio slido suplementado con Cu+2 la curva de tendencia de la actividad describe un comportamiento particular (figura 10), la inclusin de la concentracin ms alta del ion es la que provoca un incremento en la actividad volumtrica a diferencia de los medios suplementados con Fe+2, Zn+2, y Mg+2 donde se consegua a concentraciones bajas.

Figura 10. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

A 250 ppm el aumento en la actividad volumtrica es de 13.0 U/mL y a concentraciones bajas solo se alcanza un aumento de 2.95 U/mL en promedio. Un punto de gran inters en la curva, se consigue al adicionar Cu+2 en concentracin de 50 ppm ya que constituye el punto de mximo decrecimiento en la actividad enzimtica.

0102030405060

0 5 10 15 50 100 150 200 250

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Concentracin de Cu+2 (ppm)

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Act

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ca U

/mL

Concentracin de Cu+2 (ppm)

34

5.2.1.4.2 Actividad especfica para el medio slido suplementado con Cu+2 El mximo de la actividad especfica se alcanza cuando al medio se adiciona Cu+2 en concentracin de 250 ppm, con solo una diferencia de 7 U/mg con respecto a la actividad presentada si se adiciona el ion en concentracin de 5 ppm donde se encuentra al segundo mximo. Figura 11. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo slido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

La incorporacin de Cu+2 en concentracin de 50 ppm genera un efecto de inhibicin sobre la amiloglucosidasa producida. En el caso del Cu+2, el equilibrio estar desplazado a la derecha, Cu+2 + L CuL. El Cu+2 se encuentra en su mayora como complejo siendo necesaria la incorporacin de una mayor cantidad al fermentador. 2194 U/mg de protena se obtiene cuando se suministra Cu+2 al medio en concentracin de 250 ppm. El promedio de la actividad especfica es de 1641.6526 U/mg de protena.

5.2.2 IONES Y CONCENTRACIN PTIMA PARA EL MEDIO SLIDO La figura 12 muestra las concentraciones ptimas en las que se debe adicionar cada ion al fermentador slido. En la figura podemos observar que el ion Fe+2 produce el mximo aumento en la actividad cataltica de la amiloglucosidasa en comparacin con los dems iones.

0500

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Concentracin de Cu+2 (ppm)

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5001000150020002500

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Concentracin de Cu+2 (ppm)

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35

Figura 12. Ion y concentracin optima para el medio slido

5.2.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA PARA LA FERMENTACIN EN MEDIO SUMERGIDO

La actividad enzimtica se calcul siguiendo el esquema empleado para determinar la actividad de la amiloglucosidasa biosintetizada en la fermentacin en estado slido. Los datos obtenidos tras los ensayos de hidrlisis del almidn con las soluciones extradas de la fermentacin en medio sumergido suplementada con los cuatro iones de trabajo se consignan en el anexo IV.

Cuando la fermentacin tiene lugar en medio slido el blanco present una actividad volumtrica de 24.8 U/ml y una actividad especfica de 1150 U/mg de protena total.

5.2.3.1 Medio lquido suplementado con Fe+2

5.2.3.1.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Fe+2 La adicin de concentraciones crecientes de Fe+2 al medio de fermentacin lquido no ocasiona un aumento constante en la actividad volumtrica, por el contrario

0

500

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3500

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Activ

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Concentraciones optimas

Blanco Cu+2250 ppm

Zn+22 ppm

Fe+210 ppm

Mg+22 ppm

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Activ

idad

es

pec

fica

(U/m

g de

pr

ote

na)

Concentraciones optimas

Blanco Cu+2250 ppm

Zn+22 ppmZn+2

2 ppmFe+2

10 ppmFe+2

10 ppmMg+22 ppmMg+22 ppm

1435

21942567

3644

2499

36

hace que esta oscile en torno a 35.3 5.8 U/mL, actividad que es superior a la mostrada por el medio liquido blanco (figura 13).

Figura 13. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

La presencia del ion Fe+2 en el fermentador en concentracin de 2 ppm provoca el mximo aumento de la actividad volumtrica correspondiente a un 43% con respecto al blanco. 5.2.3.1.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Fe+2 Figura 14. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Fe+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

La actividad especfica presenta el mismo comportamiento oscilante de la actividad volumtrica en torno a 1476.0 U/mg de protena.

01020304050

0 5 10 15

Act

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Concentracin de Fe+2 (ppm)

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0 5 10 15

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50 100 150 200 250

0500

1000150020002500

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Concentracin de Fe+2 (ppm)

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1000150020002500

0 5 10 15 50 100 150 200 2500

5001000150020002500

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Concentracin de Fe+2 (ppm)

Act

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ad

espe

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ca

U/m

g de

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ote

na

37

Si se incorpora Fe+2 en concentraciones de 50 ppm al medio de fermentacin lquido se inhibe la actividad especfica de la amiloglucosidasa en un 59% con respecto al valor de la media en un intervalo de concentraciones de 2 a 250 ppm. Comparando la actividad volumtrica y la actividad especfica se observa una relacin directa en los mximos de actividad enzimtica que se obtiene cuando el medio esta suplementado con Fe+2 en un concentracin de 2 ppm.

5.2.3.2 Medio lquido suplementado con Cu+2

5.2.3.2.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Cu+2 La figura 15 muestra que la incorporacin de Cu+2 en concentraciones de 10 ppm provoca el aumento de la actividad volumtrica en 17.7 U/mL. La actividad volumtrica tras la adicin de Cu+2 al medio de fermentacin oscila en torno a 37.54.7 U/mL. Asimismo cuando se adiciona Cu+2 en concentraciones superiores a 10ppm se promueve la disminucin de la actividad volumtrica para la amiloglucosidasa biosintetizada.

Figura 15. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

La diferencia en la actividad de los dos mximos en la curva de tendencia es de solo 1 U/mL.

01020304050

0 5 10 15 50 100 150 200 250

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0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

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Concentracin de Cu+2 (ppm)

38

5.2.3.2.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Cu+2

Figura 16. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Cu+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

La actividad especfica de la amiloglucosidasa biosintetizada cuando al medio lquido se incorpora Cu+2 oscila en torno a 1592.6 134 U/mg de protena, valor que est 442 unidades por encima de la actividad registrada por el blanco. Segn la curva de tendencia para la actividad especfica, el mximo se consigue al adicionar Cu+2 en concentracin de 10ppm al medio. La suma de Cu+2 en concentraciones iguales o superiores a 15 ppm hace que la actividad permanezca constante en un valor promedio de 1574 U/mg de protena.

Segn la secuencia de valores de la Kf, el ion que activar en menor forma la amiloglucosidasa biosintetizada ser el Cu+2 que en su mayora se encontrar presente en el medio como ion complejo, haciendo necesaria la incorporacin de altas concentraciones.

5.2.3.3 Medio lquido suplementado con Zn+2

5.2.3.3.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Zn+2 Si es incorporado Zn+2 en concentracin de 2 ppm al medio, se produce un aumento del 51% en la actividad volumtrica correspondiente a 23.7 U/mL.

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0 5 10 15 50 100 150 200 250

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espe

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Concentracin de Cu+2 (ppm)

39

A partir de 5 ppm y hasta 250 ppm las soluciones de Zn+2 provocan un aumento casi constante al valor promedio de 29.5 12 U/mL (figura 17).

Figura 17. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

Las actividades presentadas con la adicin de Zn+2 en concentracin de 5 y 10 ppm solo difieren en 1.5 U/mL. A diferencia de la concentracin de 2 y 5 ppm, tambin dos valores cercanos que difieren en 15.9 U/mL.

5.2.3.3.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Zn+2

Figura 18. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Zn+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

01020304050

0 5 10 15Concentracin de Zn+2 (ppm)

Activ

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d v

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rica U

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1020304050

0 5 10 15Concentracin de Zn+2 (ppm)

Activ

ida

d v

olu

mt

rica U

/mL

50 100 150 200 250

0

1000

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3000

4000

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Concentracin de Zn+2 (ppm)

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4000

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Concentracin de Zn+2 (ppm)

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40

A diferenta de la curva de tendencia para la actividad volumtrica, la actividad especfica oscila en un rango mas amplio con una desviacin estndar de 547 U/mg. Asimismo tiene su mximo en 3392 U/mg de protena, 2242 unidades mayores que el blanco.

La adicin de Zn+2 en concentracin de 2 ppm tiene el mayor efecto sobre la actividad especfica de la enzima. El equilibrio M + L ML estar desplazado a la izquierda favoreciendo la presencia de Zn+2 y no la del complejo. Adems la velocidad de desaparicin del complejo ZnL es mayor que la velocidad de desaparicin del complejo MgL.

5.2.3.4 Medio lquido suplementado con Mg+2

5.2.3.4.1 Actividad volumtrica para el medio lquido suplementado con Mg+2 Al agregar Mg+2 al medio de fermentacin lquido se produce el comportamiento ms estable de las curvas de tendencia para todos los iones de trabajo en el intervalo de 2 a 250 ppm. La actividad oscila en torno a 42.15.3 U/mL (figura 18).

Figura 19. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad volumtrica de la glucoamilasa de A.niger

0102030405060

0 5 10 15 50 100 150 200 250

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Concentracin de Mg+2 (ppm)

0102030405060

0 5 10 15 50 100 150 200 2500

102030405060

0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

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ca U

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Concentracin de Mg+2 (ppm)

41

La mxima actividad volumtrica se obtiene tras la incorporacin de Mg+2 en concentracin de 250 ppm, pero la diferencia con el segundo mximo es de solo 2.5 U/ml que se obtiene al incorporar Mg+2 al medio en concentracin de 10 ppm.

5.2.3.4.2 Actividad especfica para el medio lquido suplementado con Mg+2

Figura 20. Efecto de la adicin de diferentes cantidades de Mg+2 en el medio de cultivo lquido, sobre la expresin de la actividad especfica de la glucoamilasa de A.niger

Para obtener un aumento en la actividad especfica de la protena, el ion Mg+2 debe estar en una concentracin de 250 ppm, caso contrario a lo que sucede con los dems iones donde los mximos se consiguen a concentraciones bajas (Figura 20). Ya que de esta manera se incrementa la cantidad de iones metlicos libres de agentes quelantes como aminocidos, protenas y materiales coloidales, que interfieren en la absorcin del ion por el microorganismo.

La actividad especfica oscila en 2452451 U/mg de protena, con una diferencia entre los dos mximos de 308 U/mg.

Cuando se incorpora Mg+2 en concentracin de 5 ppm se presenta una inhibicin en la produccin de la amiloglucosidasa lo que se ve reflejado en una disminucin de la actividad especfica y la volumtrica.

0500

100015002000250030003500

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Concentracin de Mg+2 (ppm)

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100015002000250030003500

0 5 10 15 50 100 150 200 2500

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0 5 10 15 50 100 150 200 250

Act

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na

Concentracin de Mg+2 (ppm)

42

5.2.4 IONES Y CONCENTRACIN PTIMA PARA EL MEDIO LQUIDO Los resultados de la actividad especfica cuando la fermentacin tiene lugar en medio lquido, estn relacionados de manera directa con al secuencia de orden creciente para la constante de formacin del complejo [ML] de cada ion.

Figura 21. Ion y concentracin optima para el medio lquido

A diferencia de la fermentacin en medio slido, en el lquido las interacciones de los agentes quelantes como aminocidos, protenas y materiales coloidales presentes en el medio con los iones metlicos son mayores. De all que las concentraciones ptimas obtenidas para cada uno de los iones difieren de un medio al otro.

5.3 MEZCLA DE IONES EN EL FERMENTADOR Despus de realizar la evaluacin del efecto en diferentes concentraciones de Zn+2, Cu+2, Mg+2 y Fe+2 por separado sobre la biosntesis de la enzima hidrolasa en fermentacin lquida y slida, se contino con la valoracin de mezclas inicas que contienen los cuatro iones de trabajo. Las concentraciones de los iones que favorecen la produccin de la enzima en medio slido y lquido se muestran a continuacin:

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Concentraciones optimas

Activ

idad

es

pec

fica

(U/m

g de

pr

ote

na)

Blanco Cu+210 ppmCu+2

10 ppmFe+2

250 ppmFe+2

250 ppmMg+2

250 ppmMg+2

250 ppmZn+2

2 ppm

Zn+22 ppm

11501793

3392

2215

3037

43

Tabla 3. Ion, concentracin y actividad enzimtica para la fermentacin en medio slido. Ion Concentracin (ppm) Actividad

volumtrica (U/mL) Actividad especifica

(U/mg de protena) Mg+2 2 70.1 2499

Zn+2 2 47.6 2567

Fe+2 10 66.5 3644

Cu+2 250 54.2 2194

Tabla 4. Ion, concentracin y actividad enzimtica para la fermentacin en medio lquido. Ion Concentracin (ppm) Actividad

volumtrica (U/mL) Actividad especifica

(U/mg de protena) Mg+2 250 49.2 3037

Zn+2 2 48.5 3392

Fe+2 2 43.2 1682

Cu+2 10 42.5 1793

Las mezclas fueron elaboradas con base en los resultados obtenidos cuando se utilizaron los iones por separado.

Las combinaciones se muestran en la tabla 4. La concentracin de cada ion que presento mayor actividad especfica se mezcl en el frasco fermentador en relacin 1:1 en volumen.

Tabla 5. Combinacin de iones Fermentador Par de iones

1 Cu+2- Fe+2

2 Zn+2- Mg+2

3 Cu+2- Zn+2

4 Fe+2- Mg+2

5 Cu+2- Mg+2

6 Fe+2- Zn+2

44

5.3.1 EVALUACIN DEL EFECTO DE LA MEZCLA DE IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Las soluciones enzimticas extradas de los medios de fermentacin que contenan las mezclas de iones fueron utilizadas para producir la hidrlisis del almidn. Los datos obtenidos se consignan en el anexo V.

5.3.2 ACTIVIDAD ESPECFICA PARA EL MEDIO SLIDO SUPLEMENTADO CON LA MEZCLA DE IONES

Como en el proceso de fermentacin en estado slido con los iones por separado, con las mezclas se tomaron siete das como el periodo ptimo para la produccin de la enzima. El mayor efecto sobre la actividad especfica se consigue cuando al medio de fermentacin se adiciona la mezcla de Fe+2-Mg+2 en concentraciones de 10 ppm y 2 ppm respectivamente, alcanzando 1749 U/mg de protena, un 22% ms que lo registrado por el medio blanco. Figura 22. Actividad especfica para el medio slido suplementado con la mezcla de iones.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Activ

idad

es

pec

fica

(U/m

g de

pr

ote

na)

Mezcla de iones

Blan

co

Cu+

2

Fe+

2

Zn+

2

Mg+

2

Cu+

2

Zn+

2

Fe+

2

Mg+

2

Cu+

2

Mg+

2

Fe+

2

Zn+

2

14351435 12971297 13421342 15261526 17491749 14561456 16121612

45

La actividad especfica oscila en torno a 1497 U/mg de protena. Las mezclas Cu+2-Fe+2 y Zn+2-Mg+2 disminuye la biosntesis de la amiloglucosidasa, que se refleja en la disminucin de la actividad especifica en comparacin con el medio blanco. Si se comparan las actividades especficas de la amiloglucoisidasa biosintetizada en medio slido cuando se adicionan los iones por separado con la producida en el medio con la mezcla de iones, se observa que las mezclas de iones disminuyen la actividad especifica de la enzima debido a un posible envenenamiento del hongo.

5.3.3 ACTIVIDAD ESPECFICA PARA EL MEDIO LQUIDO SUPLEMENTADO CON LA MEZCLA DE IONES Figura 23. Actividad especfica para el medio lquido suplementado con la mezcla de iones.

A diferencia del medio slido, el par de iones que produce el aumento en la actividad especfica es Cu+2-Fe+2 en concentracin de 10 y 250 ppm respectivamente. El mximo de actividad es de 1338 U/mg de protena, 188 unidades mayores que lo mostrados por el blanco.

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1350

Mezcla de iones

Activ

idad

es

pec

fica

(U/m

g de

pr

ote

na)

Blan

co

Cu+

2

Fe+

2

Zn+

2

Mg+

2

Cu+

2

Zn+

2

Fe+

2

Mg+

2

Cu+

2

Mg+

2

Fe+

2

Zn+

2

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1350

Mezcla de iones

Activ

idad

es

pec

fica

(U/m

g de

pr

ote

na)

Blan

co

Cu+

2

Fe+

2

Zn+

2

Mg+

2

Cu+

2

Zn+

2

Fe+

2

Mg+

2

Cu+

2

Mg+

2

Fe+

2

Zn+

2

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1350

Mezcla de iones

Activ

idad

es

pec

fica

(U/m

g de

pr

ote

na)

Blan

co

Cu+

2

Fe+

2

Zn+

2

Mg+

2

Cu+

2

Zn+

2

Fe+

2

Mg+

2

Cu+

2

Mg+

2

Fe+

2

Zn+

2

1150

1262

1196

1338

1178 1162

1269

46

Para el medio lquido la actividad oscila en torno a 123770 U/mg de protena, solo 7% por encima de la actividad alcanzada por el blanco.

Despus de analizar los resultados obtenidos cuando se adicionan los iones por separado en los dos medios, la hiptesis inicial sugera que la combinacin de iones en el medio de fermentacin favorecera la activid