Seminarski rad

OPTIMIZACJA HROMATOGRAFSKOG RAZDVAJANJA ANALITA I HPLC-MS /MS PA RAMETARA eritromicina

Sadrzaj OPTIMIZACJA HROMATOGRAFSKOG RAZDVAJANJA ANALITA I HPLC-MS /MS PA RAMETARA 7Odredjivanje specifinog optikog zakretanja otopine eritromicina 7Sinteza azitromicina 8Priprava eritromicin A oksima 9Priprava eritromicin A imino etera 9Priprava azitromicina 10

Mehanizam djelovanja eritromicinaEritromicin sadrzi iroki laktonski prsten na koji su vezani eeri. Oni se specifino veu za 50S deo bakterijskih ribozoma. Nakon vezivanja mRNK za poetno mesto 30 S podjedinice ribozoma (proces blokiraju aminoglikozidi), 50 S podjedinica vee se za 30 S komponentu i formira 70 S ribozomski kompleks to pokree produenje proteinskog lanca. Vezivanje makrolida za 50 S ribozomsku podjednicu inhibira dakle elongaciju belanevinske niti.

Odredjivanje eritromicina hromatografskom metodom

Slike 1 i 2 pokazuju UV i MS hromatogram eritromicina A oksim (Ery-AO) koji je makrolidni antibiotik koju proizvodi soj bakterije poznata kao Saccaropolyspora erythraea. Neki neistoe su navedene.Sl.3 pokazuje mase spektara eritromicin A oksim (Ery-AO). U Ery-AO molekula je prikazan kao m / z = 747,4661. Masovni razlika izmeu steenih figure i teorijske figure (747.4643) je cca. 0.002.MS / MS spektri m / z = 747 je prikazano na Sl.4. Veliki vrhuncu m / z = 571 se smatra gubitak Povrina A iz Ery-AO strukture od mase razlika m / z = 747 je 176. U m / z = 396.2416 se smatrati Povrina C. To je vrlo pouzdana brojka zbog masovne razliku 0.003 u odnosu na teorijsku figuru.

Slika 6 pokazuje mase spektara neistoe A. MS / MS spektri pokazuje slinu strukturu s Ery-AO.Masovni razlika m / z = 396.2406 je 0.002 u odnosu na teorijske figura Podruje C (396,2386). m / z = 571 je takoer otkriven i to je slian MS / MS spektri Ery-AO. Meutim, molekularne teine od neistoe A je 733, a mase razlika izmeu neistoe A i gubitak koji je 162. Dok mase razliku od Povrina A Ery-AO je 14,0144. Koristei Precizno Mass Kalkulator, ova brojka se smatrati CH2 (14,0156), a pretpostavlja se da su neistoe A ima strukturu koja se polako iz jedne metil grupe Povrina A jednom vodika.Odredjivanje eritromicina masenim spektrom Maseni spektri pozitivnih (ESI+) ili negativnih (ESI) jona analita, na osnovu kojih su odabrani prekursor joni i reakcije fragmentacije u najintenzivnije i najstabilnije fragmentne jone, prikazani su na slici 19. Na spektrima su crvenom elipsom ( ) oznaeni fragmentni joni odabrani za kvantifikaciju svakog analita, dok su plavim pravougaonikom ( ) oznaeni joni odabrani za potvrdu prisustva analita. Za potvrdu su odabrani dodatni fragmentni joni prekursor jona ili joni nastali daljom fragmentacijom fragmentnih jona odabranih za kvantifikaciju analita. Rezultati su pokazali da u procesu elektrosprej jonizacije eritromicina (slika 19), nastaju samo pozitivni joni. Kod ovih jedinjenja u MS spektrima dominiraju protonovani molekuli ([M+H](+), dok su kod makrolida eritromicina i azitromicina veoma intenzivni i adukti sa katjonom natrijuma ([M+Na]+). U spektru se uoavaju dva, podjednako zastupljena jona, koji odgovaraju protonovanom molekulu (m/z316) i protonovanom molekulu koji sadri izotop (m/z318). Za navedene analite je utvreno da ih je potrebno analizirati kao pozitivne jone i da se njihova identifikacija i kvantifikacija treba zasnivati na izolovanju protonovanog molekula, kao prekursor jona za dalju MSn analizu. Farmaceutska jedinjenja koja u procesu elektrosprej jonizacije stvaraju samo negativne jone npr: fenobarbiton i Izuzev acetilsalicilne kiseline, u MS spektrima ovih analita dominiraju deprotonovani molekuli ([MH]), koji su odabrani kao prekursor joni za MSndalju analizu navedenih analita.

OPTIMIZACJA HROMATOGRAFSKOG RA ZDVAJANJA ANALITA I HPLC-MS /MS PA RAMETARANa osnovu rezultata MSn analize, za kvantifikaciju svakog analita je odabrana karakteristina reakcija fragmentacije prekursor jona u najintenzivniji i najstabilniji fragmentni jon. Rezultati su prikazani u tabeli 7. Detektovanjem odabranih fragmentnih jona tokom HPLC-MS/MS analize dobijeni su hromatogrami proizvoda odabranih reakcija fragmentacije. SRM detekcija je podeljena na vie vremenskih segmenata da bi se zadrala osetljivost detekcije. Detekcija pozitivnih jona (ESI(+)MS) je podeljena na pet vremenskih segmenata, a u svakom segmentu su sakupljani podaci za maksimalno etiri analita (tabela 7). SRM detekcija negativnih jona (ESI()MS) je podeljena na dva vremenska segmenta. Kvantifikacija je izvrena na osnovu povrina pikova analita u SRM hromatogramima. Tipini maseni hromatogrami dobijeni analizom standardne smee lekova koji se analiziraju kao pozitivni joni pri koncentraciji 250 ng cm3 prikazani su na slici 44. Na slici 45, prikazani su hromatogrami dobijenianalizom standardne smee lekova koji se analiziraju kao negativni joni pri koncentraciji 500 ng cm3. Odreivanje specifinog optikog zakretanja otopine eritromicina Otopi se 1,00 g eritromicina u etanolu R i dopuni do 50,0 mL istim otapalom. Specifino optiko zakretanje odreuje se najmanje 30 minuta nakon pripreme otopine. Specifino optiko zakretanje izraunato u odnosu na bezvodnu tvar mora biti u granicama od 71 do 78.

Sinteza azitromicinaSinteza azitromicina poinje iz eritromicina A. U prvom stupnju keto skupina u poloaju 9 reagira s hidroksilaminom. Iz nastaloga oksima preko odgovarajuega O-sulfonil derivata Beckmannovom pregradnjom nastaje eritromicin A imino eter. Tako od 14-lanog nastaje 15-lani makrolidni prsten. Katalitikom hidrogenacijom imino eter prelazi u amin (10-dihidro-10-deoksi-11-azaeritromicin Redukcijskom metilacijom amina s formaldehidom i mravljom kiselinom u Eschweiler-Clarkeovoj reakciji nastaje azitromicin

Priprava eritromicin A oksima

a) U tikvicu od 10 mL stavi se 1,0 g (1,4 mmol) eritromicina A, 0,5 g (7,0 mmol) hidroksilamin hidroklorida, 0,18 g (1,7 mmol) bezvodnog natrijeva karbonata i 3 mL metanola. Suspenzija se grije 15 sati pod povratnim hladilom na temperaturi vrenja. Sadraj tikvice se ohladi, razrijedisa 3 mL vode, te nastavi mijeati jedan sat na temperaturi 1317 C. Nastali seprodukt odsie, ispere malom koliinom vode (3 mL), osui na temperaturi 6080 C i prema potrebi prekristalizira iz metanola. Iskoritenje: 0,7 g (68 %). Tt 157159 C b) Kontrola istoe eritromicin A oksima tankoslojnom kromatografijom Kromatografski sustav - Nepokretna faza: silikagel F254 Pokretna faza: kloroform/metanol 8,5:1,5 Detekcija UV zraenje 254 nm; jod 1. eritromicin A (RF 0,51) 2. eritromicin A oksim (RF 0,38)

Priprava eritromicin A imino etera

U tikvici od 100 mL otopi se 3,0 g (4,1 mmol) eritromicin A oksima u 40 mL acetona. U otopinu ohlaenu na 05 C istodobno se tijekom dva sata dokapava otopina 1,9 g (8,1 mmol) 4-acetamidobenzensulfonil-klorida u 13 mL acetona i otopina 1,4 g (16,7 mmol) natrijeva hidrogenkarbonata u 47 mL vode. Reakcijska smjesa mijea se jo dva sata na istoj temperaturi, a zatim se aceton otpari uz snieni tlak. Ostatak se ekstrahira diklormetanom, najprije pri pH 5,5, zatim pri pH 6 (uklanjanje oneienja) i pH 8. Organski sloj dobiven ekstrakcijom pri pH 8, koji sadri eritromicin A imino eter, osui sebezvodnim natrijevim sulfatom i upari uz snieni tlak. Iskoritenje: 2,3 g (78 %). Tt 128131 C; [ ]20D 54,6(c1, CH 2 Cl2) Priprava 10-dihidro-10-deokso-11-azaeritromicina A Otopina 2,0 g (2,7 mmol) eritromicin A imino etera u 20 mL octene kiseline katalitiki se hidrogenira uz 0,042 g PtO2 i tlak vodika Pa. Hidrogenacija se provodi na sobnoj temperaturi u trajanju dvasata. Katalizator se ukloni filtracijom, a otapalo uparavanjem pri snienom tlaku. Preostali uljni produkt otopi se u 160 mL vode i ekstrahira diklormetanom, najprije pri pH 6,0 i 6,5 (uklanjanje oneienja), a zatim pri pH 8,3. Ekstrakt pri pH 8,3 osui se bezvodnim natrijevim sulfatom i upari uz snieni tlak. Iskoritenje: 1,57 g (79 %). T t 113116 C; [ ] 20 D 33,9(c1, CH2 Cl2)

Priprava azitromicinaU tikvici od 50 mL otopi se 2,0 g (2,7 mmol) 10-dihidro-10-deokso-11-aza-eritromicina A u 12 mL kloroforma. Otopini se doda 0,2 mL formalina (36 %-tna otopina; 2,7 mmol formaldehida) i 0,2 mL (5,4 mmol) mravlje kiseline. Reakcijska se smjesa 10 sati grije pod povratnim hladilom na temperaturi vrenja, a zatim se ohladi na sobnu temperaturu, razrijedi sa 8 mL vode i ekstrahira diklormetanom pri pH 5 (uklanjanje oneienja) i 7,5. Ekstrakti pri pH 7,5 se spoje, osue bezvodnim kalijevim karbonatom i upare uz snieni tlak. Prekristalizacijom iz etera nastaje isti azitromicin. Iskoritenje: 1,8 g (87 %).

LITERATURA1. LIJEKOVI U PROSTORU: FARMAKOFORI I RECEPTORI , NENAD RAOS, RAIC MINTAS, Zagreb 1985

2. European Pharmacopoeia-Monographs, methotrexatum 01/2005:0560

3. Farmaceutska hemija, predavanja, B. Banjanin

4. http://www.belupo.hr/Default.aspx?sid=422