「染色体の構造と機能解明のためのナノデバイスに関する総 …...SPM 煮夜染色体工事構造の解明 p.51 2.1.2. 染色体の物理的特性の解析 p.65

総合研究事後評価

「染色体の構造と機能解明のためのナノ

デバイスに関する総合研究」

研究代表者名：牛木辰男（第Ⅰ期）、福井希一（第Ⅱ期）

研究期間：平成１２年４月～平成１８年３月

染色体の構造と機能解明のためのナノデバイスに関する総合研究

研究計画の概要 p.1

研究成果の概要 p.12

研究成果の詳細報告

1. 染色体の遺伝子地図に関するナノ解析

1.1. 染色体ナノ切断技術による遺伝子情報解析 p.21

1.2. 染色体ナノ FISH 法による遺伝子地図のナノスケール解析 p.37

2. 染色体のナノ構造解析とマテリアル開発

2.1. 細胞分裂における染色体ダイナミクスのナノ構造解析

2.1.1. SPM 煮夜染色体工事構造の解明 p.51

2.1.2. 染色体の物理的特性の解析 p.65

2.1.3. クロマチンファイバーの生化学的再構成 p.75

2.2. 染色体蛋白質の網羅的同定および機能解析

2.2.1. 染色体蛋白質の網羅的同定および機能解析 p.89

2.2.2. 染色体蛋白質の局在および動態解析 p.103

2.2.3. 染色体蛋白質の立体構造解析および相互作用解析 p.112

2.2.4. 染色体蛋白質の網羅的同定および機能解析 p.118

2.3. 染色体ナノ情報解析ツールの開発

2.3.1. オンチップ染色体ソーターの開発 p.124

2.3.2. 染色体の単離と供給 p.134

2.3.3. 動物染色体画像 DB の充実・公開と画像解析技法の開発 p.142

2.3.4. 植物染色体画像の収集と画像 DB の公開 p.150


研究計画の概要

■ プログラム名

総合研究（事後評価）

■ 研究課題名


■ 研究代表者名（所属研究機関名・役職）

第Ⅰ期（平成１２年４月～平成１５年３月）牛木辰男（国立大学法人新潟大学大学院医歯学総合研究科・教授）

第Ⅱ期（平成１５年４月～平成１８年３月）福井希一（国立大学法人大阪大学大学院工学研究科・教授）

■ 研究期間及び研究総経費（金額単位：百万円）

第Ⅰ期研究期間：3 年，研究総経費：780 百万円

第Ⅱ期研究期間：3 年，研究総経費：501 百万円

■ 研究規模

第Ⅰ期サブテーマ数：3，個別課題数：8，延べ研究機関：9，延べ研究者数：9 名

第Ⅱ期サブテーマ数：4，個別課題数：13，延べ研究機関：13，延べ研究者数：13 名

■ 研究の趣旨（提案書を基に研究を実施した背景、必要性、目的、目標等を記入してください）

【背景】従来のゲノムの構造と機能についての解析は、主として DNA 塩基配列の解明と個別の遺伝子に関する機能解明・制御とい

う側面から行われてきた。しかし、当然の事ながらゲノムには、これら現在の研究の主流をなしてきた課題以外にも、染色体や核の３

次元構造、細胞内構造の周期的動態変化などの未だ解明されていない多くの課題がある。これらゲノムの空間・時系列に関する情

報は充分に解明されることなく置かれていた。

【必要性】近、遺伝子・ゲノム機能の発現制御等を解明し、さらには操作していく上で、これらの空間・時系列情報が本質的な意味

を持っている事が明らかになりつつあり、近い将来、既に得られている DNA の塩基配列情報に立脚し、クロマチン、ゲノムさらには

核の高次構造およびその動態と関係づけてゲノムの発現制御機構が解明される時代が訪れると確信される。しかしながら、染色体・

ゲノムの高次構造を解析・操作する手法についてはきわめて限られているのが現状である。

【目的】本研究は、そこで、染色体・ゲノムの高次構造を解明し、操作する手法を開発することを目的とした。わが国では走査型プロ

ーブ顕微鏡をはじめ、光学的分子操作技術、半導体製造技術等、種々のナノテクノロジー分野では世界に伍する力量を有している。

こうしたナノテクノロジーを染色体・ゲノムの高次構造解析に具体的に応用・展開することが重要であると考えられた。またそれに加え

て、第Ⅱ期では近進展著しいプロテオミクスの分野も取り入れて染色体・ゲノムの高次構造をそのマテリアルであるタンパク質の面

からも解析する事とした。こうした課題に取り組むため、機械工学、マイクロマシン、計測工学、細胞生物学、分子生物学、プロテオミ

クスなどの多岐に渡る異分野の専門家を集結し、現在の生化学、分子生物学的手法を主としたゲノムプロジェクトとは別の、わが国

独自の新しい技術を確立することを目的とした。

【目標】具体的には、染色体のナノ解析・操作技術を確立し、染色体の構造・物理特性に関する画像・数値情報、および染色体操作

用デバイスを得る。また染色体に関係するタンパク質を網羅的に同定し、染色体構造との関連を解明する。そして終的に染色体・

ゲノムの高次構造の解明に立脚してその機能を解明することおよびナノテクノロジーを用いた染色体およびゲノムの解析・操作法を

開発することを目標とした。

■ 研究経緯の概要

1. 第Ⅰ期の研究計画及び研究成果の概要

第Ⅰ期では、染色体がもつ構造的側面を重視し、DNA から染色体までをナノ・マイクロレベルの「形」として可視化し、その立体構

造を直接的に解析することをめざした。さらに、形（物体）としてとらえることができた DNA やクロマチン線維をあたかも「手でつかむ」

1


ような感覚で操作するための近未来的な要素技術開発を行った。

この目的を達成するために、近年発達の著しい種々のナノテクノロジー（走査型プローブ顕微鏡をはじめ、光学的分子操作技術、

半導体製造技術等）を染色体の高次構造解析と操作に具体的に応用・展開した。これにより現在種々の生物で進められているゲノム

プロジェクトの一般的な手法（生化学、分子生物学的手法）とは異なる新しい構造機能解析法とナノ操作法の確立をめざした。特に本

研究では機械工学、マイクロマシン、計測工学、細胞生物学、分子生物学、バイオメトリクスなどの異分野の研究者を集学した体制を

とり、動物・植物等の材料にもとらわれない広い観点で、１）染色体の伸展・切断・輸送を中心とした要素技術の開発、２）走査プロー

ブ顕微鏡（原子間力顕微鏡と光プローブ顕微鏡）による染色体の高分解能可視化と三次元構造解析、３）プロジェクトで利用する染色

体の大量分取と班員への供給および得られた画像情報のデータベース化について検討した。

その結果、１）では、種々の伸展法を染色体に対して試み、マイクロニードル法により部位選択的な機械的伸展と染色体の力学特

性（伸展時の牽引力）の測定を可能にするとともに、これらの操作を力学フィードバック装置と結合するためのソフトウエアを開発した。

これにより、染色体を「手で触る」ような感触で任意の部位を機械的に伸展させるための要素技術を得ることができた。一方、原子間

力顕微鏡を用い、染色体の構造を可視化しながら目的の部位を機械的に切断することを可能にし、その断片を用いて PCR を行い、

位置特異的かつ自由に遺伝子増幅する事が可能であることを確かめた。これらの結果から、染色体の任意の部位の断片を作製し、

その遺伝子解析を行うための要素技術を得ることができた。さらに、半導体微細加工技術を用いて、染色体の輸送に適したマイクロ

流体デバイス（チップ）を作製し、染色体の大きさ別の個別輸送を行い、個々の染色体をチップ上で分別するためのオンチップに適

した要素技術を開発した。

２）では、ソレノイド構造をとるクロマチンファイバーの再構成をめざし、ヌクレオソームとセントロメア蛋白質による複合体を得ること

に成功するとともに、テロメア特異タンパク質とテロメア DNA による T ループ構造を解析し、部位特異的なクロマチンファイバー再構

成の基本情報を得た。また、原子間力顕微鏡により染色体を大気中のみならず液中で観察することに成功し、従来の電子顕微鏡で

は不可能な生体内を模擬した三次元高分解能情報が得られるようになった。この手法により、染色体の基本的な高次構造を明らか

にした。また、分染標本を含め種々の化学処理をほどこした染色体の構造変化についても解明した。さらに、光プローブ顕微鏡によ

り、原子間力顕微鏡像と近接場光像の高分解能同時観察法を確立し、三次元形状の中での蛍光標識物の局在解析が高分解能で可

能となった。またこの方法を用いて染色体FISH法における蛍光シグナルの光プローブ顕微鏡解析の基礎データを得ることに成功し

た。

３）では、本研究を推進する際の「マテリアル」である染色体を班員に大量に供給することをめざし、種々の細胞周期同調法および中

期染色体の単離・固定・分取法を比較検討し、ヒトおよびライムギを始めいくつかの植物染色体の大量単離法を開発した。これにより

各グループへの定期的な供給が可能になり、さらにセルソーターを利用して特定染色体の分取さらには供給も実施した。また本研

究を推進する上での染色体の「情報」の共有をめざし、染色体データベースシステムの構築を行った。加えてホームページ情報の

収集のための自動検索法を開発し、その情報も併せてデータベース化した。

2. 中間評価の概要（中間評価結果「今後の進め方」：ｂ）

第Ⅰ期では上記の３つのサブテーマ毎に目標を定めて研究を行い、１）では、伸展、切断、輸送、それぞれの要素技術の開発を

目標とし、各々の要素技術の基盤が確立され、２）においては、染色体の高分解能可視化と三次元構造解析を目標に、クロマチンフ

ァイバーレベルの可視化とその三次元構造の推定を行ったが、更なる検討が必要であった。３）については、支援技術として染色体

の大量分取と画像データベース化を目標とし、実際に染色体の分取と供給、データベースのグループ内公開が予定通り行われた。

以上、第Ⅰ期の研究は目標にほぼ到達したとし、研究成果に関しても、口頭発表も含めた研究発表等は約３００件、受賞2 件、特許

出願9 件と成果をあげており、また独自に国際シンポジウムの開催も行っており、概ね評価できる。しかしながら研究内容において

はかならずしもその連携、進捗は明確でなく、第Ⅰ期の段階ではバイオ・ナノ両分野の融合に関する成果が、具体的には見えにくい。

今後はナノを基盤技術として用いたバイオ研究を重視すれば、より融合、発展が期待できる。従ってここまで積み上げた結果をⅡ期

での具体的な成果に結実させるためには研究目標・体制の調整等を行い、目標をさらに絞込み終目標であるゲノム高次機能解析

を目指す研究として、代表者が視野を広げ、機能解明の明確化や、研究体制のスリム化、予算削減等の条件を踏まえる必要がある。

3. 第Ⅱ期の研究の概要

中間評価での指摘に基づき、第II期はバイオ分野とデバイス分野のより緊密な連携体制をとることとした。そのため、第II期では第

2


Ⅰ期でのそれぞれの成果をより一層融合した学際的な研究環境を作り、さらにバイオ研究に如何に役立つかという出口を明確にし

た体制へと移行させた。具体的には、研究代表者の交代を含めて研究体制を大幅に見直し、第I 期に確立したナノデバイスの各要

素技術（すなわち「伸展」・「切断」・「輸送」）の中で将来性のあるものを更に発展させて、染色体解析に実用可能な新しいナノデバイ

スを実際に作り上げるとともに、それを用いた遺伝子解析とソーティングへの利用を目指すこととした。すでに確立しつつあるナノ解

析法を利用して、具体的に細胞分裂というダイナミックな変化の中での染色体のナノ構造解析を行う。また、その目標への到達を確

実にするために、新たに染色体を構成する全ての蛋白質を網羅的に同定し、解析を進めることとした。その為、第Ⅰ期では３つあっ

た中課題を２つの中課題に整理し、２つ目の中課題に関しては研究項目を異にする３つの小課題を設けた。

【中課題１：染色体の遺伝子地図に関するナノ解析】第Ⅰ期で開発された染色体の自由な切断法と原子間力顕微鏡像と近接場光像

の高分解能同時観察法の各要素技術は、遺伝子地図の作製という、より生物学的な課題に統合された。そのため第Ⅱ期では染色体

切断用AFM（原子間力顕微鏡）プローブに加え、断片回収に適したAFMプローブを新規設計・作製し、回収技術の構築及びその

適化を行う。これら染色体切断・回収技術と、チャンバーアレイを用いた遺伝子検出法を統合させるとともに、染色体及び染色体断片

を配置したチップ上で特定遺伝子の PCR 増幅条件の適化を行う。また、走査型光プローブ顕微鏡によるシングルコピー遺伝子の

検出手法を確立し、さらに発展させることにより通常の光学顕微鏡では分離困難な、近距離あるいは隣接した複数の遺伝子の染色

体上の位置を高分解能で検出する。さらに、同時取得した染色体形状データとの対応づけを行ない、染色体の高次構造の中での遺

伝子の空間的配置やクロマチンファイバーの局所的折れ畳み構造をナノスケールで解析する。

【中課題２－１：細胞分裂における染色体ダイナミクスのナノ構造解析】第Ⅰ期に確立した染色体のナノオーダーでの解析法を基盤

としてその手法をさらに発展させる。すなわち細胞分裂の各期における染色体を原子間力顕微鏡の大気中・液中観察法を中心に、

ナノスケール解析し、クロマチン凝縮の過程とその構造変化を可視的に解明する。また染色体のマテリアルとしての側面を明らかに

するため、染色体伸展に基づく弾性率分布の測定など、ナノレベルでの物性解析を行う。またこうした染色体レベルからのアプロー

チとは逆に DNA レベルからの染色体構造構築へのアプローチとしてクロマチン再構成系を確立し、細胞分裂における DNA レベル

からの染色体構築に至る過程を生化学的およびナノレベルでの可視化法を併用して解明する。これにより、DNA から染色体に至る

クロマチンのダイナミックな構造を統一して理解する。

【中課題２－２：単離染色体による染色体タンパク質の同定と解析】第Ⅰ期に確立した染色体大量単離法を用いて、第II期は染色体

を構成する蛋白質の網羅的解析を進める。その為、高度精製単離ヒト染色体のプロテオーム解析を行い染色体蛋白質の網羅的同

定を完了する。また、染色体の塩処理により蛋白質の染色体構造における役割解明を行う。同定が完了した蛋白質については従来

のポリクローナル抗体作製法に加え、イーストディスプレイ法によるウサギモノクローナル抗体を作製し、細胞周期を通じた各蛋白質

の局在解析を行う。また染色体蛋白質の局在・動態解析も併せて行い生細胞内での機能を推定する。また、物理化学的手法を用い

て染色体凝縮やクロマチン再構成機構に関わる蛋白質の構造解析と相互作用解析を行い、それぞれの蛋白質の機能を分子および

原子レベルで解明する。終的には以上の情報をもとに蛋白質から見た分裂中期染色体の構造モデルを得る。

【中課題２－３：染色体ナノ情報解析ツール（ナノソーターなど）の開発】染色体情報解析ツールとしてヒトおよび植物染色体を対象

に、オンチップ染色体ソーティングを可能とする染色体ソーターを開発する。また、他の課題担当者が「マテリアル」として取り扱うこと

が可能となる量の染色体を単離し、ナノテクノロジーを基盤とした技術開発に適した形態の染色体試料を定期的に送付することを目

的として、第Ⅰ期で確立した同調・単離条件での染色体単離及び単離染色体を用いた染色体タンパク質の抽出を行い、班員に継続

的に送付する。さらに、第Ⅱ期では、第Ⅰ期において構築した動・植物染色体画像データベースを質・量ともにさらに発展させ、染

色体情報解析ツールとして、染色体画像以外の情報も包含したプロジェクト終了後もサービスを継続する染色体サイバーラボを構築

し、広く染色体、ナノテクノロジー関連研究者に公開する。

3


■ 実施体制

第Ⅰ期

研究項目担当機関等研究担当者

1. 染色体解析ナノテクノロジーの新たな開発

(1) ナノ構造体変換技術の開発

(2) 染色体ナノ操作法の開発

(3) オンチップ染色体ナノハンドリングシステムの開発

2. 新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

(1) 染色体の生化学的完全再構成系の開発

(2) 原子間力顕微鏡による染色体高次構造の解析

(3) 光プローブ顕微鏡による染色構造機能の解析

3. ナノ染色体解析のための支援技術の開発

(1) 染色体分取技術の開発

(2) 染色体画像情報のデータベース化に関する研究

4. 研究運営委員会・分科会

独立行政法人農業技術研究機構

北陸先端科学技術大学院大学材料科学

研究科

独立行政法人産業技術総合研究所

京都大学大学院生命科学研究科科

新潟大学大学院医歯学総合研究科

独立行政法人食品総合研究所

大阪大学大学院工学研究科

鹿児島大学理学部

新潟大学医学部附属病院


乙部和紀（主研）

○民谷栄一（教授）

井上貴仁（主研）

竹安邦夫(教授)

◎牛木辰男(教授)

大谷敏郎（室長）

○福井希一(教授)

宮本旬子（助教授）

赤澤宏平(教授)


◎ 代表者

○ サブテーマ責任者

4


第Ⅱ期

研究項目担当機関等研究担当者


(1) 染色体ナノ切断操作法による遺伝子情報解析

(2) 染色体ナノFISH法による遺伝子地図のナノスケール解析


(1) 細胞分裂における染色体ダイナミクスのナノ構造解析

1) SPMによる染色体高次構造の解明

2) 染色体の物理的特性の解析

3) クロマチンファイバーの生化学的再構成

(2) 単離染色体による染色体蛋白質の同定と解析

1) 染色体蛋白質の網羅的同定および機能解析

2) 染色体蛋白質の局在および動態解析

3) 染色体蛋白質の立体構造解析および相互作用解析

4) 染色体蛋白質の抗体作製

(3) 染色体ナノ情報解析ツール（ナノソーターなど）の開発

1) オンチップ染色体ソーターの開発

2) 動植物染色体の単離と送付

3) 動物染色体画像DBの充実・公開と画像解析技法の開発

4) 植物染色体画像の収集と画像DBの公開

3. 研究運営委員会・分科会

北陸先端科学技術大学大学院


新潟大学教育研究院医歯学系

北海道大学大学院理学研究科

京都大学大学院生命科学研究科


神戸大学発達科学部

大阪大学大学院薬学研究科

東京理科大学生命科学研究所

独立行政法人産業技術総合研究所


新潟大学医歯学総合病院

広島大学大学院理学研究科


○民谷栄一（教授）


○牛木辰男（教授）

川端和重（教授）

竹安邦夫（教授）

◎福井希一（教授）

近江戸伸子（助教授）

大久保忠恭（助教授）

東隆親（教授）

○井上貴仁（主研）

内山進（学内講師）

赤澤宏平（教授）

谷口研至（講師）

福井希一（教授）

◎ 代表者

○ サブテーマ責任者

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中間評価を受け作成した体制移行図

研究体制に対する中間評価の具体的な指摘事項は、１）研究代表者の交代，スリム化（グループ，班の削減）、２）目標の

明確化と具体的成果を出す、３）生化学的研究，in vivo での研究の強化というもので、これに基づいて研究代表者を交代

し２グループ制の研究体制を作成して文科省に提出した。これが評価報告書に掲載された体制移行図である。その後、第

二期の発足が確定した段階で、文科省から、第二期の体制を中間評価報告の指摘に沿って、メンバーの交代と指摘され

た研究項目の強化を図るように指示を受けた。そこで、乙部，宮本の課題の担当者をそれぞれ川端，谷口に交代、染色体

タンパク質関連の生化学的研究の強化を図る意味で、東，大久保，近江戸を加えた。こうして、再度移行図を作成して文

科省に提出し、これが承認されて次ページに示したような終的な体制が確定した。

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理由により確定したＩＩ期への移行図

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■ 研究運営委員会

第 I 期

氏名所属

◎ 廣澤一成

吉田廸弘藤田博之黒岩常祥石井俊輔

井上明 ○ 牛木辰男 ○ 福井希一 ○ 民谷栄一 ○ 大谷敏郎

東京大学名誉教授北海道情報大学教授東京大学生産技術研究所教授東京大学大学院理学系研究科教授理化学研究所筑波研究所主任研究員セイコーインスツルメンツ株式会社科学機器事業部技術一部・部長新潟大学大学院医歯学総合研究科教授大阪大学大学院工学研究科教授

北陸先端科学技術大学院大学材料科学研究科教授

独立行政法人食品総合研究所計測工学研究室長

◎ 研究運営委員長

○ 研究実施担当者

■ 運営委員会等の開催実績及び議題（参画機関やサブテーマ間の連携確保のためにとった処置等）

1. 運営委員会

第一回（平成12 年8 月6 日）

議題：教育講演（吉田迪弘委員他）

第二回（平成13 年6 月3 日）

議題：研究成果概要説明および研究計画検討

第三回（平成14 年5 月22 日）


2. （研究成果報告会）


各課題の概要説明


各課題の成果および計画発表


国際シンポジウム「GENETIC MATERIALS: AS THE TARGET OF NANO-BIOLOGY」

第四回（平成14 年5 月21 日）


第五回（平成14 年10 月9～11 日）

国際シンポジウム「INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CHROMOSOME RESEARCH AT THE NANO-ERA」

3. （研究連絡会）

第一回（平成12 年3 月20-21 日）

議題：本課題の主旨、経緯説明、および研究計画検討


サブリーダー会議、全体年間計画、予算配分検討

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サブグループ会議、研究計画検討、サブリーダー会議、経過概要、研究計画検討

■ 研究運営委員会

第 II 期

氏名所属

◎ 柳田敏雄山科正平

吉田廸弘

黒岩常祥

藤田博之

小林祐次

井上明

丹羽修身

中西博昭

○ 福井希一

○ 牛木辰男

○ 民谷栄一

○ 井上貴仁

大阪大学大学院生命科学研究科教授

北里大学医学部教授

北海道情報大学特任教授

立教大学理工学部教授

東京大学生産技術研究所教授

大阪薬科大学教授・大阪大学フロンティア研究機構特任教授

セイコーインスツルメンツ株式会社科学機器事業部技術一部部長

かずさＤＮＡ研究所染色体機能領域第１研究室室長

島津製作所基盤技術研究所主任研究員

大阪大学大学院工学研究科教授

新潟大学大学院教育研究院医歯学系教授

北陸先端科学技術大学院大学材料科学研究科教授

独立行政法人産業技術総合研究所主任研究員

◎ 研究運営委員長

○ 研究実施担当者

■ 運営委員会等の開催実績及び議題（参画機関やサブテーマ間の連携確保のためにとった処置等）

1. 運営委員会









2. （研究成果報告会）


各課題の第I 期の成果および計画発表



第三回（平成15 年12 月７日）

国際シンポジウム「INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CHROMOSOME RESEARCH AT THE NANO-ERA 2004」

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第五回（平成16 年10 月16, 17 日）

国際シンポジウム「NANO AND VISUAL BIOLOGY OF CHROMOSOME DYNAMICS」

第六回（平成16 年11 月22 日）


第七回（平成17 年5 月13 日）


第八回（平成18 年3 月9, 10 日）

国際シンポジウム「INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CHROMOSOME RESEARCH AT THE NANO-ERA 2006」

第九回（平成18 年3 月20 日）

各課題の成果発表

3. （研究連絡会）


サブグループ会議各課題に関する詳細な討議、分担者間の連携強化




サブリーダー会議各グループに関する詳細な討議、各サブグループ間の連携強化



第五回（平成16 年11 月22 日）


第六回（平成17 年5 月16 日）


第七回（平成17 年5 月17 日）


第八回（平成17 年12 月20 日）


第九回（平成17 年12 月25 日）


第十回（平成18 年3 月20 日）


第十一回（平成18 年3 月21 日）


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11



研究成果の概要

■ 要旨（研究成果の内容を要約し記入してください）

【染色体の遺伝子地図に関するナノ解析】第Ⅰ期で開発した原子間力顕微鏡像と近接場光像の高分解能同時観察

法の各要素技術を統合して複数の単一遺伝子の蛍光シグナルおよびトポ像の同時検出に成功し、染色体の遺伝子地

図をナノレベルで可視的に作成する基本技術を完成した。さらに従来に無い染色体切断用AFMプローブおよび染色

体回収用プローブを設計・作製し、染色体上の遺伝子を回収する技術を実現した。これにより染色体上の遺伝情報

をナノオーダーで可視化し、かつその遺伝情報をマテリアルとして自由に回収することが可能となった。【染色体のナノ構造解析とマテリアル開発】１）細胞分裂における染色体ダイナミクスのナノ構造解析では、第

Ⅰ期で手がけた液中での染色体可視化法を完成させ、生の染色体の立体構造をナノメートルレベルの分解能での可

視化することに成功した。併せて細胞周期を通じてDNAから染色体に至るクロマチンのダイナミックな構造変化を

解析し、染色体凝縮がクロマチン線維の梱包の差によるものであることを証明した。２）単離染色体による染色体

蛋白質の同定と解析では、単離ヒト染色体のプロテオーム解析を完了し、染色体を構成する200種類以上の蛋白質

の網羅的同定を完了した。また比較プロテオーム解析や作製した抗体を利用した局在および動態解析により、これ

ら蛋白質を4つのグループに分類し、染色体構造と関連付けて「染色体蛋白質4層モデル」を提唱した。３）染色体

ナノ情報解析ツールの開発では、第Ⅰ期で作製した染色体の大きさ別の選別を可能とするマイクロ流体デバイス（チ

ップ）に基づきオンチップ染色体ソーターを実現した。また第Ⅰ期において構築した染色体画像データベースをさらに発

展させ、自立的染色体サイバーラボを構築し、広く染色体、ナノテクノロジー関連研究者のフォーラムとして公開した。

■ 研究目標（課題採択時に決定した研究目標を簡潔に箇条書きで記入してください）

① 走査プローブ顕微鏡および光プローブ顕微鏡を用いて染色体切断などのマニュピュレーション操作、染色体上の特

定遺伝子のナノ FISH 解析を実現するとともに、マイクロチャンバアレイを用いた染色体チップを開発する。

② 第 I 期で確立した原子間力顕微鏡（走査プローブ顕微鏡）による染色体のナノスケール構造解析法を用いて、１）分

裂各期における染色体の高次構造変化の解明と液中イメージング、２）染色体の力学特性（弾性率分布と粘弾性変

形特性）の解明、３）生化学的なクロマチン再構成系の確立をめざす。

③ ヒト染色体蛋白質の網羅的解析、同定した染色体タンパク質に対する抗体の作製、抗体を用いた局在解析と生細胞

内での動態解析、および染色体構造に関わる蛋白質の立体構造解析を行う。

④ 染色体情報解析ツールとしてチップ上での染色体ソーティングを可能とするオンチップ染色体ソーターを開発する。

ヒト及び植物染色体を大量かつ適切に単離し、定期的に課題担当者に供給する。第Ⅰ期において構築した染色体

画像データベースをさらに発展させ、染色体画像以外の情報も包含した染色体サイバーラボを構築し、広く染色体、

ナノテクノロジー関連研究者のフォーラムとして公開する。

■ 目標に対する結果（前記目標に対比させてその結果を箇条書きで記入してください）

① ナイフエッジ型およびピンセット型など独創的な AFM プローブを開発し、これを用いた染色体の切断、移送、回収、

再配置などのナノマニュピュレーションを実現するとともに、SNOM/AFM による特定染色体部位のナノ FIISH シグナ

ル解析を実現した。また染色体チップによる遺伝子増幅法を開発した。

② １）分裂各期における染色体の高次構造変化の解析から染色体の凝縮がクロマチン線維の梱包の強弱に関わること

を示し、さらに液中での生の染色体の立体構造をナノメートルレベルの分解能で可視化した。２）染色体の力学特性

については、弾性率分布において染色体上に約１μm のドメイン様構造が存在することと、マニピュレーションによる

染色体の牽引実験法から、染色体の粘弾性変形に影響する染色体の階層構造の存在を示した。３）生化学的なクロ

マチン再構成については、長鎖 DNA とコアヒストンで再構成したヌクレオソームファイバーにリンカーヒストン H1 を加

12



えることでより高次の 30 nm ファイバーの形成に成功した。30nm ファイバーまでのクロマチン線維形成にはヒストンと

イオン環境が、それより高次の線維形成（ないし線維凝縮）には非ヒストン蛋白質が重要であることを明らかにした。

③ ヒト染色体のプロテオーム解析を完了し、染色体を構成する 200 種類以上の蛋白質を同定した。また同定した染色

体蛋白質に対する抗体を作製して局在解析、さらには動態解析を行った。比較プロテオーム解析、局在・動態解析

の結果から同定した染色体蛋白質を 4 つのグループに分類した。これらの結果を統合し、「染色体蛋白質 4 層モデ

ル」を提唱した。また、染色体構造に関わる蛋白質の大量発現系構築し、立体構造解析をすすめた。

④ 染色体選別の飛躍的効率化を目指して、チップ上でのソーターのプロトタイプを開発した。第Ⅰ期から継続してきた

ヒトおよび植物染色体の単離、および班員への安定的供給は目標どおり達成した。染色体画像データベースの開

発においては、画像データベース、文献・URL 情報の共有化を図ることにより、サイバーラボを実現した。染色体画

像データベース（CILib）へ 8 万件の登録を完了し、プロジェクト終了後も持続する自律型染色体画像登録システムを

構築した。

■ 科学的・技術的価値（研究の創造性や独創性、得られた成果の世界的な価値について、具体的な事例を

挙げて客観的に記入してください）

【研究の創造性や独創性】従来のゲノム解析は、塩基配列の解明と遺伝子に関する機能解明が中心であった。しかし、ゲ

ノムは染色体の３次元構造、周期的動態変化など空間・時系列に関する情報を有しており、これらが遺伝子発現制御に本

質的な意味を有することが明らかになりつつある。こうした背景の下、本研究では染色体の動的構造をナノレベルで可視化

さらには操作するため、必要な技術を自前で開発しつつ、研究を進めた。第Ⅱ期ではさらに染色体を蛋白質からも解析し

た。そのため、機械工学、計測工学、細胞・分子生物学などの異分野を集学し、わが国独自の新しい技術を確立しつつ研

究することをめざした。こうした取り組みは、世界的に見ても極めて斬新なものであり、独創性については高い評価を受けて

いる。

【得られた成果の世界的な価値】具体的な成果としては、①染色体地図を作成するための従来に無い技術として、走査

型プローブ顕微法（AFM、SNOM/AFM）を用いて染色体上の特定標識領域を検出し、回収する新技術を開発した。②液

中でのナノレベル染色体観察法を開発し、染色体の部位差のある高次構造モデルを提案した。③染色体蛋白質のプロテ

オーム解析を進め２００以上の蛋白質を網羅的に同定し、「染色体蛋白質４層モデル」を提案した。④オンチップ染色体ソ

ーティング技術を開発するとともに８万点の画像データを有する持続的データベースを構築一般公開した。これらの成果は

いずれも世界初のものであり、染色体をマテリアル（蛋白質）として解析し、さらには染色体の操作、構造および機能解明に

直結する革新的技術を開発したと言える。本プロジェクトの成果はロンドンでの第１５回国際染色体学会（２００５年）で発表

された本研究成果の内３つが学会賞へノミネートされるなど世界的にも注目を集めている。更に米、英、独の関連研究者の

高い評価により、本プロジェクトの報告書は米国出版社より「Chromosome Nanoscience and Technology」（仮題）として刊行

される。

■ 科学的・技術的波及効果（研究成果にどのような波及効果が期待されるか記入してください）

【波及効果】 ① SNOM/AFM および新規開発したプローブを有する AFM により、ナノ・マイクロレベルでの DNA やタンパ

ク質標識の検出および標識部位・標識物の自由な回収が可能となった。これにより、ゲノムおよび分子細胞生物学分野の

基礎分野のみならず遺伝子診断など基礎医学分野での本方法の広範な利用が期待される。② 数ナノからから数十マイ

クロメータの生体内の構造体に対して、真空中、空気中、液中等考えうるすべての環境下で構造解析を可能とする AFM 技

術を開発した。これによりナノバイオロジーを現実のものとする重要なキーテクノロジーのひとつが生み出されたと言える。

③未だ構造が不明である染色体に対して「染色体蛋白質４層モデル」を公表した。これは既に世界の著名な研究者 1000

人が選ぶ注目論文１，０００選（Factor1000）に選ばれ、今後の染色体の機能・構造解析研究に対してマイルストーンとなる

研究成果と言える。実際、このモデルを発表した論文は掲載誌においても読まれている月間 50 選（毎月７００報以上が

掲載される）にも選ばれている。④高額かつ大掛かりな装置を必要とした従来のセルソーターに代わって染色体の単離・分

別をチップ上で行うことを可能とし安価で効率的な新しい染色体診断法を開発するための基本技術を開発した。⑤染色体

13



をマテリアルおよび画像情報として取扱うための手法を確立したことにより企業、大学を問わず染色体および染色体画像を

供給することが可能となった。

■ 研究計画・実施計画について（研究計画の妥当性、実施体制の連携性について記入してください）

【研究計画の妥当性】現在、「ナノバイオロジー」と一括されている分野は、本研究の計画時点には言葉すら定かには存

在しない状況であった。こうした中で本研究では機械工学、計測工学、情報科学研究者と分子・細胞生物学、基礎医学の

研究者を、染色体高次構造の動的解析と操作関連新技術の創出という点に絞ってナノ・マイクロレベルで融合し、研究計

画を策定した。現在のナノバイオロジーや染色体研究の興隆を見れば、本計画は先見性があり妥当であったと言える。

【実施体制の連携性】研究の実施においては、両分野の研究者が自由にアイデア交換し、さらには共同研究することが

可能な体制を作り上げた。特に、工学系研究者にとっては生体材料としての染色体の調整が研究の壁となるので、関係す

る全ての班員に染色体を単離・供給する体制を当初より作りあげた。また、得られた情報、特に染色体の画像情報に関して

はそれをデータベースとして共有する体制も作り上げた。これらは６年間の研究期間、機能し続けたことから、染色体を取り

扱った経験の無い研究者も負担無く研究に参画可能となった。また運営委員会の助言を生かして、課題間の連携につい

ては意識的に取り組んだ。その結果、通常は機能しない異分野の融合研究が強い連携の下成功裏に進められた。

■ 今後の発展方向、改善点等

【今後の発展方向】例えば東京大学でのナノバイオインテグレーション研究拠点の成立などを挙げるまでもなく、ナノバイ

オロジーは新しい研究潮流として大きく発展しつつある。したがって本研究で取り上げたナノバイオロジー分野の今後の発

展は疑うところがない。具体的には、１）染色体の研究、特にクロマチンレベルでのヒストンタンパク質の翻訳後修飾によるエ

ピジェネシスの課題などは遺伝情報の発現制御の面で大きな発展を見せつつある。こうした課題をさらに発展させる上でク

ロマチンのナノ構造情報はきわめて重要であり、本研究で種々開発された観察、操作の両面における走査型プローブ顕

微鏡を用いた新手法の応用範囲はますます広がるものと考えられる。２）現在のヒトでのプロテオーム解析、抗体研究、動

態解析の進展を見るならば第Ⅱ期で取り上げた、染色体の構成マテリアルとしての蛋白質を網羅的に同定した成果は、基

礎生物学から医学的応用まで極めて広範囲にわたり基本情報として今後ますます活用されると考えられる。

【改善点】異分野融合型の研究には試料、情報の提供を継続して行うサポート部門を位置付けるのみならず、参画研究

者の意識改革、意識融合を行うための積極的な研究・分野交流をより一層計る必要があったと考えられる。

14



3. 所要経費(一般管理費を含む)

第Ⅰ期

所要経費

研究項目担当機関等研究

担当者Ｈ12

年度

Ｈ13

年度

Ｈ14

年度合計

1. 染色体解析ナノテクノロジーの新た

な開発

(1) ナノ構造体変換技術の開発

(2) 染色体ナノ操作法の開発

(3) オンチップ染色体ナノハンドリング

システムの開発

2. 新しいナノテクノロジーの染色体解

析への展開

(1) 染色体の生化学的完全再構成系

の開発

(2) 原子間力顕微鏡による染色体高

次構造の解析

(3) 光プローブ顕微鏡による染色構造

機能の解析

3. ナノ染色体解析のための支援技術

の開発

(1) 染色体分取技術の開発

(2) 染色体画像情報のデータベース

化に関する研究

4. 研究課題の推進

独立行政法人農業

技術研究機構

北陸先端科学技術

大学院大学材料科

学研究科

独立行政法人産業

技術総合研究所

京都大学大学院生

命科学研究科科

新潟大学大学院医

歯学総合研究科独

立行政法人食品総

合研究所

大阪大学大学院工

学研究科

鹿児島大学理学部

新潟大学医学部附

属病院

文部科学省研究振

興局

乙部和紀

○民谷栄

一

井上貴仁

竹安邦夫

◎牛木辰

男

大谷敏郎

○福井希

一

宮本旬子

赤澤宏平

19

39

22

22

77

22

33

22

0

1

26

41

26

26

48

26

58

26

0

0.5

24

41

24

24

45

24

39

12

12

0.5

69

121

72

72

170

72

130

60

12

2

所要経費（合計） 257 277.5 245.5 780

(単位：百万円)

15



第Ⅱ期（直接経費のみ記入してください）

所要経費研究項目担当機関等研究担当者 H15

年度

H16

年度

H17

年度合計

1.染色体の遺伝子地図に関するナノ解

析

(1)染色体ナノ切断操作法による遺伝子

情報解析

(2)染色体ナノFISH法による遺伝子地

図のナノスケール解析

2.染色体のナノ構造解析とマテリアル

開発

(1)細胞分裂における染色体ダイナミク

スのナノ構造解析

1)SPMによる染色体高次構造の解析

2)染色体の物理的特性の解析

3)クロマチンファイバーの生化学的再

構成

(2)単利染色体による染色体蛋白質の

同定と解析

1)染色体蛋白質の網羅的同定および

機能解析

2) 染色体蛋白質の局在および機能解

析

3)染色体蛋白質の立体構造解析およ

び相互作用解析

4)染色体蛋白質の抗体作製

(3)染色体ナノ情報解析ツール（ナノソ

ーターなど）の開発

1)オンチップ染色体ソーターの開発

2)動植物染色体の単離と送付

3)動植物染色体画像DBの充実・公開と

画像解析技法の開発

4)植物染色体画像の収集と画像DBの

公開

３．研究運営委員会・分科会

北陸先端科学技術大

学大学院独立行政法人食品

総合研究所新潟大学教育研究

院医歯学系北海道大学大学院

理学研究科京都大学大学院生

命化学研究科大阪大学大学院工

学研究科神戸大学発達科学

部大阪大学大学院薬

学研究科東京理科大学生命

科学研究所独立行政法人産業

技術総合研究所大阪大学大学院工

学研究科新潟大学医歯学総

合病院広島大学大学院理

学研究科大阪大学大学院工

学研究科

民谷栄一大谷敏郎 ○牛木辰男川端和重竹安邦夫 ◎福井希一近江戸伸子大久保忠恭東高親 ○井上貴仁内山進赤澤宏平谷口研至福井希一

１７

１５

１２

４

１２

２５

７

１３

６

１２

８

６

３

５

１６

１４

１７

７

１２

３２

７

１３

１１

１２

６

１３

４

７

１１

７

２４

６

１０

３３

５

１３

２２

１３

４

１９

８

１０

４４

３６

５３

１７

３４

９０

１９

３９

３９

３７

１８

３８

１５

２２

所要経費（合計）１４５１７１１８５５０１

16



4. 使用区分

第Ⅰ期（直接経費のみ記入してください）

染色体解析ナノテクノロ

ジーの新たな開発

新しいナノテクノロジー

の染色体解析への展開

ナノ染色体解析のため

の支援技術の開発計

設備備品費※ 63 104 112 279

試作品費 20 0 0 20

消耗品費 116 121 42 279

人件費 24 47 15 86

その他 28 36 20 84

計 252 307 190 748


※設備備品費の内訳（購入金額 5 百万円以上の高額な設備備品の購入状況を記入してください）

(装置名：購入期日，購入金額，購入テーマの順)


（装置名：購入期日，購入金額，購入テーマの順）

① ナノプローブ操作装置：2000 年，15 百万円，染色体解析ナノテクノロジーの新たな開発

② ブルーレーザー顕微鏡システム：2000 年，15 百万円，染色体解析ナノテクノロジーの新たな開発

③ 走査型レーザ生物顕微鏡システム：2000 年，11 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

④ 超高速パーフュージョンクロマトグラフィー：2000 年，6 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

⑤ 多機能走査プローブ顕微鏡システム：2000 年，36 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

⑥ 染色体前処理装置：2000 年，13 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

⑦ 蛍光顕微鏡：2000 年，7 百万円，ナノ染色体解析のための支援技術の開発

⑧ 画像データベースシステム：2000 年，14 百万円，ナノ染色体解析のための支援技術の開発

⑨ 走査型プローブ顕微鏡システム：2001 年，15 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

⑩ 染色体解析用計算機システム：2001 年，7 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

⑪ 染色体分取装置：2001 年，35 百万円，ナノ染色体解析のための支援技術の開発

⑫ 染色体画像データベースシステム：2001 年，20 百万円，ナノ染色体解析のための支援技術の開発

⑬ 走査型プローブ型ダイセクションシステム：2002 年，11 百万円，染色体解析ナノテクノロジーの新たな開発

⑭ 遠心分離システム：2002 年，8 百万円，新しいナノテクノロジーの染色体解析への展開

⑮ 遠心機：2002 年，7 百万円，ナノ染色体解析のための支援技術の開発

⑯ 染色体画像データベースの改良：2002 年，9 百万円，ナノ染色体解析のための支援技術の開発

17



第Ⅱ期（直接経費のみ記入してください）

染色体の遺伝子地

図に関するナノ解

析

細胞分裂における

染色体ダイナミクス

のナノ構造解析

単離染色体による

染色体蛋白質の

同定と解析

染色体ナノ情報解

析ツール（ナノソー

ターなど）の開発

計

設備備品費※ 12 33 14 9 68

試作品費 0 0 5 0 5

消耗品費 14 34 103 32 183

人件費 44 17 55 20 136

その他 10 20 10 47 84

計 80 104 187 108 479



（装置名：購入期日，購入金額，購入テーマの順）

① 高速走査型プローブ顕微鏡 AFM ユニット電装部及び制御部：2005 年 3 月 1 日, 7 百万円, 細胞分裂における染色

体ダイナミクスのナノ構造解析

② タンパク質間相互作用検出装置 2006 年 1 月 31 日、5 百万円、単離染色体による染色体蛋白質の同定と解析

18



■ 5. 研究成果の発表状況（本振興調整費による成果に限り記入してください）

研究発表件数

原著論文による発表

（査読付き）左記以外の誌上発表口頭発表合計

国内第Ⅰ期 4 件

第Ⅱ期 12 件

第Ⅰ期 29 件

第Ⅱ期 50 件

第Ⅰ期 127 件

第Ⅱ期 402 件

第Ⅰ期 160 件

第Ⅱ期 464 件

海外第Ⅰ期 70 件

第Ⅱ期 142 件

第Ⅰ期 12 件

第Ⅱ期 12 件

第Ⅰ期 50 件

第Ⅱ期 129 件

第Ⅰ期 132 件

第Ⅱ期 283 件

合計第Ⅰ期 74 件

第Ⅱ期 154 件

第Ⅰ期 41 件

第Ⅱ期 62 件

第Ⅰ期 177 件

第Ⅱ期 531 件

第Ⅰ期 292 件

第Ⅱ期 747 件

特許等出願件数

第Ⅰ期 39 件（うち国内 31 件、国外 8 件）

第Ⅱ期 10 件（うち国内 9 件、国外 1 件）

合計 49 件（うち国内 40 件、国外 9 件）

受賞等

第Ⅰ期 3 件（うち国内 2 件、国外１件）

1．民谷栄一産学連携推進いしかわ賞貢献賞（平成 12 年）

2．福井希一：日本遺伝学会第 73 回大会ベストペーパー賞（2001）

第Ⅱ期 7 件（うち国内 3 件、国外 4 件）

1． Y Matsubara, M Kobayashi, Y Morita, Y Takamura, E Tamiya, Biosensor and Bioelectronics Award, 3rd place. （The

Eighth World Congress on Biosensors, 2004.5.24-26, Spain）

2．第 15 回国際染色体学会（2004.9，London）本研究成果について３つの発表が学会賞ノミネート

3．牛木辰男：平成 16 年度新潟日報文化賞（学術部門）

（受賞理由「顕微鏡の先端技術を用いた生体立体構造の研究」）

4．川端和重他：Journal of physical Society 注目論文賞(2005.11)

主な原著論文による発表（査読制度のある雑誌への投稿論文に限る）

国内誌（国内英文誌を含む）

1) 武川哲也、中川和久、橋口原、斎藤真人、山中啓一郎、民谷栄一：「ナノ物質のマニピュレーションを行う為の AFM

ピンセットの開発」、電気学会論文誌 E（センサ・マイクロマシン準部門誌）、125(11)、 448-453、(2005)

海外誌

1) T. Inoue, H. Yokoyama, K. Takahashi: 「 Integrated microfluidics for chromosome engineering -preparation,

transportation and manipulation-」, Arch. Histol. Cytol., 65, 457-463 (2002).

2) H. Nakao, H. Hayashi, T. Yoshino, S. Sugiyama, K. Otobe, T. Ohtani：「Development of Novel Polymer-Coated

Substrates for Straightening and Fixing DNA」, Nano Lett., 289, 475-479, (2002).

3) T. Ushiki, T., O. Hoshi, K. Iwai, E. Kimura, and M. Shigeno: 「The structure of human metaphase chromosomes: its

histological perspective and new horizons by atomic force microscopy.」, Arch Histol Cytol 65, 377-90 (2002).

4) Hizume, K., Yoshimura, S. H., Maruyama, H., Kim, J., Wada, H., and Takeyasu, K.:「Chromatin reconstitution:

development of a salt-dialysis method monitored by nano-technology.」, Arch Histol Cytol, 65, 405-413, (2002)

5) D. Fukushi, M. Shichiri, S. Sugiyama, T. Yoshino, S. Hagiwara, T. Ohtani：「Scanning near-field optical/atomic force

19



microscopy detection of fluorescence in situ hybridization signals beyond the optical limit」, Experimental Cell

Research, 289, 237-244, (2003).

6) A. Sakai, Hizume, K., Sutani, T., Takeyasu, K., and Yanagida, M.:「Condensin but not cohesin SMC heterodimer

induces DNA reannealing through protein-protein assembly.」, EMBO J, 22, 2764-2775, (2003).

7) Lee, J. H., Ma, Y., Wako, T., Li, L.C., Kim, K.Y., Park, S.W., Uchiyama, S., and Fukui, K. Flow karyotypes and

chromosomal DNA contents of genus Triticum species and rye (Secale cereale). Chromosome Res. 12, 93-102 (2004).

8) Y. Matsubara, K. Kerman, M. Kobayashi, S. Yamamura, Y. Morita, Y. Takamura, E. Tamiya：「On-Chip

Nanoliter-Volume Multiplex TaqMan Polymerase Chain Reaction from A Single Copy Based on Counting

Fluorescence Released Microchambers」, Anal. Chem, 76, 6434-6439, (2004).

9) O. Hoshi, R. Owen, M. Miles and T. Ushiki: 「Imaging of human metaphase chromosomes by atomic force microscopy

in liquid.」, Cytogent. Genome Res. 107, 28-31 (2004).

10) K. Takeyasu, Kim, J., Ohniwa, R. L., Kobori, T., Inose, Y., Morikawa, K., Ohta, T., Ishihama, A., and Yoshimura, S.

H.:「Genome architecture studied by nanoscale imaging: analyses among bacterial phyla and their implication to

eukaryotic genome folding.」, Cytogenet Genome Res, 107, 38-48, (2004).

11) Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Sone, T., Matsunaga, S. and Fukui, K., Protein composition of

human metaphase chromosomes analyzed by two-dimensional electrophoreses. Cytogenet. Genome Res., 107, 49-54

(2004).

12) E. Kimura, O. Hoshi and T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of human metaphase chromosomes after differential

staining of sister chromatids.」, Arch. Histol. Cytol. 67, 171-177 (2004).

13) Shin-ichi Toyabe et al.:「CHRONIS: an animal chromosome image database」, Chromosome Research, Vol. 76,

259-265, (2005).

14) Higashi, T., Miyakawa, S., Uchiyama, S., Matsunaga, M., Takata, H., Fujimoto, S., Noda, N., Terauchi, A., Shimizu,

S., Oda, O., Azuma, T., and Fukui, K., Generation of monoclonal antibodies against chromosomal antigens that have

a high sequence similarity between humans and mice. J. Biotechnology 120, 262-72 (2005).

15) Lin, L., Nakano, H., Uchiyama, S., Fujimoto, S., Matsunaga, S., Nakamura, S., Kobayashi, Y., Ohkubo, T. and Fukui,

K. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a conserved domain in plants and prokaryotes

from Pyrococcus horikoshii OT3. Acta Cryst. F 61, 414-416 (2005).

16) Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Hori, N., Higashi, T., Hayashihara, K., Sone, T., Higo, D.,

Nirasawa, T., Takao, T., Matsunaga, S. and Fukui, K. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol.

Chem. 280, No.17, 16994-17004 (2005).

17) Ma, Y. Z. Lee, J. H. Li, L. C. Uchiyama, S. Ohmido, N. and Fukui, K. Fluorescent Labeling of Plant Chromosomes in

Suspension by FISH. Genes & Genetic Systems 80, 35-39 (2005).

18) K. Hizume, Yoshimura, S. H., and Takeyasu, K.:「Linker Histone H1 per se Can Induce Three-Dimensional Folding of

Chromatin Fiber.」, Biochemistry, 44, 12978-12989 (2005).

19) O. Hoshi, O and T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of native human metaphase chromosomes in a liquid.」, Arch.

Histol. Cytol. 69, 73-78 (2006).

20) Kobayashi, S., Uchiyama, S., Sone, T., Noda, M., Lin, L., Mizuno, H., Matsunaga, S., and Fukui, K. Calreticulin as a

new histone binding protein in mitotic chromosomes. Cytogenet. Genome Res in press (2006).

情報発信（シンポジウム、一般向けのセミナー、Web 公開等）

1) Web 公開:「Chromosome Information Network」, (http://cilibrary.hiroshima-u.ac.jp/hiroshima), 広島大学, 2005.9.1

2) Web 公開:「ナノ染色体情報システム(CHRONIS)」, 2004.8-, http://chromosome.med.niigata-u.ac.jp/

3) 「サイエンスカフェ：DNA をみる」, 神戸, 酒心館, 2006.5

20




1.1. 染色体ナノ切断技術による遺伝子情報解析

担当機関名研究室名北陸先端科学技術大学院大学マテリアルサイエンス研究科

研究者名民谷栄一

■ 要旨

本研究では、プローブ顕微鏡などによる物理・機械的操作の可能性に着目した染色体ナノ切断操作法と、その技術に

基づいて切断・加工された染色体特定部位構成成分の解析を可能にする染色体チップの開発を目的とした。これらの実

現に向け、プローブ顕微鏡などによる染色体の直接的な加工操作と、チップデバイスによる遺伝子検出の二方向よりアプ

ローチしてきた。半導体微細加工技術に基づいて、ナイフエッジ形状の染色体加工用 AFM プローブを独自に設計作製し

これ用いた染色体切断条件の適化を行い、従来のAFMプローブでは得られないシャープな切断を可能にするとともに、

同プローブをマニピュレーションすることにより切断片の基板上での移動を可能にした。また、イメージング能と回収能を併

せ持つピンセット型の染色体回収用プローブも新たに設計・作製し、これを用いて AFM 操作上で染色体切断片のイメージ

ングおよび回収を実現した。一方、マイクロチャンバーを用いた染色体の遺伝子解析のためにシリコン製マイクロチャンバ

ーアレイ（50nl容量チャンバー、1248個アレイ）を設計・作製し、これに開発したピンセットプローブを用いて特定染色体（１

および２番）およびその断片を導入し、マイクロチャンバーアレイ上で部位特異的（RhD 遺伝子:１番染色体、MYO3B 遺伝

子：2 番染色体）に増幅することが示唆できた。

■ 目的

本研究では、プローブ顕微鏡などを用いた物理的操作法に着目した新規な染色体切断・加工技術の開発を目的として

いる。特に、染色体ナノ加工技術のひとつとして特定染色体の特定部位をナノスケールで精密に操作、加工する技術を開

発するところに主眼をおいている。また、開発したナノダイセクション技術を用いて微細構造を維持した染色体ナノ断片を

作製し、これらを基板上に多数配置した染色体ナノチップの開発を検討する。これによりマイクロマシン技術を駆使した染

色体チップ作製技術の基礎を確立する。

第Ⅰ期において、AFM 探針の動作モードと走査条件を独自に適化し、タッピングモードで染色体をナノ断片化できる

事を示した。特に、ナノメートルスケールのイメージングにより得られた形態的な情報から特定染色体の特異部位を断片化

し、そこに含まれる目的遺伝子の存在を確認できた。また半導体微細加工技術に基づいてシリコン製ナノリッターチャンバ

ーアレイチップを作製し、微少量 PCR による DNA 増幅の可能性が示唆された。しかし、市販の AFM プローブによる操作に

は加工精度に困難が伴うことや回収が行えないこと、またシングルコピーレベルの遺伝子増幅に関する課題があった。第

Ⅱ期においては、AFM 等によるナノダイセクション、切断断片の回収などに特化した AFM プローブを新規に設計作製し、

AFM マニピュレーション法を確立するとともに精度向上を図る。また、シリコンチャンバー上での微少量 PCR によって、単一

の特定染色体からの特定遺伝子の増幅・検出法を確立する。ナノ操作技術により作製した染色体ナノ断片を本マイクロチ

ャンバー配置した染色体チップを構成し、新たな染色体解析ツールを実現する。特に、「染色体ナノ FISH 法による遺伝子

地図のナノスケール解析」グループとの連携を図り、切断部位の特定を行い、終的には高精度遺伝子地図の作成の解

析手法を開発する。

■ 目標

① AFM プローブを用いて染色体の特定部位の高精度切断（〜100nm）を実現する。

② 切断染色体を確実に回収する技術を実現する。

③ 染色体チップを作成し、高精度染色体解析（染色体地図など）を実現する。

21



■ 目標に対する結果

① 独自に創案設計したナイフエッジ形状の染色体加工用 AFM プローブを作製し、これを用いた染色体切断条件の

適化を行った結果、従来の AFM プローブでは得られないシャープな切断を可能にすることができた。

② 犠牲層導入基板を用いた染色体回収、抗体固定化 PS 微粒子を介した染色体回収、新規に設計・作製したピンセ

ット型プローブを用いた回収など種々検討した結果、ピンセット型プローブを用いた方法が有効であった。ナイフエ

ッジ形状 AFM プローブを用いマニピュレーションすることにより切断片の基板上での移動を可能にした。また、イメ

ージング能と回収能を併せ持つピンセット型の染色体回収用プローブを新たに設計・作製し、これを用いて AFM 操

作上で染色体切断片のイメージングおよび回収を実現した。

③ 染色体解析基盤技術として、微小体チップを用いるタンパク質検出法、電気化学的 DNA・タンパク質検出法、マイ

クロチャンバーを用いる遺伝子増幅・検出法、フロー型チップを用いる遺伝子増幅・検出法を検討した。結果として、

マイクロチャンバーを用いた染色体の遺伝子解析のために、シリコン製マイクロチャンバーアレイ（50nl 容量チャン

バー、1248 個アレイ）を設計・作製し、これに開発したピンセットプローブを用いて特定染色体（１および２番）および

その断片を導入し、マイクロチャンバーアレイ上で部位特異的（RhD 遺伝子:１番染色体、MYO3B 遺伝子：2 番染色

体）に増幅することが示唆できた。

■ 研究方法

（1）染色体試料調製

植え継ぎ後 24 時間培養したヒトリンパ球培養細胞である BALL-1 株に、50 ng/mL になるようにコルセミドを添加、同調さ

せ、14 時間後、細胞培養液を遠心分離により回収した。クエン酸バッファー（0.1 M citric acid, 0.1 M sucrose, 0.5 %

Tween20, pH 2.7）にて単離し、カルノア液(酢酸エタノール 1:3)固定した。この染色体サンプルは、大阪大学大学院工学研

究科応用生物工学専攻生命反応工学講座の福井教授、内山助手より提供された。

（2）マイクロチャンバーアレイによる DNA 増幅と検出

マイクロチャンバーアレイを用いた DNA 増幅における初期 DNA 量について検討した。以前に報告したように微細加工技

術を基に、1 チャンバー: 650×650×200 μm （50 nL）が 24×52＝1024 個集積化されたマイクロチャンバーアレイを作製

した。DNA 増幅の検出は TaqManTM 法を用い、蛍光顕微鏡観察によって行った。標的遺伝子を Rhesus D (RhD)とし、

TaqMan Control Reagents と AmpliTaq Gold DNA polymerase（Applied Biosystems）を用いた。マイクロチャンバー内に標的

遺伝子に対するプライマー及び TaqMan プローブをナノリッターディスペンサーにより分注し、乾燥させた。次に、チップ表

面をミネラルオイルでコートし、テンプレート DNA を含む PCR 溶液をオイル層の上からディスペンサーにより正確に導入し、

PCR 反応を行った。終的な PCR 溶液条件は 0-12 copies/chamber ヒトゲノム DNA、300 nM 各プライマー、200 nM

TaqMan probe、0.1 U/μL AmpliTaq Gold DNA polymerase、1X TaqMan Buffer、3.5 mM MgCl、200 nM 各 dNTP、0.1 %

PVP とした。増幅反応条件は、95 ℃-10 min、[95 ℃-15 sec、60 ℃-15 sec] 40 サイクル、30 ℃で行った。増幅反応終了

後、テンプレート DNA 濃度に対するマイクロチャンバーの蛍光シグナルのパターンから、初期 DNA 濃度の定量検出を行っ

た。

（3）マイクロチャンバーを用いた全ヒト染色体からの遺伝子増幅と検出

マイクロチャンバーアレイ上で、M 期染色体からの RhD 遺伝子増幅の可能性を示すとともに PCR 条件の適化を行った。

ナノリッターディスペンサーを用いて各マイクロチャンバー内に染色体を展開した後、RhD 遺伝子特異的プライマー及び

TaqMan プローブを含む PCR 溶液をマイクロチャンバー内に追加し、PCR 反応を行った。PCR 溶液条件は、300 nM 各プ

ライマー、200 nM TaqMan probe、0.0125～2.5 U/μL AmpliTaq Gold DNA polymerase、1X TaqMan PCR Buffer、4.5 mM

MgCl、200 nM 各 dNTP、0.5 % PVP とした。増幅反応条件は、95 ℃-10 min、[95 ℃-15 sec、60 ℃-15 sec] 40 サイクル、

25 ℃-∞で行った。増幅反応終了後、マイクロチャンバーの蛍光強度を測定した。

22



（4）ナイフ形状 AFM プローブの設計・作製

図 1a に示す寸法のナイフ形状 AFM プローブを設計した。図 1 b に作製したナイフ形状 AFM プローブの SEM 像を示す。

Silicon-On-Insulator (SOI)基板に Si3N4 層を体積させた基板を用い、半導体微細加工技術に基づき図 2 に示すプロセスに

よって作製した。プロセスを以下に示す。1:Si3N4 層除去、2:酸化膜生成（～3000 Å）、3:Si3N4 層除去、4:Si 異方性エッチン

グ、5:Si(111)面酸化処理、6:Si 異方性エッチング、7:SiO2 層除去、8:ナイフ長の調整。2 種のナイフ形状プローブを作製し、

それぞれナイフ部高さ：6 µm、共振周波数：184 kHz、バネ定数：45 N/m、およびナイフ部高さ：4 µm、共振周波数：123

kHz、バネ定数：13 N/m である。

図 1.作製したナイフ形状 AFM プローブ寸法(a)および SEM 像(b)

図 2．作製プロセス

（5）ナイフ形状 AFM プローブによる染色体切断と移動

プローブステーション SPI4000 とプローブ顕微鏡ユニット SPA300（SII ナノテクノロジー社）、および 20 µm ピエゾスキャナを

使用した。測定および切断は共振（DFM）モードで行った。ナイフプローブで染色体をイメージングした後、ベクタースキャ

ンプログラム制御下において、振幅減衰率：-0.90～-1.15 で切断操作を試みた。

（6）ピンセット型 AFM プローブの設計・作製

図 3 a に示す寸法のピンセット型 AFM プローブを設計した。図 3 b に示すように、2 本のカンチレバーから構成され、一方

が観察用 AFM プローブとして、もう一方が駆動・捕獲用プローブとして動作する。駆動用プローブの動作原理は、プローブ

の付け根に組み込まれた熱膨張アクチュエーターが電圧印加による抵抗熱を生じ膨張することによって、てこの作用によっ

てプローブ先端部位が開閉する。プローブ先端間距離を 3 μm とした。

23



図 3．ピンセット型 AFM プローブの設計（a）と動作原理（b）

半導体微細加工技術に基づき Silicon-On-Insulator (SOI)基板を用いて作製した。作製プロセスを図 4 に示す。（a）Si3N4 を

堆積、（b）プローブ部のパターニング、（c）酸化膜生成、（d）観察用プローブおよび駆動用プローブ部位のパターニング、

（e）Si3N4 層除去、（f）Si 異方性エッチング、（g）SiO2 層除去とプローブ先端長の調整、（h）基板部位の除去。図 5 a に作製し

たピンセット型 AFM プローブの SEM 像を示す。およそ 30 V の電圧印加によってプローブ先端を閉じることが可能であっ

た。

図 4．ピンセット型 AFM プローブの作製プロセス

図 5．（a）作製されたピンセット型 AFM プローブの SEM 像、

（b）プローブ先端の開閉、および（c）印加電圧とプローブ先端間距離の関係

（7）食総研グループとの連携

食総研グループが進めている SNOM/AFM による染色体高次構造の解析と、本研究グループが進めている染色体の特

定部分の切断回収と微量 DNA 増幅の技術を組み合わせ、SNOM/AFM により特定配列を高分解能で位置決めした領域

の周辺領域の DNA 配列情報を得ることができれば、公開されているゲノム情報を利用して、染色体上の特定領域を構成し

ているゲノムの範囲を特定し、染色体の折れ畳み構造に関する知見を得ることが可能であると考えた。そこでこの目的のた

め、食総研グループより SNOM/AFM または蛍光顕微鏡により特定遺伝子領域を特定した染色体試料およびデータの提

供を受け、染色体上の同じ箇所を位置決めできることを検証した。さらに、特定領域周辺の DNA の増幅実験等についても、

24



随時遺伝子の位置を特定した染色体試料の共有化などの連携に取り組んだ。

■ 研究成果

本研究では、プローブ顕微鏡などによる物理・機械的操作の可能性に着目した染色体ナノ切断操作法と、その技術に

基づいて切断・加工された染色体特定部位構成成分の解析を可能にする染色体チップの開発を目的とした。これらの実

現に向け、プローブ顕微鏡などによる染色体の直接的な加工操作と、チップデバイスによる染色体解析の二方向よりアプ

ローチしてきた。染色体解析基盤技術として、ナノスケールでの染色体および DNA の高精度なナノイメージング技術を開

発し 1, 2）、また、微小体チップを用いるタンパク質検出法 3-5）、電気化学的 DNA・タンパク質検出法 6-11）、マイクロチャンバー

を用いる遺伝子増幅・検出法 12, 13）を検討した。これらに関してそれぞれ一定の成果を得たが、マニピュレーション法との統

合に適すると考えマイクロチャンバー法を採用した。一方、半導体微細加工技術に基づいて、ナイフエッジ形状の染色体

加工用 AFM プローブを独自に設計作製し、これ用いた染色体切断条件の適化を行い、従来の AFM プローブでは得ら

れないシャープな切断を可能にするとともに、切断片の基板上での移動を可能にした 14）。また、犠牲層導入基板を用いた

染色体回収、抗体固定化 PS 微粒子を介した染色体回収、新規に設計・作製したプローブを用いた回収など種々検討した

結果、プローブを用いた方法が有効であった。このイメージング能と回収能を併せ持つピンセット型の染色体回収用プロー

ブも新たに設計・作製し 15）、これを用いて AFM 操作上で染色体切断片のイメージングおよび回収を実現した。マイクロチャ

ンバーを用いた染色体の遺伝子解析のためにシリコン製マイクロチャンバーアレイ（50nl 容量チャンバー、1248 個アレイ）

を設計・作製し、これに開発したピンセットプローブを用いて特定染色体（１および２番）およびその断片を導入し、マイクロ

チャンバーアレイ上で部位特異的（RhD 遺伝子:１番染色体、MYO3B 遺伝子：2 番染色体）に増幅することが示唆できた。

（1）ナイフ形状 AFM プローブによる染色体切断と移動

プローブステーション SPI4000 とプローブ顕微鏡ユニット SPA300（SII ナノテクノロジー社）、および 20 µm ピエゾスキャナ

を使用した。測定および切断は共振（DFM）モードで行った。切断後のイメージングは、SI-DF40 カンチレバー（バネ定数

40 N/m、共振周波数 300 kHz、SII ナノテクノロジー社）を使用した。4 µm タイプのナイフプローブで染色体をイメージングし

た後、ベクタースキャンプログラム制御下において、振幅減衰率：-0.90～-1.15 で切断操作を試みた。その結果、図 6 に示

すように、振幅減衰率：-1.00（ローディングフォース：367.9 nN）から切断されることがわかった。また、従来型プローブによる

切断では、切断箇所が掻き出される現象が見られていたが、ナイフプローブによる切断終端部位（切断線の右側）を見ると

わかるように染色体が掻き出されることはなかった。このことから、ナイフ形状プローブを用いることにより、染色体の損傷を

抑え、よりシャープに切断可能であることを示すことができた。一方、6 µm タイプのナイフプローブを用いて、切断後に断片

の移動を試みた。移動操作は、ベクタースキャンプログラム制御下、ナイフ形状プローブの先端面を用いて行った。切断、

移動ともに振幅減衰率：-1.05（ローディングフォース：1.17 µN）で行った。その結果、図 7 に示すとおり、染色体が良好に切

断され、かつその形態から染色体断片が損傷することなく移動されていることがわかる。移動操作を可能にしたことによって、

染色体から切断片が分離され、後に回収操作性向上が期待できる。

図 6. ナイフ形状プローブによる染色体切断操作

25



図 7．ナイフ形状プローブによる染色体切断と移動操作

（2）マイクロチャンバーアレイによるゲノム DNA 検出

マイクロチャンバーアレイを用いた DNA 増幅における初期 DNA 量について検討した。マイクロチャンバー内に RhD 遺

伝子に対するプライマー及び TaqMan プローブをナノリッターディスペンサーにより分注し、さらにゲノム DNA を含む PCR

溶液をディスペンサーにより正確に導入し、PCR 反応を行った。DNA 増幅反応終了後、テンプレート DNA 濃度に対するマ

イクロチャンバーの蛍光シグナルのパターンから、初期 DNA 濃度の定量検出を行った。PCR 反応後のマイクロチャンバー

アレイの蛍光像並びに、定量結果を図 8 に示す。チャンバーに含まれる DNA 量が増加するに連れて、蛍光シグナルを有

するチャンバー数も増加していることがわかる。図 8 b は、この蛍光パターンをグラフ化したものであるが、一つのチャンバー

内に 0～8 コピー含まれている際に高い直線性を示すグラフが得られた。この結果から、通常のリアルタイム蛍光強度検出

を用いることなく、PCR 反応のエンドポイントにおける蛍光強度観察により、シングルコピーレベルという非常に微量な範囲

において、初期 DNA 濃度の定量が可能であることが示された。

（a）マイクロチャンバーアレイの蛍光像（b）蛍光パターン

図 8 マイクロチャンバーアレイによる DNA 検出

（3）マイクロチャンバー上での染色体からの遺伝子増幅および検出

M 期染色体から特定遺伝子増幅の可能性を示すため、染色体を展開したマイクロチャンバーアレイ上で PCR 増幅を試

みるとともに、PCR 条件の適化を行った。マイクロアレイへの染色体導入は、カルノア液（Ethanol:Acetic acid=3:1）固定さ

れた染色体サンプルを超純水希釈し、ディスペンサーによりマイクロチャンバーへ導入が可能であった。SYBR Green I 染

色し（図 9 a）、導入されたマイクロチャンバー内の染色体数を計測したところ、80.7±9.4 chromosomes/chamber の染色体が

導入された。DNA 増幅の検出は TaqManTM 法を用い、1 番染色体（1p36.11）に存在する RhD（Rhesus blood group, D

antigen）を標的遺伝子とした。RhD 遺伝子特異的プライマー及び TaqMan プローブを含む PCR 溶液をマイクロチャンバー

内に追加し、PCR 反応を行った。PCR 溶液条件は、300 nM 各プライマー、200 nM TaqMan probe、0.0125～2.5 U/μL

AmpliTaq Gold DNA polymerase、1X TaqMan PCR Buffer、4.5 mM MgCl、200 nM 各 dNTP、0.5 % PVP とした。増幅反応

条件は、95 ℃-10 min、[95 ℃-15 sec、60 ℃-15 sec] 40 サイクル、25 ℃-∞で行った。増幅反応終了後、マイクロチャン

バーの蛍光強度を測定した結果、染色体を導入したチャンバーのみに蛍光が見られたことから、染色体から PCR 増幅反

応が可能であることが示された（図9 b）。また、PCR増幅条件の適化のためDNAポリメラーゼ濃度を検討したところ、0.25

U/µL の DNA ポリメラーゼ量において十分な蛍光強度が得られることが明らかとなった。

26



図 9．SYBR Green I 染色された染色体（a）およびマイクロチャンバーPCR 後の蛍光像（b）

（4）マイクロチャンバーチップ上での特定染色体からの遺伝子増幅と検出

マイクロチャンバー上で染色体から特定遺伝子（RhD）の増幅と検出が可能であることを示した。ここで、1 個の特定染色

体からの遺伝子増幅と検出を試みた。まず、染色体標本から RhD 遺伝子が存在する 1 番染色体を選び、マイクロマニピュ

レーター制御のもと、ガラスキャピラリーによって剥離させた。これに新規に作製したピンセット型プローブを接近させ、電圧

印加しピンセット部位を駆動させ、1 番染色体を捕獲・回収することが可能であった（図 10 a）。さらに、1 番染色体を保持し

たまま、ピンセット型プローブをマイクロチャンバー内に移動し、ピンセットを開放し、1 番染色体をチャンバー内壁に接触さ

せ再配置させることが可能であった(図 10 b)。これにより特定染色体の回収・再配置の一連の操作を確立することができ

た。

図 10．ヒト 1 番染色体の回収とチャンバー内への再配置

1 個体の 1 番染色体の回収およびチャンバー内への再配置を、同様に 7 サンプル（図 11 a、C1-A から C1–G）について行

った。この 1 番染色体を配置したマイクロチャンバーチップに、RhD 遺伝子特異的プライマー及び TaqMan プローブを含む

PCR溶液を各チャンバー内に導入し、PCR反応を行った。増幅反応終了後、マイクロチャンバーの蛍光強度を測定した結果、

図 11 b に示すように 7 サンプル中 5 サンプルにおいて DNA 増幅に伴う蛍光シグナルが見られた。1 番以外の染色体では、

DNA 増幅は見られなかった。これらの結果から、特定染色体の回収と再配置への一連のマニピュレーション操作、ならびに

1 個体の特定染色体から PCR 増幅反応および検出が可能であることが示された。

27



図 11．1 個体の 1 番染色体からの RhD 遺伝子増幅と検出

(a)ヒト染色体標本[1 番染色体：C1-A から C1–G、1 番以外の染色体：N-B から N-G]

(b) 増幅反応終了後のマイクロチャンバーの蛍光像

（5）食総研グループとの連携について：

食総研グループより SNOM/AFM または蛍光顕微鏡により特定遺伝子領域を特定した染色体試料およびデータの提供

を受け、染色体上の同じ箇所を位置決めできることを確認した。さらに、特定領域周辺の DNA の増幅実験等についても、

随時遺伝子の位置を特定した染色体試料の共有化などの連携に取り組んだ。これについて、食総研グループがナノ FISH

解析の研究を進めているヒト 2 番染色体上に存在する MYO3B 遺伝子をターゲットとして、マニピュレーション操作およびマ

イクロチャンバーPCR を試みた。微少量 PCR 増幅のための新たな MYO3B 特異的プライマー、および TaqMan プローブを

FISH 領域配列近傍から新たに設計した。食総研グループより提供された FISH データを下に、ピンセットプローブを用いて

MYO3B の FISH シグナル領域を回収し、チャンバーへ再配置した（図 12 a）。PCR 増幅反応後、DNA 増幅に伴う蛍光シ

グナルを得ることに成功した（図 12 b）。

図 12．MYO3B FISH シグナル領域の回収とマイクロチャンバーPCR

(a) 2 番染色体上の MYO3B FISH シグナル領域の回収

(b) 増幅反応終了後のマイクロチャンバーの蛍光像

(6) ピンセット型 AFM プローブを用いた AFM マニピュレーションによる染色体回収

プローブステーション SPI4000 とプローブ顕微鏡ユニット SPA300（SII ナノテクノロジー社）、および 20 µm ピエゾスキャナ

を使用した。測定および切断は共振（DFM）モードで行った。イメージングは、SI-DF40 カンチレバー（バネ定数 40 N/m、共

振周波数 300 kHz、SII ナノテクノロジー社）を使用した。これまでに確立した染色体切断法によって、ナイフプローブを用い

て切断し、切断片をスライドさせた（図 13a 左）。ピンセット型 AFM プローブによる切断片の回収は、ベクタースキャンプログ

ラム制御下、電圧印加によってピンセットプローブ先端を閉じることで試みた。回収操作後、AFM イメージングを行ったとこ

ろ、基板上から切断片が消失していることがわかった（図13 a右）。ピンセットプローブ先端をSYBR Green I染色したところ、

図 13 b に示すようにプローブ先端部位に蛍光が観察された。この結果から、ピンセット型 AFM プローブを用いた AFM マ

28



ニピュレーションによって染色体断片回収が可能であることが示された。今後、(4)で示したマイクロチャンバーPCR による検

出法と組み合わせることで、微細な染色体断片の解析が可能になるものと期待できる。

図 13．AFM マニピュレーションによる染色体断片の回収操作

(7)フロー型 PCR チップデバイスの作製と遺伝子解析

微細加工技術をもとに、溶液移動型のガラス-PDMS 製フロー型 PCR チップデバイスを設計・作製した（図 14）。シリンジポ

ンプを用いて、一端から染色体を含む PCR 溶液を注入・送液し、もう一端から反応後のサンプル液を回収した。また、チッ

プに 95℃と 60℃のヒーターが併設されており、このヒーター上を PCR 溶液が移動することで増幅反応が行われる。

図 14．フロー型 PCR チップデバイスの模式図

作製したフロー型 PCR チップを図 15 a に示す。DNA 増幅の検出は TaqManTM 法を用い、RhD 遺伝子を標的とした。PCR 溶液

条件は、14.4 ng/μL 全染色体、300 nM 各プライマー、800 nM Cy5 TaqMan プローブ、0.02% BSA、3x AccuPrime Taq DNA

polymerase、1x AccuPrime PCR buffer I とした。増幅反応条件は、[95 ˚C: 15 sec, 60 ˚C: 15 sec] x 50 cycles

で行った。増幅反応終了後に蛍光観察した結果、30 サイクル前後に相当する流路領域で DNA 増幅に伴う蛍光が観察され

た（図 15 b）。回収されたサンプル液を電気泳動により確認したところ、目的とする 74 bp の DNA 増幅が認められた（図 15 c）。

これらの結果から、染色体をテンプレートとしてフロー型チップデバイスを用いた PCR 増幅反応が可能であることが示され

た。

図 15．（a）作製したフローPCR チップ、（b）PCR 反応後の蛍光像、および（c）増幅産物の電気泳動

29



■ 考察

独自に創案設計したナイフエッジ形状およびピンセット型の染色体加工操作用 AFM プローブを作製し、これを用いた染

色体操作の条件検討を行った。これによって、従来の AFM プローブでは得られないシャープな切断を可能にし、また回収

操作を可能にすることができた。一方、マイクロチャンバーを用いる遺伝子増幅・検出法、フロー型チップを用いる遺伝子

増幅・検出法を構築することができた。マイクロチャンバーを用いた染色体の遺伝子解析のために、シリコン製マイクロチャ

ンバーアレイ（50nl 容量チャンバー、1248 個アレイ）を設計・作製し、これに開発したピンセットプローブを用いて特定染色

体（１および２番）およびその断片を導入し、マイクロチャンバーアレイ上で部位特異的（RhD 遺伝子:１番染色体、MYO3B

遺伝子：2 番染色体）に増幅することが示唆できた。これによって、シングルコピーレベルのテンプレートからの遺伝子増幅

を行えることを実際に示し、また、染色体の特定箇所および特定遺伝子を標的としたマニピュレーション・解析法を構築す

ることができた。


本プロジェクトで開発した AFM プローブ、光プローブ顕微鏡、染色体チップ技術を基盤に、染色体解析のための一連の

ツール開発を実現したが、調製段階での染色体物理構造の不安定性やプローブ顕微鏡の観測基盤での非可逆吸着の問

題など解決すべき課題も明らかとなった。今後は、染色体解析分野のみならず、染色体試料の選定や単一細胞や細胞表

層、オルガネラなど他の生体材料の解析の可能性もあり，汎用的な方法論としての展開が期待できる。また、SNOM/AFM

による光学顕微鏡の限界を超える高分解能 FISH シグナル解析手法が確立すれば、多数のマーカーの位置をナノレベル

で特定した染色体物理地図の直接構築や、SNOM/AFM によって位置決めした対象遺伝子の周辺領域を掻き取って塩基

配列情報を得る等の新たな染色体解析技術への展開が期待できる。

■ 参考（引用）文献 (本文中には引用せず)

H. Nagai, Y. Murakami, Y. Morita, K. Yokoyama, E. Tamiya, Develoment of A Microchamber Array for Picoliter PCR,

Analytical Chemistry, 73(5), 1043-1047 (2001)

H. Nagai, Y. Murakami, K. Yokoyama, and E. Tamiya, High-throughput PCR in silicon based microchamber array,

Biosensors and Bioelectronics, 16, 1015-1019 (2001)

Y.Murakami, K.Idegami, H.Nagai, T.Kikuchi, Y.Morita, A.Yamamura, K.Yokoyama, E.Tamiya, Application of micromachine

techniques to biotechnological research, Materials Science and Engineering C 12, 67-70 (2000 )

Atomic Force Microscope-Based Dissection of Human Metaphase Chromosomes and High Resolutional Imaging by Carbon

Nanotube Tip, S. Iwabuchi, T. Mori, K. Ogawa, K. Sato, M. Saito, Y. Morita, T. Ushiki, E. Tamiya, Archives of Histology

and Cytology, 65(5), 472-479(2002)

Application of a Microchamber Array for DNA Amplification Using a Novel Dispensing Method, Y, Matsubara, M. Kobayashi,

Y. Morita, E. Tamiya, Archives of Histology and Cytology, 65(5), 415-423(2002)

Nanoscopic imaging of human chromosomes via a scanning near-field optical/atomic-force microscopy (SNOAM), E.Tamiya,

M.Saito, S.Iwabuchi, Y.Morita, Science and Technology of Advanced Materials (in press)

■ 関連特許

1. 基本特許（当該課題の開始前に出願したもので、当該課題の基本となる技術を含む特許）

1) 集積化されたマイクロウェルを用いたポリメラ—ゼ連鎖反応装置（特許 3041423）

マイクロチャンバー上で微少量ＰＣＲ法に関して

2) 新規なバイオチップ及びその作製方法（特開平 14-131327）

微小担体チップを用いたタンパク質、遺伝子配列などのスクリーニング方法に関して

3) 偏心回転テーブル装置とそれを用いた処理装置（特開平 14-126494）

オンチップ PCR 用のサーマルサイクラー装置とその高速化に関して

30



4) スポッティングノズル（特願平 14-042422）

微少量液滴をチップにインジェクションするためのノズルに関して

5) スポッティング装置（特願平 13-262780）

微少量液滴をチップにインジェクションするための装置に関して

2. 参考特許（当該課題に関連する周辺特許）

31



■ 成果の発表

（成果発表の概要）

1. 原著論文による発表（査読付き） 15 報（筆頭著者：5 報、共著者：10 報）

2. 原著論文による発表（査読なし） 0 報

3. 原著論文以外による発表

（レター、レビュー、出版等）

国内誌：12 報、国外誌：2 報、書籍出版：0 冊

4. 口頭発表招待講演：16 回、主催講演：0 回、応募講演：50 回

5. 特許出願出願済み特許：4 件（国内：4 件、国外：0 件）

6. 受賞件数 2 件

1. 原著論文による発表（査読制度のある雑誌への投稿のみ。本文中の成果の番号と対比）

1) M. Saito, M. Kobayashi, S. Iwabuchi, Y. Morita, Y. Takamura, E. Tamiya：「DNA Condensation Monitoring after

Interaction with Hoechst 33258 by Atomic Force Microscopy and Fluorescence Spectroscopy」, J. Biochem. (Tokyo),

136, 813-823, 2004

2) M. Saito, Y. Takamura, E. Tamiya：「Nanoscale time-lapse AFM imaging in solution for DNA aggregation」,

NanoBiotechnology, 2006, (in press)

3) Z-L Zhi, Y. Morita, Q. Hasan, and E. Tamiya：「Micromachining microcarrier-based biomolecular encoding for

miniaturized and multiplexed immunoassay」, Anal. Chem., 75(16), 4125-4131 (2003)

4) Z-L Zhi, Y. Murakami, Y. Morita, Q. Hasan, and E. Tamiya：「Multianalyte immunoassay with self-assembled

addressable microparticle array on a chip」, Anal. Biochem., 318, 236-243 (2003)

5) Z.Zhi, S.Yamamura and E.Tamiya ：「 Microfabrication of encoded microparticle array for multiplexed DNA

hybridization detection」, Chemical Communications, 2448-2450, (2005)

6) Kagan Kerman, Yasutaka Morita, Yuzuru Takamura and Eiichi Tamiya：「Label-free hybridization detection study

based on guanine oxidation on gold electrodes」, Electrochemistry Communications, 5, 887-889(2003)

7) K. Kerman, M. Saito, Y. Morita, Y. Takamura, M. Ozsoz, E. Tamiya：「Electrochemical Coding of Single-Nucleotide

Polymorphisms By Monobase-Modified Gold Nanoparticles」, Anal. Chem., 76(7), 1877-1884, 2004

8) M. Kobayashi, T. Kusakawa, M. Saito, S. Kaji, M. Oomura, S. Iwabuchi, Y. Morita, Q. Hasan and E. Tamiya：

「 Electrochemical DNA quantification based on aggregation induced by Hoechst 33258 」 , Electrochemistry

Communications, 6(4), 337-343, 2004

9) K. Kerman, Y. Morita, Y. Takamura, M. Ozsoz and E. Tamiya：「Modification of Escherichia coli single-stranded

DNA binding protein with gold nanoparticles for electrochemical detection of DNA hybridization」, Analytica Chimica

Acta, 510(2), 169-174, 2004

10) K. Kerman, Y. Matsubara, Y. Morita, Y. Takamura and E. Tamiya：「Peptide nucleic acid modified magnetic beads for

intercalator based electrochemical detection of DNA hybridization」, Science and Technology of Advanced Materials,

5(3), 351-357, 2004

11) S. Hashioka, M. Saito, E. Tamiya and H. Matsumura ：「 Deoxyribonucleic acid sensing device with

40-nm-gap-electrodes fabricated by low-cost conventional techniques」, Applied Physics Letters, 85(4), 687-688,

2004

12) Y. Matsubara, K. Kerman, M. Kobayashi, S. Yamamura, Y. Morita, Y. Takamura, E. Tamiya ：「 On-Chip

Nanoliter-Volume Multiplex TaqMan Polymerase Chain Reaction from A Single Copy Based on Counting

Fluorescence Released Microchambers」, Anal. Chem, 76, 6434-6439, 2004

13) Y. Matsubara, K. Kerman, M. Kobayashi, S. Yamamura, Y. Morita, E. Tamiya：「Microchamber array based DNA

32



quantification and specific sequence detection from a single copy via PCR in nanoliter volumes」, Biosensors and

Bioelectronics, 20, 1482-1490, 2005

14) M. Saito, K. Nakagawa, K. Yamanaka, Y. Takamura, G. Hashiguchi, E. Tamiya：「A new design of knife-edged AFM

probe for chromosome precision manipulationg」, Sensors and Actuators A, 2006 (in press)

15) 武川哲也、中川和久、橋口原、斎藤真人、山中啓一郎、民谷栄一：「ナノ物質のマニピュレーションを行う為の AFM

ピンセットの開発」、電気学会論文誌 E（センサ・マイクロマシン準部門誌）、125(11)、 448-453、(2005)

2. 原著論文による発表（査読制度のない雑誌への投稿）

3. 原著論文以外による発表（レター、レビュー、書籍出版等）


1) 民谷栄一：「バイオセンシングの新技術動向」, M&E, 4,178-182, (2003)

2) 民谷栄一、森田資隆：「バイオセンサ、第 4 編薄膜技術の応用と展望.第 5 章センサ.第 6 節」、21 世紀版薄膜作

製応用ハンドブック、p.1089-1100 エヌ.ティー.エス(2003)

3) 民谷栄一：「ナノ・マイクロテクノロジーとバイオセンサ, ナノテクノロジーハンドブックⅣ編バイオ・化学へ使う／3 章

マイクロ空間で化学分析を行う」、p.49-58, ナノテクノロジーハンドブック編集委員会, (2003)

4) 民谷栄一：「マイクロチャンバー型バイオチップと表面技術」、表面科学 54,15-21, (2003)

5) 民谷栄一：「バイオアッセイの未来-バイオセンサ−の現状と展望」、水環境学会誌, 26(7), 415-420, (2003)

6) 民谷栄一：「バイオセンサーチップと抗体エンジニアリング」、バイオインダストリー, 20(7), 60-67, (2003)

7) 民谷栄一：「ナノテクノロジーとバイオテクノロジー」、フレグランスジャーナル, 32（8）, 15-24, (2003)

8) 民谷栄一：「ナノテクノロジーとバイオセンサー、バイオチップ」、技術と経済, 436, 46-56, (2003)

9) 民谷栄一：「バイオセンサーとバイオインフォマティクス、先端化学シリーズ III、糖鎖、バイオマテリアル、分子認識、

バイオインフォマティクス」ｐ233-239 丸善(2003)

10) 民谷栄一：「マイクロチップテクノロジーとハイスループットスクリーニング、ゲノミクス・プロテオミクスの新展開-生物

情報の解析と応用-」、1118-1128、エヌ・ティ・エス、2004.4.5

11) 民谷栄一：「ナノ機能材料とバイオセンシング」、BIO INDUSTRY, 12, 12-18, 2004

12) 民谷栄一：「バイオセンサー、高分子材料・技術総覧（宮田清蔵編）」、産業技術サービスセンター、622-629、

2004

国外誌

1) E. Tamiya et al.：「Bioanalyses using electrochemical and electrophysiological methods, biological imaging

and sensing」、T. Furukawa Ed., Springer, 205-294, 2004

2) K. Kerman, M. Kobayashi, E. Tamiya：「Recent trends in electrochemical DNA biosensor technology」,

Meas. Sci. Technol., 15, R1-R11, 2004

書籍出版

4. 口頭発表

招待講演

1) E.Tamiya：「Advanced biosensors and biodevices for biomedical applications」, Knoxvile, USA, Oak Ridge National

Rab. Symposium, (2003. 10.31)

2) E.Tamiya ：「 New electrochemical DNA sensor based on nanoaggregation induced by

DNA-intercalator complex」, Otsu Japan, Japan-Germany Enzyme Engineering Conference, (2003.11.17)

3) E.Tamiya：「Nano/micro technology-driven biosensors and biodevices」, Miyazaki Japan, 5th-IWFIPT, (2003

33



11.11)

4) E. Tamiya：「Nanobiotechnology and bioelectronics」, Tatsunokuchi Japan, JAIST Nanotechnology Conference,

(2003.9.13)

5) E. Tamiya：「Advanced technology for DNA detection」, Thailand, Japan Interaction on Science and Technology

Forum (JIST) in association with Japan-Indonesia Science and Technology Forum (JIF), 2004.8.16-21

6) E. Tamiya：「Advanced biosensors and bio-screening based on nanomaterial and microchip」, 大阪, First

International conference of combinatorial bioengineering, NPO 法人近畿バイオインダストリー振興会議, 2004.7.21

7) E. Tamiya：「Advanced biosensors/Bio-screening Systems Based on Nanomaterials and microfabricated chip」,

Tatsunokuchi Japan, JAIST International Symposium on Nano technology 2004, 2004.9.9-10

8) E. Tamiya：「Advanced optical biosensors based on nano/micro technology」, Yokohama, 13th International

Symposium on Bioliminescence and chemiluminescence 2004, 2004.8.3

9) 民谷栄一：「マイクロ・ナノテクノロジーと次世代バイオセンサー」、東京、センサ総合展２００４/総合シンポジウム次

世代ナノバイオセンサシステムとその展開、２００４.4.7

10) 民谷栄一：「医療用バイオセンサの将来」、石川、第 43 回エム・イー学会大会、２００４.5.21

11) 民谷栄一：「ナノテクノロジーとバイオデバイス-生物医学分野への応用を目指して」、大阪、第 4 回医療組織フォ

ーラム、2004.6.29

12) 民谷栄一：「ナノ材料によるバイオセンサの高機能化」、東北学院、第 65 回応用物理学会講演会「バイオナノセン

シングに向けたオプトエレクトロニクスの接点と融合」シンポジウム、2004.9.1

13) 民谷栄一：「ナノテクノロジーとバイオデバイス」、宮城、第 110 回講演大会表面技術協会、2004.9.13

14) 民谷栄一：「ナノテクノロジーが創出するバイオデバイスとその実用展開」、第 17 回秋季シンポジウム日本セラミ

ックス協会、2004.9.18

15) 民谷栄一：「微細加工チップのバイオメディカルへの応用」、石垣記念ホール、先端加工機械講演会、2004.11.1

16) 民谷栄一：「マイクロ・ナノマテリアルおよびマイクロチップテクノロジーを用いたバイオデバイス開発と生物医学応

用」、マイクロマシンセンター、東京、第 10 回マイクロマシン・ナノテクシンポジウム、2004.11.11

主催・応募講演

1) E. Tamiya：「Nano/Microtechnology and Biosensor」, Tokyo, Japan, The First International Congress on Bio-nano

interface (ICBN 2003 TOKYO), 2003.5.19-24

2) S. Iwabuchi, T. Mori, M. Saito, Y. Morita, Y. Takamura, and E. Tamiya：「A study for R&D of Chromosome Chip:

Genetic and morphological analysis of a dissected chromosomal fragment using AFM」, Oxford, UK, Oxford 2003

Scanning Probe Microscopy, Sensor and Nanostructures, 2003.5.23-26

3) M. Saito, M. Kobayashi, S. Iwabuchi, Y. Morita, and E. Tamiya：「Unraveling of bisbenzimide Induced DNA

condensation mechanism by atomic force microscopy 」 , Basel, Switzerland, 11th Eurooean Congress on

Biotechnology, 2003.8.24-29

4) Y. Matsubara, M. Kobayashi, Y. Morita, and E. Tamiya：「Silicon microchamber array for sequencespecific DNA

amplification and detection using a novel dispensing method」, Lake Tahoe, USA, Micro Total Analysis Systems

2003, 2003.10.5-9

5) Y. Takamura, Y. Horiike, Y. Baba, and E. Tamiya：「Size dependent mobility of DNA in electric and hydro drag

force field」, Lake Tahoe, USA, Micro Total Analysis Systems 2003, 2003.10.5-9

6) 民谷栄一：「ナノ・マイクロテクノロジーを用いた次世代バイオチップ／センサーの開発」、日本大学、日本農芸化

学会 2003 年度大会シンポジウム講演、2003.4.1-3

7) 民谷栄一、岩渕紳一郎：「ナノプローブ顕微鏡とバイオセンシング」、日本大学、日本農芸化学会 2003 年度大会

シンポジウム講演、2003.4.1-3

34



8) 松原泰孝、森田資隆、民谷栄一：「ナノチャンバーアレイチップによる遺伝子検出」、東京工業大学、電気化学会

2003 年大会 2003.4.1-3

9) 民谷栄一：「ナノテクノロジーが拓くバイオデバイスの新展開」、大阪、第 8 回生物工学懇話会ミニシンポジウム／

ナノバイオ日本生物工学会、2003.5.19

10) 松原泰孝、小林正昭、森田資隆、高村禅、民谷栄一：「チャンバーアレイ PCR による遺伝子診断法への応用」、熊

本、第 1 回生体機能関連化学・バイオテクノロジー部会合同シンポジウム、2003.10.12-13

11) Y Matsubara, M Kobayashi, Y Morita, Y Takamura, E Tamiya：「On-chip DNA quantification from a single copy by

counting fluorescence released microchambers after PCR in nanoliter volumes」, Spain, The Eighth World

Congress on Biosensors, 2004.5.24-26

12) K. Kerman, M. Saito, Y. Morita, Y. Takamura, M. Ozsoz, E. Tamiya：「Monobase modified gold nanoparticles for

electrochemical identification of single nucleotide polymorphisms」, Spain, The Eighth World Congress on

Biosensors, 2004.5.24-26

13) Y. Matsubara, E. Tamiya：「Simultaneous on chip PCR and trace analysis of multiple biothreat microorganisms in

nanoliter volumes」, USA, 2nd Annual Research, Technologies, and applications in biodefense 2004, 2004.8.18-19

14) 中山剛、小林正昭、森田資隆、高村禅、民谷栄一：「マイクロフロー型チップによる DNA 増幅のための基礎的研

究」、京都大学桂キャンパス、第 9 回化学とマイクロ・ナノシステム研究会、2004.5.21-23

15) 山中啓一郎、斎藤真人、森田資隆、高村禅、橋口原、民谷栄一：「新規 AFM プローブによる染色体のマニュピレ

ーション」、名城大学天白キャンパス、日本生物工学会大会、2004.9.21-23

16) Y. Tomizawa, K. Yuhki, Y. Morita, E. Tamiya, Y. Takamura：「Quantitative analysis of molecular trap emproying

electric and hydro drag force field」, Sweden, micro Total Analysis Systems 2004, 2004.9.26-30

17) 斎藤真人、高村禅、民谷栄一：「マイクロチャンバーアレイ PCR による染色体からの遺伝子増幅と検出」、京都、第

12 回化学とマイクロ・ナノシステム研究会、平成 17 年 12 月 1 日

18) Masato Saito, Kazuhisa Nakagawa, Kiichiro Yamanaka, Yuzuru Takamura, Eiichi Tamiya：「A NEW DESIGN OF

KNIFE EDGED-AFM PROBE FOR CHROMOSOME PRECISION MANIPULATING」, KOREA, The 13th

international conference on solid-state sensors, actuators and Microsystems (Transducers05), 2005.6.5-9

19) D. Kim, K. Yamanaka, M. Saito, Y. Takamura and E. Tamiya：「Development of Nano-Dissection Chip for Analysis

of Chromosome Nanostructure and Its Function, Nagoya, JAPAN, 5th IEEE Conference on Nanotechnology

(IEEE-NANO 2005), July 11-15, 2005

20) D. Kim, M. Saito, Y. Takamura and E. Tamiya：「Fabrication of a Novel Chromosome Dissection Chip by Aluminum

Anodization for Analysis of Chromosome Nanostructure」, KOREA, The 56th Annual Meeting of the International

Society of Electrochemistry (ISE2005), 2005.9.25-30

5. 特許等出願等

1) 特開 2005-172456 走査型プローブ顕微鏡用カンチレバーおよびその製造方法

染色体ナノ切断法に関するもので、AFM 制御下のもと染色体の切断加工操作用に開発したナイフ形状 AFM プロー

ブの作製方法について。

2) 特願 2005-42883 ナノピンセットおよびこれを備える走査型プローブ顕微鏡

マイクロチャンバーチップ上での特定染色体および特定部位からの遺伝子検出に関して、PCR のテンプレートとする

特定染色体および特定部位の回収とマイクロチャンバー内への再配置について。

3) 特願 2006-33531 走査型プローブ顕微鏡装置、ナノピンセット装置および試料表面形状観察方法

AFM マニピュレーションによる染色体断片の回収に関して、染色体試料の AFM 観察および AFM 回収について。

4) 特願 2005-277811 気泡の抑制を目的とした流体デバイスの設計および送液方法

フローPCR チップデバイスを用いて染色体をテンプレートとした PCR 遺伝子増幅および検出に関して。

35



6. 受賞等

1) Y Matsubara, M Kobayashi, Y Morita, Y Takamura, E Tamiya, On-chip DNA quantification from a single copy by

counting fluorescence released microchambers after PCR in nanoliter volumes, The Eighth World Congress on

Biosensors, 2004.5.24-26, Spain, Biosensor and Bioelectronics Award, 3rd place.

2) 松原泰孝、森田資隆、民谷栄一、ナノチャンバーアレイチップによる遺伝子検出、電気化学会 2003 年大会

2003.4.1-3 東京工業大学, ポスター賞

36




1.2. 染色体ナノ FISH 法による遺伝子地図のナノスケール解析

担当機関名研究室名独立行政法人食品総合研究所計測工学研究室

研究者名大谷敏郎

■ 要旨

第 I 期では、セントロメアやテロメア等の繰返し配列領域の FISH シグナルを、SNOM/AFM により光学顕微鏡を超える分

解能で検出する技術を確立したが、第 II 期においては、その技術をさらに進化させ、染色体上の単一（シングルコピー）遺

伝子の検出技術の確立を主な目的とし、また、複数の単一遺伝子の同時検出と染色体の立体形状とを関連づけることによ

り、染色体の高次構造に関する情報を得ることも目的とした。研究の結果、SNOM/AFM による単一遺伝子の FISH シグナ

ルの検出に成功し、クロマチンファイバーレベルの構造と対比させることが可能になった。さらに複数の単一遺伝子を別々

の蛍光色素で標識し、マルチカラーで FISH シグナルを検出することも可能にした。マルチカラーでの FISH 技術を応用し、

2 種類の FISH シグナルの相互位置関係に基づいた染色体の高次構造解析を行ったところ、FISH 処理時に染色体の構造

が大きく損傷を受けることが明確になったため、染色体の構造損傷の低減のための方策を提案した。

■ 目的

第Ⅱ期では、第Ⅰ期で確立した走査型光プローブ顕微鏡 (SNOM/AFM) による FISH (Fluorescence in situ

hybridization )シグナルの高分解能計測手法をさらに進展させ、テロメアなどの反復配列領域のみでなく、単一遺伝子の存

在位置をナノスケールの分解能で明らかにする「染色体ナノ FISH 法」の確立をめざす。さらにマルチカラーFISH を用いた

SNOM/AFM による複数の遺伝子の同時高分解能検出、SNOM/AFM により検出した FISH シグナル領域とクロマチンファ

イバー構造の対応付けによる染色体高次構造の解明手法の開発も目的とする。

１年目では、SNOM/AFM による単一遺伝子の検出を可能にするための、DNA プローブの選定、装置の改良等を行う。２

年目には、単一遺伝子の検出から複数の遺伝子をプローブとした FISH シグナルの SNOM/AFM による検出を検討すると

ともに、FISH 処理が染色体の構造に与える影響をさらに低減する方法を検討する。３年目では、それまでに検討した検出

手法を集大成し、複数の遺伝子座の位置を高分解能で検出し、FISH シグナルと染色体形状データとの対応づけにより、

染色体高次構造中での遺伝子の空間的配置でのナノスケール解析を検討するとともに、SNOM/AFM で切断・回収領域を

特定した染色体サンプルを同じグループの小課題 1) (北陸先端大学)へ供給する。

■ 目標 ① 第Ⅰ期で開発した走査型光プローブ顕微鏡によるナノ FISH 法の分解能を向上させ単一遺伝子の検出を可能にす

る。

② これによりヒトおよび植物染色体上の遺伝子の物理的位置をナノオーダーで位置付け、小課題 1)に遺伝子の位置

情報を提供する。

③ また染色体高次構造の中での特定タンパク質および遺伝子の空間的配置をナノスケールで解析する。

■ 目標に対する結果 ① HAT1 (Histone acetyltransferase type B catalytic subunit)遺伝子の一部領域を PCR 法により増幅し、この産物をプ

ローブとした FISH を行い、SNOM/AFM による観察を行った。高分解能観察用のスリムプローブ等の導入により、上

記単一遺伝子の FISH シグナル計測に成功した。

② 複数の遺伝子の位置を SNOM/AFM によりマルチカラーで同時計測することにも成功した。さらに、FISH 処理が染

37



色体の三次元構造に大きな損傷を与えることを見出し、染色体の高次構造を保持可能な FISH 法の開発を行った。

また、SNOM/AFM で対象箇所を特定した染色体試料を位置情報データを添付して小課題 1)に提供した。

③ 計測した蛍光シグナル像と AFM による高分解能形状像を正確に重ね合わせることにより、クロマチンファイバーレベ

ルで遺伝子の位置情報を取得することを可能とした。また、染色体上のヒストンタンパク質の SNOM/AFM 計測を行

ったが、空間配置を解析するには至らなかった。

■ 研究方法（１）FISH 試料調製法

１）ヒト染色体標本調製法

ヒト染色体標本は、以下に示す末梢血からのリンパ球培養法により調製した。ヘパリン（ノボ社）で湿らせたシリンジにてヒ

ト末梢血を採血し、培養液［RPMI 1640（ギブコ社）９ml、仔牛血清（ギブコ社）１ml、Phytohaemagglutinin（murex 社）0.1 ml］

中で５％炭酸ガス雰囲気下、37℃で 70 時間培養した後、コルセミド（終濃度 0.01μg/ml 、２時間）処理を行った。低張

処理（0.5％ KCl）後、カルノア固定液で２～３回繰り返し洗浄し、カルノア固定液中で保存した。

蛍光顕微鏡観察用にはスライドグラスを、SNOM/AFM 計測用には、親水化処理（２N NaOH、または４N HCl 中に２～５

時間浸漬）を行った直径 2.2 cm の円形カバーグラスを使用した。染色体標本を適宜カルノアで希釈し、スライドグラス、また

は親水化処理済みカバーグラスに滴下した後、完全に乾燥する前に新しいカルノア固定液を数滴滴下して洗浄を行った。

風乾後、FISH 用染色体標本とした。

２）解析対象遺伝子の選定

FISH を用いて検出を行う対象領域（遺伝子）として、ヒト２番染色体長腕中央部に位置する３種類の遺伝子

[Peptidylprolyl isomerase G (PPIG), Myosin IIIB (MYO3B), Histone acetyltransferase type B catalytic subunit (HAT1)]を

選択した（図１）。PPIG と MYO3B、HAT1 と MYO3B の間隔はそれぞれ 0.7Mb、1.5Mb である。また、非常に短距離にある

遺伝子領域検出を検証するため、MYO3B の遺伝子内の２つの隣接する領域（MYOp-1、MYOp-2）についても FISH 検出

を行った。

３）FISH 処理法

① プローブ DNA 調製

検出対象遺伝子領域の全長または一部をゲノム DNA を鋳型として PCR 増幅を行い、プローブ DNA とした。プローブ DNA

はロッシュ社の Biotin-Nick Translation Mix または DIG-Nick Translation Mix を用いてビオチン標識または DIG

（Digoxigenin）標識を行った。

図１使用したプローブ DNA

38



② 染色体熱変性

染色体をスライドガラスへのプレパレーション後、室温、大気中で２～４日間の乾燥、RNase（100 µg/ml）処理後、エタノー

ル脱水及び風乾し、65°C 、12 時間のハードニングを行った。ハードニング後、70％ホルムアミド/2xSSC で 70°C、２分間

の熱処理を行い、直ちに０°C の 70％エタノール中に移し、急冷した。５分後、室温の 100％エタノールで脱水、風乾し

た。

③ ハイブリダイゼーション

鮭精子 DNA（シグマ社）をプローブ DNA の 20 倍量加え、エタノール沈殿後、プローブ DNA 濃度が 20~25 ng/・l となる

ようにホルムアミドで再溶解し、75°C、10 分で熱変成を行い、氷中で急冷した。スライド１枚あたり熱変成を行ったプローブ

DNA を 150~200 ng に対し、ヒト Cot-1 DNA（インビトロジェン社）10 µg とハイブリダイゼーションバッファーを加え（終濃度

50％ホルムアミド、10％デキストラン硫酸塩、２mg BSA、2xSSC）、37°C で 20 時間以上ハイブリダイゼーションさせた。ハイ

ブリダイゼーション後、50％ホルムアミド/2xSSC 中で 37°C 20 分、2xSSC 中で室温 15 分、1xSSC 中で 15 分２回の洗浄

を行った。

④ 蛍光検出

3.2％ Block Ace/4xSSC で 42°C、30 分間のブロッキング処理を行い、4xSSC で洗浄後、１％ Block Ace/4xSSC で溶

解した抗 DIG 抗体［0.5~1µg/ml マウス抗 DIG モノクローナル抗体（ロッシュ社）］中で 37°C、30 分間の１次抗体処理を行

った。4xSSC 中で５分、0.1％ TritonX/4xSSC 中で５分、さらに 4xSSC 中で５分間洗浄後、Alexa488－Alexa546 混合液［５

µg/ml Alexa488 ストレプトアビジン、10 µg/ml 抗マウス IgG Alexa546（モレキュラープローブ社）、１％ Block Ace/4×SSC］

中で 37°C、45 分間の蛍光処理を行った（シングルカラー検出の場合は、単独の蛍光物質のみ使用）。4xSSC５分、0.1％

TritonX/4xSSC５分、さらに 4xSSC５分間、振盪しながら洗浄した。

作製した FISH 試料は、落射型蛍光顕微鏡（BX60、オリンパス社）または SNOM/AFM を用いて観察を行った。

（２）二遺伝子間相互位置解析（マルチカラーFISH シグナルの相互位置解析）

落射型蛍光顕微鏡にて良好なシグナルが観察されたマルチカラーFISH 核板を CCD カメラ（日本ローパー）にて撮影し

た。画像をグラフィックソフト（Paint Shop Pro 8: Jasc software）を用いて２番染色体を切り出し、回転させて染色体軸をそろ

えた。Alexa488、Alexa546 のそれぞれのシグナルの質量重心（Center of Mass）を ImageJ（National Institutes of Health）を

用いて算出した。算出された Alexa488 シグナルの質量重心を、同一姉妹染色分体上の Alexa546 シグナルを原点としてプ

ロットした。

（３）ホルムアルデヒド二重固定

上記と同様にプレパレーションを行い、風乾直後に 0.5～4.0％のパラフォルムアルデヒド／2xSSC 中で室温 10 分間の再

固定を行った。その後、2xSSC 中で室温５分３回の洗浄を行い、70％エタノール５分、100％エタノール５分間の脱水処理を

行った。

（４）SNOM/AFM

本研究で使用した SNOM/AFM（SNOAM、SPI 3800N、SII ナノテクノロジー）の概要を図２に示した。本 SNOM/AFM は、

倒立型光学顕微鏡上に設置されていることが特徴であり、生物試料の大まかな位置を光学顕微鏡で確認した上で、目的と

する場所を、SNOM/AFM を用いて高分解計測することが可能である。これにより従来の光学顕微鏡と SNOM/AFM の分解

能の比較が可能となっている。ここで使用する探針は、光ファイバーを鋭く尖らせ先端部分を曲げた構造を持っており、

AFM 用の探針とほぼ同じ扱いが可能になり、AFM と同様に形状像を計測できる（図 2 a）。探針の制御は、通常の AFM と

同様に光てこ方式で制御される（図 2 a の赤いレーザー部）。

光ファイバー製の探針は「光プローブ」と呼ばれ、外側をアルミニウムなどの金属でコーティングされ、内部にレーザー光

を通すことが可能である。光プローブの先端には 50nm～100nm 程度の開口があり、開口付近に発生する近接場光を使っ

て、試料に標識した蛍光色素を励起する（図 2 b）。探針を AFM と同様に制御し形状像を計測すると同時に、試料上の蛍

光色素が励起され、励起された蛍光は、試料下部の倒立型顕微鏡の対物レンズを利用して集光されて、極微弱光の検出

器であるフォトマルチプライアーやアバランシェ・フォトダイオードで高感度検出される。したがって、SNOM/AFM では、形

状像と蛍光信号の位置が同時に計測可能である。これまでも、標識した蛍光色素を蛍光顕微鏡で観察可能であったが、

39



分解能は光の回折限界のため数百 nm 以上に限られていた。しかしながら SNOM/AFM では、50nm 程度の開口を利用し

て、励起光をあたかもスポットライトのように絞って走査することが可能なため、分解能が飛躍的に向上し、ナノレベルの分

解能での蛍光シグナルの位置検出が期待できる。なお、光プローブは、光ファイバー製で開口部を持つため、通常のシリ

コン製 AFM 探針ほどは先端が鋭くはなく、高分解能で鮮明な形状像を計測するには不向きである。そのため、必要に応じ

て、同じ試料の形状像を AFM 探針で計測し、SNOM/AFM による蛍光像と重ねて解析した。

研究成果

第I期においては、SNOM/AFM計測に適化した染色体試料調製法の開発に始まり、一様に蛍光染色した試料、蛍光

バンド染色した試料を用いた予備的な検証を経て、終的にセントロメア、テロメア等の繰返し配列領域を対象とした

SNOM/AFM による光学顕微鏡を超える分解能での FISH シグナル検出に成功した 1, 2)。しかしながら、SNOM/AFM による

染色体高次構造解析手法「染色体ナノ FISH 法」を確立するためには、セントロメア、テロメア等の特殊領域だけでなく、通

常のクロマチン領域において、一遺伝子レベルの範囲を高分解能で検出し、染色体の立体構造との対応を解析することが

必要である。そこで、第II期においては、SNOM/AFMによる染色体上の単一遺伝子の検出技術の確立を主たる目標とし、

その技術を複数の遺伝子領域の同時検出と染色体立体形状との関連づけに適用して、染色体高次構造に関する情報の

取得を終目的とした。さらに、目的達成のために北陸先端大グループとの連携を図り、また、研究の展開にともなって明

らかになった、FISH 処理時の染色体の構造損傷を低減するための手法の開発も行った。

１）SNOM/AFM による染色体上の単一遺伝子の検出

単一遺伝子のSNOM/AFM検出の対象としては、ヒト第２染色体長腕のほぼ中央に位置(2q31)するHAT1 (Histone

acetyltransferase type B catalytic subunit)遺伝子を選択した（図１）。計測には、SNOM/AFMの観察に適した清浄な染色

体調製法及びFISH処理条件の適化を行った試料を用いた3, 5)。FISHプローブは、MYO3Bの一部領域（MYOｐ－１）を

PCR法により増幅したものを用いた（詳細は研究方法参照）。MYOｐ－１をプローブとしたFISH染色体試料を通常の光学顕

図２本研究で用いた SNOM/AFM の概要 a、全体の概要図。SNOM/AFM の本体は倒立型顕微鏡上に設置されている。b、探針先端部の拡大図。先

端部には 100nm 以下の開口があり、レーザー光源によりその開口付近に近接場光が発生し、試料表面の蛍光

色素を励起することが可能になる。近接場光の到達する深さは、開口径と同程度と考えられており、表面か

ら 100nm 程度までの深さに存在する蛍光色素が励起される。

40



微鏡により計測した場合、図３a-cに示すようにほぼ円形のFISHシグナルが染色体長腕の中央付近に観察される。また、染

色体の本体は、光学顕微鏡ではその輪郭は明確には捉えられず、得られる情報は対象遺伝子の染色体上での概略の位

置のみである。一方、同一領域のAFM及びSNOM/AFM観察（図３d-f）においては、FISHシグナルは蛍光顕微鏡のものと

比べ、よりはっきりとした輪郭を有していることがわかる。また、AFM形状像では、染色体の微細立体構造が観察されており、

両者の重ね合わせ像からFISHシグナルが染色体腕部の外縁に位置していることが明確に判別された。さらに、高倍率

のAFM及びSNOM/AFM観察（図３g-i）によれば、FISHシグナルはある程度の大きさと形状を有する領域として計測され、

AFM形状像における染色体の表面には直径数十nmのクロマチンファイバー構造が観察された。したがって、FISHシグナ

ル領域を形状像に重ねる（図３i）ことにより、どの粒子状構造（＝クロマチンファイバー）が、FISH対象配列から構成されて

いるか推測可能なことが示された。一方、FISH処理染色体の形状像（図３d, g）から、染色体が平面状に押しつぶされたよう

に変形し、FISH処理によって染色体立体構造がかなり損傷していることも明らかとなった。

２）複数の遺伝子をプローブとした FISH シグナルの SNOM/AFM による検出

次に、染色体上の複数の遺伝子位置をナノスケールの分解能で検出するため、HAT1 遺伝子の近傍(1.5Mb)に位置する

MYO3B (MYOSIN IIIB)遺伝子領域（図１）の FISH プローブ（MYOｐ－１）を波長の異なる２種類の蛍光色素（それぞれ緑と

赤）を用いて標識し、FISH 試料を作成した。その後、この試料を用いて、２種類の波長によるマルチカラーFISH の

SNOM/AFM 計測に、初めて成功した（図４）。HAT1 と MYO3B はゲノム上で 1.5 Mb 離れているため、通常の蛍光顕微鏡

によっても両者の蛍光シグナルは分離して観察することが可能であるが、その場合でもそれぞれの FISH シグナル領域は

周縁のぼやけた楕円状としてしか観察されない（図４a, b）。これに対して、SNOM/AFM の蛍光像（図４c、同一領域の AFM

a

図３ MYO3B 単一遺伝子 FISH の SNOM/AFM 観察

MYO3B遺伝子配列の一部をプローブとしたFISH試料のSNOM/AFM観察例。a-b、蛍光顕微鏡観察。d, g, AFM形状像。e, h,

SNOM/AFM 蛍光像。f, i, AFM 形状像と SNOM/AFM 蛍光像の重ね合わせ像。FISH シグナルとクロマチンファイバーの対応づ

けを目的とするため、SNOM/AFM 形状像に代って、同一領域の、より高分解能の AFM 形状像を示した。

41



形状像との重ね合わせ像）では、それぞれの領域が、明確な輪郭をもって可視化されており、さらにその一部がある程度重

なり合っている（右側のシグナル）ことも判別できる。この結果は、ゲノム上の２つの領域の相対位置関係を、染色体構造の

上において高分解能で検出可能なことを意味しており、SNOM/AFM による FISH シグナル情報と AFM 形状像におけるク

ロマチンファイバーの空間配置情報を比較解析することによって、クロマチンファイバーの折れ畳み構造等の染色体高次

構造に関する知見を得るための手法として、「染色体ナノ FISH 法」が有効な手段となる可能性を示している。

３）隣接した複数の遺伝子の検出と染色体高次構造中での遺伝子空間的配置のナノスケール解析

さらに、極めて近接した遺伝子領域の分離検出を目的に、MYO3B 遺伝子中の隣接した２つの領域（両領域共、約 38ｋ

ｂ、図１）の FISH プローブ（MYOｐ－１，MYOｐ－２）を作製し、SNOM/AFM 計測を行った。得られた蛍光像は、AFM による

高分解能形状像と対比させ、FISH シグナル領域とクロマチンファイバーの対応付けについての検討を行った（図５）。高倍

率の AFM 形状像では、染色体表面は直径 50～100nm 程度の粒子状構造に覆われており（図５d）、現在までの研究により、

AFM カンチレバーの先端径を考慮した上で、クロマチンファイバーが折れ畳まれた構造に相当するものと推測されている。

このクロマチンファイバーの形状と SNOM/AFM で得られた２つのプローブの蛍光像を重ね合わせた図が図５b および５c で

ある。図５d は、さらに拡大し、AFM による高分解能の形状像と組み合わせた図であり、図５e では蛍光シグナルの輪郭部を

抽出して表示している。図に示されるように、両領域の端はわずかに重なっているが、これは両 FISHプローブの間隔をゼロ

として設計しているため、染色体の高次な折れ畳み構造を考慮すれば、重なりは必然であると考えられる。２種類の FISH

シグナルの分布と形状を比較検討した結果、MYOp-1（赤色のシグナル）の分布には、クロマチンファイバーの立体形状

（高低）との相関が低いのに対し、MYOp-2（緑色のシグナル）は立体形状が高い領域に顕著に分布しておることがわかっ

た。このデータは、MYOp-2 の配列を含むクロマチンファイバーが染色体の表面に顕われており、MYOp-1 の配列を含むク

ロマチンファイバーは染色体内部に畳み込まれていることを示唆していると考えられる。したがって、この結果より、FISH 法

と SNOM/AFM 計測の組み合わせによる「染色体ナノ FISH 法」が、クロマチンファイバーの折れ畳みなどの染色体高次構

造に関する情報を得るためのツールとして有効であることが示されたと考える。

図４ SNOM/AFM による HAT1、MYO3B マルチカラーFISH シグナルの検出

a、b、HAT1 (緑色シグナル)及び MYO3B (赤色シグナル)の FISH シグナルの蛍光顕微鏡像。c、SNOM/AFM で検

出した HAT1（緑）及び MYO3B（赤）の蛍光像を原子間力顕微鏡（AFM）で観察した形状像の上に重ねて表示。

MYO3B: red signal

c

a

b

42



図５ SNOM/AFM による隣接領域のマルチカラーFISH シグナルの検出

a、蛍光顕微鏡像。b～d、SNOM/AFM 像。２つの隣接領域の FISH 試料（MYOp-1：赤、MYOp-2：緑）の蛍光像を、AFM

で計測した染色体の形状像の上に重ねて表示している。走査範囲：10 x 10 µm2、5 x 5 µm2、2 x 2 µm2。e、FISH シグナル

の輪郭を抽出し形状像に重ねた図で、FISH シグナルに対応したクロマチンファイバーレベルでの位置特定が可能になっ

た。

a b c

d e

図６ホルムアルデヒドによる再固定の効果

a～d、カルノア固定のみ(通常の FISH 法)。e～h、1%ホルムアルデヒドによる再固定。i～l、4%ホルムアルデヒドによ

る再固定。a、e、i、FISH 処理前。b、ｆ、ｊ、RNase 処理後。c、ｇ、ｋ、熱処理後。d、h、l、断面図(c、ｇ、ｋ)。

43



４）FISH 処理時の染色体構造損傷の低減手法の検討

SNOM/AFM による FISH シグナルの計測において、染色体の高次構造が FISH 処理により損傷をかなりの受けているこ

とが明らかとなった（図３−５）。したがって、詳細な染色体高次構造の解析を進めるためには、染色体の損傷を低減し、高

次構造をある程度保持した状態で FISH 処理が可能な方法を開発する必要がある。そこで、いくつかの方法を検討した結

果、ホルムアルデヒドによる再固定を FISH 処理に先立って行うことにより染色体構造の保存効果が大きいことを見出した。

図６に結果を示したように、再固定を行わず、通常の手順によって FISH 処理した試料（a～d）は、処理前に比べて高さが大

幅に低下し、全体の形状もつぶれて、立体構造がほぼ完全に破壊されていることがわかる。特に高さ（d）は、当初の 200nm

程度から、40nm 程度まで大きく低下し、エッジが残った特殊な形状（c）となった。この傾向は、ヒトのみに限らず、植物染色

体においても同様であった 4)。一方、ホルムアルデヒド再固定を導入した場合は、ホルムアルデヒド濃度の増加につれて構

造破壊が低減される傾向がみられた。1%の場合（e～h）は効果が少なく、高さが徐々に低下し、終的には約 70nm となっ

た。ホルムアルデヒド濃度を 4%まで増加させた場合にはほとんど形状が変化せず、処理に伴って熱処理後の終的な高さ

も 140nm 前後で維持され、形状を変化させずに FISH 処理が可能であると考えられた。また同時に、再固定染色体の

SNOM/AFM 計測が可能かどうか検証するため、２％ホルムアルデヒド再固定染色体を用いた FISH を行い、SNOM/AFM

計測を試みたところ、図７に示すように、染色体上の FISH シグナルを検出することが可能であった。

５）FISH の処理が染色体の構造に与える影響の検証

本研究では、SNOM/AFM により、近接ないし隣接したゲノム上の遺伝子領域の位置を高分解能で検出し、得られた領域

間の物理距離とゲノム上での位置関係を対比させることにより、染色体の高次構造に関する情報を得ることを目的としてい

る。しかしながら、遺伝子領域位置検出のために FISH 処理を行うことにより、染色体構造にある程度の損傷が生じることが、

上記４）で明らかになった。そこで、FISH 処理を施した染色体試料において、遺伝子領域間の相対的位置関係を複数の染

色体について蛍光顕微鏡により計測した。計測対象には、1.5Mb 離れた HAT1 遺伝子領域と MYO3B 遺伝子領域、0.7Mb

離れた PPIG 遺伝子領域と MYO3B 遺伝子領域、及び、隣接する MYOｐ－１領域と MYOｐ－２領域を選んだ。その結果を

図８上段に示す。図では、MYO3B（MYOｐ－１）遺伝子の位置を原点とし、他方の遺伝子までの距離と方向をプロットしたも

のである。未固定染色体の場合、いずれの遺伝子領域を用いた場合にも、２つの領域間の距離はほとんど重なっているも

のから、数100nm～1.5µm以上離れたものまで染色体毎に大きく異なっていた。ただし、隣接領域を用いた場合は大でも

500nm 程度に留まっていた。ヒト染色体の姉妹染色分体の幅は、ほぼ 1.5µm であること、隣接した遺伝子領域（MYOｐ－１

と MYOｐ－２）の中心間距離（約 40kb）がクロマチンファイバーの延長に換算すると 500nm 弱になることから、２つの領域間

の距離は離れることが可能な大距離からゼロ距離までの分布を示していることがわかる。また、領域間の方向性に関して

は、全データの平均値（緑の点）がほぼ原点付近にあり、特定の傾向はみられない。これらの結果は、２つの領域の位置関

係には特定の傾向はなく、両者の位置関係はランダムに決まっていると考えられた。このことは、FISH 処理により、染色体

図７ホルムアルデヒド再固定染色体を用いた FISH 試料の SNOM/AFM 計測

２％ホルムアルデヒド固定染色体を用いた FISH シグナルの SNOM/AFM 観察例。ハイブリダイゼーション効率がやや

低下するが、SNOM/AFM による計測は可能である。a、走査範囲 8 x 8 µm2。b、走査範囲 4 x 4 µm2。

a b

44



の内部高次立体構造がかなり大きく破壊されている可能性を示唆している。一方、AFM 計測により、染色体表面にはクロ

マチンファイバー構造が観察されることから、比較的低次の構造には FISH 処理の影響は及んでいないものと考えられる。

そこで、FISH 処理時の染色体立体形状が比較的保持されることが検証された、１％、２％、及び４％ホルムアルデヒド再

固定を施した試料について同様の解析を行った（図８上中段～下段）。その結果、ホルムアルデヒド濃度が高くなるにつ

れて、シグナルの分散の程度が小さくなり、わずかながら収束する傾向があった。特に、HAT1 と MYO3B の組み合わせの

場合は、４％ホルムアルデヒド再固定により全データの平均値が染色体の内側よりにシフトした。このことは、HAT1 遺伝子

領域が MYO3B 遺伝子領域よりも染色体の内側に座乗していることを示しており、再固定処理がある程度ではあるが、染色

体の内部構造保持に効果を持つことを示している。しかしながら、FISH シグナルの分散の程度には顕著な減少は観察され

ず、染色体内部の遺伝子領域の位置は、ランダムに近い状態にあると推測される。再固定処理が染色体の全体形状（高さ

や外形）の保持する効果を持つことが確認されている（図６）にも関わらず、遺伝子領域間の位置関係は染色体毎に大きく

異なる理由は、現時点では不明であるが、以下のような可能性が考えられる。①再固定で構造が保持されているのは染色

体の比較的表層のみであり、内部構造は FISH 処理により損傷している。②FISH 処理以前に、カルノア固定液処理の時点

で、染色体内部の高次構造がすでに損傷している。③染色体の高次構造はサブマイクロメートルレベルでは正確に制御さ

れているが、近接した遺伝子領域の位置関係等のクロマチンファイバーのナノレベルの折れ畳みに関しては、正確に規定

されていない。今回の研究で見出されたこの現象を解明するには、さらに引き続き検討が必要と思われる。

６）染色体高次構造の中での特定タンパク質の検出

SNOM/AFMによる染色体構成タンパク質の検出の予備実験として、ヒストンH4を対象とした免疫標識蛍光の計測を試み

た。免疫蛍光染色は、ビオチン標識抗ヒストンH4抗体とCy3標識ストレプトアビジンを用いて行った。そのSNOM/AFM計測

の結果を図９に示す。SNOM/AFM計測により、ヒストンH4が染色体のほぼ全域に分布している様子が計測できたが、部位

特異的なヒストンH4の量的変化等を計測するには至らなかった。

図８ホルムアルデヒド再固定による FISH シグナルの相対位置関係の変化

MYO3B プローブ A の FISH シグナル位置を原点にとり、これに対する他方（HAT1, PPIG, MYO3B プローブ B）の FISH

シグナル位置をプロットしたもの。縦軸は、セントロメア方向を正、横軸は腕の内側方向を正としている（右上図参

照）。

2_m

MYO3B - HAT1 (1.5Mb) MYO3B - PPIG (0.7Mb) MYO3B -MYO3B (隣接)

未固定

1% ホルムア

ルデヒド固定

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

Observed values90% confidence limit95% confidence limit99% confidence limitMean value

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000


-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000


-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-1000

-500

0

500

1000

-2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

2% ホルムア

ルデヒド固定

4% ホルムア

ルデヒド固定

45



７）北陸先端大グループとの連携

本研究グループでは、SNOM/AFM による染色体高次構造の解析を行うにあたって、小課題 1)の北陸先端大グループ

（以後、先端大）が進めている染色体の特定部分の切断回収と微量 DNA 増幅の技術を組み合わせることを考えた。すなわ

ち、SNOM/AFM により高分解能で位置決めした特定配列の周辺領域の DNA 配列情報を得ることができれば、公開されて

いるゲノム情報を利用して、染色体上の特定領域を構成しているゲノムの範囲を特定し、染色体の折れ畳み構造に関する

知見を得ることが可能である。そこで、この目的のため、SNOM/AFM または蛍光顕微鏡により特定遺伝子領域を位置決め

した染色体試料を、形状及び蛍光データとともに先端大に送付し、染色体上の同じ箇所を位置決めできることを検証した。

さらに、特定領域周辺の DNA の増幅実験等についても、随時遺伝子の位置を特定した染色体試料を提供するなど、連携

して取り組んだ。

考察

単一および複数の遺伝子領域の SNOM/AFM による光学顕微鏡の限界を超えるナノスケール位置計測が可能になった

ことは、複数の遺伝子領域の位置関係を精密に解析する手法として今後の大きな展開が期待できる。さらに、これらの位置

情報を AFM で計測したクロマチンファイバーレベルの形状像と対比させることも可能であり、SNOM/AFM および AFM の

分解能が向上し、染色体の構造を維持したまま FISH が可能な方法が開発されば、現在まで、まったく未解明の中期染色

体の高次構造解明にも繋がる。そのためにも、FISH処理が染色体の構造に与える影響の解明やホルムアルデヒドによる染

色体再固定による構造破壊の低減法の開発は、今後要求される高精度遺伝子マッピング及びそのデータに基づく染色体

高次構造解析に不可欠である。なお、染色体構造タンパク質の空間配置を SNOM/AFM で解析することも計画したが、

SNOM/AFM と FISH 法の組み合わせによるクロマチンファイバーの折れ畳み構造の解析手法の実現性とその染色体高次

構造解析における効果がより大きいと考えられたため、「染色体ナノ FISH 法」の検討に集中した。

今後の発展方向、改善点等

染色体の構造は、細胞の核内から取り出したり、固定作業を行ったりすると、全体形状の変形はもとより、高次構造の損

傷、構成タンパク質の構成成分の損失など、多くの問題が生ずる。そこで、溶液中で高次構造を保ったまの染色体の

SNOM/AFM 計測を可能にし、さらに、構造損傷を抑えた FISH を実現できれば、SNOM/AFM での解析が大きく前進する。

そのためには、SNOM/AFM による溶液中での生体試料計測手法についてさらに研究を進める必要がある。また、

SNOM/AFM の特徴の一つは、光学顕微鏡の限界を超える高分解能での蛍光標識の検出にあるが、現状では、光学顕微

鏡の限界を僅かに超える程度に留まっているため、装置としてさらに改良が望まれる。一方、特定の遺伝子を蛍光標識す

る FISH 法も、シグナル出現効率の向上など確実な標識と定量性が実現されれば、SNOM/AFM による高分解能計測との

組合せによる本手法の有効性が高まり、新たな染色体研究や細胞生物学研究に繋がるものと期待できる。

a b

図９ SNOM/AFM による染色体タンパク質の検出

抗ヒストン H4 抗体を用いて免疫蛍光染色した染色体の SNOM/AFM 像。a、蛍光像。b、形状像。

46



参考（引用）文献 (本文中には引用せず)

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11) Liu, X., Sugiyama, S., Xu, Q.Y., Kobori, T., Hagiwara, S. amd Ohtani T.：「Atomic Force Microscopy Study of

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関連特許


該当なし


該当なし

47



■ 成果の発表（成果発表の概要）

1. 原著論文による発表（査読付き） 5 報（筆頭著者：5 報、共著者： 0 報）




国内誌：4 報、国外誌： 0 報、書籍出版： 0 冊


5. 特許出願出願済み特許：0 件（国内： 0 件、国外： 0 件）



1) D. Fukushi, M. Shichiri, S. Sugiyama, T. Yoshino, S. Hagiwara, T. Ohtani：「Scanning near-field optical/atomic force

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treated chromosomes: visual analyses by FISH and atomic force microscopy」, Chromosome Research, 11, 65-71,

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該当なし



1) 吉野智之、大谷敏郎：「SNOM/AFM の生物試料への応用」, 電子顕微鏡, 13(3), 2-6, (2003)

2) 大谷敏郎：「食品や生体試料のナノレベルでの画像計測」, TSUKUBA SCIENTIFIC PHOTO, 13, 2-5,（2003）

3) 中尾秀信、大谷敏郎：「伸張固定制御とバイオ分子デバイスへの展開」, 未来材料, 4(10) , 14-17, (2004）

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業, 47(14),45-54,（2004）

国外誌

書籍出版

4. 口頭発表

招待講演

1) T. Ohtani：「Scanning near field optical / atomic force microscope(SNOM/AFM) - novel imaging technique in

48



nano-meter scale - and development of DNA nano-FISH method」,Yokohama, 13th International Symposium on

Bioluminescence & Chemiluminescence, 2004.8.3

2) 大谷敏郎：「走査型光プローブ原子間力顕微鏡(SNOM/AFM)を用いた DNA-および染色体-nanoFISH 法-、DNA

の伸長・固定方向の制御と金ナノワイヤの作製」, 東京, 国際ナノテクノロジー総合展・技術会議（nano tech

2004）, 2004.2.17


1) 吉野智之、松戸隆之、杉山滋、七里元晴、福士大輔、中尾秀信、萩原昌司、大谷敏郎：「SNOM/AFM による染色

体のナノ構造解析」, 札幌, 電子顕微鏡学会５９回学術講演会, 2003.6.9

2) 大谷敏郎、吉野智之、中尾秀信、佐宗めぐみ、杉山滋、萩原昌司、村松宏：「SNOM/AFM による DNA ナノ FISH

法の開発と細胞生物学への応用」,札幌, 電子顕微鏡学会５９回学術講演会, 2003.6.9

3) 杉山滋、金原浩子、佐宗めぐみ、吉野智之、七里元晴、萩原昌司、大谷敏郎：「オオムギ染色体蛍光バンドの走

査型光プローブ顕微鏡（SNOM/AFM）による観察」, 新潟, 日本生物物理学会年会, 2003.9.23

4) 吉野智之、杉山滋、金原浩子、大谷敏郎：「液中 AFM によるオオムギ染色体の構造変化の計測」, 東京, 日本食

品科学工学会第 50 回大会, 2003.7

5) T. Yoshino, T. Matsuto, D. Fukushi, M. Shichiri, S. Sugiyama, S. Hagiwara, K. Akazawa, T. Ushiki, T. Ohtani：

「Visual-nanobiology of barley chromosomes by scanning near-field optical/atomic force microscopy and image

analysis」, Eindhoven, The 12th International Conference on Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and

Related Techniques (STM’03), 2003.7.21

6) H. Nakao、T. Yoshino、 S. Sugiyama、 T. Ohtani：「Simple route to construction of highly aligned DNA nanowires」,

Eindhoven, The 12th International Conference on STM, 2003.7.21

7) 杉山滋、佐宗めぐみ、金原浩子、吉野智之、七里元晴、萩原昌司、大谷敏郎：「走査型プローブ顕微鏡（SPM）に

よるオオムギ染色体の微細構造解析」, 福岡, 第 64 回応用物理学会学術講演会, 2003.8.30

8) 佐宗めぐみ、杉山滋、大谷敏郎：「DNA の伸長固定における基板表面状態の影響」, 福岡, 第 64 回応用物理学

会学術講演会, 2003.9.1

9) 大谷敏郎、JongMin Kim、吉野智之、中尾秀信、佐宗めぐみ、杉山滋、廣瀬玉紀、村松宏：「SNOM/AFM による

DNA-nanoFISH 法」, 千歳, 日本顕微鏡学会 SPM 研究部会第６回研究会, 2003.11.16

10) T. Yoshino, D. Fukushi, M. Shichiri, T. Matsuto, S. Sugiyama, S. Hagiwara, K. Akazawa, T. Ushiki, T. Ohtani：

「Visual-nanobiology by scanning near-field optical/atomic force microscopy」, Atagawa, The 11th International

Colloquium on Scanning Probe Microscopy, 2003.12.11


「Visual-nanobiology of barley chromosomes by SNOM/AFM」, Miami, IEEE, Conference on Nanoscale Devices &

System Integration, 2004.2.15

12) 中尾秀信、吉野智之、杉山滋、大谷敏郎：「転写による高配向DNAナノワイヤの調製と観察」, 山口, 第52回高

分子学会年次大会, 2004.5.28

13) T. Yoshino, S. Sugiyama, H. Kanahara, T. Ohtani：「Atomic force microscopic study on chromosome structure in

liquid」, Kanazawa, 8th Asia-Pacific Conference on Electron Microscopy, 2004.6.7


「 Investigation of barley chromosome structure by scanning near-field optical/atomic force microscopy」 ,

Antowerpen, The thirteenth European Microscopy Congress, 2004.8.22

15) 吉野智之、七里元晴、中尾秀信、佐宗めぐみ、福士大輔、杉山滋、大谷敏郎：「走査型光プローブ原子間力顕

微鏡による染色体や DNA 上の特定塩基配列の可視化」, 京都, 第 13 回日本バイオイメージング学会, 2004.10.6

16) 杉山滋、吉野智之、福士大輔、七里元晴、佐宗めぐみ、関口博史、萩原昌司、大谷敏郎：「Application of

49



scanning near-field optical/atomic force microscopy to genetic analysis: detection of fluorescent signals on

chromosomes ad DNA with resolution exceeding optical limit.」, 神戸, 第 77 回日本生化学会大会, 2004.10.15

17) T. Ohtani, M. Shichiri, T. Yoshino, S. Sugiyama,：「Chromosome nano-FISH: An effective tool for nano-resolution

single gene detection useing SNOM/AFM」, Kyoto, Nano and Visual Biology of Chromosome Dynamics,

2004.10.16

18) 杉山滋、大谷敏郎：「走査型光プローブ顕微鏡の染色体解析への適用」,岡崎,自然科学研究機構生理学研究

所研究会「ＤＮＡ構造を基盤とするゲノム生理学の展開, 2004.11.4

19) M. Shichiri, D. Fukushi, A. Matsumoto, S. Sugiyama, T. Yoshino, T. Ohtani：「The preserving effect of the

chromosome structure by formaldehyde fixation before FISH treatment」, Spain, International Cytogenetic and

Genome Society, 2005.6.15

20) 七里元晴、松本敦子、吉野智之、杉山滋、大谷敏郎：「走査型光プローブ原子間力顕微鏡（SNOM/AFM）による

高分解能マルチカラーFISH」,青森, 染色体学会 2005 年度（第５６回）大会, 2005.10.10


6. 受賞等

50





2.1.1. SPM による染色体高次構造の解明

担当機関名研究室名新潟大学教育研究院医歯学系（医歯学総合研究科）顕微鏡解剖学分野

研究者名牛木辰男

■ 要旨

原子間力顕微鏡と他の顕微技法を組み合わせて染色体高次構造のナノスケール解析を行い、１）染色体の部位特異的

な高次構造の解析、２）細胞分裂時の染色体の凝縮と分離の形態変化の解析、３）生の染色体の高次構造解析を行い、そ

れぞれ以下のような結果をえた。

１）染色体の高次構造は染色体腕上で均一ではなく、凝縮の強い部位と弱い部位の組み合わせからなることを明らかに

した。また、このような凝縮の強弱と各種バンド（G/Q バンド、C バンド）との相関、非ヒストン性骨格を構成するトポイソメラー

ゼ IIαの分布との相関を解析し、染色体の高次構造の基本模型を明らかにした。

２）紡錘糸形成阻害剤（コルセミドなど）を投与しないヒトの培養リンパ球から分裂各期（前期から終期まで）の染色体展開

標本を得て、光学顕微鏡および原子間力顕微鏡で詳しい解析を行い、前期のクロマチンの凝縮から終期のクロマチンの

脱凝縮までの立体高次構造変化を可視化することに成功した。

３）染色体を生のまま細胞から単離し、化学固定を行わずに原子間力顕微鏡で直接観察することを可能にした。

■ 目的

本担当項目は、染色体の構造と機能解明のためのナノデバイスの開発に資するため、走査型プローブ顕微鏡（特に原

子間力顕微鏡）を用いて、具体的な染色体の高次構造・機能解析を行うことを目的として研究を行った。そこで、第Ⅰ期で

は、原子間力顕微鏡を用いてヒトリンパ球の分裂中期染色体の構造解析を行うための技術開発、および実際の染色体の

解析を行った。これにより、原子間力顕微鏡による染色体の可視化技術を確立し、大気中で数十万倍の分解能で染色体

の立体表面形状解析ができるようにした。また、その技法により、ヒト分裂中期染色体の原子間力顕微鏡観察を行い、染色

体の染色腕上でクロマチン線維の凝縮の強い部位と弱い部位が交互に存在し、これが G/Q バンド染色のバンド構造が染

色体の微細構造を反映していることを明らかにした。また、これによりヒト中期染色体の高次構造の基本を明らかにした。し

かし、中間評価では、分裂各期の染色体の高次構造解析の必要性と、試料作製のアーティファクトのない染色体の直接観

察法の開発の必要性が指摘された。そこで、第Ⅱ期では染色体の高次構造をより生理的にかつダイナミックに解析する目

的で、原子間力顕微鏡と他の顕微技法を併用しながら、細胞分裂の各期における染色体の高次構造のナノスケール解析

を行い、クロマチン凝集の過程とその構造変化の可視化をはかった。特に第Ⅰ期で解明した染色体の基本高次構造を基

盤に、構造の部位差、凝縮・分離の過程での構造変化に注目し、液中観察法も駆使しながら、染色体の高次構造と機能と

の連関を明らかにすることを目的にした。

■ 目標

① 染色体の部位特異的な高次構造を解明する。

② 分裂各期の染色体の構造解析による染色体の凝縮と分離の形態変化を解明する。

③ 生の染色体の高次構造を解明する。

④ 染色体の高次構造に関する形態学的な基盤を構築する。

51




① 染色体の部位特異的な高次構造の解明

染色体の非ヒストン性骨格を構成するトポイソメラーゼ IIαの分布を蛍光顕微鏡と近接場光学顕微鏡で観察し、各

姉妹染色分体の中心部に局在するこの蛋白質が、G/Q バンドに関連して分布している可能性を示した。

② 分裂各期の染色体の構造解析による染色体の凝縮と分離の形態変化の解明

紡錘糸形成阻害剤であるコルセミドを投与しないヒトの培養リンパ球から分裂各期（前期から終期まで）の染色体展

開標本を得て、光学顕微鏡および原子間力顕微鏡で詳しい解析を行い、前期のクロマチンの凝縮から終期のク

ロマチンの脱凝縮までを、クロマチン線維の梱包と配列の変化として原子間力顕微鏡で解析することを可能にし

た。

分裂各期におけるトポイソメラーゼ IIαの局在変化を解析し、染色体の部位により異なる凝縮を示す可能性を示し

た。

③ 生の染色体の高次構造解析

染色体展開標本を緩衝液中で原子間力顕微鏡観察することに成功し、この標本のトリプシン処理による変化と Q バ

ンド染色による変化を解析することに成功した。

さらに染色体を生のまま細胞から単離したものを、化学固定を行わずに原子間力顕微鏡で直接観察することを行い、

その高分解能観察に成功した。これにより、染色体の高次構造についてこれまで得られた結果が妥当であること

を示した。

④ 染色体の高次構造に関する形態学的な基盤の構築

染色体の高次構造についての従来のモデルでは、染色体を構成する種々のオーダーの線維が染色体内で均一

であるように考えられている。これに対して、本研究の上記①、②、③の結果から、染色体は均一な構造をとらず、

凝縮度の異なる部位があることを明らかにした。

■ 研究方法（試験研究の実験手法等を記入して下さい）

(1) 染色体標本の調整法

1) 一般的な染色体調整法

① ヘパリン採血したヒト末梢血を 10％phytohemagglutin 存在下で、10%ウシ血清培地中で 72 時間培養。

② 0.05μg/ml のコルセミドを加え、さらに 1 時間培養。

③ 1,500rpm で 5 分間遠心して得られた沈査に 75mMKCl を 5ml 添加し、室温で 30 分間の低張処理。

④ メタノール酢酸（3：1）を 2ml 加え、ピペッティングによりよく撹拌して固定。

⑤ 遠心上清除去の操作を 2～3 回繰り返し、固定液で細胞を洗浄。

⑥ 標本をスライドグラス上に展開。

2) 大貫の方法による標本調整法

① 1) と同様の方法でヒト末梢血リンパ球を 3 日間培養。

② 10μg/ml のコルセミドを加え、さらに 1 時間培養。

③ 0.055M の塩化カリウム、硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム混合液を用い、室温で 2 時間低張処理。

④ メタノール酢酸（3：1）により固定。

⑤ 標本をスライドグラス上に展開し、大気中で自然乾燥。

3) 5-aza-cytidine（5-aza-C）処理による染色体標本の調整法

①末梢血培養終了 7 時間前に、5-aza-C を培養液中に 3.5×10－7 M（final）投与する。

②培養終了後、通常の染色体標本作成手順に従って標本を作成する。

4) 単離染色体標本の調整法

① Ball-1(ヒト B 細胞白血病細胞株）の培養。

52



② 0.06μg/ml のコルセミドを加え、12 時間培養後、190×g で 10 分間 2 回遠心し、得られた沈査に 75mMKCl を 5ml

添加し、室温で 15 分間の低張処理。

③ 遠心後、hexylene glycol buffer (1.0 M hexylene glycol, 0.5 mM CaCl2, 0.1mM PIPES)に 37℃で 10 分間処理。

④ Dounce 型ホモゲナイザーで細胞を破砕後、1680×g で 15 分間遠心。

(2) 各種染色体染色法

1) Ｇバンド染色標本の調整法

① 4℃の 0.025％トリプシン(ハンクス液)で 5-15 秒処理。

② 5％ギムザ染色液(リン酸緩衝液 pH6.8)で 15 分間染色。

2) Ｑバンド染色標本の調整法

① キナクリンマスタード染色液（50μg/ml Mcllvaine 緩衝液 pH5.5）で 10 分間染色。

② 流水と緩衝液で洗浄後、緩衝液に封入した状態で蛍光顕微鏡による観察。

3) C バンド染色標本の調整方法:barium/saline/Giemsa（BSG）法

① 標本を 0.2N HCl 中に室温、1 時間静置。

② 50℃の 5% Ba(OH)2 で 3-5 分処理。

③ 60℃の 2×SSC に 1 時間静置。

④ 4％ギムザ染色液（リン酸緩衝液 pH6.8）で 2.5 時間染色。

4) トポイソメラーゼⅡαによる免疫染色のための染色体の調整方法

① －20 度に冷やしたアセトンで 10 分間後固定し、PBS で洗浄する。

② 10% FBS、0.05% Triton-X 100 を含む PBS 溶液で 30 分間ブロッキング処理。

③ 一次抗体（Anti-Topoisomerase Ⅱα antibody、20 倍希釈）で 24 時間反応。

④ PBS で洗浄後、二次抗体（Anti-mouse IgG antibody Alexa Fluor 488 conjugated、200 倍希釈）で 12 時間反応。

⑤ PBS で洗浄後、YOYO-3（2500 倍希釈）で 10 分間染色。

⑥ PBS で洗浄後、15% ホルマリンで 10 分間固定し、蒸留水で洗浄。

(3) 原子間力顕微鏡のための試料作製

1) 自然乾燥標本

2) 臨界点乾燥標本

① 1％タンニン水溶液と 1％オスミウム酸処理。

② エタノール系列で脱水し、臨界点乾燥。

3) 乾燥しない液中標本

(3)原子間力顕微鏡観察法

1) 大気中観察

セイコーインスツルメント社製のプローブ顕微鏡ユニット(SPA-400)とプローブステーション(SPI-3800)からなる AFM

を用いた。測定には 20μm スキャナを用い、共振（振動）モードで像を得た。カンチレバー(SI-DF40)は方型で、バネ

常数 33-50N/m、共振周波数 300-370kHz のものを使用した。信号の変化の検出にはスロープ検出方式を用い、Q カ

ーブで得られた共振点のピークより低周波数側を動作点とし、探針のアプローチ後に探針・試料間の力が小となる

条件を選び、凹凸像（力一定モード）、変位像、位相像を同時に測定した。スキャン速度はスキャン範囲に依存するが、

0.1～0.5Hz 程度にした。

一部の標本は、原子間力顕微鏡観察後、金属コーティングを行い、走査型電子顕微鏡による観察を行った。

2) 液中観察法

大気中観察法と同様に SPA-400 と SPI-3800 を用い、20μm スキャナを装着して、コンタクトモードと共振モードで測

53



定を試みた。終的な観察条件は研究成果で述べる。

図-1 ヒト染色体の調整・作製・観察の概略

■ 研究成果

（１）染色体の部位特異的な高次構造の解明

1) 染色体の高次構造と Q バンドとの相関 6)

染色体展開標本を緩衝液中で原子間力微鏡観察し、トリプシン処理による変化と Q バンド染色による変化を直接観

察することに成功した（図-2）。これにより、染色体上に観察されるジグザグ構造と Q バンドとのあいだに相関があること

が明らかになった。すなわち、Q バンド陽性部位はほぼ隆起部に一致し、G バンド陰性部位は溝に一致する傾向にあ

った。

図-2 ヒト 2 番染色体の Q バンド染色の前と後の原子間力顕微鏡像と光顕像、イディオグラムとの比較

2) トポイソメラーゼ IIαの染色体上の分布

染色体の非ヒストン性骨格を構成するトポイソメラーゼ IIαの分布を蛍光顕微鏡で観察した。トポイソメラーゼ IIαの

免疫活性は染色手技により大きく変化したので、抗体の希釈率や反応時間を変えることで、安定した染色性を得られる

条件を明らかにした。得られた蛍光像から、トポイソメラーゼ IIαは、YOYO-3 の染色部分、すなわち染色体全体に一

様に存在するのではなく、姉妹各染色分体の中心部に局在している像が観察された（図-３）。また、この蛋白質の局在

が、G/Q バンドに関連して分布している可能性を示した。また、この標本を走査型近接場光学・原子間力顕微鏡

(SNOM/AFM)により観察し、トポイソメラーゼ IIαの局在を染色体の立体構造と直接結びつけて観察できる手法を開発

した（図-４）。

before treatment after treatment.before treatment after treatment.

54



図-３ヒト染色体のトポイソメラーゼ IIα免疫蛍光染色図-４トポイソメラーゼ IIα免疫蛍光染色標本の走

査型近接場・原子間力顕微鏡画像

3) C バンド染色標本の原子間力顕微鏡解析 15)

C バンド処理した染色体を原子間力顕微鏡で観察した結果、染色体全領域で直径約 50 nm のクロマチン線維を認

めた。また、この線維がCバンド濃染部（動原体領域）では凝集し、Cバンド淡染部（腕部）ではほどけていることが明ら

かになった（図-５）。C バンドにおける一連の処理にもかかわらず C バンド濃染部ではクロマチン線維が密に梱包して

いることから、C バンド処理に抵抗性のあるタンパクがセントロメア領域のクロマチン線維同士を強固に結び付けている

可能性が示された。

図-５ヒト１番染色体の C バンド染色標本の原子間力顕微鏡像

4) 5-aza-C 処理染色体の構造

ヒト末梢血培養時に凝縮抑制剤である 5-aza-C を投与すると 1 番染色体ではセントロメア領域のヘテロクロマチン

が凝縮抑制され、この領域が伸びたままの構造をとる。この標本を大気中で原子間力顕微鏡観察したところ、この領

域における凝縮抑制度そのものも均一ではなく、1 ないし 2 個の小さな凝縮塊が存在することが明らかになった。C バ

ンド染色を行うと、凝縮塊は濃染され、そのうち 1 つは長腕基部に存在し、さらに凝縮塊以外の凝縮抑制部位は淡染

されることがわかった。以上、5-aza-C 処理により認められたセントロメア領域での凝縮抑制度の不均一さを示す結果

を得た。

5) ヒトリンパ球の細胞分裂時における姉妹染色分体交叉（SCE）の高次構造との関連 7), 14)

ヒトリンパ球の細胞分裂時における姉妹染色分体交叉（SCE）の高次構造との関連について原子間力顕微鏡で解

析した。

（２）分裂各期の染色体の構造解析による染色体の凝縮と分離の形態変化の解明

a b 500 nm

1 μm

a

bC バンド濃染部（動原体領域） C バンド淡染部（腕部）

AFM 像

TopoⅡ YOYO3 重ね合せTopoⅡ YOYO3 重ね合せ

55



紡錘糸形成阻害剤（コルセミドなど）を投与しないヒトの培養リンパ球を用いて、分裂各期（前期から終期まで）の染色体

展開標本を作製し、光学顕微鏡および原子間力顕微鏡で詳しい解析を行った（図-６）。その結果、前期にクロマチ

ンの凝縮が始まり、中期で染色体を形成した後、後期から終期にかけてクロマチンの脱凝縮がおこり、再び核が形成される

各段階の染色体の微細形態変化を原子間力顕微鏡で解析することを可能にした。とくに、染色体が終期まで、徐々に長さ

を減じていく様子と、その際にクロマチン線維が強く梱包される様式、さらにその段階からクロマチン線維がほどけて脱凝縮

が起こる過程を可視化することに成功した。また、この諸過程におけるトポイソメラーゼ IIαの局在変化を解析し、染色体の

部位により異なる凝縮を示す可能性を示した。

図-６分裂各期におけるヒト１番染色体の長さの変化

図-６分裂各期における染色体の構造変化を示す原子間力顕微鏡像

（３）生の染色体の高次構造解析

1) 液中観察条件の検討

液中コンタクトモードでは、探針で試料を傷つけたり引っ掻いたりしてしまうことが多く、まして染色体のように毛糸の

玉のような構造をしているものは、探針に糸（クロマチン線維）が引っかかり、きれいな画像が得られない。一方ｍ液中ダ

イナミックモードにおいて、バネ定数が 0.08-0.37N/m 程度の V 字型カンチレバーを用い、10kHz 近傍の共振点を選ぶ

ことで比較的安定した観察が可能となることがわかった。また、この条件に Q コントロール法を加えることも効果的であっ

た。

前期前中期中期後期終期

一番染色体の長さ（平均値）

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

1 2 3 4 5

細胞分裂

染色

体の

長さ

平均

前期全中期中期後半中期後期

一番染色体の長さ（平均値）

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

1 2 3 4 5

細胞分裂

染色

体の

長さ

平均

前期全中期中期後半中期後期

56



2) 空気展開法により作製したカルノア固定染色体の液中観察 13)

通常の染色体展開法により作製した標本を一度かるく乾燥後、緩衝液に

浸漬し、(1 番と 2 番)染色体の液中観察を行った（図-７）。乾燥標本にくらべ

液中での染色分体の高さは 300nm とやや増加したが、これまでの大気中観

察と同様に姉妹染色分体のジグザグ構造が明瞭に観察された。このジグザ

グは腕部の隆起と溝のくり返しとして観察され、隆起部と溝の数は各染色体

に固有にみえた。また、この標本のトリプシン処理による変化と Q バンド染色

による変化を解析することに成功した。

図-７液中染色体の原子間力顕微鏡像

3) 単離未固定染色体の液中観察 18)

染色体を生のまま細胞から単離したものを、化学固定を行わずに原子間力顕微鏡で直接観察することを行い、その

高分解能観察に成功した（図-８）。これにより、染色体の高次構造についてこれまで得られた結果が妥当であることを

示した。

図-８未固定染色体の位相差顕微鏡像（左上）、表面形状像（弱拡大、強拡大）と蛍光像（左下）

（４）染色体の高次構造に関する形態学的な基盤の構築 6)

染色体の高次構造についての従来のモデルでは、染色体を構成する種々のオーダーの線維が染色体内で均一である

ように考えられている。これに対して、本研究の上記（１）、（２）、（３）の結果から、染色体は均一な構造をとらず、凝縮度の

異なる部位があることを示す知見を得ることができた。また、染色体は終期まで、徐々に長さを減じていき、その際にクロマ

チン線維が強く梱包される様式、さらにその段階からクロマチン線維がほどけて脱凝縮が起こる過程について、その形態変

化が明らかになった。

図-９ヒト染色体の基本高次構造図-10 分裂各期の構造変化

前期・・・・・・・・・前中期.・・・・・・・・・・・・・・中期.・・・・・・・・・・後期.・・・・・・終期前期・・・・・・・・・前中期.・・・・・・・・・・・・・・中期.・・・・・・・・・・後期.・・・・・・終期

100nm

50-60nm線維が梱包されている。

強い凝縮

弱い凝縮

分体間でのクロマチン線維の絡まり

50-60nm線維が梱包されている。

強い凝縮

弱い凝縮

分体間でのクロマチン線維の絡まり

57



■ 考察

本研究では、ヒト染色体の三次元微細構造について原子間力顕微鏡を用いて解析する手法を確立し、さらにその手法と

従来の染色体観察法を組み合わせて、染色体の基本構造を形態学的立場から解析することを行った。ほぼ当初の目標ど

おり、① 染色体の部位特異的な高次構造の解明、② 分裂各期の染色体の構造解析による染色体の凝縮と分離の形態

変化の解明、③生の染色体の高次構造の解明、について研究を進め、④染色体の高次構造に関する形態学的な基盤の

構築についてもある程度の成果を得たものと考える。ここで得られた結果は染色体の高次構造について、形態学的な立場

から新しい解釈を与えたもので、染色体の凝縮と分配に関しての今後の研究に対して新たな視点を与え、単に形態学の分

野のみならず分子生物学の広い分野の研究の進展につながる基盤的成果が得られたといえる。


染色体の高次構造についての従来のモデルは、染色体を構成する種々のオーダーの線維が染色体内で均一であるよ

うに考えている。これに対して、現在この研究で想定している染色体の高次構造は、染色体の中で凝縮度の異なる部位が

あるというものである。したがって、この研究を進めてきたことで、染色体の高次構造について、新しい解釈ができた。また、

本研究で得られた成果は、今後の種々の染色体研究の基礎データとなるものと考えられる。また液中での生体試料の原子

間力顕微鏡観察は、染色体研究以外でも種々の細胞生物学的分野に応用されることが期待される。染色体研究における

発展方向としては、ここで得られた形態学的な手法と知見を生かして、さらに RNAi 実験染色体の解析のような分子生物学

的手法とより緊密な連携をもち、一方で多様な免疫染色との組み合わせを行うことで、細胞分裂時の染色体の分配と凝縮

のメカニズムに関して大きな発展をもたらすのではないかと思う。

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latency-associated nuclear antigen of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus is essential for persistent episome

maintenance and is functionally replaced by histone H1.」, J Virol. 76, 12917-12924 (2002)

R. Mizuta, K. Iwai, M. Shigeno, M. Mizuta, T. Uemura, T. Ushiki, and D. Kitamura: 「Molecular visualization of

immunoglobulin switch region RNA/DNA complex by atomic force microscope.」, J. Biol. Chem. 278, 4431-4434 (2003)

O. Hoshi, R. Owen, M. Miles and T. Ushiki: 「Imaging of human metaphase chromosomes by atomic force microscopy in

liquid.」, Cytogent. Genome Res. 107, 28-31 (2004)

E. Kimura, O. Hoshi and T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of human metaphase chromosomes after differential staining

of sister chromatids.」, Arch. Histol. Cytol. 67, 171-177 (2004)

D. Fukushi and T. Ushiki: 「The structure of C-banded human metaphase chromosomes as observed by atomic force

microscopy.」, Arch. Histol. Cytol . 68, 81-87 (2005)

S. Toyabe, K. Akazawa, D. Fukushi, K. Fukui, and T. Ushiki: 「CHRONIS: an animal chromosome image database.」,

Chromosome Res. 13, 593-600 (2005).

K. Nomura, O. Hoshi, D. Fukushi, T. Ushiki, H. Haga and K. Kawabata: 「Visualization of elasticity distribution of single

human chromosomes by scanning probe microscopy.」, Jpn. J. Appl. Phys. 44, 5421-5424 (2005)

O. Hoshi, O and T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of native human metaphase chromosomes in a liquid.」, Arch. Histol.

Cytol. 69, 73-78(2006)

■ 関連特許


該当なし


該当なし

59



■ 成果の発表











1) T. Ushiki, S. Yamamoto, J. Hitomi, S. Ogura, T.Umemoto and M. Shigeno: 「Atomic force microscopy of living

cells.」, Jpn. J. Appl. Phys. 39, 3761-3764 (2000)

2) T. Ushiki: 「Atomic force microscopy and its related techniques in biomedicine.」, It. J. Anat. Embryol.106, 3-8

(2001)

3) E. Sonoda, T. Matsusaka, C. Morrison, P. Vagnarelli, O. Hoshi, T. Ushiki, K. Nojima, T. Fukagawa, I. C.

Waizenegger, J-M. Peters, W.C. Earnshaw and S. Takeda: 「Scc1/Rad21/Mcd1 is required for sister chromatid

cohesion and kinetocore function in vertebrate cells.」, Develop. Cell 1, 759-770 (2001)

4) O. Hoshi and T. Ushiki: 「Three-dimensional structure of G-banded humanmetaphase chromosomes observed by

atomic force microscopy.」, Arch. Histol.Cytol. 64, 475-482 (2001)

5) T. Yoshino, S. Sugiyama, S. Hagiwara, T. Ushiki and T. Ohtani: 「Simultaneous collection of topographic and

fluorescent images of barley chromosomes by scanning near-field optical/atomic force microscopy.」, J. Electron

Microsc. 51, 199-203 (2002)

6) T. Ushiki, T., O. Hoshi, K. Iwai, E. Kimura, and M. Shigeno: 「The structure of human metaphase chromosomes:

its histological perspective and new horizons by atomic force microscopy.」, Arch Histol Cytol 65, 377-90 (2002).

7) E. Kimura, E., J. Hitomi, and T. Ushiki: 「 Scanning near field optical/atomic force microscopy of

bromodeoxyuridine-incorporated human chromosomes.」, Arch. Histol. Cytol. 65, 435-444 (2002)

8) T. Sone, M. Iwano, S. Kobayashi, T. Ishihara, N. Hori, H. Takata, T. Ushiki, S. Uchiyama, and K. Fukui:

「Changes in chromosomal surface structure by different isolation conditions.」, Arch. Histol. Cytol. 65, 445-455

(2002)

9) S. Iwabuchii, T. Mori, K. Ogawa, K. Sato, M. Saito, Y. Morita, T. Ushiki, and E. Tamiya: 「Atomic force

microscope-based dissection of human metaphase chromosomes and high resolutional imaging by carbon

nanotube tip.」, Arch. Histol. Cytol. 65, 473-479 (2002)

10) T. Ohtani, M. Shichirii, D. Fukushi, S. Sugiyama, T. Yoshino, T. Kobori, S. Hagiwara, and T. Ushiki: 「Imaging of

chromosomes at nano-meter scale resolution using scanning near-field optical/atomic force microscopy.」, Arch.

Histol. Cytol. 65, 425-434 (2002)

11) H. Shinohara, M. Fukushi, M. Higuchi, M. Oie, O. Hoshi, T. Ushiki, J. Hayashi, M. Fujii: 「Chromosome binding

site of latency-associated nuclear antigen of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus is essential for persistent

episome maintenance and is functionally replaced by histone H1.」, J Virol. 76, 12917-12924 (2002)

60



12) R. Mizuta, K. Iwai, M. Shigeno, M. Mizuta, T. Uemura, T. Ushiki, and D. Kitamura: 「Molecular visualization of

immunoglobulin switch region RNA/DNA complex by atomic force microscope.」, J. Biol. Chem. 278, 4431-4434

(2003)

13) O. Hoshi, R. Owen, M. Miles and T. Ushiki: 「Imaging of human metaphase chromosomes by atomic force

microscopy in liquid.」, Cytogent. Genome Res. 107, 28-31 (2004)

14) E. Kimura, O. Hoshi and T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of human metaphase chromosomes after differential

staining of sister chromatids.」, Arch. Histol. Cytol. 67, 171-177 (2004)

15) D. Fukushi and T. Ushiki: 「The structure of C-banded human metaphase chromosomes as observed by atomic

force microscopy.」, Arch. Histol. Cytol . 68, 81-87 (2005)

16) S. Toyabe, K. Akazawa, D. Fukushi, K. Fukui, and T. Ushiki: 「CHRONIS: an animal chromosome image

database.」, Chromosome Res. 13, 593-600 (2005).

17) K. Nomura, O. Hoshi, D. Fukushi, T. Ushiki, H. Haga and K. Kawabata: 「Visualization of elasticity distribution of

single human chromosomes by scanning probe microscopy.」, Jpn. J. Appl. Phys. 44, 5421-5424 (2005)

18) O. Hoshi, O and T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of native human metaphase chromosomes in a liquid.」, Arch.

Histol. Cytol. 69, 73-78(2006)


該当なし



1) 牛木辰男「走査プローブ顕微鏡（SPM）試料作製法」, （第１１回電顕サマースクール編）電子顕微鏡基礎技

術と応用 2000 ～凍結技法で広がる超微の世界～,学際企画 (2000) p.100-109.

2) 牛木辰男、山科正平「走査プローブ顕微鏡」, 電子顕微鏡. 35, 136-138(2000)

3) 星治、牛木辰男「染色体の構造解析」, 電子顕微鏡. 38, 78-82 (2003)

4) 牛木辰男、星治「クロマチンの超微構造.－原子間力顕微鏡による近の研究から－」, 生体の科学. 54,

160-165 (2003)

5) 牛木辰男「顕微鏡テクノロジー」, Bio テクノロジージャーナル 5, 328-332 (2005)

6) 牛木辰男、星治「走査型プローブ顕微鏡の生物学応用」, Electrochemistry 73, 838-842 (2005)

7) 牛木辰男、星治「走査型プローブ顕微鏡による生体構造機能イメージング」応用物理, 74, 1563-1568 (2005)

国外誌

1) T. Ushiki, O. Hoshi, K. Iwai, and E. Kusumi: Atomic force microscopy of human chromosomes. In: (ed. K. Fukui

and Z. Xin) Advances in chromosome sciences. Vol. 1. -Chromosome sciences in the new millennium. China

Agricultural Science and Technology Press, China, 2002 (pp. 60-62)

2) O. Hoshi, K. Iwai and T. Ushiki : G-banded human chromosomes observed by atomic force microscopy. In: (ed. K.

Fukui and Z. Xin) Advances in chromosome sciences. Vol. 1. -Chromosome sciences in the new millennium. China

Agricultural Science and Technology Press, China, 2002 (pp. 181-182)

3) T. Ushiki: Atomic force microscopy for imaging living organisms: from DNA to cell motion. In: (ed. by H. Fujita)

Micromachines as tools for nanotechnology. Springer, Berlin, 2003 (pp.121-130)

61



書籍出版

1) 「Chromosome Nanoscience and Technology」, K. Fukui and T. Ushiki,Taylor and Francis. 2006 (出版予定)

4. 口頭発表

招待講演

1) 牛木辰男：「原子間力顕微鏡による生体微細構造の三次元イメージング」, 第 54 回日本細胞生物学会、岐阜,

2001.5.31

2) T. Ushiki: 「Comparison of scanning probe microscopy with scanning electron microscopy in the biological fields」,

Ecole d’ete de “Microscopie Electronique a Balayage et Microanalyses, Monpellier, 2001.7.2

3) 牛木辰男：「原子間力顕微鏡の上手な使い方と試料作製法」、第 33 回日本臨床電子顕微鏡学会総会・講演会、

長崎, 2001.9.26

4) T. Ushiki: 「Atomic force microscopy of human chromosomes」, The 1st Asian chromosome colloquium, Beijing,

2001.9.28

5) 牛木辰男：「SPM の生物試料への応用」, 応用物理学会第 49 回春季応用物理学関係連合講演会、2002.3.27

6) T. Ushiki, O. Hoshi, and K. Iwai: 「Combination of scanning electron microscopy and atomic force microscopy as

a new approach to the three-dimensional analysis of the human chromosome.」, XVII International symposium on

morphological sciences, Timisoara, Rumania, 2002.9.9

7) T. Ushiki: 「Atomic force microscopy as a tool for bio-medical research」, The 2nd China-Japan seminar on atomic

level characterization. Guillin, Chaina, 2002. 11.3

8) 牛木辰男：「走査プローブ顕微鏡による細胞・染色体解析」, 第２回日本再生医療学会、神戸、2003.3.11

9) T. Ushiki: 「Scanning probe microscopy in the biomedical field. (opening lecture)」, 5th Internatinal Malpighi

Symposium, Rome, Italy, 2003. 9.10

10) 牛木辰男：「ポストゲノムと走査プローブ顕微鏡観察-生体試料の構造・機能・物性解析-」, 日本電子顕微鏡学会

第 28 回関東支部講演会、東京, 2004.3.12

11) T. Ushiki: 「Scanning probe microscopy in biology.」 2004 International symposium on organic and inorganic

electronic materials and related nanotechnologies. Niigata, Japan, 2004.6.2

12) T. Ushiki, O. Hoshi, D. Fukushi and E. Kimura: 「Structure of human metaphase chromosomes observed by

atomic force microsopy.」 16th International congress of IFAA. Kyoto, Japan, 2004.8.22

13) 牛木辰男：「原子間力顕微鏡の生物学応用」, 秋季第 65 回日本応用物理学会、仙台, 2004.9.1

14) O. Hoshi, D. Fukushi, E. Kimura and T. Ushiki: 「Chromosome Imaging by atomic force microscopy in liquid.」

International symposium “Nano and visual biology of chromosome dynamics”. Kyoto, Japan, 2004.10.16

15) 牛木辰男：「生物分野における走査プローブ顕微鏡」, 第 1 回可視化技術ワークショップ、NPO 綜合画像研究支

援、東京、2005.2.19

16) T. Ushiki: 「Cathodoluminescence imaging and near field optical imaging in biology.」 ⅩⅧ International

Symposium on Morphological Sciences, Beograde, Serbia, 2005, 6.4

17) 牛木辰男：「走査プローブ顕微鏡の生物応用」、プローブ顕微鏡セミナー、東京 2005.6

18) 牛木辰男：「走査プローブ顕微鏡によるヒト染色体の高次構造解析」。日本遺伝学会第７７回大会、東京,

2005.9.28

19) T. Ushiki: 「Scanning near-field optical/ atomic force microscopy in biology.」 The 5th Asia-Pacific Conference

on Near-Field Optics. Niigata, Japan, 2005. 11.15

62



20) 牛木辰男：「走査プローブ顕微鏡による生体イメージング」。第 3 回文部科学省分野横断スクール「ナノバイオスク

ール：生細胞を観る」、東京, 2006.1

21) T. Ushiki and O. Hoshi: 「Atomic Force Microscopy of Human Chromosomes」, The third China-Japan joint

seminar on atomic level characterization. Xhiamen, China, 2006.3.6

22) T. Ushiki and O. Hoshi: 「Atomic Force Microscopy of Human Chromosomes」, Chromosome Research at the

Nano-Era 2006, Tokyo, Japan, 2006.3.9

23) 牛木辰男、星治：「染色体の高次構造解析と走査プローブ顕微鏡」。応用物理学会、東京, 2006.3.25


1) T. Ushiki: 「Chromosome Research and nanodevices」, International symposium on chromosome research at the

nano-era. Niigata, 2002.10.9

2) O. Hoshi, R. Owen, M. Miles and T. Ushiki: 「Structure of human metaphase chromosomes observed by atomic

force microscopy in liquid environments.」 16th International congress of IFAA. Kyoto, Japan, 2004. 8. 22

3) H. Miyashita, D. Fukushi, E. Kimura, O. Hoshi and T. Ushiki: 「The structure of the CHO chromosomes

observed by atomic force microscopy.」 16th International congress of IFAA. Kyoto, Japan, 2004. 8.22

4) D. Fukushi and T. Ushiki: 「High-resolution analysis of C-banded human chromosomes by atomic force

microscopy.」 16th International congress of IFAA. Kyoto, Japan, 2004. 8.22

5) E. Kimura and T. Ushiki: 「The distribution of topoisomerase IIa in human metaphase chromosomes.」 16th

International congress of IFAA. Kyoto, Japan, 2004. 8.22

6) E. Kimura, O. Hoshi and T. Ushiki: 「Application of scanning near field optical/ atomic force microscopy to the

observation of human metaphase chromosome.」 The 15th International chromosome conference, London UK,

2004.9.4

7) O. Hoshi, R. Owen, M. Miles and T. Ushiki: 「Imaging of the human metaphase chromosomes by atomic force

microscopy in liquid.」 The 15th International chromosome conference, London UK, 2004.9.4

8) 福士大輔、牛木辰男：「Cバンド法を用いたヒト染色体の原子間力顕微鏡による高分解能観察」。日本染色体学会

2004 年度年会、岡山, 2004.11.2

9) 牛木辰男：「SPM の生物応用」。日本顕微鏡学会 SPM 分科会 H16 年度研究会、東京, 2004.11.11

10) D. Fukushi, O. Hoshi and T. Ushiki: 「Analysis the human chromosome structure during cell division by atomic

force microscopy.」 The first International Cytogenetic and Genome Society congress, Spain, 2005.7.12

11) 星治、牛木辰男：「原子間力顕微鏡によるヒト染色体の液中構造解析」。日本電子顕微鏡学会第６１回学術講演

会、つくば, 2005. 6.1

12) 福士大輔、星治、牛木辰男「細胞分裂における染色体の微細構造変化についての原子間力顕微鏡による観察。

日本染色体学会 2005 年度年会、弘前, 2005.10.9

13) 繁野雅次、牛木辰男、星治：「走査型プローブ顕微鏡による未固定染色体の液中観察」。応用物理学会、東京,

3.25

14) 牛木辰男、星治：「走査プローブ顕微鏡と形態科学」。第 111 回日本解剖学会総会・全国学術集会、北里大学

2006.3.29

15) 星治、小松原奈英、牛木辰男：「単離ヒト染色体の液中原子間力顕微鏡解析」。第 111 回日本解剖学会総会・全

国学術集会、北里大学 2006.3.29


1) 平成17年12月7日,「画像処理法、画像処理装置および画像処理プログラムを記録した記録媒体」, 松戸隆之、

63



赤澤宏平、牛木辰男, 特願 2005-3130 号（国際出願番号：PCT/JP2005/22459）

顕微鏡画像のノイズ除去アルゴリズムの改良

6. 受賞等

1) 牛木辰男：平成 16 年度新潟日報文化賞（学術部門）。（受賞理由「顕微鏡の先端技術を用いた生体立体構造

の研究」）

2) 牛木辰男：第 15 回国際染色体学会（ICCXV）学会賞ノミネート、平成 16 年 9 月

3) 牛木辰男：2006 年日本顕微鏡学会学会賞（瀬藤賞）。（「走査プローブ顕微鏡法の開発と新たな生体構造解析

分野への応用研究」に対して受賞）,2006.5.20

64





2.1.2. 染色体の物理的特性の解析

担当機関名研究室名北海道大学大学院理学研究科生物科学専攻

研究者名川端和重

■ 要旨

未固定のヒト染色体について、走査型プローブ顕微鏡（SPM）を用いて薄膜におけるフォースマッピング法により形状と弾

性分布を測定した。染色体の高さと硬さには微細な凹凸がある。高さ変化は周期的であり、高い部分は柔らかく、低い部分

は硬く形態と弾性率分布に対応が見られる。また、高さだけでなく弾性率にも周期的な変化（約１mm・のドメイン構造）が存

在した。また染色体を生体環境に近いHexylene Glycol Buffer においてマイクロマニュピュレーターを用いて牽引を行い、

伸張の様子を位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡、SPMをもちいて観察した。伸張に従って、染色体は弾性変形した後に、

解けて糸状になった。弾性変形領域では、染色体中でバンド状に存在するDNA密度の低い領域が大きく変形し、さらに糸

状への乖離を示した。乖離した糸の微細構造をSPMによって観察すると、200nm程度の太さを持ちクロマチンより高次の構

造を持つことを見出した。

■ 目的

本研究プロジェクトでは、細胞分裂時に強く凝縮する染色体の力学的な諸特性の解析から、染色体の高次構造と力学

的特性との連関を探る。担当分野では、高次構造を変化させる種々の環境を制御することで得られた結果と力学構造を対

比することで、染色体を構成する諸成分の凝縮能を探って、統一的に染色体の構造を解明することが目的である。

まず、モデル系として大きい染色体を有するイモリの染色体を用いて、マニュピュレーターや蛍光顕微鏡・原子間力顕微

鏡を組み合わせ、生体を模擬した環境における染色体の弾性率分布、引き裂き力等の力学的特性を測定する弾性率分

布測定システムを確立する。また、外力の印加に対する染色体の構造変化（局所的伸び、バンド構造など）との相関等に

拠って力学構造の測定法を確立する。そして、これらの技術をヒトなどのほ乳類染色体について適用し、弾性率分布およ

び力学的牽引による構造変化を測定して、分裂期におけるヒト染色体の高次凝集構造の性質を明らかにする。後に、未

固定ヒト染色体において、牽引力に対する伸び依存性を明らかにして、ヒト染色体の高次凝集構造の起源をを力学的観点

から明らかにする。

■ 目標

① 染色体の弾性率分析測定システムを構築

② 張力を印加した染色体の微細構造評価


1. 力学ＳＰＭを用いて、生体環境に近い培養溶液中におけるヒト染色体について、厚みを取り入れた弾性率の定量的

解析法が適用可能であることを確認し、染色体の弾性率分布の測定・解析法を確立した。SPM を用いた弾性率分布

の測定から約１μm の大きさのやわらかいドメインがヒト染色体に存在することを見出した。

2. 生体環境に近い Hexylene Glycol Buffer において未固定のヒト染色体をマイクロマニュピュレーターを用いて牽引す

ると、染色体は弾性変形した後に解けて糸状になった。弾性変形領域では、染色体中でバンド状に存在する DNA 密

度の低い領域が大きく変形し、さらに糸状への乖離を示した。SPM 観察により、乖離した糸は 200nm 程度の幅を持ち

クロマチンより高次の構造を持つことを発見した。

65



■ 研究方法

１）ヒト染色体

本研究には、主に白血病 B 細胞から抽出し、固定を行っていない染色体を用いた。Hexylene Glycol Buffer、1.0M

hexykene glycol (2-methyl-2,4-pentanediol)、0.5mM CaCl2、0.1mM PIPES, pH6.5。この試料は未固定であるということから

非常に生体中に近い状態であるといえる。これらの試料は新潟大学医学部医歯学総合研究科の牛木グループより提供を

受けた。未固定の試料に変化が見られない期間は 1 週間程度であることから、試料の変性を避けるために、採取後 1 週間

以内に実験を行うようにした。未固定染色体の場合、染色体はばらばらに単離しているので、溶液のままカバーガラス上に

展開した。ただし、莢雑物と染色体の見分けが難しいため、蛍光顕微鏡をもちいて、判別を行った。展開した溶液に DNA

を染めることができる DAPI 溶液を加え、UV 光を照射することにより単離している染色体を探し、その中で莢雑物が付着し

ていないものをもちいて実験を行った。

２）走査型プローブ顕微鏡(SPM)1-2,4-11)

スライドガラス上に展開された染色体の形状と硬さを測定する方法として走査型プローブ顕微鏡(SII,SPI4000,SPA400)を用

いた。スキャナには大操作エリアが 100μｍϒのものを用い、カンチレバーのバネ定数は 0.5N/m のものを用いた。試料の

高さと硬さの同時測定を行う方法としてフォースマッピング法を用いた[4]。フォースマッピング法とはフォースカーブと呼ば

れる試料へのカンチレバーの押し込み量とカンチレバーに発生する力の関係を示す曲線を試料の測定領域(64×

64pixels)の各部分で測定した。得られたフォースカーブを弾性接触のモデルである Hertz モデル[5]を用いてフィッティング

し、各部分の局所弾性率を求める。さらに各部分の局所弾性率を再び画像化することにより、染色体上の弾性率の空間分

布を調べた。

３）マイクロマニュピュレーターによる染色体牽引

マイクロマニュピュレーター（Sutter,MP-285）は高い分解能を持つステップモーター駆動の 3 次元微動操作装置である。ガ

ラスキャピラリーを用いて、試料の特定の位置に正確にトラップさせ、物質の注入・抽出を可能にすることができる。本研究

では、倒立顕微鏡(Nikon,TE2000-U) 下にマイクロマニュピュレーターを付属させ、ガラスキャピラリーにより液中環境での

染色体の直接伸張を試み、その動画を CCD カメラでパソコンに取り込んだ。その概略図を図１に示す。

倒立顕微鏡には 10 倍の接眼レンズ、100 倍の位相差の対物レンズを使用し、マイクロマニュピュレーターには先端径約 1

μm に加工したガラスキャピラリーを両端に接続した。また、本研究で用いたマイクロマニュピュレーターは大 1.4 μm、

小 40 nm 単位で操作することが可能である。溶液の吸引・排出にはスクリューマイクロシリンジを使用した。マイクロマニュ

ピュレーターに接続したガラスキャピラーはマイクロピペット・プラー（微小電極作成装置）を使用して作成した。本研究では、

先端径が約 1 μm で先端にいたる形ができるだけ細長くなるようにした。加工前のガラスキャピラリーは外径が 1 mm、内径

が 0.5 mm のものを使用した。

牽引方法としては、まず片側のキャピラリーで染色体を押さえ、基盤との摩擦を避けるために、もう一方のキャピラリーで培

養液中で染色体を引っ掛け、少し持ち上げた後、一定速度(2 μm/s)で牽引した。牽引方法を模式図で表したものが図２で

ある。

■ 研究成果

１）染色体の弾性率分布 3)

バネ定数 0.5N/m のカンチレバーを使用し、走査型プローブ顕微鏡でフォースマッピング法を用いて蒸留水を滴下した染

色体の高さと硬さを測定したものを図３に示す。染色体の形状には微細な凹凸があり、硬さ像にも同様の分布が現れてい

る。染色体の高さと硬さの腕軸方向の空間分布をしめす。（図３(a2)）高さ変化は周期的であり、高い部分は柔らかく、低い

部分は硬く形態と弾性分布に対応が見られる。また、高さだけでなく弾性率にも周期的な変化（ドメイン構造）が存在し（図

４）、これは凝集構造の違いに基づくと考えられる。

２）張力を印加した染色体の微細構造評価

66



マイクロマニュピュレーターを用いて、一定速度(2 μm/s)で染色体を牽引した。その結果を図５に示す。染色体を牽引する

と 8.9～13.9 秒後までは伸長量が小さく、弾性的に伸長していることが確認できた。ここまでは生体物質として予想されたと

おりの挙動であった。しかしながら、さらに牽引した 14.9 秒後では細い糸状にほどけることがわかった。これは染色体が染

色体を構成する繊維に解けたものと考えられる。このときのキャピラリー間の距離を染色体の伸長の長さとして時間に対し

てプロットしたものを図 6 に示す。伸長量の小さい弾性的な伸長領域では、ゆっくりと染色体が伸びていくことがわかる。し

かし、その領域を超えると伸長は大きくなり、急激な伸長を示し、そのときの画像から染色体がより細い糸状に解けることが

わかった。

次に、牽引前の染色体、弾性的な伸長、糸状に解ける現象について、それぞれ解析する。位相差顕微鏡でカバーガラ

ス上に展開した染色体を観察したところ、その腕方向にバンド状の明暗が観察された。そのバンドの様子またバンドが現れ

る周期を示したものが図 7 である。このことから 0.3～1 μm 周期で明暗のバンド構造をとっていることがわかる。染色体を

DAPI 染色すると、このバンド構造に対応した蛍光強度の強弱が観測できた。これにより、位相差顕微鏡像におけるコントラ

ストは、DNA の濃度分布を反映しているといえる。さらに、SPM 観測で得られた硬さ分布におけるドメイン構造の周期 0.3～

1 μm と類似することから、位相差像で見られる明暗は硬さにおけるバンド構造とも対応していると考えられる。つまり、位相

差像における明暗はクロマチン繊維の凝集の強さを反映している。

次に、弾性的な伸長において先述したバンド構造がどのように変化するかを観察した。図７をみると暗領域はほとんど変

化せず、明領域が大きく伸長していることがわかる。このように弾性的な伸長では明領域が暗領域に対し、2～3 倍大きく伸

長することがわかった。また糸状化は明領域でおこることもわかった。これらは明領域と暗領域でクロマチン繊維の凝集構

造もしくは密度が異なることを示唆している。

糸状に解けたときの伸長の様子及び伸長の時間変化を図６に示す。緑の丸の部分で糸状化がおこっている。糸状化が

おこると、急激に 2 μm 程度伸長し、その後いったん止まるという挙動を示すことがわかる。これは何らかの結合が解け、留

められていた領域(2 μm 程度)が一気に伸びたものと考えられる。また乖離するときの大引張り力を見積もると、１～２μN

であることがわかった。

この糸がどのような形状をしているかをみるために、糸状化後の染色体を乾燥させ SPM で観察した。染色体は図 8 にある

ような糸状化の状態である。そのＳＰＭ像が図９である。図をみると、糸は 200nm の太さを持つ繊維状のもので表面に 50～

100nm 程度の球状の構造が連なることがわかる。この球状の構造は形態から判断してＳＥＭや高分解ＳＰＭによって観察さ

れた、染色体表面の球状構造と同一のものであると考えられる。この球状の構造はクロマチン繊維の太さに比べて非常に

大きいので、染色体を形成する場合にクロマチン繊維がさらに大きい高次構造を形成していることを示している。

67



図１マイクロマニュピュレーターの概略図図２牽引方法

(a1) (a2) (a2)

557 nm 821102.62 kPa 103.99

図 3 （a1）形状像、（a2）硬さ像走査領域は 12μｍ

0 1000 2000 3000 4000 5000

0

100

200

300

400

hgt

高さ

[nm

]

距離[nm]

0

200

400

600

800

1000

1200

硬さ

[kPa]

yng

-1000100200300400500600700800

0

2

4

6

8

F[n

N]

距離[nm]

図 4 （a）フォースカーブ（b）図 3 における直線部分の高さと硬さ依存性

68



■ 考察

生体環境に近い Hexylene Glycol Buffer において１本の未固定のヒト染色体をマイクロマニュピュレーターを用いて牽引す

ると、伸張に従って、染色体は弾性変形した後に、解けて糸状になった。弾性変形領域では、染色体中でバンド状に存在

する DNA 密度の低い領域が大きく変形し、さらに糸状への乖離を示した。SPM 観察により、乖離した糸は 200nm 程度の幅

を持ちクロマチンより高次の構造を持つことを発見した。力学ＳＰＭを用いてヒト染色体の弾性率分布を測定した結果、約１

図 5 牽引による染色体

変

図 6 糸状化の伸長の様子

図７染色体の不均一な伸長

69



μmφの大きさのやわらかいドメイン(バンド)が存在することを見出した。これは、DNA 密度の低い領域に対応する。これらの

構造から、染色体の凝集はクロマチンを 50nmφの粒状に凝集させその粒が 200nm 程度の繊維に凝集させ、それを約１μm

程度のドメイン（バンド）にして、染色体を形成するという階層的な凝集があることを示唆している。


本研究により見出した階層構造（５０nm の粒状構造、２００nm の繊維構造、１μｍのバンド構造をつくりだす要因について、

topoII 等の関連タンパクの局在性との対比、凝集力からみた凝集構造を明らかにする。


[1] Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, James D.Watoson: Molecular Biology of THE

CELL Third Edition

[2] M.P.F.Marsden and U.K.Laemmli. Metaphase Chromosome Structure: Evidence for a Radial Loop Model.,

Cell. ,17: 849-858（1979）.

[3] Michael G. Poirier, Ajay Nemani, Prateek Gupta, Sertac Eroglu, and John F.Marko: Probing Chromosome

Structure with Dynamic Force Relaxation, Physical Review Letters. 86, 360-363 （2001）

[4] M. Radmacher, M.Fritz, C.M. Kacher, J.P. Cleveland, P.K. Hansma: Measuring the viscoelastic properties of

human platelets with the atomic force microscope, Biophys. J. 70: 556-576（1996）.

[5] Hertz: Ueber die berührung fester elastischer Körper. J.Reine Angew. Mathematik. 92: 156-171（1881）.

[6] G. Holmquist, M. Gray, T. Porter and J. Jordan: Cell, 31, 121-129(1982).

■ 関連特許

該当なし

70



■ 成果の発表（本振興調整費による成果に限り記入してください）


1. 原著論文による発表（査読付き）１１報（筆頭著者：１報、共著者：１０報）

2. 原著論文による発表（査読なし）０報








1) K. Kato, Y. Ohmori, T. Mizutani, H. Haga, K. Ohashi, T. Ito and K. Kawabata:The Role of Actin-Binding Protein

Filamin A in Cellular Stiffness and Morphology Studied by Wide-Range Scanning Probe Microscopy,Jpn. J. Appl.

Phys., 45,2328-2332(2006).

2) T. Mizutani, H. Haga, K. Kato, K. Matsuda and K. Kawabata:Observation of Stiffer Domain Structure on

Collagen Gels Using Wide-Range Scanning Probe Microscopy, Jpn. J. Appl. Phys. ,45,2353-2356(2006).

3) K. Nomura, O. Hoshi, D. Fukushi, T. Ushiki, H. Haga, and K. Kawabata: "Visualization of Elasticity

Distribution of Single Human Chromosomes by Scanning Probe Microscopy", Jpn. J. Appl. Phys., 44,

5421-5424 (2005).

4) H. Haga, C. Irahara, R. Kobayashi, T. Nakagaki, and K. Kawabata: "Collective Movement of Epithelial Cells on a

Collagen Gel Substrate", Biophys. J., 88, 2250-2256 (2005).

5) S. Toko, T. Mizutani, H. Haga, and K. Kawabata: "Spatiotemporal Variation in Cellular Stiffness

Corresponding to Development of Morphological Polarity", Jpn. J. Appl. Phys., 44, 5451-5454 (2005).

6) T. Nitta, H. Kato, H. Haga, K. Nemoto, and K. Kawabata: "Static Friction of Agar Gels: Formation of

Contact Junctions at Frictional Interface", J. Phys. Soc. Jpn., 74, 2875-2879 (2005).

7) T. Mizutani, H. Haga, K. Nemoto, and K. Kawabata: "Wide-Range Scanning Probe Microscopy for

Visualizing Biomaterials in a Sub-Millimeter Range", Jpn. J. Appl. Phys., 43, 4525-4528 (2004).

8) M. Nagayama, H. Haga, M. Takahashi, T. Saitoh, and K. Kawabata: "Contribution of Cellular

Contractility to Spatial and Temporal Variations in Cellular Stiffness", Exp. Cell Res., 300, 396-405

(2004).

9) T. Mizutani, H. Haga, and K. Kawabata: "Cellular Stiffness Response to External Deformation: Tensional

Homeostasis in a Single Fibroblast", Cell Motil. Cytoskeleton, 52, 242-248 (2004).

10) T. Nitta, Y. Endo, H. Haga, and K. Kawabata: "Microdomain Structure of Agar Gels Observed by

Mechanical-Scanning Probe Microscopy", J. Electron. Microsc., 52, 277-281 (2003).

11) K. Kawabata, Y. Sado, M. Nagayama, T. Nitta, K. Nemoto, Y. Koyama, and H. Haga: "Visualization of

Dynamic Organization of Cytoskeleton Gels in Living Cells by Hybrid-SPM", Chinese J. Polym. Sci., 21,

169-174 (2003).


71



該当なし



1)永山昌史、芳賀永、田中芳雄、平井義彦、川端和重：『細胞のマイクロ粘弾性解析』電子顕微鏡、38(2)、

90-93 (2003)

2)水谷武臣、芳賀永、川端和重：「広域走査型プローブ顕微鏡の開発と細胞生物学への応用生物物理、45(2),

105-108 (2005)3) 新田高洋、川端和重：「ゲルの滑り摩擦：接触領域形成の直接観察」固体物理、

(2006)41,37-44.

国外誌

該当なし

書籍出版

1)水谷武臣、川端和重:「細胞バイオメカニクス」バイオ・ナノテク森北出版 2006。印刷中

4. 口頭発表

招待講演

1) K. Kawabata:"Mechanical Domain Structure of Single Human Chromosome"6the International Symposium on

Chromosome Research at the Nano-Era 2006, Tokyo (Japan), 2006.

2) K. Kawabata:"Static Friction of Agar Gels"International Tribology Conference, Kobe (Japan), 2005.

3) K. Kawabata:"Dynamical properties of living cells measured by SPM"16th Intl. Cong. of International Federation of

Associations of Anatomists, Kyoto (Japan), 2004.

4) K. Kawabata:"Dynamic Properties of a Single Living Cell"2nd Symposium on Physics of Self Organized System, Tokyo

(Japan), 2004

5) 川端和重、芳賀永、水谷武臣：『細胞運動におけるバイオトライボロジー』日本トライボロジー学会第 48 期通常総

会（2004 年 5 月東京機械振興会館）

6) 芳賀永、川端和重：『力学走査型プローブ顕微鏡の開発と細胞運動への応用』第 1 回バイオロジーナノ計測研究会

（2004 年 4 月東京東大生産研）

7) 川端和重、芳賀永：『細胞のダイナミクスと集団運動』京都大学基礎物理学研究所ソフトマター研究会 2004 （2004

年 7 月京都京都大学）

8) 川端和重、水谷武臣、芳賀永：『ナノテクノロジーを用いた細胞レベルの機能解明：細胞力学系のダイナミクス』

第 53 回高分子討論会（2004 年 9 月札幌北大）

9) 川端和重：『細胞を小さい針でつついてみたら・・・・・・・！』北海道新聞社市民キャンパス（2004 年 11 月札幌北海

道新聞社）

10) 川端和重：『細胞系の階層的ダイナミクス』21世紀COE「特異性から見た非線形構造の数学」シンポジウム（2005年

1 月札幌北大）

11) 川端和重：『プローブ顕微鏡の新展開に向けて：現状と未来「生物材料を測る」』第 65 回日本応用物理学会学術講演

会（2005 年 3 月さいたま埼玉大学）

12) 芳賀永、永山昌史、高橋正行、川端和重：『ナノ力学 SPM を用いた細胞運動に伴うかたさ分布の時間変化測定』

日本機械学会バイオエンジニアリング部門講演会（2003 年吹田大阪大学）

72



13) 芳賀永、水谷武臣、川端和重：『力学プローブ顕微鏡を用いた外力に対する生きた細胞のかたさ応答』日本電子

顕微鏡学会学術講演会（2003 年札幌札幌コンベンションセンター）

14) 芳賀永、永山昌史、水谷武臣、川端和重：『細胞内外に働く張力により協調される細胞運動の機構』日本動物細

胞工学シンポジウム（2003 年吹田大阪大学）

15) 川端和重、水谷武臣、芳賀永：『細胞の外的刺激に対する動力学的応答』第 2 回重力生物学懇話会（2003 年筑

波宇宙開発事業団筑波本社）

16) 加藤秀章、新田高洋、芳賀永、川端和重：『高分子ゲルの静止摩擦の待機時間効果：真実接触領域の直接観

察』京都大学基礎物理学研究所研究会（2003 年京都京都大学）


1) T. Mizutani, K. Tamura, H. Haga, and K. Kawabata:"Cellular Stiffness Response to Sequential External

Deformations in a Single Fibroblast"International Biological Congress, Montpellier (France), 2005.

2) H. Haga, K. Hayashi, and K. Kawabata:"Spatial Organization in Collective Movement of Epithelial Cells on a

Collagen Gel Substrate"American Society for Cell Biology 45th Annual Meeting, San Francisco (USA), 2005.

3) K. Kato, H. Haga, K. Ohashi, T. Ito, and K. Kawabata:"Contribution of Actin-Binding Protein Filamin A to the

Process of Stress Fiber Formation in Nonmuscle Cells"American Society for Cell Biology 45th Annual Meeting,

San Francisco (USA), 2005.

4) K. Kato, Y. Ohmori, H. Haga, K. Ohashi, T. Ito, T.P. Stossel, and K. Kawabata:"The Role of Actin-Binding Protein

Filamin A in Cellular Stiffness and Morphology Studied by Wide-Range SPM"13th International Conference on

Scanning Probe Microscopy, Sapporo (Japan), 2005.

5) T. Mizutani, H. Haga, K. Kato, and K. Kawabata:"Spatial Distribution of Stiffness on Biomaterial Gels Measured by

Wide-Range Scanning Probe Microscopy"13th International Conference on Scanning Probe Microscopy, Sapporo

(Japan), 2005.

6) T. Mizutani, H. Haga, and K. Kawabata:"Temporal and Spatial Change in Distribution of Stiffness of Epithelial Cells

Exposed to Mechanical Stress Measured by SPM"First International Conference on Mechanics of Biomaterials and

Tissues, Hawai'i (USA), 2005.

7) K. Tamura, T. Mizutani, H. Haga, and K. Kawabata:"Cellular Stiffness Response to Sequential External

Deformations in a Single Fibroblast Measured by SPM"The 4th International Symposium on Surface Science and

Nanotechnology, Omiya (Japan), 2005.

8) K. Kawabata, K. Nomura, H. Haga, O. Hoshi, D. Fukushi, and T. Ushiki:"Domain Like Structure of

Human-Chromosome Observed by Mechanical Scanning Probe Microscopy"American Society for Cell Biology

44th Annual Meeting, Washington DC (USA), 2004.

9) H. Haga, K. Hayashi, and K. Kawabata:"Collective and Unidirectional Movement of Epithelial Cells on a Collagen

Gel Substrate"American Society for Cell Biology 44th Annual Meeting, Washington DC (USA), 2004.

10) T. Mizutani, H. Haga, M. Takahashi, and K. Kawabata:"Tensional Homeostasis of a Single Fibroblast Regulated by

Phosphorylation of the Myosin Regulatory Light Chain"American Society for Cell Biology 44th Annual Meeting,

Washington DC (USA), 2004.

11) S. Toko, T. Mizutani, H. Haga, and K. Kawabata:"Spatio-Temporal Variations of Cellular Stiffness with

Development of Polarity in Fibroblasts"12th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy, Atagawa

(Japan), 2004.

12) K. Nomura, O. Hoshi, D. Hukushi, T. Ushiki, H. Haga, and K.Kawabata:"Domain Like Structure of A Human

Chromosome Observed in Elasticity Distribution from Mechanical-SPM"12th International Colloquium on

Scanning Probe Microscopy, Atagawa (Japan), 2004.

73



13) H. Haga, C. Irahara, R. Kobayashi, T. Nakagaki, and K. Kawabata:"Collective Movement of Epithelial Cells on

Collagen Gel Substrate"Biophysical Society 2005 Annual Meeting, Long Beach, CA (USA), 2005.

14) T. Mizutani, Y. Ohmori, H. Haga, and K. Kawabata:"Wide Range Scanning Probe Microscope for Visualization of

Biomaterials on Sub-millimeter Range"11th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy, Atagawa

(Japan), 2003.

15) M. Nagayama, H. Haga, M. Takahashi, and K. Kawabata:"Correlation of Contractility Driving Cellular Migration

with Stiffness Imaged with Mechanical Force Microscopy"ASCB 43nd Annual Meeting, San Francisco (USA), 2003.

16) H. Haga, T. Irahara, and K. Kawabata:"One Directional Collective Movement of Epithelial Cells Induced by

Rearrangement of Collagen Gel Fiber"ASCB 43nd Annual Meeting, San Francisco (USA), 2003.

17) T. Mizutani H. Haga, and K. Kawabata:"Mechanical Response of Fibroblast Cell to External Stress"ASCB 43nd

Annual Meeting, San Francisco (USA), 2003.


該当なし

6. 受賞等

1) 川端和重他：Journal of Physical Society of Japan 注目論文賞 2005.11.1

74





2.1.3. クロマチンファイバーの生化学的再構成

担当機関名研究室名京都大学大学院生命科学研究科分子情報解析学分野

研究者名竹安邦夫

■ 要旨

染色体構造構築原理を理解することをめざし、試験管内でクロマチン高次構造を再構築し、ＡＦＭによる可視化解析を

行なった。第 I 期は、（１）一分子の DNA 上に数百個のヌクレオソームが形成される実験系を開発し、（２）そのクロマチンフ

ァイバーの構造解析からヌクレオソームの持つ物理的性質を解析した。また、（３）細胞分裂期の染色体凝縮や姉妹染色体

間の接着に必須なタンパク質複合体であるコンデンシンやコヒーシン複合体をクロマチン再構成系に加える実験を行なっ

た。さらに、第Ⅱ期に入り、より高次な染色体構造の生化学的完全再構成系を目指した。(４)第 I 期に開発したクロマチン再

構成系にリンカーヒストンを加えることで、高次ファイバーを形成させることに成功した。また、(５)転写調節因子ＰＣ４タンパ

ク質が、コアヒストンとの結合を介してヌクレオソームを凝集させる活性があることを示した。更に、(６)染色体スキャホールド

の構成成分であるトポＩＩが、ヒストンＨ１存在下でのみ、クロマチンを凝縮させることを示した。

■ 目的

ゲノム DNA は生命活動のサイクルにあわせた複製や転写の活性を制御しており、それに応じてその姿を大きく変化させ

る。一般に、構造が緩む方向に働くことで転写や複製が活発になることが知られており、転写活性が低い染色体領域であ

るヘテロクロマチンは転写活性の高いユークロマチンよりも構造がタイトである。また、二つの娘細胞に均等に遺伝子を分

配するためには染色体構造が分裂期特有の高度な凝縮をすることが必須であることが知られている。われわれは、このよう

な染色体構造の変化を伴う遺伝子機能の現場を捉えることを目的とし、走査型プローブ顕微鏡による構造解析と生化学

的・細胞生物学的手段を用いた解析を組み合わせたアプローチを行なった。ミクロ的にはそこで働くタンパク質の分子機能

の解明を、マクロ的には染色体構造の変化機序を捉えることを目指した。第 I 期は、真核生物のゲノム構造の小単位は

DNA がヒストンに巻き付くことで出来るヌクレオソーム／クロマチンファイバーであり、ゲノム機能は裸の DNA 上ではなくクロ

マチン上で起こっていることをふまえ、（i）試験管内でこのクロマチンファイバーを人工的に再構成し、更に、（ii）ヘテロクロ

マチン様構造を形成させることを目標とした。さらに、第Ⅱ期に入り、より高次な染色体構造の生化学的完全再構成系を目

指した。ヌクレオソームのビーズ構造はらせん状に密に詰められファイバー状構造を形成すると考えられている。しかし、細

胞から精製した核内構造の微細観察ではそのファイバー構造が確認されているものの、DNA とヒストン分子とからスタートし

た再構成系では未だその構造は構築されてはおらず、そのファイバーの性質や形成機構などには不明な点が多かった。

第 II 期は、第 I 期に開発したクロマチン再構成系にリンカーヒストンを加えることで、高次ファイバーを形成させることにを目

指し、それに成功した。更に、ヒストン以外の染色体タンパク質がクロマチン構造に相互作用して形成される構造を明らか

にすることを目指した。

■ 目標

① ＤＮＡと種々のタンパク質との混合実験を行ない、ヌクレオソームファイバーが絡まって形成される 30 nm ファイバー

や 300 nm ファイバーの試験管内再構成を達成する。

② 再構成したファイバーを走査型プローブ顕微鏡で解明することで、染色体の凝縮部分と脱凝縮部分の構造の相違

を解明する。

③ 再構成ファイバーの細胞内導入を可能にする。また、細胞内に導入した再構成ファイバーを可視化し、核内での様

子を明らかにする。

75



④ 細胞分裂時の染色体を模した構造を試験管内で再構成する系を確立する。これにより、転写・複製能と染色体構造

との連関の解析を可能にする。


① に対し、

• 実験の基礎材料としての長鎖ヌクレオソームファイバーの、試験管内再構成法を確立した。これにより、100

kb の DNA 上に ~400 個のヌクレオソームを形成させることに成功した。

• 長鎖ＤＮＡへのヌクレオソーム再構成を通じて、ヌクレオソーム形成に対して、ＤＮＡの長さと負のスーパーコ

イルとが促進的に機能することを明らかにした。

• ヌクレオソーム間の距離からその間に働く相互作用の力を計算し、ヌクレオソームファイバーが凝集状態か

展開した状態かの２相性を示すことを示した。

• コアヒストンとＤＮＡとから形成されたヌクレオソームファイバーに対し、リンカーヒストンＨ１を加えることで、フ

ァイバー状構造が形成されることを示した。

② に対し、

• リンカーヒストン添加により再構成されたファイバーを走査型プローブ顕微鏡で観察した結果、塩濃度依存

的にファイバーの幅が変化することを示した。すなわち、生理的塩濃度に近い100 mM NaCl条件下では30

nm 幅であったのに対し、50 mM NaCl の低塩濃度下では 20 nm 幅となった。

• 上記のＨ１ファイバーの幅の変化が何に起因するかを調査するため、ヌクレオソームファイバーに関しても

異なる塩濃度下で観察を行なった。その結果 100 mM 塩濃度下ではヌクレオソーム同士が強く相互作用

を起こし、互いに結合していたのに対し、低塩濃度下では、ヌクレオソーム同士が結合せず拡がった様子

が観察された。すなわち、Ｈ１ファイバー幅の変化は、塩濃度に依存的なヌクレオソーム間の相互作用の強

さの変化に起因していることが示唆された。

• ヒストンのアミノ基末端部分にあるテールとよばれる部分をトリプシン消化により除去すると、ヌクレオソーム

間の相互作用が失われた。このことから、ヌクレオソーム間の相互作用にはテール部分が重要な役割を示

すことがわかった。

③ に対し、

• 再構成ファイバーの細胞内導入は達成できなかったが、再構成ファイバーとの構造比較のために、核内ク

ロマチン構造の観察を行なった。ＨｅＬａ細胞、トリの赤血球核、分裂酵母の核等について、その内部構造

を露出させ、走査型プローブ顕微鏡により観察した。

• 上記の観察結果から、それぞれの核内に、30-40 nm のファイバー構造と 80-100 nm のファイバーあるい

は顆粒状構造が存在することを明らかにした。

④ に対し、

• 細胞分裂時に部位特異的な構造を形成するテロメアについて、テロメア結合タンパク質 TRF2 とテロメア特

異的配列のＤＮＡとを混合し、その相互作用を走査型プローブ顕微鏡で観察し、テロメアＤＮＡの

3’-overhanging に TRF2 がループ構造を形成することを明らかにした。

• H1 により形成された 30 nm ファイバーよりも高度に凝縮した構造を構築することを目指し、細胞分裂期の

染色体凝縮に必須なタンパク質であるトポＩＩを再構成クロマチンに加える実験を行なった。その結果、ヒスト

ンＨ１存在下でのみトポＩＩはクロマチン凝縮を引き起こした。

• 転写活性制御に相関した染色体構造変化を解析するために、転写因子ＰＣ４を再構成ヌクレオソームファ

イバーに添加した。コアヒストンとＰＣ４の結合に依存して、ヌクレオソームが凝集を引き起こす様子が観察さ

れた。

76



■ 研究方法

(1)クロマチンの試験管内再構成

クロマチン再構成には、塩透析法と呼ばれる手法や、ヒストンシャペロンタンパク質を用いる手法、あるいは細胞抽出液を

用いる手法がある。本課題では、原子間力顕微鏡による分子イメージングを解析の手段にすることから、DNA とヒストンタン

パク質以外にタンパク質因子を必要としない塩透析法を用いた。これにより、観察されるクロマチン構造に他のタンパク質

等の凶雑物が含まれる可能性を排除できる。さらに、他の因子の助けを受けずに、DNAとヒストンタンパク質とのみから形成

された構造を解析することが出来る。この利点により、第Ｉ期に示したような、DNA の superhelicity とヌクレオソーム構造形成

効率の相関といった、染色体構造の物理的特性を明らかにすることが可能となった。さらには、今後このクロマチンに他の

染色体タンパク質を加えていくことにより、そのタンパク質因子がクロマチン構造に及ぼす影響を特定することが可能とな

る。

第 II 期に入り、クロマチン再構成系にヒストン H1 を加える実験を行なってきた。その実験方法について記す。（操作はす

べて 4℃で行った）

1) ヒストン H1 を含まないクロマチン再構成

① 精製したヒストン（0.5μg）と DNA（0.5μg）とを 50μl の Hi buffer 中で混合する。[Hi buffer] 2.0 M NaCl、10 mM

Tris-Cl[pH7.5]、1 mM EDTA、0.05% NP-40、0.1 mM PMSF、5 mM 2-mercaptoethanol

② 透析チューブに詰めて、スターラーで攪拌している 150ml の Hi buffer 中に浮かす。

③ ぺリスタポンプにより 0.46ml/min で透析液を排水しつつ、同じ速度で Low buffer を加えていく。[Low buffer] 10 mM

Tris-Cl[pH7.5]、1 mM EDTA、0.05% NP-40、0.1 mM PMSF、5 mM 2-mercaptoethanol

④ 20 時間後に 550ml の Low buffer が加わった時点で透析を終了する。このとき透析液の NaCl 濃度は 50mM となっ

ている。

⑤ 透析チューブ内からサンプルを回収し、AFM 解析に用いる。観察に際しては、10 mM Hepes [8.0], 0.3% グルタル

アルデヒド溶液で 10 倍希釈し、室温で 30 分間静置し固定を行う。

2) ヒストン H1 を 50 mM NaCl 時に加えるクロマチン再構成

①～④は、1) と同様に行なう。

⑤ 透析チューブ内からサンプルを回収し、0.1 μg のヒストン H1 を加える。

⑥ 氷上で 30 分静置する。

⑦ 10 mM Hepes [8.0], 0.3% グルタルアルデヒド溶液で 10 倍希釈し、室温で 30 分間静置し固定を行ったのち、AFM

解析に使用する。

(2) AFM 観察

AFM 装置は、Digital Instruments 社製の Nanoscope III もしくは Nanoscope IV を用いた。測定には E スキャナを用い、

タッピングモードにより像を得た。カンチレバーはオリンパス製のバネ定数 42 N/m、共振周波数 300 kHz の

OMCL-AC160TS を使用した。スキャン速度は、2.00 ～ 3.50 Hz 程度に設定した。以下のように雲母上にサンプルを準備

し、大気中観察を行なった。

1) クロマチンあるいは DNA の観察

① 雲母の新表面に 10 mM spermidine を滴下して 10 分間静置したのち、窒素ガスで液滴を吹き飛ばし、表面を乾燥さ

せる。

② ①で表面を spermidine コートした雲母上に、固定したクロマチン試料もしくは適当に希釈した DNA 試料を 10～20

μl 滴下する。

③ 15 分静置したのち、1 ml の蒸留水で雲母表面を洗浄し、窒素ガスを吹きつけ乾燥させる。

2) コアヒストンの観察

77



① 雲母の新表面に、1 ng/μl に希釈したコアヒストン試料を滴下する。希釈は 10 mM Hepes [8.0], 0.3% グルタルアル

デヒド溶液で行なう。

② 15 分静置したのち、1 ml の蒸留水で雲母表面を洗浄し、窒素ガスを吹きつけ乾燥させる。

■ 研究成果

(1) ヌクレオソームファイバー再構成 6 , 11）

第 I 期までに、当課題では、染色体の基本構

造であるヌクレオソーム構造の再構成に取り組んでき

た。特に、より高次な染色体構造の構築を実現する

ため、Large Scale なクロマチンファイバーの試験管内

形成を行うために、100 kb のプラスミドDNAを調整し、

そこにクロマチンを再構成させることに成功した。

図１a は、100 kb の再構成クロマチンの原子間

力顕微鏡像である。プラスミド DNA 上に 350~400 個

のヌクレオソーム構造が形成された。一般に、塩

透析法のクロマチン再構成では、5S RNA gene

などのヌクレオソームポジショニングシグナルを持つ DNA 上でない限り、

極めてヌクレオソームの形成効率が低いことが知られている。実際、

我々が数 kb のプラスミド上に再構成を試みた場合も、平均して

700~800 bp にひとつのヌクレオソームしか形成されなかった（図 1b）。

生体内では 200 bp にひとつのヌクレオソームが形成されていることから、

この効率は極めて低いものであるといえる。しかし、プラスミドの長さを

30 kb、50 kb、100 kb と大きくするにしたがって、ヌクレオソーム形成効

率は上昇し、100 kb の場合には、250 bp にひとつのヌクレオソームが

形成される様子が観察された（図２黒丸）。DNA が線状である場合に

はこの様な長さ依存的な形成効率の上昇は得られなかったため（図２

白丸）、ここにはプラスミドの持つ negative superhelicity が影響している

と考えられた。

特に、各長さのプラスミドについて、観察した試料の中でも多く

のヌクレオソームが形成されたものに注目すると、ヌクレオソーム形成と

スーパーコイルの相関が強く示唆された（図２黒四角）。3 kb や 5 kb

のプラスミドについては、大腸菌から調整した際にそのプラスミドが

保有する supercoil の数が、それぞれ 7 個と 12 個であると知られて

いる。これは、それぞれの長さのプラスミドに形成されたヌクレオソー

ムの数の大値とよく一致する。これまでの研究により、ヌクレオソー

ム構造がひとつ形成されると、negative supercoil がひとつ解消されることが知られている。したがって、我々が得た結果から、

negative supercoil はヌクレオソームの形成に促進的に働き、supercoil がすべて解消されるまでヌクレオソームが形成されう

るということが示唆された。DNA 長に応じてヌクレオソーム形成効率が上昇した結果から、DNA が長くなった場合、大腸菌

中でプラスミドに導入される super coil の密度が高くなることが示された。これは、DNA 鎖が長くなったことにより DNA 鎖に

flexibility が増すことに起因すると考えられる。以上のように、塩透析という DNA とコアヒストンとの親和性のみに頼った再構

成法を用いても superhelicity という物理的要因を操作することで生体内と同様の頻度でヌクレオソームが形成される現象が

見出された。

図 1 塩透析法により、（a）106 kb （b）3 kb のプラスミドに再構成したクロマチン

図 2 再構成に用いるDNAの長さと再構成さ

れるヌクレオソーム頻度の関係。DNA が線状

の場合の平均（○）と、DNA が環状の場合の

平均（●）あるいは最も密にヌクレオソーム

が形成された例（■）。

78



(２)再構成ヌクレオソームファイバーの、物理化学的な解析への応用

（１）に記したように、ヌクレオソームファイバーは DNA の物理化学的性質によりその構造を大きく変化させる。再構成に

用いた 100 kb の長鎖プラスミドをＡＦＭ観察やＤＡＰＩ染色観察した結果から、そのＤＮＡ分子が持つ熱力学的半径やＤＮ

Ａ鎖の持続長を算出した 18)。その結果、ＤＮＡの形状がそれらに影響を及ぼす結果が得られ、予想に反して環状ＤＮＡは

直鎖状ＤＮＡよりも熱力学的半径が大きいことが示された。

ヌクレオソームのＡＦＭ像解析から、ヌクレオソーム構造がＤＮＡ上を容易にスライドすること 5)や、ヌクレオソームファイバ

ーが凝集・非凝集の２相性の形状を取ること 14)も明らかにした。また、酸化ストレスによるＤＮＡの二本鎖切断をビタミンＣが

保護することを、再構成長鎖ヌクレオソームファイバーを用いた実験により明らかにした 16)。

(３) ヒストンＨ１の効果 15）

前述したように、染色体の基本構造であるヌクレオソーム構造は DNA の物理的要因によりその安定性が大きく左右さ

れることが示された。しかし、細胞内でゲノム DNA は種々のタンパク因子の助けを借りて階層構造を構築している。そこで、

より高次な染色体構造を形成させるため、コアヒストンの次に重要と思われる染色体タンパク因子であるヒストン H1 をこの実

験系に加えた。

ヌクレオソーム構造がヒストンH1の作用を受けて密に結合し合い、ファイバー構造を形成すると考えられてきた。しかし、

そのファイバー形成にいたる分子機構やそのファイバーの構造的な特性は完全な理解には程遠い。その原因として、ヌク

レオソームの集合体としてのこのファイバーの複雑な構造が、結晶化や生化学的手法による構造理解の妨げになっている

点や、このファイバー構造が細胞内から精製しない限り入手できない人工的に再現不可能な構造であるという点が、挙げら

れる。我々は、第 I 期に開発した Large Scale な再構成クロマチンを材料にすることで、このファイバーが構築できると考え実

験を行った。

図３a は、再構成したヌクレオソームファイバーにヒストンＨ１を加えた後に行なったＡＦＭ観察像である。ｂの拡大像の

ように、一定の幅を持つファイバー構造が形成されている様子が観察された。その幅を測定した結果、ｃのように 20 nm で

あった。

図３の実験結果は、50 mM NaCl の溶液中で固定した試料の観察例である。より生理的塩濃度に近い 100 mM NaCl

条件下でも観察を行なった結果が図４a,b であり、図４c のように、そのファイバーの幅は 30 nm であった。

ヌクレオソーム間の相互作用は塩濃度依存的に変化する。図５は、Ｈ１を含まない再構成ヌクレオソームファイバーを

50 mM と 100 mM の塩濃度下で観察したものである。50 mM では一つ一つのヌクレオソームがはっきり確認できるように

観察基板上に広がっていたヌクレオソームファイバーが、100 mM では凝集している様子が検出された。このような塩濃度

依存的なヌクレオソーム間の相互作用が、ファイバーの太さの変化を引き起こすものと考えられる。

図３ヒストン H1 を加えることで形成されたファイバー構造。(a)再構成クロマチン上に形成されたファイバー状構造の AFM 像。(b)

ファイバー部分の拡大像。(c)ファイバ部分の幅を測定した結果をヒストグラムにより示したもの。スケールバーは 200 nm

79



(４)ノンヒストンタンパク質の効果

ヒストン以外の染色体タンパク質がどのような分子機能を有し、構造形成に役立っているかを調査することは染色体高次

構造構築のメカニズムを理解するうえで重要である。そこで、以下の箇条書きのように、種々の染色体タンパク質やタンパ

ク質複合体と、ＤＮＡとの相互作用様式を、走査型プローブ顕微鏡観察により明らかにした。

• セントロメア領域に特異的に局在するヒストンＨ３と相同性の高いCENP-Aタンパク質が、他のコアヒストンサブユ

ニット（H2A, H2B, H4）とオクタマーを形成し、ヌクレオソーム構造を形成することを示した2）。

• 複製開始因子RepEは、プラスミドDNAに結合してDNAのトポロジーを変化させることを示した3）。

• 転写調節因子がプロモーター領域の数箇所に結合し、その結合箇所同士が相互作用することによりDNAがル

ープ状の構造を形成することを示した4）。

• 細胞分裂期の染色体凝縮に必須なコンデンシン複合体は、球状のヘッド部分と、長さ20-40 nm のテール部分

とからなる形状をしていることを示した。また、DNAと結合しその凝集を引き起こすことを示した7）。

• コンデンシン複合体が、相補的な一本鎖DNA同士を相互作用させて二本鎖DNAにするreannealing 反応を促

進する様子を可視化解析した。その結果、コンデンシンのサブユニットであるCnd1-3タンパク質が加わることで

reannealing 反応が抑制されることを明らかにした８）。

• テロメア局在タンパク質TRF2と、3’overhangingを持つテロメアDNAとが相互作用し、DNA端にループ状構造を

形成させることを示した13）。

• さらに、再構成したクロマチンと染色体タンパク質とを混合して、その構造の可視化解析を行なった。

• 姉妹染色体接着に必須なコヒーシン複合体と再構成ヌクレオソームを混合して可視化解析した結果、コヒーシ

図 4 ヒストン H1 により形成されたファイバー構造を、100 mM NaCl 存在下で観察した。(a)再構成クロマチン上に形成されたファイ

バー状構造の AFM 像。(b)ファイバー部分の拡大像。(c)ファイバ部分の幅を測定した結果をヒストグラムにより示したもの。スケー

ルバーは 200 nm

図5 再構成したヌクレオソームファイバー（H1 を含まない）を、異なる塩濃度下で観察した。(a)50 mM NaCl 条件化での再構

成ヌクレオソームファイバーの AFM 像。(b) 100 mM NaCl 条件化での再構成ヌクレオソームファイバーの AFM 像。スケール

バーは 200 nm

80



ンのサブユニットであるRad21が加わることで、コヒーシン／ヌクレオソームファイバー間の相互作用が促進され

ることを明らかにした８）。

• スキャホールドに結合するDNA領域と考えられているSAR/MAR配列を含むプラスミドDNA（β-globin 遺伝子

全領域186 kbを含む）を用いてヌクレオソームを再構成し、さらにリンカーヒストンを加えて 30 nm ファイバーを

形成させ、そこに、スキャホールド構成タンパク質であるII型トポイソメラーゼ（以下、トポII）を加えてAFM観察を

行なった。極めて低濃度（185 kb DNA１分子に対してトポII 18 分子）でトポIIを用いたところ、30 nm ファイバー

同士が絡まりあうようなコンパクションが観察された（図6a）。更に10倍量（185 kb DNA１分子に対してトポII 180

分子）のトポIIを用いた結果、強く凝縮して巨大な球状体になり 90 nm のビーズ状構造ができた（図6b）。しか

し、ヌクレオソームを形成していない裸のDNA や、ヌクレオソームファイバー（H1を加えていない再構成クロマ

チン）にトポIIを加えたところ、コンパクションは検出されなかった（投稿準備中）。

• 核内には、低分子量のヌクレオソーム結合タンパク質が数種存在し、遺伝子活性の活性化／不活性化を調

節する機能を有していることが知られている。そのようなタンパク質のひとつである PC4（positive coactivator

4）について、ヌクレオソームファイバーの構造に及ぼす影響を調査した 20)。その結果、ヌクレオソームファイバ

ーの随所に直径 30~250 nm の凝集が観察された(図 6ｃ)。従来から転写活性調節とクロマチン凝縮度調節と

が互いに連鎖していることが予想されてきたが、本研究結果は、実際に転写活性調節因子がヌクレオソーム

の構造変化を引き起こす分子活性をも保持することを明確に示すものである。

（５）核内構造の観察

ヒト培養細胞をガラス基板上で穏やかな一連の処理を通してゲノム構造を露出させる方法（On-substrate Lysis 法）を開

発し、AFMにより解析することで、直径80 nmのビーズが連なる基本構造を検出した 9)。この構造はRNase処理により30-40

nm ファイバーになった 19)。

同様にガラスや雲母などの基板にバクテリアを貼り付け、細胞壁と細胞膜を非常に穏やかに取り除いてゆくと、内部のゲ

ノムが周囲に広がる。これを AFM などで観察すると、様々な段階のゲノムの高次構造を観察することができ、真核生物のゲ

ノム構造とも共通する幅 80 nm の基本構造を検出した 10, 12)。80 nm ファイバーは 40 nm ファイバーのソレノイド型高次構造

であるが、この 40 nm ファイバーは RNase 処理により裸の DNA になった 19)。このことは、真核生物のゲノム高次構造はヌク

レオソームを介して構築されるが、原核生物のそれはヌクレオソーム構造を介しないことを示している。

大腸菌ゲノムは、細胞増殖期と休止期との間で構造を大きく変化させる。AFM 観察により、休止期のゲノムが高度に凝

集している様子が観察された。これは Dps と呼ばれる核様体タンパク質の発現によるものであった 10)。

図６ (a) 再構成クロマチンファイバーにトポ II を加えた試料の AFM 観察像。（DNA10 kb に対して topo II 1 分子）(b)再

構成クロマチンファイバーにトポ II を加えた試料の AFM 観察像。（DNA1 kb に対して topo II 1 分子）(c)再構成ヌクレオ

ソームファイバー（H1 を含まない）に PC4 を加えた試料の AFM 観察像。

81



■ 考察

当初の目標であったヌクレオソームよりも高次な構造を形成させることは成功した。ヒストンＨ１を加えることにより 30 nm

ファイバーを形成させ、また、ＰＣ４やトポＩＩを加えることにより、より高次に凝集した構造を構築することが可能となった。そ

れらの結果は、細胞周期に呼応した染色体構造変化や、転写調節因子がどのようにクロマチン構造に影響を及ぼすかを

理解するのに有用である。再構成したクロマチンファイバーを細胞内に導入する計画は達成できなかったが、これは再構

成したヌクレオソームが塩濃度等の影響を受け大きく構造を変化させる動的な構造であることが分かったため、安定にハン

ドリングすることが困難であったためである。その動的性質を利用して、種々の構造変化を追跡できたことや、物性的な解

析に供してヌクレオソームの性質を示すことが出来たのは、当初の期待を上回る成果である。また、on-substrate-lysis によ

る核内構造の観察と再構成クロマチンの観察を両立することにより、再構成した構造の評価が出来たことも収穫であった。

核内には 30 nm のファイバー構造の上位に 80-100 nm のファイバーや顆粒状構造が観察された。このような構造は文献

(１８)に示したようにヒストンＨ１を過剰にヌクレオソームファイバーに加えることで再構成することが可能であった。


30 nm ファイバーを再構成できる実験系を新規に開発したことにより、そこに、数多くの染色体タンパク質を加える実験を

行なうことが非常に有意義であると考えられる。核内ではヒストンＨ１が豊富にあるため、この再構成系は核内のゲノムの状

態を非常によく反映した状態であると考えられる。これに対して、既に行なったＰＣ４のほかにも多数存在する転写因子、あ

るいはトポＩＩのほかにもコンデンシンやコヒーシン複合体など染色体高次構造に影響を及ぼす因子を加えることで、それら

のタンパク質やタンパク質複合体がどのようにクロマチン構造に変化を及ぼすかを具体的に示すことが可能であると期待さ

れる。また、文献(１９)のように、on-substrate-lysis により、ＲＮＡが染色体構造構築に機能していることを強く示唆するデー

タを得ることが出来た。これも、再構成実験系に応用することで、具体的にＲＮＡにより導入される構造変化を明らかにする

ことが出来ると思われる。終的な目標として、再構成したクロマチンをテンプレートとした転写活性測定の実験が可能とな

れば、クロマチン構造と遺伝子活性を連結した理解が可能となり、大きく研究が発展すると期待される。


Hohmura, K. I., Itokazu, Y., Yoshimura, S. H., Mizuguchi, G., Masamura, Y. S., Takeyasu, K., Shiomi, Y., Tsurimoto, T.,

Nishijima, H., Akita, S., and Nakayama, Y.：「Atomic force microscopy with carbon nanotube probe resolves the subunit

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protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro.」, Proc Natl Acad Sci U S A, 97,

7266-7271, (2000)

Yoshimura, S. H., Ohniwa, R. L., Sato, M. H., Matsunaga, F., Kobayashi, G., Uga, H., Wada, C., and Takeyasu, K.:「DNA

phase transition promoted by replication initiator.」, Biochemistry, 39, 9139-9145, (2000)

Yoshimura, S. H., Yoshida, C., Igarashi, K., and Takeyasu, K.:「Atomic force microscopy proposes a 'kiss and pull'

mechanism for enhancer function.」, J Electron Microsc (Tokyo), 49, 407-413, (2000)

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the chain end.」, Phys Rev Lett, 87, 078105, (2001)

Hizume, K., Yoshimura, S. H., Maruyama, H., Kim, J., Wada, H., and Takeyasu, K.:「Chromatin reconstitution:


Yoshimura, S. H., Hizume, K., Murakami, A., Sutani, T., Takeyasu, K., and Yanagida, M.:「Condensin architecture and

interaction with DNA: regulatory non-SMC subunits bind to the head of SMC heterodimer.」, Curr Biol, 12, 508-513,

(2002)

Sakai, A., Hizume, K., Sutani, T., Takeyasu, K., and Yanagida, M.:「Condensin but not cohesin SMC heterodimer induces

82



DNA reannealing through protein-protein assembly.」, Embo J, 22, 2764-2775, (2003)

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revealed chromosome structures in eukaryotes and prokaryotes.」, J Electron Microsc (Tokyo), 52, 415-423, (2003)

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Escherichia coli nucleoid revealed by atomic force microscopy.」, Nucleic Acids Res, 32, 1982-1992, (2004)

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superhelicity in nucleosome dynamics.」, Cell Biochem Biophys, 40, 249-262, (2004)

Takeyasu, K., Kim, J., Ohniwa, R. L., Kobori, T., Inose, Y., Morikawa, K., Ohta, T., Ishihama, A., and Yoshimura, S. H.:

「Genome architecture studied by nanoscale imaging: analyses among bacterial phyla and their implication to eukaryotic

genome folding.」, Cytogenet Genome Res, 107, 38-48, (2004)

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formation by TRF2.」, Genes Cells, 9, 205-218, (2004)

Nakai, T., Hizume, K., Yoshimura, S. H., Takeyasu, K., and Yoshikawa, K.:「Phase transition in reconstituted chromatin.」,

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Hizume, K., Yoshimura, S. H., and Takeyasu, K.:「Linker Histone H1 per se Can Induce Three-Dimensional Folding of

Chromatin Fiber.」, Biochemistry, 44, 12978-12989, (2005)

Yoshikawa, Y., Hizume, K., Oda, Y., Takeyasu, K., Araki, S., and Yoshikawa, K.：「Protective effect of vitamin c against

double-strand breaks in reconstituted chromatin visualized by single-molecule observation.」, Biophys J, 90, 993-999,

(2006).

Kobori, T., Kodama, M., Hizume, K., Yoshimura, S. H., Ohtani, T., and Takeyasu, K.:「Comparative structural biology of

the genome: nano-scale imaging of single nucleus from different kingdoms reveals the common physicochemical property of

chromatin with a 40 nm structural unit.」, J Electron Microsc (Tokyo), 55, 31-40, (2006)

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that of linear DNA.」, Chemical Physics Letters, 418, 255-259, (2006)

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Prokaryote and Chloroplast.」, J. Microscopy ＆ Microanalysis, 52, (In Press)

Das, C., Hizume, K., Batta, K., Kumar, P, Deepa, P., Ganghly, S., Lorain, S., Verreault, A., Sadhale, P., Takeyasu, K.,

Kundu, TK.：「ranscriptional Coactivator PC4, A Chromatin-associated Protein, Induces Chromatin Condensation.」, Mol

Cell Biol, (under revision)

■ 関連特許


該当なし


該当なし

83



■ 成果の発表











1) Hohmura, K. I., Itokazu, Y., Yoshimura, S. H., Mizuguchi, G., Masamura, Y. S., Takeyasu, K., Shiomi, Y.,

Tsurimoto, T., Nishijima, H., Akita, S., and Nakayama, Y.：「Atomic force microscopy with carbon nanotube

probe resolves the subunit organization of protein complexes.」, J Electron Microsc (Tokyo), 49, 415-421,

(2000)

2) Yoda, K., Ando, S., Morishita, S., Houmura, K., Hashimoto, K., Takeyasu, K., and Okazaki, T.:「Human

centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro.」, Proc Natl Acad

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3) Yoshimura, S. H., Ohniwa, R. L., Sato, M. H., Matsunaga, F., Kobayashi, G., Uga, H., Wada, C., and Takeyasu,

K.:「DNA phase transition promoted by replication initiator.」, Biochemistry, 39, 9139-9145, (2000)

4) Yoshimura, S. H., Yoshida, C., Igarashi, K., and Takeyasu, K.:「Atomic force microscopy proposes a 'kiss and

pull' mechanism for enhancer function.」, J Electron Microsc (Tokyo), 49, 407-413, (2000)

5) Sakaue, T., Yoshikawa, K., Yoshimura, S. H., and Takeyasu, K.：「Histone core slips along DNA and prefers

positioning at the chain end.」, Phys Rev Lett, 87, 078105, (2001)

6) Hizume, K., Yoshimura, S. H., Maruyama, H., Kim, J., Wada, H., and Takeyasu, K.:「Chromatin reconstitution:


7) Yoshimura, S. H., Hizume, K., Murakami, A., Sutani, T., Takeyasu, K., and Yanagida, M.:「Condensin

architecture and interaction with DNA: regulatory non-SMC subunits bind to the head of SMC heterodimer.」,

Curr Biol, 12, 508-513, (2002)

8) Sakai, A., Hizume, K., Sutani, T., Takeyasu, K., and Yanagida, M.:「Condensin but not cohesin SMC

heterodimer induces DNA reannealing through protein-protein assembly.」, Embo J, 22, 2764-2775, (2003)

9) Yoshimura, S. H., Kim, J., and Takeyasu, K.:「On-substrate lysis treatment combined with scanning probe

microscopy revealed chromosome structures in eukaryotes and prokaryotes.」, J Electron Microsc (Tokyo), 52,

415-423, (2003)

10) Kim, J., Yoshimura, S. H., Hizume, K., Ohniwa, R. L., Ishihama, A., and Takeyasu, K.:「Fundamental structural

units of the Escherichia coli nucleoid revealed by atomic force microscopy.」, Nucleic Acids Res, 32, 1982-1992,

(2004)

11) Hizume, K., Yoshimura, S. H., and Takeyasu, K.:「Atomic force microscopy demonstrates a critical role of DNA

superhelicity in nucleosome dynamics.」, Cell Biochem Biophys, 40, 249-262, (2004)

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84



Yoshimura, S. H.:「Genome architecture studied by nanoscale imaging: analyses among bacterial phyla and their

implication to eukaryotic genome folding.」, Cytogenet Genome Res, 107, 38-48, (2004)

13) Yoshimura, S. H., Maruyama, H., Ishikawa, F., Ohki, R., and Takeyasu, K.:「Molecular mechanisms of DNA

end-loop formation by TRF2.」, Genes Cells, 9, 205-218, (2004)

14) Nakai, T., Hizume, K., Yoshimura, S. H., Takeyasu, K., and Yoshikawa, K.:「Phase transition in reconstituted

chromatin.」, Europhysics Letters, 69, 1024-1030, (2005)

15) Hizume, K., Yoshimura, S. H., and Takeyasu, K.:「Linker Histone H1 per se Can Induce Three-Dimensional

Folding of Chromatin Fiber.」, Biochemistry, 44, 12978-12989, (2005)

16) Yoshikawa, Y., Hizume, K., Oda, Y., Takeyasu, K., Araki, S., and Yoshikawa, K.：「Protective effect of vitamin c

against double-strand breaks in reconstituted chromatin visualized by single-molecule observation.」, Biophys J,

90, 993-999, (2006).

17) Kobori, T., Kodama, M., Hizume, K., Yoshimura, S. H., Ohtani, T., and Takeyasu, K.:「Comparative structural

biology of the genome: nano-scale imaging of single nucleus from different kingdoms reveals the common

physicochemical property of chromatin with a 40 nm structural unit.」, J Electron Microsc (Tokyo), 55, 31-40,

(2006)

18) Araki, S., Nakai, T., Hizume, K., Takeyasu, K., and Yoshikawa, K.：「Hydrodynamic radius of circular DNA is

larger than that of linear DNA.」, Chemical Physics Letters, 418, 255-259, (2006)

19) Ohniwa, R.L., Morikawa, K., Kim, J., Kobori, T., Hizume, K., Matsumi, R., Atomi, H., Imanaka, T., Ohta, T.,

Yoshimura, S.H., and Takeyasu, K.: 「 Atomic Force Microscopy Dissects the Hierarchy of Genome

Architectures in Eukaryote, Prokaryote and Chloroplast.」, J. Microscopy ＆ Microanalysis, 52, (In Press)

20) Das, C., Hizume, K., Batta, K., Kumar, P, Deepa, P., Ganghly, S., Lorain, S., Verreault, A., Sadhale, P.,

Takeyasu, K., Kundu, TK.：「ranscriptional Coactivator PC4, A Chromatin-associated Protein, Induces

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該当なし



1) 吉村成弘竹安邦夫：「原子間力顕微鏡と分子生物学の接点～遺伝子のナノバイオロジー～」, 電子顕微鏡, 36,

99-105, (2001)

2) 吉村成弘竹安邦夫：「遺伝子のナノ構造生物学－DNA の高次構造をとらえる」, 生化学, 73(4), 264-268, (2001)

3) 吉村成弘竹安邦夫:「ゲノムの高次構造を作る役者たち」, 数理科学, 468, 38-43, (2002)

4) 日詰光治吉村成弘竹安邦夫：「ビジュアルバイオロジー1 核酸から核へ－"遺伝子のかたち"を探る旅」, 実

験医学増刊, 20(11), 121-130, (2002)

5) 日詰光治吉村成弘竹安邦夫：「生化学と形態学の融合～DNA とタンパク質のイメージング」, 電子顕微鏡, 38,

74-77, (2003)

6) 小堀敏郎横川雅俊竹安邦夫：「原子間力顕微鏡－ナノバイオロジーへの架け橋－」, 生物物理, 44(6), 255-259,

(2004)

7) 横川雅俊吉村成弘竹安邦夫：「原子間力顕微鏡による生体試料観察」, タンパク質核酸酵素増刊号バイオ

高性能機器, 49(11), 1607-1614, (2004)

8) 日詰光治吉村成弘竹安邦夫：「クロマチンの原子間力顕微鏡観察」, 実験医学別冊クロマチン・染色体実験

85



プロトコール, 168-174, (2004)

国外誌

1) Yoshimura, S.H., Hizume, K., Y. Maruyama, Kim, J. and Takeyasu, K.: 「Nano-biology in Japan: Application of

Nano-technology to Genome Research 」 , In "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and

biotechnology", ISTC Scientific Advisory Committee Seminar Series, Ioffe Institute, St. Petersburg, 2002

2) Yoshimura, S.H., Hizume, K., Y. Maruyama, Kim, J. & Takeyasu, K.: 「Nano-biology in Japan: Application of

Nano-technology to Genome Research」, 2004

書籍出版

1) 「ナノバイオロジー－ナノテクノロジーによる生命科学－」, 竹安邦夫, 共立出版, (2004)

2) 「細胞核のダイナミクス」, 竹安邦夫米田悦啓, シュプリンガー, (2004)

3) 「Nuclear Dynamics: Approaches from Biochemistry, Molecular Biology and Visual Biology」, 竹安邦夫永田恭介,

Springer Verlag, (2006)

4. 口頭発表

招待講演

1) 竹安邦夫：「Development and Application of Carbon Nanotube Probe to Atomic Force Microscopy.」, 金沢,

JAIST Symposium on Nanobiology and Biotechnology, 2001.3.

2) 吉村成弘：「カーボンナノチューブプローブの生物学的応用」, 北九州市, 第 57 回日本電子顕微鏡学会学術講

演会シンポジウム, 2001.5.

3) 吉村成弘：「ナノチューブピンセットの作成とナノマニピュレーション技術の開発」, 京都, 第 74 回日本生化学会

大会シンポジウム, 2001.10.

4) 吉村成弘：「Nano-technology is powerful to understand molecular mechanisms underlying DNA/protein

interactions.」, The 7th International Symposium on Advanced Physical Fields, 2001.11.

5) 日詰光治：「原子間力顕微鏡の分子生物学的応用」, 大阪市, 第 58 回日本電子顕微鏡学会学術講演会シンポ

ジウム, 2002.5.

6) 吉村成弘：「生化学的手法と SPM との融合」, 大阪市, 第 58 回日本電子顕微鏡学会学術講演会シンポジウム,

2002.5.

7) 竹安邦夫：「Life Science Policy in Japan and its Relation to Nanotechnologies.」, ロシア, The 5th ISTC Scientific

Advisory Committee Seminar: Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology,

2002.3.27-29

8) 竹安邦夫：「細胞核から核酸へ：超微細構造を求めて」, 公開シンポジウム「超微細構造の直接観察と新機能開

発への道」, 2002.11.

9) 吉村成弘：「Nano-biology of the Gene: Structural Analysis of Reconstituted Chromatin by Atomic Force

Microscopy」, 韓国釜山, International Symposium on Nano-biology, 2002.11.22-23

10) 吉村成弘：「Nano-biology of the Nucleus.」, 横浜, International Workshop on Nuclear Dynamics: Approaches

from Molecular, Biochemical and Visual Biology, 2002.12.

11) 竹安邦夫：「Prokaryotic and Eukaryotic Genome Architecture Studied by Nano-Scale Imaging.」, つくば,

International Symposium on Fusion of Nano and Bio Technologies, 2003.3.

12) 横川雅俊：「高速 AFM による制限酵素の配列認識機構の解析」, 山口, 第 52 回高分子討論会, 2003.9.

86



13) 横川雅俊：「目で見る DNA ファイバーのダイナミズム」, 東京, みらいせんい展, 2004.7.

14) 竹安邦夫：「Higher-order architectures of human and bacterial genomes revealed by atomic force microscopy.」,

京都, The 16th International Congress of the IFAA, 2004.8.22-27

15) 竹安邦夫：「Prokaryotic and Eukaryotic Genome Architecture Studied by Nano-Scale Imaging.」, バンガロール,

Indo-Japan Workshop on Chromatin Structure and Function, 2005.1.20-23

16) 大庭良介：「Comparative Genomics: Analyses among bacterial phyla by nano-scale imaging, molecular genetics

and bioinformatics」, 米国オレゴン, APRU 国際学生会議, 2005.8.

17) 大庭良介：「Regulation of genome architecture in Escherichia coli: the depletion of Fis and the presence of Topo1

is essential to compact nucleoid induced by DPS.」, 米国ウィスコンシン, Molecular Genetics of Bacteria and

Phages, 2005.8.

18) 横川雅俊：「高速 AFM によるタンパク質間相互作用の一分子解析」, つくば, 日本顕微鏡学会第 61 回学術講演

会, 2005.6.

19) 横川雅俊：「高速走査 SPM による生体試料観察」, 幕張, 有機バイオ SPM 研究会 2005, 2005.9.

20) 日詰光治：「Linker histone H1 per se can induce three dimensional folding of chromatin fiber.」, 北京, The 7th

AEARU Molecular Biology and Biotechnology Workshop, 2005.9.20

21) 横川雅俊：「Single-molecule analysis of protein-protein interactions by fast scanning atomic force microscopy」,

北京, The 7th AEARU Molecular Biology and Biotechnology Workshop, 2005.9.20

22) タパスクンドゥー：「 Transcriptional coactivator activates Tumor suppressor function and plays an

important role in chromatin organization.」, 福岡, 第２８回日本分子生物学会年会, 2005.12.

23) 竹安邦夫：「AFM elucidates genome architectures where reconstitution of chromatin fibers and dissection of

nuclear chromatin meet.」, オーストリアリンツ, Linz Winter Workshop, 2006.2.

24) 竹安邦夫：「 Single-molecule reaction analysis by fast-scanning atomic force microscopy reveals the

ATP/ADP-dependent conformational changes of chaperonin GroEL」, 米国ソルトレークシティ, Biophysical

Society's 50th Annual Meeting, 2006.2.

25) 日詰光治：「Chromatin Dynamics in Reconstituted System.」, 東京, Chromosome Research at the Nano-Era

2006 at Tokyo, 2006.3.10


1) 小堀敏郎：「分裂酵母核クロマチンのアンフォールディング」, 福島県郡山, 第 3 回細胞核ダイナミクス研究会,

2003.5.

2) 横川雅俊：「高速 AFM による制限酵素の配列認識機構の解析」, 札幌市, 日本顕微鏡学会第 59 回学術講演会,

2003.6.

3) 小堀敏郎：「酵母ゲノムを例にして」, つくば, 食品関係技術研究会, 2003.9.

4) 小堀敏郎：「クロマチンの相転移」, 千歳市, 日本顕微鏡学会 SPM 研究部会第 6 回研究会, 2003.11.

5) 日詰光治：「リンカーヒストンにより形成されるクロマチン高次構造の試験管内再構築」, 千歳市, 日本顕微鏡学

会 SPM 研究部会第 6 回研究会, 2003.11.

6) 横川雅俊：「高速 AFM による制限酵素の配列認識機構の解析」, 千歳市, 日本顕微鏡学会 SPM 研究部会第 6

回研究会, 2003.11.

7) 竹安邦夫：「Nuclear subdomains and architectures revealed by atomic force and fluorescence microscopy.」, コー

ルドスプリングハーバー, Nuclear Dynamics, 2004.

8) 大庭良介：「酸化ストレスによる S. aureus ヌクレオイドの構造変化」, The 49th JSSSI Japanese Symposium on

Staphylococci and Staphylococcal Infections, 2004.9.

9) 粂田昌宏：「核骨格タンパク質に対するモノクローナル抗体作製と抗原タンパク質の局在」, 倉敷, 第 4 回核ダイ

87



ナミクス研究会, 2004

10) 江波和彦：「異なる細胞内構造/タンパク質群を同時に認識するモノクローナル抗体について」, 倉敷, 第 4 回核

ダイナミクス研究会, 2004

11) 竹安邦夫：「Fundamental structural unit of the chromosomes identified by atomic force microscopy.」, Brunei UK,

The 15th International Chromosome Conference, 2004.9.5-10

12) 竹安邦夫：「Single-molecule analysis of protein-protein interactions by fast scanning atomic force microscopy.」,

オーストリアリンツ, VII Annual Linz Winter Workshop, 2005.2.4-7

13) 横川雅俊：「高速 AFM によるタンパク質間相互作用の一分子解析」, 伊豆, 日本顕微鏡学会 SPM 研究部会第

6 回研究会, 2005.2.

14) 大庭良介：「ヌクレオイド凝集機構の比較ゲノム解析」, 千葉, 文部科学省特定領域研究ゲノム４領域第 8 回ワ

ークショップ「微生物ゲノム研究のフロンティア」, 2006.3.

15) 円山拓行：「カーボンナノチューブ先端へのタンパク質分子トラッピング」, 東京, 第 53 回応用物理学関係連合

講演会, 2006.3.

16) 竹安邦夫：「ナノバイオロジーから見える原核生物・真核生物染色体の階層的折り畳み構造」, 千葉, 文部科学

省特定領域研究ゲノム４領域第 8 回ワークショップ「微生物ゲノム研究のフロンティア」, 2006.3.


該当なし

6. 受賞等

1.第 15 回国際染色体学会（ICCXV）学会賞ノミネート、平成 16 年 9 月

88





2.2.1. 染色体蛋白質の網羅的同定および機能解析

担当機関名研究室名大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻

研究者名福井希一

■ 要旨

本研究では染色体の構造と機能解明のため、ヒト染色体を大量調製し、染色体を構成する成分を網羅的に同定するプ

ロテオーム解析を行い、染色体蛋白質のカタログ化を図ることを目的とした。解析には第 I 期で確立した手法により単離し

た染色体に加えて、新たに開発した高純度染色体単離法を用いて単離した染色体を用いた。蛋白質の抽出、分離から質

量分析による網羅的同定までを、現在利用可能な善の手法を駆使することにより世界に先駆けて 200 種類以上の染色

体蛋白質を同定することに成功した。更に、単離法と構成蛋白質の比較（比較プロテオーム解析）および各蛋白質の局在

を検討することにより、同定した染色体蛋白質を 4つのグループに分類した「染色体蛋白質 4層モデル」を提唱した。また、

染色体が膨化する塩処理条件において染色体から解離する蛋白質を同定し、染色体凝縮に関わる蛋候補白質を見出し

た。また、従来から染色体構造との関係が注目されていた染色体タイチンについてプロテオームおよびマイクロアレイ解析

を行い、その存在を明確に否定した。以上のように、本研究の結果、蛋白質から捉えた染色体構造が初めて明らかとなり、

今後、染色体研究を構成蛋白質の面から進めるための枠組みを与えた。

■ 目的

染色体高次構造が現在に至るまで未解明である理由のひとつに染色体の構成要素がほとんど明らかとなっていない点

があげられる。これまでにトポイソメラーゼ IIαやコンデンシンといったいわゆる染色体スキャフォールド蛋白質が報告され

ているが、いずれも系統的な解析に基づいたものではないため、それぞれの蛋白質の染色体構造における位置づけが不

明であった。こうした背景には、マテリアルとしての染色体の大量調製が従来は困難であったことがあげられる。本総合研

究では第 I期に染色体の大量調製についての検討を重ね、その結果、大量の染色体をマテリアルとして扱うことを可能とし

た。そこで、第 II 期では、I 期において確立しており、従来から染色体の生化学や形態学研究において頻繁に用いられて

きた単離方法（ポリアミン法としょ糖密度勾配遠心法）を用いてヒト染色体を大量調製し、染色体を構成する蛋白質を網羅

的に同定し、染色体蛋白質をカタログ化する「ヒト染色体プロテオーム解析」を目的とした。これはヒトのゲノム配列が既知と

なった現在においてはじめて可能な研究であり、染色体構造の更には機能解明のための基本的情報となる。加えて、高精

製度の染色体調製法を開発し、その手法を用いて単離したヒト染色体についてもプロテオーム解析を行い、単離方法と同

定された構成蛋白質の比較から各蛋白質の役割を推定することとした。また、染色体形態が変化する条件で染色体より解

離する蛋白質を同定し、染色体凝縮に関わる蛋白質を同定することも目的とした。更に、従来から染色体構造との関係から

注目を集めていた巨大蛋白質タイチンの染色体上での存在の問題についても解決することを目的とした。

得られた結果を、他の課題担当者が行うナノデバイスを用いた染色体構造解析と適用・照合し、更には本小項目での研

究協力による染色体蛋白質の局在・動態解析、相互作用解析、三次元構造解析から得られた各蛋白質の染色体構造と機

能についての解析結果とも対比させることで、染色体高次構造について解明し、蛋白質からみた染色体高次構造モデル

を構築することを目的とした。

89



■ 目標

① 第 I 期に確立した手法（ポリアミン法としょ糖密度勾配遠心法）により単離した染色体のプロテオーム解析

② 高純度精製法（パーコール密度勾配遠心法）により単離した染色体のプロテオーム解析

③ 蛋白質からみた染色体構造モデルの提唱

④ 染色体形態が大きく変化する塩処理条件において解離する蛋白質の同定

⑤ 染色体巨大蛋白質タイチンの存在の確認


① ２つの手法を用いて単離した染色体（ポリアミン法により単離した染色体：PA 染色体；しょ糖密度勾配遠心法により

単離した染色体：SG 染色体）について、蛋白質抽出、一次元および二次元電気泳動、質量分析による網羅的解析

を行い、合計 157 種類の染色体蛋白質の同定に成功した。

② パーコール密度勾配遠心法により単離した染色体（PG 染色体）についても、蛋白質抽出、一次元および二次元電

気泳動、質量分析による網羅的解析を行い、合計 107 種類の染色体蛋白質の同定に成功した。

③ 同定した蛋白質を局在情報および単離の際の生化学的性質に基づいてグループ分けし、「染色体蛋白質 4 層モ

デル」を構築した。

④ 染色体が膨化する 0．4M の塩化ナトリウム処理時に解離する蛋白質を 20 種類同定した。

⑤ プロテオーム解析、抗体を用いた解析、およびマイクロアレイ解析から HeLa 細胞ではタイチンは発現しておらず、

染色体タイチンは存在しないことを明らかにした。

■ 研究方法

ヒト染色体プロテオーム解析

材料としてヒト細胞（HeLa S3 株）を用い、コルセミドにより同調させた後、染色体を単離した。また、細胞株の違いによる

染色体蛋白質構成の差異を調べるため、ヒト細胞 K562 株と BALL 株についても染色体単離を行い、構成蛋白質の比較を

行った。I 期において確立した多段階の遠心を用いる手法（ポリアミン法）により単離した PA 染色体、PA 染色体をショ糖密

度勾配により精製した SG 染色体、およびパーコール密度勾配遠心法により高度に精製した PG 染色体、の 3 種類の単離

染色体をプロテオーム解析の対象とした。単離染色体からの蛋白質抽出は、一次元 SDS アクリルアミドゲル電気泳動

（SDS-PAGE）の場合にはサンプルバッファーに染色体を直接加えて行った。一方、2-DE の蛋白質抽出は酢酸法により行

った。染色体蛋白質の全体構成は SDS-PAGE により確認した。分子量 100kDa 以下の蛋白質の分離および定量は幅広い

等電点（pI）領域をカバーするために二種類の二次元電気泳動を用いた。1 種類目は等電点電気泳動（IEF）を一次元目の

分離に用いる手法(IEF 2-DE)で、pI4～7 と pI6-11 の二つの領域について行った。2 種類目は高い pI で分子量が小さい蛋

白質の分離に適した RFHR（Radical Free and Highly Reducing）法でヒストンなどの pI が高い蛋白質を含む染色体蛋白質に

は適した手法である。分離された蛋白質の検出および各バンドとスポットの定量は CBB 染色後に行った。同一の試料に関

して 6 回の分離を行い、高い再現性で検出されたバンドとスポットについて存在量が多いものから順に質量分析による解析

を行った。切り出したバンドとスポットに含まれる蛋白質同定のためにゲル内消化を行い、消化されたペプチドをゲルより抽

出し、MALDI-TOF、MALDI-TOF/TOF および LC ESI-MS/MS 型質量分析器を用いて質量を測定した。得られたペプチ

ドの質量あるいは MS/MS パターンに適合する蛋白質をデータベース検索ソフト Mascot により同定した（PMF 法：ペプチド

マスフィンガープリント法あるいは質量タグシーケンス法）。

90



図-1 ヒト染色体プロテオーム解析の流れ図-2 解析に用いた 3 種類の単離法

塩処理の際に解離する蛋白質の同定

図 3 に示したように染色体が膨化する 0．4M の塩化ナトリウムにおいて染色体から解離する蛋白質を同定するために、処

理により解離した蛋白質を一次元 SDS-PAGE のより分離し、プロテオーム解析の手法により同定を行った。

図-3 各 NaCl 濃度における染色体形態

巨大蛋白質タイチンの染色体上での存在の有無

HeLa 細胞および単離染色体から抽出した蛋白質を用いてタイチンの存在について検証した。解析は複数種類の抗タイチ

ン抗体を用いたウェスタンブロティング、免疫染色、電気泳動後のゲルの質量分析により行った。また、タイチンには多くの

スプライシング変異体の存在が報告されていることから、マイクロアレイを用いたタイチンの発現解析も併せて行った。

■ 研究成果

ヒト染色体プロテオーム解析

3 つの異なる単離法により調製した PA 染色体、SG 染色体、PG 染色体のすべてについて特徴的な染色体の形態を維持し

ており（図 4）、それぞれの染色体について網羅的解析に必要な量を調製した 4,5,6）。

図-4 染色体プロテオーム解析に用いた単離染色体（左）ＰＡ染色体、（中央）ＳＧ染色体、（右）ＰＧ染色体

当初、染色体蛋白質抽出は染色体の DNase および超音波処理後に冷やしたアセトンを加え蛋白質を沈殿させるアセトン

法により行ったが、抽出した染色体蛋白質は SDS を含まない二次元電気泳動サンプルバッファーに対する溶解度が低く、

91



また、電気泳動の障害となる核酸が含まれているために再現性のある泳動結果を得ることが困難であった。そこで染色体

蛋白質を不溶化させず、終的に蛋白質を粉末として取得可能な酢酸法を用いて抽出を行った。通常、2.8×108 個の細

胞から 500μg の蛋白質が得られた。

酢酸法により抽出した染色体蛋白質の抽出効率の確認および二次元電気泳動サンプルバッファーへの溶解性の確認

を行った。粉末状の蛋白質を二次元電気泳動サンプルバッファーに溶解させ 15000rpm で 15 分遠心後、上清に SDS サン

プルバッファーを添加し、SDS-PAGE に供したところ、図 5 に示したように染色体を直接 SDS サンプルバッファーに加え蛋

白質を抽出した場合と同程度の効率で蛋白質抽出が行われており、かつ二次元電気泳動サンプルバッファーに溶解して

いることが明らかとなった 4）。SDS-PAGE のパターンから染色体は様々な分子量の蛋白質により構成されているものの、ヒス

トンが染色体蛋白質のなかでも高い比率を占めており、画像解析から全体の 70 %を占めていた。更に、図6 に示したよう

に二次元電気泳動（IEF 2-DE）の結果から 100 個以上のスポットが検出され染色体が多種類の蛋白質から構成されている

ことが示された。また、RFHR 法により高い塩基性の蛋白質も高分解能で分離されており、この電気泳動でも 100 個以上の

スポットが検出された 4）。

図-5 染色体蛋白質の抽出方法の比較

1. アセトン法 2. SDS-PAGE サンプルバッファーに直接溶解 3. 酢酸法

コルセミドを添加しない条件で培養した細胞から単離した PA 染色体の二次元電気泳動パターン（図 6A）から、コルセミド

添加は染色体蛋白質構成に大きな影響を与えないことも明らかとなった。また K562（図 6B）および HeLa(図 6C)から単離し

た PA 染色体の蛋白質構成は BALL-1 から単離したものと大きくは差異がないことが示された 4）。

図-6 PA 染色体の蛋白質構成 (A) コルセミド添加なし (B) K562 株 (C)HeLa 株

図-7 PMF による染色体蛋白質同定の例

92



質量分析により得られたピークパターンをもとに PMF 法により同定した例を図 7 に示した。同様の手法で電気泳動により

分離された量的に多いほとんどのバンドとスポットに含まれる染色体蛋白質について同定した（図 8～10）。PA および SG 染

色体から全部で 208 個の蛋白質を同定したが、このうち 51 個は同一の蛋白質であった。以上より、PA および SG 染色体を

構成する合計 157 種類の染色体蛋白質の同定を完了した 5）。

図-8 PA 染色体の SDS-PAGE パターンと同定した蛋白質

図-9 IEF-2DE による分離と同定結果（左）pI4-7 (a)PA 染色体 (b)pI6-11; SG 染色体（右）pI6-11(a)PA 染色体、(b)SG 染色

図-10 RFHR-2DE による分離と同定したスポット（左）PA 染色体、（右）SG 染色体

93



PA および SG 染色体より同定した蛋白質を間期での局在情報に基づいて分類を行った（図 11）。同定した数により割合

を計算すると全体の 35%がミトコンドリア（M）蛋白質、10%が細胞質(Cy)蛋白質であり、核(N)蛋白質は 33%であった。一方、ヒ

ストン H4 に対する相対的モル数から算出した割合をみると全体の 85%は核蛋白質であり、ミトコンドリア蛋白質と細胞質蛋

白質はそれぞれ 10%と 8%であった。この結果から単離染色体の大部分は核蛋白質によって構成されており、数は多いもの

の量的には少ないミトコンドリア蛋白質を含んでいるらしいことが明らかとなった 5）。

図-11 同定した蛋白質の分類A数から見た場合（左）量（右）から見た場合 B各蛋白質の存在量の変化

PG 染色体の単離、染色体蛋白質の一次元 SDS-PAGE、 RFHR 二次元電気泳動を行い、染色体蛋白質の同定を行っ

た。その結果、検出可能なバンド及びスポットのほぼ全てについて同定を完了し、終的にPG染色体を構成する107種類

の蛋白質の同定に成功した 5）（図 12）。本結果は高精製度の染色体のプロテオーム解析の結果であることから同定された

染色体蛋白質の多くは染色体構造に関与する可能性が高いと予想できる。実際に同定された蛋白質について局在解析を

行ったところ、染色体への局在が確認された。一方、これまでに染色体構造との関連が報告されてきたヒストン、HMG、コン

デンシン、およびトポイソメラーゼ IIα等と同程度の量を持つ蛋白質は染色体上にはほとんど見当たらないことが明らかとな

った 5）。

図-12 高度に精製した単離染色体（ＰＧ染色体）のプロテオーム解析結果（左）一次元電気泳動による分離と同定結果、（右）RFHR

二次元電気泳動による分離と同定結果

以上の SG 染色体、PA 染色体、PG 染色体の比較プロテオーム解析の結果、および分裂期の挙動から同定した染色体

蛋白質を新たに 4 つのグループ（chromosome coating protein； CCPs， chromosome peripheral protein； CPPs，

94



chromosome structural protein； CSPs， chromosome fibrous protein； CFPs）に分類した 5）（図 13）。

CCPsはショ糖密度勾配精製により大きく量が減少するもので（図11参照）、ミトコンドリア蛋白質と細胞質蛋白質がこのグ

ループに属する。細胞内ではこれらの蛋白質は膜によって仕切られた各オルガネラ内に存在しており、染色体上に存在す

るとは考えにくく、おそらく CCPs は単離の際に染色体に非特異的に付着したものと考えられる。

間期の局在から核蛋白質と分類された蛋白質は更に二つのグループに分類分けした。CPPs は分裂期には染色体の周

辺部位に存在する蛋白質で核小体や核膜を構成する蛋白質がこのグループに属する。CSPs は PA、SG 双方の染色体で

同程度の量存在し DNA やヒストンに強く結合し染色体構造の構築に寄与していると考えられたものである。また繊維を形

成する細胞骨格蛋白質の染色体構造への関与はあまりよく分かっていないが、今回の結果では PA、SG 双方の染色体で

一定量存在している蛋白質として同定されたことから、CSPs とは別に CFPs として分類した。

図-13 染色体蛋白質 4 層モデルと同定した染色体蛋白質の分類

塩処理の際に解離する蛋白質の同定

0.4M の塩処理により解離する染色体蛋白質の同定を行い、21 種類の蛋白質の同定に成功し、ヒストン H1、トポイソメラ

ーゼ I や IIαなどに加えて、染色体構造との関連についての報告が無い蛋白質を複数見出した（図 14）。これらは、今後蛋

白質の観点から染色体構造を解明する際の候補蛋白質である。

図-14 0.4M 塩処理により解離した染色体蛋白質

同定した 24 種類の蛋白質のうち量が多い 10 種類を表示

95



巨大蛋白質タイチンの染色体上での存在の有無

HeLa 細胞および単離染色体から抽出した蛋白質について解析を行ったが、複数種類の抗タイチン抗体を用いたウェス

タンブロティングと免疫染色、および電気泳動後のゲルの酵素処理および質量分析による同定ではその存在は確認できな

かった。更に、マイクロアレイを用いたタイチンの発現解析を行ったところ、HeLa 細胞ではタイチンが発現していないことが

確認された 7）。

図-15 染色体タイチンの解析（左）抗タイチン抗体による免疫染色 (右 A-C) 染色体タイチンの検証 (A)一次元電気泳動の結果

(B）抗タイチン抗体によるウェスタンブロッティング 1. ウサギ骨格筋、 2. HeLa 細胞抽出液、3. 染色体蛋白質 (C)タイチンマイクロアレイ

による発現解析

■ 考察

これまで染色体を生化学的に研究した例は極めて少なく、染色体が蛋白質の面から解析可能であることを示すことがで

きたことは、今後の染色体研究に新たな局面をもたらすこととなる。特に、染色体が発見されてから 100 年以上を経て、よう

やくその構成蛋白質の全貌が明らかとなり、「染色体蛋白質 4 層モデル」を提唱することができたことは、意義深いといえる。

今回の結果から、染色体を構成する蛋白質の大部分はヒストンが占めている一方で、ヒストンと同程度の量を占める蛋白質

は存在せず、従来から染色体構造との関係が報告されていたトポイソメラーゼ IIαやコンデンシンはヒストンと比べると

1/200～1/300 程度であることが分かったが、これらのことは染色体が高次構造を形成する際にクロマチンが高度に折れ畳

まれるためには、ヒストン以外の特定の蛋白質を必要としない可能性を示唆している。1998年に染色体タイチンの存在が報

告されてから、1μm の長さを持ち伸縮性を発揮するタイチンと染色体構造との関わりが注目されてきたが、本研究ではタイ

チンは染色体上には存在しないことを実証した。以上のように本研究では、染色体を蛋白質からアプローチする際の枠組

みとなる実験手法および情報を与えるという大きな成果を得た。


本研究成果により染色体構造の研究対象とするべき蛋白質の候補が絞られ、今後は蛋白質を中心とした分子レベルで

の染色体研究が展開されると期待できる。特に、各蛋白質の染色体構造における役割や各蛋白質の相互作用ネットワーク

を解析することにより、染色体を包括的に理解できるようになる。各蛋白質の機能解析には近年発展著しいＲＮＡｉ解析など

が有効な手段となると考えられる。

また、本研究では染色体の高次構造構築には特定の蛋白質以外の関与が示唆されたが、今後は例えば陽イオンなど

の環境因子と染色体構造形成との関係について研究を進める必要がある。こうした研究は、本総合研究で開発したナノデ

バイスを利用することにより実現できるであろう。その結果、染色体の生化学と高分解能での新しい構造解析が組み合わさ

った新時代の染色体研究が展開されると期待できる。


Lewis, C. and Laemmli, U. (1982) Higher order metaphase chromosome structure: evidence for metalloprotein interactions.

Cell 29, 171-181.

96



Spector, D., Goldman, R., and Leinwamd, L. (1998) Chromosome isolation for biochemical and morphological analysis in

Cells: A laboratory manual, (Janssen, K., ed.), Cold Springer Harbor Laboratory Press, NY, pp 49.1-49.12.

Sone, T., Iwano, M., Kobayashi, S., Ishihara, T., Hori, N., Takata, H., Ushiki, T., Uchiyama, S., and Fukui, K. (2002)

Changes in chromosomal surface structure by different isolation conditions. Arch. Histol. Cytol. 65, 445-455.

Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Sone, T., Matsunaga, S., and Fukui, K. (2004) Protein composition

of human metaphase chromosomes analyzed by two-dimensional electrophoreses. Cytogenet. Genome Res. 107, 49-55.

Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Hori, N., Higashi, T., Hayashihara, K., Sone, T., Higo, D., Nirasawa,

T., Takao, T., Matsunaga, S., and Fukui, K. (2005) Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem.

280, 16994–17004.

Engelhardt, P., Meriläinen1, J., Zhao, F., Uchiyama, S., Fukui, K., and Lehto, V.-P., (2006) Whole-Mount

Immuno-Electron Tomography (IET) of Chromosomes and Cells, Electro Microscopy Methods and Protocols (Methods in

Molecular Biology) 2nd Ed., in press.

Takata, H., Uchiyama, S., Nakamura, N., Nakashima, S., Kobayashi, S., Sone, T., Kimura, S., Lahmers, S., Granzier, H.,

Labeit, S., Matsunaga, S., and Fukui, K. A comparative proteome analysis of human metaphase chromosomes isolated from

two different cell lines reveals a set of conserved chromosome-associated proteins. J. Proteome Res.（投稿中）

■ 関連特許


1) 2002 年８月 23 日出願、「蛋白質溶液の調製方法、当該蛋白質溶液を利用したモノクローナル抗体の作製方法及

び当該モノクローナル抗体」福井希一、内山進、曽根岳史、大阪ＴＬＯ、特願 2002-244049

本研究で使用した染色体蛋白質抽出法および可溶化法は本特許で利用した手法と同一の手法であり、効率的か

つ高い再現性で染色体蛋白質を抽出および分離できる。


1) 平成１７年８月２４日、「名称分子間相互作用測定方法及びこの方法を用いた測定装置」、福井希一、内山進、川上

茂樹、西川聡、大阪大学、関西 TLO、特願 2005-242273

同定した染色体蛋白質の分子間相互作用解析を定量的かつ網羅的に可能とするための発明である。

2) 平成１６年１２月８日、「細胞の活性評価方法、細胞測定用システム、及び細胞測定用プログラム」、松永幸大、内山

進、福井希一、大阪大学、特願 2004-355235

細胞周期を細胞分裂時の染色体の形態に基づいて判別する手法であり、本研究で同定した染色体蛋白質を可視

化し、本発明の実施例とすることが可能である。

97



■ 成果の発表











1) Iwano, M., Che, F., Takayama, S., Fukui, K., Isogai, A.：「Three-dimensional localization of ribosomal DNA within

barley nucleoli revealed with electron microscopy」，Scanning，25, 257-263. (2003)

2) Wako, T., Fukui, K.：「Quantitative analysis of nuclear chromocenter in Spiranthes sinensis (Pers.)」，Ames.

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（投稿中）


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書籍出版

1）「酵素解離空気乾燥法（EMA 法）」，福井希一, クロモソーム,養賢堂, 2006.3.3

2) 「制限酵素バンド」，福井希一, クロモソーム,養賢堂, 2006.3.3

3) 「インゲンマメ（多糸染色体）」，福井希一, クロモソーム,養賢堂, 2006.3.3

4) 「核型表記法（凝縮型：Condensation pattern）」，福井希一, クロモソーム,養賢堂, 2006.3.3

5) 「定量的染色体地図（Idiogram）作製法」，福井希一, クロモソーム,養賢堂, 2006.3.3

6) 「主要植物染色体地図」，福井希一, クロモソーム,養賢堂, 2006.3.3

4. 口頭発表

招待講演

1) Fukui.：「High Resolution Pachytene Chromosome Mapping By Repetitive Sequences And TAC Clone Markers In

Lotus japonicus」，San Diego, CA, USA，Plant & Animal Genome Ⅻ，January 10-14, 2004

2) 福井希一、伊東一良：「細胞内ネットワークのダイナミズム解析装置の開発」，神戸国際会議場，第２回関西広域ク

ラスター合同成果発表会～スーパークラスターの形成を目指して～，2004 年 3 月 20 日

3) 福井希一：「バイオアクティブマイクロビーズによる新形質転換法」，（独）農業生物資源研究所，平成１５年度植

物バイテク研究会―遺伝子導入法の新展開―，2004 年 1 月

4) Kiichi Fukui：「Chromosome technologys in the post-genome era.」，Pacifico Yokohama，The 1st Pacific-Rim

International Conference on Protein Science，April 14-18, 2004

5) Kiichi Fukui, Sachihiro Matsunaga, Keisuke Isobe, Tsunehito Higashi, Wataru Watanabe, Kazuyoshi Itoh：

「 Analyses of fluorescence proteins by multiple-wavelength excitation fluorescence microscopy using

supercontinuum」，千里ライフサイエンスセンター（豊中市），第 57 回（平成 16 年度）日本細胞生物学会大会，

2004 年 5 月 26－28 日

6) 福井希一、東隆親：「モノクローナル抗体を用いたプロテオーム解析」，蛋白質科学研究所，蛋白質科学研究所

セミナー，2005 年 3 月 14-15 日

7) 福井希一：「イントロダクトリートーク：生細胞内分子可視化のためのコヒーレントバイオフォトニクス」，徳島大学，第

66 回応用物理学会秋季学術講演会，9 月 7-11 日

8) 福井希一、内山進：「染色体ナノデバイスに関する総合研究および染色体のプロテオーム解析」，国立オリンピッ

ク記念青少年総合センター（東京都渋谷区），日本遺伝学会第 77 回大会，2005 年 9 月 27－29 日

9) 福井希一：「百聞は一見にしかず：バイオテクノロジーにおける可視化技術」，東京駅大丸 11,12 階ルビーホー

ル，横浜・神奈川バイオビジネス・ネットワーク第１回オープンフォーラム：可視化技術に見るバイオの将来，

2005 年 12 月 20 日


1) 堀直人、内山進、小林昇平、石原武、松永幸大、福井希一：「ヒト染色体構成蛋白質の塩処理による段階的解

析」，神戸ポートアイランド，第２６回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13 日

2) 内山進、小林昇平、石原武、高田英昭、曽根岳史、韮沢崇、松永幸大、福井希一：「ヒト分裂期染色体のプロテオ

ーム解析」，神戸ポートアイランド，第２６回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13 日

3) 高田英昭, 内山進, 韮沢崇, 曽根岳史, 小林昇平, 松永幸大, 福井希一：「RFHR 法を用いた二次元電気泳動

によるヒト染色体のプロテオーム解析」，神戸大学神大会館，第１３回染色体コロキュウム，2003 年 12 月 13-14 日


100



によるヒト染色体のプロテオーム解析」，神戸国際会議場，第 26 回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13

日

5) 高田英昭、内山進、曽根岳史、小林昇平、松永幸大、福井希一：「RFHR 法を用いた二次元電気泳動によるヒ

ト染色体のプロテオーム解析」，神戸国際会議場，第 27 回日本分子生物学会，2004 年 12 月 8－11 日

6) 林原加代子, 内山進, 小林昇平, 近江戸伸子, 松永幸大, 福井希一：「間接蛍光抗体法を用いた染色体関連

蛋白質の局在解析」，名古屋大学天白キャンパス，日本生物工学会大会，2004 年 9 月 21-23 日

7) 中村直子, 内山進, 種子田艶, 高田英昭, 中嶋祥子, 木村澄子, 松永幸大, 福井希一：「超高分子量ヒト染色

体蛋白質の分離および同定」，名古屋大学天白キャンパス，日本生物工学会大会，2004 年 9 月 21-23 日

8) Susumu Uchiyama, Shouhei Kobayashi, Hideaki Takata, Takeshi Ishihara, Takehumi Sone, Takashi Nirasawa,

Toshihumi Takao, Sachihiro Matsunaga, and Kiichi Fukui ：「 Proteomic analysis of human metaphase

chromosomes」，Brunel University, West London, UK，15th International Chromosome Conference (ICC XV)，

September 5-10, 2004

9) Kiichi Fukui, Susumu Uchiyama, Takehumi Sone, Megumi Iwano and Sachihiro Matsunaga ：「Changes in

chromosomal surface structure are directly related to protein composition.」，Brunel University, West London,

UK，15th International Chromosome Conference (ICC XV)，September 5-10, 2004

10) Shouhei Kobayashi, Aya Kuwae, Susumu Uchiyama, Sachihiro Matsunaga, and Kiichi Fukui：「Localization of

calreticulin on human metaphase chromosomes.」，Brunel University, West London, UK，15th International

Chromosome Conference (ICC XV)，September 5-10, 2004

11) Shouhei Kobayashi, Susumu Uchiyama, Sachihiro Matsunaga, and Kiichi Fukui.：「Localization of calreticulin on

human metaphase chromosomes」，Pacifico Yokohama，The 1st Pacific-Rim International Conference on

Protein Science，April 14-18, 2004

12) Hideaki Takata, Susumu Uchiyama, Takehumi Sone,Shouhei Kobayashi, Sachihiro Matsunaga and Kiichi Fukui：

「Proteomic analysis of human metaphase chromosomes by using RFHR-PAGE」，Pacifico Yokohama，The 1st

Pacific-Rim International Conference on Protein Science，April 14-18, 2004

13) 内山進、小林昇平、高田英昭、石原武、曽根岳史、林原加代子、中村直子、松永幸大、福井希一：「ヒト分裂期染

色体のプロテオーム解析」，ヤフードーム（福岡県福岡市），日本分子生物学会第 28 回(2005 年度)年会，2005

年 12 月 7－10 日

14) 福井希一、柳澤昌伸、内山進、松永幸大、鷹岡昭夫：「塩処理によるヒト染色体高次構造の解析」，福岡国際会議

場，第 5 回日本蛋白質科学会年会，2005 年 6 月 30 日－7 月 2 日

15) 高田英昭、中村直子、小林昇平、曽根岳史、木村澄子、内山進、松永幸大、福井希一：「ヒト分裂期染色体の比

較プロテオーム解析」，福岡国際会議場，第 5 回日本蛋白質科学会年会，2005 年 6 月 30 日－7 月 2 日

16) Susumu Uchiyama, Shouhei Kobayashi, Hideaki Takata, Tsunehito Higashi, Kayoko Hayashihara, Takefumi Sone,

Sachihiro Matsunaga, and Kiichi Fukui：「Proteome analysis of human metaphase chromosomes」，Babraham

Institute Cambridge, UK，Epigenetics and the Dynamic Genome Conference Cambridge 2005，June 30-July 2,

2005

17) Kayoko Hayashihara, Shouhei Kobayashi, Susumu Uchiyama, Sachihiro Matsunaga, Nobuko Ohmido, Kiichi

Fukui：「Localization analyses of human metaphase chromosome proteins」，大宮ソニックシティ，第 58 回日本細胞

生物学会大会，2005 年 6 月 15－17 日

18) Hiroshi Ishii, Tsunehito Higashi, Tomoko Shimada, Wataru Watanabe, Kazuyoshi Itoh, Sachihiro Matunaga and

Kiichi Fukui：「Morphological changes of mitochondria by femtosecond laser pulses」，大宮ソニックシティ，第 58

回日本細胞生物学会大会，2005 年 6 月 15－17 日

19) Arni E. Gambe, Rika Maniwa, Natsumaro Kutsuna, Takumi Higaki, Seiichiro Hasezawa, Susumu Uchiyama,

Sachihiro Matsunaga and Kiichi Fukui：「Development of a novel monitoring system of cell activity based on

101



visualization of chromosomal dynamics」，大宮ソニックシティ，第 58 回日本細胞生物学会大会，2005 年 6 月 15

－17 日

20) Kiichi Fukui: “Proteome analysis of human metaphase chromosomes”, Tokyo, Chromosome Research at the

Nano-Era, March 9 (2006)


平成１７年８月２４日、「名称分子間相互作用測定方法及びこの方法を用いた測定装置」、福井希一、内山進、川上茂

樹、西川聡、大阪大学、関西 TLO、特願 2005-242273

6. 受賞等

1.第 15 回国際染色体学会（ICCXV）学会賞ノミネート、平成 16 年 9 月

102




2.2. 単離染色体による染色体蛋白質の同定と解析

2.2.2. 染色体蛋白質の局在および動態解析

担当機関名研究室名神戸大学発達科学部

研究者名近江戸伸子

■ 要旨

ヒト染色体の高次構造の形成に重要な役割を果たす蛋白質を同定し、機能を理解するために、染色体プロテオーム解

析(Uchiyama et al. 2005)で発見された蛋白質について、動態解析ならびに局在解析を行った。まず、染色体蛋白質のアミ

ノ酸配列からさまざまの領域を抗体のエピトープにした場合の特異性を評価する方法を確立した。そして、染色体を構成す

る候補蛋白質 30 種類について、間接蛍光抗体染色法を用いて、細胞周期ごとの染色体上への局在を解析し、可視的な

染色体蛋白質抗体の選抜をおこなった。興味深い局在を示した蛋白質について、蛍光蛋白質 GFP と融合し、細胞に導入

して、クロマチン動態の可視化を行った。生細胞の中で、空間的・経時的に刻々と移り変わる染色体を可視的に解析するこ

とによって、染色体の高次構造形成に関与する蛋白質として、RBMX ならびに有力候補として、FtsJ homolog3 を特定した。

■ 目的

染色体は細胞分裂の特定の分裂期に出現し、遺伝物質を均等に娘細胞に分配するための構造体として非常に重要で

ある。これまでに染色体蛋白質として 5 種類のヒストンやトポイソメラーゼ、コンデンシンなどが認められている。それ以外に、

染色体の高次構造の形成に重要な役割を果たす蛋白質を同定し、その機能を理解することが、細胞機能として複雑でか

つ必須の染色体の機能・構造を理解するために重要である。

中課題グループで、プロテオーム解析で得られたヒト染色体を構成する候補蛋白質について、ポリクローナルならびにモ

ノクローナル抗体を作成する。そして、本課題では、作製された抗体について、染色体に特異的に存在する抗原蛋白質を

同定することを目的とする。そのために、再現性が良く、精度の高い抗体蛋白質を選び出すためのエピトープの選定ならび

に精度の高い局在解析が可能となる標本作製法を確立する。そして、その評価法により、どの蛋白質がどの細胞周期に出

現し、どこに局在するかについて、網羅的に解析する。局在性が認められた蛋白質について、生細胞での動態ならびに過

剰発現での分裂細胞への影響を明らかにすることで、細胞においてのその蛋白質の本来の機能を知り、染色体機能解明

にアプローチすることを目的とする。ヒト細胞核内での特異的に発現する遺伝子ならびに蛋白質の動態を可視的に解析す

ることで、染色体の生体内高分子の構造と機能の研究の進展に寄与できると考えられる。

■ 目標

① プロテオーム解析によって推定された染色体関連蛋白質について、細胞学的、遺伝学的、生化学的手法により、細

胞内局在に影響する機能ドメインの解析を行う。

② 局在解析によって、染色体蛋白質の細胞内での機能を推定し、染色体高次構造形成に関与する蛋白質を特定し、

細胞内局在のカタログ化を行なう。

③ 局在解析で、染色体機能に関連すると予想される蛋白質について、生細胞の中で空間的・経時的に動態変化を解

析する。


① 染色体画分に存在が認められた、S6 リボソーム蛋白質を用いて、その機能部位を決定し、作成された抗体について

の解析法を確立した。

② ２８の染色体関連の候補蛋白質の抗体について細胞内での局在性について決定した。

103



③ 染色体動態の解析系として、染色体を構成する代表的な DNA 結合蛋白質であるヒストン H1 と蛍光蛋白質 GFP と

融合し、蛍光蛋白質融合遺伝子を構築した。デコンボリューションシステムによる三次元的なクロマチン動態の可視

化に成功した。また RBMX、ＦｔｓＪについて細胞動態を観察し、それらが染色体形成に何らかの役割をになっている

ことが推定された。

■ 研究方法

（１）染色体蛋白質の局在解析

１）HeLa 細胞の培養

HeLa 細胞を, 5% Fetal Bovine Serum (FBS) (GIBCO; 26140-087), 1% Penicillin-Streptomycin (GIBCO; 15070-063) を

含む Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO; 11885-084) 中, 37°C, 5% CO2 条件下, 10 cm ディッシュ

(Falcon; 353003) 内で培養した. 継代培養は 3-4 日に一度, 付着した細胞を Tripsin-EDTA (GIBCO) を用いて剥離した

後, 10 ml の新しい培地中に懸濁し, さらに別に用意した新しい培地に 1/10 量の細胞懸濁液を加えることにより行った.

２）細胞標本の調整

培養３日目の HeLa 細胞を、3000 rpm、5 min 遠心後、上清を除去し、PBS に細胞を懸濁した。Poly-L-Lysine カバーグラ

スの上に細胞懸濁液を滴下し、室温で 20 min 静置することにより細胞を付着させた。PBS で 1 回洗浄し、2 % PFA/XBE2

で、室温で 15 分間固定した。

３）展開染色体標本の調製

HeLa 細胞ならびに HeLa S3 細胞の対数増殖期にあたる３日目の培養細胞を、0.1 μg/ml のコルセミドにより同調化し、

75 ｍM KCl による低張処理を行なった後、Schandon Cytospin4 (Thermo 社)で 1300 rpm 10 分間遠心し、APS コートスラ

イドグラス（マツナミ）上に展開した。展開後、固定には 4 % Paraformaldehyde/XBE2（Maeshima and Laemmli 2003）で細胞

を固定した。

４) 単離染色体標本の調製

単離染色体の展開は、Maeshima and Laemmli (2003)にしたがって行った。単離染色体は 0.8 % PFA in XBE2 で室温、15

分間固定後、等量の 60% sucrose in XBE2 を加えた。Schandon Cytospin4 を用い、2000 rpm、10 分間遠心した。

単離染色体での局在

→個々の染色体上での

局在

展開染色体（75 mM KCl

処理）での局在

→染色体核板での局在

インタクト細胞での局在

→細胞内局在、生体に

近似する

図 1 局在解析に用いた 3 種のヒト細胞標本。コントロールの抗体はトポイソメラーゼ IIαを用いた。

5）免疫染色法に用いた抗体

104



２８種類のポリクローナル抗体ならびに９種類の S6 ペプチド抗体を用いて、間接蛍光抗体染色法により、局在を詳細に

解析した。２）細胞標本、３）展開染色体標本ならびに４）単離染色体標本を用いて、抗原蛋白質の局在を分類した。免疫

染色法は、Ono et al, (2003)、Maeshima and Laemmli (2003)法に準じて行った。

コントロールとしての 1 次抗体は Topoisomerase IIαモノクローナルマウス抗体(TopoGEN)と Topoisomerase II モノクロー

ナルマウス抗体(Oncogene)をそれぞれ 50 倍希釈、ヒストン H1 マウス抗体を 100 倍希釈し用いた(Summer et al. 1996)。2

次抗体は抗マウス IgG-FITC 抗体(Leinco Technologies)を用いた。染色体の染色は 1 μg/ml DAPI を含む、ベクターシー

ルド(Vector 社)を用いて行った。

９種類の S6 リボソーム蛋白質について、各ペプチド抗体を１次抗体として 100 倍希釈、２次抗体は抗ラビット IgG-FITC

conjugate 抗体(Sigma、 M113)を 100 倍希釈して用いた。免疫染色法ならびにウエスタン法による抗原蛋白質の特性を検

証した。

（２）染色体蛋白質の動態解析

１）ヒストンの動態解析

GFＰ遺伝子を構築したヒストンＨ１を HeLa 細胞に形質転換し、恒常的に発現している細胞系の確立を試みた。ヒストン

H1 には 1-5 の 5 種類のサブタイプが存在し(Misteli et al. 2000)、そのなかでもほとんど全ての組織で恒常的に発現してい

る Histone H1.2 (以下、H1 と記述)（Meergans et al. 1997）遺伝子を用いた。遺伝子を PCR 法により獲得し、pUC18 にサブ

クローニング後、動物細胞での GFP 融合蛋白質発現ベクターpEGFP-C1 へクローニングし、形質転換用のベクターを構築

した(東 2003)。構築したベクターをリポフェクションにより HeLa 細胞に導入し、１昼夜後、GFP-H1 融合蛋白質の発現確認

を実施したところ、10％弱の細胞で発現が確認された。発現が確認された形質転換された細胞について、限界希釈法によ

る恒常的に発言している形質転換体の選択を行った。形質転換 3 週間後、GFP-H1 融合蛋白質の発現を確認した。

２）hnRNPG 遺伝子の単離および動態解析

hnRNPG 遺伝子 (1176 bp; accession number BC006550) を N 末端 EGFP 融合発現ベクターpEGFP-C1 (BD Biosciences

Clontech; 6084-1, Genbank Accession No. U55763) に挿入し、クローニングを行った。塩基配列の確認後、リポフェクショ

ン法を用いて、 HeLa 細胞に形質転換し，得られた形質転換体について立体的に細胞を観察することが可能なデコンボリ

ューション法で解析した。

■ 研究成果

（１）染色体蛋白質の局在解析

９種類の S6 リボソーム蛋白質のペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングならびに免疫染色の結果、この蛋白質に

種を越えて共通なアミノ酸配列をエピトープにした場合に、強い結合が認められた５）。3 種類の標本作製法を確立すること

で７）、染色体蛋白質の細胞内での機能を推定し、染色体高次構造形成に関与する蛋白質を特定し、細胞内局在のカタロ

グ化を行った。

この判断基準に従い、２８の抗体蛋白質の免疫染色法により評価を行った結果、それぞれの蛋白質は以下のように分類

された (表 1)。

表１免疫染色より局在を同定した染色体関連蛋白質一覧

蛋白質同定から推定される局在

hCAP-E、hCAP-G、DNA TopoIIα CSP＊ (Scaffold)

Histone H2A,H2B,H3,H4,H1 CSP

HP１binding protein 74 CSP

hSNF2H CSP

RBMX、Ki-67, FtsJ homolog 3 CPP

β-actin CFP

105



GRP78, CRT CCP

S6 ribosomal CCP(Cytoplasmic)

＊Uchiyama et al． 2005 による

RBMX 抗体を用いて、細胞内染色体標本の間接蛍光抗体法を行った。抗体のシグナルは、間期核では核質に局在し

た。有糸分裂期における染色体上のシグナルは不明瞭であったが、中期では主に染色体周囲の細胞質、後期では赤

道面の細胞質に強いシグナルが観察された。単離染色体標本と展開染色体標本を用いた場合、染色体分体間に局在し

た６）。

4 種の FtsJ homolog 3 抗体を用いて、細胞内染色体標本の間接蛍光抗体法を行った。その結果、4 種の抗体す

べてにおいて間期核の核小体にシグナルが観察された。いくつかの抗体では、中期と後期には紡錘体様の局在が、細胞

質分裂期には中心体への局在が観察されたが抗体によって局在にばらつきが観察された。いずれの抗体についても単離

染色体標本(図2)、展開染色体標本の結果は同様に、染色体全体にシグナルが認められた。

（２）染色体蛋白質の動態解析

GFP-H1融合遺伝子の形質転換体の選択直後においてはEGFP-H1融合蛋白質を発現する細胞株の割合が10%と低く

かったが、42クローンの株化細胞を取得し、それぞれについて蛍光顕微鏡を用いて、GFP-H1融合蛋白質の発現確認を

行ったところ、4クローンにおいて高いGFP-H1融合遺伝子の発現が確認され、その中で1クローンがすべての細胞周期に

恒常的に融合蛋白質を発現していることが確認できた。この細胞系については、継代を繰り返しても、全ての細胞で融合

蛋白質の発現ならびに増殖が確認されたため、この方法で、恒常的にGFP-H1融合蛋白質を発現する細胞株を取得でき

ることが明らかとなった。

２８の抗体について局在性のスクリーニングの結果、RBMXは単離染色体および展開染色体標本において明瞭に染色

体周縁部への局在が得られ、細胞分裂のなかでも中期の姉妹染色分体の接着に関連して機能する蛋白質である可能性

が示唆される（成果６）。このRBMXについて、細胞内での機能を推測するため、RBMXを生細胞で可視化し、動態解析した。

RBMXは細胞質分裂の進行にともない、細胞質のシグナルが消失し, 染色体に集合する。間期では核に局在し, 有糸分

裂期には染色体の周縁部, 姉妹染色分体間, および細胞質に局在する(図3)。これより、姉妹染色分体間のコヒージョンに

関連する可能性が示唆され、細胞周期の調節に重要な蛋白質であると考えられる。

図 2 単離染色体上での FtsJ の局在図 3 RBMX の動態解析

また、RBMX –GFP遺伝子を強制的に発現させたHeLa細胞では、中期から後期で停滞する細胞が観察されたことにより、

RBMXの過剰発現によって姉妹染色分体の分離が行われず、後期への進行が阻害された可能性が考えられる。

106



■ 考察

さまざまな標本による詳細局在が可能になり、新規の染色体関連の蛋白質を同定することができる系が確立さ

れた。ただし、ポリクローナル抗体でのエピトープの違いによって、ウェスタンブロッティングでの多数の非

特異的バンドを検出した。免疫染色では、局在結果が異なる場合がみられた。技術的な課題として、ペプチド免

疫抗体を用いる場合は、抗体によって特性が大きく異なり、エピトープの選択が非常に重要である。これら特性

の差異に関して、エピトープの違いによる局在の差異、抗体の非特異的結合による要因が考えられる。

今回見つかった、RBMX は、RNA Binding Domain (RBD), K homology (KH) domain, RGG domain の 3 つの共通配列を

もつ mRNA 前駆体に結合する蛋白質であり、ヒトでは 30 の蛋白質と, そのうち 19 の遺伝子が同定されている (Elliott et al.

2004)。本研究結果から、RBMX は染色体の周縁部と姉妹染色分体間に局在し、姉妹染色分体の接着に機能し、細胞分

裂を制御する有力な染色体蛋白質の一つであると考えられた。


FtsJ homolog 3 は間期で核小体に局在し, 細菌の FtsJ と同様に ribosomal RNA methyltransferase である可能性が示唆

される (Morozova et al. 2005)。さらに、FtsJ homolog 3 の正確な局在および生化学的特性、他の蛋白質との関連性を明ら

かにする必要があると考える。機能の解明を行うには、FtsJ homolog 3 立体構造を保ち、全アミノ酸配列を有する蛋白質に

おいての抗体産生をおこなう必要性がある。cDNA による組み換え蛋白質抗体の作製とそれによる動態解析が必要であ

る。

hnRNPG や FtsJ homolog 3 といった染色体蛋白質のより詳細な解析によって, 病因の解明をはじめとする人間環境改善

に役立つ知見が得られると考える。ゲノム研究からなる莫大なデータベースを活用し, 人間生活に影響が大きい蛋白質を

絞り込む手段として, 染色体の蛋白質を解析することは有効であると考える.


1. 東恒仁 (2003) ヒト染色体・核局在蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製.大阪大学大学院工学研究科博

士前期課程論文

2. Cuvier O., Hirano T. (2003) A role of topoisomerase II in linking DNA replication to chromosome condensation. J.

Cell Bio. 160:645-655.

3. 福井希一 (2001) 染色体の分取技術の開発.染色体ディバイス研究会資料集.pp.69-77.

4. Maeshima K., Laemmli UK. (2003) A Two-Step Scaffolding Model for Mitotic Chromosome Assembly.

Developmental Cell 4: 467-480.

5. Meergans T., Albig W., Doenecke D. (1997) Varied expression patterns of human H1 histone genes in different cell

lines. DNA Cell Biol. 16:1041-1049.

6. Misteli T., Gunjan A., Hock R., Bustin M., Brown DT. (2000) Dynamic binding of histone H1 to chromation in

living cells. Nature 408: 877-881.

7. Morozova OV, Dubytska LP, Ivanova LB, Moreno CX, Bryksin AV, Sartakova ML, Dobrikova EY., Godfrey HP.,

Cabello FC. (2005) Genetic and physiological characterization of 23S rRNA and ftsJ mutants of Borrelia burgdorferi

isolated by mariner transposition. Gene 357.63-72.

8. Nakagawa M., Ohmido N., Ishikawa K., Uchiyama S., Fukui K., Azuma T. :「Diagnosis of protein-conformation and

interaction in cells by antibodies against synthetic peptides.」(in preparation)

9. Ono T., Losada A., Hirano M., Myers M P., Neuwald A.F., Hirano T. (2003) Differential Contributions of

Condensin I and Condensin II to Mitotic Chromosome Architecture in Vertebrate Cells. Cell 115: 109-121.

10. Uchiyama S, Kobayashi S, Takata H, Ishihara T, Hori N, Higashi T, Hayashihara K, Sone T, Higo D, Nirasawa T,

Takao T, Matsunaga S, Fukui K. (2005) Proteome analysis of human metaphase chromosomes. The Journal of

107



Biological Chemistry 280.16994-7004.

11. Sumner A T. (1996) The distribution of topoisomerase II on mammalian chromosomes. Chrom. Res. 4: 5-14.

■ 関連特許


該当なし


該当なし

108



■ 成果の発表


1. 原著論文による発表（査読付き）８報（筆頭著者：２報、共著者：６報）




国内誌：１報、国外誌：２報、書籍出版：冊

4. 口頭発表招待講演：０回、主催講演：２回、応募講演：１５回

5. 特許出願出願済み特許：０件（国内：０件、国外：０件）

6. 受賞件数０件


1) Kato S., Ohmido N., Fukui K.:「Development of a quantitative pachytene chromosome map in Oryza sativa by

imaging methods」, Genes Genet. Syst., 4,155-161, (2003)

2) Kitamura S., Inoue M., Ohmido N., Fukui K., Tanaka A., N., Fukui K.:「Chromosomal rearrangements in

interspecific hybrids between Nicotiana gossei Domin and N. tabacum L.」, obtained by crossing with pollen

exposed to helium ion beams or gammma-rays, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, 5,

548-552,(2003)

3) Liu H., Kawabe A., Matsunaga S., Kobayashi A., Harashima S., Uchiyama S., Ohmido N., Fukui K.:「Application

of the Bio-Active Beads Method in Rice Transformation」, Plant Biotechnology， 7, 21, 303-306．(2004)

4) Ma Y., Lee J H., Li L. C., Uchiyama S. ,Ohmido N. ,Fukui K.:「Fluorescent labeling of plant chromosomes in

suspension by FISH」, Genes. Genet. Syst., 2, 35-39．(2005)

5) Nakagawa M., Ohmido N., Ishikawa K., Uchiyama S., Fukui K., Azuma T. :「Diagnosis of protein-conformation

and interaction in cells by antibodies against synthetic peptides.」(in preparation)

6) No, D., Matsunaga, S., Uchiyama, S., Fukui, K., Azuma, T., Nakagawa, M., Ohmido, N.：Localization and

dynamics of chromosomal proteins in human cells」，(in preparation)

7) Ohmido N., Kijima K., Hoshi O., Ushiki T., Fukui K.:「Comparison of surface structures between extended and

condensed stages of barley chromosomes revealed with atomic force microscopy」, Cytologia, 70, 101-108．

(2005)

8) Ohmido N, Fukui K, Kinoshita T :「Advances in rice chromosomes research」, The Proceedings of the Japan

Academy, Series B12., 81, 382-392．(2005)

9) Sato S., Isobe S., Asazuma E., Ohmido N.: 「 Comprehensive structural analysis of genome of red

clover(Trifolium pratense L.)」, DNA research (in press)

10) Sakamoto K., Abe T, Matsuyama T, Yoshida S, Ohmido N., Fukui K., Satoh S.:「RAPD markers encoding

retrotransposable elements are linked to the male sex in Cannabis sativa L.」, Genome, 48, 931-936． (2005)



109




1) 佐藤修正, 近江戸伸子, 中村保一, 田畑哲之:「ゲノム構造解析システム」, 蛋白質核酸酵素, 8, 1828-1833,

(2004)

国外誌

1) Ohmido N., Fukui K.:「Recent advances in FISH analysis of plant chromosomes, Recent Res.Devel.Biochem., 12,

267-279, (2004)

2) Ohmido N., Fukui K.:「High-resolution fluorescence in situ hybridization (FISH) for gene mapping and molecular

analysis of rice chromosomes.」 Genetic diversity, 115-117, (2004)

書籍出版

4. 口頭発表

招待講演


1) 石丸彰子, 坂口容子, 佐藤修正, 田畑哲之, 林誠, 福井希一, 近江戸伸子：「反復配列ならびに

TAC クローンを用いたミヤコグサ染色体物理地図の作製」, 神戸, 日本育種学会第 104 回講演会, 2003.9

2) Ohmido, N., Ishimaru, A., Sakaguchi, Y., Hayashi, M., Satoh, S., Tabata, S., Fukui, K.:「High resolution

chromosome mapping of Lotus japonicus., 太田/韓国, The 2nd asian chromsome colloquium, 2004 .5

3) 石丸彰子, 田畑哲之, 佐藤修正, 林誠, 橋本雅子, 福井希一, 近江戸伸子：「FISHならびにCHIAS3

を用いたミヤコグサ定量的パキテン染色体地図の構築」, 津, 日本育種学会第 106 回講演会日本育種学会,

2004. 9

4) 農大輔, 中川強, 河邊昭, 松永幸大, 福井希一, 近江戸伸子：「植物細胞周期を通じた

Heterochromatin Protein 1 ならびにヒストン H3 メチル化の局在性」, 吹田, 日本遺伝学会第 76 会大会日本

遺伝学会, 2004. 9

5) No, D.,Nakagawa, T., Kawabe, A., Matunaga, S., Fukui, K., Ohmido N., No, D., Nakagawa, T., Kawabe, A.,

Matunaga, S., Fukui, K., Ohmido, N.：「Intercelluler dynamics of heterochromatin protein in BY-2 cell cycle.」,

横浜, International workshop Cell and Molecular Biology of Tobacco BY-2 cells BY 2, 2004.9

6) 石丸彰子, 片岡遼平, 田畑哲之, 佐藤修正, 福井希一, 近江戸伸子：「マメ科植物ミヤコグサの定量

的染色体地図と連鎖地図の統合」, つくば, 日本育種学会第 107・108 回講演会, 2005.8

7) 農大輔, 近江戸伸子：「HP1 染色体蛋白質の局在および動態」, 神戸, 第 14 回染色体コロキウム, 2005.12

8) 安部真弓, 近江戸伸子:「S6 蛋白質のエピトープと局在」 , 神戸 , 第 14 回染色体コロキウム，

2005.12

9) 石丸彰子, 近江戸伸子：「マメ科モデル植物ミヤコグサの染色体に関する研究」, 神戸, 第 14 回染色体コロ

キウム, 2005.12

10) 片岡遼平, 近江戸伸子：「アカクローバー連鎖群と染色体核型分析」, 神戸, 第 14 回染色体コロキウム,

2005.12

11) 田中美佳, 近江戸伸子:「植物培養細胞の効率的凍結保存法の確立」, 神戸, 第 14 回染色体コロキウム,

2005.12

12) 田畑哲之, 佐藤修正, 浅水恵理香, 片岡遼平, 近江戸伸子, 笹本茂美, 櫻井望, 金子貴一, 中村

110



保一, 渡邊安希子：「アカクローバーゲノムの構造解析」, 福岡, 第 28 回日本分子生物学会年会, 2005.12

13) 林原加代子, 小林昇平, 内山進, 松永幸大, 近江戸伸子, 福井希一:「間接蛍光抗体法による分裂期

染色体関連蛋白質の局在解析」, 福岡, 第 28 回日本分子生物学会年会, 2005 .12

14) No, D., Matsunaga, S., Uchiyama, S., Fukui, K., Azuma, T., Nakagawa, M., Ohmido, N.：「Localization and

dynamics of chromosomal proteins in human cells 」San Francisco/USA, The American society for cell Biology

45th Annual meeting, 2005.12

15) Ishimaru, A., Kataoka, R., Fukui, K., Sato, S., Tabata, S., Ohmido, N.:「Integration of chromosome and linkage

map of Lotus japonicus」SanDirgo/アメリカ, Plant and Animal Genome XIV Scherago International,Inc., 2006.1

16) Ohmido, N.: Chromosome research at the Nano-Era 2006., 「Localization and dynamics of chromosomal

proteins in human cell」, 東京産総研臨海副都心センター 2006.3.9

17) 近江戸伸子：「サイエンスカフェ：DNA をみる」,神戸, 酒心館,2006.5.


該当なし

6. 受賞等

該当なし

111




2.2. 単離染色体による染色体蛋白質の同定と解析

2.2.3. 染色体蛋白質の立体構造解析および相互作用解析

担当機関名研究室名大阪大学大学院薬学研究科

研究者名大久保忠恭

■ 要旨

本研究では構造生物学の手法を駆使して染色体蛋白質の立体構造決定を行い、クロマチン高次構造形成や染色体凝縮

の機構解明を行うことを目標として研究を行った。具体的には、ヒト染色体プロテオーム解析により同定された染色体蛋白

質について、その特性に合わせた大量発現系及び精製系の構築を行い、個々の蛋白質の立体構造を X 線結晶構造解析

法並びに NMR 法により決定した。併せて物理化学的測定法により関連蛋白質間の相互作用を定量的に解析した。解析の

ターゲットとする染色体関連蛋白質の選定、cDNA の取得、発現系の構築等の立体構造解析、相互作用解析を指向する

各研究はほぼ計画通りに進捗し目標達成した。

■ 目的

染色体は種々の蛋白質とDNAの複合体であるが分裂期に観察される分裂中期染色体の高次構造形成メカニズムはほとん

ど分かっていない。現在まで多くの研究者の努力にもかかわらず、立体構造の面での理解が得られているのは、染色体の基

本構造であるヌクレオソームのみである。本研究では構造生物学の手法を駆使して染色体蛋白質の立体構造決定を行い、ク

ロマチン高次構造形成や染色体凝縮の機構解明を行うことを目標とする。具体的には、ヒト染色体プロテオーム解析により同

定された染色体蛋白質について、その特性に合わせた大量発現系及び精製系の構築を行い、個々の蛋白質の立体構造をX

線結晶構造解析法並びにNMR法により決定する。併せて物理化学的測定法により関連蛋白質間の相互作用を定量的に解析

する。得られた結果と他の課題担当者が行う染色体蛋白質の網羅的同定及び細胞内での局在・動態解析の結果から、染色

体高次構造形成の分子レベルでの機構解明を行うことを目標とする。

■ 目標

① ヒト染色体プロテオーム解析により同定された染色体蛋白質について、その特性に合わせた大量発現系及び精製

系の構築

② 個々の蛋白質の立体構造の X 線結晶構造解析法並びに NMR 法による決定

③ 物理化学的測定法により関連蛋白質間の相互作用の定量的な解析


① ヒト染色体プロテオーム解析により同定された染色体蛋白質について、その特性に合わせた大量発現系及び精製

系の構築に関してはヒト由来コアヒストン蛋白質(H2A, H2B, H3, H4)、ヒストンシャペロン NAP-1、クロマチン再構成

因子 ACF1 / SNF2h 並びにコンデンシン SMC サブユニットの大量発現系及び精製系の構築を行った。

② 個々の蛋白質の立体構造をX線結晶構造解析法並びにNMR法により決定に関しては分裂期に核内で重要な役割

を果たしていると考えられる Plant and prokaryote conserved 蛋白質 (PPC)の大量発現系の構築、結晶化を行った。

結晶化条件の探索より構造解析に適した結晶が得られ高分解能回折データを収集し、電子密度マップの構築とチ

ェイントレースを行い、分解能 1.7 Å での立体構造決定に成功した。得られた PPC の立体構造のフォールディングパ

ターンは新規のものであった。

③ 物理化学的測定法により関連蛋白質間の相互作用を定量的に解析に関しては溶液中における hNAP1 の分散状態

112



を超遠心沈降速度法により調べたところ会合度が異なる複数の hNAP1 会合体が存在することが明らかとなり、会合

状態の違いにより hNAP1 の活性が制御されている可能性が示唆された。またクロマチン再構成因子 ACF1 / SNF2h

の相互作用に関与するドメインの同定と定量的な相互作用の解析を行った。

■ 研究方法

(1) 発現系構築

多層にわたるクロマチン構造の構築機構や動的挙動、遺伝子発現制御機構を原子レベルで解明するには、各構成蛋白

質を高純度で大量に得る必要がある。真核生物由来のクロマチン関連蛋白質は細胞内で様々な種類の修飾を受けている

ことが多く、また複数の蛋白質が会合し巨大な複合体を形成して機能発現するものが多いため一般に大量発現・精製が困

難である。そこで、まず本研究ではクロマチン関連蛋白質の大量発現系の構築と精製システムの構築を行った。

蛋白質の大量発現及び精製には標準的なプロトコールはないので、クローンした遺伝子を出来るだけ多くの発現系に適

用して蛋白質が発現する系を見つけることにした。発現系の構築に必要なクローニングには Invitrogen 社の Gateway シス

テムを用いた。Gateway システムでは制限酵素、リガーゼを使用せず遺伝子の転移反応を活用することにより、高い融通性、

効率、正確性でクローニングを行える。また、融合蛋白質やタグ付き蛋白質の発現系構築が容易であるため、様々な発現

系の検討が迅速に行える。遺伝子サイズが大きい時等 Gateway システムでクローニングが困難なときには従来の制限酵素

とリガーゼを使用する方法を用いた。発現系としては大腸菌発現系で GST 融合蛋白質、His-Tag 蛋白質、Thioredoxin 融

合蛋白質、Intein 融合蛋白質として発現させた。またバキュロウィルス発現系では SF9 細胞，Tn6 細胞を用いて FLAG-Tag

蛋白質として発現させた。以下に大腸菌の系で制限酵素とリガーゼを用いた hSNF2h の C 末ドメインの発現系構築及び蛋

白質精製の手順を示す。

1．hSNF2h C 末ドメイン(アミノ酸残基番号 737-1051、分子量 37.5 kDa)をコードする遺伝子を RT-PCR プライマーに関

してフォーワードプライマーに Xho I、リバースプライマーに Nco I の制限酵素部位を含むように設計した。

2．PCR 産物と、pET42b+ベクターを Nco I / Xho I 部位により切断し、ライゲーションによって、pET42b+ベクターに

hSNF2h C 末ドメインをコードする遺伝子を組み込んだ。

3．大腸菌 DH5α に形質転換しコロニーPCR で hSNF2h C 末ドメインの組み込まれた株を選別した。

4．大腸菌 BL21(DE3)で発現させ菌体を超音波破砕した後、遠心機により上清画分を回収した。

5．SDS-PAGE により hSNF2h C 末ドメイン-GST 融合蛋白質の発現を確認した。

6．GST カラムにより精製し蛋白質分解酵素(スロンビン)処理により hSNF2h C 末ドメインを単離精製した。

上記手順によりこれまでに、コアヒストン蛋白質、NAP-1、hACF1、hSNF2h、SMC-C、SMC-D、PPC 及びそのフラグメントの

発現系の構築を行ってきた。

(2) Ｘ線結晶構造解析

1) 結晶化

蛋白質のＸ線結晶構造解析を行う際、初にして大の難関は結晶化である。しかし、結晶化条件は用いる沈殿剤や緩

衝液の種類、pH、温度など多種多様なファクターにより無限に存在する。結晶化条件の探索を迅速かつ効率的に行うため

スパースマトリックス法を用いた 2)。結晶化の初期スクリーニングでは Hampton Research 社の Crystal Screen I, Crystal

Screen II, PEG/ION、Emerald Biostructure 社の Wizard I, Wizard II, Cryo I, Cryo II,、Jena Bioscience 社の JB Screen を

用いて約700種類の結晶化条件を試してみて、微結晶等が析出したものに対しては細かくpH、温度、濃度を変化させて結

晶化条件の適化を行った。また、蛋白質の純度も結晶化の成否を決める大きなファクターであるので、SDS ポリアクリルア

ミドゲル電気泳動でほぼ単一であることを確かめた後に結晶化を行った。さらに結晶化溶液中で蛋白質が単分散状態であ

ることを動的光散乱装置 DynaPro-MS/X を用いて調べた 3)。

2) 測定と解析

Ｘ線回折データの測定は試料吹付低温装置を備えたリガク社製イメージングプレートＸ線回折装置 R-AXIS IV++で行った。

大型イメージングプレート、Confocal ミラー光学系等により R-AXIS IV++では、分解能 1.7 Å 以上の高分解能回折データが

113



得られた。蛋白質結晶が小さい場合等では高エネルギー加速器研究機構の BL6A ビームラインや大型放射光施設

Spring-8 の BL41XU ビームラインで測定を行った。1.0 mm クライオループを用いてゴニオメーターに蛋白質結晶を置き、カ

メラ長 170 mm で試料吹付低温装置により結晶を-165 oC に冷却して測定を行った。

得られた回折データは HKL パッケージの DENZO と SCALEPACK ソフトウェアを用いて回折ピークの指数付け、積分強

度の算出、各測定データのスケーリングを行った。分子置換法を用いる場合は AMoRe ソフトウェアを用いた。電子密度マッ

プのチェイントレースと立体構造の精密化には X-PLOR と TOM ソフトウェアを用いた。重原子同型置換法を用いる場合に

は位相決定を Sharp/auto Sharp ソフトウェアで解析し差バターソンマップで確認した。DM ソフトウェアによる溶媒平滑化後、

得られた初期電子密度マップに対して FFFear ソフトウェアによるフラグメントサーチを行い、poly-Ala モデルでの初期構造

モデルを構築した。初期モデルは Refmac ソフトウェアによってリファインした。

■ 研究成果

ヒト染色体プロテオーム解析により同定された染色体蛋白質について発現・精製系の構築を行った。その結果、様々な

レベルの染色体高次構造形成（ヌクレオソーム形成～凝縮染色体形成）に関与する蛋白質の発現系を揃えることに成功し

た。さらに大量に取得できた蛋白質に関しては X 線結晶構造解析法による立体構造決定と超遠心分析法等よる蛋白質間

の定量的相互作用解析に成功した(1)。またクロマチン関連蛋白質のような巨大生体分子複合体の X 線結晶構造解析の

手順を確立した(2)。個々のターゲット蛋白質に関しては下記に箇条書きにした。

(1) hACF1 / hSNF2h：ヌクレオソーム再構成因子 hACF1, hSNF2h 及びそのドメインをバキュロウィルスまたは大腸菌の系

で発現させることに成功した。hSNF2h C 末ドメイン、hACF1 BAZ ドメインは大腸菌の系で大量に試料が得られた。CD スペ

クトル解析より、ヌクレオソーム結合に関与する hSNF2h C 末ドメインの２次構造は主に α ヘリックスであることが示された。

(2) コンデンシン：凝縮染色体形成に関与するコンデンシンのサブユニット hCAP-C、hCAP-D2、hCAP-E のドメインを大

腸菌の系で発現させることに成功した。hCAP-D2 の N 末ドメインは可溶化した状態で大量に試料が得られた。hCAP-D2

の N 末ドメインの精製条件の探索を進めた。

(3) PPC：分裂期に核内で重要な役割を果たしていると考えられる PPC 蛋白質の大量発現系の構築、結晶化を行った。

結晶化条件の探索より構造解析に適した結晶が得られ高分解能回折データを収集し、電子密度マップの構築とチェイント

レースを行い、分解能 1.7 Å での立体構造決定に成功した。得られた PPC の立体構造のフォールディングパターンは新規

のものであった 1)。

(4) コアヒストンとhNAP1：コアヒストンH2A, H2B, H3, H4とヒストンシャペロンhNAP1の大量発現系の構築に成功した。CDス

ペクトル解析からhNAP1のコア領域が主にαヘリックス構造より形成されていることが示された。溶液中におけるhNAP1の分散

状態を超遠心沈降速度法により調べたところ会合度が異なる複数のhNAP1会合体が存在することが明らかとなり、会合状態の

違いによりhNAP1の活性が制御されている可能性が示唆された。

■ 考察

染色体の高次構造は転写制御や癌化に深く関与しているため、染色体高次構造形成に関わる蛋白質の立体構造と相

互作用様式を明らかにすることによりその機構を解明できると期待される。特に本研究では様々なレベルの染色体高次構

造形成（ヌクレオソーム形成～凝縮染色体形成）に関与する蛋白質の発現系を揃えることに成功しており、従来、個別のレ

ベルでしか行われてなかったこの分野の研究に対して各レベル間の連携も含めた総合的な染色体高次構造形成機構の

解明を進めることができる。


蛋白質を大量に高純度に得る体制が確立される事により、種々の波及効果がある。本研究担当者が行う立体構造決定

や相互作用解析に用いることができるのみならず、これらの蛋白質を利用した生化学、分子生物学的手法による解析も大

きく進展させることが出来る。染色体高次構造形成機構が明らかとなればM期における染色体分配の機構を分子レベルで解

明する糸口が得られると共に広く細胞周期の制御機構の理解が進み、高等生物の遺伝子発現を人工的に抑制する手法の開

114



発が期待できる。


1) L. Lin, H. Nakano, S. Uchiyama, S. Fujimoto, S. Matsunaga, S. Nakamura, Y. Kobayashi, T. Ohkubo, K. Fukui：

「Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a conserved domain in plants and prokaryotes from

Pyrococcus horikoshii OT3.」Acta Cryst., F61, 414-416 (2005)

2) D.N. Wilson, F. Schluenzen, J.M. Harms, T. Yoshida, T. Ohkubo, R. Albrecht, J. Buerger, Y. Kobayashi, & P.

Fucini, ：「X-ray crystallography study on ribosome recycling: The mechanism of binding and action of RRF on the

large subunit」, EMBO J. 24, 251-260 (2005)

■ 関連特許

該当なし

115



■ 成果の発表


1. 原著論文による発表（査読付き） 9 報（筆頭著者： 0 報、共著者： 0 報）




国内誌： 0 報、国外誌： 0 報、書籍出版： 0 冊

4. 口頭発表招待講演： 3 回、主催講演： 1 回、応募講演： 2 回

5. 特許出願出願済み特許： 0 件（国内： 0 件、国外： 0 件）



1) Takashima H, Mimura N, Ohkubo T, Yoshida T, Tamaoki H. and Kobayashi Y. ：「Distributed computing and NMR

constraint-based high-resolution structure determination: applied for bioactive Peptide endothelin-1 to determine

C-terminal folding」,J Am Chem Soc. 126, 4504-4505. (2004)

2) Takinowaki, H. Matsuda, Y. Yoshida, T. Kobayashi, Y. Ohkubo, T. ：「1H, 13C and 15N resonance assignments of

the N-terminal 16kDa domain of Escherichia coli Ada protein」, J. Biomol. NMR, 29, 447-448 (2004)

3) S. Oka, Y. Shiraishi, T. Yoshida, T. Ohkubo, Y. Sugiura and Y. Kobayashi ：「NMR Structure of Transcription

Factor Sp1 DNA Binding Domain」 , Biochemistry, 43, 16027-16035 (2004)

4) D.N. Wilson, F. Schluenzen, J.M. Harms, T. Yoshida, T. Ohkubo, R. Albrecht, J. Buerger, Y. Kobayashi, & P.

Fucini, ：「X-ray crystallography study on ribosome recycling: The mechanism of binding and action of RRF on the

large subunit」, EMBO J. 24, 251-260 (2005)

5) Nishi Y, Uchiyama S, Doi M, Nishiuchi Y, Nakazawa T, Ohkubo T, Kobayashi Y. ：「Different effects of

4-hydroxyproline and 4-fluoroproline on the stability of collagen triple helix」, Biochemistry, 44, 6034-6042

(2005)

6) Takashima H, Yoshida T, Ishino T, Hasuda K, Ohkubo T, Kobayashi Y.：「Solution NMR structure investigation

for releasing mechanism of neocarzinostatin chromophore from the holoprotein」, J Biol Chem.，280, 11340-11346．

(2005)

7) N. Kasai, Y. Mizushina, H. Murata, T. Yamazaki, T. Ohkubo, K. Sakaguchi, F. Sugawara. ：

「Sulfoquinovosylmonoacylglycerol inhibitory mode analysis of rat DNA polymerase beta.」，FEBS J., 272,

4349-4361 (2005)

8) L. Lin, H. Nakano, S. Uchiyama, S. Fujimoto, S. Matsunaga, S. Nakamura, Y. Kobayashi, T. Ohkubo, K. Fukui.：

「Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a conserved domain in plants and prokaryotes

from Pyrococcus horikoshii OT3.」，Acta Cryst., F61, 414-416 (2005)

9) S. Ichiki, S. Nakamura, T. Ohkubo, Y. Kobayashi, J. Hasegawa, S. Uchiyama, H. Nishihara, K. Mizuta and Y.

Sambongi.：「Cloning, expression, crystallization and preliminary X-ray characterization of cytochrome c552 from a

moderate thermophilic bacterium, Hydrogenophilus thermoluteolus.」 Acta Cryst.. F61, 395-398 (2005)


該当なし

原著論文以外による発表（レター、レビュー、書籍出版等）

116



該当なし

国外誌

該当なし

書籍出版

該当なし

3. 口頭発表

招待講演

1) 分子研研究会「生体金属分子科学の展望」“大腸菌DNA 修復蛋白質Ada のZn 配位Cys38 メチル化による転

写制御機構” (2004年10月) 岡崎

2) 蛋白研セミナー "再生過程リボソーム複合体の立体構造決定と新規抗菌剤への展開" (2006年3月) 大阪


1) 藤田裕子、Mariana A. Petkova、中村昇太、中野博明、内山進、福井希一、小林祐次、大久保忠恭「クロマチ

ンリモデリング因子ACF1/SNF2hの発現系構築とドメイン構造解析」 2004年10月23日日本生化学会近畿支部

2) 林麟晏、藤本聡、中村昇太、中野博明、内山進、松永幸大、大久保忠恭、小林祐次、福井希一「超好熱菌由

来ＰＰＣ蛋白質の結晶構造解析」 2005年 6月30日ー7月2日福岡国際会議場

3) Tadayasu Ohkubo, International Symposium : Chromosome Research at the Nano-Era 2006 “Interaction of

chromosomal proteins, chromatin-remodeling factor and condensin” (2006年3月) 東京


該当なし

5. 受賞等

該当なし

117





2.2.4. 染色体蛋白質の網羅的同定および機能解析

担当機関名研究室名東京理科大学生命科学研究所東研究室

研究者名東隆親

■ 要旨

染色体蛋白質の網羅的な解析により、染色体上への局在が明らかにされた染色体蛋白質に対するウサギポリクローナル

抗体の作製を行った。本研究室で作製した抗体を用いてウエスタンブロッティングや免疫沈降、免疫染色が可能であった。

特に、数種類の抗体で染色体上に存在する蛋白質を鮮明に染色することが可能であるなど非常に親和性が高い抗体を作

製することに成功した。これら親和性の高い抗体の作製により、様々な生化学実験的手法を用いることが可能になった。その

中で特に興味深い結果が得られた抗コンデンシンサブユニット（hCAP-G, hCAP-E, hCAP-D3）に対する抗体を産生したウ

サギの脾臓あるいは骨髄細胞からイーストディスプレイ法を用いてモノクローナル抗体を作製することを試みた。その結果、

脾臓と骨髄から得られたモノクローナル抗体を比較すると、骨髄から抗原結合性、特異性が高いscFv発現イーストが得られる

ことがフローサイトメーターの解析から判明した。これまでハイブリドーマ作製では、脾臓細胞のみが対象であったが、今後は

骨髄細胞を検討する必要があることが明らかとなった。

■ 目的

染色体高次構造に関連する染色体蛋白質について組替え体を調整し、これらを用いて、各種染色体蛋白質間における

相互作用の解析を生化学的かつ網羅的に行うことを目的とする。特に RNAi などを用いた研究から細胞周期特異的に染色

体または核の異常が見られた蛋白質についてポリクローナル抗体を作製し、細胞内での局所解析を行うメンバーに提供す

る。プロテオーム解析により同定される複数の蛋白質について組替え蛋白質または合成ポリペプチドを用いてポリクロー

ナル抗体を作製し、細胞内での局在解析を行うメンバーに提供する。また、イーストディスプレイ法を用いたウサギモノクロ

ーナル抗体作製法の開発もあわせて行う。ウサギモノクローナル抗体を迅速に作製する方法を開発することにより、未知の

蛋白質の局在解析等がよりすばやく、かつ迅速に行えるような系を確立する。終的にはこれらの抗体を基軸抗体として、

蛋白質高次複合体中の各タンパク質のトポロジカルな関係を解明する。

■ 目標

① ウサギモノクローナル抗体作製

② マウスモノクローナル抗体作製

③ ウサギポリクローナル抗体作製


① 染色体上に局在すると考えられる蛋白質の部分ペプチドを合成、または組替え体を作製し、それらを抗原としてウサ

ギの免疫を行った。免疫したウサギの脾臓と骨髄細胞から抗体可変部領域の遺伝子を取り出し、イーストディスプレ

イ法を用いてモノクローナル抗体の作製を行った。その結果、骨髄由来の細胞から作製した抗体は、特異性が高く、

非常に有用的であることが明らかとなった。

② 大腸菌で発現させた蛋白質を用いてマウスに免疫を行い、モノクローナル抗体の作製を行った。その結果、IgG では

なく、IgM のモノクローナル抗体が得られた。

③ 染色体上に局在すると考えられる蛋白質の部分ペプチドを合成、または組替え体を作製し、それらを抗原としてウサ

118



ギの免疫を行った。まず、免疫に用いるキャリヤーおよび抗原性を持つ部位の選定法を確立するために、リボソーマ

ル蛋白質である S6 をモデルとしてポリクローナル抗体の作製を行った。その結果、抗原として用いる部位により、染

色の程度などが異なることが分かった。この方法をもとに種々のポリクローナル抗体を作製した。作製したポリクロー

ナル抗体は精製後、班員に提供した。本研究室で作製した抗体を用いてウエスタンブロッティングや免疫沈降、免

疫染色が可能であった。特に、数種類の抗体で染色体上に存在する蛋白質を鮮明に染色することが可能であるな

ど非常に親和性が高い抗体を作製することに成功した。

■ 研究方法

ペプチド免疫法を確立するために、リボソームタンパク質 S6 をモデルとしてエピトープに適な部位の探索およびキャリ

ヤーの選定を行った。抗原とするペプチドは N 末端もしくは C 末端にシステイン残基を付加するようペプチド合成機により

合成し、そのシステインを介してキャリヤーとジスルフィド結合させた。それを用いてウサギに免疫を行い、血清の力価から

ポリクローナル抗体の結合親和性を決定した。また、大腸菌による S6 な大量発現系を構築し、得られた S6 を用いてマウス

モノクローナル抗体もあわせて作製した。S6 の結果を基に、種々の染色体蛋白質をターゲットとして抗ペプチド抗体を作製

し班員に提供した。次に、ウサギモノクローナル抗体を作製するために、これらの中で、特に興味深い結果が得られた抗コ

ンデンシンサブユニット（hCAP-G, hCAP-E, hCAP-D3）に対する抗体を産生したウサギの脾臓あるいは骨髄細胞からモノク

ローナル抗体を作製することを試みた。これには、従来から用いられているモノクローナル抗体作製法であるハイブリドーマ

法と平行して、イーストディスプレイ法を用いた (図 1)。この方法は、免疫したウサギの脾臓および骨髄細胞から mRNA を

抽出し、これより single-chain Fv (scFv) 発現ベクターを構築してイースト表面に発現するという手法である。特徴としては、

目的とする scFv を発現するイーストを、抗原でコートしたマグネットビーズで濃縮し、フローサイトメーターで分取することが

できる点である。

HA-Tag

c-myc-TagscFv

antigen

PE

FITC

酵母

AGA2

AGA1

S S

S S

図－１イーストディスプレイ法

酵母表面に存在するAGA1とジスルフィド結合するAGA2のC末端側に解析用タグとともにscFvを共発現させた。タグを認識する抗体、及

び蛍光標識した抗原を用いてフローサイトメーターにより解析を行う。

そこで我々は、hCAP-G, hCAP-E, hCAP-D3を免疫したウサギの脾臓と骨髄細胞を取り出し、抗体可変部領域の遺伝子

を増幅したところ、脾臓、骨髄の両方からscFvを作製することができた。そこでこれらのscFvを酵母表面に発現させ、マグネッ

トを用いたMACSによる濃縮と、フローサイトメーターによる目的酵母の単離を行った。その後、得られた酵母をプレートにまき、

シングルコロニーにすることでモノクローナル抗体を作製した。脾臓と骨髄から得られたモノクローナル抗体を比較すると、骨

髄から抗原結合性、特異性が高いscFv発現イーストが得られることがフローサイトメーターの解析から判明した (図2)。これま

でハイブリドーマ作製では、脾臓細胞のみが対象であったが、今後は骨髄細胞を検討する必要があることが分かった。さらに

遊離のscFvをイースト細胞内に高発現させて回収する作業を行った。

119



hCAP-G hCAP-E hCAP-D3 BSA

脾臓SP

脾臓DP

骨髄DP

抗原

c-myc

100 101 102 103 104100

101

102

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100

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100

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100

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100

101

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100 101 102 103 104 100 101 10 2 103 104

100

101

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103

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100 101 102 103 104

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100 101 10 2 103 104 100

101

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103

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10 0 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

100

101

102

103

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100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100

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100 101 102 103 104 100

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103

104

100 101 102 103 104

活性測定抗原

図－2 モノクローナル抗体のフローサイトメーターによる解析

骨髄より得られたクローンは、抗原結合性、抗原特異性ともに非常に優れていた。

■ 研究成果

染色体上に局在する蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体を作製し、その機能と局在の関係を明らかにした。1, 2)

また、ウサギポリクローナル抗体により、新規な蛋白質のウエスタンブロッティングや免疫染色による機能解析が可能にな

った。さらにイーストディスプレイ法によりウサギモノクローナル抗体を作製することに成功した。

■ 考察

S6 に対する抗体作製結果から、キャリヤーには BSA を用いるほうが力価の高い抗体ができやすく、抗原として選択する

部位により得られる染色結果の質が異なることが分かった。そこでこの結果をもとに種々のポリクローナル抗体を作製したと

ころ、ウエスタンブロッティング、免疫染色等に使用できる力価の高い抗体を作製することに成功した。また、ウサギモノクロ

ーナル抗体の作製では、イーストディスプレイ法を用いることで、限界希釈法などを用いずに、MACS や FACS といった簡

便な方法でモノクローナル抗体を発現する酵母を選択することが出来た。そして、その解析結果から、従来からハイブリド

ーマ法などで用いられる脾臓細胞を使用するより骨髄細胞から抗体を作製したほうが特異性の高い抗体が作製できること

が示唆された。これは、骨髄にメモリーB 細胞やプラズマ細胞など、抗原に対する親和性が十分に高くなった細胞がいるた

めと考えられる。


染色体蛋白質の局在や機能を調べるために十分なアフィニティを持つポリクローナル抗体を作製することができた。しか

し、ポリクローナル抗体は血清がなくなると尽きてしまうので、モノクローナル抗体の迅速な作製法の開発が望まれる。この

点を克服するためにイーストディスプレイ法を導入し、ウサギモノクローナル抗体の作製法を開発した。その結果、従来のハ

イブリドーマ法では使用することの出来なかった骨髄由来の B 細胞を用いることにより、特異性の高い抗体を scFv として酵

母の表面に発現することが出来た。今後は、遊離の scFv の大量発現系を構築し、抗体の機能評価を行う。また、染色体上

の蛋白質の機能解析をするために、scFv の細胞内発現を行うことで標的蛋白質の機能解析を行う。

120




Fujimoto, S., Matsunaga, S., Yonemura, M., Uchiyama, S., Azuma, T., Fukui, K.：「Identification of a novel plant MAR DNA

binding protein localized on chromosomal surfaces」， Plant Mol. Biol. 56，225-239．(2004).

Higashi T, Miyakawa S, Uchiyama S, Matsunaga S, Takata H, Fujimoto S, Noda M, Terauchi A, Shimizu T, Oda M, Azuma

T, Fukui K.：「Generation of monoclonal antibodies against chromosomal antigens that have a high sequence similarity

between human and mouse」，J Biotechnol. 120，262-72．(2005).

■ 関連特許


該当なし


該当なし

121



■ 成果の発表










1. 原著論文による発表

1) Tobita, T., Oda, M., Morii, H., Kuroda, M., Yoshino, A., Azuma, T., Kozono, H.：「A role of P1 anchor residue

for the thermal stability of MHC class II molecule I-Ab」， Immunol. Letters, 85， 47-52. (2003)

2) Sato, E., Hirahasa, K., Wada, Y., Yoshimomi, T., Azuma, T., Matsuoka, K., Kubo, S., Taya, C., Yonekawa, H.,

Karasuyama, H., Shiraishi, A.：「Chronic inflammation in skin can be induced in IgG transgenic mice by a single

challenge of multivalent antigen」， J. Allergy Clinic. Immunol.., 111， 143-148. (2003)

3) Saito, K., Sarai, A., Oda, M., Azuma T., Kozono, H.：「Thermodynamic analysis of the increased stability of

major histocompatibility complex class II molecule I-Ek complexed with antigenic peptide at an acidic pH 」，J.

Biol. Chem., 278， 14732-14738. (2003)

4) Oda, M., Kozono, H., Morii, H., Azuma, T.：「Evidence of allosteric conformational changes in the antibody

constant region upon antigen binding」， Int. Immunol.,. 15， 417-426. (2003)

5) Sagawa, T., Oda, M., Ishimura, M., Furukawa, K., Azuma, T.：「Thermodynamic and kinetic aspects of

antibody evolution during the immune response to hapten」， Mol. Immunol,. 39，801-808. (2003)

6) Shimizu, T., Oda, M., Azuma, T.：「Estimation of the relative affinity of B cell receptor by flow cytometory」，

J. Immunol. Methods, 276，33-44. (2003)

7) Shimizu, T., Shinkai, Y., Ogi, T., Ohmori, H., Azuma, T.：「The absence of DNA polymerase does not affect

somatic hypermutation of the mouse immunoglobulin heavy chain gene」， Immunol. Letters, 86， 265-270.

(2003)

8) Tobita, T., Oda, M., Azuma, T.：「Segmental flexibility and avidity of IgM in the interaction of polyvalent

antigens」， Mol. Immunol., 40, 803-811. (2004).

9) Fujimoto, S., Matsunaga, S., Yonemura, M., Uchiyama, S., Azuma, T., Fukui K.：「Identification of a novel

plant MAR DNA binding protein localized on chromosomal surfaces」， Plant Mol. Biol., 56， 225-239 (2004).

10) M. Oda, N. Sato-Nakamura, T. Azuma. ：「 Molecular characterization of monovalent and multivalent

hapten-protein conjugates for analysis of the antigen-antibody interaction」， Anal. Biochem., 333， 365-371．

(2004)

11) Yamamoto, M., Nojima, T., Hayashi, K., Goitsuka, R., Furukawa, K., Azuma, T., Kitamura. D. ：

「BASH-deficient mice:limited primary repertoire and antibody formation, but sufficient affinity maturation and

memory B cell generation, in anti-NP response」，Int. Immunol., 16， 1161-1171．(2004)

12) Furukawa, A., Furukawa, K., Azuma. T.：「A landscape for the dynamics of an immune response」，Biochem.

Biophys. Res. Comm., 319， 469-478．(2004)

13) Shimizu, T., Kozono, Y., Kozono, H., Oda, M., Azuma, T.：「Affinity maturation of secreted IgM pentamers on B

122



cells」， Int. Immunol., 16， 675-684．(2004)

14) Sugiyama, S., Kohyama, M., Oda, M., Azuma, T., Wither, J.E., Hozumi. M.：「Molecular basis of antigen

recognition by insulin specific T cell receptor」，Immunol. Letters. 91， 133-139. (2004)

15) Saito, K., Oda, M., Sarai, A., Azuma, T., Kozono. H.：「Bound peptide-dependent thermal stability of major

histocompatibility complex class II molecule I-Ek」，Biochemistry, 43， 10186-10191．(2004)

16) Sagawa, T., Oda, M., Morii, H., Takizawa, H., Kozono, H., Azuma, T.：「Conformational changes in the

antibody constant domains upon hapten-binding」， Molec. Immunol., 42， 9-18．(2005)

17) Shimizu, T., Azuma, T., Ishiguro, M., Kanjo, N., Yamada, S., Ohmori, H.：「Normal immunoglobulin gene

somatic hypermutation in Polk-Polyi double-deficient mice」， Immunol. Letters， 98，259．(2005)

18) Masuda, K., Ouchida, R., Takeuchi, A., Satito, T., Koseki, H., Kawamura, K., Tagawa, M., Tokuhisa, T.,

Azuma, T., O-Wang, J.：「DNA polymerase Ө contributes to the generation of C/G mutations during somatic

hypermutation of Ig genes」， Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102，13986．(2005)

19) Higashi, T., Miyakawa, S., Uchiyama, S., Matsunaga, M., Takata, H., Fujimoto, S., Noda, N., Terauchi, A.,

Shimizu, S., Oda, O., Azuma, T., and Fukui, K.：「Generation of monoclonal antibodies against chromosomal

antigens that have a high sequence similarity between humans and mice」， J. Biotechnology， 120, 262-72．

(2005).

20) Oda, M., Uchiyama, S., Robinson, C.V., Fukui, K., Kobayashi, Y., Azuma, T.：「Regional and segmental

flexibility of antibodies in interaction with antigens of different size」， FEBS J., 273， 1476-1487．(2006).


該当なし



国外誌

書籍出版

4. 口頭発表

招待講演

該当なし


1) 中川将利、岡谷理恵子、東隆親、イーストディスプレイ法を用いたモノクローナル抗体作製法の開発、京都、日本

生物物理学会第 42 回年会、2004、12、15

2) 中川将利、東隆親、イーストディスプレイ法を用いたウサギ抗体作製法の開発、札幌、日本生物物理学会第 43 回

年会、2005、11、25


該当なし

6. 受賞等

該当なし

123





2.3.1. オンチップ染色体ソーターの開発

担当機関名研究室名独立行政法人産業技術総合研究所ナノテクノロジー研究部門

研究者名井上貴仁

■ 要旨

本研究課題では、染色体ナノ情報解析ツールの開発を目的として、チップスケールで染色体の選別を実現するオンチッ

プ染色体ソーターの開発を行った。表面処理、輸送、選別、検出などの各要素技術の開発と安価で使い捨て可能なデバ

イスの適な作製プロセスの検討を行い、その成果について報告する。染色体ソーターの開発に必要な要素技術となる電

圧変調法と既存の電気泳動法との組み合わせた染色体ソーターを試作し、グリセロールマトリックス中においてスイッチン

グ操作と電圧変調で染色体の選別を手動で行った。また、選別のスイッチング操作を自動化する試みとして 2 対のマイクロ

電極をソーターチップの流路内に組み込み、交流インピーダンス法により個々の染色体を高感度に電気的に検出する技

術を開発した。さらに、選別の高速化と効率化を目指して、磁場を用いたフローソーターのプロトタイプを開発し、大阪大学

でグリセロール密度勾配遠心により単離したヒト染色体を実際に用いて選別に成功した。

■ 目的

チップスケールで高効率化と高速化を実現するバイオ・化学分析システムの開発を目標に、半導体微細加工技術を応

用したマイクロ流体デバイス（マイクロフルイディクス）の開発を進めている。このマイクロフルイディクスは、フォトリソグラフィ

ーにより、小さな（数十ミリメートル角程度の）半導体やガラスチップに直径数１０マイクロメートル以下の流路をネットワーク

状に形成したもので、これにサンプルの輸送、選別、検出などの機能を作り込むことにより、小のサンプル量で高効率か

つ高速に検査・解析を行うものである。

本研究課題では、染色体ナノ情報解析ツールの開発を目的として、第Ⅰ期で開発したマイクロ流路を用いた染色体個

別の輸送技術をさらに発展させ、チップスケールで高速かつ高効率に染色体の選別を実現するオンチップ染色体ソータ

ーの開発を行う。そのために、輸送、選別、検出などの各要素技術の高性能化と安価で使い捨て可能なデバイスの適な

作製プロセスの検討を行う。具体的には、

①染色体とマイクロ流路材料間の凝着力を低減し、選別後の回収効率を上げるため、適な表面処理技術を開発す

る。

②電圧変調法を高度化することにより染色体ソーテイングを実現する。

③選別プロセスを高速かつ高感度で評価するために、染色体チップソーター用の電気による検出技術を開発する。

④研究開発あるいは臨床検査現場での使用を念頭に、安価で使い捨て可能なマイクロ流路材料の選択と作製プロセス

の検討を行う。

そして、終的には、染色体の操作技術を確立し、ゲノムの高次機能解析・操作法の開発を目的とする。ここで開発する

染色体ソーターは、研究全体のテーマであるナノデバイス開発に必要なハードウエアの主要技術として位置づけられる。

■ 目標

染色体ナノ情報解析ツールの開発を目的として、チップスケールで染色体の選別を実現するオンチプの染色体ソータ

ーの開発を行う。そのために、輸送、選別、検出などの各要素技術の高性能化と安価で使い捨て可能なデバイスの適な

作製プロセスの検討を行う。具体的には、

①染色体とマイクロ流路材料間の凝着力を低減し、選別後の回収効率を上げるため、適な表面処理技術を開発する。

②電圧変調法と既存の電気泳動法を組み合わせた操作法を用いて染色体ソーテイングを実現する。

③選別プロセスを高速かつ高感度で評価するために、染色体チップソーター用の電気による検出技術を開発する。

124



④研究開発あるいは臨床検査現場での使用を念頭に、安価で使い捨て可能なマイクロ流路材料の選択と作製プロセスの

検討を行う。


①生体膜類似表面を構築できるリン脂質極性基を側鎖に有する 2-メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン(MPC)ポリマ

ーを用いて流路内壁を表面処理することによって染色体の表面吸着を抑制できることを示した。

②電圧変調法と既存の電気泳動法を組み合わせた操作法を用いて染色体のソーテイングに成功した。

③分子検出機構もチップ上で実現し、システム全体を小型化するために、染色体チップソーター内に分子検出用のマイク

ロ電極アレイを作り込むプロセスを検討し、インピーダンスなどの電気物性測定による単一染色体分子の検出に応用した。

④研究開発あるいは臨床検査現場での使用を念頭に、安価で使い捨て可能なマイクロ流路材料を選択し、新規な作製プ

ロセスを提案した。

■ 研究方法

（１）ポリマー製マイクロ流路の作成

マイクロコンタクトプリンテイング（μCP）で使用される材料を用いた、安価で使い捨て可能なポリマーマイクロ流体デバイ

スの作製についてそのプロセスを報告する。μCP は、サブマイクロメートルの微細な構造を有するスタンプを作製する技術

として注目されている。この方法の特徴は、鋳型（マスター）さえ作製しておけば同じ構造物を何度でもわずか一工程で作

製可能であり、デバイス作製の大幅なコストダウンを図れる点にある。図１にポリマーマイクロ流体デバイスの作製プロセスを

簡略的に示す。このプロセスでは、まず、はじめに光リソグラフィープロセスにより、スタンプの鋳型となる微細構造を厚膜フ

ォトレジストで作製し、それをマスターとしてポリマー流路を形成する。以下にこのプロセスの詳細について述べる。

①光リソグラフィーにより流路の鋳型を厚膜フォトレジストで作製する。厚さ約 20-30μm のネガ型厚膜フォトレジスト

（THB120N、JSR 製）をスピンコートし、マスクレス任意パターン転写装置を用いて、MS パワーポイントにより作製したパター

ンを高精度でレジストに転写する。現像は専用現像液 TMAH （JSR 製）を純水で 50 倍に希釈後使用する。

②この鋳型にシリコンエラストマー（Silpot184、ダウコーニング）と硬化剤（Sylgard184 Curing Agent、ダウコーニング）を

流し込み、ポリジメチルシロキサン(PDMS)流路を形成する。ホットプレート上で６５℃、1 時間硬化後、PDMS を鋳型からはが

してアセトン、エタノールで洗浄する。

③PDMS 表面を親水性にするために、６０℃に過熱した 0.01wt％塩酸で 40 分間表面処理を施す。別途作製した電極付

ガラスプレートに貼り合わせる。

④ 後にチップキャリーにマウントしワイヤーボンディングを施して完成する。

図 1 ポリマーマイクロ流体デバイスの作製プロセス

125



（２）染色体試料の調整

ヒト染色体試料は、大阪大学福井研内山先生のグループより供給されたものを使用した。コルセミドにより分裂期に同調

した HeLa S3 細胞を、低張処理後、ポリアミンバッファー中でホモジナイズすることにより破砕し、遠心にて染色体を 60%グリ

セロールクッションに回収した。ポリアミン溶液（×４溶液）の組成は、Tris-Cl 15mM pH7.4 80mM KCl, 2mM EDTA-KOH

pH7.4, 0.2mM spermine, 0.5 mM spermidine、Empigen またはジギトニンを加え、0.45μm のフィルターで滅菌し、４℃で保

存したものを使用した。ヒト染色体試料は、YOYO-1 で蛍光染色した後、観察に使用した。エタノール 100μl に YOYO-1

を適量加え染色液を調製した。染色体の懸濁されている固定液 20μl に蛍光染色液 10μl を加え軽く混和させた後観察に

用いた。

（３）流路内マイクロ電極によるインピーダンス計測

インピーダンスを計測する手法は大別すると従来のアナログ方法とデジタル方式とに分けられる。アナログ方式としては

ブリッジ法と位相弁別法が知られている。ブリッジ法は４つの RC 素子を各辺としたホイートストーンブリッジの平衡点を求め、

その平衡条件から測定セルのインピーダンスを求める手法である。この測定手法は計測精度は高いが、測定時間が長く周

波数範囲も狭いという欠点を持つ。一方、位相弁別法は、ロックインアンプを用いて測定セルへの入力信号に対する応答

信号の振幅と位相差のずれを検出する方法である。この手法は短時間での測定と自動化に適しており、また、測定感度も

高い。本課題では、この位相弁別法を用いて流路セルのインピーダンスを計測した。計測の構成を図 2 に示す。電極間に

は周波数 1kHz、100-200mVpp の正弦波電圧を印加し、応答信号の振幅と位相をロックインアンプを用いて 10-100 ミリ秒

の時定数で計測した。ロックインアンプからの振幅と位相の信号は AD コンバーターによりノート PC に取り込み解析を行っ

た。

図 2 位相弁別法を用いた流路セルのインピーダンス計測の構成図と等価回路

（４）生体適合材料による付着の抑制

生体超分子をマイクロ流路内で長時間、選別あるいは操作するためには流路内壁へのサンプルの付着を抑制すること

が必要となる。特に、本課題で扱う染色体は凝着力が強く、容易に流路内壁に張り付き、輸送、選別を困難にする。そこで、

生体膜類似表面を構築できるリン脂質極性基を側鎖に有する 2- メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン(MPC)ポリマ

ーを用いて、表面処理による染色体の表面吸着量の抑制効果について検討した。

本報告で使用した MPC ポリマーは、（株）日本油脂ライフサイエンス事業部よりご提供いただいたシランカップリングユニ

ットを持つ MPC 共重合体である。使用に際しては、MPC ポリマー溶液をエタノールで 10 倍希釈した後、洗浄した PDMS

上に適量を塗布した。反応時間は 1-30 分程度とし、反応後は皮膜された PDMS 表面をエタノールで再度洗浄し、吸着実

験に使用した。MPC ポリマー皮膜への染色体吸着量は蛍光顕微鏡を用いて計測した。

126



（５）磁場フローソートによる選別

ACおよびDC電圧による選別は非常に正確な選別を可能とするが、バッチプロセスでありかつ手動操作である。そこで、

連続フロープロセスによる選別の自動化と高効率化の検討を行った。連続フローソーティングでは、自動化と連続操作、短

時間で選別を終了できるという利点がある。図３にその原理を示す。層流の流れる方向に対して垂直方向に不均一な磁場

を与えることによって選別チャンバーに磁場勾配が発生する。ここで、超常磁性微粒子を結合した染色体をインレットチャン

バーから導入する。超常磁性微粒子は選別チャンバーで磁化され不均一磁場に引き込まれる。その際、たとえば１番、２番

３番などの大きな染色体にはより多くの磁気ビーズが結合するため、より磁石に近い位置に引き込まれる。

図３磁場フローソートによる選別の模式図。（右から左に向かって層流を発生させる。その流れの方向に対して垂直方向に不均一な磁

場を与えることによって選別チャンバーに磁場勾配が発生する。）

■ 研究成果

（１）ポリマー流体デバイス

今回使用した厚膜レジスト（ネガ型厚膜フォトレジスト THB120N、JSR 製）の膜厚とスピンコーターの回転数の関係を図

４に示す。回転数 1000rpm で約 20μm 弱の膜厚となることがわかる。図５に今回作製したフォトレジストマスターの触針式膜

厚計測の結果を示す。幅約 40μm、高さ約 30μm の構造を持つ流路マスターが形成されていることがわかる。ただし、触

針式膜厚計測では、マスターの側壁近辺の形状は測定の原理から正確には求められていない。

図４レジスト膜厚とスピンコーター回転数図５フォトレジストマスターの断面

図６右の写真は作製した PDMS 流路の鳥瞰図とマイクロ電極付ガラス基板に張り合わせた流体デバイス

127



このレジストマスターにシリコンエラストマーと硬化剤を流し込み、硬化して作製した PDMS 流路の写真（図６右の鳥瞰図）

とマイクロ電極付ガラス基板に張り合わせた流体デバイスの写真（図６中央の 2 枚）を図６に示す。染色体の大きさを考慮し

て流路のサイズは、幅約 40μm、深さ約 30μm に設定した。

（２）電圧変調による選別

第Ⅰ期では、振動する電場に置かれた染色体の挙動を解析し、染色体がサイズ依存の振動振幅を示すことを明らかに

した 1)。また、印加電圧周波数の上昇にともない、その振動振幅は急激に減少し、交流電場により染色体を固定化できるこ

とを示した 1)。第Ⅱ期では第Ⅰ期の成果を用いて、電圧変調により高精度に染色体ソーテイングする技術の開発を行った。

図７に染色体のサイズと変調電圧信号１パルスあたりの移動量の関係（左は 1Hz、右は 5Hz の繰返し周波数）を示す。この

結果から、小さな染色体の移動度は大きな染色体の移動度より大きいために、電圧変調を用いれば大きさにより選別可能

であることがわかる。

図７染色体のサイズと変調電圧信号１パルスあたりの移動量の関係（左は 1Hz、右は 5Hz）

染色体の選別に用いた流路の模式図とチップの写真を図８に示す。選別は、①直流電気泳動でサンプル注入、②ピン

チインジェクションで少量の染色体を選別レーンに導入する、③変調電圧でサイズの異なるゾーンに分ける、④電圧スイッ

チングで分岐路で分けるの順序で行った。

図８染色体の選別に用いた流路の模式図（左図）とチップの写真（右図）

（３）流路内マイクロ電極によるインピーダンス計測

現在、高速 DNA 遺伝子型解析のための微細加工キャピラリーアレー電気泳動チップや PCR 用マイクロチップの開発例

が数多く報告されている。しかしながら、その検出法は、基本的には、分子をラベルした色素からの蛍光を用いているので、

色素の励起光源として高出力のレーザーや高圧水銀灯、さらに、検出系として冷却 CCD カメラや分光器を必要とする。そ

のため、チップデバイスは、今後さらに微小化、高集積化可能であるが、検出系は基本的には従来と同じであり、このことが、

システム全体の小型・軽量化、省エネ化を妨げている。

本研究では、検出機構もチップ上で実現し、システム全体を小型化するために、流体デバイス内に検出用のマイクロ電

極アレイを作り込むプロセスを検討し、インピーダンスなどの電気物性測定による単一分子の検出に応用した。

図９は直径 10μm のヒト染色体が電極間隙を通過する際のインピーダンス変化を示している。染色体の通過に伴いイ

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

Chromosome size (μm)

Mov

ility

(μ

m/P

uls

e)

00.20.40.60.8

11.21.4

0 2 4 6 8 10

Chromosome size (μm)

Mov

ility

(μ

m/

Pul

se)

128



ンピーダンスが高くなり、通過後低くなる。これは、電極間隙に存在する電解質溶液が絶縁体である染色体の存在により排

除されたことによるものと考えられる。

図９ヒト染色体が電極間隙を通過した際のインピーダンス変化（横軸は時間）。通過時の速度はそれぞれ 3-5μm/s（左図）と 10-15

μm/s（右図）

（４）生体適合材料による付着の抑制

マイクロ流路内で染色体の輸送と選別を行う染色体ソーターの開発においては、染色体とマイクロ流路材料間の付着力

を低減し、長時間の動作と選別の高い回収効率を可能とするための適な表面処理技術の検討を行う必要がある。特に、

本課題で扱う染色体は付着力が強く、容易に流路内壁に張り付き、輸送、選別を困難にする。そこで、生体膜類似表面を

構築できるリン脂質極性基を側鎖に有する MPC ポリマーを用いて、表面処理による染色体の表面吸着量の抑制効果につ

いて検討した。この MPC ポリマーは、MPC ユニットがタンパク質との相互作用を弱め、細胞などの吸着を効果的に抑制す

る性質を有することが報告されている。

図１０に MPC 未処理（左）と MPC 処理した PDMS（右）への染色体の付着量を計測した結果を示す。実験では染色体 105

個/200μｌを 2 時間フローした後に観察を行った。吸着量は、処理したものは処理なしの約 4-5 分の 1 という結果となった。

これにより、リン脂質極性基を側鎖に有する MPC ポリマー表面処理は、染色体とマイクロ流路材料間の付着力を低減し、

長時間の動作と選別の高い回収効率を可能とするための適な表面処理技術であることが示された。

図１０ MPC 未処理（左）と MPC 処理した PDMS（右）への染色体の付着量

（５）磁場フローソートによる選別

磁場を用いたフローソーターのプロトタイプを開発し、大阪大学でグリセロール密度勾配遠心により単離したヒト染色体を

用いて選別を行った 2)。その結果を図１１に示す。大きさ９μm 以上の大きな染色体は磁石の位置に近いチャンネル１に、

大きさ６～８μmはチャンネル２に、さらに小さな染色体は磁石から一番離れたチャンネル４に収集できることがわかった。印

129



加する磁場の強さ、マグネットと選別チャンバーの相対的な位置関係、フリーフローの流速などのパラメーターを調整するこ

とにより、染色体の大きさにより選別可能である。現在、選別効率を数値化するために選別後のサンプル回収を行い、北海

道大学の協力の下、回収後のサンプルを PCR にかけて染色体ペインテイングを行っている。

図１１磁場フローソートによる選別の結果

■ 考察

近年、微細加工技術を応用したマイクロチップ化キャピラリーを用いた DNA 電気泳動法やレーザーピンセット、走査型プ

ローブ探針を用いた DNA 分子の物理的操作に関する研究例が多数報告されている。しかし、DNA の高次構造である染色

体はその組成、構造、形状の複雑さのため非常に扱いが困難な生体分子であり、その複雑さゆえその物理的性質は明ら

かではない。本研究課題では、微細加工技術と電場による操作法を組み合わせて染色体そのものをバッファー溶液中で

任意に物理的に操作する技術を開発しており、これにより染色体 1 個 1 個の電荷、誘電率、導電性などの電気的情報を得

ることが可能である。さらに、この物理的操作技術は、染色体ソーターへの応用以外に、細胞やウイルスをはじめとする生

体関連超分子の選別、操作に広く応用可能であり、従来にない産業的、医学的さらには科学的価値がある。


染色体を「マテリアル」として取り扱う事を可能にしたことによって、染色体を単なる「観察する」対象から工学的に操作を

する対象へ、さらには生化学的な操作も可能な対象となった。将来は染色体をチップソーターで選別し、ソーター中でＦＩＳ

Ｈを行い、原子間力顕微鏡を用いて溶液中で観察するという様な従来にない新しい染色体診断法の開発も可能となる。ま

た、染色体以外の生体関連物質、たとえば、細胞の選別への応用が期待できる。

来るべき高齢化社会では、医療費の高騰などを避けるためにも、小型でどこにでも設置できたり、安価で携帯できるよう

な検査装置が望まれる。本研究課題で開発している使い捨て可能で安価なポリマー材料を用いた流路作製技術は、化学

分析や臨床検査分野のマイクロ化に直ちに転用可能であり、それらの分野の技術者のニーズを取り込めれば大きな波及

効果が望める。また、マイクロ電極検出技術も、臨床検査用チップデバイスの小型化と自動化に必要とされる要素技術であ

り、さらなる高感度化が達成されれば、蛍光色素による染色を必要としない安価で携帯できるような検査装置を開発できる

可能性がある。


Woolley. A. T., G. F. Sensabaugh and R. A. Mathies: 「High-speed DNA genotyping using microfabricated capillary array

electrophoresis chips」, Anal. Chem., 69, 2181-2186, (1997)

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Kopp. M. U., A. J. de Mello and A. Manz: 「Chemical amplification: Continuous-flow PCR on a chip」, Science, 280,

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Harrison. D. J., A. von den Berg.: 「Micro total analysis systems 98」, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, (1998)

A. Manz and H. Becker: 「Microsystem technology in chemistry and life sciences」, Springer, Germany, (1999)

Inoue T., K. Takahashi and H. Yokoyama: 「 Integrated microfluidics for chromosome engineering -preparation,

transportation and manipulation-」, Arch. Histol. Cytol., 65, 457-463, (2002)

Inoue T. and H. Yokoyama: 「Integrated microfluidic devices for chromosome engineering」, JAIST symposium on

nanobiology and biotechnology, (2001)

石原一彦: 「生体構造に啓発されたポリマーバイオマテリアルの創製」, 生体材料 18, 33-40, (2000)

■ 関連特許



1) 2003/02/14, 「粒子選別法」、井上貴仁横山浩高橋一典、特願 2003-36532

振動する電場に置かれた染色体の挙動を解析し、染色体がサイズ依存の振動振幅を示すことやそれを用いれば粒子を

選別できることを示した電圧変調による選別の原理と応用に関する特許である。

2) 「光階調マイクロ造形法」井上貴仁横山浩藤田泰之特許出願中

光階調マイクロ造形法は、流路などのマイクロスケールの３次元構造体を市販の液晶プロジェクターを使用した非常にコン

パクトな構成で、光の階調を用いてわずか 1 回の露光で 3 次元微細構造を作製するプロセスに関する特許である。

131



■ 成果の発表


1. 原著論文による発表（査読付き） 3 報（筆頭著者：3 報、共著者：報）




国内誌：2 報、国外誌：報、書籍出版：冊

4. 口頭発表招待講演：5 回、主催講演：回、応募講演：12 回

5. 特許出願出願済み特許：1 件（国内：1 件、国外： 0 件）

6. 受賞件数件


1) T. Inoue, H. Yokoyama, K. Takahashi: 「Integrated microfluidics for chromosome engineering -preparation,

transportation and manipulation-」, Arch. Histol. Cytol., 65, 457-463 (2002)

2) T. Inoue, Y. Fujita, H. Yokoyama 「On-chip chromosome flow sorter using magnetic force gradient」, Jpn. J. Appl.

Phys., (2006) （投稿中）

3) T. Inoue, Y. Fujita, H. Yokoyama 「Micro fabrication process based on optical gradient method」, Jpn. J. Appl.

Phys., (2006) （投稿中）


1) T. Inoue, Y. Noguchi, H. Yokoyama : 「An Integrated On-Chip Sorter for Bioparticles and Macromolecules」,

Chemical Sensors，Supplement B-20，834-835, (2004)

2) S. Nishida, H. Yokoyama, T. Inoue : 「Bio and Chemical sensors using magnetically driven oscillating

cantilevers」, Chemical Sensors, Supplement B-20，868-869, (2004)



1) 井上貴仁：「新世紀を拓くナノテクノロジー」日本の科学者 38-11，30-35, (2003)

2) 井上貴仁：「マイクロカンチレバーセンサー」日本機械学会誌 108-1042, 712-713, (2005)

国外誌該当なし

書籍出版

該当なし

4. 口頭発表

招待講演

1) T. Inoue：「Key Tools for Nano Biotechnology」, Kyoto, The 5th International Conference on Chromosome

Research at the Nano-Era， 2004.10.17

2) T. Inoue：「Biomolecular detection using cantilever based sensors and low-cost fabrication process of plastic

cantilever arrays」, Madrid, Spain, 1st WORKSHOP ON NANOMECHANICAL SENSORS, 2004.11.15

3) T. Inoue：「On-chip chromosome sorter」, Tokyo, The 6th International Conference on Chromosome Research at

the Nano-Era，2006.03.10

132



4) 井上貴仁：「ナノバイオのキーツール－マイクロフルイディクスと液中ＡＦＭ－」, つくば, 第３回界面ナノアーキ

テクトニクスワークショップ，2004.3.3

5) 井上貴仁：「ナノバイオのキーツール－ナノバイオの要素技術と研究開発動向－」, 東京, 日本石鹸洗剤工業

会技術委員会，2004.9.14


1) T. Inoue, S. Nishida, H. Yokoyama: 「Bio and chemical sensors based on magnetically oscillating cantilevers and

the fabrication of micro cantilever arrays」，Linz, Austria, VI. Annual Linz Winter Workshop， 2004.1.31

2) T. Inoue, S. Nishida, H. Yokoyama: 「Biomolecular detection based on magnetically oscillating cantilevers and

low-cost fabrication process of micro cantilever arrays」，Bejin-TEDA, China, Scanning Probe Microscopy,

Sensors and Nanostructures， 2004.5.26

3) T. Inoue, Y. Noguchi, H. Yokoyama: 「An Integrated On-Chip Sorter for Bioparticles and Macromolecules」，

Tsukuba, The 10th International Meeting on Chemical Sensors， 2004.7.14

4) T. Inoue, Y. Fujita, S. Hayashi, H. Yokoyama: 「On-chip sorter for biomolecules」，Omiya, 4th International

Symposium on Surface Science and Nanotechnology (ISSS-4)， 2005.11.16

5) T. Inoue, Y. Fujita, S. Hayashi, H. Yokoyama: 「Micro cantilever based bio/chemical sensing」，Omiya, 4th

International Symposium on Surface Science and Nanotechnology，2005.11.16

6) S. Nishida, T. Inoue, H. Yokoyama: 「Bio and Chemical sensors using magnetically driven oscillating cantilevers」，

Tsukuba，The 10th International Meeting on Chemical Sensors，2004.7.14

7) 井上貴仁, 横山浩：「染色体エンジニアリング用マイクロ流体デバイスの開発」，平塚, 応用物理学会春季講

演会，2002.3.29

8) 井上貴仁, 野口豊, 横山浩：「分子検出用マイクロ電極アレイ付き流体チップ」，福岡, 応用物理学会秋期

学術講演会，2003.8/31

9) 藤田泰之, 井上貴仁, 平田芳樹, 西田周平, 横山浩：「カンチレバーのスペクトル解析による生体分子認

識の計測」，東京, 応用物理学会，2006.3.26

10) 井上貴仁：「生体分子ハンドリング用マイクロ流体デバイス技術およびマイクロ流体デバイス作製支援」，東京，

nano tech 2003 + Future、2003.2.26

11) 井上貴仁：「バイオチップ用マイクロフルイディクス」，東京，日経ナノテクフェ 2003, 2003.10.8

12) 井上貴仁：「マイクロカンチレバーを用いたバイオ・化学センサーおよびマルチカンチレバー作製技術」，東京，

nano tech 2004, 2004.3.17


1) 2003/02/14, 「粒子選別法」、井上貴仁横山浩高橋一典、特願 2003-36532

振動する電場に置かれた染色体の挙動を解析し、染色体がサイズ依存の振動振幅を示すことやそれを用いれば

粒子を選別できることを示した電圧変調による選別の原理と応用に関する特許である。

2) 「光階調マイクロ造形法」井上貴仁横山浩藤田泰之特許出願中

光階調マイクロ造形法は、流路などのマイクロスケールの３次元構造体を市販の液晶プロジェクターを使用した非

常にコンパクトな構成で、光の階調を用いてわずか 1 回の露光で 3 次元微細構造を作製するプロセスに関する特

許である。

6. 受賞等

133





2.3.2. 染色体の単離と供給

担当機関名研究室名大阪大学大学院工学研究科

研究者名内山進

■ 要旨

本研究は他の課題担当者の研究の支援研究である。具体的には他の課題担当者がマテリアルとして取り扱うことが可能

となる量の染色体を単離し、ナノテクノロジーを基盤とした技術開発に適した形態の染色体試料を定期的に送付することを

目的としている。送付先である他の課題担当者は生物試料の直接の取り扱いが困難な環境にあり、工学をベースとした研

究者が当該分野の研究に集中する事を可能とするため、本研究は第 I 期と同様重要な支援研究である。染色体の単離お

よび保存は他の課題分担者の研究目的に適した方法に従って行い、他の課題分担者の研究需要に基づき定期的に一定

量の送付を行った。平成１５年度はヒト染色体に加え、ライムギやクレピス染色体の単離・供給を行ったが、平成１６年度お

よび１７年度は他の課題分担者の要請によりヒト染色体の単離・供給を中心に行った。また、ヒト特定染色体である１番染色

体についてもセルソーターを用いて単離し、送付を行った。このように本小課題の目標であった染色体の単離、および他の

研究分担者への安定的供給は目標どおり達成した。

■ 目的

高等真核生物のゲノムは DNA のみならず，その DNA の折りたたみ，複製，転写，修復などの維持管理および機能発現

に関係するさまざまな蛋白質が複合したクロマチン繊維として存在している．このクロマチン繊維は細胞分裂に際して，

DNA およびその機能発現・維持管理に必須な蛋白質群を娘細胞に均等に分配するために，高度にパッケージングされた

染色体という高次構造をとる．この染色体こそが高等真核生物に特有の高次構造であり，ゲノムの機能発現に深く関わっ

ていると考えられる．

染色体の構造と機能解明のためには，従来２つの点が大きな問題となっていた．その第1点目は染色体をマテリアルとし

て取り扱うことが困難であったこと，第 2 点目は形態情報を比較検討する事が困難であったこと，である．平成１２～１４年度

（第１期）では動物および植物染色体の調製法の検討を重ね、大量に供給可能な手法を確立した。また、染色体調製およ

び保存条件と形態的安定性の関係についても第１期に解明した。このように先に記した２つの課題を克服することで染色

体をマテリアルとして取り扱うことを可能とし、染色体の構造と機能解明に向けた支援体制が整った。

そこで、本小課題では，第１期に確立した手法を用いて染色体の機能と構造の解明のためのナノデバイスを開発する工

学系の研究者が必要な染色体試料を安定して供給することを目的とした．染色体試料は他の課題分担者が必要な量を定

期的に送付することとした。また，染色体のサイズがヒトよりも大きく観察が容易な植物（ライムギ）染色体についても定期的

に調製し，各分担者に供給することも目的とした．更に，ハプロイドのゲノム当たり染色体数が 3 本であるクレピスは染色体

識別が容易であるため、オンチップ染色体ソーター開発に適しているクレピス染色体の単離，および送付も目的とした．加

えて、ナノデバイス開発に必要である特定のヒト染色体（１番染色体）の単離と送付も目的とした。

■ 目標

① ヒト染色体の安定供給

② 植物(ライムギ）染色体の供給

③ 植物（クレピス）染色体の単離および送付

④ ヒト染色体（１番）の供給

134




①他の課題分担者が必要な量の単離ヒト染色体を定期的（平均２週間に１度、計８０回）に送付し目標を達成した。

②平成１５年度は定期的な送付を行い、目標を達成した。平成１６および１７年度は他の課題分担者がヒト染色体を用いた

開発を進め、ライムギ染色体を必要としなかったため送付は中止した。

③平成１５年度は送付を行い、目標を達成した。平成１６および１７年度は他の課題分担者がヒト染色体を用いた開発を進

め、必要としなかったためクレピス染色体の送付は中止した。

④フローソーターを用いて単離した１番染色体の送付を行った、以上により本研究課題の目標は全て達成した。

■ 研究方法

（1）ヒト染色体及び染色体蛋白質の単離及び送付

材料として染色体が 46 本であるヒト細胞（BALL-1 株）を用い，コルセミドにより同調させた後，細胞回収後ポリアミン法、グリ

セロール密度勾配遠心法あるいはクエン酸法により染色体を単離し，単離染色体の送付を行った．ポリアミン法とグリセロ

ール密度勾配遠心法ではポリアミンバッファー（15mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 80mM KCl, 20mM NaCl, 0.5mM EGTA,

1mg/ml digitonin, 14mM 2-mercaptoethanol, 0.1mM PMSF, 0.2mM spermine, 0.5mM spermidine, pH 7.2）を用いており、

染色体形態を保つことが可能である。一方、クエン酸法では染色体単離の際に，クエン酸溶液（0.1M citric acid, 0.1M

sucrose, 0.5% Tween20, pH 2.7）を用いることで、染色体中の DNA どうしの反発を防ぐと共に蛋白質をなかば変性させるこ

とで形態を維持していると考えられる。いずれの手法も２週間程度であれば 4℃での保存が可能である。

（2）植物染色体の単離および送付

植物染色体の単離のための材料としてはライムギを用いて実験を行った。ライムギ種子を発芽させた後，まず Hoagland

Solution，ヒドロキシウレアを加え DNA 合成の阻害を行うことで，S 期同調を行った。次に，トリフルラリンを加えた Hoagland

Solution 中での生育をさせ，同調化を行った。2%パラホルムアルデヒドを用いて固定した後，ホモジナイザーを用いてマグ

ネシウムバッファー（10 mM MgSO4, 50 mM KCl, 5 mM HEPES, 3 mM Dithiothreitol 0.25% Triton-X）中で細胞破砕を行

い，遠心分離により染色体を単離した。

（4）クレピス染色体の単離および送付

広島大学谷口研至先生より提供して頂いた Crepis capillaris (L.)Waller 苗条原基 CC739 系統を用い，19℃で振蘯培養を

行った。0.02％，6 hr コルヒチン処理によって細胞周期の同調化を行った。4℃にて LB101Lysis バッファー（15 mM Tris, 2

mM EDTA, 0.5 mM spermidine, 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.1% 2-mercaptoethanol, pH 7.5)で 3 回細

胞を洗浄後，ポリトロンホモジナイザーPT1300D にて細胞破砕を行った。20, 30, 60 μm のナイロンメッシュによるフィルタ

ー処理後，遠心にて染色体を回収した。単離染色体は DAPI 染色によって観察した。

図-1 （左）クエン酸法により単離したヒト染色体、（中央）単離ライムギ染色体、（右）単離クレピス染色体（倍率は異なる）

135



■ 研究成果

単離ヒト染色体を材料として供給し、他の課題分担者が行ったナノデバイス開発をマテリアル面から支援した。本小課題

は支援研究であったが、ヒト染色体の単離方法の過程で同調化方法の適条件や細胞の処理温度、さらには収量などに

ついて異なる手法間での相関を見出し、染色体の単離方法とその特性について記した文献として報告した 12）。また、染色

体を安定して供給可能となったため、染色体そのものを生化学的に解析可能となり、ヒト染色体を構成する蛋白質の網羅

的解析やヒト染色体蛋白質抗体の作製を可能とした 1, 2, 4, 8）。

図-2 平成１５～１７年度の染色体送付状況

■ 考察

今回の研究から動物および植物染色体をマテリアルとして取り扱い大量供給することが可能であり、かつ目的に応じた

染色体の調製が可能となった。本研究課題の成果により、ヘテロな研究者が「材料」に関しては全く同一の条件での研究

が可能となった。この様な研究の推進は我国のみならず国際的にもこれまでには見当たらず、新ししくかつ有効なものと言

える。


今後、基礎、応用の両面において染色体を対象とした研究が期待される。また、動植物染色体を「材料」として取り扱っ

ているため、本プロジェクト参加者以外の染色体及びゲノム研究者への供給が考えられる。

改善点としては植物染色体の場合には盛んに細胞分裂を繰り返す植物根端の同調を行い、染色体単離を行ってきたが、

より大量の染色体調製には植物培養細胞を使用するのが好ましい。しかしながら植物培養細胞の高度同調化は依然とし

て困難である。そこで、植物細胞の高度同調化、さらには植物染色体の単離を焦点に絞った研究を行う必要がある。


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laboratory manual, (Janssen, K., ed.), Cold Springer Harbor Laboratory Press, NY, pp 49.1-49.12. (1998)

Sone, T., Iwano, M., Kobayashi, S., Ishihara, T., Hori, N., Takata, H., Ushiki, T., Uchiyama, S., and Fukui, K. Changes in

chromosomal surface structure by different isolation conditions. Arch. Histol. Cytol. 65, 445-455. (2002)

Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Sone, T., Matsunaga, S., and Fukui, K. (2004) Protein composition

of human metaphase chromosomes analyzed by two-dimensional electrophoreses. Cytogenet. Genome Res. 107, 49-55.

Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Hori, N., Higashi, T., Hayashihara, K., Sone, T., Higo, D., Nirasawa,

T., Takao, T., Matsunaga, S., and Fukui, K. (2005) Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem.

280, 16994–17004.

Dolezel J., Cihalikova J., Weiserova J. and Lucretti S. (1999) Methods in Cell Science 21, 95-107.

136



Lee, J.H., Arumuganathan, K. Yen, Y., Kaeppler, S., Kaeppler, H., and Baenziger, P.S. (1997) Genome ,40, 633-638.

Lee, J.H., Arumuganathan, K., Chung, Y.S., Kim, K.Y., Chung, W.B. Bae, K.S., Kim, D.H. Chung, D.S., and Kwon, O.C.

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Lucretti, S. and Dolezel, J. (1995) Methods in Cell Biology ,50, 61-83.

Lee, J.H., Arumuganathan, K., Kaeppler, S.M., Park, S.W., Kim, K.Y., Chung, Y.S., Kim, D.H., Fukui, K. (2002) Planta

215, 666-71.

Kejnovsky, E., Vrana, J., Matsunaga, S., Soucek, P., Siroky, J., Dolezel, J.,and Vyskot, B. (2001) Genetics. 158,

1269-77.

Lee, J.H., Arumuganathan, K., Kaeppler, S.M., Park, S.W., Kim, K.Y., Chung, Y.S., Kim, D.H., Fukui, K. (2002) Planta

215, 666-71.

Dolezel J, Lysak MA, Kubalakova M, Simkova H, Macas J, Lucretti S. (2001) Methods Cell Biol. 64, 3-31.

■ 関連特許

基本特許

なし

1) 平成１４年８月２３日、「蛋白質溶液の調製方法、当該タンパク質溶液を利用したモノクローナル抗体の作製方法及び当

該モノクローナル抗体」、福井希一、内山進、曽根岳史、大阪大学、特願 2002-244049,

染色体蛋白質の純度検定には染色体蛋白質に対する抗体が必要となるが、本発明は染色体蛋白質に対する抗体の作製

法に関するものであり、本小課題と同じ染色体単離法を利用している。

参考特許（当該課題に関連する周辺特許）

1)平成１７年８月２４日、「名称分子間相互作用測定方法及びこの方法を用いた測定装置」、福井希一、内山進、川上茂樹、

西川聡、大阪大学、関西 TLO、特願 2005-242273

染色体蛋白質間の相互作用を検出可能とする手法に関する発明で、単離ヒト染色体の網羅的解析の成果を発展させるも

のである。

2)平成１６年１２月８日、「細胞の活性評価方法、細胞測定用システム、及び細胞測定用プログラム」、松永幸大、内山進、

福井希一、大阪大学、特願 2004-355235

細胞周期を自動判別する手法に関する発明であり、本発明により本小課題でも必要であった同調化条件の適化を自動

的かつ正確に達成可能となる。

137



■ 成果の発表


1. 原著論文による発表（査読付き）１7 報（筆頭著者：２報、共著者：１5 報）




国内誌：０報、国外誌：０報、書籍出版：３冊

4. 口頭発表招待講演：５回、主催講演：２回、応募講演：６５回

5. 特許出願出願済み特許：２件（国内：２件、国外：０件）

6. 受賞件数１件


1) Takata, H., Uchiyama, S., Nakamura, N., Nakashima, S., Kobayashi, S., Sone, T., Kimura, S., Lahmers, S.,

Granzier, H., Labeit, S., Matsunaga, S., and Fukui, K. A comparative proteome analysis of human metaphase

chromosomes isolated from two different cell lines reveals a set of conserved chromosome-associated proteins. J.

Proteome Res.（投稿中）

2) Kobayashi, S., Uchiyama, S., Sone, T., Noda, M., Lin, L., Mizuno, H., Matsunaga, S., and Fukui, K. Calreticulin

as a new histone binding protein in mitotic chromosomes. Cytogenet. Genome Res in press (2006).

3) Matsunaga, S., Kurihara, D., Kawabe, A., Nakagawa, K., Yoneda, A., Hasezawa, S., Uchiyama, S. and Fukui, K.

Dynamics of the plant Aurora kinase AtAUR3 during mitosis and spindle abnormality induced by AtAUR3

overexpression. Cytologia, 70, 1-2．(2005).

4) Higashi, T., Miyakawa, S., Uchiyama, S., Matsunaga, M., Takata, H., Fujimoto, S., Noda, N., Terauchi, A.,

Shimizu, S., Oda, O., Azuma, T., and Fukui, K., Generation of monoclonal antibodies against chromosomal

antigens that have a high sequence similarity between humans and mice. J. Biotechnology 120, 262-72．(2005).

5) Fujimoto, S., Yonemura, M., Matsunaga, S., Nakagawa, T., Uchiyama, S. and Fukui, K. Characterization and

localization analysis of Arabidopsis condensin subunits, AtCAP-H and AtCAP-H2. Planta 222, 293-300．

(2005).

6) Lin, L., Nakano, H., Uchiyama, S., Fujimoto, S., Matsunaga, S., Nakamura, S., Kobayashi, Y., Ohkubo, T. and

Fukui, K. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a conserved domain in plants and

prokaryotes from Pyrococcus horikoshii OT3. Acta Cryst. F 61, 414-416．(2005).

7) Kawabe, A., Matsunaga, S., Nakagawa, K., Kurihara D., Yoneda, A., Hasezawa, S., Uchiyama, S. and Fukui, K.

Characterization of plant Aurora kinases during mitosis. Plant Mol Biol. 58, 1-13．(2005).


Nirasawa, T., Takao, T., Matsunaga, S. and Fukui, K. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J.

Biol. Chem. 280, 16994-17004．(2005).

9) Ma, Y. Z. Lee, J. H. Li, L. C. Uchiyama, S. Ohmido, N. and Fukui, K. Fluorescent Labeling of Plant

Chromosomes in Suspension by FISH. Genes & Genetic Systems 80, 35-39．(2005).

10) Fujimoto S, Matsunaga S, Yonemura M, Uchiyama S, Azuma T, Fukui K. Identification of a novel plant MAR DNA

binding protein localized on chromosomal surfaces. Plant Mol Biol. 56, 225-39．(2004).

11) Matsunaga, S., Ohshio, K., Harada, E., Fujiwara, S., Uchiyama, S. and Fukui, K. Development of new dosimetry

using extended DNA fibers. J. Biosci. Bioeng. . 98, 384-386．(2004).

12) Uchiyama, S., Kobayashi, S., Takata, H., Ishihara, T., Sone, T., Matsunaga, S. and Fukui, K., Protein

composition of human metaphase chromosomes analyzed by two-dimensional electrophoreses. Cytogenet.

138



Genome Res., 107, 49-54．(2004).

13) Liu, H., Kawabe, A.,Matsunaga, S., Kobayashi, A., Harashima, S.,Uchiyama, S., Ohmido, N. and Fukui, K.(2004)

Application of the bio-active beads method in rice transformation. Plant Biotechnology . 21, 303-306．(2004).

14) Liu, H., Kawabe, A., Matsunaga, S., Kim, Y. H., Higashi, T., Uchiyama, S., Harashima, S., Kobayashi, A. and

Fukui K. An Arabidopsis thaliana gene on the yeast artificial chromosome can be transcribed in tobacco cells.

Cytologia. 69, 235-240．(2004).

15) Doi, T., Matsunaga, S., Maeno, E., Tsuchiya, T., Higashi, T., Misawa, S., Uchiyama, S., Ooi, T., Nakao, M. and

Fukui, K. Cell culture in a closed nano-space. J. Biosci. Bioeng. 98, 304-305．(2004).


chromosomal DNA contents of genus Triticum species and rye (Secale cereale). Chromosome Res. 12, 93-102．

(2004).

17) Sone, T., Iwano, M., Kobayashi, S., Ishihara, T., Hori, N., Takata, H., Ushiki, T., Uchiyama, S., and Fukui, K..

Changes in Chromosome Structure by Different Isolation Conditions. Arch. Histol. Cytol. 65, 445-455. (2002)


該当なし



該当なし


書籍出版

1) 「Whole-Mount Immuno-Electron Tomography (IET) of Chromosomes and Cells」, Engelhardt, P., Meriläinen1, J.,

Zhao, F., Uchiyama, S., Fukui, K., and Lehto, V.-P., (2006) Electro Microscopy Methods and Protocols

(Methods in Molecular Biology) 2nd Ed., in press.

2) 「植物染色体の単離法」、内山進、クロモソーム、養賢堂、 2006 年３月

3) 「植物染色体のソーティング法」、内山進、クロモソーム、養賢堂、 2006 年３月

4. 口頭発表

招待講演

1) Susumu Uchiyama: 「Proteome analysis of human metaphase chromosomes」 Kings College, London, London

chromatin club, 2005, 9 月 13 日

2) Susumu Uchiyama: 「Proteome analysis of human metaphase chromosomes」 University of Helsinki, Biomedica

seminar, 2004 12 月 12 日

3) 内山進：「Proteome analysis of human metaphase chromosomes」大阪ヒルトンホテル、 NRW バイオセミナー、

2004 年 9 月 27 日

4) 内山進：「タンパク質の分子内および分子間相互作用の定量解析」大阪豊田ビル第 7 回マイクロカロリメトリ

ー技術セミナー 2004 年 6 月 30 日

5) Susumu Uchiyama: 「Analysis of protein-protein interactions in solution -Feature and advantage of several

techniques-」Yokohama, The 1st Pacific-Rim International Conference on Protein Science., April 14-18 (2004).

139




1) Susumu Uchiyama. 「Massive isolation of metaphase chromosomes for different purposes.」 Osaka, Chromosome

Research at the Nano-Era, March 9 (2006)

2) Susumu Uchiyama, Shouhei Kobayashi, Hideaki Takata, Tsunehito Higashi, Kayoko Hayashihara, Takefumi Sone,

Sachihiro Matsunaga, and Kiichi Fukui：「Proteome analysis of human metaphase chromosomes」，Babraham

Institute Cambridge, UK，Epigenetics and the Dynamic Genome Conference Cambridge 2005，June 30-July 2,

2005

3) 高田英昭、中村直子、小林昇平、曽根岳史、木村澄子、内山進、松永幸大、福井希一：「ヒト分裂期染色体の比

較プロテオーム解析」，福岡国際会議場，第 5 回日本蛋白質科学会年会，2005 年 6 月 30 日－7 月 2 日

4) 福井希一、内山進：「染色体ナノデバイスに関する総合研究および染色体のプロテオーム解析」，国立オリンピッ

ク記念青少年総合センター（東京都渋谷区），日本遺伝学会第 77 回大会，2005 年 9 月 27－29 日

5) 内山進、小林昇平、高田英昭、石原武、曽根岳史、林原加代子、中村直子、松永幸大、福井希一：「ヒト分裂機

染色体のプロテオーム解析」，ヤフードーム（福岡県福岡市），日本分子生物学会第 28 回(2005 年度)年会，2005

年 12 月 7－10 日

6) Hideaki Takata, Susumu Uchiyama Naoko Nakamura, Shouhei Kobayashi, Sachihiro Matsunaga, Kiichi Fukui：

「Comparative Proteome Analysis of Human Metaphase Chromosomes」，Moscone Center, San Francisco, CA，

The American Society for Cell Biology (ASCB) 45th Annual Meeting，2005 年 12 月 10-14 日

7) Hideaki Takata, Susumu Uchiyama, Takehumi Sone,Shouhei Kobayashi, Sachihiro Matsunaga and Kiichi Fukui：

「Proteomic analysis of human metaphase chromosomes by using RFHR-PAGE」，Pacifico Yokohama，The 1st

Pacific-Rim International Conference on Protein Science，April 14-18, 2004

8) Tsunehito Higashi, Shuichi Miyakawa, Hideaki Takata, Akiko Terauchi, Takeyuki Shimizu, Masayuki Oda,

Susumu Uchiyama, Sachihiro Matsunaga, Takachika Azuma, Kiichi Fukui：「Analyses of human chromosomal

proteins using monoclonal antibodies」，千里ライフサイエンスセンター（豊中市），第 57 回（平成 16 年度）日本細

胞生物学会大会，2004 年 5 月 26－28 日

9) Tsunehito Higashi, Shuuichi Miyakawa, Hideaki Takata, Akiko Terauchi, Takeyuki Shimizu, Masayuki Oda,

Susumu Uchiyama, Sachihiro Matsunaga, Takachika Azuma, and Kiichi Fukui：「Analysis of human chromosomal

protein using monoclonal antibodies」，Brunel University, West London, UK，15th International Chromosome

Conference (ICC XV)，September 5-10, 2004

10) Kiichi Fukui, Susumu Uchiyama, Takehumi Sone, Megumi Iwano and Sachihiro Matsunaga：「Changes in

chromosomal surface structure are directly related to protein composition.」，Brunel University, West London,

UK，15th International Chromosome Conference (ICC XV)，September 5-10, 2004

11) Susumu Uchiyama, Shouhei Kobayashi, Hideaki Takata, Takeshi Ishihara, Takehumi Sone, Takashi Nirasawa,

Toshihumi Takao, Sachihiro Matsunaga, and Kiichi Fukui ：「 Proteomic analysis of human metaphase

chromosomes」，Brunel University, West London, UK，15th International Chromosome Conference (ICC XV)，

September 5-10, 2004

12) 中村直子, 内山進, 種子田艶, 高田英昭, 中嶋祥子, 木村澄子, 松永幸大, 福井希一：「超高分子量ヒト染色

体タンパク質の分離および同定」，名古屋大学天白キャンパス，日本生物工学会大会，2004 年 9 月 21-23 日

13) 林原加代子, 内山進, 小林昇平, 近江戸伸子, 松永幸大, 福井希一：「間接蛍光抗体法を用いた染色体関連

蛋白質の局在解析」，名古屋大学天白キャンパス，日本生物工学会大会，2004 年 9 月 21-23 日

14) 高田英昭、内山進、曽根岳史、小林昇平、松永幸大、福井希一：「RFHR 法を用いた二次元電気泳動によるヒ

ト染色体のプロテオーム解析」，神戸国際会議場，第 27 回日本分子生物学会，2004 年 12 月 8－11 日

15) 小林昇平, 内山進, 曽根岳史, 水野晴夫, 石原武, 松永幸大, 高尾敏文, 福井希一：「ヒト分裂期細胞におけ

るカルレティキュリンの局在」，神戸国際会議場，第 26 回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13 日

140




によるヒト染色体のプロテオーム解析」，神戸国際会議場，第 26 回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13

日


によるヒト染色体のプロテオーム解析」，神戸大学神大会館，第１３回染色体コロキュウム，2003 年 12 月 13-14 日

18) 内山進、小林昇平、石原武、高田英昭、曽根岳史、韮沢崇、松永幸大、福井希一：「ヒト分裂期染色体のプロテ

オーム解析」，神戸ポートアイランド，第２６回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13 日

19) 堀直人、内山進、小林昇平、石原武、松永幸大、福井希一：「ヒト染色体構成蛋白質の塩処理による段階的解

析」，神戸ポートアイランド，第２６回日本分子生物学会年会，2003 年 12 月 10-13 日

20) Susumu Uchiyama. “Proteomic analysis of human metaphase chromosomes” Osaka, Chromosome Research at the

Nano-Era”, December 7 (2003)


1) 平成１７年８月２４日、「名称分子間相互作用測定方法及びこの方法を用いた測定装置」、福井希一、内山進、川上茂

樹、西川聡、大阪大学、関西 TLO、特願 2005-242273

2) 平成１６年１２月８日、「細胞の活性評価方法、細胞測定用システム、及び細胞測定用プログラム」、松永幸大、内山進、

福井希一、大阪大学、特願 2004-355235

6. 受賞等

1．第 15 回国際染色体学会（ICCXV）学会賞ノミネート、平成１６年 9 月

141





2.3.3. 動物染色体画像 DB の充実・公開と画像解析技法の開発

担当機関名研究室名新潟大学医歯学総合病院医療情報部

担当者名赤澤宏平

■ 要旨

動物染色体画像データベースの構築ならびに世界各国の動物染色体画像の収集を行い、一般研究者向けに公開した。

国内外の35学会と120の論文誌の協力を得て、13,400枚の動物染色体画像が登録された。収集された画像の動物種は

1,900種、ヒトに関する染色体画像も2,200枚以上登録されている。染色体異常疾患の画像を参照しその特徴づけが可能とな

った。収集した動物染色体画像を広島大学の植物染色体画像DBに移植し統合化を行なった。

顕微鏡画像のノイズ除去アルゴリズムを開発した。研究期間の前半では、SNOM/AFMによるFISH画像のようなポアソンノ

イズを含む画像から、ポアソン分布の一様性の検定を逐次的に適用する方法を開発した。研究期間後半では、染色体の境

界領域をより鮮明に描写できる機能を付加した。

■ 目的

染色体の構造は、DNA の複製と分配のメカニズムや核内のゲノムの存在様式を知る上で必要不可欠な情報である。染

色体がもつ構造的側面を重視し、DNA から染色体までを実際の｢形｣として可視化しその立体構造を解析することが本総

合研究の目的である。本研究の推進にあたり、染色体の構造や機能に関する研究成果、ナノレベルでの染色体画像、構

造解析に必要なナノテクノロジーや分取技術に関する情報の基盤整備が必要である。

本小項目の研究目的は、染色体の構造や機能の解析技術ならびにその研究成果を統合的に収集し、それらを参照し

やすい形で研究者に提供するシステムを構築することである。特に、動物染色体の画像を収集し、世界初の大規模な動物

染色体画像データベースを構築することで、ヒトの染色体異常疾患の病態特徴の把握や多くの種の動物の遺伝子解析研

究に寄与できることが期待される。

また、染色体画像の収集に関連して SNOM/AFM などの顕微鏡画像のノイズ除去に関して、新しい画像処理技術を開

発した。収集したナノレベルでの染色体画像をより詳細に解析する際に、本ノイズ処理技術は重要なツールになりうる。

■ 目標

① 染色体の画像収集を促進する。

② 染色体画像データベースを一般研究者向けに公開する。

③ 染色体の構造機能解析、ナノテクノロジーなどの新情報をエンドユーザーに提供する。

④ 画像解析ツールを開発する。


① 染色体の画像収集を促進する。

動物染色体画像データベースの構築ならびに世界各国の動物染色体画像の収集を行い、一般研究者向けに公開

した。国内外の35学会と120の論文誌の協力を得て、13,400枚の動物染色体画像が登録されている。収集された画

像の動物種は1,900種、ヒトに関する染色体画像も2,200枚以上登録されている。染色体異常疾患の画像を参照しそ

の特徴づけが可能となった。収集した動物染色体画像を広島大学の植物染色体画像DBに移植し統合化を行なっ

た。

② 染色体画像データベースを一般研究者向けに公開する。

142



染色体画像データベース（システム名称：CHROmosome Nano-Information System, CHRONIS）を一般研究者向けに

公開した。研究者は10,000件を越える画像の中から、自分が参照したい画像のみをキーワード（動物種、染色法な

ど）で検索し、18項目の付帯情報とともに参照できる。CHRONISには、国内外の研究者から月間300～400件のアクセ

スがある。

③ 染色体の構造機能解析、ナノテクノロジーなどの新情報を一般研究者に提供する。

染色体の機能・構造の解明に必要なナノテクノロジー、ナノデバイス、染色体分取技術に関する文献情報や URL

情報を収集しデータベース化した。収集された情報の件数は、文献情報が 8,800 件、URL が 148 サイトである。URL

情報の中には、Entrez、DBGET、LocusLink などのゲノム情報データベースや医学文献情報データベース Medline

なども含まれ、これらのデータベースへのアクセスも行うことができる。画像データベース、文献・URL 情報の共有化

を図ることにより、自分の研究室に居ながらにして図書館とのアクセスが可能となった。

④ 画像解析ツールを開発する。

顕微鏡画像のノイズ除去アルゴリズムを開発した。研究期間の前半では、SNOM/AFMによるFISH画像のようなポアソ

ンノイズを含む画像から、ポアソン分布の一様性の検定を逐次的に適用する方法を開発した。研究期間後半では、

染色体の境界領域をより鮮明に描写できる機能を付加した。

■ 研究方法

１）ナノ染色体情報システム（CHRONIS）の機能

染色体の構造・機能解析に携わる研究者が、ナノ染色体情報を迅速に獲得するための統合情報システム CHRONIS を

構築した。CHRONIS では、特に、動物染色体画像をデジタル化して管理し、インターネット上で検索・参照できる機能を有

する。CHRONIS では、情報を染色体画像、ナノテクノロジー、ナノデバイス、構造解析、染色体分取という 5 種類のカテゴリ

ーに分けている。

染色体画像データベースの初期画面を図-1 に示した。キーワード、和名、英語名、属名、種名、染色法を指定した検索

が可能である。検索結果は、図-1 のように検索ボックス下に表示される。表示されたサムネイル画像のうち、興味ある画像

をさらに詳しく見たい場合には、そのサムネイルをクリックすると、目・科・属・種、染色法、著者、出典などの詳細情報が表

示される。詳細情報では、画像が大きく表示されるほか、付帯情報として 17 項目の情報を参照できる。

染色体画像以外のカテゴリーでは、サブカテゴリーとして、論文・総説、書籍、研究レポート、ホームページの URL の 4 種

類のジャンルが用意され、効率的な情報収集が可能である。表示画面は、日本語英語のほか、翻訳ツールを併用すること

により中国語で参照できる。

医学関連の論文ならびに総説は、学術文献データベースPubMedにおけるhtmlのタグを利用して、医学・医療で扱われ

る疾患に関与する染色体情報、遺伝子情報、ナノテクノロジーなどの情報を自動的に収集できる。医学関連以外のナノ染

色体の論文や総説、書籍、研究レポートについては、いまだ権威あるデータベースが世界的に構築されていないので、論

文誌や研究レポート情報を手入力し、書誌情報としてデータベース化した。

URL の情報収集は、基点となる URL をカテゴリー別およびジャンル別に用意しておき、それらの URL からリンクが張られ

ているページを指定階層数（リンクの張られたホームページを孫引きしていくときの回数）までたどり情報を収集する検索ロ

ボットにより行われている。通常、あるホームページから別のホームページを見たいとき、画面上でのリンク先ボタンを主導

でクリックしているが、これらの処理を自動的に行いリンク先からさらに次のリンク先へと各ページを検索しながら欲しい情報

を収集する。また、市販の検索エンジン（Yahoo, Google など）の区別なくすべて網羅されたメタ検索を行うことができる。自

動検索する時間帯やリンクの指定階層数などはシステム管理上も望ましいパラメータを指定できる。

国内外の関連研究施設や研究者のホームページ情報を包括的に検索するために、指定した URL を基にそのホームペ

ージのコンテンツ内の情報を検索し、他のホームページへのリンクが張られている場合には、そのリンク先の URL や情報も

収集する。

143



２）CHRONIS の構築方法

本システムは、Dell Power Edge 600SC (CPU: Intel Pentium 4, 1.8GHz, メモリー512MB,

ハードディスク 74GB)上にインストールされている。このマシンの OS は Windows 2000 Server Service Pack 3 である。

ソフトウエアの開発には、Java2SDK Standard Edition 1.4.0.01 を使用した。トップページ用ならびに文献・URL 収集用

の WebServer の管理・運用には、それぞれ Tomcat4.04 と Microsoft Internet Information Server 4.0 を使用した。URL リス

トの自動メタ検索機能を作成するために wget を用いた。wget は、Web から http および ftp のプロトコールを使用してデータ

を一括取得するためのツールである。

図-1．動物染色体画像データベースの検索画面例。一般公開用画像のうち、染色法が FISH のものは 172 件検索された（画面下段のサ

ムネイル）。

３)画像解析ツールの開発

FISH において、ある画素内で観測される信号（光子数）の期待値は、概ね、対応する部位の蛍光色素濃度に比例すると

仮定する。従って、蛍光色素濃度の分布の推定は、各画素の信号強度の期待値の推定と同義である。もし注目する点の

近傍で、蛍光色素濃度の変化が十分緩やかならば、その点の信号強度の期待値の尤推定量は、近似的に、その点を

含む近傍の点の信号強度の平均値で与えられる。このような特徴を持つ顕微鏡画像において、移動平均法がノイズ除去

法として良く利用される。移動平均法では、大きさを固定した近傍を、注目する点を中心とする矩形または円形領域として

定義し、すべての画素にわたる平均操作を繰り返して画像の平滑化を行う。しかしながら、蛍光色素濃度がほぼ同一とみ

なせる近傍の大きさは、画像の解像度によって異なり、また同一画像内でも位置によって変化するので、大きさを固定した

近傍で処理することには問題がある。たとえば、色素に濃染した領域の内部の点では広く、境界に近い部分では狭くなると

思われる。

移動平均法の欠点を補うために、本研究では、近傍の大きさを動的に変化させながら平滑化を行う動的適応平均法

（adaptive averaging）を考案した。これは、注目する点の近傍の観測値について分布の一様性（それらの値が同一の確率

144



分布に従っているとみなせるかどうか）の検定を行い、一様性の仮説が受容されればそれらの平均値を注目する点の値と

して設定するものである。適当な大きさの近傍から始めて、仮説が棄却されるまで近傍の大きさを拡大しながら計算を繰り

返す。

シミュレーションによって生成した画像および実測された FISH 画像について、動的適応平均法と移動平均法を適用しそ

の結果を比較した。移動平均法では円形の近傍を用いている。シミュレーション画像は、まず各点の信号の期待値の分布

を設定し、個々の画素における値を Poisson 分布のパラメータ（λ）として、累積分布と擬似一様乱数により観測値の値を決

定することによって生成した。

■ 研究成果

１．CHRONIS による染色体画像等の情報提供

動物染色体画像、ならびに、ナノテクノロジー、ナノデバイス、分取技術、染色体の構造と機能に関連のある論文、書籍、

学会誌、研究会誌、ホームページ等のうち、染色体や遺伝子の研究に携わる研究者が必要とする情報を収集し、それらを

統合的に提供するナノ染色体情報システム（CHRONIS）を構築した 1)。CHRONIS の URL は以下のとおりである。

http://chromosome.med.niigata-u.ac.jp/chronis/servlet/chronis.ChronisServlet

3 年間で動物染色体画像 13,400 点を付帯情報とともに登録した。このうち、不特定多数のユーザーが参照できる一般公

開用画像が 5,000 枚である。国内外の 28 研究施設からまとまった件数の画像を提供してもらった。海外の画像提供元はド

イツ、ロシア、インド、エジプト、米国、カナダなどの研究所からである。また、動物種は 1,900 種にのぼり、主なものは、ネズ

ミ、ロバ、魚類、鳥類、コウモリ、モグラである。

平成 18 年 3 月の時点でのナノ染色体情報の収集状況は、文献が 8,774 件、URL148 件であり、ナノテクノロジー、ナノ

デバイス、染色体の構造と機能、分取技術に分類され閲覧、検索できるようになっている。

CHRONIS を利用すると、次のような研究の効率化が期待できる。たとえば、原子間顕微鏡（AFM）による染色体構造の

分析方法について、既知の情報を得たいとする。キーワードとして、Atomic force microscope と chromosome structure を指

定し検索すると、14 件の文献と 15 件の URL が抽出された。14 件の文献のうち、8 件は英国の研究者の文献でその研究者

はホームページを作成し自分の研究の紹介も行っていた。ホームページには、染色体構造解析のための操作の様子が動

画で表示されているので、文献よりも詳細な情報が入手できた。

また、医学に特化した応用例は以下のとおりである 2)。

（１）先天異常や悪性腫瘍を始めとする、染色体異常を伴うヒトの疾患の染色体画像および付帯情報を多数含むことから

疾患データベースとして活用できる。

（２）同一の種、同一の細胞周期について、様々な染色方法や顕微鏡で観察した染色体画像を一覧できる。

（３）数多くの FISH 画像を含むことから、FISH に用いる適なプローブを検索できる。

（４）多くの種類の動物染色体画像を含むことから、ヒトの類縁種あるいは亜種の相同性解析が可能となる。

２．ノイズ除去アルゴリズムの開発

色素濃度が画面全体にわたって一様な状況を想定したシミュレーション画像、中央に矩形の高輝度領域が存在するよう

なシミュレーション画像、小さな高輝度領域を含むシミュレーション画像を生成し、移動平均法と動的適応平均法のノイズ

除去精度を比較した。いずれのシミュレーション画像に対しても、移動平均法のノイズ除去には問題があり、一方の動的適

応平均法には大きな問題は見出されなかった。

図-2 は実際の染色体の FISH 画像である。1 画素当りの観測光子数は 0～22 であった。図-2e の動的適応平均法では、

図-2b2c2d の移動平均法に比べ、プローブの特異的結合部位を示す高輝度領域の形状や輝度が保たれたまま、背景や

染色体上の非特異的結合部位の信号が平滑化されていることが分かる 3)。

145



図-2. 実際の FISH 画像に対する動的適応平均法 a. 元 FISH 画像 b. 移動平均法 (半径 = 3). c. 移動平均法 (半径 = 5). d. 移動平均

法 (半径 = 10). e. 動的適応平均法 (有意水準 = 0.001)

■ 考察

CHRONIS の構築により、染色体研究に特化した文献情報のみならず、染色体画像が研究者の自室で入手できる。この

分野での情報源として、動物染色体画像は世界中でいまだデータベース化されていない。さらに、医学文献データベース

は別として、ナノ染色体情報をひとつに統合したデータベースも世界中で稀有といってよい。これまで体系化されてこなか

った染色体関連の情報を整理統合して、それらを世界に発信できるデータベースを構築したことは本研究のも大きな業

績といえる。

ノイズ除去アルゴリズムの開発では、移動平均法のこれらの問題点を克服するために、局所的に適な近傍の大きさを

決定するための一つの方法を考案した。シミュレーションデータを用いた検討では、FISHで重要な高輝度部分の形状や輝

度を損なわずに十分な平滑化を達成することができた。なお、この方法では、同一の点について検定を繰り返すことになる

ため多重検定の問題が発生するが、有意水準の補正を施すことにより有意水準の大きさの画質への影響は小さかった。


CHRONIS は、今後、動物染色体画像の登録件数を増やすことにより、学術的価値が高まることが期待される。研究者個

人からの画像提供は、この 3 年間でほぼ完了しているので、今後は出版社や学会等に働きかけ、著作権を十分に考慮し

つつも学術的に貴重な画像提供を依頼する努力が必要となる。また、遺伝子の配置との関連を示す染色体地図や異種間

での遺伝子相関図の作成などが研究価値を高めると思われる。

顕微鏡画像のノイズ除去アルゴリズムの開発は、国際特許申請中であるが、さまざまな顕微鏡画像での事例検討を重ね、

また、演算処理の高速化を行い実用化にめざしたい。市販されているデジタルカメラの画像への応用も検討されており顕

微鏡画像以外の適用も検討しているところである。

a b c

d e

146




該当なし

■ 関連特許

基本特許（当該課題の開始前に出願したもので、当該課題の基本となる技術を含む特許）

該当なし


該当なし

147



■ 成果の発表






国内誌： 0 報、国外誌： 0 報、書籍出版： 0 冊

4. 口頭発表招待講演：2 回、主催講演： 0 回、応募講演： 0 回




1) Shin-ichi Toyabe et al.:「CHRONIS: an animal chromosome image database」, Chromosome Research, Vol. 76,

259-265, (2005)

2) Takayuki Matsuto et al.：「A new noise reduction algorithm for FISH images observed by SNOM/AFM」,IEEE T

MED IMAGING,（投稿中）

3) Shin-ichi Toyabe et al.：「Construction of an Image Database of Animal Chromosomes its Application to Medical

Sciences」,Computers in Biology and Medicine,（投稿中）


1) 赤澤宏平他：「染色体画像データベースの構築とその医学研究への応用」,第 25 回医療情報学連合大会論文

集, 3-C-2-1, （2005）

2) 松戸隆之他：「SNOM/AFM による FISH 画像のノイズ除去法の開発」, 第 25 回医療情報学連合大会論文集,

3-E-2-5, (2005）



該当なし


書籍出版

該当なし

4. 口頭発表

招待講演

1) Kohei Akazawa et al.：「CHRONIS : a database for viewing animal chromosome images」, The 5th International

Conference on Chromosome Research at the Nano-Era, Kyoto University, 2004.10.16-17

2) Shin-ichi Toyabe et al：「Construction of an Image Database of Animal Chromosomes and its Application to Medical

Science」,Chromosome Research at the Nano-Era 2006, AIST Tokyo Waterfront, 2006.3.9

148





1) 2005.12.7:「画像処理法、画像処理装置および画像処理プログラムを記録した記録媒体」, 松戸隆之他, 特願

2005-3130

染色体画像処理法に関し、特に、微弱な信号からなる画像からノイズを処理した鮮明な画像を得るための画像処

理記録媒体の開発

6. 受賞等

該当なし

149




2.3. 染色体ナノ情報解析ツール（ナノソーター）の開発

2.3.4. 植物染色体画像の収集と画像 DB の公開

担当機関名研究室名広島大学大学院理学研究科附属植物遺伝子保管実験施設

研究者名谷口研至

■ 要旨

染色体に関するあらゆる情報を、これを必要とする各方面の研究者および教育者などのユーザとともに、画像データを

永続的に蓄積し続ける染色体画像データベースシステムを構築し、これを WEB 上で公開するために必要な初期画像の収

集と登録を以下のとおり行った。１）染色体画像登録への各方面への働きかけを行い、現在までに２９研究機関から染色体

画像データの登録の承諾を得た。そのうち、６研究者のアナログ染色体画像のデジタル化を行い、情報整理を行った。現

在までに本染色体画像データベースへ 84,236 件の登録を完了した（2006.03.30 現在）。また、新潟大学で作成している

動物染色体の画像データベース 4,848 件、および神戸大学の渡辺教授の作成した、現在稼働中の染色体データベース

（31,435 件）の全ての委譲を受けた。また、画像データの収集・登録と併せて、２）染色体画像データベースシステムの

WEB ソフトの構築を行った。このシステムはユーザ参加型の「自律的染色体画像データベース」を中心に、染色体技術マ

ニュアル、電子ジャーナル、染色体-遺伝子リンクを加えた複合システムである。

■ 目的

近の多くの生物研究分野では、遺伝子情報を抜きに考えることができなくなってきている。これらの遺伝子の収納箱と

しての染色体に関する情報の必要性もまた急速に増してきている。たとえば、対象植物が倍数体であるのか、それは同質、

又は異質倍数体であるか、目的の遺伝子は染色体上のどこに位置しているのか等の情報は、遺伝子との関連で必ず考慮

しておかなければならない前提条件である。しかし、これらの情報のデータベース化には、多大な労力を必要とするため体

系だって整理がなされていない。そこで、必要とされる染色体の多方面にわたる情報を取り出して、染色体の構造と機能解

明に取り組んでいる多くの生物研究者へ、これらの情報を提供できるシステムを構築していこうとするものである。そのため

に、ユーザと管理者の双方向からの画像データ登録を行うことができる画像データベースを作る。さらにこのシステムを強

化するために、染色体記載に特化した電子ジャーナルを新たに作り、その情報が自動的にデータベースに組み込まれるシ

ステムを構築する。そして管理者側からの入力に関しては、特に 20 世紀に残された多くの研究者の膨大なアナログデータ

を植物染色体画像データベースとして収集・保存していく。

■ 目標（課題採択時に決定した研究目標を簡潔に箇条書きで記入してください）

① アナログ染色体画像の効果的デジタル変換システムを完成する。

② 染色体アナログ画像データのデジタル化とデータベース登録を行い、このプロジェクト期間に 3,000 分類群、総

計 10 万件を目指す。

③ このプロジェクト終了後も、自律的に染色体画像を登録システムとして、ユーザ参加型のシステム（染色体技術マ

ニュアルと電子ジャーナルの発刊を含む）を作成する。

④ 本データベース中の染色体画像を標準化し、遺伝子、タンパク質、ヘテロクロマチン構造に関する情報を標準化

染色体上にマッピングするシステムを追加し、さらなる利用者の拡大を計り、持続的なデータベースシステムの構

築を完成させる。

⑤ 新潟大学で実施されている動物で集積された染色体画像データベースと連結すると共に、画像データ登録者に

対し、画像データベースを公開し、システムチェックを行い、不具合がでた場合はそれを修正していく。

150




① アナログ染色体画像の効果的デジタル変換システムを完成する。

② 染色体アナログデータのデジタル化とデータベース登録をすすめ、5,575 分類群、84,236 件の登録

が完了した。動物のデータと併せて目標の 10 万件を達成した。

③ このプロジェクト終了後も継続できる、自律型染色体画像登録システムを作成した。画像データベー

スの画像はすでに低必要量の登録は実施しているが、染色体技術マニュアルのデータの登録と電

子ジャーナルの発刊に関してはこのプロジェクト完了後にスタートさせることにしている。

④ 染色体画像を標準化し、遺伝子、タンパク質、ヘテロクロマチン構造に関する情報を標準化染色体上

にマッピングするシステムを作成したので、データの登録はこれから継続的に進めていく。

⑤ 新潟大学で実施されている動物で集積された染色体画像データベースとの統合を行った。

■ 研究方法 1．アナログデータのデジタル化

染色体画像データを画像データベースシステムに取り込むために、2003 年にまず、フィルムに残されている染色

体画像を簡単で高解像度を保ってデジタル画像に変換するシステム構築に取り組んだ。通常、フィルムのデジタル

化はスキャナーを用いて行うが、大量の画像データにこれを実施するには多くの時間を費やしてしまう。そこでベロー

ズを利用する方法を考えたが、デジタルカメラでは倍率が等倍以上になりそのままベローズを利用することができない。

そこで既存のフィルム複写装置を改造して、倍率を等倍にあわせるようにした。この装置を用いてフィルムからのデジ

タル化を行った。また、雑誌の画像データはデジタルカメラを用いてデジタル化した。

2．染色体画像のデータベース登録

登録した染色体画像に対して、アノテーション付けを行った。アノテーションは次のように設定した。

画像情報： accession number, digital image name, image created date, figure size (pixels), scale (pixels/um)

報告者情報： reporter, date, title

分類情報： family, genus, species, species author, variety, variety author, Japanese name, English name, source,

strain

実験情報： experimental number, tissue, pretreatment, fixation, staining, probe

ゲノム情報： n, 2n, phase, genome information (karyotype, genome formula), memo

出版情報： author, title, journal (meeting), date

3．自律型画像データベースシステムの作成

a. 染色体画像データベースの作成次に、染色体データベースを構築するに当たり、如何にして多くの染色体研究者からの登録してもらうか、

そしてこれを長期にわたって継続していくためにはどのようにすべきかという観点から、染色体データベー

スの洗い直しを行い、染色体画像データの自律的大量集積システムを企画し、2004 年度から新規に画像デー

タベースシステムソフトの作成を行った。

b. 染色体・遺伝子リンクシステムの作成

染色体画像データベースへ登録されたあらゆる種のオルセインやギムザによって染色された染色体から、それぞ

れの種の代表染色体を選び、その染色体腕を測定し、得られた情報を CSV ファイルとして登録することにより、標準

核型として染色体イディオグラム化する。そして標準化染色体上に分染パターン、各種タンパク質情報、遺伝子情報

を CSV ファイルとして登録することにより、染色体上にマッピングできるプログラムを作成した。

c. 染色体技術マニュアル

管理者によって染色体染色法・調整法に関するテキストファイルおよび画像原稿を登録し、それを技術マニュアル

WEB 画面として表示できるシステムの作成を行った。

151



d. 電子ジャーナル

ユーザが論文としてテキストファイルおよび画像原稿を WEB 上から投稿し、それを WEB 上で校正者に校正しても

らい、受理された論文を電子ジャーナルに掲載できるシステムを作成した。

4．動物染色体画像データベースとの統合

本システムのデータベースは植物染色体情報を中心にデータ収集・登録を行っており、このシステムに新潟大学

で収集された画像とそのアノテーションを記した CSV ファイルから、本システムに併合した。

■ 研究成果

過去から現在に至る膨大な量の染色体画像情報を、これを必要とするユーザへ提供するために、画像データベースとし

て WEB 上で提供し、プロジェクト終了後も画像情報を収集し続けることができるシステムを構築し、このシステムにプロジェ

クト期間の 3 年間で集めることができた画像と画像情報の登録を行った。以下、画像収集とデータベース登録に関する成

果と自律型画像データベースシステムの構築結果について報告する。

1. 染色体画像のデジタル化・登録・アノテーション付け

染色体研究者が保有している染色体画像は多くの場合フィルムとして残されているので、これをデジタル画像への

取り込む作業を行った。フィルムのデジタル化に当たり、一般的なスキャナーの利用は１コマ当たりの時間が非常にか

かるので、デジタル一眼レフカメラによるフィルム画像の撮影を行うことにより大幅な時間の短縮を図った。その結果、

高解像度の画像が短時間にデジタル化できるようになった。

データベースへの画像の登録は、1) ネット上での当事者登録、2) 受託データ登録サービス（フィルムのデジタル

変換支援：過去のデータの早急な保存が必要）、3) 許可を得た既存ジャーナルの登録、4) 染色体記載電子ジャー

ナルからの自動登録（新規記載電子ジャーナルの発刊）の４方式を含めて考えており、このプロジェクトでは、２)およ

び３)の方式に関して実施した。１）および４）に関しては、作成したソフトのもとに、このプロジェクト終了後に立ち上げ

ができるように準備することができた。

デジタル化は、まず我々の研究室に保存されてきたフィルムデータのデジタル変換から開始した。次いで、他施設

からのフィルムの委託デジタル化サービスも開始した。そして、取り込まれた染色体画像に関して以下のアノテーショ

ン付けを行った。このサービスはこのプロジェクト終了後も、継続していくことにしている。

画像情報、分類情報、実験情報、ゲノム情報、出版情報

図-１．デジタル化画像サンプル

画像情報の登録は提供された画像により様々であったので、種名情報は低限登録することとし、提供状況に応じてす

べてのアノテーションを満たすまでの範囲で登録を行った。現在までに 84,236 件のフィルムのデジタル化を行い、それらの

情報の登録を行った。

152



2. 染色体画像データベースシステムの構想

WEB 上での染色体画像データベースシステムを、図2 に示す 5 つの基幹構想の下に、個人データベースホームページ

を除く、１）染色体画像データベースを基本として、２）染色体技術マニュアル、３）染色体-遺伝子リンク、４）電子ジャーナル

のソフトを設計し、そのソフトを作成した。

画像ソフトは、基本的に、登録者の画像登録、アノテーション付け、登録画像の個人閲覧、一般WEB利用者の画像デー

タの検索と閲覧が図3～6に示すような流れで設計された。このソフトを作成するに当たりいくつかの工夫が必要でまず画像

登録が一般的に WEB 上でなされる一画像一画像登録ではなく、一括画像登録が可能なこと、染色体の１核版の画像登録

およびアノテーション付けでなく多核版が１画像として登録されている組図版に対してのアノテーション付けとその閲覧がで

きるような工夫を行った（図-5）。

図-２．染色体画像データベースソフト設計フローチャート

3. 染色体画像データベースソフトの作成

a. ◇システム◇

このシステムはユーザが直接参加することによって作り上げていくスタイルのものである．「染色体画像データベー

ス」を核として，「電子ジャーナル」，「染色体マニュアル」、「染色体-遺伝子リンク」を付加した４WEB サイトより構成さ

れる．これらは画像保護の観点から基本的に会員制とする．

b. ◇機能◇

染色体情報：検出組織，染色法，前処理，固定，プローブ，時期，n，2n，ゲノム式，ゲノムサイズ，ゲノム情報（核型，

ヘテロクロマチン，in situ ハイブリダイゼーション等の情報）

登録ユーザ専用画面：「画像登録作業画面」，「新規情報登録（Input）画面」，「訂正・更新（Update）画面」，「個人登

録画像一覧画面」からなり，各画面には「文字情報表示」，「サムネイル表示」，「1 画像詳細表示」のサブ画面を有す

る．

一般ユーザ一覧画面：「検索画面」からなり，「検索文字情報表示」，「検索サムネイル表示」，「1 画像+検索文字情

報表示」「1 画像詳細表示」のサブ画面を有する．

機能：検索機能，ソート機能，個人データベース機能，個人ホームページオープン機能

c. ◇使用法◇

染色体画像データのユーザ登録：この染色体画像データベースは電子ジャーナルからの自動登録，既存の出版

物の内部的な登録，ユーザによる登録からなっている．ここでは実際にこのデータベースを利用するユーザの利用法

について記す．ユーザ利用に関しては，ユーザ登録とユーザ検索が基本に構成されており，以下のとおりである．

1) 画像登録（アップロード）

登録者パスワードを通してログインし，画像を登録する．登録は複数画像を一括して登録できる機能を有する．さら

153



に，登録画像の確認を行い登録が完了する．

図-３．画像登録画面設計図図-４．サムネイル画面

2) 登録画像ファイルへの文字情報の付加と個人データベース

画像登録者のみが操作できる画面表示で，新規情報登録（Input）と訂正・更新（Update）と個人登録画像一覧

（View）より構成されている．これら 3 画面はいずれの画面も文字情報，サムネイル（図-４），詳細表示（図-６）できる．

一般公開あるいは非公開の制限をユーザの判断で設定することができる．

1．新規情報登録画面：文字情報，サムネイル（図-４），詳細表示画面（図-６）より構成．コンバートされた画像に新

規文字情報を記入する画面．文字情報は一括して登録したい場合が多いので，複数の画像および組み画像

に対して，表形式の一括登録を基本として工夫されている（（図-５）．また少数画像登録の場合は個々に登録

する詳細表示画面が用意されている．

図-５．表形式登録画面図-６．詳細登録画面

2．訂正・更新画面：画面構成は新規情報登録画面と同じ．初に登録した後，訂正あるいは未記載情報，訂正を

行うための画面．登録日時にかかわらず，いつでも自由に閲覧および訂正できる．操作は新規情報登録画面と

ほぼ同じ．

3．登録画像一覧画面：登録者自身のデータベースとして使用できる画面．検索およびソート機能を有しており個

人データ管理に便利．

非公開画像は本人以外，誰からも閲覧されることないので，登録した全画像を全くプライベートに閲覧でき，データ整理

に利用できる．

3) 検索

染色体情報は画像を含む情報と文字データのみの情報の双方がデータベースとして登録されている．このデータ

は全てのユーザが会員登録をすることにより使用することができる．検索は文字情報表示画面，サムネイル画面，1 画

像付き文字情報表示画面，詳細表示画面の４種の画面から行える．前 2 者では自由閲覧が可能で，後 2 者では会員

登録により閲覧できるようになっている．染色体情報は各情報に画像写真の有無，登録画像の種類（組織写真，細胞

154



写真，染色体整列画面など），染色体画像の質，個人ホームページ開設の有無とそこへのリンク等について表示して

いる．検索機能は単純検索と著者名，発表年，植物名，染色法，キーワードからなる複合検索機能を備えている．ま

た，登録番号，植物名，著者，発表年，画像種類に関するソート機能を併せて使用することができる．

4. 染色体・遺伝子リンクシステムの作成

染色体画像データベースへ登録されたあらゆる種のオルセインやギムザによって染色された染色体から、それぞ

れの種の代表染色体を選び、それを標準核型として標準化し、そして標準化染色体上に分染パターン、各種タンパ

ク質情報、遺伝子情報を染色体上にマッピングするプログラムを作成した。

5. 染色体技術マニュアル

染色体画像データベースに登録された染色体像を得るための様々な手法を、染色体研究者が利用できるための

技術マニュアルを登録するシステムを作成した。

6. 電子ジャーナル

高品位な染色体画像を画像データベースに登録する一環として、電子ジャーナルの発刊システムを作成した。こ

のシステムは原稿の投稿、原稿の校正、電子ジャーナルの WEB 上の掲載より構成されている。

7. 動物染色体画像データベースとの統合

本システムのデータベースは植物染色体情報を中心にデータ収集・登録を行っており、このシステムに新潟大学

で収集された画像とそのアノテーションを記した CSV ファイルから、本システムに併合した。

■ 考察

染色体画像データ登録はほぼ達成でき、画像データの登録に関しては、分類群数、登録総数を高いレベルに設定する

ことにより、分類群数は予定を約 6 割超え、大きな成果を上げた。しかし、登録総数は予定の 10 万件を達成した。

データベースシステムの画像データベース、染色体技術マニュアル、電子ジャーナルの発刊、染色体・遺伝

子リンクに関する複合システムソフトを作成する目的は達成できた。しかし、システムの効果を確かめるにはデ

ータの登録やジャーナルの発刊をある程度進めておく必要があった。これを実施することまで含めた計画が立

てられなかったのが残念である。この点に関しては、今後継続的に進めていく予定である。


染色体画像データベースシステムの作成と画像データベースの画像登録という基本的な体制が確立されたことにより、

多くのユーザが染色体情報を利用することができるようになった。しかし、自律的データベースシステムとして染色体画像デ

ータベースを除く、染色体技術マニュアル、染色体・遺伝子リンクのデータ情報がほとんど登録されおらず、また電子ジャー

ナルもこのプロジェクト終了後に発刊する計画としていたので、今後この部分を精力的に推進していく必要がある。そのた

めに染色体研究分野へのボランティア的なエネルギーを費やしていく必要があり、これを今後の使命として進めていかなけ

ればならないと考えている。

このシステムが軌道にのることにより、このデータベースシステムを利用する多くの染色体研究者、および分子レベルの

研究、育種、環境、教育分野に携わる者にたいし情報を瞬時に提供することができるようになる。このシステムは時間の経

過とともに急速に情報量が増えていくので、塩基配列のデータベースがそうであったように将来的な価値は計り知れない。


DBGET GenBank, http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bfind?genbank-today （2006 現在）

Missouri Botanical Garden, Index to Plant Chromosome Numbers(IPCN): http://mobot.mobot.org/W3T/Search/ ipcn.html

155



（2006 現在）

Watanabe K, Index to chromosome numbers in Asteraceae: http://www-asteraceae.cla.kobe-u.ac.jp/index.html （2006 現

在）

Takamiya M, Index to Chromosomes of Asian Pteridophyta, http://dapc.sci.kumamoto-u.ac.jp/pterid/topdb.html （2006

現在）

■ 関連特許

基本特許（当該課題の開始前に出願したもので、当該課題の基本となる技術を含む特許）

該当なし


該当なし

156



■ 成果の発表


1. 原著論文による発表（査読付き） 0 報（筆頭著者： 0 報、共著者： 0 報）




国内誌： 8 報、国外誌：0 報、書籍出版：１冊

4. 口頭発表招待講演： 4 回、主催講演：1 回、応募講演：３回


6. 受賞件数０件





1) 谷口研至: C バンド法『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研至編）．養賢堂,

21-23, (2006)

2) 谷口研至: 培養細胞『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研至編）．養賢堂,

73-75, (2006)

3) 谷口研至・藤重郁子: BrdU 標識法『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研

至編）．養賢堂, 116-120, (2006)

4) 谷口研至: 染色体画像データベース『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口

研至編）．養賢堂, 164-165, (2006)

5) 谷口研至: 苗条原基誘導法『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研至編）．

養賢堂, 203-206, (2006)

6) 谷口研至: 懸濁細胞誘導法『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研至編）．

養賢堂, 207-208, (2006)

7) 谷口研至・藤重郁子: 細胞同調法『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研

至編）．養賢堂, 208-209, (2006)

8) 谷口研至: 試薬の調整『クロモソーム植物染色体研究の方法』（福井希一・向井康比己・谷口研至編）．養賢

堂, 234-246, (2006)

国外誌該当なし書籍出版 1) 『クロモソーム植物染色体研究の方法』，福井希一・向井康比己・谷口研至編著．養賢堂, 2006.3.3

4. 口頭発表

招待講演

1) Taniguchi,K.: 「Differentiation and diversity of pNN806 repetitive DNA family in Dendranthema」，Korea, The 2nd

157



Asian Chromosome Colloquium, 2004

2) 谷口研至：「野生菊の系統とキクの起源」，富山，第 12 回 TOYAMA 植物フォーラム, 2004

3) 谷口研至：「新しいタイプの染色体画像データベース」，東京，日本遺伝学会第 77 回大会, 2005

4) Taniguchi,K.: 「Chromosome Image Database Being Created by User and System Administrator」，Tokyo,

Chromosome Research at the Nano-Era 2006 （文部科学省科学技術振興調整費総合研究, 2006


1) 谷口研至：「20 世紀に残された課題」，神戸，第 13 回染色体コロキウム，2003

一般講演

1) 谷口研至･吉田英史・松井太志：「反復 DNA から見た四倍体および六倍体シマカンギクの分化」，日本植物学会

第 68 回大会, 2004

2) 谷口研至･三枝千晴・松井太志：「反復 DNA から見た栽培ギクの起源(５)」，日本遺伝学会第 76 回大会, 2004

3) 三枝千晴・谷口研至：「キク属植物における 45S-rDNA の IGS 領域の多型性」，日本遺伝学会第 76 回大会, 2004


該当なし

6. 受賞等

該当なし

158

Documents

「染色体の構造と機能解明のためのナノ デバイスに関する総 …...SPM 煮夜染色体工事構造の解明 p.51 2.1.2. 染色体の物理的特性の解析 p.65

「染色体の構造と機能解明のためのナノデバイスに関する総 …...SPM 煮夜染色体工事構造の解明 p.51 2.1.2. 染色体の物理的特性の解析 p.65