ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------------------

Phạm Thu Hằng

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG LÚA CHUYỂN GEN MÃ HÓA

NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH

CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62420116

(DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

PGS.TS. Phạm Xuân Hội

Phản biện 1: .............................................

Phản biện 2: .............................................

Phản biện 3: .............................................

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học

Quốc gia họp tại:

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

vào hồi......giờ......., ngày.......tháng.......năm 2017.

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Dƣới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán

xảy ra thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là

nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng cây trồng. Trong khi đó, dân

số toàn cầu tăng nhanh, ƣớc tính năm 1950 sẽ tăng lên 9 tỷ ngƣời,

ảnh hƣởng nghiêm trọng đến an ninh lƣơng thực, tạo ra một áp lực

lớn cho việc đảm bảo lƣơng thực. Vì vậy, an ninh lƣơng thực là vấn

đề then chốt của nền khoa học nông nghiệp thế giới nói chung và

Việt Nam nói riêng.

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lƣơng thực quan

trọng nhất của con ngƣời. Trên thế giới, cây lúa đƣợc xếp vào vị trí

thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lƣợng. Ở Việt Nam, một đất

nƣớc từ lâu đời đã gắn liền với nền văn minh lúa nƣớc, vai trò cây

lúa đặc biệt quan trọng. Cây lúa đóng vai trò chính trong sản xuất

lƣơng thực, đóng góp sản lƣợng cao nhất (60%) và đƣợc canh tác với

diện tích lớn nhất (xấp xỉ 3,8 triệu ha). Chính vì vậy, việc tạo ra các

giống lúa có năng suất cao, đồng thời chống chịu đƣợc với điều kiện

bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn có ý nghĩa quan trọng đối với việc

duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng

thực quốc gia.

Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các

phƣơng pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt đƣợc

không thực sự cao. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng

nhƣ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt đƣợc một số kết

quả nhất định nhƣng vẫn có những hạn chế. Phƣơng pháp chuyển gen

ra đời đƣợc ví nhƣ “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn

2

gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống

nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng đƣợc kết

hợp với nhau. Với hƣớng nghiên cứu này, các gen quy định những

tính trạng quan tâm đƣợc chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các

giống lúa mang các đặc tính nhƣ mong muốn của con ngƣời.

Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen mà sự biểu hiện của mỗi

gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Vì vậy, nhóm gen mã

hóa nhân tố phiên mã tham gia điều khiển quá trình phiên mã đang là

trọng tâm trong các nghiên cứu chọn tạo giống nhằm tăng cƣờng tính

chống chịu của cây trồng với điều kiện hạn. Nhóm gen mã hóa nhân

tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng

với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều

hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng

cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều nghiên cứu chuyển

gen mã hóa nhân tố phiên mã vào lúa đã đƣợc chứng minh tăng

cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen.

Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC (tên gọi đƣợc bắt

nguồn từ tên gọi của ba protein đầu tiên đƣợc phát hiện có chứa vùng

NAC là NAM - no apica meristem, ATAF - trancription activation

factor và CUC - cup shaped cotyledon) là họ nhân tố phiên mã lớn

nhất đặc trƣng của thực vật. Nhân tố phiên mã NAC tham gia vào rất

nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế bào, bao gồm các

quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp và đáp ứng

chống chịu stress môi trƣờng nhƣ hạn, mặn và lạnh của tế bào. Một

số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa nhƣ SNAC1/OsNAC9,

SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh có liên

quan tới quá trình đáp ứng hạn ở cây lúa. Cây lúa chuyển gen

3

SNAC1/OsNAC9, OsNAC5 và OsNAC10 có khả năng kháng hạn và

năng suất cao hơn so với cây không chuyển gen.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ

“Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã

nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu thu tạo ra

các dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không gây ảnh

hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển. Các kết quả thu đƣợc sẽ

là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây

trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn.

Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã

nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.

Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm

NAC có khả năng chống chịu hạn.

Đối tƣợng v nội dung nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các gen mã hóa nhân tố phiên

mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam.

ác n i ung nghiên cứu ch nh

Nội dung 1: Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm

NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn

từ giống lúa Việt Nam;

Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 ở

thực vật dƣới sự điều khiển của promoter liên tục (Ubiquitine, 35S)/

cảm ứng (Lip9, Rd29A).

Nội dung 3: Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1

vào lúa.

Nội dung 4: Đánh giá sinh trƣởng, phát triển và khả năng

chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen.

4

Địa điểm nghiên cứu

Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: ộ môn ệnh học

Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp

Việt Nam); Phòng Thí nghiệm tƣơng tác cây trồng - vi sinh vật thuộc

Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp.

Đóng góp mới của luận án

Luận án đã phân lập đƣợc 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm

NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa bản địa Việt

Nam. Luận án đã tạo đƣợc các hệ vector biểu hiện gen trong tế bào

thực vật mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển bởi promoter hoạt động

liên tục (Ubiquitin và 35S) và promoter hoạt động cảm ứng (Lip9 và

Rd29A). Luận án đã tạo đƣợc một số dòng lúa chuyển gen biểu hiện

gen đích, sinh trƣởng bình thƣờng trong điều kiện không xử lý hạn và

có khả năng chịu hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển gen.

Ứng dụng thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng lúa T2

mang một bản sao của gen OsNAC1 ở dạng đồng hợp đặt dƣới sự

điều khiển của promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 và

promoter hoạt động liên tục Ubiquitin. Cây chuyển gen có kiểu hình

tƣơng đồng với cây đối chứng không chuyển gen (về khả năng sinh

trƣởng, phát triển và năng suất) trong điều kiện bình thƣờng không

có stress hạn, trong khi tỷ lệ sống sót cao hơn trong điều kiện xử lý

stress hạn ở giai đoạn cây non và các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý,

sinh hóa thể hiện khả năng chịu hạn cao hơn ở giai đoạn sinh sản

trong điều kiện xử lý stress hạn. Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ

tiềm năng ứng dụng của gen OsNAC1 nói riêng và các gen mã hóa

nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói

chung trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở

5

kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNAC1 do luận án tạo

ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng

nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng… để tạo ra các giống cây chuyển gen kháng

hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay

đổi khí hậu toàn cầu ở Việt Nam.

2. Bố cục của luận án

Luận án gồm 144 trang, bao gồm: Phần mở đầu (04 trang); Tổng

quan tài liệu (42 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (15

trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (47 trang); Kết luận (02

trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên

quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (22 trang) với 215 tài

liệu gồm 2 thứ tiếng: tiếng Việt (11 tài liệu) và tiếng Anh (204 tài

liệu); Phụ lục (7 trang). Luận án có 9 bảng, 27 hình.

6

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA

1.1.1. Đặc điểm nông sinh học của cây lúa Oryza sativa

Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo

(Graminaceae), chi Oryza. Chi Oryza phân bố rộng trên thế giới và

có từ 19 – 23 loài, trong đó có loài Oryza sativa L (2n = 24) đƣợc

trồng phổ biến ở khắp các nƣớc trên thế giới và tập trung chủ yếu ở

châu Á. Loài Oryza gluberrima S. đƣợc trồng một diện tích nhỏ ở

một số nƣớc thuộc châu Phi.

1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo

Việt Nam là một trong số các quốc gia bị tác động nặng nề nhất

bởi biến đổi khí hậu. Sự xuất hiện thƣờng xuyên của hạn hán tiếp tục

đe dọa nghiêm trọng đến nền sản xuất lúa gạo trong nƣớc. Hệ quả

của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo

trên thị trƣờng thế giới do Việt Nam là một trong những nƣớc xuất

khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới.

1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn tới đặc điểm chịu hạn cuả cây lúa

Hạn hán luôn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nền sản xuất

lúa gạo. Hạn ảnh hƣởng tiêu cực đến cây lúa ở tất cả các đặc điểm,

bao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa, phân tử.

1.2. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI ĐÁP

ỨNG STRESS HẠN Ở THỰC VẬT

Nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF) là những protein

hoạt động kết hợp với một số yếu tố điều hòa khác, bao gồm các protein

cải biến/thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc, để điều hòa tƣơng tác của RNA

polymerase với DNA.

NAC là nhân tố phiên mã lớn nhất đặc chƣng của thực vật. Tên gọi

NAC bắt nguồn từ tên của ba protein đầu tiên đƣợc phát hiện có chứa

7

vùng liên kết DNA tƣơng tự nhau (domain NAC), bao gồm NAM (no

apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) và

CUC (cup-shaped cotyledon). NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh

lý, hóa sinh khác nhau trong tế bào, bao gồm các quá trình phát triển, già

hóa, tạo thành tế bào thứ cấp, đáp ứng các yếu tố stress phi sinh học và

hữu sinh. NAC là thành phần rất quan trọng của con đƣờng truyền tín hiệu

trong đáp ứng chống chịu stress của thực vật cho thấy tiềm năng ứng dụng

của họ gen NAC trong nghiên cứu tạo giống cây trồng chống chịu stress.

1.3. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHẾ CHUYỂN

GEN VÀO THỰC VẬT

Stress sinh học và phi sinh học là nguyên nhân chính làm giảm

năng suất trên nhiều đối tƣợng cây trồng quan trọng nhƣ lúa, ngô,

bông, lúa mì, cà chua... Và để đối phó với vấn đề này, công nghệ

chuyển gen thực vật đƣợc sử dụng và đƣợc coi là một công cụ hiệu

quả để chuyển các gen ngoại lai nhằm cải thiện nguồn gen cây trồng.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN

GEN CHỐNG CHỊU HẠN

Một hƣớng giải quyết đƣợc chính phủ, các tổ chức xã hội và các

nhà khoa học đặc biệt quan tâm đó là nghiên cứu tạo ra các giống lúa

mới có năng suất cao, đồng thời có khả năng chống chịu tốt với điều

kiện hạn. Định hƣớng nghiên cứu phổ biến và rất đƣợc quan tâm hiện

nay đó tăng cƣờng biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp

ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen. Ở Việt Nam, định hƣớng

chuyển gen vào lúa đã bắt đầu hình thành vào những năm 1995 của thế

kỷ trƣớc. Tuy nhiên, chúng ta hầu nhƣ chƣa có một nghiên cứu hoàn

chỉnh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress, đặc biệt

là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng hạn ở lúa.

8

Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Giống lúa J02 đƣợc mua từ Công ty Cổ phần giống – vật tƣ nông

nghiệp công nghệ cao Việt Nam;

Các giống lúa nƣơng và IR64 do Trung tâm Tài nguyên môi

trƣờng – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.

2.1.2. Chủng vi sinh vật

Vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α đƣợc mua từ hãng

Thermo Scientifics (Mỹ); vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA4404

đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ).

2.1.3. Vector và oligonucleotide

Vector pBI-Lip9, pBI-Ubi, pBI-35S và pCAM-Rd29A do nhóm

nghiên cứu của Phạm Xuân Hội (Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật –

Viện Di truyền nông nghiệp) thiết kế và cung cấp; vector pGEM-T

mạch thẳng có đầu T đƣợc đóng gói kèm trong bộ kit pGEM®-T

Easy Vector Systems của hãng Promega.

Các cặp oligonucleotide sử dụng làm mồi cho PCR đƣợc thiết kế

dựa trên các trình tự đã đƣợc công bố trên Gen ank và đƣợc đặt mua

từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet

(2003) và Tran (2004).

- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA.

- Nhân dòng gen OsNAC1/ OsNAC5/ OsNAC10 vào vector

pGEM-T.

- Thiết kế vector biểu hiện gen OsNAC1.

9

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-Rd/OsNAC1

Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế pBI-Lip9/ OsNAC1, pBI-35S/ OsNAC1 và

pBI-Ubi/ OsNAC1

- Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsNAC1.

- Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình của các cây chuyển gen

- Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ở điều kiện nhà

lƣới bằng các phƣơng pháp định lƣợng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa:

hàm nƣớc tƣơng đối theo phƣơng pháp của Schonfeld (2002), hàm

lƣợng chlorophyll theo phƣơng pháp của Robert J. Porra (2006), hàm

lƣợng proline theo phƣơng pháp của Bates (1973), sự sản sinh ROS

theo phƣơng pháp Thorda- Christensen (1997).

10

Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM

NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA

3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam

10 giống lúa Việt Nam và giống lúa đối chứng IR64 khảo sát khả

nănng chịu theo phƣơng pháp chuẩn của Viện Lúa quốc tế IRRI, 1996.

Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở lúa

STT Tên giống Phƣơng pháp đánh

giá theo IRRI

1 Lúa Tẻ đỏ 1,00 ± 0,6

2 Pê đớ 2,33 ± 0,8

3 Khấu le 2,67 ± 0,5

4 Blue xá 2,67 ± 1,1

5 Lốc nghệ 3,33 ± 1,1

6 Lúa ngoi 3,67 ± 0,8

7 Lúa lốc đỏ 4,33 ± 0,8

8 Nếp khau Pí Pột 4,67 ± 0,5

9 Lúa tẻ nƣơng 5,67 ± 0,8

10 Chành trụi 5,67 ± 0,8

11 IR64 5,67 ± 1,1

Giống lúa Tẻ đỏ đƣợc lựa chọn làm nguồn vật liệu thí nghiệm

phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới

tính chịu hạn ở lúa.

3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên

quan tới tính chịu hạn

3.1.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn

Kết quả điện di RNA trên gel agarose 1% cho thấy, các mẫu RNA

11

tinh sạch phục vụ cho thí nghiệm phân lập gen (Hình 3.1).

Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn

Ghi chú: giếng 1 – 4: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lá lúa xử lý hạn

trong 1, 6, 12 và 24 giờ được điện di trên gel agarose 1%. Giếng M:

thang chuẩn DNA 1 kb.

3.1.2.2. Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC

3.1.2.2.1. Nhân bản gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC

Các đoạn gen đích đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng

các cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế, sau đó kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 1%.

Hình 3.2: Nhân bản gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 bằng kỹ

thuật PCR từ cDNA lúa Tẻ đỏ xử lý hạn

Ghi chú: Sản phẩm PCR nhân gen đích từ cDNA của các mẫu lúa Tẻ đỏ

được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR nhân bản gen OsNAC1,

giếng 1: mẫu lúa xử lý hạn. giếng 2: đối chứng âm (mẫu lúa không xử lý

hạn); (B) PCR nhân bản gen OsNAC, giếng 2: khuôn là cDNA; giếng 1:

đối chứng âm. (C) PCR nhân bản gen OsNAC10, giếng 2: khuôn là

cDNA; giếng 1: đối chứng âm. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.

12

Kết quả phân tích trình tự axit amin suy diễn của các gen OsNAC1,

OsNAC5 và OsNAC10 từ lúa Tẻ đỏ cho thấy, cả 3 gen phân lập đƣợc đều

mã hóa cho protein với các vùng đặc trƣng của họ protein NAC. OsNAC1,

OsNAC5 chứa đầy đủ cả 5 domin bảo thủ A, B, C, D và E, trong khi

OsNAC10 thiếu domai E (Hình 3.3). Ngoài ra, cả ba protein này đều chứa

một vùng tín hiệu định vị nhân PRDRKYP phổ biến cho các nhân tố

phiên mã, nằm ở domain C (Hình 3.3). Kết quả này hoàn toàn phù hợp

với các công bố trƣớc đây.

Hình 3.3: Phân tích trình tự axit amin của protein OsNAC1,

OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ đỏ

Ghi chú: Vùng tín hiệu định vị nhân được kí hiệu bởi dấu ngoặc; các

vùng bảo thủ của protein NAC được kí hiệu A, B, C, D, E; TĐ: gen

phân lập từ lúa Tẻ đỏ, JA: gen phân lập từ lúa Japonica (Niponbare)

đã công bố trên ngân hàng gen mã số AY596808.1, AB028184.1 và

AK069257.1.

13

3.1.3. Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10

trong điều kiện hạn

Hình 3.4: Mức độ biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10

trong điều kiện xử lý hạn

Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen OsNAC1 (cột màu xanh), OsNAC5

(cột màu đỏ) và OsNAC10 (cột màu vàng) của lúa Tẻ đỏ đã xử lý hạn

(PEG 20%) trong thời gian 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được

xác định bằng RT - PCR. Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử

lý stress (0 h) có giá trị bằng 1. Actin được sử dụng làm gen nội

chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp

lại thí nghiệm

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp RT-PCR

nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC5 và

OsNAC10 ở giống lúa Tẻ đỏ trong điều kiện xử lý stress hạn. Mức độ

biểu hiện khác nhau ở các gen khác nhau, trong đó OsNAC1 có mức

độ biểu hiện cao hơn rõ rệt và duy trì mức độ biểu hiện cao trong thời

gian dài hơn đáng kể so với hai gen còn lại khi xử lý stress hạn. Điều

này cho phép dự đoán OsNAC1 đóng góp vai trò nhiều hơn trong đáp

ứng chống chịu hạn của cây lúa Tẻ đỏ so với OsNAC5 và OsNAC10,

đặc biệt là đối với stress hạn kéo dài. Chính vì vậy, OsNAC1 đƣợc

lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu chính cho các thí nghiệm tiếp

theo nhằm tạo ra dòng lúa chuyển gen có khả năng chống chịu hạn.

14

3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO

THỰC VẬT

3.2.1. Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301

Hình 3.5: PCR v cắt enzyme giới hạn kiểm tra sự có mặt của

OsNAC1 trong plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd/OsNAC1

Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR plasmid pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 1 và 3:

PCR với mồi OsNAC1-Fw/Rv; giếng 3 và 4: PCR với mồi RD-Fw/NAC1-

Rv; giếng 1 và 2: khuôn là pCAM-Rd/OsNAC1; giếng 3 và 4: đối chứng

âm (không có DNA khuôn). (B) Sản phẩm cắt enzyme giới hạn plasmid

pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme

BamHI; giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme HindIII/EcoRI;

giếng 2: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.

3.2.2. Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101

Hình 3.6: PCR v cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNAC1

trong plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNAC1, pBI-Lip9/OsNAC1và

pBI-Lip9/OsNAC1

Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1, 3: khuôn là

pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 5, 7: khuôn là pBI-35S/OsNAC1; giếng 9,

11 : khuôn là pBI-Lip9/OsNAC1; giếng 1-2, 5-6 và 9-10: PCR với

cặp mồi OsNAC1-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 3, 4: PCR với cặp mồi

Ubi-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 7, 8: PCR với cặp mồi 35S-Fw/

OsNAC1-Rv;giếng 11,12: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/ OsNAC1-Rv;

giếng 1, 3, 6, 8, 10, 12: đối chứng âm với khuôn là nước. (B) Sản

phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng BamHI; giếng 1 và 2:

pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 3 và 4: pBI-35S/OsNAC1; giếng 5 và 6:

pBI-Lip9/OsNAC1; giếng 2, 4 và 6: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 1,

3 và 5: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.

15

3.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN OsNAC1 TRONG CÂY LÚA

3.3.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens LBA4404

Hình 3.7: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNAC1,

pBI-35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1

Ghi chú: Sản phẩm PCR khuẩn lạc A. tumefaciens với cặp mồi OsNAC1-

Fw/ OsNAC1-Rv được điện di trên gel agarose 1%. (A) Thể biến nạp pBI-

35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1, giếng 5, 6 và 13:

đối chứng âm (khuôn là nước); giếng 1 – 4: khuôn là thể biến nạp pBI-

35S/OsNAC1; giếng 7 – 9: khuôn là thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1;

giếng 10 – 12: khuôn là thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1. (B) Thể biến nạp

pCAM-Rd/OsNAC1; giếng 2 – 4: khuôn là thể biến nạp pCAM-

Rd/OsNAC1; giếng 4: đối chứng âm. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.

3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa

Cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 đƣợc chuyển vào mô sẹo của lúa

J02 (Oryza sativa L. Japonica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens. Mô sẹo hình thành từ phôi lúa đƣợc lần lƣợt chuyển các

cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 (Ubi:OsNAC1, Lip9:OsNAC1,

35S:OsNAC1, Rd29A:OsNAC1) và các cấu trúc vector nhị phân không

mang gen đích (pCAM IA1301, p I101). Sau đó, mô sẹo đƣợc chọn

lọc và tái sinh trên môi trƣờng nuôi cấy in vitro.

Bảng 3.2: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens

Cấu trúc gen

chuyển Callus Chọn lọc

Tái sinh

chồi

Tái sinh

rễ

Lip9: OsNAC1 ~100 38 32 29

Ubi: OsNAC1 ~100 50 37 36

35S: OsNAC1 ~100 51 44 41

16

Rd29A:

OsNAC1 ~100 38 14 14

pBI101 ~100 27 17 17

pCAMBIA1301 ~100 41 27 25

3.3.3. Chọn lọc cây lúa mang gen chuyển OsNAC1 có một bản

copy đời T0

Các cây tái sinh trƣớc khi đƣa ra bầu đất sinh trƣởng trong nhà

lƣới đƣợc kiểm tra khả năng mang gen cần chuyển bằng các phản

ứng PCR với ba cặp mồi là Actin-Fw/ Actin-Rv, Hyg-Fw/ Hyg-Rv

và OsNAC1-Fw/ Nos-Rv (đối với dòng chuyển cấu trúc gen

OsNAC1) và xác định số lƣợng bản copy cấu trúc gen chuyển bằng

phƣơng pháp phân tích PCR định lƣợng thời gian thực (qRT-PCR)

với cặp mồi Hyg-RT-Fw/ Hyg-RT-Rv.

Bảng 3.3: Kết quả s ng lọc cây lúa tái sinh mang cấu trúc biểu

hiện gen OsNAC1

Cấu trúc gen

chuyển

Số

cây

kiểm

tra

PCR

Actin

(Actin-

Fw/Actin-Rv)

Hygromycin

(Hyg-Fw/

Hyg-Rv)

OsNAC1:Nos

OsNAC1-Fw/

Nos-Rv)

Lip9: OsNAC1 29 29/29 21/29 21/29

Ubi: OsNAC1 36 36/36 30/36 30/36

35S: OsNAC1 41 41/41 31/41 31/41

Rd29A:

OsNAC1 14 14/14 11/14 11/14

pBI101 17 17/17 13/17 0/0

pCAMBIA1301 25 25/25 18/25 0/0

Tổng 162 162/162 124/162 93/162

17

Bảng 3.4: Xác định bản copy cấu trúc gen chuyển trong cây lúa T0

Cấu trúc gen

chuyển

Số cây

kiểm tra

qRT-PCR

1 bản copy > 1 bản copy

Lip9: OsNAC1 21 12/21 9/29

Ubi: OsNAC1 30 16/30 14/30

35S: OsNAC1 31 11/31 20/31

Rd29A:

OsNAC1 11 3/11 8/11

pBI101 13 4/13 9/13

pCAMBIA1301 18 6/18 12/18

Tổng 124 52/124 72/124

3.3.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen ở thể đồng hợp tử đời T1

Bảng 3.5: Kết quả s ng lọc các dòng lúa chuyển gen T1

Các dòng lúa

chuyển gen

T1

Số

hạt

kiểm

tra

Số hạt nảy

mầm trên

môi trƣờng

bổ sung

hygromycin

PCR (+) Số cây

đồng hợp

(> 1 bản

copy) Mồi

actin

Mồi

Hygro

Mồi

(gen+nos)

Lip9:

OsNAC1

L1 5 3 3/3 3/3 3/3 1/3

L2 12 9 9/9 9/9 9/9 2/9

L3 6 2 2/2 2/2 2/2 0/2

L4 18 12 12/12 11/12 11/12 2/11

L5 7 4 4/4 3/4 3/4 1/3

U1 2 0 0/0 0/0 0/0 0/0

Ubi:

OsNAC1

U2 7 5 5/5 5/5 5/5 1/5

U3 4 3 3/3 3/3 3/3 0/3

U4 15 12 12/12 11/12 11/12 3/11

U5 5 4 4/4 4/4 4/4 1/4

U6 10 7 7/7 7/7 7/7 2/7

U7 2 1 1/1 0/1 0/1 0/1

U8 2 0 0/0 0/0 0/0 0/0

Tổng cộng 95 62/95 62/62 58/62 58/62 13/58

18

3.3.5. Chọn lọc dòng lúa có biểu hiện gen chuyển đời T2

Hình 3.8: Mức độ biểu hiện của OsNAC1 trong các cây lúa chuyển gen

Ubi:OsNAC1

Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen đích trong các dòng lúa chuyển gen

Ubi:OsNAC1 đời T2 được xác định dựa trên hàm lượng mRNA OsNAC1

tương quan giữa các dòng lúa chuyển gen với dòng lúa không chuyển gen

(ĐC). Mức độ biểu hiện gen của cây lúa không chuyển gen có giá trị bằng

1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị

là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.

Hình 3.9: Biểu hiện của OsNAC1 trong các cây lúa chuyển gen

Lip9:OsNAC1

Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen

Lip9:OsNAC1 đời T2 được xác định dựa trên hàm lượng mRNA OsNAC1

tương quan giữa các dòng lúa chuyển gen với dòng lúa không chuyển gen

(ĐC). Mức độ biểu hiện gen của cây lúa không chuyển gen có giá trị bằng

1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị

là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.

19

3.4. ĐÁNH SINH TRƢỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG

KHÁNG HẠN DÒNG LÚA CHUYỂN GEN

3.3.1. Đánh giá sinh trưởng, phát triển của các dòng lúa chuyển gen

Hình 3.10: Đánh giá sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen

5 dòng lúa chuyển gen có khả năng sinh trƣởng và phát triển

tƣơng đƣơng với cây đối chứng tiếp tục đƣợc sử dụng trong thí

nghiệm đánh giá khả năng kháng hạn.

3.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen T2

3.3.2.1.1. Đánh giá khả năng chịu hạn theo thang điểm chuẩn IRRI

Bảng 3.6: Đánh giá khả năng chịu hạn theo thang chuẩn IRRI ở

các dòng lúa chuyển gen v dòng lúa đối chứng

STT Dòng lúa Thang điểm Thứ tự chịu hạn

1 Đối chứng (ĐC) 7,8 ± 0,96 6

2 L1.1 4,2 ± 0,96 1

3 L4.1 5,8 ± 1,44 3

4 L5.1 6,2 ± 1,28 4

5 U4.2 6,6 ± 0,64 5

6 U6.1 5,4 ± 1,28 2

Nhƣ vậy, xét theo thang điểm chuẩn IRRI, thứ tự chịu hạn giảm

dần của các dòng lúa nhƣ sau: L1.1, L4.1, L5.1, U4.2, U6.1, ĐC.

20

3.3.2.1.2. Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng nước tương đối

Bảng 3.7: H m lƣợng nƣớc đƣơng đối trong dòng lúa chuyển gen

v dòng lúa không chuyển gen

Dòng lúa

H m lƣợng nƣớc tƣơng đối (%) Thứ tự

chịu

hạn ĐK

thƣờng ĐK hạn

Tỷ lệ % so với

ĐK thƣờng

ĐC 92 ± 0,02 67 ± 0,01 73 6

L1.1 95 ± 0,03 88 ± 0,03 92 1

L4.1 94 ± 0,06 81 ± 0,05 87 2

L5.1 90 ± 0,08 76 ± 0,10 84 4

U4.2 91 ± 0,05 71 ± 0,12 78 5

U6.1 93 ± 0,06 80 ± 0,03 86 3

Dựa vào chỉ tiêu RWC trong mô lá, các dòng sắp xếp theo mức

độ chịu hạn giảm dần nhƣ sau: L1.1, L4.1, U6.1, L5.1, U4.2, ĐC.

3.3.2.1.3. Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng diệp lục trong lá lúa

Diệp lục là sắc tố chính có vai trò quan trọng trong hoạt động

quang hợp ở thực vật. Chỉ tiêu hàm lƣợng diệp lục dùng để đánh giá

khả năng quang hợp và chống chịu hạn của cây.

Bảng 3.8: H m lƣợng chất diệp lục a trong các dòng lúa chuyển

gen v dòng đối chứng

Dòng

lúa

H m lƣợng chất diệp lục tổng số (µg/mg lá) Thứ

tự

chịu

hạn ĐK thƣờng ĐK hạn

Tỷ lệ h m

lƣợng giảm (%)

ĐC 1,95 ± 0,05 1,31 ± 0,12 67,21 6

L1.1 3,24 ± 0,08 2,91 ± 0,07 89,73 1

L4.1 2,04 ± 0,03 1,69 ± 0,06 82,89 2

L5.1 1,87 ± 0,02 1,44 ± 0,02 77,12 4

U4.2 2,02 ± 0,06 1,50 ± 0,08 74,36 5

U6.1 2,03 ± 0,03 1,63 ± 0,03 79,92 3

21

Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, nếu chỉ dựa vào chỉ tiêu

hàm lƣợng diệp lục để đánh giá khả năng chịu hạn thì các dòng lúa

chuyển gen đều có khả năng chịu hạn tốt hơn dòng lúa đối chứng.

3.3.2.1.4. Hàm lượng proline

Bảng 3.9: H m lƣợng proline trong các dòng lúa

Dòng

lúa

H m lƣợng proline (%) Thứ tự

chịu

hạn ĐK thƣờng ĐK hạn H m lƣợng

proline tăng

ĐC 121,09 ± 19,02 215,81 ± 28,94 174,92 6

L1.1 142,93 ± 9,84 347,57 ± 41,04 243,18 1

L4.1 131,95 ± 6,10 268,29 ± 16,46 203,32 3

L5.1 129,52 ± 6,26 254,38 ± 7,32 196,40 5

U4.2 132,09 ± 19,02 265,81 ± 28,94 201,23 4

U6.1 137,24 ± 2,75 282,10 ± 6,87 205,55 2

Nhƣ vậy, chỉ xét chỉ tiêu sự tăng tích lũy hàm lƣợng proline

trong cây có thể khẳng định, các dòng lúa chuyển gen tích lũy hàm

lƣợng proline cao hơn dòng đối chứng thì có khả năng thích nghi và

có sức chống chịu hạn tốt hơn dòng đối chứng.

3.3.2.1.5. Ảnh hưởng của hạn đến sự sản sinh ROS trong lá lúa

Hình 3.11: Ảnh hƣởng của hạn đến sự sản sinh ROS (H2O2)

trong lá lúa

Nhƣ vậy, mức độ tổn thƣơng oxy hóa ở dòng lúa không chuyển

gen cao hơn dòng lúa chuyển gen.

3.3.2.1.6. Đánh giá chung về khả năng chịu hạn của các dòng lúa

chuyển gen theo các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa

22

Bảng 3.10: Đánh giá chung khả năng chịu hạn dựa trên chỉ tiêu

hình thái, sinh lý v sinh hóa của các dòng lúa

Dòng

lúa

Chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn

Tổng

điểm

Thứ

tự

chịu

hạn

Độ

cuốn

lá

RWC

H m lƣợng

diệp lục Hàm

lƣợng

proline

Sự

sản

sinh

ROS a b Tổng

số

ĐC 6 6 6 6 6 6 6 42 6

L1.1 1 1 1 1 1 1 1 7 1

L4.1 3 2 2 2 2 3 3 17 2

L5.1 4 4 4 4 4 5 5 30 4

U4.2 5 5 5 5 5 4 4 33 5

U6.1 2 3 3 3 3 2 2 18 3

Trong nghiên cứu này, dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và

sinh hóa, cho thấy các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt

hơn so với dòng lúa đối chứng ở giai đoạn sinh sản.

3.3.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua tỷ lệ sống sót của

các òng lúa chuyển gen sau khi xử lý hạn

Hình 3.12: Tỷ lệ sống sót của các dòng lúa chuyển gen v dòng

đối chứng sau 2 tuần tƣới nƣớc trở lại trong thí nghiệm xử lý hạn

23

Kết quả, các dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1 và

Lip9:OsNAC1 có khả năng chống chịu stress hạn cao hơn so với cây

lúa không chuyển gen. Đặc biệt, ở các dòng U4.2, U6.1 và L1.1 có tỷ

lệ sống sót ~ 90%, trong khi dòng đối chứng ~ 50%.

KẾT LUẬN

1. Đã phân lập thành công 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã

OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 từ giống lúa Việt Nam. Các gen phân

lập đƣợc có kích thƣớc lần lƣợt 951 bp, 993 bp, 1182 bp và giống

99% (AY596808.1), 98% (AB028184.1) và 92% (AK069257.1) ở

giống lúa Japonica (Niponbare) đã đƣợc công bố trên Ngân hàng Gen

thế giới. Trình tự protein của các gen phân lâp đƣợc chứa đầy đủ các

vùng peptide đặc trƣng cho nhóm protein NAC và vùng tín hiệu định

vị nhân. Các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đều biểu hiện trong

điều kiện xử lý hạn giả định, trong đó gen OsNAC1 có mức độ biểu

hiện cao hơn rõ rệt và duy trì mức độ biểu hiện cao trong thời gian dài

hơn đáng kể so với hai gen còn lại.

2. Đã thiết kế thành công hai hệ vector biểu hiện gen trong tế

bào thực vật: pCAMBIA1301 và pBI101 mang gen OsNAC1 đƣợc

điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục Ubiquitin và 35S;

promoter hoạt động cảm ứng stress Rd29A và Lip9. Các vector mang

cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 đƣợc biến nạp thành công vào các

chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105.

3. Đã chuyển thành công cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos và

Lip9:OsNAC1:Nos vào giống lúa J02. Sự có mặt của cấu trúc biểu

hiện gen đích trong các dòng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng

phƣơng pháp PCR. Các dòng lúa chuyển gen đồng hợp mang một

24

bản copy gen chuyển OsNAC1 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp

qRT-PCR. Biểu hiện của gen chuyển OsNAC1 trong cây chuyển gen

T2 đã đƣợc chứng minh bằng phƣơng pháp RT-PCR.

4. Đã đánh giá sinh trƣởng, phát triển thông qua các chỉ tiêu

nông học (chiều cao cây, số nhánh, số hạt chắc/ bông, thời gian sinh

trƣởng) và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen thông qua

các chỉ tiêu về hình thái (độ cuốn lá), sinh lý (hảm lƣợng nƣớc tƣơng

đối, hàm lƣợng chất diệp lục) và sinh hóa (hàm lƣợng proline, sự sản

sinh chất hoạt hóa oxi hóa). 2 dòng lúa chuyển cấu trúc biểu hiện gen

Ubi:OsNAC1:Nos và 3 dòng lúa chuyển cấu trúc biểu hiện gen

Lip9:OsNAC1:Nos có khả năng sinh trƣởng tƣơng đƣơng với cây đối

chứng trong điều kiện bình thƣờng. Trong điều kiện xử lý stress hạn,

các dòng lúa chuyển gen có các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa

thể hiện khả năng chịu hạn cao hơn dòng lúa đối chứng ở thời kỳ

sinh sản. Đồng thời, tỷ lệ sống sót của các dòng lúa chuyển gen thời

kỳ cây non cao hơn so với dòng đối chứng khi xử lý hạn. Cụ thể, các

dòng lúa chuyển gen L1.1, L4.2, U6.1, L5.1, U4.2 có tỷ lệ sống sót

là 90%, 84%, 81%, 67%, 62% cao hơn dòng đối chứng với tỷ lệ sống

sót chỉ đạt 53%.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu, phân tích các dòng cây chuyển gen

OsNAC1 ở các thế hệ T3, T4… (tính bền vững di truyền, khả

năng duy trì tính chống chịu, năng suất…)..

Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào các đối tƣợng

cây trồng khác với các promoter điều khiển hoạt động cảm

ứng điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phƣơng và Phạm Xuân Hội

(2014), “Phân lập gen OsNAC10 liên quan tới tính chống chịu

hạn từ giống lúa Indica”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(2), tr

319-326

2. Nguyễn Duy Phƣơng, Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội

(2014), “Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC5 liên

quan tới tính chống chịu stress từ giống lúa Indica”, Tạp chí

Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 30(4), tr

40-47.

3. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phƣơng, Trần Lan Đài, Phan

Tuấn Nghĩa và Phạm Xuân Hội (2014), “Thiết kế vector biểu

hiện mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển bởi promoter cảm ứng

điều kiện bất lợi RD29A”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa

học Tự nhiên và Công nghệ 30(4), tr 1-10.

4. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phƣơng, Phan Tuấn Nghĩa,

Phạm Xuân Hội (2016), “Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 liên

quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Japonica”, Tạp chí Nông

nghiệp và phát triển nông thôn 1, tr 17-22.

5. Phạm Thu Hằng, Đàm Quang Hiếu, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm

Xuân Hội (2016), “Thiết kế vector và chuyển gen OsNAC1 liên

quan đến tính chịu hạn vào giống lúa J02 (Oryza sativa L.

japonica), Tạp chí Công nghệ sinh học 14(2), tr 271 – 277.