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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
P53 E O CÂNCER: REVISÃO DA LITERATURA
Vanessa de Sousa Cruz Pimenta Orientador: Eugênio Gonçalves de Araújo
GOIÂNIA 2012
ii
VANESSA DE SOUSA CRUZ PIMENTA
P53 E O CÂNCER: REVISÃO DA LITERATURA
Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Nível: Doutorado
Área de concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Linha de Pesquisa:
Patobiologia animal, experimental e comparada
Orientador:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo - EV/UFG
Comitê de Orientação:
Profª. Dra. Maria Clorinda Soares Fioravanti - EV/UFG
Profª.Dra. Yandra Cassia Lobato do Prado - EV/UFG
GOIÂNIA 2012
iii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 3
2.1 A proteína p53 .................................................................................................. 3
2.2 Vias de sinalização dependentes da proteína p53 ........................................... 7
2.3 Mutação da p53 ................................................................................................ 8
2.4 A influência de outros genes sobre p53 ........................................................... 9
2.4.1 O gene Mdm2 .............................................................................................. 10
2.4.2 Oncogene MCT-1 ........................................................................................ 11
2.4.3 Gene Fox03 ................................................................................................. 12
2.5 A proteína p53 em diversos tipos de câncer .................................................. 13
2.5.1 Osteossarcoma ........................................................................................... 13
2.5.2 Câncer de mama ......................................................................................... 14
2.5.3 Linfoma canino ............................................................................................ 15
2.5.4 Carcinoma espinocelular oral ...................................................................... 15
2.5.6 Papilomavírus Humano ............................................................................... 19
2.5.7 Tumores do trato gastrointestinal ................................................................ 19
2.5.8 Câncer de pele ............................................................................................ 22
2.6 Tratamentos anticâncer e a proteína p53 ....................................................... 24
2.6.1 As pequenas moléculas .............................................................................. 25
2.6.2 A proteína M ................................................................................................ 26
2.6.3 A quinase Cdc7 ........................................................................................... 27
2.6.4 A p53 adenoviral ......................................................................................... 28
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 29
iv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - A) Imunofluorescência de alfa e beta-tubulina, mostando células
epitelias mamárias humanas mononucleadas e binucleadas
(asteriscos). DAPI. B) Imuno FISH combinando alfa e beta tubulina
em conjunto com sondas específicas de DNA para os
cromossomos quatro e 18 revelando duas células tetraplóides
monucleadas (acima), e uma célula tetraplóide binucleada
(abaixo). .............................................................................................. 4
FIGURA 2 - Esquema do ciclo celular mostrando a intérfase (G1, S e G2) e fase
mitótica. O ponto de checagem G1/S é o local onde a p53 efetua o
bloqueio do ciclo, em caso de dano ao DNA. ...................................... 5
FIGURA 3 - Fotomicrografias de fragmentos de neoplasias, marcadas com
anticorpo anti p53. DAB, contracoloração com hematoxilina. A)
Mastocioma canino, mostrando marcação nuclear. B) Linfoma
canino, mostrando marcação no citoplasma. C) Carcinoma tubular
mamário em leoa, mostrando marcação na membrana. ..................... 9
FIGURA 4 - Fotografias de nódulos de adenocarcinoma pulmonar em ratos,
promovidos por xenoenxertos, mostrando que MCT-1 promoveu
um maior desenvolvimento dos tumores, em comparação com o
grupo controle sem MCT-1. ............................................................... 11
FIGURA 5 - Fotomicrografia de fragmento de osteossarcoma canino, marcado
com anticorpo anti p53, mostrando marcação nuclear nas células
tumorais. DAB, contracoloração com hematoxilina de Mayer, 60µm 13
FIGURA 6 - Fotografias mostrando aspecto macroscópico da superfície dorsal
da língua de ratos Wistar. A) Mucosa normal. B) Aspecto irregular
com alterações leves. C) Aspecto irregular com alterações
moderadas. Placas brancas leucoplásicas. D) Aspecto irregular
com alterações graves e superfície papilomatosa erosiva. E) Lesão
exofítica. F) Placa leucoplásica. G) Lesão erosiva na borda lateral
da língua. H) Lesão erosiva com mancha eritroplásica vermelha. .... 16
v
FIGURA 7 - Fotomicrografia de fragmento de carcinoma espinocelular oral em
gato, marcado com anticorpo anti p53. As setas indicam a
marcação nuclear. DAB, contracoloração com hematoxilina. ........... 17
FIGURA 8 - Fotomicrografias de fragmentos de carcinoma basocelular
humano. A) CBC morfeiforme. HE, 100X. B) CBC morfeiforme
marcado com anticorpo anti p53. DAB, contracoloração com
hematoxilina de Harris, 200X. C) CBC nodular. HE, 100X. D) CBC
nodular marcado com anticorpo anti p53. DAB, contracoloração
com hematoxilina de Harris, 200X. .................................................... 23
FIGURA 9 - Fotomicrografias de fragmentos neoplasia cutânea humana,
marcados com anticorpo anti p53. A) Ceratose Actínica. B)
Carcinoma Espinocelular. DAB, contracoloração com hematoxilina
de Harris, 100X. ................................................................................ 24
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
Adp53 p53 adenoviral
BAX Bcl-2 Associated X Protein
CBC Carcinoma basocelular
CdK Cyclin dependent Kinase
CEC Carcinoma espinocelular cutâneo
CECO Carcinoma espinocelular oral
C. elegans Caenorhabditis elegans
CEP-1 Caenorhabditis elegans protein-1
CRC Câncer colorretal
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FASR Fas Receptor
Fox0 Forkhead box
G Gap: intervalo
HPV Papilomavírus Humano
IGF-BP3 Insulin like growth factor binding protein 3
JEG Adenocarcinoma da junção esofagogástrica
MCT-1 múltiplas cópias em doença maligna de células T
Mdm2 Murine doble minute 2
NSCLC Non-small-cell lung carcinoma: carcinoma pulmonar de células
não pequenas
NOXA Gene pró-apoptótico
PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction - Restrictios Fragment Lenght
Polymorphism: Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos
de restrição
PUMA P53 Upregulated Modular of Apoptosis
RITA Reativação de p53 e Indução da Apoptose de células Tumorais
S Synthesis: síntese
TP53 tumor protein 53
UC Colite ulcerosa
XPC Xeroderma pigmentosum-complementation group C
1 INTRODUÇÃO
O câncer é uma doença genética cuja evolução conduz a inúmeras
alterações no DNA. Os proto-oncogenes são genes responsáveis pela regulação
positiva da proliferação celular, enquanto os genes supressores de tumor se
encarregam de inibir a multiplicação das células. Durante o desenvolvimento das
neoplasias ocorre a ativação de proto-oncogenes simultânea a inativação de
genes supressores de tumor. A mutação de um oncogene promove divisões
celulares sem restrição e a mutação de um gene supressor de tumor leva a
produção de proteínas defeituosas.
Há cerca de duas décadas, p53, uma proteína relacionada ao bloqueio
do ciclo celular em caso de dano ao DNA, tornou-se um foco de pesquisas e a
sua bioquímica, suas funções biológicas e sua relevância para o câncer, têm
proporcionado uma série de conhecimentos para a oncologia.
Em 1982 foi feita a primeira descrição dos anticorpos contra a proteína
p53 humana. Inicialmente o método de detecção utilizado era imunoprecipitação,
mais tarde passou a ser realizado por ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay) (CRAWFORD et al., 1982).
A análise sorológica é um ensaio global que não depende da
amostragem e o mecanismo que leva à formação destes anticorpos é pouco
conhecido. Além disso, o acúmulo de p53 mutante também é um componente
importante da resposta humoral e os anticorpos podem reconhecer tanto o tipo
selvagem, quanto a p53 mutante (SOUSSI, 2000).
A imunoistoquímica tem sido utilizada na detecção da proteína p53
mutante em diversas neoplasias. O anticorpo anti p53 reconhece antígenos que
são expressos pelas células neoplásicas, permitindo conhecer melhor a biologia
do câncer e obter informações como imunorreatividade de receptores de
membrana e características proliferativas do tumor (DE NARDI, 2007).
As tecnologias em genética molecular têm favorecido o conhecimento
do gene TP53, mostrando a influência das suas alterações no desenvolvimento
das neoplasias. A procura por terapias seletivas contra o câncer, proporcionando
um direcionamento específico para as células neoplásicas, vem estimulando a
ideia de desenvolver meios para reconstituir a função da p53 selvagem.
2
Com esta revisão de literatura pretendeu-se reunir, de forma global,
informações importantes sobre a p53, especialmente sobre sua ação supressora
de tumor, relação com outros genes, expressão nos diferentes tipos de neoplasias
e papel no tratamento anticâncer.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 A proteína p53
O gene supressor de tumor TP53 (tumor protein 53) está localizado, na
espécie canina, no cromossomo cinco e codifica a proteína p53 (phosphoprotein
53) (MAXIMOV & MAXIMOV, 2008; FERREIRA & ROCHA, 2010).
O TP53 é um gene regulador de uma extensa rede que controla a
integridade do genoma frente a danos celulares, como alterações cromossômicas,
depleção de metabólitos, choque térmico, hipóxia, oncoproteínas virais e ativação
de oncogenes celulares (MENENDEZ et al., 2007; MAXIMOV & MAXIMOV, 2008;
FERREIRA & ROCHA, 2010). A variedade de fatores, como o estresse e
cofatores de transcrição pode influenciar a interação direta entre p53 e o reparo
ao DNA (VOGELSTEIN et al., 2000).
Tais atividades ocorrem durante o desenvolvilmento do câncer e
resultam em mudanças biológicas, como o equilíbrio entre a apoptose e a
sobrevivência celular (MENENDEZ et al., 2007; PETITJEAN et al., 2007). As
células tumorais são geneticamente instáveis e acumulam rearranjos
cromossômicos desequilibrados (PAMPALONA et al., 2012).
Os telômeros, estruturas que formam as extremidades dos
cromossomos, quando excessivamente curtos, promovem instabilidade
cromossômica, observada no início da formação do câncer humano. O
encurtamento dos telômeros ocorre devido à excessiva proliferação celular, com
deficiência no ponto de checagem, por disfunção da p53, promovendo o
aparecimento de extremidades não niveladas, levando a tipos complexos de
anormalidades genômicas que são características das células tumorais humanas
(ARTANDI et al., 2000).
Além dessa disfunção, a tetraploidia, três réplicas para cada
cromossomo, também é observada nos primeiros estágios da carcinogênese
(PAMPALONA et al., 2012).
Para determinar o mecanismo pelo qual a tetraploidia acontece em um
ambiente onde a disfunção telomérica progressiva ocorre, células epiteliais
mamárias humanas foram cultivadas e tratadas para obtenção de preparações
4
cromossômicas em metáfase. A presença de células mononucleadas e
binucleadas (Figura 1) foi analisada por imunofluorescência (PAMPALONA et al.,
2012).
FIGURA 1 - A) Imunofluorescência de alfa e beta-tubulina,
mostando células epitelias mamárias humanas mononucleadas e binucleadas (asteriscos). DAPI. B) Imuno FISH combinando alfa e beta tubulina em conjunto com sondas específicas de DNA para os cromossomos quatro e 18 revelando duas células tetraplóides monucleadas (acima), e uma célula tetraplóide binucleada (abaixo).
Fonte: PAMPALONA et al. (2012)
A maioria das células tetraplóides continham dois núcleos em um único
citoplasma, no entanto, uma fração de células mononucleadas poliplóides
também foi observada. As análises mostraram uma diminuição gradual na
frequência de células binucleadas após a restauração da telomerase e uma
redução significativa após a transdução (PAMPALONA et al., 2012).
Em conjunto, estes resultados demonstram que a restauração da
telomerase reduz a formação espontânea de células binucleadas. Sugerem,
ainda, que os telômeros curtos disfuncionais, associados à deficiência no ponto
de checagem do ciclo celular, por disfunção da p53, podem promover a formação
de células tetraplóides. A inativação, das vias moduladas pela p53, ocorre em
muitos tipos de tumores em ambiente permissivo para a proliferação de células
anormais (PAMPALONA et al., 2012).
5
A proteína p53 está diretamente relacionada ao bloqueio do ciclo
celular (Figura 2), no caso de dano ao DNA. Esta proteína sinaliza o bloqueio do
ciclo celular no ponto de checagem na fase G1/S (Gap – intervalo / Synthesis -
síntese). O ponto de checagem corresponde a um mecanismo para impedir a
formação de células anômalas. A p53 possui vários mecanismos para efetuar o
reparo ou induzir a apoptose, e diferentes fatores induzem a p53 a gerar a
resposta celular mais adequada (ZÖRNIG et al., 2001; BROOKS & GU, 2003; WU
et al., 2006; MAXIMOV & MAXIMOV, 2008).
FIGURA 2 - Esquema do ciclo celular mostrando a intérfase (G1, S e G2) e
fase mitótica. O ponto de checagem G1/S é o local onde a p53 efetua o bloqueio do ciclo, em caso de dano ao DNA.
Fonte: Adaptado de www.sobiologia.com.br
P53 foi a primeira proteína não histona, ou seja, que permanece após
as histonas serem removidas, regulada por acetilação e desacetilação. Os níveis
de acetilação da p53 aumentam, significativamente, em resposta ao estresse. Na
ausência de estresse celular, a proteína p53 é mantida em baixos níveis, sem
exercer efeito sobre o destino da célula. (LUO et al., 2000; OREN, 2003).
6
Os tipos de estresse que promovem a ativação da p53 incluem as
condições associadas com a iniciação e progressão do câncer. Desta forma, p53
é um ativador de transcrição de sequência específica, pois se liga a elementos
dentro do genoma e ativa a transcrição de genes que residem nas imediações
dos locais de ligação. Existe um contexto celular, dentre eles a disponibilidade de
sinais de sobrevivência, definido por eventos de sinalização intra e extracelulares,
que promove alterações genéticas e afeta o estado funcional da p53 (OREN,
2003).
As alterações genéticas que tenham impacto sobre a competência de
outras proteínas associadas à apoptose, o controle do ciclo celular e o reparo de
danos ao DNA, são capazes de modular a probabilidade da ação da p53, bem
como o resultado da ativação biológica e suas múltiplas interações para controlar
o crescimento das células neoplásicas (OREN, 2003).
A escolha de subconjuntos específicos do gene-alvo e as interações de
p53 com outras proteínas podem fazer a diferença entre a vida e a morte, por
apoptose, da célula em questão. O contexto celular, realizado pelo equilíbrio intra
e extracelular nos eventos de sinalização, define se a ativação de p53 poupará a
célula ou levará à sua morte por apoptose. Quando os sinais de sobrevivência
celular estão disponíveis, a ativação de p53 levará, provavelmente, à interrupção
da progressão do ciclo celular. Na ausência de fatores de sobrevivência
adequada, será mais provável que p53 conduza à apoptose (OREN, 2003).
Quando as células sofrem agressão, a p53 se acumula no núcleo, onde
pode regular os seus alvos de transcrição para induzir os eventos como apoptose
e parada do ciclo celular (ZHANG & XIONG, 2001). Logo, na célula, a principal
localização da p53, é o núcleo, onde promove a transativação dos genes-alvo. No
entanto, a p53 também pode ter alguma função de transcrição no citoplasma. E
raramente, por indução da apoptose, será encontrada na membrana (ERSTER et
al., 2004).
Outros papéis para p53 têm sido estabelecidos, incluindo a
senescência, angiogênese, autofagia e metabolismo de carbono e lipídeos
(VOUSDEN & PRIVES, 2009). O Caenorhabditis elegans é um nematódeo
utilizado como modelo para estudar o envelhecimento (MCGEE et al., 2012).
7
CEP-1 (Caenorhabditis elegans protein) é uma proteína, no C. elegans,
evolutivamente relacionada com a p53 do mamífero, cuja expressão é precoce
nos tumores uterinos e diminui com a idade. A partir de oócitos não fertilizados,
C. elegans apresenta crescimentos uterinos exacerbados com a idade,
despertando o interesse pelo estudo dos mecanismos dos fenótipos do
envelhecimento relacionados com a idade germinativa (MCGEE et al., 2012).
CEP-1 controla a transcrição de muitos genes-alvo e promove
apoptose induzida por dano ao DNA. No entanto há uma diminuição significativa
na transcrição de cep-1, com a idade, no C. elegans (DERRY et al., 2001;
SCHUMACHER et al., 2001; MCGEE et al., 2012).
O aumento de danos ao DNA por apoptose induzida, em conjunto com
níveis diminuídos de CEP-1, juntamente com tecidos com prováveis
consequências funcionais, poderia dar mais detalhes sobre a idade de tumores
uterinos em outras espécies. Nos mamíferos, a atividade de p53 também diminui
com a idade, e esta diminuição pode ser um fator contribuinte para o aumento da
incidência das neoplasias na população de idosos (MCGEE et al., 2012).
A p53 humana e canina apresentam estrutura e funções semelhantes
(VELDHOEN & MILNER, 1998).
2.2 Vias de sinalização dependentes da proteína p53
Existem vias de sinalização, no ciclo celular, que são dependentes da
ação da p53. A sequência específica do fator de transcrição da p53 coordena a
expressão de um grande número de genes alvo que participam em diferentes
respostas celulares a condições de estresse (MENENDEZ et al., 2009).
Por meio da ativação da p21, proteína reguladora da transmissão da
fase G1 para S no ciclo celular, p53 controla a fosforilação do complexo molecular
ativo ciclina-CdK (cyclin dependent kinase), interrompendo o ciclo celular
(PECORINO, 2008).
Pela conjugação da p21 à proteína PCNA (proliferating cell nuclear
antigen), p53 promove o reparo ao DNA. Este também ocorre pelo estímulo direto
à proteína codificada pelo gene XPC (Xeroderma pigmentosum-complementation
8
group C), que está envolvido com o reparo por excisão de nucleotídeos
(PECORINO, 2008).
P53, também, induz a apoptose ao regular a expressão de mediadores
anti ou pró-apoptóticos, envolvidos em atividades celulares, como os membros da
família de proteínas Bcl-2: NOXA (gene pro-apoptótico), PUMA (P53 upregulated
modulator of apoptosis), BAX (Bcl-2 associated X protein), proteína FASR (Fas
Receptor) e a proteína IGF-BP3 (Insulin-like growth factor binding protein 3)
(PECORINO, 2008).
A apoptose regulada por p53, quando ativada pela via intrínseca, é
dependente da ativação de Bcl-2, que controla a liberação da proteína citocromo
C, a partir da membrana interna da mitocôndria, promovendo a morte celular
(HAUPT et al., 1995; KELEKAR & THOMPSON, 1998).
2.3 Mutação da p53
A inativação da via p53 no câncer frequentemente ocorre por meio da
expressão da proteína p53 mutante (ANDREOTTI et al., 2011). A proteção celular
é alterada por mutações do gene TP53, combinadas com diferentes
polimorfismos, originando uma proteína não funcional (PIETSCH et al., 2006; WU
et al., 2006). As mutações são herdadas ou ocorrem por exposição à
carcinógenos ambientais ou agentes infecciosos. Acontecem sobre o domínio
central da região codificadora, entre os exons três e nove, alterando a ligação
com as sequências no DNA e promovendo alterações no potencial invasivo e
migratório das células tumorais (CADWELL & ZAMBETTI, 2001; HAGA et al.,
2001; FERREIRA & ROCHA, 2010).
Em resposta ao estresse, a acetilação de p53 pode induzir a acetilação
da lisina 120 (K120), dentro do domínio de ligação ao DNA. Esta lisina é um sítio
de repetição para a mutação da p53 no câncer, retendo a sua capacidade de
interromper o crescimento celular (TANG et al., 2006).
Como um guardião completo da integridade do genoma, p53 mutante
confere as vantagens de promoção da sobrevivência das células cancerosas,
9
exercendo efeitos anti-apoptóticos, essenciais para o desenvolvimento de um
organismo (KIM et al., 2009).
A p53 mutante ocorre em 50% a 70% das neoplasias, está associada à
pior sobrevida global livre de doença e tem sido implicada na resistência às
terapias anticâncer. Sua expressão indica um prognóstico preditivo (NGUYEN et
al., 1996; ZÖRNIG et al., 2001; MILLER et al., 2005; SOUSSI & LOZANO, 2005).
O aumento da frequência de p53 mutante em um nódulo inflamatório
não tumoral, como uma lesão pré neoplásica, pode ser considerado como um
marcador de aumento da susceptibilidade ao câncer (HUSSAIN et al., 2000).
Em células normais a concentração de p53 está abaixo dos valores
detectáveis pela imunoistoquímica, já a p53 mutante se acumula nas células,
sendo eliminada lentamente e expressa pela imunoistoquímica, como evidenciado
na Figura 3 (DE NARDI, 2007).
FIGURA 3 - Fotomicrografias de fragmentos de neoplasias, marcadas com
anticorpo anti p53. DAB, contracoloração com hematoxilina. A) Mastocioma canino, mostrando marcação nuclear. B) Linfoma canino, mostrando marcação no citoplasma. C) Carcinoma tubular mamário em leoa, mostrando marcação na membrana.
2.4 A influência de outros genes sobre p53
Vários genes podem ser recrutados simultaneamente dentro da mesma
célula. A escolha dos genes específicos parece ter envolvimento com a interação
de uma variedade de outras proteínas, favorecendo a transativação de genes pró-
apoptóticos. Qualquer alteração genética que tenha impacto sobre a competência
de outras proteínas envolvidas com a apoptose, controle do ciclo celular ou
reparo aos danos do DNA, também são capazes de modular a resposta da p53 ao
estresse (OREN, 2003).
10
2.4.1 O gene Mdm2
A proteína p53 tem sua função supressora de tumor regulada de forma
negativa, ou seja, inativada pelo gene Mdm2 (Murine doble minute 2). As
alterações genéticas das células tumorais, como a superexpressão de Mdm2,
afetam o estado funcional da p53. A maior parte da regulação negativa de p53 é
executada pela proteína Mdm2, que é um produto de um proto-oncogene
expresso na maioria dos tumores humanos (DEB, 2002; BROOKS & GU, 2006;
TANG et al., 2008).
Mdm2 leva à repressão da expressão de p53 por três mecanismos.
No primeiro, Mdm2 se liga a p53 na seu domínio de transativação e bloqueia sua
capacidade de ativar a transcrição. No segundo, promove a exportação nuclear
de p53 para o citoplasma. E no terceiro, Mdm2 serve como uma ligase de
ubiquitina que promove a degradação de p53 (MICHAEL & OREN, 2003).
Dos três mecanismos, destaca-se a ubiquitinação na extremidade
carboxi-terminal da cadeia polipeptídica, exportando a p53 do núcleo para o
citoplasma, onde a p53 será degradada pelo proteossoma, justificando a
esporádica expressão citoplasmática de p53 pela imunoistoquímica e
caracterizando uma forma mais agressiva de tumor (ZHANG & XIONG, 2001;
TEIXEIRA et al., 2011). Em situações normais, quando há mutação envolvendo o
gene p53, a estrutura quaternária da proteína p53 é modificada, alterando as
posições dos epítopos de MDM2, evitando o processo de degradação, mantendo
um acúmulo da proteína p53 no núcleo da célula (LEHRBACH et al., 2009).
Mdm2 pode interferir na atividade transcricional de p53, em virtude da
sua ligação aos domínios de transativação N-terminal de p53, desempenhando
um papel central na degradação contínua da p53, mesmo sob condições não
estressantes. Mdm2 contém dois sítios no seu primeiro intron e p53 pode se
vincular a estes sítios, acionando a expressão de Mdm2 e estabelecendo uma
retroalimentação negativa de p53, estimulando a síntese de Mdm2 que, por sua
vez, desliga a atividade de p53. (OREN, 2003).
A acetilação da p53 é suficiente para revogar a repressão de Mdm2
durante a resposta ao estresse. Além disso, a acetilação e interação de p53 com
Mdm2, no DNA, resultam na ativação de p53, independentemente do seu estado
11
de fosforilação. Desta forma, as funções de transcrição da p53 podem ser
restauradas pela inativação de Mdm2 (TANG et al., 2008).
2.4.2 Oncogene MCT-1
O oncogene MCT-1 (múltiplas cópias em doença maligna de células T)
é altamente expresso nos linfomas humanos, promovendo a sobrevivência
celular, proliferação e desvio no ponto de checagem (SHI et al., 2003).
Além disso, MCT-1 promove a depressão do gene p53, alterando a
estabilidade da função da p53 selvagem. Em contrapartida, a p53 não pode
conter os impactos tumorais de MCT-1, prosseguindo a malignidade celular
(KASIAPPAN et al., 2010).
Seis sítios de ligação de p53 foram identificados na região MCT-1,
sendo que, em células epiteliais de mama, a redução de p53 pode alterar
inversamente a expressão de MCT-1. O potencial oncogênico de MCT-1 também
foi além da função protetora de p53 em xenoenxertos de células de
adenocarcinoma pulmonar em ratos (Figura 4). O grupo expressando MCT-1
apresentou desenvolvimento do tumor 12,8 vezes maior, comparado ao grupo
controle (KASIAPPAN et al., 2010).
FIGURA 4 - Fotografias de nódulos de adenocarcinoma pulmonar em ratos,
promovidos por xenoenxertos, mostrando que MCT-1 promoveu um maior desenvolvimento dos tumores, em comparação com o grupo controle sem MCT-1.
Fonte: KASIAPPAN et al. (2010)
Nem mesmo a reativação da p53 pôde comprometer o crescimento dos
tumores induzidas pelo MCT-1, ou seja, o potencial oncogênico de MCT-1
12
ultrapassa a capacidade de supressão tumoral de p53. Conseguir um equilíbrio
entre eles poderia determinar a prevenção do desenvolvimento tumoral e a
disfunção de MCT-1 seria uma estratégia para a inibição da tumorigenicidade
(KASIAPPAN et al., 2010).
2.4.3 Gene Fox03
Existe uma ligação entre o envelhecimento e o câncer e as
intervenções que prolongam a vida podem diminuir a incidência de tumores
(MASORO, 2005). Da mesma forma, os genes que estendem a vida fazem parte
de uma rede molecular que suprime a tumorigênese (RENAULT et al., 2011).
O grupo FoxO (Forkhead Box - FoxO1, FoxO3, FoxO4 e FoxO6)
pertence a uma família de genes de fatores de transcrição e desempenha um
papel fundamental na ligação entre a longevidade e a supressão do tumor. Atua,
também, como um supressor de tumor de linhagem específica em mamíferos
(PAIK et al., 2007).
FoxO3 está envolvida com o controle, tanto do envelhecimento quanto
do câncer. Tendo relação, também, com a parada do ciclo celular, o reparo ao
DNA, hipóxia e apoptose (RENAULT et al., 2009).
Além da ligação entre o envelhecimento e o câncer, existe interação,
direta e indireta, entre FoxO3 e p53 na supressão tumoral (WANG et al., 2008).
FoxO3 e p53 compartilham funções em comum, mas estas duas
moléculas podem ter papéis antagonista sobre o tempo de vida no organismo. A
regulação da expressão gênica por FoxO3 e p53 pode ser específica para um
determinado tipo de tecido, podendo funcionar melhor em algumas células em
relação a outras (RENAULT et al., 2011).
A ação de p53 promove o envelhecimento em ratos, vermes e moscas,
diminuindo o tempo de vida em moscas macho, porém aumentando a
longevidade em moscas fêmeas (MAIER et al., 2004; ARUM & JOHNSON, 2007;
SHEN & TOWER, 2010).
As bases moleculares para as diferenças entre FoxO3 e p53 no
envelhecimento não são conhecidas, mas entender a relação entre estas duas
13
proteínas pode fornecer informações essenciais para os mecanismos que
regulam a longevidade (RENAULT et al., 2011).
2.5 A proteína p53 em diversos tipos de câncer
2.5.1 Osteossarcoma
LOUKOPOULOS et al. (2003) avaliaram 167 tumores ósseos caninos
e classificaram os osteossarcomas em subtipos histológicos, de acordo com a
matriz extracelular, em osteoblástico, condroblástico, fibroblástico, pouco
diferenciado, de células gigantes e telangiectásico. A análise foi feita de acordo
com a frequência e intensidade de marcação para p53 (Figura 5). A intensidade
da marcação nuclear foi estimada e expressa como fraca, moderada ou forte. A
marcação citoplasmática foi observada, porém só foi registrada como positiva
quando a marcação nuclear também estava presente.
FIGURA 5 - Fotomicrografia de fragmento de
osteossarcoma canino, marcado com anticorpo anti p53, mostrando marcação nuclear nas células tumorais. DAB, contracoloração com hematoxilina de Mayer, 60µm
Fonte: LOUKOPOULOS et al. (2003)
14
Uma correlação direta foi percebida entre a marcação de p53 e os
parâmetros clínico patológicos, incluindo a avaliação histológica como o número
de figuras mitóticas, grau de necrose tumoral e grau de pleomorfismo nuclear. O
índice de p53 foi maior em osteossarcomas condroblásticos, que apresentam
comportamento biológico mais agressivo e taxa de proliferação celular
descontrolada (LOUKOPOULOS et al., 2003).
2.5.2 Câncer de mama
O câncer de mama é a neoplasia mais comum em cadelas e 50%
destes tumores são malignos, sendo que o seu comportamento biológico é
semelhante ao do mesmo tumor na espécie humana (ZUCCARI et al., 2005).
A expressão de p53 em carcinomas mamários está associada com a
agressividade tumoral, resistência à quimioterapia e recidiva
(KUMARAGURUPARAN et al., 2006).
DE NARDI (2007) analisou 60 amostras de tumores mamários em
cadelas por meio da imunoistoquímica e estabeleceu um escore pontuando a
intensidade da coloração. Houve baixa expressão de p53 nos adenomas e
marcação acentuada nos carcinomas com pior prognóstico, nas metástases e nos
carcinomas inflamatórios, associando a mutação de p53 com a malignidade das
neoplasias mamárias.
TEIXEIRA et al. (2011) avaliaram a expressão da proteína p53, por
imunoistoquímica, em tecido mamário com carcinoma e glândulas normais do
mesmo animal, totalizando 18 cadelas. Analisaram, também, as mutações no
éxon oito do gene Tp53, pela técnica de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction
- Restrictions Fragment Lenght Polymorphism: Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrição). Como marcação imunoistoquímica consideraram a
localização nuclear e citoplasmática. Não foi observada nenhuma expressão da
p53 no grupo das glândulas normais. Também, não houve associação
estatisticamente significativa entre o grau histológico e a intensidade da
imunomarcação no grupo dos carcinomas.
15
O estudo pela técnica de PCR-RFLP apresentou resultados
dependentes de mutações em locais específicos, pois as mutações observadas
no éxon oito foram frequentes, inclusive nas mamas que ainda não apresentavam
alterações histopatológicas. Este exame pode vir a ser uma importante ferramenta
para o estudo da carcinogênese mamária em cadela, permitindo gerar
diagnósticos precoces (TEIXEIRA et al., 2011).
2.5.3 Linfoma canino
As características histológicas, imunológicas e a resposta à terapia do
linfoma são semelhantes no cão e no homem, sendo que nos cães, o linfoma B
ocorre com maior frequência e o linfoma T tem pior prognóstico (KIUPEL et al.,
1999; CALAZANS, 2009). A intensidade da expressão de p53 está relacionada ao
grau histológico do linfoma canino, sendo maior nos linfomas de célula T
(SUEIRO et al., 2004).
A sequência do gene TP53 e a expressão da p53 foram analisadas em
amostras de neoplasia, linfonodo e bulbo piloso de tecido normal de 12 cães com
linfoma canino. A imunomarcação de p53 foi obtida pela imunoistoquímica e a
sequência do gene por extração do DNA genômico e PCR. A maioria (90%) dos
linfomas apresentou expressão de p53. O único linfoma que não apresentou
marcação foi classificado como centrocítico-centroblástico, com baixo grau de
malignidade. As maiores expressões ocorreram nos pacientes com menor tempo
de sobrevida, associando a imunomarcação de p53 com o prognóstico
desfavorável. Não houve relação entre a reatividade pela imunoistoquímica e as
mutações na região entre os éxons quatro e nove do gene TP53 (CALAZANS,
2009).
2.5.4 Carcinoma espinocelular oral
Em todo o mundo, mais de 300.000 novos casos de carcinoma
espinocelular oral (CECO), são diagnosticados por ano, em seres humanos. Os
16
principais fatores associados ao desenvolvimento desta neoplasia são o
tabagismo e o consumo de bebidas alcoólicas (GREENLEE et al., 2000;
MINICUCCI, 2008).
A leucoplasia, placa queratótica branca, é a lesão pré-neoplásica mais
comum que precede o CECO (BRENNAN et al., 2007).
MINICUCCI (2008) investigou o papel da proteína p53 e do gene TP53,
induzindo a carcinogênese bucal por agente químico, em língua de rato Wistar. As
lesões iniciaram após a 12ª semana de tratamento (Figura 6), sendo observado
CECO a partir da 20ª semana. A expressão de p53 nuclear foi observada nas
displasias e no carcinoma. Porém, as amostras estudadas apresentaram
sequenciamento idêntico ao controle utilizado, sem nenhuma mutação na região
entre os éxons cinco e oito do gene TP53. Concluiu-se que a expressão de p53
não foi relacionada à presença de mutações entre os éxons cinco e oito do gene
TP53.
FIGURA 6 - Fotografias mostrando aspecto macroscópico da superfície dorsal da
língua de ratos Wistar. A) Mucosa normal. B) Aspecto irregular com alterações leves. C) Aspecto irregular com alterações moderadas. Placas brancas leucoplásicas. D) Aspecto irregular com alterações graves e superfície papilomatosa erosiva. E) Lesão exofítica. F) Placa leucoplásica. G) Lesão erosiva na borda lateral da língua. H) Lesão erosiva com mancha eritroplásica vermelha.
Fonte: MINICUCCI (2008)
A fumaça, de produtos do tabaco, contem substâncias cancerígenas
que podem afetar o não fumante. A exposição crônica a esta fumaça pode colocar
17
indivíduos não fumantes em risco maior de desenvolver neoplasias. Os gatos que
convivem com indivíduos fumantes podem ser expostos às mesmas situações
ambientais contaminantes, tanto por meio de inalação, quanto por ingestão oral
de partículas do fumo (BUKOWSKI & WARTENBERG, 1997; SNYDER et al.,
2004).
Em felinos, o carcinoma espinocelular oral é uma agressiva neoplasia,
localmente invasiva e frequentemente ulcerativa, podendo causar mudança lítica
em estruturas ósseas subjacentes. Mesmo com tratamento agressivo, as taxas de
sobrevivência por mais de um ano são menores do que 10% (SNYDER et al.,
2004).
SNYDER et al. (2004) realizaram um estudo em 23 amostras de
CECO, associando a expressão da p53 aos fatores como estilo de vida e
exposição ambiental ao fumo do tabaco. Somente a marcação nuclear foi
considerada positiva (Figura 7). Como grupo controle, foi utilizado epitélio normal
da região lingual e sublingual de gato doméstico de pelo curto.
FIGURA 7 - Fotomicrografia de fragmento de
carcinoma espinocelular oral em gato, marcado com anticorpo anti p53. As setas indicam a marcação nuclear. DAB, contracoloração com hematoxilina.
Fonte: SNYDER et al. (2004)
18
As amostras dos gatos expostos ao fumo ambiental apresentaram
expressão 4,5 vezes maior que os tumores de gatos não expostos. Todos os
aspectos investigados, sobre a rotina do animal, correlacionados com a
expressão, positiva ou negativa, de p53 estão listadas na Tabela 1. Os dados
indicam que a expressão de p53 frequentemente ocorre em CECO de gatos
domésticos e sugerem o envolvimento desta proteína na carcinogênese do tumor
(SNYDER et al., 2004).
TABELA 1- Associação entre diversos fatores de risco, no ambiente do gato doméstico, com a expressão de p53 no carcinoma espinocelular oral.
CARACTERÍSTICA AVALIADA VARIÁVEL p53 + p53 - TOTAL
Gênero masculino
feminino
9
6
7
1
16
7
Componente principal da dieta alimento seco
enlatado
5
10
2
6
7
16
Qualquer atum na dieta não
sim
7
8
4
4
11
12
Uso de produto de antipulgas nunca
sempre
6
9
2
6
8
15
Uso de coleira antipulgas nunca
sempre
9
6
4
4
13
10
Uso de xampu antipulgas nunca
sempre
15
0
8
0
23
0
Comprimento da pelagem longo
curto
4
11
5
3
9
14
Exposição domiciliar ao tabaco nunca
sempre
6
9
6
2
12
11
Duração da exposição em
anos*
< 5 anos
≥ 5 anos
7
7
7
1
14
8
Número de cigarros por dia* < 20
≥ 20
11
3
7
1
18
4
*Análise limitada aos gatos expostos a qualquer agregado fumante Fonte: Adaptado de SNYDER et al. (2004)
19
SNYDER et al. (2004) encontraram uma forte associação entre a
marcação de p53 e a exposição ao fumo ambiental nas amostras de CECO. Além
disso, gatas e felinos de pelo curto têm uma probabilidade de maior expressão
desta proteína. Alimentos enlatados, ingestão de atum e utilização de produtos
antipulgas aumentam o risco do CECO em gatos, no entanto, não estão
associados ao aumento da expressão de p53.
2.5.5 Papilomavírus humano
O papilomavírus humano (HPV) desempenha um importante papel na
indução de carcinomas do colo uterino. A maioria dos carcinomas cervicais
expressa uma oncoproteína viral, que promove a degradação da p53 e a
transferência horizontal de oncogenes de HPV, podendo ser um mecanismo
alternativo de carcinogênese (GAIFFE et al., 2012).
Os oncogenes do HPV são capazes de transformar células e bloquear
a via de supressão da p53. O DNA viral, transferido por células apoptóticas, pode
ser reutilizado pelas células receptoras, que expressam diminuição dos níveis de
p53 selvagem, podendo explicar as alterações no circuito de controle do
crescimento e a transformação cancerosa (BERGSMEDH et al., 2002;
BERGSMEDH et al., 2006).
2.5.6 Tumores do trato gastrointestinal
O câncer de esôfago representa a terceira causa mais comum de
câncer do trato gastrointestinal em seres humanos. Fatores ambientais, estilo de
vida, doença celíaca e raça negra são fatores predisponentes a este tipo de
câncer. O TP53 é o principal gene alterado nos tumores de esôfago, sendo que o
carcinoma esofágico apresenta a segunda maior incidência de mutação deste
gene (COTRAN et al., 2000).
FELIN et al. (2008) escolheram 31 amostras de carcinoma de células
escamosas de esôfago humano. Amostras de áreas não-tumorais da mucosa
20
adjacente, referentes a cada caso, foram incluídas no estudo para fins de
comparação. A expressão de p53 foi considerada positiva quando a marcação
nuclear ocorreu em quantidade igual ou superior a 10%. A análise
imunoistoquímica foi estatisticamente diferente do tecido normal em 15 amostras
tumorais, ou seja, 48,38% das amostras tumorais apresentaram p53 mutante.
Com base nos achados deste estudo, a proteína p53 não pode ser associada ao
estadiamento destes tumores, devendo ser mais amplamente estudada em
relação a outros parâmetros histopatológicos.
O adenocarcinoma da junção esofagogástrica (JEG) é um tumor que
acontece 5 cm acima ou abaixo da cárdia anatômica. Nas últimas décadas houve
uma aumento considerável do número de casos de (JEG) nos países ocidentais.
No Brasil, esta é uma neoplasia comum, com taxa de mortalidade elevada
(SIEWERT & STEIN, 1998).
Cortes histológicos de 75 JEG foram analisados por imunoistoquímica
para a p53, tendo marcação positiva em todos os tumores, mas não houve
associação entre a expressão e a invasão vascular ou perineural, características
que determinam a sobrevida geral nos pacientes com JEG (LEHRBACH et al.,
2009).
O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum em homens
e o segundo em mulheres. Há 943.000 novos casos por ano. Condições
associadas à polipose podem ter início na segunda década de vida, sendo que o
carcinoma se desenvolve, em média, dez anos após o aparecimento dos pólipos
(BISHNUPURI et al., 2006; ARMAGHANY et al., 2012).
Uma sequência de eventos leva ao desenvolvimento do câncer
colorretal, onde o epitélio passa por transformações invasivas, correlacionadas
com a progressão da neoplasia. As vias específicas para o seu desenvolvimento
resultam em mutação e diferenciação de genes que regulam o crescimento
celular. Estas alterações genéticas levam à inativação de genes supressores de
tumor, como o TP53. A p53 mutante transforma a divisão celular em um processo
descontrolado e induz a formação do CRC (FEARON & VOGELSTEIN, 1990;
LIMA et al., 2006).
O acúmulo de células indiferenciadas nas criptas do cólon leva à
formação de um pólipo e as mutações subsequentes, envolvendo o geneTP53,
21
podem levar ao carcinoma. A mutação da p53 ocorre, geralmente, durante a
instabilidade cromossômica, no momento da transição adenoma-carcinoma
(LANE & BENCHIMOL, 1990; ARMAGHANY et al., 2012).
Durante um estudo sobre o significado prognóstico da mutação da p53,
os pacientes com CRC e expressão positiva da proteína, tiveram cinco anos de
tempo de sobrevida, enquanto que os pacientes com expressão negativa
sobreviveram por dez anos (ZENG et al., 1994). Entretanto, em outro estudo, a
expressão de p53 nos pacientes em tratamento com quimioterapia, não teve valor
prognóstico significativo (POPAT et al., 2006).
MENEZES et al. (2010) avaliaram a expressão imunoistoquímica da
proteína p53 em 82 casos de CRC, correlacionando-a com fatores prognósticos.
O intervalo livre da doença foi considerado a partir da remoção cirúrgica até a
recorrência local ou distante do tumor, variando entre seis e 64 meses. A
expressão de p53 foi positiva em 70 tumores (85,4%) e negativa em 12 (14,6%),
sendo positiva em 84,6% dos tumores de baixo grau e 100% positiva entre os
tumores de alto grau.
Houve recorrência do tumor em 18 pacientes. Não houve correlação,
estatisticamente significativa, entre a expressão imunoistoquímica e a recorrência.
Nos 16 pacientes que morreram durante o período do pós-operatório, a p53 foi
positiva em 14 (87,5%) e negativa em dois (12,5%) (MENEZES et al., 2010).
A colite ulcerosa (UC) é uma doença inflamatória crônica que produz
espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e aumenta o risco do CRC. A
instabilidade tem sido relatada em UC, podendo gerar um fenótipo mutante,
levando ao desenvolvimento do câncer (RABINOVITCH et al., 1999).
HUSSAIN et al. (2000) submeteram lesões ativas e amostras normais
de cólon à análise de códons do gene TP53. As lesões mostraram quantidade
variável de inflamação, incluindo infiltração de neutrófilos com formação de
microabscessos. Foi encontrada alta frequência de alelos de p53 mutante nas
lesões com inflamação, sendo que o mesmo não ocorreu nas lesões normais do
grupo controle, tornando consistente a hipótese de que espécies reativas,
produzidas durante a inflamação, podem induzir estas mutações (HUSSAIN et al.,
2000).
22
HUSSAIN et al. (2000) observaram que um número significativo de
pacientes com UC possuem uma carga elevada de p53 mutante, sugerindo
estudos prospectivos para determinar se UC, com expressão de p53 mutante, têm
maior probabilidade de desenvolver CRC.
2.5.8 Câncer de pele
O carcinoma basocelular (CBC) é o tipo de câncer de pele mais comum
em humanos. Ocorre, principalmente, em pessoas com mais de 50 anos de idade
e gênero masculino. Apresenta-se como nódulo infiltrativo, da cor da pele,
eritematoso ou de coloração acastanhada, com telangiectasias e aspecto
perolado. O crescimento é lento, de baixa agressividade e raramente apresenta
metástase (LAGE et al., 2001; CORREA et al., 2009).
Para identificação dos fatores de risco para o desenvolvimento de
lesões mais agressivas, com maior potencial de recidiva e metástases, CORREA
et al. (2009) avaliaram a expressão de p53 em 15 casos de CBC com diagnóstico
histopatológico confirmado, comparando com amostras de indivíduos normais do
grupo controle. Nos testes imunoistoquímicos, foram consideradas positivas as
reações estritamente nucleares (Figura 8). Nenhum dos pacientes do grupo
controle apresentou expressão desse marcador e, de acordo com os resultados
encontrados neste estudo, a expressão da p53 pode indicar uma tendência à
gravidade do carcinoma basocelular.
23
FIGURA 8 - Fotomicrografias de fragmentos de carcinoma basocelular humano.
A) CBC morfeiforme. HE, 100X. B) CBC morfeiforme marcado com anticorpo anti p53. DAB, contracoloração com hematoxilina de Harris, 200X. C) CBC nodular. HE, 100X. D) CBC nodular marcado com anticorpo anti p53. DAB, contracoloração com hematoxilina de Harris, 200X.
Fonte: CORREA et al. (2009) O carcinoma espinocelular cutâneo (CEC) representa 20% das
neoplasias malignas cutâneas em humanos e origina-se a partir da proliferação
de células escamosas atípicas e lesões não invasivas como a ceratose actínica
(DORNELAS et al., 2009).
DORNELAS et al. (2009) estudaram amostras de 30 pacientes, sendo
dez com diagnóstico histopatológico de ceratose actínica, dez com carcinoma
espinocelular e dez amostras de pele de pálpebra, do grupo controle negativo. O
perfil imunoistoquímico das lesões foi considerado positivo quando as células
apresentavam coloração acastanhada, estritamente nuclear para p53. Houve
expressão de p53 (Figura 9), em todos os casos avaliados, sendo graduada em
escala de um a quatro pontos. Os resultados, quando associados a outros
24
indicadores como a análise histopatológica e a apresentação clínica, sugerem que
a expressão de p53 reflete o grau de malignidade destas lesões cutâneas,
permitindo um diagnóstico mais seguro (DORNELAS et al., 2009).
FIGURA 9 - Fotomicrografias de fragmentos neoplasia cutânea humana,
marcados com anticorpo anti p53. A) Ceratose Actínica. B) Carcinoma Espinocelular. DAB, contracoloração com hematoxilina de Harris, 100X.
Fonte: DORNELAS et al. (2009)
2.6 Tratamentos anticâncer e a proteína p53
Tanto a senescência, quanto a apoptose contribuem para a ação do
quimioterápico e a perda de qualquer processo promove a falha do tratamento.
Diversos agentes anticancerígenos podem induzir a apoptose através de vias
comuns e, as mutações que desativam estas vias, podem promover resistência a
estes quimioterápicos. Os agentes anticâncer podem ativar a p53 selvagem a
promover a apoptose, no entanto, os defeitos apoptóticos contribuem para a má
evolução de pacientes portadores de tumores com p53 mutante. Além disso, a
perda da função de p53 também pode determinar resistência ao tratamento
(JOHNSTONE et al., 2002; SCHMITT et al., 2002).
A quimioterapia continua sendo o principal tratamento para doenças
malignas sistêmicas. No entanto, alguns tumores são insensíveis a agentes
quimioterápicos e outros adquirem resistência sobre a recidiva (JOHNSTONE et
al., 2002).
Em linhagens celulares e em modelos experimentais utilizando animais
é possível estabelecer que a reconstituição da atividade de p53 pode levar à
25
morte de células tumorais e a regressão de tumores já estabelecidos. Estes
resultados têm estimulado a ideia de desenvolver meios para restaurar a função
da p53 selvagem nas células neoplásicas (FOSTER et al., 1999; ANDREOTTI et
al., 2011).
A ativação excessiva de p53 é considerada como uma oportunidade de
opção para terapias seletivas contra o câncer, proporcionando um direcionamento
para as células neoplásicas e poupando o tecido normal não afetado pelo câncer
(OREN, 2003).
2.6.1 As pequenas moléculas
Uma proposta de tratamento, visando a inibição do crescimento
tumoral, é a ativação da via de p53 através da supressão da proteína Mdm2. Com
o objetivo de identificar compostos que pudessem inibir a interação p53-Mdm2,
VASSILEV et al. (2004) selecionaram, em uma biblioteca química, os compostos
nutlins. Nutlins são imidazolínicos análogos que inibem a interação entre Mdm2 e
p53. Procedeu-se o tratamento de células de cultivo do câncer de cólon, com a
finalidade de promover a estabilização e o acúmulo da proteína p53, bloqueando
sua saída e promovendo a ativação de outros genes regulados pela proteína p53.
Os resultados confirmaram que a p53 do tipo selvagem pode se acumular nas
células tratadas com nutlin-1, elevando os níveis de Mdm2, consistente com a
ativação da via de p53.
Para confirmar se o acúmulo de p53 era devido à degradação da
proteína ao invés da expressão elevada do gene TP53, foram tratadas três linhas
celulares com nutlin-1 durante 8 horas A transcrição de p21 aumentou, de forma
dependente da dose, nas 3 linhas de células, consistente com o acúmulo da p53.
Em contraste, o gene TP53 não foi alterado por nutlin-1, mesmo na mais alta
concentração (VASSILEV et al., 2004).
Foi feita análise do ciclo, para detecção de células em proliferação
confirmando que nutlin-1 ativa a função celular da via p53. Além do nutlin-1, duas
drogas genotóxicos, doxorrubicina (antibiótico da família das antraciclinas) e
fosfato de etoposido (inibidor da enzima topoisomerase II) foram analisadas por
26
western blot, revelando que todos os três compostos induziram o acúmulo de p53.
No entanto, somente a doxorrubicina e o etoposido causaram fosforilação,
sugerindo que nutlin-1, provavelmente, não contribua com mecanismos
genotóxicos, para a ativação de p53 (VASSILEV et al., 2004).
VASSILEV et al. (2005) também avaliaram se nutlin-3 poderia suprimir
o crescimento de xenoenxertos de tumores de osteossarcoma humano em
camundongos. A utilização de nutlin-3, por via oral inibiu o crescimento do tumor,
sem perda significativa de peso e sem anormalidades durante a necropsia.
Da mesma forma, ANDREOTTI et al. (2011) analisaram a interação
funcional p53-Mdm2, bem como o impacto das pequenas moléculas nessa
interação. Nutlin se ligou a Mdm2 e RITA (reativação de p53 e indução da
apoptose de células tumorais) a p53, levando a mudanças conformacionais nas
proteínas. O tratamento com nutlin afetou diretamente a ligação de Mdm2 com a
região amino-terminal de p53, conduzindo ao acúmulo de p53 em várias células
tumorais, interrompendo o ciclo celular, sem muita evidência de toxicidade.
RITA é uma pequena molécula que se liga à p53, induzindo o seu
acúmulo nas células tumorais. Além disso, RITA inibe a interação p53-Mdm-2,
minimizando os efeitos reguladores negativos da Mdm-2 sobre a p53. Ao induzir
esta molécula, foi possível promover a apoptose em linhagens de células
tumorais, expressando a p53 selvagem. RITA pode ser uma esperança no
desenvolvimento de novas drogas antineoplásicas a partir da atividade da p53
selvagem (ISSAEVA et al., 2004).
2.6.2 A proteína M
Com a intenção de aumentar a resistência ao câncer, a proteína M foi
examinada em vários contextos celulares. Esta proteína interage com o tipo
selvagem da p53, aumentando a sua estabilidade e mantendo a sua localização
nuclear intacta e funcional, mesmo na ausência de estresse. Ao impedir a saída
da p53 para o citoplasma, consegue evitar a sua degradação, promovendo um
estado de hiperatividade crônica (MOORE et al., 2007).
27
Para avaliar as funções antiproliferativas da proteína M, na presença e
ausência de p53, ensaios de supressão de colônias foram realizados em três
linhas de células de osteossarcoma humano. Quando a proteína M foi introduzida
nestas células, houve supressão da formação de colônias, sugerindo que esta
proteína tem funções supressivas de crescimento, independente de p53. Com a
adição de p53 selvagem houve um aumento significativo na supressão do
crescimento e redução na formação das colônias. Estes resultados sugerem que
a proteína M pode melhorar a função supressora de colônias de p53 (MOORE et
al., 2007).
Em outro estudo, ao gerar ratos com alterações no tipo selvagem da
p53, promovendo um alelo truncado, sob o efeito da proteína M, foi possível
perceber alta resistência ao desenvolvimento de tumores. No entanto, estes ratos
exibiram início precoce de sintomas associados ao envelhecimento, tais como
redução do peso, atrofia muscular, osteoporose e uma diminuição da tolerância
ao estresse (TYNER et al., 2002).
2.6.3 A quinase Cdc7
Cdc7 é uma quinase que desempenha um papel crítico na origem da
replicação do DNA, sendo essencial para a proliferação de células nos
mamíferos. No entanto, sua depleção provoca a morte celular, mesmo em células
p53 positivas (MASAI & ARAI, 2002; YAMASHITA et al., 2005).
Neste contexto, a morte celular foi induzida em células tumorais p53
positivas e negativas. Utilizou-se uma linhagem de células de câncer colorretal,
analisando os efeitos da depleção da Cdc7. Em muitas células cancerosas, a
depleção de Cdc7 provocou a morte celular. Em seguida, examinou-se o efeito de
agentes genotóxicos, utilizados em tratamentos convencionais para o câncer, em
combinação com inibidores de Cdc7, concluindo que o tratamento simultâneo
estimula a apoptose. Os melhores resultados foram obtidos em células
cancerígenas p53 positivas. No entanto, o mesmo resultado não foi observado em
células p53 negativas (ITO et al., 2012).
28
2.6.4 A p53 adenoviral
As abordagens envolvendo terapia gênica de segmentação do gene
p53 têm sido exploradas para reforçar tratamentos quimioterápicos em pacientes
oncológicos. A p53 adenoviral (Adp53) é um adenovírus mediado (Ad) contendo
transferência de p53 humana (NEMUNAITIS et al., 2000).
Vinte e quatro pacientes humanos com avançado estágio de carcinoma
pulmonar de células não pequenas (NSCLC: Non-small-cell lung carcinoma)
receberam um total de 83 injeções intratumoral com Adp53 associadas ao
tratamento quimioterápico com cisplatina. A administração foi feita por
broncoscopia ou por via percutânea (KLASTERSKY et al., 1989; NGUYEN et al.,
1996; NEMUNAITIS et al., 2000).
O grau de apoptose foi avaliado em amostras de biópsias coletadas
antes do tratamento e no sétimo dia de cada curso de administração. O índice de
apoptose foi registrado como o número de células positivas observadas por
número de células avaliadas. Se uma única célula foi positiva, esta foi
interpretada como evidência de apoptose. Dezessete pacientes obtiveram uma
melhora na resposta clínica da doença e dois pacientes uma resposta parcial. A
cisplatina isolada induz um baixo grau de apoptose nas células tumorais,
enquanto a maioria dos pacientes mostrou um aumento no índice de apoptose
com a suplementação de Adp53. A injeção intratumoral com Adp53, em
combinação com a cisplatina, foi bem tolerada, sendo a febre a única toxicidade
relacionada ao tratamento (NEMUNAITIS et al., 2000).
29
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As mutações no gene TP53 podem não ter correlação com a
expressão de p53, no entanto cada tipo de câncer parece ter envolvimento com
mutações em éxons diferentes.
É preciso conhecer a p53 e manter-se informado sobre suas
atualizações e descobertas para interpretar os resultados da sua expressão nos
diferentes tipos de câncer. As divergências podem ocorrer por muitos fatores,
incluindo a diferença nos anticorpos utilizados, os métodos de fixação, a
intensidade e localização da marcação, a subjetividade da interpretação e a
técnica empregada.
A maioria dos estudos, que utiliza a imunoistoquímica, não considera a
localização citoplasmática como marcação, sendo que ela é frequente e tem
ligação com o mecanismo de exportação nuclear de p53 para o citoplasma,
promovido pela ação inibidora de Mdm2. Este fato pode representar uma forma
de transformação tumoral, como característica de maior agressividade.
A avaliação de p53 pode ser útil na identificação precoce do câncer,
em indivíduos com exposição a agentes cancerígenos, em situações clínicas
onde as lesões não malignas podem ser detectadas antes da progressão para o
câncer e para determinar o prognóstico de neoplasias já existentes.
Restaurar a função da p53 selvagem parece ser uma esperança na
busca de terapias seletivas contra o câncer, haja visto os resultados que têm sido
obtidos por meio de estudos que envolvem cultivo celular e técnicas de
diagnóstico molecular.
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