Panduan Praktikum Bioteknologi Kelautan

7/25/2019 Panduan Praktikum Bioteknologi Kelautan

1/41

BUKU PANDUAN PRAKTIKUM

MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI KELAUTAN

ANALISIS DATA DNA

Oleh:

Ade Yamindago, S. Kel., M. Sc., MP.

Cynthia Asthari Kris Hardani

Marufah

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2014


2/41

PENDAHULUAN

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan materi genetik yang dicopy dari

induknya. DNA disusun oleh empat tipe nukleotida (basa nukleotida) dan gula

pentosa (deoxyribosa) yang berikatan membentuk rantai polinukleotida ganda

(double helix) melalui ikatan fosfat. Basa nukleotida terdiri dari grup Purin

(Adenine-Guanine) dan Pirimidin (Thymine-Cytocine). Ikatan antar basa

nukleotida yaitu ikatan hidrogen yang mengikat A-T dengan dua ikatan dan G-C

dengan tiga ikatan.

Analisis DNA menggunakan sekuens DNA yang dihasilkan dari proses

ekstraksi jarigan organisme, PCR (Polymerase Chain Reaction), dan

elektroforesis serta sekuensing. Ekstraksi DNA jaringan merupakan tahap

pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. Ekstraksi DNA juga diperlukan

cukup banyak prosedur kerja laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan

membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen

sel yang lain (Syafaruddin et al, 2011).

PCR terdiri dari tiga tahap utama yaitu denaturasi, annealing, dan

ekstensi atau yang terkadang disebut polimerasi. Menurut Toha (2001), tahap

denaturasi bertujuan untuk memutuskan ikatan hidrogen dari DNA rantai gandayang akan diamplikasi. Hasil yang diperoleh merupakan DNA rantai tunggal

untuk penempelan primer saat tahap annealing. Pada tahap annealing terbentuk

ikatan baru antara untai tunggal DNA cetakan dengan primer. Tahap ekstensi

atau polimerasi merupakan tahap pemanjangan rantai tunggal primer dengan

enzim DNA polimerase. Ketiga tahap ini membutuhkan temperatur dengan

variasi tertentu tergantung dari sampel yang digunakan sehingga tidak ada

standar yang sama untuk temperatur pada tahap-tahap tersebut. Maka

temperatur yang digunakan dapat berbeda untuk organisme, sel, dan gen yangberbeda pula.

Prinsip kerja elektroforesis yaitu adanya aliran protein dari kutub negatif

(-) menuju ke kutub positif (+) sesuai dengan Fatchiyah et al (2011), bahwa

kecepatan molekul yang bergerak pada suatu medan listrik tergantung pada

muatan, bentuk, dan ukuran. Molekul yang bergerak ini memerlukan medium

sebagai matriks penyangga, yang biasa digunakan adalah gel agarose. Gel

diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk menghubungkan

kutub negatif dan positif. Besarnya molekul yang bermuatan listrik tergantung


3/41

pada pH dan komposisi medium dimana molekul tersebut terlarut. Pada pH

rendah, protein bersifat kation (bermuatan positif) yang bergerak ke katoda

(bermuatan negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat anion (bermuatan negatif)

yang bergerak ke anoda (bermuatan positif). Oleh karena itu, pH buffer

elektroforesis yang berkisar antara 8-9 akan menyebabkan protein bermuatan

negatif yang akan bergerak ke anoda.

Jika telah didapatkan sampel yang positif mengandung band DNA,

sampel hasil PCR dikemas untuk dilakukan proses sekuensing. Hasil sekuensing

berupa format ab1 file yang biasa disebut sebagai elektrophoregram atau

kromatogram dari sekuens DNA hasil primer forward dan primer reverse.

Selanjutnya, data tersebut akan mengalami proses edit dan alignment DNA

menggunakan software MEGA (The Molecular Evalutionary Genetic Analysis).

Proses edit dan alignmentadalah untuk mendapatkan sekuens gabungan terbaik

dari kedua primer, untuk mempermudah identifikasi menggunakan BLAST (Basic

Local Alignment Search Tool) dan digunakan pada analisis filogeni dan DNA

Barcoding.

Aplikasi data DNA dapat digunakan pada analisis filogeni dan DNA

Barcoding. Analisis filogeni merupakan analisis kekerabatan antar organisme

yang menggunakan fragmen sekuens DNA yang berasal dari gen mitokondria

dan nukleus. Selain itu, analisis filogeni dapat pula menggunakan complete

genomedengan mengikutsertakan sekuens dari seluruh gen yang ada.

DNA barcoding merupakan metode yang digunakan untuk

mengidentifikasi spesies menggunakan urutan sekuens DNA pada studi

keanekaragaman hayati, identifikasi dan taksonomi organisme, serta analisis

forensik. Dengan teknik ini proses identifikasi dapat lebih cepat dan akurat

sehingga mampu mengidentifikasi suatu spesies baru (Lucas et al., 2012).

DNA barcoding berguna untuk mempercepat identifikasi DNA dari

organisme jenis baru yang akan dikoleksi pada herbarium dan museum. DNA

barcoding menggunakan data fragmen sekuens DNA hingga tingkat spesies

untuk menghasilkan informasi yang lebih detail. Tingkat akurasi sekuens DNA

dapat diketahui melalui kemampuan sekuens tersebut untuk mengidentifikasi

suatu organisme. Pada saat sekuensing dilakukan dan jika ditemukan organisme

baru, maka hal ini akan memperkaya obyek studi tentang keanekaragaman

hayati (Hollingsworth, 2007).


4/41

1. Pengenalan Database

Database sekuens DNA tersimpan pada GenBank pada laman

website open access sehingga dapat diakses dimanapun selama tersedia

koneksi internet. Ada beberapa database yang dapat diakses yaitu DataBank

of Japan (DDBJ), the European Molecular Biology Laboratory (EMBL),

Barcode of Life Database (BOLD) dan GenBankyang akan kita pelajari yaitu

NCBI (National Center for Biotechnology Information). NCBI merupakan

server yang memuat databasetentang informasi kesehatan dan bioteknologi.

Database terus menerus diperbarui sesuai dengan penemuan-penemuan

terkini yang menyangkut DNA, protein, senyawa aktif, dan taksonomi.

Disamping database, NCBI juga menyediakan berbagai macam fasilitas

untuk analisis DNA, protein 3D, pencarian primer, dan lain sebagainya. NCBI

merupakan salah satu bank data gen, protein dan literatur khususnya

dibidang kesehatan yang terlengkap dan dijadikan acuan oleh para peneliti

didunia.

Laman website NCBI dapat dibuka dengan mengetikkan

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pada address barkemudian tekan enter. Muncul

tampilan awal laman websiteNCBI seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Tampilan Awal WebsiteNCBI

Langkah yang dapat dilakukan untuk mencari sekuens DNA yaitu

dengan meng-klik tombok segitiga di pojok kiri atas menjadi nucleotide.

Ketikkan nama spesies yang akan dicari beserta nama gennya untuk

mempercepat pencarian, kemudian klik tombol Search.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


5/41

Selain itu, terdapat pula sistem BLAST yang dapat diakses pada

laman http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool) dapat digunakan untuk menentukan homologi suatu urutan

DNA atau asam amino dengan data yang ada di NCBI (National Center for

Biotechnology Information). Berdasarkan Widodo dan Miftakhunnafisah

(2010), BLAST memiliki menu analisis pensejajaran (alignment analysis).

Analisis pensejajaran dapat digunakan untuk membandingkan dua sekuen

atau lebih. Program ini dapat diakses melalui website National Center for

Biotechnology Information at The National Library of Medicine in Washington,

DC). Laman websiteini dapat digunakan untuk melihat urutan sekuens data

penelitian dengan sekuens yang terdapat pada GenBank. Proses BLAST

dapat pula dilakukan melalui software MEGA versi 5.2 dengan

menghubungkan software tersebut dengan NCBI seperti Gambar 2.

Gambar 2. Tampilan Menu BLAST pada NCBI

2. MEGA 5.2

MEGA 5.2 (The Molecular Evalutionary Genetic Analysis) merupakan

perangkat lunak yang dikembangkan dengan tujuan untuk menyediakan

pusat informasi biologi, analisis statistik dari DNA, dan data-data sekuens

DNA serta protein dari sudut pandang evolusi. MEGA 5.2 terus berkembang

hingga dapat juga digunakan untuk visualisasi dan rekonstruksi pohon

filogenetik serta menguji berbagai hipotesis evolusi Tamura et al(2011).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST


6/41

2.1 Proses Analisis Hasil Sekuensing

Skema kerja proses analisis hasil sekuensing dapat dilihat pada Gambar

3 berikut ini :

Memasukkan kedua sekuens DNA hasil dari primer forward

dan reverse pada MEGA 5.2

Menghapus huruf N di bagian awal sekuens dan bagian akhir

sekuens

Menggabungkan sekuens DNA hasil dari primer forward dan

reverseyang masing-masing telah diedit

Memulai proses BLAST pada laman website

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Melakukan analisis hubungan filogenetik antar spesies sampel

penelitian menggunakan MEGA 5.2

Prosedur KerjaLangkah pertama yang dilakukan adalah dengan membuka MEGA 5.2 dengan

cara klik Start lalu pilih MEGA 5.2 atau klik dua kali pada ikon MEGA 5.2 yang

terdapat pada desktop, seperti pada Gambar 4.

Gambar 4. Membuka SoftwareMEGA 5.2

Hasil

Sekuens DNA

Gambar 3. Skema Kerja Proses Analis Sekuensing
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


7/41

Selanjutnya, akan terbuka tampilan awal MEGA 5.2 seperti pada Gambar 5.

Gambar 5. Tampilan Awal SoftwareMEGA 5.2

Setelah terbuka tampilan awal MEGA 5.2, klik menu Align lalu pilih Edit/Build

Alignment untuk melakukan alignmentsekuens DNA seperti pada Gambar 6.

Gambar 6. Menu Edit/Build Alignment

Pilih Create a New Alignmentpada kotak dialog yang muncul untuk menampilkan

lembar dokumen baru dari proses alignmentsekuens DNA seperti pada Gambar

7.

Gambar 7. Menu Create a New Alignment


8/41

Pilih DNA pada kotak dialog Are you building a DNA or Protein sequence

alignment? Hal ini disebabkan karena akan dilakukan proses edit sekuens DNA

bukan Protein seperti pada Gambar 8.

Gambar 8. Kotak Dialog konfirmasi data

Muncul tampilan seperti pada Gambar 9 berikut ini yaitu menu DNA alignment.

Gambar 9. Tampilan Menu DNA Alignment

Pilih ikon menu View/Edit trace data from DNA sequencersseperti pada Gambar

10 untuk memulai menggabungkan dua data berbentuk elektrophoregram atau

kromatogram yang didapatkan sebagai hasil dari proses sekuensing dengan

primer forwarddan primer reverse.


9/41

Gambar 10. Tampilan Menu View/Edit trace data from DNA sequencers

Hasil sekuensing yang diperoleh berupa elektrophoregram atau kromatogram

dimana terdapat berbagai garis warna-warni yang membentuk puncak (peak)

sebagai simbol dari nukleotida yang teridentifikasi saat proses sekuensing.

Nukleotida A (Adenin) berwarna hijau, nukleotida G (Guanin) berwarna hitam,

nukleotida C (Citosin) berwarna biru, dan nukleotida T (Timin) berwarna merah.

Pola warna pada elektrophoregram ini sama dengan pola warna yang

dikemukakan oleh Ratnayani et al(2007) dalamFerita et al(2012). Setiap satu

sampel yang diidentifikasi berdasarkan primer, terdapat dua hasil sekuensing

dari dua primer yang digunakan yaitu primer forward dan primer reverse.

Pilih dua data format elektrophoregram berdasarkan primer masing-masing yang

tersimpan pada PC dengan cara tekan dan tahan tombol Shiftserta klik masing-

masing elektrophoregram lalu pilih Openseperti pada Gambar 11 berikut ini.


10/41

Gambar 11. Membuka Data Format ab1 File

Maka akan terbuka data sekuens DNA dari primer forward dan reverseseperti

pada Gambar 12 dan Gambar 13.

Gambar 12. Sekuens DNA Hasil dari Primer Forward

Gambar 13. Sekuens DNA Hasil dari Primer Reverse

Pilih menuAdd unmasked sequence to Alignment Exploreruntuk primer forward.

Pada primer forward, data sekuens dapat langsung dimasukkan pada software


11/41

MEGA 5.2 tanpa harus dilakukan Reverse complement sequenceterlebih dahulu

seperti pada Gambar 14.

Gambar 14. MenuAdd unmasked sequence to Alignment Explorer

Data sekuens primer forwardakan masuk ke dalam menu Alignment DNApada

MEGA 5.2 seperti pada Gambar 15.

Gambar 15. Sekuens DNA Hasil dari Primer Forwardpada MenuAlignment DNA

Buka data elektrophoregram untuk primer reverse lalu pilih menu Reverse

complement sequenceuntuk menyamakan urutan sekuens DNA dengan primer

forwardseperti pada Gambar 16.


12/41

Gambar 16. Menu Reverse complement sequence untuk PrimerReverse

Pilih menuAdd unmasked sequence to Alignment Exploreruntuk memasukkandata sekuens pada MEGA 5.2 seperti pada Gambar 17.

Gambar 17. MenuAdd unmasked sequence to Alignment Explorer

untuk Primer Reverse

Tampilan Alignment DNA sekuens primer forward dan reverse yang telah

dimasukkan pada MEGA 5.2 seperti pada Gambar 18.


13/41

Gambar 18. Tampilan Urutan Sekuens DNA pada MEGA 5.2

Proses edit sekuens sangat dibutuhkan sebelum memasuki tahap alignment

sekuens karena kualitas elektrophoregram dari hasil sekuensing yang didapatkan

dapat kurang maksimal. Sinyal gelombang bagian depan maupun bagian

belakang elektrophoregram dapat kurang jelas karena banyak terdapat sinyal

ganda yang tidak beraturan (noise). Saat edit sekuens noise tersebut akan

dihapus. Jika tidak dihapus maka akan teridentifikasi sebagai N pada software

MEGA 5.2.

Selanjutnya adalah proses trim atau pemotongan noisesekuens DNA yang tidak

dibutuhkan untuk prosesAlignment DNA.Langkah awal pada proses trimadalah

dengan menyorot noise DNA dan dilambangkan dengan huruf N yang terlalu

banyak pada awal dan akhir urutan sekuens DNA. Untuk menyorot sekuens yang

berada di awal, dapat dilakukan dengan tekan Shift + Home seperti pada

Gambar 19.

Gambar 19. Proses TrimUrutan Sekuens Awal

Hapus huruf-huruf N tersebut, dapat dilakukan dengan menekan tombol Delete,

sehingga hasil yang akan muncul seperti pada Gambar 20.


14/41

Gambar 20. Proses Menghapus Urutan Sekuens Awal

Setelah huruf-huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA,

yaitu dengan menyamakan urutan sekuens DNA hasil dari primer forward

maupun reverse.

Caranya adalah dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil dari primer

forwarddan reverselalu memilih ikonAlign selected with MUSCLE. Prinsip kerja

dari MUSCLE yaitu dengan perhitungan algoritma UPGMA, UPGMB, dan

Neighbor Joining. Pemilihan ikon Align Selected with MUSCLE seperti pada

Gambar 21.

Gambar 21. MenuAlign selected with MUSCLE

Pada ikon Align selected with MUSCLE, klik pilihan menu Align DNA, seperti

pada Gambar 22.

Gambar 22. PilihAlign DNA

Maka akan muncul tampilan seperti pada Gambar 23 dan untuk mulaiAlign DNA,

klik Compute lalu tunggu beberapa saat hingga Progressmencapai 100%.


15/41

Gambar 23. Tampilan Menu MUSCLE

Jika alignment telah selesai dilakukan untuk keseluruhan sekuens maka akan

muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah sesuai.

Selanjutnya menghapus huruf-huruf N yang berada di bagian belakang dari

urutan sekuens DNA hasil dari primer forward tersebut. Caranya adalah dengan

menekan Shift + Endlalu tekan Delete, seperti pada Gambar 24.

Gambar 24. Tampilan Sekuens DNA Setelah Klik MenuAlign selected with

MUSCLE

Berikutnya, setelah ditekan Delete maka huruf-huruf N tersebut akan terhapus


Gambar 25. Tampilan sekuens DNA setelah ditekan Delete

Seperti yang telah dilakukan sebelumnya, langkah selanjutnya setelah huruf-

huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA. Caranya adalah


16/41

dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse

lalu memilih ikonAlign selected with MUSCLEseperti pada Gambar 26.



pada Gambar 27.



klik Compute lalu tunggu beberapa saat hingga Progress mencapai 100%

sehingga akan muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah

sesuai.


Proses Alignment DNA dari primer forward sudah selesai dilakukan. Langkah

selanjutnya adalah dengan melakukan tahapan yang sama untuk proses


17/41

Alignment DNA dari primer reverse. Untuk menyorot sekuens yang berada di

awal, dapat dilakukan dengan tekan Shift + Homeseperti pada Gambar 29.

Gambar 29. Proses Trim Urutan Sekuens Awal

Hapus huruf-huruf N tersebut dengan menekan tombol Delete, sehingga hasil

yang akan muncul seperti pada Gambar 30.

Gambar 30. Proses Menghapus Urutan Sekuens Awal

Setelah huruf-huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA,

yaitu dengan menyamakan urutan sekuens DNA hasil dari primer forward

maupun reverse. Caranya adalah dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil

dari primer forward dan reverse lalu memilih ikon Align selected with MUSCLE




pada Gambar 32.



18/41




sesuai.


Jika alignment telah selesai dilakukan untuk keseluruhan sekuens maka akan

muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah sesuai.Selanjutnya adalah dengan menghapus huruf-huruf N yang berada di bagian

belakang dari urutan sekuens DNA hasil dari primer reverse tersebut. Caranya

adalah dengan menekan Shift + End lalu tekan Delete. Setelah ditekan Delete

maka huruf-huruf N tersebut akan terhapus, langkah selanjutnya setelah huruf-

huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA. Caranya adalah

dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse

lalu memilih ikonAlign selected with MUSCLEseperti pada Gambar 34.


Pada ikonAlign selected with MUSCLE, klik pilihan menuAlign DNAseperti pada

Gambar 35.


19/41





sesuai.


Sekuens DNA yang sudah mengalami proses Alignment DNA akan berurutan

dan sejajar pada urutan sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse-nya

seperti pada Gambar 37 dan Gambar 38.

Gambar 37. Tampilan Sekuens DNA Hasil dari Primer Forward dan

ReverseBagian Depan


20/41

Gambar 38. Tampilan Sekuens DNA Hasil dari Primer Forwarddan Reverse

Bagian Belakang

Tahap selanjutnya adalah menghapus noiseyang terdeteksi sebagai huruf-huruf

N yang berada pada sekuens. Caranya adalah dengan mencocokkan letak huruf

N tersebut dengan data elektrophoregram setiap primer. Langkah awal pencarian

sekuens pada elektrophoregram adalah dengan menyorot beberapa basa yang

berada di depan atau di belakang huruf N tersebut lalu tekan Ctrl + C seperti

pada Gambar 39.

Gambar 39. Proses Penyorotan Beberapa Basa Nitrogen

Klik kanan pada nama primer forwardmaka akan muncul beberapa pilihan menu

kemudian pilih Open Sequencer Fileseperti pada Gambar 40.

Gambar 40. Klik Open Sequencer File

Maka akan muncul elektrophoregram yang sesuai dengan data sekuens yang

dipilih, kemudian klik ikon Find the first position of the specified sequence, lalu

tekan Ctrl + Vpada kotak isian yang muncul. Letak basa nitrogen yang dicari

tersebut secara otomatis akan disorot seperti pada Gambar 41.


21/41

Gambar 41. Proses Pencarian Letak Suatu Basa Nitrogen

Bagian sekuens yang disorot merupakan daerah yang dicari dan teridentifikasisebagai huruf N. Pada Gambar 42 di bawah ini, huruf N yang dimaksud adalah

basa nitrogen C karena dilambangkan dengan puncak berwarna biru.

Gambar 42. Letak Suatu Basa Nitrogen telah Ditemukan pada Elektrophoregram

Sekuens yang terdeteksi sebagai huruf N tersebut dihapus dengan mengarahkan

kursor pada huruf N tersebut lalu tekan Delete. Setelah itu ketik huruf C sebagai

pengganti huruf N seperti pada Gambar 43.

Gambar 43. Letak Suatu Basa Nitrogen telah Ditemukan

Langkah berikutnya, dilakukan hal yang sama untuk sekuens lain yang terdeteksi

sebagai huruf N. Hal ini penting dilakukan supaya diperoleh sekuens yang


22/41

lengkap dan memudahkan dalam proses BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool).Setelah semuanya selesai diedit, dilakukan prosesAlignment DNAkembali

untuk mensejajarkan sekuens selanjutnya dilakukan proses penggabungan

kedua sekuens. Caranya adalah dengan memilih untaian sekuens yang

terpanjang, dapat dipilih pada primer forward ataupun reverse. Jika telah

ditemukan untaian sekuens yang lebih panjang, misalnya pada bagian depan

primer reversemaka tekan Shift + Homepada basa terakhir dari primer reverse

bagian depan yang sejajar dengan basa pertama pada primer forwardlalu tekan

Ctrl + Cseperti pada Gambar 44.

Gambar 44. Tekan Ctrl + Cpada Hasil Sekuens DNA bagian Awal dari Primer

Reverse

Letakkan kursor pada hasil sekuens DNA pertama pada primer forwardlalu tekan

Shift + Homelalu tekan Ctrl + Vsehingga sekuens yang telah dicopydari primer

reverse akan menggantikan bagian sekuens yang telah disorot pada primer

forwardselanjutnya alignment DNAkembali untuk mensejajarkan sekuens DNA.

Jika hal ini selesai dilakukan maka pada sekuens dari primer forward telah

memiliki bagian sekuens dari primer reverse. Selanjutnya primer reverse dapat

dihapus dengan cara klik kanan pada nama primer reverse lalu piih Delete


Gambar 45. Proses Penghapusan Sekuens DNA Hasil dari Primer Reverse

Hanya terdapat satu sekuens sebagai bentuk gabungan dua sekuens

sebelumnya yaitu dari sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse.


23/41

Berikutnya lakukan BLASTsekuens dengan cara memilih ikon BLAST selected

sequence, seperti pada Gambar 46.

Gambar 46. Klik Menu BLAST selected sequence

Proses BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)yang dapat digunakan untuk

menentukan homologi suatu urutan DNA atau asam amino dengan data yang

ada di NCBI (National Center for Biotechnology Information). Analisis

pensejajaran dapat digunakan untuk membandingkan dua sekuen atau lebih.

Program ini dapat diakses melalui website National Center for Biotechnology

Information at The National Library of Medicine in Washington, DC

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Laman website ini dapat digunakan untuk

melihat urutan sekuens data penelitian dengan sekuens yang terdapat pada

GenBank.

BLAST selected sekuensakan menghubungkan koneksi internet antara MEGA

5.2 dengan http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, sehingga akan muncul tampilan awal


Gambar 47. Tampilan Lamanhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ untuk BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST


24/41

Pilih database Others karena sekuens yang akan diBLAST bukan sekuens

Human genomicatau Mouse genomic. Langkah selanjutnya dengan scroll layar

ke bawah hingga Program Selectionlalu pilih Optimize fordan klik Highly similar

sequences (megablast)kemudian klik BLAST seperti pada Gambar 48.

Gambar 48. Tampilan Menu Program Selection

Tunggu hingga muncul urutan Sequences producing significant alignments.Hasil

identifikasi BLAST ditampilkan pada tabel Sequences producing significant

alignments dengan ini dapat diketahui nilai dari identity, query cover, dan E value

dari masing-masing sampel setelah disesuaikan dengan dataGenBank. Tabel

Sequences producing significant alignments dapat dilihat pada Gambar 49.


25/41

Gambar 49. Tampilan Sequences producing significant alignments

Jenis spesies dari sampel yang di-BLASTdapat terlihat dari urutan pertama dari

nilai Ident. Jika yang ditampilkan pada hasil BLAST dari sampel seperti pada

Gambar 49 maka sampel tersebut merupakan spesies Thalassia hemprichii

dengan Ident 99% atau kemiripan 99% dengan spesies Thalassia hemprichii

chloroplast matK DNA for maturase , partial cds. Sedangkan untuk mengetahuirincian sekuens dari Thalassia hemprichiitersebut dapat digunakan dengan cara

klik Thalassia hemprichii chloroplast matK DNA for maturase , partial cds yang

merupakan sebuah link, hingga muncul tampilan seperti pada Gambar 50 berikut

ini.


26/41

Gambar 50. Rincian Sekuens DNA dari Thalassia hemprichii chloroplast matK

DNA for maturase , partial cds

Dapat dilihat pada Gambar 50 bahwa basa nitrogen nomor 1 dari sekuens

sampel yang ditunjukkan dengan Query 1, disamakan dengan basa nitrogen

nomor 194 yang ditunjukkan dengan Sbjct 194 atau Subject 194 dari sekuens

yang ada pada GenBank. Hal ini disebabkan karena panjang sekuens pada

GenBankadalah 1308 bp (base pair)sedangkan panjang sekuens sampel hanya

904 bp.

Setelah diketahui spesies sampel yang diujikan maka akan dilakukan

pengubahan nama dari sampel sekuens pada MEGA 5.2. Simpan berkala

dokumen dengan cara klik Datalalu klik Save Session, seperti pada Gambar 51.


27/41

Gambar 51. Menu Save Session

Beri nama dokumen tersebut lalu simpan dalam bentuk Aln. Session (*mas)lalu

klik Saveseperti pada Gambar 52.

Gambar 52. Simpan Dokumen MAS File

Jika dokumen telah disimpan dengan format MAS file (.mas), dokumen juga

harus disimpan dengan format MEG file (.meg). Kedua format ini mempunyai

fungsi yang berbeda-beda, MAS file berguna untuk Alignment sekuens DNA

sedangkan MEG file berguna untuk analisis sekuens DNA yang telah di-

alignment. Cara untuk mengubah formatnya adaah dengan klik Data, klik Export

Alignment, lalu klik MEGA formatseperti pada Gambar 53.


28/41

Gambar 53. Menu Export Alignment MEGA Format

Sama seperti menyimpan MAS file, beri nama dokumen yang akan disimpan

tersebut, simpan dalam bentuk MEG file, lalu klik Saveseperti pada Gambar 54.

Gambar 54. Simpan Dokumen MEG File

Saat melakukan proses alignment, alangkah lebih baik jika proses penyimpanan

dilakukan secara berkala agar data yang disimpan selalu update. Jika terjadi

sesuatu pada PC, data yang disimpan juga tidak akan hilang


29/41

Contoh :

Terdapat beberapa sekuens DNA lamun yang semuanya telah selesai

dilakukan alignment sekuens dan juga dilakukan proses BLAST satu per satu

untuk keseluruhan sampel. Jika hasil identifikasi BLAST ditampilkan pada tabel

Sequences producing significant alignments seperti pada Gambar 55 berikut ini

maka dapat diketahui nilai dari identity, query cover, dan E value dari masing-

masing sampel setelah disesuaikan dengan dataGenBank.

Gambar 55. Tabel Hasil Pencarian BLAST berdasarkan Komponen Sekuens

Data hasil BLAST sekuens sampel lamun tersebut juga dibandingkan

dengan dua data sekuens yang lain yaitu sekuens dari Enhalus acoroides

dan Halophila ovalisseperti pada Tabel 1 berikut ini.

Tabel 1. Hasil Identifikasi Spesies Lamun pada Gen matK menggunakan BLAST

Lokasi ID Sampel Spesies

GenBank

Accession Identity

Query

Cover

E

Value

Sendang Biru IBRC.07.14.10 T.hemprichii AB 002577.1 99% 100% 0.0

Sendang Biru IBRC 07.14.11 T.hemprichii AB 002577.1 99% 100% 0.0



GenBankE.acoroides AB 002569.1 96% 100% 0.0

H.ovalis AB 002570.1 95% 99% 0.0


30/41

Keempat sampel lamun tersebut setelah disesuaikan dengan GenBank

teridentifikasi sebagai spesies Thalassia hemprichii pada data GenBank AB

002577.1. Semua sampel memiliki nilai identity99%, nilai query cover100%, dan

nilai E value (expect value) 0.0. Data ini menjelaskan bahwa hasil identifikasi

DNA dari keempat sampel lamun memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan

data DNA yang terdapat pada GenBank. Selanjutnya dapat dilihat pula pada

Gambar 22, sekuens sampel diidentifikasi sebagai spesies Thalassia hemprichii

pada urutan pertama dan kedua sedangkan pada urutan ketiga sekuens sampel

diidentifikasi sebagai Enhalus acoroides dan pada urutan keempat sekuens

sampel diidentifikasi sebagai Halophila ovalis. Sekuens sampel teridentifikasi

sebagai Enhalus acoroides pada urutan ketiga dengan nilai identity 96%, nilai

query cover100%, dan nilai E value0.0 sedangkan untuk Halophila ovalispada

urutan keempat dengan nilai identity 95%, nilai query cover 99%, dan nilai E

value0.0 dapat ditemukan pada keempat sampel.

Berdasarkan nilai identity, query cover, dan E value dari hasil pencarian

BLAST maka diambil nilai yang tertinggi agar tidak terjadi kesalahan dalam

identifikasi. Persentase nilai yang diambil berkisar antara 96% sampai 100%,

semakin tinggi persentase nilai maka semakin mirip pula sekuens sampel

dengan sekuens yang ada pada GenBank dilihat dari sisi kesamaan urutannya

maupun panjang sekuensnya.

Identity, query cover, dan E value (expect value) adalah standar

identifikasi dari proses BLAST yang digunakan oleh NCBI. Identifikasi dengan

BLAST perlu memperhatikan urutan pembacaan dari strandar identifikasi, yaitu

nilai identity, nilai query cover, dan nilai E value. Jika urutan pembacaan

identifikasi tersebut tidak sesuai maka akan menghasilkan interpretasi yang tidak

tepat. Identitydigunakan untuk mengukur kesamaan urutan sekuens yang dimiliki

oleh sampel dengan sekuens yang terdapat pada GenBank. Semakin tinggi nilai

identity maka semakin mirip pula urutan sekuens sampel dengan data sekuens

yang terdapat pada GenBank. Query cover digunakan untuk mengukur berapa

panjang sekuens dari sampel dengan sekuens yang ada pada GenBank.

Semakin tinggi nilai query cover maka semakin tinggi pula tingkat kesamaan

panjang sekuens sampel dengan sekuens yang ada pada GenBank sehingga

semakin memadai sekuens DNA tersebut untuk dianalisis. E value digunakan

untuk menggambarkan jumlah perbedaan pada alignment. Semakin rendah nilai


31/41

E value maka sekuens DNA dari sampel semakin mirip dengan sekuens DNA

yang terdapat pada GenBankNCBI.

2.2 Mengunduh dan Memasukkan Sekuens dari GenBank ke MEGA 5.2

Sekuens dapat dimasukkan (diinput) ke MEGA 5.2 dengan cara

membuka sekuens yang tersimpan pada PC atau dengan mengunduh

(download) sekuens yang tersedia pada GenBank. Tahapan-tahapan download

sekuens adalah sebagai berikut, dimulai dengan membuka software MEGA 5.2

pada desktop seperti pada Gambar 56 berikut ini.

Gambar 56. Membuka Software MEGA 5.2

Jika tampilan awal MEGA 5.2 telah terbuka, pilih menu Align lalu pilih Edit/Build

Alignmentuntuk membuka dokumen baru seperti pada Gambar 57 .

Gambar 57. Pilihan Menu Edit/Build Alignment


32/41

Muncul pilihan Alignment Editor lalu pilih Create a new alignmentseperti pada

Gambar 58.

Gambar 58. MenuAlignment Editor

Jika lembar kerja telah terbuka, klik menu Web lalu pilih Query GenBankuntuk

memulai mencari sekuens DNA pada GenBankseperti pada Gambar 59.

Gambar 55. Menu Query GenBank

Ubah pilihan menuAll Databasesdengan Nucleotidelalu ketikkan nama spesies

beserta gen yang digunakan pada kotak yang tersedia lalu pilih Searchseperti

pada Gambar 60.


33/41

Gambar 56. Tampilan Awal Menu Nucleotide

Pada kotak disebelah kiri nama spesies tambahkan tanda ceklis kemudian klik

nama spesiesnya untuk menampilkan data sekuens dari spesies tersebut seperti

pada Gambar 61.

Gambar 57. Menu Search Nucleotide

Tunggu beberapa saat hingga muncul tampilan sekuens seperti pada Gambar

62, klikAdd to Alignmentuntuk input sekuens pada MEGA 5.2.


34/41

Gambar 58. Data Sekuens dalam Bentuk FASTA

Jika sudah klik Add to Alignmentmaka diperoleh sekuens yang telah masuk ke

MEGA 5.2 dan siap untuk dilakukan analisis seperti pada Gambar 63.

Gambar 63. Sekuens dari GenBankpada MEGA 5.2

3. Pembuatan Pohon Kekerabatan (Pohon Filogeni)

Pohon filogeni dibutuhkan untuk menggambarkan kekerabatan antar taxa

atau antar spesies yang berada dalam satu pohon filogeni tersebut. Pembuatan

pohon filogeni dengan softwareMEGA 5.2. Pohon filogeni dapat dibuat dengan

beberapa metode tergantung dari kebutuhan dan data yang dimiliki. Pendekatan


35/41

atau metode pembuatan pohon filogeni ada 4 jenis yaitu Neighbor Joining (NJ),

Maximum Parsimony (MP), Maximun Likelihood (ML), dan Bayesian Inference

(BI). Pada Praktikum Bioteknologi Kelautan Materi Analisis DNA kali ini akan

mempelajari tentang pembuatan pohon filogeni dengan metode Neighbor Joining

(NJ).

Langkah yang pertama adalah membuka MEGA 5.2 dan klik menu Data

lalu pilih menu Open A File/Session. Cari dataset sekuens dengan tipe MAS file

yang akan diubah formatnya menjadi MEG file, lalu klik Open seperti pada

Gambar 64.

Gambar 59. Memasukkan Dataset Sekuens

Jika dataset sekuens telah masuk pada MEGA 5.2, klik menu MUSCLE seperti

pada Gambar 65.

Gambar 60. Dataset Sekuens yang telah Masuk pada MEGA 5.2


36/41

Dataset sekuens yang telah selesai alignmentakan sejajar menurut site masing-

masing seperti pada Gambar 66 berikut ini. Simpan data tersebut dalam MAS file

dan MEG file.

Gambar 61. Dataset Sekuens SelesaiAlignment

Minimize dataset sekuens tersebut, lalu pada halaman utama MEGA 5.2 pilih

Menu Datalalu klik Open File Session. Buka data dengan format MEG fileuntukdilakukan analisis lalu klik Openseperti pada Gambar 67.

Gambar 62. Buka Data Format MEG File


37/41

Pilih model terbaik yang akan digunakan untuk membangun pohon filogeni

dengan klik menu Models lalu klik Find Best DNA/Protein Models seperti pada

Gambar 68.

Gambar 63. Menu Find Best DNA/Protein Models

Muncul kotak dialog Analysis Preferences yang berguna untuk memulai proses

running model terbaik yang akan digunakan untuk proses pembuatan pohon

filogeni, langsung pilih tampilan default lalu klik Compute seperti pada Gambar

69.

Gambar 64. MenuAnalysis Preferences

Tunggu beberapa saat hingga muncul tabel daftar model seleksi yang terbaik

berdasarkan urutan nilai BIC mulai dari terkecil hingga terbesar. GTR untuk


38/41

General Time Reversible, HKY untuk Hasegawa Kishino Yano, TN93 untuk

Tamura Nei, T92 untuk Tamura 3 Parameter, K2 untuk Kimura 2 parameter, dan

JC untuk Jukes Cantor. Model seleksi digunakan untuk menduga seberapa

banyak laju substitusi yaitu transisi dan transversi pada satu site. Transisi adalah

perubahan dari basa purin menjadi purin atau pirimidin menjadi pirimidin

sedangkan transversi adalah perubahan dari basa purin menjadi pirimidin atau

pirimidin menjadi purin.

Amati nilai BIC (Bayesian Information Criterion)yang terkecil dan berada pada

urutan teratas seperti pada Gambar 70.

Gambar 65. Daftar Model Seleksi dalam Pembuatan Pohon Filogeni

Nilai terbaik yan ditunjukkan pada daftar adalah GTR+G (General Time

Reversible), namun pada pembuatan pohon filogeni dengan metode Neighbor

Joining (NJ) tidak terdapat pilihan GTR. Oleh karena itu, dipilih model pada

pilihan kedua terbaik yaitu T92 (Tamura 3 Parameter). Model seleksi GTR

mempertimbangkan frekuensi nukleotida (nucleotide frequency) dan laju

perubahan transisi dan transversi (substitution rate) yang tidak sama. Untuk

mulai membuat pohon filogeni, klik menu Phylogeny lalu pilih Construct/Test

Neighbor Joining Treeseperti pada Gambar 71.


39/41

Gambar 66. Pilihan Menu Phylogeny

Akan muncul kotak dialog Analysis Preferences untuk mulai running pohon

filogeni dengan metode NJ, pilih Tamura 3 Parameterpada pilihan Model/Methodlalu pilih Computeseperti pada Gambar 72.

Gambar 67. MenuAnalysis Preferences untuk Pembuatan Pohon Filogeni

Akan muncul pohon filogeni dengan metode Neighbor Joining (NJ) dengan model

perhitungan menurut Tamura 3 Parameter seperti pada Gambar 73.


40/41

Gambar 68. Pohon Filogeni dengan Metode NJ

Pohon filogeni ini dapat disimpan dalam bentuk PNG fileatau PDF file, jika akan

menyimpan dalam bentuk PNG file, caranya adalah dengan klik menu Imagelalu

klik Save as PNG Fileseperti pada Gambar 74.

Gambar 69. Save a PNG File


41/41

REFERENSI

Fatchiyah, Estri Laras A., Sri Widyarti, Sri Rahayu. 2011. Biologi MolekulerPrinsip Dasar Analisis. Jakarta : Erlangga.

Ferita, I., Jamsari, I. Suliansyah, Gustian. 2012. Studi Hubungan KarakterMorfologi, Anatomi, dan Molekuler Terkait Potensi Kadar Katekin padaTanaman Gambir (Uncaria gambir (Hunter) Roxb). Fakultas PertanianUniversitas Andalas, Padang.

Hollingsworth, Peter M. 2007. DNA Barcoding : Potential Users. Genomics,Society and Policy. Volume3 No. 2,pages44-47.

Lucas, Christina, Thirunavakkarasu Thangaradjou, and Jutta Papenbrock. 2012.Development of a DNA Barcoding System for Seagrasses: Successful butnot Simple.Journal of PLOS One7 (1) e29987.

Syafaruddin , E., Randriani, dan T. J Santoso. 2011. Efektivitas dan EfisiensiTeknik Isolasi dan Purifikasi DNA pada Jambu Mete. Balai PenelitianTanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri, Sukabumi. Balai BesarPenelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya GenetikPertanian, Bogor.

Tamura, K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei and S. Kumar. 2011.MEGA 5 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using MaximumLikelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods.Journal of Molecular Biology Evolutionary28 (10) : 2731-2739.

Toha, Abdul Hamid. 2001. Deoxyribo Nucleic Acid. Bandung : Alfabeta.

Widodo dan Miftakhunnafisah. 2010. Pengenalan NCBI untuk Analisa DNA,Protein, dan Senyawa Kimia. Laboratorium Biosistem Fakultas MIPAUniversitas Brawijaya. Malang.

Documents

Panduan Praktikum Bioteknologi Kelautan