Penetapan Kadar Kinin

PENETAPAN KADAR KININ DI URIN SETELAH MENGKONSUMSI TABLET KININ DENGAN METODE FLUORESENSI (ALAT DENGAN SPEKTROFOTODENSITOMETRI-MODE FLUORESENSI)

I. TujuanPraktikum ini dilakukan bertujuan untuk menetapkan kadar kinin di urin setelah mengkonsumsi tablet kinin dengan metode fluoresensi (alat dengan spektrofotodensitometeri - mode fluoresensi).

II. Dasar Teori2.1 KLT-SpektrodensitometriPrinsip pengukuran kadar suatu senyawa dengan sistem spektrofotodensitometri adalah dengan mengukur absorban maupun fluorosensi dari analit yang menyerap sinar UV. Pada mode absorbsi yang diukur adalah banyaknya REM yang diabsorsi atau diserap oleh kromofor suatu senyawa, sedangkan untuk mode fluorosensi yang diukur adalah energi yang dilepas setelah kromofor tersebut diberikan bereksitasi. Setelah diberikan energi REM berlebih maka senyawa tersebut akan tereksitasi. Namun pada kondisi tersebut, elektron berada pada kondisi yang kurang stabil. Elektron akan cenderung menempati posisi yang lebih stabil sehingga terjadi relaksasi. Saat terjadi eksitasi, elektron melepaskan sejumlah tertentu energi misalnya berupa dalam bentuk cahaya. Peristiwa ini disebut dengan fluorosensi (Gandjar dan Rohman, 2007).Evaluasi visual kromatogram sebelum derivatisasi hanya mampu memberikan hasil kualitatif sedangkan evaluasi optikal secara langsung (insitu) pada plat menggunakan suatu instrumen dapat memberikan hasil kualitatif dan hasil kuantitatif. Alat optis yang dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif ini adalah spektrofotodensitometer atau sering disebut dengan TLC Scaner. Spektrofotodensitometer digunakan dengan menghubungkan pada suatu perangkat komputer (PC) yang dikendalikan dengan suatu program evaluasi. PC akan menampilkan hasil kalkulasi, protokol pendukung, menyediakan data dari semua parameter dari peralatan dan program evaluasi serta data hasil yang berupa angka dan grafik (Deinstrop, 2007).

Gambar 2. TLC Scanner

Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Untuk evaluasi bercak hasil KLT secara densitometri, bercak di-scanning dengan sumber sinar dalam bentuk celah (slit) yang dapat dipilih baik panjangnya maupun lebarnya. Sinar yang dipantulkan diukur dengan sensor cahaya (fotosensor). Perbedaan antara sinyal optik daerah yang tidak mengandung bercak dengan daerah yang mengandung bercak dihubungkan dengan banyaknya analit yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam lempeng yang sama. Pengukuran densitometri dapat dibuat dengan absorbansi atau dengan fluoresensi (Settel, 1997).Kebanyakan pengukuran kromatogram lapis tipis dilakukan dengan cara absorbansi. Kisaran ultraviolet rendah (di bawah 190 nm sampai 300 nm) merupakan daerah yang paling berguna (Settel, 1997).

Gambar 1. Komponen Spektrofotodensitometer

Karena adanya penghamburan sinar oleh partikel-partikel yang ada di lempeng, maka suatu persamaan matematis yang sederhana dan terdefinisi dengan baik yang menyatakan hubungan antara sinyal sinar dan banyaknya (konsentrasi) senyawa dalam lapisan lapis tipis tidak pernah dijumpai. Sebagai akibatnya hubungan ini tidak bersifat linier. Meskipun demikian, karena saat ini tersedia perangkat lunak (software) ataupun integrator yang dapat menangani hubungan yang tidak linier, maka tidak diperlukan untuk melinierkan hubungan antara konsentrasi dan respon optis (Settel, 1997).Untuk scanning dengan fluororesensi, intensitas sinar yang diukur berbanding langsung dengan banyaknya analit (senyawa) yang berfluororesensi lebih sensitif dibanding dengan pengukuran absorbansi dan fungsi kalibrasi seringkali linier pada kisaran konsentrasi yang agak luas. Karena alasan-alasan ini, senyawa-senyawa yang bersifat fluororesensi secara inhiren selalu di-scan dengan fluororesensi. Untuk senyawa-senyawa yang tidak berfluororesensi, maka senyawa tersebut dapat diperlakukan dengan cara mereaksikannya dengan reagen tertentu hingga dihasilkan senyawa yang berfluororesensi (Settel, 1997).

Sumber radiasi pada spektrofotodensitometri ada tiga macam tergantung pada rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan. Lampu deuterium dipakai untuk pengukuran pada daerah ultraviolet (190-400 nm) dan lampu tungsten digunakan untuk pengukuran pada daerah sinar tampak (400-800 nm) sedangkan untuk penentuan secara flouresensi digunakan lampu busur merkuri bertekanan tinggi (Deinstrop, 2007).

2.2 Kinin (Quinine)Kinin merupakan senyawa antimalaria, termasuk kedalam golongan alkaloid yang diperoleh dari kulit kayu pohon kina dan isomer levorotatory dari kuinidin (McEvoy, 2002).

Gambar 3. Struktur Kimia Kinin

Quinin merupakan obat antimalaria. Di dalam tubuh mengalami metabolisme di hati melalui oksidasi menjadi metabolit terhidroksilasi. Metabolit obat diekskresi dalam urin dan kurang dari 5% dari dosis diekskresi dalam urin sebagai bentuk yang tidak berubah. Jadi, pasien yang menggkonsumsi tablet quinin, penentuan kadar obat maupun metabolitnya di dalam urin dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode yaitu spektrofotometri UV-Vis dan metode kromatografi, baik KLT maupun KCKT. Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT, yang mana densitometer dapat bekerja secara serapan maupun fluororesensi (Gandjar dan Rohman, 2007).Percobaan penetapan kadar quinin di urine setelah mengkonsumsi tablet quinin ini, dilakukan dengan metode KLT spektrofotodensitometri yang dikerjakan dengan metode fluororesensi. Artinya, setelah komponen dari tablet dipisahkan dengan KLT, maka bercak hasil pemisahan diukur dengan sistem fluoresensi sinar UV dan respon sinyal yang dihasilkan akan sebanding dengan jumlah absorpbansi dari analit yang ditotolkan. Quinin memiliki rumus molekul C20H24N2O2, dengan berat molekul 324,4 g/mol. Pemeriannya berupa serbuk mikrokristal atau granul-granul berwarna putih, sedikit berfluorosensi. Titik lebur kinin sebesar 510 C. Kelarutannya dalam air sebesar 1 : 1900, dalam air panas 1 : 760, dalam alkohol 1 : 0,8, dalam benzene 1 : 80, dalam kloroform 1 : 1,2, dalam eter kering 1 : 250, dalam gliserol 1 : 2. Quini tidak larut dalam petroleum eter. Quinin memiliki pKa 4,1 : 8,5 dalam suhu 200 C. Identifikasi (kromatografi lapis tipis), sistem TARf 51; sistem TBRf 02; sistem TCRf 11; sistem TERf 45; sistem TLRf 04; sistem TAERf 26; sistem TAFRf 65 (Fluoresensi biru di bawah sinar UV; positif dengan reagen Dragendorff; positif dengan larutan asam iodoplatinate)

Tabel1. Harga Rf Kinin dan Metabolitnya Dalam Berbagai Sistem Fase GerakSistemTATBTCTDTETFTLTADTAETAFTAJTAKTAL

Kinin510211-45-04-2665---

Hidroksiquinin32------------

(Moffat, 2005)Keterangan :Sistem Fase GerakPerbandingan

TAMethanol : larutan amonia kuat100 : 1,5

TBSikloheksana : toluen : dietilamin75 : 15 : 10

TCKloroform : methanol90 : 10

TDKloroform : aseton80 : 20

TEEtil asetat : methanol : larutan amonia kuat85 : 10 : 5

TFEtil asetat

TLAseton

TADKloroform : methanol90 : 10

TAEMethanol

TAFMethanol : n-butanol60 : 40 (ditambahkan 0,1 mol/L NaBr

TAJKloroform : etanol90 : 10

TAKKloroform : sikloheksana : asam asetat4 : 4 : 2

TALKloroform : methanol : asam propionat72 : 18 : 10

(Moffat, 2005)

Quinin sulfat menghitam oleh kontak cahaya. Kapsul quinin sulfat disimpan dalam tempat yang rapat dan terlindung cahaya pada suhu kurang dari 400C, lebih baik antara 15-30oC. Tablet quinin sulfat harus disimpan dalam tempat yang tertutup baik pada suhu kurang dari 40oC, lebih baik 15-30oC (McEvoy, 2002).2.3 Farmakokinetika Quinin2.3.1 AbsorpsiQuinin sulfat sebagian besar diabsorpsi dari saluran pencernaan, bahkan pada pasien dengan diare. Absorpsi quinin terjadi terutama dari usus kecil bagian atas. Berdasarkan administrasi dosis oral tunggal, konsentrasi serum puncak dari alkaloid cinchona, termasuk quinin, umumnya terjadi dalam 1-3 jam. Apabila terapi tidak dilanjutkan maka konsentrasi obat dalam plasma akan cepat menurun.(McEvoy, 2002)

2.3.2 DistribusiVolume distribusi quinin lebih rendah pada pasien dengan malaria daripada individu yang sehat. Volume distribusi rata-rata 1,2-1,7 L/kg pada orang dewasa dengan malaria serebral dan moderat. Volume distribusi quinin dilaporkan rata-rata 0,8 L/kg pada anak-anak 1-12 tahun yang memiliki malaria moderat dan 1,1 L/kg pada anak yang sembuh 1-12 tahun (McEvoy, 2002).Quinin terdistribusi secara luas ke dalam jaringan tubuh. Jumlah kecil dari obat didisrtribusi ke dalam empedu dan saliva. Konsentrasi quinin dalam CSF dilaporkan menjadi 2-7% dari konsentrasi plasma obat yang bersamaan. Quinin melewati plasenta dan terdistribusi ke dalam susu. Kira-kira 70% quinin terikat dengan protein plasma (McEvoy, 2002).2.3.3 Metabolisme Metabolisme melalui oksidasi menjadi metabolit terhidroksilasi. Metabolit utama adalah 2-hidroksiquinolin dan derivate 6-hidroksikuinolin, 3-hidroksiquinin, dan komponen dihidro yang berhubungan. Quinin-10, 11-epoksida dan quinin-10,11-dihidrodiol juga pernah dideteksi pada urin. Setiap metabolit dari quinin akan berfluoresensi pada keadaan tertentu. 2-hidroksiquinolin berfluoresensi pada panjang gelombang 2595 nm pada kondisi asam; 332 nm pada pelarut non polar; 324 nm pada pelarut polar. 6-hidroksikuinolin akan berfluoresensi pada panjang gelombang 419 nm dan 583 nm jika kondisinya asam (aseton). Sedangkan quinin akan berfluoresensi pada panjang gelombang 425 nm (O`Reilly, 1975)2.3.4 EliminasiWaktu paruh eliminasi plasma rata-rata 8-21 jam pada orang dewasa dengan malaria dan 7-12 jam pada orang dewasa yang sudah sembuh. Pada anak 1-12 tahun, waktu paruh eliminasi plasma dari quinin dilaporkan rata-rata 11-12 jam pada anak dengan malaria dan 6 jam pada anak yang sehat (McEvoy, 2002).Quinin sulfat dimetabolisme terutama dalam hati. Berdasarkan dosis tunggal administrasi oral quinin sulfat, metabolit obat diekskresikan dalam urin dan kurang dari 5% dari dosis sebagai bentuk yang tidak berubah. Karena quinin direabsorpsi ketika urin alkali, ekskresi ginjal dari obat dua kali lebih cepat ketika urin asam dibandingkan urin alkali (McEvoy, 2002).

Tabel ekskresi normal zat padat dalam urin dalam waktu 24 jamSenyawaJumlah yang diekskresi dalam g

N amoniakKalsiumKaliumMagnesiumNatriumKloridaFosfat (dihitung sebagai P)SulfatUreaAsam uratAsam hipuratKreatininAsam oksalat1,4-1,00,05-0,41,0-5,00,05-0,153,0-6,06,0-9,00,7-1,51,8-3,520-300,25-0,750,1-1,00,5-1,8Sampel 0,03

(Mutschler, 1991)

III. Alat dan BahanAlatBahan

Neraca analitik Labu ukur 10 ml Labu ukur 100 ml Pipet ukur 1 ml Ball filler Tabung reaksi Gelas ukur Beaker glass Vortex mixer Sentrifuge Plat KLT (silika G60) Spektrofotodensitometer Pipet syringe Pipet tetes Chamber Effendorf Urin Serbuk tablet kinin Aquades Alkohol cuci Metanol P Kloroform P Isopropanol P Amoniak pekat P H2SO4 0,1 N

IV. Prosedur Kerja4.1 Preparasi SampelDisiapkan sebanyak 9 larutan di dalam 9 tabung reaksi yang berbeda. Tabung 1 digunakan sebagai kontrol; tabung 2,3,4 digunakan sebagai larutan uji; tabung 5,6 merupakan sampel; dan tabung 7,8,9 digunakan sebagai larutan standar. Komposisi tiap tabung adalah sebagai berikut.

LarutanNo tabungKandungan

Kontrol (Blanko)12 mL urin

Larutan Uji21,8 mL urin + 0,2 mL larutan baku quinin sulfat (500ng)

31,6 mL urin + 0,4 mL larutan baku quinin sulfat (1000 ng)

41,2 mL urin + 0,8 mL larutan baku quinin sulfat (2000 ng)

Sampel5urin yang mengandung quinine sulfat

6urin yang mengandung quinine sulfat

Larutan Standar7500 ng quinine sulfat

81000 ng quinine sulfat

92000 ng quinine sulfat

Larutan Quinin sulfat yang digunakan untuk tabung 2,3,dan 4 dibuat dari larutan baku quinine 5000 ng/ml. Perhitungan untuk tabel di atas yaitu : Kandungan quinine sulfat pada tabung 2C1V1=C2V2

5000 ng/mLX=500 ng/mL

2 ml

V2=

V2=

V2=0,2 mL

Kandungan quinine sulfat pada tabung 3 C1V1=C2V2


2 ml

V2=

V2=

V2=0,4 mL

Kandungan quinine sulfat pada tabung 4C1V1=C2V2


2 ml

V2=

V2=

V2=0,8 mL

Quinine sulfat pada tabung 7,8, dan 9 dibuat dari larutan baku stok dengan konsentrasi 1 mg/ml. Dibuat satu larutan dengan konsentrasi 50 ng/g, variasi konsentrasi diatur dalam penotolan, yakni dengan cara mengatur volume penotolan, yaitu 10 l, 20 l, dan 40 l. Perhitungan pembuatan larutan yaitu : C1V1=C2V2

1 mg/mlX=50 ng/

1 ml

1000 ng/ X=50 ng/

1 ml

V2=

V2=

V2=50 = 0,05 ml

Sebanyak 0,05 mL larutan baku stok quinin sulfat 1 mg/ mL kemudian dimasukkan ke dalam effendrof, lalu ditambahkan metanol hingga volume 1 mL. Dari larutan tersebut volume penotolan diatur agar memperoleh jumlah quinin yang sama seperti pada larutan 2, 3, dan 4. Perhitungan : Penotolan pertama Jumlah quinine = C x V

= 50 ng/ x 10 = 500 ng Penotolan kedua Jumlah quinine = C x V

= 50 ng/ x 20 = 1000 ng Penotolan ketigaJumlah quinine = C x V

= 50 ng/ x 40 = 2000 ng4.2 Ekstraksi Cair CairTabung 1 - 6 diberi amonia secukupnya + 0,1 mL hingga mencapai pH 9-10. Ditambahkan 2 ml campuran pelarut kloroform dan isopropanol (3 : 1). Tabung 7 - 9, tidak ditambahkan amonia dan campuran pelarut kloroform dan isopropanol. Kemudian, tabung 1 - 6 divortex dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit agar terbentuk emulsi sempurna. Tabung 1 - 6 disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Fase kloroform diambil dari masing masing tabung, kemudian diuapkan pada suhu 60C. Residu dilarutkan dalam 25 L methanol.4.3 Kromatografi Lapis Tipis dan SpektrofotodensitometriSistem KLT:TA.Fase diam :silika G60 ukuran 10 cm 10 cmFase gerak :methanol : larutan amoniak pekat (100:1,5)Plat dicuci dengan methanol, kemudian diaktivasi pada oven dengan suhu 120 C selama 30 menit. Chamber dijenuhkan dengan fase gerak. Disiapkan tepi atas dan tepi bawah pada plat silika. Kemudian, larutan kontrol, larutan uji, larutan sampel, dan larutan standar ditotolkan pada plat silika G60. Lalu, plat dielusi. Plat diangkat dan dikeringkan pada suhu 60C selama 10 menit, lalu diamati menggunakan spektrofotodensitometer. Bercak diamati dengan spektrofotodensitometer. Masing-masing noda diukur luasnya dengan spektrofotodensitometer pada panjang gelombang 250 nm. Plat KLT selanjutnya disemprot dengan larutan asam sulfat 0,1 N. Dilakukan pengukuran spektrum emisi pada panjang gelombang 254 nm dengan mode fluoresensi. Kemudian dilakukan analisis terhadap hasil scan yang didapat. Dari data yang diperoleh melalui metode spektrofluorodensitometri, diukur luas area dari tiap penotolan. AUC antara larutan uji dan standar dibandingkan dan dihitung perolehan kembali. AUC larutan uji dengan sampel dibandingkan dan ditentukan kadar yang terdapat pada sampel.

V. SKEMA KERJA5.1Preparasi Larutan-larutan

0,05 ml larutan baku stok quinine sulfat 1 mg/mlDimasukkan ke dalam effendorf

Ditambahkan metanol hingga volume larutan 1 mL

Tambahkan sampai tanda batas

Larutan standar 50 ng/L

5.2 Preparasi Sampel

Disiapkan 6 tabung reaksiTabung 1 :2 mL urinTabung 2, 3, 4 :2 mL urin + larutan baku quinine sulfat (0,2 mL; 0,4 mL; dan 0,8 mL)Tabung 5, 6 :Sampel

5.3.Ekstraksi Cair-cair

Tabung 1 6 + ammonia secukupnya + 2 mL kloroform : isopropanol (3 : 1)Divortex kecepatan 2500 rpm selama 30 menitDisentrifugasi kecepatan 3000 rpm selama 30 menitFase kloroform dari masing-masing tabung diambilDiuapkan pada suhu 60CResidu dilarutkan dalam 25 L methanol

5.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Spektrofotodensitometri

Disiapkan plat silica G60 dengan ukuran 10cm 10cm

Tepi atas dan bawahnya ditandai

Plat diaktivasi dalam oven 120 C selama 30 menit

Semua larutan ditotolkan pada platUntuk larutan 7,8, dan 9 volume yang ada pada plat sebanyak 10 L, 20 L, dan 40

Dilakukan analisi terhadap hasil scan

Plat dielusi dalam chamber yang sudah jenuh dengan fase gerak methanol : amonia kuat (100 : 1,5)

Plat diangkat dan dikeringkan dalam oven 60C selama 10 menit

Bercak diamati dengan spektrofotodensitometer. Masing-masing noda diukur luas areanya dengan pada max eksitasi 250 nm.

Plat disemprot dengan H2SO4 0,1 N dan dikeringkan dalam oven pada suhu 600C selama 10 menit.

Dilakukan pengukuran spektrum emisi pada panjang gelombang 254 nm.Dilakukan analisi terhadap hasil scan

VI. Hasil Pengamatan

NoDataRfAUCJumlah Quinine

1Blangko0.462492.5-

2Lar. Uji I0.453401.8500 ng

3Lar. Uji II0.4116633.21000 ng

4Lar. Uji III0.429132.22000 ng

5Sampel I0.453885.8-

6Sampel II0.444367.7-

7Lar. Standar I0.455558.0500 ng

8Lar. Standar II0.4519578.21000 ng

9Lar. Standar III0.4730056.52000 ng

VII. Analisis Data7. 1 Perhitungan Regresi Linier r2 = 0,927a = 318,85b = 15,496y = bx + ay = 15,496 x + 318,85

Jumlah Quinin Hasil AnalisisAUC quinin untuk larutan uji 1 (tabung 2) = 3401,8 y = 45980,7 y = 15,496 x + 318,853401,8 = 15,496 x + 318,85 x = 198,95 ngDengan cara yang sama maka diperoleh :Jumlah Quinin Hasil Analisis

larutan uji 1198,95 ng



Sampel 1230,18 ng

Sampel 2261,28 ng

7.2 Perhitungan Simpangan baku residual (Sy)

Sy=y1= Nilai AUC quinin terukur alat (respon detector)

= Nilai AUC quinin hasil perhitungan berdasarkan persamaan garis lurus

= bx + aN= jumlah standar yang diukurUntuk larutan standar I

= bx + a = 15,496 (500) + 318,85 = 8066,85Dengan cara yang sama diperoleh untuk larutan standar II dan III yaitu 15814,85 dan 31310,85

Sy =

=

= = 4693,74

7.3 Perhitungan LOD dan LOQy = 15,496 x + 318,85

LOD =

LOD= LOD= 908,7 ng

LOQ =

LOQ =LOQ = 3029 ng

7. 4.Perhitungan Perolehan KembaliUntuk mennghitung perolehan kembali hasil ekstraksi, digunakan data dari larutan uji (tabung 2,3, dan 4) Larutan Uji 1% perolehan kembali = x 100 %

% perolehan kembali = x 100 %% perolehan kembali = 39,79 %Dengan cara yang sama didapat persentase perolehan kembali dari larutan uji 2 dan larutan uji 3 adalah 105,281 % dan 28,4375 %

7.5 Perhitungan PresisiBerdasarkan data yang diperoleh dari dua kali pengulangan pada sampel

Sx=

= = 21,99

KV = x 100%

= x 100%= 8,949 %

VIII. PembahasanPada praktikum kali ini akan dilakukan percobaan penentuan kadar quinin dalam urin pasien yang telah mengkonsumsi tablet quinin. Penetapan kadar quinin ini bertujuan untuk mengetahui kadar quinin di dalam urin pasien. Karena indeks terapi dari quinin itu sempit, maka perlu dilakukan therapeutic drug monitoring (TDM) untuk mengontrol jumlah quinin yang diberikan agar tidak menimbulkan efek toksik. Prinsip penetapan kadar quinin dalam sampel urin ini adalah memisahkan quinin yang ada di urin dengan menggunakan campuran pelarut kloroform dan isopropanol kemudian dipisahkan dengan menggunakan KLT dan selanjutnya dibuat dalam bentuk quinin sulfat yang akan berfluoresensi pada panjang gelombang tertentu dan intensitas flouresensinya adalah sebanding dengan kadar quinin yang dinyatakan sebagai quinin sulfat pada hasil kromatografi.Metode yang digunakan dalam penentuan kadar quinin dalam urin adalah KLT-spektrofotodensitometri dengan mode flouresensi. Metode ini digunakan karena quinin sulfat memiliki sifat mampu berfluorosensi. Prisip kerja alat spektrofotodensiometer berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat (Mulja dan Sukarman, 1995). Mode yang digunakan pada analisis ini adalah mode fluoresensi, dimana intensitas cahaya flouresensi setelah dipancarkan melalui suatu monokromator berbanding lurus dengan berat senyawa yang ada dalam noda (Sherma and Fried, 1994). Penetapan kadar quinin dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu preparasi larutan-larutan, ekstraksi, KLT, dan analisis dengan spektrofotodensitometer. Pelarut yang digunakan dalam pembuatan larutan adalah methanol. Pelarut ini digunakan karena dapat melarutkan quinin sulfat. Selain itu, methanol tidak menyerap cukup banyak cahaya dalam daerah UV-Vis. Methanol memiliki titik batas transparansi minimum sebesar 210 nm pada daerah UV-Vis sehingga tidak menimbulkan masalah saat pengukuran pada daerah spektrum quinin (Underwood and Day, 1998). Larutan yang dibuat adalah larutan blanko, larutan uji, sampel, dan larutan standar.

Larutan blanko adalah larutan yang komposisinya persis sama dengan sampel namun tidak mengandung analit, sehingga pada analisis ini larutan blanko yang digunakan adala urin yang tidak mengandung quinin sulfat. Larutan blanko digunakan untuk mengatur spektrofotometer hingga pada panjang gelombang pengukuran memiliki nilai serapan (absorbansi) nol. Tujuan dari penggunaan larutan blanko adalah koreksi serapan yang disebabkan oleh pelarut, pereaksi, sel ataupun pengaturan alat (Anonim a, 1979). Larutan uji bertujuan untuk menentukan akurasi dari metode yang digunakan dalam penetapa kadar quinin. Kecermatan merupakan ukuran yang menyatakan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Kecermatan dapat dinyatakan dengan persentase perolehan kembali. Pembuatan larutan uji dari matriks yang tidak diketahui kandungannya secara pasti, seperti urin, seharusnya menggunakan metode penambahan baku dan sebaiknya dibuat sedikitnya lima sampel yang mengandung analit 50-150% dari kandungan yang diharapkan dan plasebo (Harmita,2004). Namun, dalam praktikum ini pembuatan larutan uji dilakukan dengan metode simulasi. Berdasarkan metode tersebut, dilakukan penambahan sejumlah analit bahan murni ke dalam urine dari sumber urin yang sama. Tabung 5 dan 6 berisi larutan sampel yang disiapkan oleh asisten merupakan urin yang mengandung sejumlah quinin sulfat. Dan standar 7, 8, dan 9 merupakan larutan standar quinin sulfat dengan jumlah berturut-turut 500ng, 1000ng, dan 2000ng pada tiap penotolan. Data dari ketiga seri larutan ini digunakan untuk membuat kurva kalibrasi yang digunakan untuk menentukan kadar sampel. Kurva kalibrasi juga berfungsi untuk uji validasi metode, yaitu linearitas. Linearitas merupakan kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas biasanya digunakan untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit. Untuk membuat suatu larutan sandar, biasanya digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 150% kadar analit dalam sampel dan dibuat sekurang-kurangnya delapan buah larutan (Harmita, 2004). Namun, pada praktikum ini, hanya dibuat 3 larutan standar, dengan anggapan 3 larutan standar sudah cukup untuk membuat kurva kalibrasi dan menentukan linearitas. Larutan standar yang dibuat mengandung quinin sulfat sebanyak 50 ng/. Larutan blanko, larutan uji, dan sampel diekstraksi terlebih dahulu dengan metode ekstraksi cair-cair. Ekstraksi ini bertujuan untuk memisahkan quinin dari senyawa-senyawa pengotor dalam urin. Quinin merupakan senyawa yang bersifat basa dan akan berada dalam bentuk bebasnya pada larutan dengan suasana yang basa pula. Dengan demikian, maka sebelum proses ekstraksi ditambahkan amonia pekat sebanhyak 0,2 mL ke dalam tabung 1-6 untuk memperoleh suasana basa (pH 9 10). Rentang pH ini dipilih karena berdasarkan perhitungan, jumlah quinin yang berada dalam bentuk bebas pada rentang ini adalah 97 %. Kemudian dilakukan ekstraksi cair-cair dengan kloroform-isopropanol (3:1) melalui pengocokan dan sentrifugasi. Quinin merupakan salah satu senyawa golongan alkaloid yang larut dalam kloroform. Proses pengocokan bertujuan untuk memperbesar kontak pelarut dengan zat target sehingga distribusi kinin ke fase kloroform akan lebih optimal. Selama proses pengocokan, kinin bebas ini akan terpartisi ke fase pelarut organik yaitu kloroform, sedangkan pengotor akan berada pada fase berair karena pada umumnya zat-zat yang terdapat dalam urin sifatnya larut dalam air. Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan fase kloroform dengan fase urin dan isopropanol. Selain itu sentrifugasi juga membantu memisahkan makromolekul-makromolekul yang terdapat dalam urin yang dapat mengganggu proses analisis. Setelah sentrifugasi fase kloroform kemudian diambil dan diuapkan untuk memperoleh ekstrak kinin. Penguapan dilakukan dalam tabung effendorf diatas penangas air pada suhu 70oC, titik uap klorofom adalah sekitar 60oC (Anonim b, 1995). Dengan suhu 70 oC tidak akan merusak analit karena titik leleh kinin adalah pada suhu 120 0C. Ekstrak quinin direkontitusi menggunakan 25 L methanol untuk selanjutnya dipisahkan dengan KLT.Setelah terpisah dari pengotor, dilakukan lagi pemisahan, yaitu dengan KLT yang bertujuan untuk memisahkan quinin dari metabolitnya, yaitu hidroksiquinolin. Pemisahan dengan KLT dilakukan terhadap semua larutan, termasuk larutan standar. Pada larutan standar dilakukan penotolan dengan variasi volume untuk mendapatkan kadar akhir quinin sulfat dalam standar sejumlah 500 ng, 1000 ng, dan 2000 ng. Volume penotolan berturut-turut 10 L, 20 L, dan 40 L. Pada proses KLT, plat yang digunakan adalah silika gel G60 yang tidak berfluoresensi. Penggunaan plat yang berfluoresensi dapat mengganggu pemindaian flouesensi analit akibat adanya intervensi hamburan sinar dari plat. Fase gerak yang digunakan adalah sistem TA yang terdiri dari campuran metanol-amonia pekat (100:1,5). Sistem pelarut ini dipilih karena mampu memisahkan kinin berdasarkan perbedaan harga Rf dengan metabolitnya yaitu hidroksiquinolin. Setelah dilakukan pemisahan dengan KLT, dilakukan scanning dengan spektrofotodensitometer dengan mode absorbspsi pada panjang gelombang 250 nm. Setelah itu plat yang telah di-scan disemprot dengan larutan asam sulfat 0,1 N. Penyemprotan bertujuan untuk membentuk quinin sulfat yang mampu berfluoresensi. Selain itu, penambahan asam sulfat bertujuan meningkatkan intensitas fluoresensi quinin sulfat yang terbentuk karena quinin sulfat mampu berluoresensi pada suasana asam. Pada preparasi semua larutan, larutan qunin yang digunakan merupakan quinin sulfat, namun penambahan amonia kuat saat ekstraksi dapat mengubah quinin sufat menjadi quinin bebas. Fluoresensi yang diberikn quinin bebas lebih lemah dibandingkan quinin sulfat, karenanya perlu disemprot dengan asam sulfat 0,1 N. Plat yang telah disemprot di-scan dengan spektrofotodensitometer mode floresensi pada panjang gelombang 254 nm karena memberikan spektrum emisi yang maksimum berdasarkan praktikum yang telah dilakukan sebelumnya. Hasil dari scanning yang dilakukan berupa data AUC, Rf, kromatogram, dan spektra. Kromatogram yang dihasilkan dicocokkan dengan kromatogram library alat spektrofotodensitometer untuk mengetahui apakah senyawa yang diidentifikasi tersebut adalah quinin. Untuk mencocokkan kromatogram, dilakukan pembandingan harga Rf dan kesesuaian pola spektrum yang dihasilkan masing-masing puncak. Berdasarkan literatur harga hRf quinin dengan pemisahan menggunakan sistem TA adalah 51 (Moffat et al, 2004). Setelah dilakukan pembandingan, diperoleh bahwa nilai hRf quinin yang dihasilkan sesuai dengan literatur, dimana kisaran hRf yang diperoleh adalah antara 45-55. Spektra yang diperoleh dari masing-masing track, menunjukkan kemiripan yang berarti senyawa yang diidentifikasi memang benar quinin sulfat.Berdasarkan data fluorosensi hasil scan, diperoleh bahwa pada semua track ditemukan adanya quinin sulfat. Seharusnya pada track 1 tidak ditemukan quinin sulfat. Hal ini terjadi karena kesalahan dalam preparasi sampel, yakni ketika mengambil fase kloroform setelah ekstraksi. Seharusnya larutan blanko mendapat perlakuan terlebih dahulu, agar tidak bercampur dengan quinine sulfat yang terdapat dalam larutan uji dan sampel. Dari data yang didapatkan dilakukan sejumlah validasi metode meliputi permbuatan kurva kalibrasi dan persamaan regresi, perhitungan persen perolehan kembali, perhitungan LOD dan LOQ, dan perhitungan kadar quinin dalam sampel. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan cara memplot AUC yang dihasilkan dari masing-masing standar terhadap konsentrasi. Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan adalah kecermatan atau akurasi, keseksamaan (presisi), linieritas dan rentang, serta parameter lainnya adalah batas deteksi dan batas kuantitasi (LOD dan LOQ) (Harmita, 2004).Perolehan kembali menyatakan kecermatan dan akurasi. Kecermatan merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar sebenaranya. Harga perolehan kembali untuk larutan uji 1, 2, dan 3 yaitu 39, 79%, 105, 281%, dan 28, 4375 %. Pada larutan uji 2 perolehan kembali lebih dari 100%, hal ini kemungkinan disebabkan karena adanya tumpang tindih antar kromatogram sehingga peak ganda terbaca menjadi peak tunggal sehingga diperoleh nilai AUC yang besar yang besar. Presisi atau keseksamaan merupakan suatu ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual , diukur melalui penyebaran hasil individual rata rata jika prosedur yang diterapkan secara berulang pada sampel sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur sebagai simpangan baku dan simpangan baku relatif (koefisien variasi atau KV), pada praktikum ini diperoleh simpangan baku sebesar 4693, 74 ng, dan nilai koefisien variasi sebesar 8,949%. Semakin kecil nilai standar deviasi maka hasil yang diperoleh semakin baik, karena hasil yang diperoleh pada masing masing pengukuran hampir sama. Sedangkan nilai KV menunjukkan simpangan relatif terhadap kadar rata rata sampel. Semakin kecil nilai KV maka data hasil yang diperoleh semakin baik. Berdasarkan pustaka nilai presisi yang adalah

Documents

Penetapan Kadar Kinin