PLASMIDELE

I. Definiţia Plasmidele reprezintă molecule de ADN dublu-catenare Plasmidele sint elemente genetice spaţial separate (elemente genetice extracromozomale)

sau integrate în cromozomul bacterian. Plasmidele sunt unităţi autonome de replicare care conţin origine proprie de replicare şi se

replică independent de cromozomul bacterian, dar depind de metaboliţii celulari pentru realizarea replicării.

Plasmidele conţin informaţie genetică neesenţială pentru creşterea celulelor normale ale speciei-gazda, astfel încît pot fi dobîndite sau pierdute, fără a afecta viabilitatea acestora (Lederberg, 1952 ; Novick, 1976).

Transmit informația genetică, pe verticală (de la o generaţie de indivizi la alta) sau pe orizontală (de la un individ la altul în cadrul aceleeaşi generaţii).

Termenul „plasmidă” a fost utilizat pentru prima dată de Lederberg în 1952 în literatura de specialitatea, pentru a defini toți determinanții genetici extracromozomali.

În 1952-1953 : W. Hayes , și J. Lederberg , Cavalli și E. Lederberg raportează că capacitatea de „împerechere” adică de conjugare la bacterii este controlată de un factor (F), care pare a nu fi asociat cu cromozomul.

1954 : Pierre Frédéricq si colegii au stabilit că colicine (plasmide) (proteine toxina mari (50 - 70kD)) se comportă ca factori genetici independenți a cromozomului.

1958 : François Jacob și Elie Wollman propune termenul " epizom " pentru a descrie elemente genetice cum ar fi factorul F , colicine și fagul lambda, care pot exista atât în asociere cu cromozomul bacterian și independent de acesta.

II. Diversitatea plasmidelor. Plasmide celulelor bacteriene.

Plasmidele au o răspândire universală la bacterii, fiind găsite intr-o anumita perioada a existenţei lor la toate speciile. Pînă in prezent au fost izolate peste 1 000 de tipuri de plasmide diferite, prezente in mod natural, in special la bacteriile Gram-negative. Numai de la E. coli au fost izolate 269 plasmide diferite (Birge, 1981)

Plasmidele celulelor eucariote. Existenţa plasmidelor în sistemele eucariote este controversata. Structuri de tip plasmidial

capabile de replicare fizic autonoma au fost descrise in citoplasma sau in mitocondriile mai multor organisme. Exista date privind prezenta unor plasmide ,,adevărate", fără nici o analogic cu ADN-ul mitocondrial, la unele plante superioare ca Zea mays, Beta vulgaris si Viciia faba, desi Kemble si Bedrook (1980) considera ca natura lor necesita confirmări suplimentare.

Plasmide asociate cu mitocondriile, dar independente de genomul acestora, au fost descrise la Nenrospora crassa, si Claviceps purpurea (Hollenberg, 1982). Cel mai mult studiate sint plasmidele descrise la Saccharomyces cerevisiae. Astfel, plasimide 2 m (lungimea conturilui), prezente la cele mai multe tulpini in nucleoplasma, in 50 – 100 de copii/celulă, au structura, de molecule de ADN dublu catenare circulare închise covalent, cu o lungime de ~ 6 300 pb.

Similar palsmidelor bacteriene, ADN 2m are o singura origine a replicării și gene structurale. Două gene structurale, codifica doua funcţii ,,REP", care asigura stabilitatea numerică a ADN 2 m in celulele levurilor.

In condiţii normale, plasmida 2 m se replica cu aceeaşi viteză, ca si restul genomului. Cind numărul copiilor scade, proteinele REP pot ,,să ignore" cocncordanța normala a replicării

plasmidelor cu ciclul celular, iniţiind cicluri de replicări multiple ale ADN 2 m pina cind numărul copiilor acestuia este readus la 30—50 per celula (Watson si colab., 1983).

III. Trăsături distinctive ale palsmidelor Diferențe dintre plasmide și cromozomul bacterian

Plasmidele sînt elemente genetice analoage structural si funcţional cromozomului bacterian, caracterizate prin următoarele proprietăţi distincte :

1) dimensiunea mai mica (~ 1—2% din mărimea cromozomului) (conţin de la 3000 la 100.000 perechi de baze);

2) conţinutul in baze (G + C) diferit de cel cromozomal, datorita prezentei unei informaţii genetice diferite;

3) prezenta unor trăsături morfologice particulare, ca, de exemplu, forma superhelicala, forma concatemeră etc.;

4) conţin informaţie genetica accesorie (adică neesenţială pentru multiplicarea bacteriilor in mediul lor natural si de aceea pot fi pierdute fără a prejudicia viabilitatea bacteriilor respective);

5) funcţionează ca un replicon capabil de replicare ,,autonoma", fizic independenta, dar in general corelata cu ritmul de replicare al cromozomului.

Diferențe dintre plasmide și bacteriofagiExistenţa unor deosebiri nete intre plasmide si bacteriofagii temperati a dus la excluderea

acestora din urma din categoria plasmidelor, bazata pe următoarele proprietăţi (Helinski, 1979):1) Plasmidele sunt limitate la o existenţa intracelulara, in timp ce fagii tipici pot exista si

extracelular sub forma unor particule virale infecţioase.2) Plasmidele se replica, autonom, fără sa afecteze viabilitatea celulelor gazdă, in timp ce

replicarea fagului temperat este însoţită de sinteza a numeroaso proteine structurale si enzimatice si de moartea celulei-gazda;

3) În cazurile in care informaţa genetica fagică persista in celula, ea nu este autonoma, ci integrata in cromozomul bacterian ca profag. Exista si excepţii, ca de exemplu fagul PI, la care profagul se replica liber fata de cromozomul bacterian (Ikeda, 1968), comportîndu-se ca o plasmida tipica, cu toate ca, produsul replicării sale vegetative sunt particule fagică mature. In mod asemănător se comporta formele replicativc ale fagilor fl, fd si M13 ai E. coli, care sint moştenite intr-o stare extracromozomală stabila, caracterizata prin producerea continua, de particulc fagice infecţioase (Hofman-Berling, 1964).

MORFOLOGIA PLASMIDELOR

I. Dimensiunile plasmidelorPlasmidele variază ca dimensiune: ele pot fi apreciate ca mici dacă sînt formate din cca 846

pb și o singură genă, mari care conțin cca 500 de gene și „gigante” cu 1674 gene. II. Forma palsmidelor

Similar cromozomilor plasmidele sînt circular închise CCC sau liniale. Există bacterii cum ar fi Borrelia burgdorferi care conți atît plasmide circulare (2) cît și liniare (9).

Plasmide circulare.

Plasmidele circulare sunt alcatuite din ADN d.c. CCC (Covalently Closed Circular), care prezinta in plus 1-2 torsiuni ce dau moleculei aspectul de suprahelice.

Foarte rar si temporar se intalneste forma CO (“circular open”), in care una din cele doua catene nu este continua avand o legatura fosfodiesterica lipsa.

Tot in vivo se mai intalnesc si concatemeri (oligo/multimeri). Plasmidele concatemere sau oligomere concatenate, sunt complexe supramoleculare formate din cateva plasmide si sunt rezultatul unor erori de replicare a monomerilor circulari sau a proceselor de recombinare interplasmidiala. Daca ambele catene sunt inchise, componentele individuale ale complexului sunt suprahelicale, iar daca una dintre catene este deschisa, forma este circulara. Configuratia circulara este o conditie a existentei lor in celula, cea care le confera rezistenta la actiunea nucleazelor celulare.

Fig. 1. Configuratii diferite ale ADN plasmidial. a. Plasmida circulara cu o catena incizata. b, c. Plasmide covalent inchise superhelicale. d. Plasmide concatenate.

2) Plasmide lineare. Asemenea plasmide sunt alcatuite din ADN d.c. linear (L). Au fost descrise doua tipuri de plasmide lineare :

1.    Plasmide lineare cu telomere hairpin (telomere in ac-de-par). Acestea sunt intalnite cu precadere la plasmidele lineare de la Borrelia (fig 1). Toate speciile de Borrelia examinate au un cromosom linear de 950-1000 kb si mai multe plasmide lineare cu dimensiuni cuprinse intre 5 si 200 kb (unele au si plasmide CCC). Toate plasmidele lineare de la Borrelia descrise pana in prezent au telomere de tip hairpin. Telomerele hairpin se caracterizeaza prin palindroame terminale bogate in A/T, la capete existand o continuitate in legatura de tip covalent intre cele 2 catene. Asemenea structuri (ADN d.c. L cu telomere de tip hairpin) mai exista si la ADN mt de la reprezentantii levurilor din genul Pichia, si la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi.

*Un palindrom este un șir de caractere (de obicei cuvinte, fraze sau numere) care citit de la stânga la dreapta sau de la dreapta la stânga rămâne neschimbat. Termenul "palindrom" a fost introdus de scriitorul englez Ben Jonson (1572-1637) și provine de la cuvintele grecești palin (πάλιν; "înapoi") și dromos (δρóμος; "drum, direcție"). Aba, aerisirea, aga, aha, alabala, ama, ana, anina, ici, monom, minim, radar.

Structura telomerelor hairpin la Borrelia

palindroame terminale, bogate in A-T

2. Plasmide cu telomere invertroni Asemenea telomere sunt intalnite la plasmidele lineare de la genul Streptomyces – plasmide cu dimensiune cuprinsa intre 9 si 600 kbp. Ca si cele hairpin, telomerele invertroni prezinta si ele palindroame terminale bogate in A/T. Diferenta consta insa in faptul ca nu exista legatura covalenta intre capetele celor 2 catene, si, ca urmare, capetele 5’ si 3’ sunt libere. La capul 5’ al fiecarei catene este atasata covalent o molecula proteica denumita proteina TP (“Telomeric Protein”) (Fig. 2). Telomerele invertroni sunt caracteristice repliconilor lineari de la eucariote, in mod special la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi si plante si din citoplasma de fungi.

invertroni la Streptomyces (b) (dupa H.Hinnebusch, 1992).

= la capul 5¢ al fiecarei catene exista o proteina atasata covalent

STRUCTURA GENETICA A PLASMIDELOR Fiind repliconi fizic independenti, toate plasmidele poarta determinanți genetici responsabili

de replicare, prezența cărora le asigură autonomie față de celula-gazdă.Autonomia plasmidelor. Novik (1980) considera ca plasmidele reprezintă expresia unui ultim

stadiu al simbiozei, fiind dependente funcțiile vitale ale celulei-gazdă, ele sînt individuale sau autonome prin proprietatea sa de a se autoreplica și distribuţia copiilor sale in celulele-fiice. Astfel autonomia este relativă, iar plasmidele menţin o relaţie constanta cu celula-gazdă. Cercetînd plasmida Rpl 258 de la stafilococ, Novik (1980) a demonstrat ca în structura ei xista o zona mica (1/10) ,,interzisa", la nivelul cţreia orice deleţie distruge ,,viabilitatea" plasmidei, deoarece ea dirijează replicarea (,,replication drive unit"). Rolul acestei regiuni a fost demonstrat de Novik (1980) : ,,plasmidele" reconstituite din fragmentele plasmidei originare, întroduse intr-o celula bacteriana, se replica numai daca. an în structura lor aceasta regiune.

Hărțilegenetice ale plasmidelor care au fost deja deduse au pus în evidență următorii determianți genetici plasmidiali:

Gene esențiale pentru existența plasmidelor, responsabile pentru replicarea lor. Gene de specificitate pentru incompatibilitate. Incompatibilitatea corespunde situatiei in

care, doua plasmide omologe nu pot fi mentinute stabil in aceiasi celula, deoarece una o exclude pe cealalta. Tehnica hibridarii ADN-ADN evidentiaza o omologie neta intre plasmidele din acelasi grup de incompatibilitate si o foarte mica asemanare intre plasmidele compatibile.

suprafeţe de legare de mezosomi, care asigura corelarea replicării plasmidei cu replicarea cromozomului și diviziunea celulei și repartizarea copiilor de plasmide în celulel fiice.

Secvențe de inserție. La palsmidele de conjugare operonii de transfer. Genele structurale care sînt neesențiale pentru existența plasmidelor dar care determină

funcţii noi ce se manifestă in fenotipul celulei gazda. Aceste regiuni de regulă confera caractere adaptative, avantajoase gazdelor bacteriene.

Multe plasmide au regiuni a caror expresie fenotipică este înca necunoscută,Caracterele conferite de prezenta plasmidelor celulei bacteriene acoperă o gama foarte larga de

funcţii ŞI proprietăţi noi intre care cele mai importante sint următoarele:1) rezistenţa la diferiţi agenţi bacterieni (antibiotice ca penicilina, ampicilna, cefalosponele,

streptomicina, kanamicina, neomicina, gentamicina, tetraciclinele, cloramfenicolul etc. si sulfatamidele) •

2) rezistenţa la metale ca Hg+, Cd2+, Bi, Pb si la ionii arseniat si arsenit3) rezistenta la UV;4) producerea unor toxine şi/sau factori de virulenţa, si patogenitate ca, de exemplu,

enterotoxina (Ent ), hemolizina (Hly ), factorul de virulenţa (C'oi V) la ~E. coli;5) producerea de bacteriocine (plasmidele Col);6) inducerea de tumori la plante (plasmida Ti la Agrobacterium tumefaciens);7) capacitatea de a utiliza substanţe neobişnuite cum sint camforul, octanul, numeroase

hidrocarburi policiclice ;8) capacitatea de a metaboliza anumite substraturi, ca lactoza la Proteus mirabilis si P.

morganii;9) fermentaţia lactică (Lactobacillus sp.);10) formarea vacuolelor cu gaze la Halobacterium;11) capacitatea de a asigura transferul de material genetic prin conjugarc si formarea

structurilor specifice corespunzătoare (pilii de sex);

12) producerea de antibiotice. In general, in structura plasmidelor, regiunile esenţiale si cele neesenţiale nu sint amestecate.

Astfel, genele răspunzătoare de replicarea lor autonoma sint grupate intr-un segment relativ mic al moleculei, care include regiunea corespunzătoare originii (ori) replicării (Timmis, 1978).

Face excepţie plasmida UK 2 la care genele pentru replicare sint distribuite pe o porţiune largă a ADN circular (Aleyer, 1977). În mod similar, genele răspunzătoare de proprietăţile de transfer si conjugaţi sint grupate într-un operon unic (Achtman, 1972; Sharp, 1972). In cazul plasmidelor cu rol in conjugare, hărţile genetice construite pîn-n prezent scot in evidenta o mare similaritate, cel puţin in ceea ce priveşte regiunile ce conţin genele implicate in transfer care prezintă un grad mare de omologie, reflectînd, probabil, o origine comuna (Beale si Knowles, 1978).

PRINCIPII DE CLASIFICARE A PLASMIDELOR

Plasmidele sint denumite si clasificate in mod curent după efectul lor cel mai evident, produs asupra celulelor-gazda (fertilitate, colicinogeneza, rezistenţa la antibiotice etc.). Utilizată, pentru nevoile curente, această clasificare este nesatisfăcătoare, in primul rind pentru faptul ca multe plasmide au mai mult de un efect (sprc exemplu, "plasmidele" JB pot purta în acelaşi timp determinanţi genetici de conjugare şi de rezistenţa la antibiotice). In plus, plasmidele pot pierde sau ciştiga prin recombinare diferite proprietăţi noi, caracteristice. Pentru a evita acete neajunsuri, s-a propus clasificarea plasmidelor pe criteriul ,,incompatibilitaţii" lor, adica. al capacităţii" lor de a exclude alte plasmide de aceleaşi tip de la coexistenţa in aceeaşi bacterie (Datfca, 1973). Pe acest criteriu an fost descrise la bacteriile Gram-negative peste 30 de grupuri de incompatibilitale (Helinski, 1977),

În funcţie de capacitatea lor de a media transferul de material genetic prin conjugarea celulelor bacteriene, plasmidele aparţin la doua categorii diferite : plasmide conjugative și nonconjugative.

1) Plasmidele conjugative (transmisibile sau infecţioase}, numite si factori de sex controlează proprietatea celula-gazda de donator de material genetic şi apariţia unor caractere fizice noi (apariţia pililor de sex etc.), care permit transferul de material genetic de la celula purtătoare de plasmida (donator) la. celulele fără plasmidă (receptor). Plasmidele conjugative sint cunoscule şi sub denumirile de conjugoni, factori de fertilitate sau transferoni si au în structura lor genetica, pe lînga genele de replicare autonomă, gene care stimulează, formarea de cupluri de încrucişare între bacterii. In categoria plasmidelor conjugative intra plasmidele de sex, în diferitele lor variante (F, Hfr şi F’), plasmidele ,,Entl" si unele plasmide ,,CCol" şi ,,R".

Plasmidele F (Fertility sunt unitati genetice extracromosomale cu proprietati episomale si functie de conjugon. Prototipul plasmidelor de fertilitate este cel descris la E. coli K12, prezenta intr-un singur exemplar/celula bacteriana, datorita sincronizarii replicarii sale cu replicarea cromosomului (fig.111). Marimea sa este apreciata la 94,5 kbp, distribuite in 4 regiuni distincte:

- regiunea genelor de incompatibilitate (inc) si a celor implicate in replicare (rep);

- regiunea care cuprinde cele patru elemente genetice transpozabile (trei secvente de insertie (IS) si transpozonul Tn l000;

- regiunea “linistita”, cuprinsa intre IS2 si inc-rep;- regiunea tra, care cuprinde secventele ori T (de origine a transferului) si inca cel putin 28 de

gene structurale ale plasmidei.

Plasmidele F se replica fizic autonom, dar sincron cu cromosomul bacterian, datorita unei stranse asocieri fizice cu acesta.In functie de prezenta plasmidelor de sex F, de raportul lor cu cromosomul bacterian si de mecanismul in care este mediat transferul de material genetic, celulele bacteriene se pot grupa in patru categorii distincte:

l. Celulele F-, lipsite de factorul F, echivalente fiziologic unor celule “femele”, care se comporta ca receptoare de material genetic.

2. Celulele F+ poarta plasmide F autonome si sunt fiziologic echivalente unor celule “mascule” sau donoare de material genetic, fiind capabile sa transfere o copie a plasmidei F, in timpul conjugarii.

3. Celulele Hfr poseda plasmida F integrata in cromosom. Fiziologic, sunt considerate ca avand un caracter de “supermascul”, deoarece se comporta ca donoare de material genetic, realizand procese de conjugare si recombinare cu o frecventa mare.

4. Celulele F’ sunt purtatoare ale unei plasmide F recombinata, care a incorporat in structura sa, si gene ale cromosomului bacterian in care a fost initial integrata si din care a trecut in stare autonoma, printr-un proces de excizie eronata. Aceste celule au caracter “mascul” si se comporta ca donoare de material genetic (transfera factorul F’).

2) Plafimulele neconjugalive, ca, de exemplu, celelalte tipuri de factori Col si R nu sint autotransmisibile şi in consecinţă nu sint infecţioase, deoarece nu conferă starea de donator de material genetic. Ele sint lipsite de genele tra, care asigura transferul prin conjugare al materialului genetic. Transferul lor se realizeaza prin intermediul unui fag transductor sau datorită prezenţei concomitente in celula bacteriana, a unei plasmide de sex (tabelul 1).

Tabelul 1Plasmidele conjugative şi neconjugative (după Helinski, 1977, modificări)

Clasa Tipul de plasmidă Regiunile genetice conţinuteComune Specifice

Plasmide conjugative (plasmide de sex)

F, Col, R, Ent Replicarea autonomă transfer (“tra”)

Gene provenite din cromozomul bacterian

Producerea de colicineRezistenţa la antibiotice Producerea de enterotoxine

Plasmide neconjugative

Col (unele)R

Replicarea autonomă Producere de colicineRezistenţala antibiotice

In funcţie de capacitatea lor de integrare in cromozomul bacteriilori. plasmidele se împart in doua categorii :

1) Plasmidele cu funcţii episomale episomale (episom = corp adăugat; Jacob, 1958) pot exista alternativ in stare autonoma (libere in citoplasma) sau integrate - incorporate in genomul celulei-gazda. In aceasta categorie intra plasmida de sex F si plasmida Col E1

2) Celelalte plasmide, ca factorul Col, răspunzător de fenomenul de colicinogeneză, si factorul F’ (derivat al plasmidei F integrate, care a incorporat un fragment de cromozom bacterian), sint incapabile de integrare în genomul cclulei-gazda şi de aceea persista indefinit numai in stare autonomă.

În corespundere cu carecterele conferite celulei gazdă plasmidele formează următoarele categorii

Plasmidele criptice formează categorie aparte, fara efect aparent asupra fenotipului celulei-gazda. S-ar putea ca ele sa poarte informaţie numai pentru propria lor replicare sau sa codifice și o serie de funcţii adiţionale, care vor fi detectate numai cind vor fi elaborate folosite teste adecvate.

Plasmidele de virulenţă Orskov si colab. (1975) au descris existenţa unor tulpini de E. coli care produc îmbolnăviri severe de tip enteritic la copii, adulţi si animate domestice. Spre deosebire de tulpinile de E. coli izolate de la oameni sănătoşi, tulpinile enteropatogene au o serie de proprietaţi adiţionale: capacitatea de a elabora doua tipuri de enterotoxina (termolabilă TL şi termostabilă TS) si capacitatea de a coloniza suprafaţa epiteliului intestinal, datorita unor antigene proteice, similare pililor, pe suprafaţa celulelor bacteriene {antigenele de colonizare sau de aderenţă).1975. Determinanţii genetici ai enterotoxicităţii şi ai antigenelor de suprafaţă sint transmisibili, fiind purtaţi de plasmide specifice: plasmida enterotoxinei (M ~ 55—61 X 106 dal), plasmida, antigenului de colonizare şi plasmida de virulentă.

Plasmidele R

Plasmidele R (de rezistenta transmisibila, cu caracter infectios), descrise de Watanabe (l960), sunt elemente genetice extracromosomale care confera celulei purtatoare, rezistenta simultana la mai multe antibiotice, la sulfamide, la cationii metalelor grele. El a demonstrat rezistenta simultana a celulelor de Shigella (agentul dizenteriei, bacterie Gram negativa, enterica), la mai multe antibiotice, iar rezistenta s-a dovedit a fi transmisibila la celule sensibile.

Plasmidele R contin informatia genetica ce confera rezistenta la mai multe antibiotice, la sulfamide (produsi de sinteza chimica, derivati ai acidului paraaminobenzoic) si la diferiti agenti chimici. Datorita inrudirii chimice dintre diferite familii de antibiotice, o plasmida confera rezistenta simltana, la un numar mare de antibiotice. Astfel, celula bacteriana devine suprarezistenta, atat calitativ cat si cantitativ. Datorita rezistentei plasmidiale, bacteriile patogene produc infectii foarte greu de controlat prin mijloacele terapeutice obisnuite.

Plasmidele R au fost evidentiate la E. coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Erwinia, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium etc.

Plasmidele R au o structura genetica complexa si sunt alcatuite din urmatoarele categorii de determinanti genetici:

-         genele care confera rezistenta la antibiotice (genele “r ”);-         genele care confera plasmidei R, functia de conjugon (transferon). Ele sunt grupate intr-un

transpozon, formand factorul de transfer al rezistentei (FTR). Se numesc gene tra si codifica sinteza proteinelor necesare transferului plasmidei prin conjugare;

-         secvente de insertie;

-         secventa de initiere a procesului de replicare (“ori”);-         genele ce asigura replicarea fizic autonoma, a plasmidei.

Genele “r ” fac parte din structura unor transpozoni (fiind delimitate de secvente de insertie) si au o mobilitate foarte accentuata, adica se deplaseaza dintr-un situs in altul in structura plasmidei sau intre plasmida si cromosom. Numarul genelor de rezistenta intr-o plasmida este variabil. Spre deosebire de plasmidele F, plasmidele R nu se integreaza in cromosomul bacterian.

Cele doua categorii de determinanti genetici, de rezistenta si de transfer, pot sa existe in stare recombinata sau se gasesc disociati in celula bacteriana, ca unitati de sine statatoare (fig. 112):-         factorul de transfer al rezistentei (FTR) ce poarta gene reglatoare ale replicarii, genele de

transfer si uneori gena de rezistenta la tetraciclina (tet), cu gr. mol. de ll x l06 D; -         celalalt component, care contine genele de rezistenta la antibiotice si are dimensiuni foarte

diferite, intre cateva milioane - l00 milioane D. Cele doua plasmide mici se replica autonom.

Fig. 112. Harta genetica a unei plasmide R, cu gene de rezistenta la diferite antibiotice si la diferiti agenti chimici cu efect antibacterian. Unele plasmide R contin factorul de transfer al rezistentei (FTR) cu

determinantii genetici de rezistenta.

In celulele de E. coli, cele doua plasmide se recombina si formeaza o plasmida mare, care poarta atat genele de rezistenta, cat si pe cele de transfer. In aceasta stare, plasmida R se transmite prin conjugare cu o frecventa foarte mare: l00% din celulele sensibile ale unei populatii celulare ce formeaza cupluri de conjugare, primesc o copie a plasmidei R si devin rezistente (asa numita rezistenta infectioasa sau transmisibila). Frecventa transmiterii conjugative scade treptat, datorita sintezei unui represor care blocheaza activitatea genelor tra si astfel este inhibata sinteza pilinei si implicit asamblarea pililor.

Daca plasmida R nu contine determinantii genetici tra (FTR), transferul sau se face prin transductie mediata de un fag de dimensiuni mari, sau prin conjugare initiata de alte plasmide conjugative.

Plasmidele “Col”

Plasmidele “Col” sunt elemente genetice extracromosomale, care codifica sinteza unor substante antibiotice de tip special, denumite colicine. Fenomenul de colicinogeneza a fost descoperit de Gratia (l925). Denumirea de “colicine” a fost atribuita unor substante cu proprietati antibiotice produse de o tulpina virulenta de E. coli, care au efect letal asupra celulelor producatoare, precum si a unor tulpini strans inrudite cu cea producatoare. Producerea de colicine nu este limitata la E. coli, ci este un fenomen mult mai raspandit in lumea bacteriilor si din acest motiv, Jacob (l953) a dat

denumirile de bacteriocine, bacteriocinogeneza si factori bacteriocionogeni, pentru a desemna substantele, fenomenul si respectiv plasmidele care controleaza producerea lor.

Plasmidele (factorii “Col”) au aceleasi particularitati, comune altor plasmide: sunt molecule de ADN, circulare, dublu catenare inchise, suprahelicale. La E. coli, in mod obisnuit se gasesc 5-25 de copii/celula.

Unele plasmide “Col” (de exemplu, Col E1) au functie de conjugon, deoarece poarta in structura lor genetica, determinantii genetici de transfer. Ele se pot transfera la tulpinile col-, prin conjugare. Plasmidele Col tra- se transfera prin transformare genetica, transductie fagica sau prin conjugare initiata de alte plasmide cu functie de conjugoni.

Bacteriocinele sunt substante antibiotice cu actiune bactericida, a caror sinteza este codificata de plasmidele Col. De cele mai multe ori, bacteriocinele sunt proteine pure, uneori sunt glicoproteine, cu o gr. mol. de l8-90 kDa.

Bacteriocinele produse de bacteriile Gram negative au cateva proprietati generale:

- au un spectru de actiune foarte ingust, limitat la tulpina producatoare si la altele strans inrudite;

- actiunea lor este bactericida;

- contin o componenta biologic-activa, de natura proteica;

- se leaga de celulele sensibile prin intermediul unor receptori celulari cu specificitate inalta, ceea ce explica spectrul lor foarte restrans de actiune;

- biosinteza bacteriocinelor are efect letal asupra celulei producatoare. Denumirile diferitelor bacteriocine provin de la numele genului sau al speciei bacteriei

producatoare, la care se adauga sufixul “cina”: de exemplu, lactocine (produse de Lactobacillus), vibriocine (produse de Vibrio), respectiv pesticine (produse de Yersinia pestis), megacine (produse de B. megatherium), subtilicine (produse de B. subtilis) etc.

Bacteriocinele produse de bacteriile Gram pozitive au un spectru de actiune foarte larg. Ele sunt active asupra celulelor producatoare, dar si asupra unor specii mai indepartate si chiar asupra bacteriilor Gram negative. Din punct de vedere chimic, sunt glicoproteine sau lipoproteine.

O categorie speciala de bacteriocine, o constituie cele sintetizate de Ps. aeruginosa (bacilul piocianic), denumite piocine. Ele se evidentiaza in lizatele culturilor, dupa inductia sintezei cu UV, sub forma unor bastonase perechi, asemanatoare cozilor contractile ale fagilor din seria T-par, infectiosi pentru E. coli, cu lungimea de 90-l25 nm si grosimea de 20 nm. Uneori, perechile de bastonase apar contractate, mai scurte si groase, iar intre cele doua structuri electrono-dense se evidentiaza zona centrala (“core”), echivalentul structural al cilindrului axial al cozii fagului.

Mecanismele de actiune a bacteriocinelor Bacteriocinele produse de celulele Gram negative actioneaza prin mecanisme specifice asupra

unor “tinte” situate in membrana sau in citoplasma. Spectrul foarte limitat de actiune a bacteriocinelor produse de celulele Gram negative, sugereaza existenta unor receptori prin care acestea isi dobandesc accesul la structurile sensibile. De fapt, moleculele care functioneaza ca receptori nu sunt specializate in acest sens, ci indeplinesc diferite activitati, in special de transport celular al unor substante nutritive.

Mecanismele de actiune s-au studiat pentru colicine (produse de E. coli). Dupa fixarea ireversibila la nivelul receptorilor membranei externe, colicinele isi exercita efectul bactericid prin unul din urmatoarele mecanisme:

- inhibarea fosforilarii oxidative, stopand astfel procesele energetice celulare. Consecutiv se produce alterarea permeabilitatii membranei plasmatice, blocarea sintezei macromoleculare (ADN,

ARN, proteine), ca si a transportului activ al substantelor nutritive; - unele colicine se fixeaza specific pe molecula de ADN si determina aparitia inciziilor

monocatenare, ceea ce deschide calea actiunii nucleazelor celulare si a degradarii ADN; - altele inactiveaza subunitatile ribosomale 30 S, prin clivarea ARNr l6 S.In concluzie, bacteriocinele au efect bactericid asupra celulelor sensibile. Ceea ce le deosebeste

fundamental de alte antibiotice este faptul ca au efect letal asupra celulelor in care s-au sintetizat si din aceasta cauza, proprietatea de bacteriocinogeneza nu se poate perpetua intr-o celula, decat in starea ei potentiala. Periodic, sinteza bacteriocinelor este indusa si celula producatoare se lizeaza, eliberand moleculele cu efect litic in mediu. Efectul litic al bacteriocinelor se manifesta numai asupra celulelor aceleiasi specii, care nu o pot codifica, fiind lipsite de factorul Col. Celulele care poarta factorul Col sunt rezistente la actiunea colicinei omologe, elaborata de celule purtatoare ale aceluiasi factor, ca si cum ar fi imune la actiunea lor.

Originea plasmidelor este un subiect al speculatiilor. Plasmidele par sa fi evoluat din EGT, a caror structura genetica s-a complicat progresiv, prin dobandirea unor gene noi. Plasmidele au specificitate de gazda. Fiecare grup de bacterii pare sa aiba setul propriu de plasmide. In general, plasmidele rezidente in bacteriile Gram pozitive nu se stabilizeaza in celulele Gram negative si invers. Fac exceptie plasmidele enterobacteriilor, care pot fi transferate la multe, daca nu la toate genurile de bacterii.