PORFİRİN METABOLİZMASIPORFİRİN METABOLİZMASI

Doç.Dr.Banu Sancak

Porfirinler 4 pirol halkasının metilen köprüleriyle birleşmesiyle oluşan siklik bileşiklerdir.

Özellikleri pirol halkasındaki nitrojenlere metal iyonlarının kompleks yapmasıdır.

Değişik porfirinler her 4 pirol halkasına bağlı yan zincirlere göre farklılıklar gösterirler.

Örneğin; üroporfirin yan zincirinde asetat ve propionat taşırken, kaproporfirin metil ve propionat grupları taşır.

Bununla birlikte, yan zinciri asimetrik dağılım gösteren tip III porfirinler en çok bulunan biçimdir ve fizyolojik olarak önemlidir.

İnsanda en çok görülen metallo porfirin hemdir. (Demir porfirin)Katabolik yıkıma uğrayan hem molekülünü yerine koymak için sağlıklı bir erişkin günde 5 – 6 gram hemoglobin üretir .

Canlılarda Hem Sentezi

İnsanlarda miktar olarak en önemli porfirin olan hem; hemoglobin, miyoglobin, sitokrom, katalaz ve pirolazın prostetik grubudur.

Hem biyosentezinin yapıldığı başlıca yerler karaciger ve hemoglobin sentezinin aktif olduğu kemik iliğindeki eritrosit üreten hücrelerdir. Hemoproteinlerin turn over’ı da porfirinlerin sentez ve yıkımı ile birlikte gerçekleşir.

Süksinil Co A + Glisin

ALA

ALA Sentaz

ALA Dehidrataz

Porfobilinojen

Üroporfirinojen I Sentaz

Hidroksimetil bilan

Üroporfirinojen III Co Sentaz

Üroporfirinojen III

Üroporfirinojen Dekarboksilaz

Kaproporfirinojen III

Kaproporfirinojen Oksidaz

Protoporfirinojen III

Protoporfirin III

Protoporfirinojen Oksidaz

Hem

Ferroşelataz

Hemoprotein

Fe(+2)

Protein

Porfirin sentezinin ilk basamağı süksinil Co A ve glisin kondanzasyonudur. Pridoksal fosfat glisini aktive etmek için kullanılır. Bu reaksiyon mitokondride gerçekleşir.

Süksinil Co A ve glisin aminoasidinden Aminolevulinat (ALA) sentezlenir. Reaksiyonu katalizleyen enzim ALA Sentaz; porfirin metabolizmasının hız kısıtlayan enzimidir.

ALA Sentaz enziminin indüksiyonu hipoksi ve böbrekler tarafından üretilen eritropoetin tarafından artırılır; enzim üretimi serbest hem tarafından inhibe edilir.

Hem yokluğunda ALA Sentaz aktivitesi

artarken, hem artarsa enzim inhibe olur.

ALA Sentazın turn over hızı fazladır. Enzim yarı ömrü 1 saattir.

SüksinilCoA + GlisinALA Sentaz

Aminolevulinat (ALA)

Co A, SH,Pridoksal Fosfat ve Mg(+2)

Takip eden reaksiyon sitoplazmada gerçekleşir ve irreversibledir. Sitoplazmada 2 molekül ALA, ALA dehidrataz (porfobilinojen sentaz) enzimi ile kondanze edilir ve 2 molekül suyla porfobilinojen (PBG) oluşur.

2 H2O

ALA dehidrataz çinko taşıyan bir enzimdir. Sülfidril içeren ağır metallerce inhibe edilir.

2 ALA ALA Dehidrataz (PBG Sentaz) Porfobilinojen

4 molekül porfobilinojenin (PBG) kondanzasyonuyla tetrapirol halkasının oluşumu gerçekleşir. Tetrapirol yapısına “PORFİRİN” adı verilir.

4 molekül porfobilinojenin tek C köprüsü aracılığıyla birleşmesi üroporfirinojen III oluşumuna neden olur. Reaksiyonu Üroporfirinojen I Sentaz katalizler. Bu da hızla Üroporfirinojen III kosentaz ve üroporfirinojen sentaz yardımıyla üroporfirinojen I’ i oluşturur.

Üroporfirinojen I sentaz, 4 PBG molekülünün simetrik olarak birleşmesini katalizler ve bir lineer tetrapirol oluşturur. (hidroksimetil bilan) ki bu yapı spontan olarak üroporfirinojen tip I’ i oluşturabilir.

4 molekül PBG

Üroporfirinojen I Sentaz(PBG Deaminaz)

4 NH 3

Hidroksimetil bilan (lineer tetrapirol)

Spontan

Tip I Üroporfirinojen

Üroporfirinojen I SentazÜroporfirinojen III Cosentaz

Tip III Üroporfirinojen

Üroporfirinojen III kosentaz asimetrik olan üroporfirinojen III’ü oluşturur. Üroporfirinojen III, bir dizi dekarboksilasyon ve oksidasyon reaksiyonu ile oluşan bir çok ara üründen sonra heme çevrilir.

Üroporfirinojenlerin kaproporfirinojenlere dönüşümünde asetat gruplarının dekarboksilasyonu ve metil gruplarının oluşması söz konusudur.

Bu basamağa dek sitoplazmada gerçekleşen bu reaksiyonlar sonunda oluşan kaproporfirinojen III mitokondriye geçer. Burada protoporfirinojen III ve protoporfirin III oluşur. Reaksiyonlarda yer alan enzimler mitokondride bulunur.

Tip I üroporfirinojenden hem sentezi gerçekleşmez; az miktarlarda üretilerek, idrarla atılır.

Kaproporfirinojen IIIO 2 Kaproporfirinojen oksidaz

CO 2Protoporfirinojen III

Protoporfirinojen oksidaz

Protoporfirin III

Ferroşelataz (Hem Sentaz)Fe (+2)

Hem

Bu reaksiyonlarda yer alan 3 enzim de mitokondridedir.

Tüm üroporfirinojenler metilen köprüleri ile bağlı pirol halkası içerirler, konjuge bir halka olmaması nedeniyle renksizdirler. Ancak porfobilinojenler hızla renkli porfirinlere okside olabilirler. Bu oksidasyon ışıkla ve oluşan porfirinlerle gerçekleşir.

Her bir bileşiğin karekteristik bir absorbans spektrumu vardır. 400 nm.de yüksek bir absorbans gösterirler. Oluşan banda ‘Sored bandı” adı verilir.

Kuvvetli mineral asitlerde veya organik solventlerde çözündüklerinde porfirinler kırmızı bir floresans verirler. Bu özellikleri sayesinde çok küçük miktarlardaki porfirinler bile tespit edilebilir.

Porfirinlerin soret bandı oluşturma ve floresanslanma özellikleri pirol halkasındaki çift bağlardan ileri gelir.

HEM BİYOSENTEZİNİN ÖZETİ Hem biyosentezi süksinil Co A ve glisin gibi basit

moleküllerle başlar. İlk ve son basamak mitokondride, diğerleri

sitozoldedir. ALA sentazca sentezlenen ilk basamak, hız

kısıtlayıcı basamaktır. 2 molekül ALA’ nın kondanzasyonu pirol’ü

oluşturur, pirol 2 veya 3 karbonlu yan zincirler içeren bileşiktir.

4 tane pirol, porfirin halkasını oluşturur. Yan zincirler üroporfirinojen III kosentaz tarafından organize edilir ve III serisinden porfirinler oluşur.

Yan zincirlerin oksidasyonu ve dekarboksilasyonu sonucu üroporfirin ve kaproporfirinler oluşur. Bu bileşiklerin ayırımı porfirin halkasının periferal karboksil gruplarının sayısıyla olur.

son basamak demirin porfirin halkasının ortasına yerleşmesidir.

Sağlıklı bir erişkin günde 5 – 6 gram hemoglobin üretir.

PORFİRİYAPORFİRİYA Porfiriyalar hem biosentezine katılan

enzimlerin sentezini yöneten genlerde mutasyonlara bağlı,yeni doğan döneminde izlenen metabolik bozukluklardır.

Çok sık görülmeseler de, karın ağrıları ve çeşitli nöropsikiyatrik bulguların ayırıcı tanısında hatırlanmaları önemlidir.

Yeni doğanın bir çok metabolik hastalığında olduğu gibi semptomlar, enzimatik blok nedeniyle metabolik ürünlerde eksiklik veya bloktan önceki metabolitlerde, istenmeyen miktarlardaki artışa bağlıdır.

DNA’daki mutasyonlara bağlı hem sentezindeki anormallikler sonucu iki grup porfiriya gözlenir.

DNA mutasyonu

Hem sentezindeki enzim abnormallikleri

ALA ve PBG birikimi Porfirinojenlerin ve/veya

dokular ve deride biyolojik sıvılarda ve hücrelerde birikimihem azalması

Porfirinojenlerin porfirinlere Nöro psikiyatrik semptomlar spontan oksidasyonu

Fotosensivite

Tüm porfiriyalar otozomal dominant geçişli genetik hastalıklardır.Sadece konjenital eritropoetik porfiriya otozomal resesif özellik gösterir.

Porfiriyalar için değişik sınıflandırmalar mevcuttur.Enzim defekti gösteren dokuya bağlı olarak hepatik veya eritropoetik porfiriyalar olarak adlandırılırlar.

1.Hepatik Porfiriyalara)Akut intermitant porfiriya b)Variegata porfiriyac)Herediter kaptoporfiriya d)Porfiriya cutenea tarda 2.Eritropoetik Porfiriyalar a)Konjenital eritropoetik porfiriya b)Eritropoetik porfiriya

Akut İntermitant PorfiriyaAkut İntermitant Porfiriya

Üroporfirinojen I sentaz aktivitesinde azalma söz konusudur.

Vucut sıvılarında ve dokularda ALA ve porfobilinojen birikir.

Akut ataklar sırasında idrarda bol miktarda ALA ve PBG tespit edilir,idrar porfirinleri de artar,ancak bu daha çok PBG’nin spontan kondanzasyonu sonucudur.Porfirinlerin fekal atılımı normaldir.

ALA ve porfobilinojen idrar,hava ve ışıkla temas ettiğinde koyulaşır.Bu ürünler SSS’de ,özellikle abdominal sıvılarda toksiktir ve karın ağrısı,nöropsikiatrik semptomlara yol açarlar.

Biyokimyasal mekanizması ALA’nın sinir sisteminde ATP azı inhibe etmesi veya ALA’nın beyin tarafından alınarak paraliziye sebep olmasıdır.

AİP’ de abdominal ağrı atakları olur.İntermitant nöromusküler semptomlar sıktır.

Ataklar özellikle barbitürat türü ilaçlarla, enfeksiyonlarla,hormonal balanstaki değişikliklerle (hamilelik,OKS,steroid kullanımı) aktive olur veya sıklaşır.

Hastalarda foto sensivite yoktur.

ALA sentaz hem indüksiyon,hem de represyona uğrayabilir.Özellikle bazı grup ilaçlar aktivitesini artırır. Barbitüratlar ve griseofulvin gibi ilaçlar sitokrom P450 sistemini indüklerler.Bu sistem de hem kullanıldığından ALA sentaz aktivitesini indükler.

Porfiriya Cutenea TardaPorfiriya Cutenea Tarda

En sık rastlanan tiptir. Üroporfirinojen dekarboksilaz enziminde

defekt vardır. İdrarda ve feçeste porfirin atılımı artar. Fotosensivite ana semptomdur.

Güneş ışığına maruz kalan deri bölgelerinde büllöz lezyonlar meydana gelir.

Hastaların çoğunda kronik karaciğer hastalığı mevcuttur.Karaciğer hastalıkları ve hepatik tümörlerde bu tip semptomlar verir.OKS ile östrojen tedavisi de PCT’ ye sebep olur çünkü karaciğere toksiktir.

Toksik etkilerle PCT oluşturabilir.

Porfiriya VariegataPorfiriya Variegata

Protoporfirinojen oksidaz eksikliği söz konusudur.

AİP semptomlarına çok benzerdir.Bir grup hastada fotosensivite en belirgin bulgudur.

Ataklar sırasında ve remisyon döneminde feçeste porfirinler artar.Üriner porfirin ise ataklar sırasında artar.Atak döneminde idrarda üroporfirin ve PBG de gözlenir.

Herediter KaproporfiriyaHerediter Kaproporfiriya

Kaproporfirinojen oksidazda defekt vardır.

Hastalar fotosensitivdir. İdrarda kaproporfirinojen III birikir. Nadir gözlenir.

Konjenital Eritropoetik Konjenital Eritropoetik PorfiriyaPorfiriya

Üroporfirinojen III kosentaz aktivitesi azalır.

Hastalar fotosensitivdir. Diş,kemik,idrar pembe ve koyu kurşuni

tonlar arası renklerde boyanır. Üroporfirinojen I ve kaproporfirinojen I

idrarda birikir.

Eritropoetik ProtoporfiriyaEritropoetik Protoporfiriya

Kemik iliğindeki retikülositlerde ferroşelataz eksikliği vardır.

Fotosensivite mevcuttur.

ALA sentaz aktivitesinde azalma şimdiye

kadar rapor edilmemiştir.

ALA dehidrataz aktivitesinin azalması ise çok nadirdir.

Kurşun İntoksikasyonu

Kurşun,barsak ve akciğer absorbsiyonundan sonra kanda eritrositlerin yüzeyinde taşınır ve kemikte depolanır.

Periferal nöropati,abdominal ağrı,anemi ve ensefalopati ana bulgulardır.

Kurşun bir çok enzim sistemini inhibe eder,ancak özellikle porfirin sentezinde inhibisyona neden olur.Akkiz porfiriyaya yol açar.

ALA dehidrataz,ferroşelataz ve daha az olasılıkla kaproporfirinojen oksidaz üzerine inhibitör etkisi vardır.

Eritrositlerde protoporfirin artar,idrarda ALA ve kaproporfirin III artar.

Tanısal Testler

1.Artmış kurşun düzeyini gösteren testler a)Kanda kurşun düzeyi (çevresel faktörlerden çok fazla etkilenir)

b)Kurşunla bağlanan EDTA,Ca tuzları gibi şelatörler verildiğinde idrarla atılan kurşun miktarının saptanması(24 saatlik idrar kullanılır.60 dakika İV EDTA infüzyonu yapılır.Test iyi bir kurşun zehirlenme indeksidir,ancak tarama testi için uygun değildir.)

2.Kurşunun toksik etkilerini gösteren testler

a)Eritrositlerdeki PBG sentaz aktivitesinin gösterilmesi(En sensitiv indekstir.)

b)İdrarda ALA atılımı(Diğer sensitiv

testtir,özellikle kurşuna mağruz kalan çalışanlar için iyi bir tarama testir.)

c)Eritrosit protoporfirin ölçümü en pratik testtir.

Fotosensivite

Işığa maruz kalan porfirinler uyarılırlar ve moleküler oksijenle reaksiyona girerek, oksijen radikallerini oluştururlar.Radikaller lizozomları ve organelleri hasara uğratırlar.Hasara uğramış lizozom, degradadif enzimleri açığa çıkararak deri lezyonlarına neden olur.

Porfirin Analiz Metotları

Porfiriya olgularında her bir defektif enzim için spesifik enzim analizleri mevcuttur.

Tarama testleri kolay uygulanabilmeli ve acil durumlarda yararlı olabilmelidir. Yalancı pozitif ve negatif sonuçlar gözlenebilir.

Tüm tarama testlerinde kantitatif yöntemler kullanılmalıdır.

Triporfirin(üro-proto-kapro) ve twoporfirin prekürsörlerinin kantitatif ölçümleri bir çok porfiriyayı klasifiye etmemizi sağlar.

Üriner PBG ve ALA Testleri

Üriner PBG için en yaygın kullanılan iki test;Watson-Schwartz ve Hoesch testleridir.Her iki testin temel mantığı Ehrlıch reaktanı ile(asidik beta dimetil aminobenzaldehit) karıştırma sonucunda portakal kırmızısı rengi oluşumudur.

Watson testinde kloroform veya bütanolün eklenmesiyle ekstrakte edilen PBG’ nin Ürobilinojen ve İndol gibi substratlarından diferansiasyonu sağlanır.

Kloroform eklendiği zaman aköz fazda eğer kiraz kırmızısı renkte kalırsa bu PBG için ( +) işarettir.

Hoesch testindeki reaktan ürobilinojenle reaksiyona girmez, bu özellik Watson testinin sonuçlarıyla karşılaştırmada kullanılır. Diğer idrarda bulunan maddeler de Ehrlich reaktanı ile birlikte idrarda değişik renkler oluşturulabilir. Her iki test de yalancı ( +) veya ( -) sonuçlar verebilir. Bu tesleri takiben kantitatif bir test yapılmalıdır.

Porfobilinojen ve ALA kantitatif olarak iyon exchange yapılarına göre değerlendirilir.

Bu testler taze idrar veya 24 saatlik idrarda yapılır.PBG analizlerinde;anyon exchange kromotografisinde birçok değişik maddeler absorbe edilir ve tekrarlayan yıkamalarda PBG çıkarılır.

PBG asetik asitle karıştırılır.Karışıma Ehrlich reaktanı eklenerek, sonuçtaki kırmızı renk spektrofotometrede değerlendirilir.

ALA da benzer bir prosedürle katyon exchange kromatografi ile işaretlenir.ALA Ehrlich reaktanı ile reaksiyona girip, aseton ile kondanze edildikten sonra bir pirol halkası oluşur.Reaksiyon maksimum düzeyde gerçekleştikten sonra 5 dk. İçinde okunmalıdır.

Metodun seçiminde göreceli olarak testin basitliği ve ucuzluğu göz önünde bulundurulmalıdır. Bu testler tarama testlerine tercih edilir.

Porfirin Testleri

Porfirinlerdeki tarama testleri , kimyasal yapılarının UV ışığı altında karekterisik kırmızı floresan renk oluşturmasına dayanır.

Porfirinler önce asidifiye organik solvent içine ekstrakte edilir,sonra aköz asit içine konulmuştur.

Bu test idrar,kan veya feçeste yapılabilir.Tercih edilen 24 saatlik idrardır.

Antikoagülanlı kan veya 1 gr gaita kullanılabilir. Cam ekipmanlar kullanılmalıdır .Çünkü sentetik

materyaller floresanla reaksiyona girer.

İdrar asetik asit veya etil asetatla karıştırılır ve seperasyon sağlanır.En üst tabaka UV.lambasında karekteristik portakal rengi için incelenir.Daha sonra üst tabaka çıkarılarak, HCI ile karıştırılır ve floresan ışıkta değerlendirilir.

Asidik yapıdaki tabakada görülen floresans, porfirinlerin varlığının göstergesidir.

Kan ve feçeste de benzer yöntemle analiz yapılır.

Sonuçların karşılaştırılması ve yorumu subjektiftir,yalancı (+) ve(-) sonuçlar ortaya çıkarabilir.Tavsiye edilen,değişik kantitatif testlerin kalitatif testlerin yerine kullanılmasıdır.

Porfirinler için bir çok kantitatif testte temelde solvent eklenir ve florometrik ve kromatografik yöntemlerle analiz yapılır.

Porfirinlerin ölçümü ve belirlenmesinde yaygın kulanılan metot,yüksek performanslı likit kromatografidir.Bu metotta fraksiyonlarına ayırma yöntemi kullanılır. Değişik porfirin tiplerinin(üro,izokapro,kapro) oluşturduğu pik değerleri ölçülür.

Hb’ deki hem bağlayıcı tuzaklar kan hücrelerinde hayat boyu mevcuttur.Zn hemin proto halkasına bağlanmak için Fe ile yarışır.Eritrositin gelişme döneminde Fe miktarı indirekt yöntemlerle ölçülebilir.(ZPP)

Fe eksikliği anemisinde ZPP seviyesi yükselir.Kronik hastalık anemisi ve zehirlenmelerde de ZPP düzeyi yüksektir.

ZPP için kullanılan hızlı tarama testlerinde, yıkanmış eritrositlerin hematoflorometri ve tam kanın floresans la ölçülmesi kullanılır.

Kan porfirinlerinin analizinde daha kesin bir metot serbest eritrosit protoporfirinlerinin (FEP) ölçüldüğü geleneksel ayrımlaştırma tekniğidir.

Porfirinlerin tanısında moleküler tanı yöntemleri de yararlı hale gelmişlerdir.Hem sentezini yapan enzimleri kodlayan genlerin çoğu tanımlanmış ve çeşitli porfiriyalarla, neden olan mutasyonlar tespit edilmiştir.

Porfirinlerin tanısında yardımcı olan bu tekniklerin, geleneksel biokimyasal tekniklere göre avantajları vardır. Geleneksel testler, akut ataklar dışında çeşitli hastalıklarda da çok yüksek değerlere ulaşmaları nedeniyle yalancı (+) ve (-) sonuçlar verebilirler.

Moleküler testlerin kullanımında en önemli yarar, standart lab.testleriyle saptanamayan asemptomatik gen taşıyıcılarının tespit edilebilmesidir.