Práctica #4 de Microbiología General

Métodos de Cultivo de Microorganismos

Introducción:

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

Objetivos:

Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones. Organizar el material para su fácil manejo e identificación. Manipular adecuadamente los cultivos puros. Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos. Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.

Marco Teórico:

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células

descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.  Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:

La contaminación y pérdida del cultivo en estudio La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación

de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos.

Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, cable de Kolleo portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tiene aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista. Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta Pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno. Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se

inclinan o vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.

Técnicas de Siembra:

Método: Siembra por Estrías en Placa

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.

Técnicas de Estriado:

1. Estriado simple o continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.

2. Estriado en cuadrantes: La mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el medio. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias.

Procedimiento:

1. Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero2. Introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra3. Sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y4. Volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo

grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas.

5. Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.

Métodos: Vertido en Placa y Extensión en Placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro. Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

Procedimiento:

1. Tomar 3 tubos conteniendo 9ml de SSP.2. Homogenizar las muestras a estudiar.3. Usando técnicas de asepsia transfiera 1ml de la suspensión microbiana al primer tubo,

mezclar bien con movimientos suaves.4. Extraer 1ml de esta mezcla y llevar al segundo tubo. Posteriormente mezclar.5. Repetir esta operación hasta completar 3 tubos. Rotular los tubos con las diluciones.6. Las diluciones son: Tubo 1: 1/10. Tubo 2: 1/100. Tubo 3: 1/1000.7. Inmediatamente colocar 0.1ml de cada dilución, en tres placas Petri diferentes.8. Verter aproximadamente 15ml de agar nutritivo licuado y enfriado a 45-50°C a cada una de

las placas Petri rotuladas igual que los tubos.9. Mover las placas suavemente seis veces, describiendo círculos en el sentido de las agujas del

reloj. Repetir el mismo número de veces, en el sentido contrario. Mover las placas de atrás hacia adelante seis veces. Estos movimientos se realizan con el fin de dispersar la mezcla.

10. Dejar enfriar en posición horizontal.11. Incubar en posición invertida a 37°C por 24horas.

Método: Transplante o Resiembra

Para el mantenimiento, estudio y preservación de los cultivos puros se necesita realizar resiembras de los cultivos a los medios frescos.La siembra se efectúa utilizando el asa o aguja bacteriológica que permita una desiminación de los gérmenes en el medio de cultivo.

Materiales:

1. Tubos con caldo nutritivo.2. Tubos con agar nutritivo recto.3. Tubos con agar nutritivo en pico de flauta (inclinado).4. Asa y aguja de Kolle.5. Cepas en medios líquidos y sólidos: Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp.

Procedimiento:

1. Con la mano izquierda tomar un tubo con la fuente de inóculo.2. Destapar el tubo con el dedo meñique de la mano derecha y sostener el tapón entre los

dedos.3. Flamear la boca del tubo y el aguja o asa de Kolle.4. Con el aguja o el asa de Kolle, picar la colonia y volver a flamear el tubo para proceder a

colocar su respectivo tapón de algodón.5. Con la mano izquierda tomar el tubo con el medio a sembrar y destaparlo con el dedo

meñique de la mano derecha.6. Flamear el tubo y hacer la siembra del inóculo por: Picadura en agar recto (aguja), Estrías en

agar inclinado, Suspensión en medio líquido.7. Colocar en la estufa para su incubación a 37°C por 24horas.

En todos los cultivos realizados, se puede distinguir:

Características morfológicas de las colonias:

1. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, rizoide, fusiforme, irregular.2. Elevación: Plana, elevada, convexa, pulvinada, ondulado.3. Margen: Entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso, enrollado.4. Superficie: Lisa, rugosa, radiada.5. Consistencia: Dura, blanda, mucosa, hilante.

Características ópticas de las colonias y pigmentación:

1. Opaca: No permite el pasaje de la luz.2. Translúcida: Sólo permite el paso de escasa cantidad a la luz.3. Iridiscente: Con reflejos metálicos cuando se expone a la luz.4. Butirosa: Con aspecto semejante a la grasa.5. Pigmentación: Ninguna. Color específico.

Características de crecimiento en estrías sobre agar inclinado:

1. Cantidad: Escasa, moderada, abundante.2. Margen o borde de crecimiento: uniforme, liso o presentando irregularidades.3. Consistencia de Crecimiento: Butiroso, viscoso, fibroso.4. Pigmentación: Coloración del cultivo verde, amarillo, rojo, azul, etc.

Crecimiento en cultivo por picadura:

1. Crecimiento limitado a la línea de inoculación.2. Crecimiento con propagación fuera de esta línea.3. Crecimiento superficial, en profundidad o ambas a la vez.

Crecimiento en caldo nutritivo:

1. Cantidad: Escasa, moderada, abundante.2. Distribución en caldo: Uniformemente distribuido, crecimiento limitado a la superficie,

desarrollo que se acumula como sedimento (granuloso o viscoso).3. Olor: Pútrido, a frutas aromáticas o imperceptible.

Condiciones Ambientales Idóneas para el Cultivo de Microorganismos en Laboratorio

Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, también es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado.

Temperatura

Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación, se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo humano. Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baños de agua, ambos controlados termostáticamente. Los incubadores, o estufas, son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces. Los medios líquidos, distribuidos en tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo.

pH

El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores. 

Oxígeno La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios

estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno. Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia, representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más difícil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibióticos, es un desafió para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire. La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxígeno y se haya remplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reacción consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece. Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno.

Conservación de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número

enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.

Imágenes:

Resultados:

Discusión de Resultados:

1. Se realizaron 3 técnicas para sembrado de cultivo: en medio líquido (con caldo nutritivo), en medio semi-sólido (medio SIM) y en placa (con estriado simple y en cuadrantes), con 6 diferentes bacterias para después dejar incubar las bacterias.

2. Una vez incubadas las bacterias se observaron sus características macroscópicas o culturales y sus características microscópicas; Los resultados de estas observaciones realizadas se pueden ver en la tabla anterior, en la que se puede observar que cada una de ellas varía de a cuerdo a sus características específicas de crecimiento en los diferentes medios.

Conclusiones:

Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo.

Bibliografía:

1. Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitología Humana: Bases etiológicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-429

2. http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS0506.doc3. http://es.wikipedia.org/wiki/4. http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf