aislamiento y cultivo de microorganismos

7/21/2019 aislamiento y cultivo de microorganismos

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Práctica No 4:Aislamiento y Siembra de Bacterias Aerobias

OBJETIVO

Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y aislamiento de bacterias.

INTROD!!I"N

En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos

complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que

dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que serequiera. Para ello existen tcnicas de siembra! conservación y mantenimiento de los

cultivos microbianos.

"na tcnica esencial en #icrobiología es la de obtención de cultivos puros! a partir de los

cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. "n cultivo

puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es

necesario concurrir a las tcnicas conocidas como aislamiento.

SIE#BRA

Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo! elegido de acuerdo a las

exigencias vitales del microorganismo! lo que permite su desarrollo y multiplicación! si se

incuba en condiciones adecuadas! un tiempo conveniente.

Para ello una peque$a porción de cultivo o muestra! que se denomina in$c%lo se trans%iere

al medio con precauciones especiales de asepsia a %in de evitar la introducción de otrosmicroorganismos ajenos al inóculo.

El conjunto de pasos a e%ectuar para lograr una siembra correcta! se conoce como t&cnicaas&'tica.

&a toma del inóculo es simple! pero se requiere tener en cuenta lo siguiente'

(. &a siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire )cerrar bien

puertas y ventanas*! con movimientos pausados! poco amplios! sin brusquedad y sin+ablar.

,. -oloque %rente a usted el mec+ero y la preparación o muestra que contiene los

microorganismos! así como el resto del material necesario )portaobjetos! tubos!

placas*. odo ello +a de ser alcanzado con %acilidad y sin tropiezos.

/. Se debe trabajar a una distancia no mayor de (0 cm. de la llama de un mec+ero.

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1. El ansa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo )%lamelo +asta que

alcance un rojo incandescente* y antes de retirar el inóculo debe %acilitarse suen%riamiento! a %in de evitar el deterioro del material a sembrar )en%ríelo en la

proximidad de la llama unos (2 segundos*.

0. "na vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa o aguja a la llama del

mec+ero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo. 3unca debe depositarse untapón sobre la mesa o gradilla! pues estos elementos están cargados de

microorganismos.

4. -uando est destapado! mantener el tubo en la %orma más +orizontal posible paraevitar que los microorganismos del ambiente! en su caída! tengan acceso al interior.

5. &as bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde serán

trans%eridos! deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de queel ansa o aguja sea introducida. ambin se debe %lamear la boca del tubo antes de

taparlo. Este procedimiento %ija al vidrio los microorganismos que pueden estar en

dic+a boca y tiende a crear corrientes +acia a%uera )el aire tiende a salir*!

disminuyendo así el riesgo de contaminación.6. Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri! coloque la

placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio

de cultivo con los microorganismos. &lvela a la proximidad de la llama delmec+ero y tome el inóculo con el ansa de siembra. 7tro mtodo permitido consiste

en retirar el inóculo a sembrar! levantando la tapa solo lo su%iciente para permitir la

introducción del ansa o aguja! para evitar que los microorganismos ambientales sedepositen en la super%icie del medio.

8. Si la siembra se realiza con pipeta! sta debe estar convenientemente preparada y

esterilizada +asta el momento de su empleo. "na vez utilizada se descartaintroducindola en una solución antisptica.

(2. rans%iera el inóculo a otro medio de cultivo estril! tomando las mismas

precauciones en su manejo )%lameando bocas de tubos! trabajando en la proximidad

de la llama! etc.*.

&a %inalidad de una siembra puede ser la de realizar una trans%erencia o un aislamiento. &a

primera se e%ect9a con cultivos puros )una sola especie bacteriana*! ya sea con el objeto derenovar el medio de cultivo para perpetuar la especie! o bien para conocer alguna de sus

propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento! en cambio! se realiza a partir de un

material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas paraobtener cultivos puros.

TO#A DE( IN"!(O

• Si la muestra proviene de un medio líquido! el inóculo se toma agitando el

suavemente el ansa dentro del mismo! quedando la muestra ad+erida por tensión

super%icial en el extremo del %ilamento del ansa de siembra.

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• Si el medio es sólido y se encuentra en super%icie la muestra a sembrar )caja de

Petri*! tome una peque$a porción de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de

siembra. Si la muestra se encuentra en la pro%undidad del agar )tubo con agar en pico de %lauta*! +unda el %ilamento dentro del medio +asta tomar una peque$a

porción de la misma. :lamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el

soporte necesario.

TRANS)EREN!IA

&a tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo derecipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos'

a* Siembra de medio líquido a medio líquido' El procedimiento se puede realizar conansa en anillo! aguja o pipeta y en tubos de ensayo! matraces o %rascos.

b* Siembra de medio sólido a medio líquido' El procedimiento se puede realizar con

ansa en anillo o aguja y en tubo de ensayo! matraces o %rascos.

c* Siembra de medio sólido a medio sólido' El procedimiento se puede realizar con

ansa o aguja y en tubo de ensayo! ya sea en super%icie o en pro%undidad o en caja dePetri! en super%icie.

d* Siembra de medio líquido a medio sólido' El procedimiento se puede realizar conansa en anillo! aguja o pipeta y en tubo de ensayo! ya sea en super%icie o en

pro%undidad o en caja de Petri! ya sea en super%icie o por +omogenización.

T&cnica de trans+erencia en t%bos de ensayo,

T&cnica 'ara medio l-.%ido

&os dos tubos! el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los

microorganismos a trans%erir! se toman con una mano! con las bocas colocadas a la

misma altura.

Se sostienen con los dedos índice! medio y anular apoyándolos en el dedo me$ique! y se

los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualización de todala super%icie del cultivo.

-on el dedo pulgar e índice )como un lápiz* de la otra mano! se toma la pipeta estril oel mango de ;oll con su aguja o ansa en anillo y se esteriliza.

Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el ansa! de la siguiente

manera' el tapón del tubo más alejado del operador )que es el que contiene la muestra*entre el dedo me$ique y la palma de la mano< el tapón del tubo más cercano al operador

)que contiene el medio de cultivo estril* entre el me$ique y el anular.

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Se %lamean las bocas de los tubos! se toma el inóculo< se siembra< se %lamean

nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de lostapones y se quema el ansa.

-omo el inóculo procede de un medio líquido! antes de realizar la trans%erencia se debe

agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza en medio líquido! se agita el tubo sembrado para

distribuir +omogneamente el inóculo.

Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos

índice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo índice de la

otra mano con una amplitud de 0 cm. 7tra %orma consiste en +acer rotar los tubos entrelas palmas de las manos.

T&cnicas 'ara medio s$lido,

-uando el medio de cultivo a sembrar es sólido! se puede sembrar en super%icie! en pro%undidad o en pro%undidad y super%icie.

a* En super%icie'

• Por estr-a: =ntroducir el asa o aguja en el tubo de agar inclinado +asta el %ondo

diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte! luegomover el ansa suavemente sobre la super%icie del agar con un movimiento en zig>

zag ascendiendo desde el %ondo +asta la parte superior del medio.

• Por tra/o: =ntroducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar

una línea de siembra desde la base del pico de %lauta +asta el extremo superior! sinejercer presión para que no se rompa el medio.

b* En pro%undidad'

• Por '%nci$n: El medio de cultivo que se emplea está solidi%icado en tubo en %orma

vertical y la siembra se realiza con aguja! la que se introduce con el inóculorápidamente en el seno del medio y se retira de la misma %orma. &a punción se

realiza en el centro del medio o excntricamente.

c* En pro%undidad y super%icie'

• Por '%nci$n y estr-a: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con

muc+o %ondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado! se punza el %ondo!se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de %lauta.

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T&cnica de trans+erencia en ca0a de Petri,

&a siembra en caja de Petri! puede +acerse'

(. En super%icie.

• Por estr-a central: Se levanta la tapa lo su%iciente como para permitir la

introducción del ansa con la carga de microorganismos! iniciándose la estría en el

borde del medio más alejado del operador y se la extiende +asta llegar al centro de

la placa! luego se gira sta (62 ? y se contin9a realizando otra estría de la mismamanera. Esta división evita el obstáculo del borde de la placa

• Por estr-a en c%adrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y se siembra en

estría cada uno de ellos! partiendo del borde de la caja +acia el centro. El cuadrante

a sembrar debe ser el más alejado del operador y el inóculo en cada caso puede ser el mismo )la misma especie* o distinto )di%erente especie* para cada cuadrante.

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• Por diseminaci$n con es'át%la de Dri1als2y: Se deposita sobre el medio sólido

contenido en la placa! una asada o una gota con pipeta del material a sembrar! que

luego se extenderá por toda la super%icie del medio con una espátula de@=BA&S;C. &a espátula se introduce inmediatamente despus de su uso en un

recipiente para su esterilización en autoclave o en %ormalde+ído al 0 D.

,. Por +omogeneización'

• T&cnica de la siembra en t%bo 'ara 3olcar en 'laca: El inóculo se introduce con

el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo %undido y en%riado a 10 ?- encantidad su%iciente para cubrir la placa de Petri. Se +omogeneiza por rotación y se

vuelca en la placa previo %lameado de la boca del tubo.

• T&cnica del a1ar 3olcado: Se deposita el inóculo con pipeta en el centro de la caja

de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo %undido y en%riado a

10?-. Se +omogeneiza por rotación para lo cual se le imprime a la caja movimientoscirculares! en sentido +orario y en sentido anti+orario y movimientos rectilíneos!+orizontales y verticales.

Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con medio de cultivo

para sembrar! debe eliminarse el agua de sinresis )condensación* antes de e%ectuar dic+a operación. Para tal %in es aconsejable preparar las placas con ,1 +s. de

anticipación y dejarlas invertidas a temperatura ambiente.

EIPOS

•

-ampana de :lujo &aminar

#ATERIA(ES

• -ajas Petri con agar #c-oney

• -ajas Petri con agar nutritivo.

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NOTA: ANTES 7 DESPES DE TO#AR (A #ESTRA PROB(E#A ESNE!ESARIO ESTERI(I8AR POR #EDIO DE( #E!9ERO E( EIPOTI(I8ADO 7A SEA E( ASA DE SIE#BRA O (A A;JA DE SIE#BRA,

PRE;NTAS(. @escriba las %ormas de reproducción bacteriana.

,. FGu di%erencias existe entre una siembra por di%usión y por diseminaciónH/. F-uál es el objetivo de la siembra de microorganismosH 1. FGu mtodos utilizaría para cultivar y aislar microorganismos anaerobiosH

RES(TADOS 7 !ON!(SIONES,

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