Příprava, charakterizace a porovnání nanočástic připravených

tepelným rozkladem v pevné fázi a nanočástic vzniklých

biomineralizací (bakteriální magnetické nanočástice)

Obecný úvod

Nanočástice oxidů železa

Magnetické nanočástice oxidů železa jsou jednou z nejvíce dnes zkoumaných oblastí

nanosvěta. To je dáno jejich specifickými vlastnostmi (velikost a distribuce částic, tvar resp.

krystalografie, či jejich magnetické vlastnosti), které je možné řídit způsobem jejich přípravy.

Magnetické nanočástice pak nacházejí uplatnění v řadě aplikací: magnetická rezonanční zobrazení

(MRI), kontrastní látky, v protinádorové terapii využívající principu hypertermie, značení buněk. Pokud

jsou nanočástice vhodně povrchově upraveny, pak mohou být též použity pro imobilizaci (vyvázání)

léků, proteinů, enzymů, nukleových kyselin a dalších aktivních látek pro jejich purifikaci či transport do

oblastí jejich účinku. Možnost uplatnění různých oxidů železa je především dáno jejich velikostí částic

a magnetickými vlastnostmi, které patří mezi stěžejní charakteristiky nanočástic.

Oxidy železa se vyskytují v několika formách, které se liší svými vlastnostmi. Nejznámějším z

nich je hematit (alfa-Fe2O3). Jedná se o slabě feromagnetickou látku při pokojové teplotě, což

znamená, že jeho výsledné magnetické pole je velmi slabé. Díky svým katalytickým vlastnostem je

však využíván při fotochemických reakcích. Magnetit (Fe3O4) a maghemit (gama-Fe2O3) pak patří

mezi oxidy se silným magnetickým polem a díky jejich biokompatibilitě nacházejí uplatnění v

medicínských i průmyslových aplikacích. Vzácnými formami oxidu železitého jsou pak beta- a epsilon-

Fe2O3, které se v přírodní formě prakticky nevyskytují. Nanočástice oxidů železa se běžně připravují

pomocí chemických metod, avšak stále vyšší zájem se obrací i k využití magnetických nanočástic

vzniklých v přírodě procesem biomineralizace (příkladem může být vznik biogenního magnetitu

magnetotaktickými bakteriemi).

Obr. 1 Ukázky magnetických nanočástic připravených (zleva) reakcí v pevné fázi (laboratorní cesta) a

izolací z magnetozomů produkovaných magnetotaktickými bakteriemi.

Příprava nanočástic oxidů železa metodou tepelného rozkladu v pevné fázi

Příprava nanočástic oxidů železa touto metodou spočívá v rozkladu pevnolátkového prekurzoru

působením tepla. Kombinací vhodné teploty, času a prekurzoru, můžeme ovlivnit vlastnosti

výsledných nanočástic. Výhodou této metody je především snadná příprava a to i většího množství

částic, z toho vyplývá i jejich poměrně nízká cena. Jednou z vlastností takto připravených částic je

schopnost ponechat si morfologii původního materiálu. Cílem této úlohy je připravit magnetické

nanočástice tepelným rozkladem octanu železitého. Rozkladem tohoto prekurzoru vzniknou

magnetické částice γ-Fe2O3 (maghemitu) s malou příměsí α-Fe2O3 (hematitu).

Příprava nanočástic oxidů železa izolací z magnetozomů produkovaných magnetotaktickými

bakteriemi Magnetospirillum gryphiswaldense

Magnetotaktické bakterie (MTB) patří mezi zvláštní skupinu bakterií, které se mohou orientovat podle

magnetického pole země za účelem určení jejího nejpřirozenějšího prostředí. Do této skupiny bakterií

patří i Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1, která patří mezi dobře laboratorně kultivovatelný

druh. Tyto bakterie jsou schopny produkovat ferimagnetické nanočástice magnetitu (tvaru

kubooctahedral) s průměrnou velikostí cca 40 nm, tedy magnetické nanočástice o velikosti chemickou

cestou „ve zkumavce“ obtížně připravitelné. Tyto nanočástice jsou však v buňce obaleny

fosfolipidovou membránou, která tak vytváří speciální kompartmenty - magnetozomy, které jsou

v buňce uspořádané do řetízků a fungují tak jako malé střelky kompasů, čímž umožňují buňce vnímat

vnější magnetické pole a využít jej tak k vlastní orientaci. Magnetozomální membrána však

neobsahuje pouze lipidy, ale i proteiny. Také endotoxin lipopolysacharidu může být asociovaný s touto

membránou. Tyto složky pak mohou být příčinou zvýšení toxicity bakteriálního magnetitu, a pro

porovnání se syntetickými nanočásticemi bude v následující úloze povrch magnetitu upraven, a to

odstraněním membrány.

Obr. 2 Snímek pořízený Transmisní elektronovou mikroskopií: Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 obsahující řetízek magnetozomů

Metody charakterizace připravených nanočástic oxidů železa

SDS-PAGE elektroforéza

SDS-PAGE elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného, je technika

používaná v biochemii, genetice, imunologii, mikrobiologii a molekulární biologii k separaci a

identifikaci proteinů na základě jejich elektroforetické pohyblivosti. Zde bude tato metoda využita

k identifikaci rozpuštění magnetozomální membrány a to stanovením zbytkových proteinů, které jsou

v membráně integrovány či s magnetozomální membránou asociovány. Budou tak porovnány vzorky

magnetozomů (tedy s membránou) a biogenního magnetitu, u nějž byla membrána odstraněna.

Obr. 3 SDS-PAGE elektroforéza - porovnání. Line1 - proteiny magnetozomální membrány, Line2 -

proteiny po rozpuštění membrány SDS nebyly detekovány, Line3 - nedokonalé odstranění membrány

- byly detekovány proteiny, avšak v nižší koncentraci, Line4 - standart proteinů s jejich definovanou

molekulovou hmotností

Mössbauerova spektroskopie

57Fe Mössbauerova spektroskopie je prvkově selektivní metoda pro strukturní a magnetickou

charakterizaci železo obsahujících materiálů v pevné fázi. Její význam se projevuje zejména v případě

nanomateriálů, neboť výsledky nejsou příliš ovlivněny krystalinitou vzorku, ani velikostí částic. Velmi

snadno je například možné odlišit maghemit a magnetit, které jsou strukturně izomorfní a zejména

v případě velmi malých nanočástic je velmi obtížné je užitím rentgenové práškové difrakce odlišit.

Kromě identifikace železo obsahujících fází Mössbauerova spektroskopie poskytuje kvantifikaci

zastoupení jednotlivých fází (s detekční mezí asi 3 %). Relativní plochy subspekter vyjádřené

v procentech odrážejí relativní počty atomů železa v jednotlivých identifikovaných fází (tedy nemusí

vyjadřovat hmotnostní zastoupení – nutno přepočítat!)

Na obr. 4 jsou zobrazena Mössbauerova spektra a) nanočástic magnetitu připraveného reakcí v pevné

fázi, b) magnetozomů měřená při pokojové teplotě. Zatímco magnetit připravený reakcí v pevné fázi je

prakticky stechiometrický (poměr ploch subspekter je přibližně 1:2), biogenní magnetit (magnetozomy)

vykazuje značnou nestechiometrii jako důsledek částečné povrchové oxidace během samotného

izolačního procesu magnetozomů z bakterií. Tato nestechiometrie se ve spektru projevuje ve změně

poměru ploch subspekter (asi 1:1)

Obr. 4 a) Mössbauerova spektra a) nanočástic magnetitu připraveného reakcí v pevné fázi, b)

magnetozomů.

Zadání úlohy:

Úloha A

Příprava nanočástic oxidů železa reakcí v pevné fázi, strukturní a magnetická charakterizace

nanočástic užitím Mössbauerovy spektroskopie

- dle postupu připravte nanočástice oxidu železa

- stanovte fázové složení připraveného materiálu užitím Mössbauerovy spektroskopie

Úloha B

Příprava nanočástic oxidů železa izolací z magnetosomů produkovaných magnetotaktickými

bakteriemi Magnetospirillum gryphiswaldense, ověření odstranění membrány pomocí SDS-PAGE

elektroforézy, charakterizace nanočástic užitím Mössbauerovy spektroskopie

- dle postupu připravte nanočástice oxidu železa: odstraňte magnetozomální membránu a stanovte

zbytkový obsah proteinů absorbovaného na povrchu nanočástic po jejím odstranění, a to metodou

SDS-PAGE

- stanovte fázové složení připraveného materiálu užitím Mössbauerovy spektroskopie

Úloha A

Příprava nanočástic oxidů železa metodou reakce v pevné fázi

Postup:

- Octan železnatý předsušíme v elektrické laboratorní sušárně při teplotě 80 °C po dobu jedné hodiny.

Předsušením získáme materiál zbavený adsorbované vody. Takto připravený prekurzor ještě lehce

podrtíme ve skleněné třecí misce.

- Navážíme 1g této látky a v co možná nejtenčí a nejsouvislejší vrstvě volně rozsypeme na velkou

plochou keramickou misku.

- Misku se vzorkem vložíme do laboratorní pícky vyhřáté na teplotu 400 °C a ponecháme v ní jednu

hodinu. Je nutné, aby teplota v peci co nejméně kolísala kolem nastavené hodnoty a působila na

vzorek v misce rovnoměrně. Proto je laboratorní pec vybavena kvalitním programovatelným

regulátorem a přesnými čidly teploty.

- Po uplynutí doby jedné hodiny vyjmeme misku se vzorkem z pece a necháme vychladnout.

- Vzniklý prášek obsahující nanočástice sesypeme na achátovou třecí misku a lehkým protřením

dokonale homogenizujeme.

- S takto připravenými částicemi můžeme dále pracovat a podrobit je komplexní charakterizaci.

Charakterizace připravených nanočástic užitím Mössbauerovou spektroskopie

Postup:

15-20 mg vzorku zabalíme do vážicího papírku a následně do parafilmu. Dbáme na rovnoměrné

rozvrstvení zabaleného vzorku. Zabalený vzorek vložíme do plastové měřicí cely a do Mössbauerova

spektrometru pro měření při pokojové teplotě. Necháme načítat experimentální body spektra alespoň

24 hodin. Vyhodnotíme naměřené spektrum užitím vhodného software (např. Mosswinn, Confit). Na

základě hodnot hyperjemných parametrů a relativních ploch subspekter provedeme identifikaci a

kvantifikaci oxidů železa.

Dle možností necháme vzorek charakterizovat pomocí rentgenové práškové difrakce, transmisní a

skenovací elektronové mikroskopie, případně změříme specifickou plochu povrchu užitím fyzisorpce

BET.

Úloha B

Příprava nanočástic oxidů železa izolací z magnetosomů produkovaných magnetotaktickými

bakteriemi Magnetospirillum gryphiswaldense

Postup:

Příprava magnetitu izolací z magnetozomů: odstranění membrány

- Magnetozomální membránu odstraníme povařením magnetozomů v 1% roztoku SDS.

- 5 ml magnetozomů o koncentraci 1 mg magnetitu/mL zakoncentrujeme pomocí magnetu.

- Supernatant odpipetujeme a magnetozomy resuspendujeme v 5 mL 1% SDS a reakční směs ve

skleněné vialce umístíme do vodní lázně vytemperované na 100°C a necháme 30 min povařit.

- Poté suspenzi necháme zchladnout a za pomocí magnetické separace magnetit 5 x promyjeme

stejným objemem destilované vody. Promývání provádíme vždy 10-ti minutovou sonikací v lázni a

následnou magnetickou separací a odstraněním supernatantu.

- Pro určení, zda membrána magnetozomů byla odstraněna, bude stanoveno zbytkové zastoupení

proteinů na nanočásticích magnetitu a porovnáno s proteiny magnetozomální membrány bez

působení SDS.Toto stanovení provedeme metodou diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém

gelu (SDS-PAGE)

Příprava vzorku pro SDS - elektroforézu

- Ke vzorku (100 µl, pro nanesení by mělo být ve vzorku asi 100 µg magnetitu) se přidá 100 µl

Sampling buffer (Sample buffer, Laemmli 2x concentrate, Sigma) a povaří se 10 min. 20 µl suspense

bez magnetické části (ta se stáhne magnetem) se nanese do důlku na gel pomocí pipety.

- Pro elektroforézu použijte 2-5 µl standardu (LS- low standard).

SDS-PAGE elektroforéza

- Připravíme si sklíčka - odmastí se ethanolem, složí se do aparatury dle pokynů vedoucího praktika.

- Podle tabulky si připravíme dělící gel (running gel): do kádinky - za stálého míchání se napipetují

jednotlivé komponenty dle tabulky uvedené níže.

Tabulka: dělící gel

Gel AA/Bis [30%/0,8%]

TRIS.HCl [1,5 M, pH 8,8]

H2O 10% SDS 10% APS TEMED

12% 4 ml 2,5 ml 3,2 ml 0,1 ml 0,05 ml 0,01 ml

- Po přídavku APS a TEMEDu začne gel tuhnout, proto jej rychle napipetujeme mezi skla (asi 1,2 cm

pod okraj) a převrstvíme jej n-butanolem.

- Gel necháme 20-30 min ztuhnout.

- Po uplynutí doby pro polymeraci gelu odstraníme z povrchu n-butanol a povrch gelu opláchneme

destilovanou vodou

- Podle tabulky si připravíme zaostřovací gel (stacking gel) - obdobně jako dělící gel.

Tabulka: zaostřovancí gel

Gel AA/Bis [30%/0,8%]

TRIS.HCl [0,5 M, pH 6,8]

H2O 10% SDS 10% APS TEMED

4% 0,65 ml 1,25 ml 2,95 ml 0,1 ml 0,06 ml 0,01 ml

- Roztok po přidaní APS a TEMEDu rychle promícháme a přeneseme na dělící gel zarovno s menším

sklem tak aby nikde nevznikly bublinky a pomalu vložíme hřeben (vkládáme jej zešikma) a rovně jej

usadíme na sklo.

- Gel necháme opět 30 min ztuhnout.

- Po ztuhnutí vyjmeme skla a vložíme jej do aparaturky a tu následně do elektroforetické vany.

- Dno (do asi 3 cm) a prostor mezi skly (až po jejich okraj) zalijeme SDS - running pufrem.

- Opatrně vyjmeme hřebeny a odstraníme bublinky.

- Naneseme vzorky.

- Elektroforetickou vanu přikryjeme víčkem a připojíme ke zdroji elektrického napětí , který zapneme a

nastavíme na 100 V pro zaostření (asi 10 min) a na 130 V pro dělení (asi 50 min).

- Ihned po vyjetí barvičky z gelu aparaturu odpojíme od zdroje el. napětí, rozebereme ji a gely

vyjmeme z meziskel (za pomocí špachtličky a vody).

- Gely ponoříme do nádobky obsahující asi 15 ml barvícího roztoku (přes noc)

- Poté gely odbarvíme v odbarvovacím roztoku dokud nevystoupí píky a gel se úplně neodbarví

- gely je možné určitou dobu uchovat v 5% kys. octové

Chemikálie pro SDS-PAGE

AA/Bis [30%/0,8%]

TRIS.HCl [1,5 M, pH 8,8]

10% SDS

10% APS (10% roztok persíranu amonného)

TEMED

TRIS.HCl [0,5 M, pH 6,8]

n-butanol

SDS-running pufr - 3,03 g TRIS.HCl , 14,4 g Glycine, 1 g SDS rozpustit v 1 L destilované vody

Barvící roztok - 0,1% CBB R-250 v roztoku 15% kys. octové a 45% methanolu

Odbarvovací roztok - 40% methanol, 10% kys. octová

5% kys. octové