Prednosti i ograničenja neinvazivnog prenatalnog ... · rezultat analize bio informativan (16. gestacijski tjedan) dob 25 g. dob 40. g. osjetljivost (%) specifičnost (%) PPV (%)

I zv.prof.dr.sc . Jasenka Wagner Kostadinović , spec.med.b iokemije i lab.medic ine

Laborator i j za medic insku genet iku, Katedra za medic insku b io logi ju i genet iku, Medic insk i fakul tet Os i jek

Prednosti i ograničenja neinvazivnog prenatalnog testiranja (NIPT)

HKMB tečaj: Planiranje i nadzor trudnoće - multidisciplinarni pristup, 17.11.2018.

UVODkod oko 4% novorođenčadi nalazimo bolesti koje u potpunosti ili djelomično imaju gensku etiologiju

“genske” bolesti:

a) kromosomski poremećaji

b) monogenske bolesti

c) poligenske/multifaktorijalne bolesti

prenatalna dijagnostika

genetičko informiranje


INVAZIVNE TEHNIKE PRENATALNE DIJAGNOSTIKE

najčešće korištene metode →

amniocenteza, biopsija korionskih resica i kordocenetza

Prednost:

◦ uzorak sadrži fetalni materijal pogodan za citogenetičku, molekularno-genetičku ili biokemijsku analizu

Nedostaci:

◦ invazivnost

◦ dugotrajnost (u slučaju kariotipizacije)


INVAZIVNE TEHNIKE PRENATALNE DIJAGNOSTIKE

Indikacije:

◦ starost trudnice >36 g.

◦ opterećena osobna ili obiteljska anamneza

◦ abnormalan ultrazvučni nalaz

◦ povišen rizik nakon biokemijskog probira

◦ psihološki razlozi

◦ ostalo

Komplikacije:

◦ spontani pobačaj

◦ prijevremeni porod

◦ krvarenja majke i ploda

◦ kontrakcije maternice

◦ oštećenje posteljice

◦ ozljeda ploda

◦ otjecanje plodove vode

◦ infekcije

◦ Rh imunizacija


NEINVAZIVNE TEHNIKE PRENATALNE DIJAGNOSTIKE

ultrazvuk u dijagnostičkoj praksi od 1961.g.

od 90-ih g. 20.st. neinvazivni screening testovi - testovi probira

princip: ◦ stadij trudnoće◦ dob trudnice◦ koncentracije biokemijskih biljega u serumu trudnice (biljezi funkcije

fetoplacentne jedinice):AFP, nE3, slobodna βHCG, Inhibin A, PAPP-A

◦ UZV biljeg – nuhalni nabor (NN)

izračun rizika za fetalnu aneuplodiju i oštećenje neuralne cijevi


NEINVAZIVNE TEHNIKE PRENATALNE DIJAGNOSTIKE

Testovi probira

◦ Prednosti:◦ neinvazivnost◦ dostupnost široj populaciji

◦ Nedostaci:◦ zbog nepotpune osjetljivosti i specifičnosti to su testovi probira, a ne

dijagnostički testovi◦ stopa lažno pozitivnih rezultata kod ovih testova iznosi 1.9-5.2%, a lažno

negativnih 19-23%


STOPA DETEKCIJE SINDROMA DOWN(uz stopu lažno pozitivnih rezultata od 5%)


Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Committee Opinion No. 640. American College ofObstetricians and Gynecologists. Obstet Gynecol 2015;126:e31–37.

Hrvatsko društvo za perinatalnu medicinu Hrvatskog liječničkog zbora. Nacionalna stručna preporuka za prenatalni probir i dijagnostiku kromosomopatija. GynaecolPerinatol 2010;19:119-26.

Neinvazivni testovi probira preporučuju se u nisko rizičnih trudnoća, odnosno trudnica mlađih od 36 godina koje imaju negativnu osobnu ili obiteljsku anamnezu.

Invazivna prenatalna dijagnostika preporučuje se trudnicama s navršenih 36 godina života i starijim zbog dokazanog povećanog rizika za sindrom Down, ali i za druge sindrome uzrokovane promjenama kromosoma, posebno trisomijama.

Osim zbog poodmakle dobi trudnice, invazivna prenatalna dijagnostika medicinski je opravdana i preporučuje se u:

◦ pozitivne ili opterećene obiteljske i/ili reproduktivne anamneze

◦ pozitivnih ultrazvučnih biljega kromosomopatija

◦ pozitivnog nalaza testova probira prvog ili drugog tromjesečja


PRENATALNA DIJAGNOSTIKA


• biopsija korionskih resica

• amniocenteza

• kordocentezaInvazivna

• biokemijski i ultrazvučni biljezi

• fetalne stanice

• slobodna fetalna DNANeinvazivna

Fetalne stanice

1893.g. njem. patolog Georg Schmorl → dokaz fetalnog mikrokimerizma◦ Bianchi DW. Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis. Br J Haematol 1999;105:574–83.

1979. g. Herzenberg pronašao stanice s kromosomom Y u perifernoj krvi trudnica koje su nosile muški plod

◦ Herzenberg LA, Bianchi DW, Schroder J, Cann HM, Iverson GM. Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichmentby fluorescence-activated cell sorting. Proc Natl Acad Sci USA 1979;76:1453-5.

1990. g. Diana Bianchi dokazala „muške“ stanice kod žena koje su rodile sinove prije više desetljeća

◦ Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 yearspostpartum. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:705–8.

fetalne stanice normalno fiziološki migriraju i u druga tkiva majke, ali su prisutne u iznimno malim količinama: oko 2-12 fetalnih st./ 1 ml majčine krvi (1 fetalna st. / 1 milijun majčinih st.)


Fetalne stanice

prednost:

dobar izvor genetičkog materijala fetusa (nema smetnji od strane majčine DNA)

nedostatak:

teško “uhvatljive”, zaostaju u organizmu majke godinama nakon poroda

Analiza fetalnih stanica do danas nije zaživjela u kliničkoj praksi!


Slobodna fetalna DNAeng. cell free fetal DNA (cffDNA)

alternativni izvor fetalnog genetičkog materijala za

(neinvazivnu) prenatalnu dijagnostiku od 1997.g.

→ Dennis Lo i sur. metodom nested PCR identificirali Y kromosom (DYS14

marker) u plazmi i serumu trudnica → muški spol ploda

progresivan rast tijekom trudnoće, udio fetalne frakcije nakon 10. gestacijskog

tjedna 3-13%


Slobodna fetalna DNAeng. cell free fetal DNA (cffDNA)

brza eliminacija nakon poroda (t½=16.3 minute) → specifičnost

porijeklom iz trofoblasta (placente)

u odnosu na majčinu slobodnu DNA kraća, degradiranija i hipometiliranija

detektabilna od 4. gestacijskog tjedna

lako dostupna, ali praktički neodvojiva od majčine slobodne DNA

dokazana i u plodovoj vodi, urinu, likvoru i peritonejskoj tekućini


Rani razvoj embrija

Citotrofoblasti:

analiziraju se putem kratkotrajne CVS kulture (STC-villi), NIPT analiza je analiza DNA iz citotrofoblasta

Mezenhimalna stroma:

analizira se putem dugotrajne CVS kulture (LTC-villi), porijeklom je iz ekstraembrijskogmezoderma (EEM), fetus i ekstraembrijskimezoderm (EEM) su porijeklom iz unutrašnje stanične mase (ICM) blastociste


Published in: Diane Van Opstal; Malgorzata I Srebniak; Expert Review of Molecular Diagnostics 2016, 16, 513-520.

Primjena slobodne fetalne DNA u neinvazivnoj prenatalnoj dijagnostici / prenatalnom probiru (Wagner J. Biochemia Medica 2012;22:24-38)

NEINVAZIVNO ODREĐIVANJE SPOLA PLODA (NIPD)

PCR u stvarnom vremenu, osjetljivost 87-100%, specifičnost 98-100%, pouzdano od 5. gest. tjedna

indikacije: sumnja na X vezanu bolest, potvrda genetičkog spola, sumnja na kongenitalnu adrenalnu

hiperplaziju

NEINVAZIVNO UTVRĐIVANJE RHD STATUSA PLODA (NIPD)

kod RhD negativnih trudnica ispituje se prisutnost RhD gena (1p34-p36), pouzdana od 6. gestacijskog tjedna

PCR u stvarnom vremenu, osjetljivost 98-100%, specifičnost 95-100%

kod RhD negativne trudnice koja ima povećan rizik za razvoj hemolitičke bolesti novorođenčeta zbog prijašnje

trudnoće ili povišenog titra protutijela;

kod svih RhD negativnih trudnica tijekom trećeg tromjesečja trudnoće u svrhu prevencije majčinog

imunološkog odgovora prema moguće RhD pozitivnom plodu


Primjena slobodne fetalne DNA u neinvazivnoj prenatalnoj dijagnostici / prenatalnom probiru (Wagner J. Biochemia Medica 2012;22:24-38)

NEINVAZIVNA PRENATALNA DIJAGNOSTIKA MONOGENSKIH BOLESTI

de novo mutacije ili paternalno naslijeđene (ß-talasemija major, miotonična distrofija, ahondroplazija, Huntingtonova bolest i cistična fibroza)

POTENCIJALNI BILJEG PATOLOGIJE TRUDNOĆE

preuranjenog poroda, fetalne aneuplodije, idiopatskog polihidramnija, zastoja u rastu ploda, preeklampsije, feto-maternalnog krvarenja

NEINVAZIVNO UTVRĐIVANJE BROJA KROMOSOMA KOD PLODA –

visoko diskriminirajuće kvantitativne metode za analizu broja kromosoma istovremenom analizom majčine i fetalne DNA


MPS - masivno paralelno sekvencioniranje+ bioinformatika


Norwitz ER, Levy B. Noninvasive Prenatal Testing: The Future Is Now. Rev Obstet Gynecol. 2013;6(2):48-62.

NIPT tehnike (2011)1. masivno paralelno sekvencioniranje čitavog genoma

◦ 10-20 milijuna očitanja; temelji se na sekvencioniranju i brojanju velikog broja pojedinačnih DNA fragmenata iz plazme koji se, temeljem usporedbe s referentnim genomom, pridružuju kromosomu s kojeg potječu

◦ potencijal za utvrđivanje aneuploidija svih kromosoma

2. ciljano sekvencioniranje kromosoma od interesa◦ manji broj očitanja, jeftinije i brže do rezultata

◦ daje manju količinu informacija o genomu

3. SNP sekvencioniranje lokusa na kromosomima od interesa◦ uzima u obzir relativni kvantitativni doprinos majčinog i očevog genoma u plazmi

◦ ne zahtijeva referentnu vrijednost

◦ u jednoj reakciji umnaža se 20000 SNP sekvenci

◦ ima potencijal za utvrđivanje triploidije


Karakteristike NIPT za aneuploidije kod pacijentica kojih je rezultat analize bio informativan (16. gestacijski tjedan)

dob 25 g. dob 40. g.

osjetljivost (%) specifičnost (%) PPV (%) PPV (%)

trisomija 13 91.7 99.8 33 87

trisomija 18 97.4 99.8 13 68

trisomija 21 99.3 99.9 9 57

spolni kromosomi 91.0 99.6 20-40


Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Committee Opinion No. 640. American College of Obstetricians andGynecologists. Obstet Gynecol 2015;126:e31–37.

Biološki čimbenici koji utječu na fetalnu frakciju slobodne DNA


E.S. Taglauer et al. / Placenta 35, Supplement A, Trophoblast Research, Vol. 28 (2014) S64eS68

Neinvazivno DNA testiranje na najčešće autosomalne aneuploidijePrednosti

◦ neinvazivnost

◦ može se provoditi tijekom cijele trudnoće

Ograničenja

◦ usmjerenost na najčešće trisomije

◦ ne detektira druge kromosomske abnormalnosti, samo aneuploidije čitavih kromosoma

◦ relativno velik udio neuspjelih analiza (2.6%-5.4%)

◦ neuspješan u slučaju niske koncentracije slobodne fetalne DNA (5% donja granica)

◦ nije validiran za višeplodne trudnoće

◦ svaki pozitivni rezultat NIPT testa mora se potvrditi referentnom metodom -postotak lažno pozitivnih (0.25 - 1%) i lažno

negativnih rezultata (manje od 1%)

Posljedice

NIPT je smanjilo broj invazivnih zahvata, no nije poboljšalo stopu detekcije kromosomopatija te je smanjilo postotak

otkrivenih drugih kromosomskih abnormalnosti koje bi standardna kariotipizacija detektirala


Biološki razlozi neslaganja fetalnog kariotipa i NIPT rezultata (0.1%)

◦ ograničeni placentarni mozaicizam

◦ uniparentalna disomija

◦ abnormalan kariotip majke (abnormalnosti spolnih kromosoma, mozaicizam)

◦ maligno oboljenje trudnice

◦ gubitak jednog od blizanaca


Utjecaj ograničenog placentarnog mozaicizma (CPM) na neslaganje rezultata NIPT analize i fetalnog kariotipa – primjeri lažno pozitivnih

rezultata (E. Taglauer et al. Placenta 35, Vol.28, (2014) S64-S68)

NIPT rezultat Fetalni kariotip CVS Reference

Aneuploidije autosoma

Trisomija 13 46,XX (amniocenteza) CPM: 46,XX,+13,der (13;13) (q10;q10)[5] direktna kultura

Mennutiet al. Am J Obstet Gynecol2013

Trisomija 13 46,XY (fetalno tkivo) CPM: 47,XY,+13 direktna kultura

Mennutiet al. Am J Obstet Gynecol2013

Trisomija 13 46,XY (amniocenteza i krv iz pupkovine)

CPM:47,XY,+13[10]/46,XY [12

Hall et al. Genet Med 2013

Trisomy 21 46,XX,upd(21)mat CPM: Trisomija 21 Pan et al. Prenat Diagn 2013

Trisomija 22 Normalan nalaz sekvencioniranjemuzorka krvi iz pupkovine

CPM: Trisomija 22 Choi et al. Prenat Diagn 2013

Aneuploidije spolnih kromosoma

47,XXY 46,XY (amniocenteza) CPM: 49,XXX,+7,+21 [24]/46,XY [6]

Lau et al. Prenat Diagn 2013


Primjeri lažno negativnih slučajevaNIPT rezultat Fetalni kariotip CVS /Placenta Reference

T21 T18 T21 and T18 mozaicizam Mao et al. Clin Chim Acta. 2014 Jun 10;433:190-3.

Lažno negativan T21 Euploidne stanice u placenti Prenat Diagn 2013;33:1207-10

46,XY Fetalna krv:47,XY,+18

Direktna kultura 46,XYIndirektna kultura: 47,XY,+18FISH biopsija 10 uzoraka mezenhimalnihstanicas: 47,XY,+18 u 80% stanicaFISH biopsija 10 uzoraka stanica citotrofoblasta: mali postotak 47,XY,+18 (7 uzoraka), visok postotak T18 u 3 uzorka

Hochstenbach et al. Clin Case Rep 3: 489–491 (2015a).

Lažno negativan NIPT i kombinirani probir

T21 Majčin kariotip pokazao 10%-tni gonosomalnimozaik kromosoma X. FISH specifičan za k. 21 ukazao je na 21 monosomy/trisomiju.

Maresova I. et al. Paediatria Croatica Vol. 60 Suppl 2 2016

Kombinirani probir: visok rizik za T21NIPT: visok rizik za triple X sindrom

Amniocenteza: T18 Placenta: stanična linija s T18 i XXX, većinom XXX

Maresova I. et al. Paediatria Croatica Vol. 60 Suppl 2 2016


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24667696

http://www.cee-nipd2016.mefos.hr/images/paediatria_croatica/paediatria_croatica_2016.pdf

http://www.cee-nipd2016.mefos.hr/images/paediatria_croatica/paediatria_croatica_2016.pdf

Lažno pozitivni slučajevi

NIPT rezultat CVS ili drugi ne-fetalni materijal

Amniocenteza Fetalni kariotip Referenca

1. 16.gest.tj. ‘Notinformative’2. 18.gest.tj. T18

placenta nakon rođenja: mosaični oblik T18 (50%)

46,XX 46,XX Hayata K et al. Acta Med Okayama. 2017 Apr;71(2):181-185

T18 majčini kromosomi 18 sadrže brojne brojneduplikacije

normalan Snyder et al. N Engl J Med 372: 1639–1645 (2015).


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28420901

Prošireni panel za mikrodelecijske sindromeTrisomija 16

Trisomija 22

1p36 delecija

4p delecija (Wolf Hirschhorn)

5p delecija (Cri du chat)

7q11.23 delecija (Williams–Beuren)

15q11-q13 delecija (Prader–Willi/Angelman)

17p11.2 delecija (Smith Magenis)

17p13.3 delecija (Miller–Dieker)

22q11.2 delecija (DiGeorge)

22q13.3 delecija (Phelan–McDermid)


Clinical Experience with NIDT, Ferres et al. American Journal of Perinatology Vol. 31 No. 7/2014

Resolution: 3 Mb duplications or deletions, deletions as small as 300 kb

Neinvazivno testiranje na monogenske poremećaje

Relativno spor napredak u razvoju testova◦ manje tržište

◦ tehnički zahtjevnije (FGFR3 gen; -globin gen; HD)

◦ još u fazi istraživanja

◦ trenutno nespremni za kliničku implementaciju


Neinvazivno testiranje čitavog fetalnog genoma

Izvedivo, ali limitirano relativnom količinom fetalne DNA u uzorku

Neophodno regulirati etičke dvojbe prije nego postane klinički dostupno


Neinvazivno testiranje fetalnog metiloma i transkriptomaWong Al, Lo YM. Trans Mol Med. 2015; 21:98-108

posteljica je globalno hipometilirana u odnosu na druga tkiva

metilacijski status posteljice mijenja se tijekom gestacije te je analizom majčine plazme moguće pratiti dinamiku metilacijskih promjena

potencijal za neinvazivno praćenje fizioloških i patofizioloških procesa kod ploda


Gdje smo danas?

komercijalno dostupni testovi (“direct to consumer”)

najčešće bez adekvatnog genetičkog savjetovanja

ponekad predstavljeni kao dijagnostički testovi, a ustvari su testovi probira čiji patološki rezultat se mora potvrditi invazivnom metodom

zdravstveno osiguranje ne pokriva troškove testiranja, ograničeno dostupni

smjernice stručnih udruženja, postoje li ?

nedovoljna informiranost javnosti, ali i struke o testovima koji se “rutinski”primjenjuju


Smjernice 1Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Committee Opinion No. 545. American College ofObstetricians and Gynecologists. Obstet Gynecol 2012;120:1532–4.

ACOG preporučuje primjenu NIPT samo kod visokorizičnih trudnoća:

◦ NIPT nuditi samo trudnicama s visokim rizikom za enuploidiju, a invazivne metode primijeniti

samo kod trudnica s iznimno visokim rizikom za aneuploidiju, odnosno, da NIPT bude opcija

nakon patološkog nalaza kombiniranog probira, a prije invazivnog zahvata

◦ visoko rizične trudnice: visoka dob majke(>35 g.), abnormalan nalaz UZV, patološki nalaz

serumskih biokemijskih biljega, osobna i/ili obiteljska anamneza aneuploidija, 1 od partnera

nositelj Robertsonove translokacije


Smjernice 2Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Committee Opinion No. 640. American College ofObstetricians and Gynecologists. Obstet Gynecol 2015;126:e31–37.

NIPT ne nuditi kao zaseban test, temeljem njega ne može se donijeti odluka o prekidu trudnoće

Optimalni neinvazivni probirni test za sve trudnice u 1. tromjesečju je (i dalje) kombinirani test zbog:

◦ niske PPV NIPT u populaciji žena niskog rizika

◦ primjenom samo NIPT-a gubi se oko 10 % kromosomske patologije koju je moguće detektirati kombiniranim probirom

Ne preporučuje se za višeplodne trudnoće kao ni za rutinski probir na mikrodelecijske sindrome

Pacijentice kojima zbog ‘tehničkih’ razloga nije izdan nalaz, obavezno trebaju biti dodatno informirane (predložiti detaljan UZV pregled te invazivan dijagnostički zahvat)

NIPT ne otkriva defekte neuralne cijevi i ventralnog zida te je potrebno uz NIPT obavezno ponuditi testiranje AFP i UZV


Ukratko…

Neinvazivna DNA testiranja (NIDT) / neinvazivna prenatalna testiranja (NIPT) vrlo su brzo prošla put “bench to bedside”

NIPD za određivanje RHD i SRY statusa dio je rutinske antenatalne skrbi u mnogim dijelovima Europe

NIPT za najčešće autosomalne aneuploidije je u procesu integracije u kliničku skrb širom svijeta

Iako NIPT za aneuploidije još uvijek nije dijagnostički test, kao posljedica njegove visoke specifičnosti primijećeno je značajno smanjenje invazivnih zahvata

U bliskoj budućnosti, mogućnosti testiranja će se proširiti na detekciju submikroskopskih abnormalnosti i monogenskih poremećaja, a možda i čitavog genoma, metiloma i transkriptoma


Hvala vam na pažnji!


Documents

Prednosti i ograničenja neinvazivnog prenatalnog ... · rezultat analize bio informativan (16. gestacijski tjedan) dob 25 g. dob 40. g. osjetljivost (%) specifičnost (%) PPV (%)