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UTILIZACION DE PLANTAS COMO BIORREACTORES
Universidad Nacional De Quilmes
Carrera de Especialización en Biotecnología Industrial
Fernando Bravo Almonacid
Las plantas como
biorreactores
SumarioLas plantas como biorreactores
- Sistemas de expresión
- Las plantas como sistema alternativo
- Ventajas
- Costos comparativos entre distintos sistemas
Elementos a considerar en una estrategia
de expresión
- Nivel de expresión
- Sistemas de expresión integrativos
y no integrativos
- Optimización de costos de purificación
Aplicaciones
- Antígenos para inmunización
- Anticuerpos
- Biofármacos
- Otras aplicaciones
Las plantas como
biorreactores
Sistemas de
producción
de proteínas
recombinantes
• Sistemas biológicos comúnmente usados para
producir proteínas recombinantes a gran escala:
- Cultivos de bacterias
- Cultivos de levaduras
- Cultivos de células animales
- Animales transgénicos
- El plegado de proteínas de origen eucariótico
sintetizadas en bacterias puede ser incorrecto.
• Principales limitaciones:
- Existe el riesgo de contaminación del producto
final con microorganismos patógenos o toxinas
bacterianas.
- Los costos para aumentar la escala de producción
son altos en los cuatro casos.
La utilización
de las plantas
como
biorreactores
presenta
ventajas sobre
los otros
sistemas de
producción
• Permiten una gran producción de biomasa.
• Los mecanismos de síntesis y secreción de proteínas
y las modificaciones post-traduccionales son las propias
de las células eucariotas.
• El aumento en la escala de la producción implica bajos
costos incrementales y requiere la misma infraestructura
que se utiliza para el cultivo, cosecha, procesado y
almacenamiento de plantas transgénicas.
• No implican riesgos de contaminación con patógenos
animales o toxinas microbianas.
• Permiten el almacenamiento estable
de la proteína recombinante en semillas
y tubérculos, facilitando su conservación,
transporte y distribución.
Las plantas como
biorreactores
Los costos de producción de proteínas recombinantes en
plantas son potencialmente menores que en otros sistemas
Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.
Estimación de los costos de producción en función
del nivel de expresión de IgA en distintos sistemas
- Lograr altos niveles de expresión
- Disminuir los costos de purificación
- Conseguir un producto de características
idénticas al sintetizado en el sistema de origen
• La producción competitiva de proteínas
recombinantes en plantas requiere el diseño
de estrategias de expresión que cumplan con
tres premisas fundamentales:
Factores a
considerar en
el diseño de
una estrategia
de expresión
en plantas
Las plantas como
biorreactores
Elementos a considerar
en una estrategia de expresión
Las plantas como
biorreactores
La expresión
de la proteína
recombinante
puede
optimizarse
mediante
diversas
estrategias
• Elección del sistema de expresión: sistemas
integrativos y no integrativos
• Elección de secuencias promotoras de la
transcripción adecuadas (promotores tejido
específicos, inducibles, constitutivos, etc.)
• Utilización de secuencias reguladoras y regiones
no traducidas 5´ y 3´ adecuadas
• Optimización del uso de codones (“vegetalización”
de la secuencia)
• Utilización de secuencias señal para localización en
distintos espacios subcelulares o extracelulares
• Eliminación de secuencias desestabilizantes del
ARN mensajero
• Co-expresión de chaperonas para facilitar el
plegamiento proteico
Las plantas como
biorreactores
• Elección de la especie vegetal
• Rizosecreción en cultivos hidropónicos y
secreción en células en cultivo
• Proteínas de fusión a oleosinas
• Acumulación en las semillas u otros órganos
de almacenamiento para la co-extracción con
productos convencionales como almidón o
aceites
• Producción directa en partes comestibles de
la planta.
Los costos
de purificación
pueden
reducirse
explotando
características
propias
de las plantas
Las plantas como
biorreactores
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresión
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transgénicas nucleares
• Ventajas
- Expresión estable heredable por la progenie
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamaño
de la secuencia a introducir
• Limitaciones
- Niveles de expresión relativamente bajos
- Silenciamiento génico
Plantas transplastómicas (cloroplastos)
• Ventajas
- Altos niveles de expresión
- Expresión estable heredable por la progenie
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamaño
de la secuencia a introducir
- Ausencia de silenciamiento génico
- Introducción de policistrones
- Transferencia horizontal del transgén escasa o nula
• Limitaciones
- No ocurrencia de glicosilación
Las plantas como
biorreactores
Sistemas de expresión no integrativos
Vectores y amplicones virales
• Ventajas
- Niveles de expresión potencialmente altos
- Verificación rápida de la estabilidad y función
de los productos génicos antes de proceder
con la producción de transformantes estables
• Limitaciones
- Limitaciones en el tamaño de la secuencia
introducida
- Inestabilidad genética de la secuencia introducida.
- Silenciamiento génico
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresión
Las plantas como
biorreactores
Agroinfiltración
Contrucciones utilizadas para transformar
plantas de Arabidopsis thaliana
Nivel de expresión
(% de la proteína
total soluble en semilla)
Adaptado de: Geert De Jaeger, Nat. Biotech. 2002.
La correcta elección de las secuencias promotoras
y reguladoras de la transcripción y de la traducción
puede determinar variaciones importantes en los
niveles de expresión de la proteína recombinante
El nivel de
expresión
depende
de la correcta
combinación
de regiones
reguladoras Parc ss G4 myc 3´arc5’UTR ar KDEL
WParc ss G4 myc 3´arcKDEL
Pphas ss G4 myc 3´arc5’UTR ar KDEL
P35S ss G4 myc 3´arc5’UTR ar KDEL
10%
5%
36%
1%
Parc: promotor de arcelina de Phaseolus vulgaris
Pphas: promotor de -faseolina de Phaseolus vulgaris
W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus
ss: secuencia señal de envío a retículo endoplásmico
KDEL: secuencia de retención en retículo endoplásmico
Las plantas como
biorreactores
Citosol
Núcleo
Cloroplasto
Peroxisoma
Apoplasto
Retículo
Vacuola
Vacuola
Vacuola
Secreción
El nivel de
expresión
dependerá
de la
estabilidad de
la proteína en
el destino
final de la
misma
Diferentes destinos donde acumular las proteínas recombinantes
La rizosecreción
permite reducir
los costos de
purificación
• El gen de interés se fusiona a una secuencia señal de
. transporte al retículo endoplasmático para dirigir
. el producto correspondiente a la vía de secreción.
Secuencia señal Gen de interés
Inicio de la traducción
Sitio de procesado de la señal
• La proteína recombinante se obtiene por purificación
a partir de la solución hidropónica que circula en torno
a la rizósfera.
Tomado de: Finer, J. Nat. Biotech., 1999.
Las plantas como
biorreactores
Rizosecresión
de la xilanasa
de Clostridium
thermocellum
en tabaco
transgénico
• La expresión de la xilanasa de Clostridium
thermocellum fue utilizada como un
modelo de producción por rizosecreción.
p35SCaMV secuencia señal xilanasa
Planta no transformada Planta transgénica
Halo de
degradación
del sustrato
generado
por la
xilanasa
rizosecretada
Las plantas de tabaco se cultivaron en medio conteniendo
remazol brilliant blue-xilano como sustrato para la xilanasa.
Tomado de: Borisjuk et al. Nat. Biotech., 1999.
Construcción utilizada para la
transformación de plantas de tabaco
Las plantas como
biorreactores
Las fusiones
a oleosinas
permiten
reducir los
costos de
purificación
• La proteína de interés se fusiona a una oleosina, proteína que
normalmente forma parte de los cuerpos grasos de las semillas
Las plantas como
biorreactores
Gen de interés
Sitio de reconocimiento
para una proteasa
Oleosina
Adaptado de: www.sembiosys.com
Purificación de la proteína recombinante
a partir de los cuerpos grasosLa purificación
a partir de
cuerpos
grasos es
un proceso
sencillo
Las plantas como
biorreactores
La especie a
utilizar debe
seleccionarse
de acuerdo
con las
necesidades
de producción
de la proteína
a sintetizar
Tabaco
Sistema de transformación bien establecido
Producción de abundante biomasa, no comestible
Procesamiento bien establecido
Papa
Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en tubérculos
Procesamiento industrial de los tubérculos bien establecido
Contenido proteico en tubérculos relativamente bajo
Tomate
Consumo crudo de los frutos
Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en frutos
Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido
Contenido proteico en frutos relativamente bajo
Cereales
Tecnología de producción ampliamente establecida
Almacenamiento estable de la proteína recombinante en las semillas
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido
Alfalfa
Alto contenido proteico en hojas
Producción de biomasa abundante
Lemna (lenteja de agua)
Alta eficiencia de proliferación clonal
Alta tasa de duplicación de la biomasa
Rizosecresión muy eficiente
Physcomitrella (musgo)
Genoma completamente secuenciado
Transformación por recombinación homologa
Las plantas como
biorreactores
Proteínas recombinantes: glicosilación
Humanización
de las
glicoproteínas
recombinantes
Las plantas como
biorreactores
- Expresión de la (1,4)-galactosiltransferasa humana en plantas
transgénicas.
- Retención de la proteína en el retículo endoplásmatico.
- Inactivación de la a(1,3)-fucosiltransferasa y la (1,2)-xilosiltransferasa
de plantas.
• Los patrones de N-glicosilación en plantas difieren
de los presentes en mamíferos.
• Esto puede alterar la inmugenicidad, resistencia a la
degradación proteolítica y actividad biológica de la
proteína expresada, particularmente en anticuerpos.
• Se están ensayando diversas estrategias para humanizar
las glicoproteínas recombinantes expresadas en plantas:
Glicanos complejos
en plantas
NAcGlc
Asn
NAcGlc
Man Man
Man
NAcGlcNAcGlc
Fuc
Xyl
a -1,3NAcGlc
Asn
NAcGlc
Man Man
Man
NAcGlcNAcGlc
Fuc
NAcGlc
Gal Gal Gal
AcNeu AcNeu AcNeu
a-1,6
Glicanos complejos
en mamíferos
Aplicaciones
• Antígenos para la producción de vacunas
• Anticuerpos y antígenos para diagnóstico
• Polipéptidos de uso farmacológico
• Enzimas de interés industrial, suplementos
alimentarios, biopolímeros.
Las plantas como
biorreactores
La producción
de anticuerpos
en plantas
transgénicas
permite
ensamblar
moléculas de
Ig complejas
Los genes que codifican los cuatro polipéptidos de las
inmunoglobulinas secretorias se acumulan en una misma
planta por cruzamientos sucesivos entre plantas
transgénicas individuales y sus descendientes recombinantes.
Las plantas como
biorreactores
Ig dimérica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Cadena J
(J)Ig monomérica
(Ig)
Cadena liviana
()
Cadena pesada
(a)X
X
X
Ig secretoria
(sIg)
Ig dimérica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Cadena J
(J)Ig monomérica
(Ig)
Cadena liviana
()
Cadena pesada
(a)X
X
X
Ig secretoria
(sIg)
Ig dimérica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Cadena J
(J)Ig monomérica
(Ig)
Cadena liviana
()
Cadena pesada
(a)X
X
X
Ig secretoria
(sIg)
Expresión
del
anticuerpo
monoclonal
anti-AgI/II en
plantas de
tabaco
Estrategia:
Expresar el anticuerpo monoclonal murino anti-AgI/II en Nicotiana
tabacum con el fin de obtener grandes cantidades del mismo.
Cruzamientos
N. tabacum que expresa las
cadenas pesadas y livianas
del anticuerpo monoclonal
anti AgI/II
N. tabacum que expresa la
cadena J murina
N. tabacum que expresa el
componente secretorio de
conejo
Se obtuvieron plantas
de N. Tabacum que
expresan las cuatro
proteínas juntas.
Éstas cadenas se
ensamblaron en una
inmunoglobulina
secretoria funcional
que reconoce al
antígeno nativo AgI/II
Adaptado de: Ma, J., et al., Science, 1995.
Las plantas como
biorreactores
La bacteria Streptococcus mutans es uno de los principales
agentes causales de la caries dental. El antígeno de superficie
AgI/II participaría en la interacción hidrofóbica entre S. Mutans
y un complejo de glicoproteínas de alto peso molecular
presente en la superficie dental.
El anticuerpo
anti Agl/II
actuaría
alterando la
dinámica de
repoblación
de la superficie
dental
Luego del tratamiento con un agente antiséptico, la presencia
del anticuerpo anti AgI/II evitaría la recolonización de los
nichos en la superficie dental por Streptococcus mutans.
Las plantas como
biorreactores
Adaptado de: www.planetbiotechnology.com
La inmunización pasiva local de humanos con anti-AgI/II
producido en plantas otorga protección contra S. mutants
Recolonización de Streptococcus mutants en la cavidad oral de voluntarios humanos
previamente tratados con clorohexidina (CHX) para eliminar la flora oral
Tomado de: Ma, J., et al., Nat. Med. 1998 y www.planrtbiotechnology.com
neuraminidasa hemaglutinina
Influenza virus-like particles produced by transient expression in Nicotiana benthamiana induce a
protective immune response against a lethal viral challenge in mice
Medicago Inc., Plant Biotechnology Journal (2008) 6 , pp. 930–940
INFLUENZA
Production of glucocerebrosidase with terminal mannose glycans for enzyme
replacement therapy of Gaucher’s disease using a plant cell system
Plant Biotechnology Journal (2007) 5 , pp. 579–590 Protalix Biotherapeutics
35S OCS
Desarrollo de sistemas de expresión integrativos y no integrativos
para la producción de biofármacos y antígenos para vacunas
en plantas de tabaco.
EGF
Plantas transgénicas nucleares
Vectores virales
Plantas transplastómicas (cloroplastos)
Vacunas de uso veterinario
Factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF)
•Une a un receptor tirosina-quinasa presente
en casi todos los tipos celulares.
•Factor mitogénico. Interviene en el
desarrollo, diferencianción, reparación y
protección de tejidos epiteliales.
Tratamiento de heridas y quemaduras
Agente reparador en transplantes de córnea
Tratamiento de úlceras gástricas y otras
afecciones gastrointestinales
ss
1 22D. extracelular D. citoplasmático
TrhEGF
971 1023
1033 1053
53
1207
N-glic.
hEGF maduro: 6,2 Kda
Puentes -SH
pre-pro-hEGF
(114 Kda)
35SCaMV hegf tNOS p35EGF
hegf tNOS35S(L)CaMV W p35(L)EGF
Versiones
Citoplasmáticas
Versiones
Apoplásticas
p35APLEGF35SCaMV hegf tNOSss AP
p35(L)APLEGF35S(L)CaMV W hegf tNOSss AP
ss (péptido señal, 21aa) AP (17aa)
hEGF
MGNLRSSFVFFLLALVTYTYA ATIEVRNNCPYTVWAAS M NSD...
Expresión de hEGF en plantas transgénicas
p35(L)APEGFhegf tNOS35S(L)CaMV W ss
MGNLRSSFVFFLLALVTYTYA ANSD...
hEGF
Wirth et al. 2004
35SCaMV hegf tNOS p35EGF
hegf tNOS35S(L)CaMV W p35(L)EGF
p35APLEGF35SCaMV hegf tNOSss AP
p35(L)APLEGF35S(L)CaMV W hegf tNOSss AP
p35(L)APEGF
Agrobacterium tumefaciens N. tabacum cv Xanthi D8
p35APLEGF p35(L)APLEGF p35(L)APEGFH20 p35EGF p35(L)EGFC M
600 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
n = 11 n = 17 n = 15 n = 14 n = 17
pBI121
Hind III
300 pb
460 pb
510 pb
420 pb
390 pb
Análisis preliminar por PCR
Hind III
Hind III
Hind III
Hind III
hegf tNOS35S(L)CaMV W ss
Tamaño del
fragmento
amplificado
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
C
402
410
414
121
124
127
131
135
138
204
207
212
215
218 3 8 11 14 17 300
305
309
315
320
323
p35EGF
(n=11)
p35(L)EGF
(n=19)
Versiones citoplasmáticas
0,00001 % TPS
3 ng hEGF/ g hoja
ng
hE
GF
/g h
oja
Versiones apoplásticas
Niveles de expresión de hEGF
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
C
402
410
414
121
124
127
131
135
138
204
207
212
215
218 3 8 11 14 17 300
305
309
315
320
323
p35EGF
(n=11)
p35(L)EGF
(n=19)
Versiones citoplasmáticas
0,00001 % TPS
3 ng hEGF/ g hoja
ng h
EG
F/g
hoja
Niveles de expresión de hEGF
0,11% TPS
34 mg hEGF/g hoja
p35APLEGF
(n=16)
p35(L)APLEGF
(n=14)p35(L)APEGF
(n=17)
Versiones apoplásticasL
og
Rizosecreción de hEGF
Línea de
purificación
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0 5 10 15 20 25 30 35
T (días)
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
% T
PS
0,025 %
Planta 319 (p35(L)APEGF)
apoplástica
Planta 408 (p35EGF)
citoplasmática
Actividad biológica. Ensayo de radioreceptor
Membranas de placenta
+125I-rhEGF
rhEGF Extractos
plantas
125I-rhEGF
remanente
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.00.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
0.150
0.175
0.200
0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0
0,200
0,175
0,150
0,125
0,100
0,075
0,050
0,025
hEGF (nM)
hE
GF
un
ido (
nM
)
Kd (rhEGF): 0,77 ± 0,06 nM
Kd (319): 0,70 ± 0,03 nMKd (rhEGF): 0,77 ± 0,06 nM
Kd (319): 0,70 ± 0,03 nM
rhEGF
Extracto Planta 319
Actividad biológica. Ensayo de expansión de células del cumulus
Wirth et al. 2004
Vectores
virales
derivados
de virus
a ARN
(PVX)
ARN ARN
Vector viral
recombinante
ADNcADNc
Genoma viral
ADNc del
genoma viral
Transcripción in vitro
Clonado del ADNc en un
plásmido. Introducción de
un sitio de clonado múltiple
Obtención del ADNc del
genoma viral completo
Gen XT7
Clonado del gen de interés
Vector viral ADNcT7
SCM
Infección mecánica
con transcriptos de ARN
Transcripción in vitro
Infección de N. benthamiana
Expresión de hEGF utilizando vectores virales
Replicasa 24K 12K Cápsidepsg8K
hegfReplicasa 24K 12K psg8K Cápsidepsg poliAT7 pr PVXEGF
PVXAPEGF
PVX
ss hegfReplicasa 24K 12K psg8K CápsidepsgT7 pr poliA
poliAT7 pr
NI PVX
PVXAPEGF
PVXEGF
Características comparadas de los sistemas
de transformación nuclear y plastídica
Genomas
Correcto
(pasando por retículo
endoplasmático)
CorrectoPlegamiento y formación
de puentes disulfuro
SíHerencia maternaTransferencia horizontal
TGS y PTGS afectan
la expresiónNo se ha reportadoSilenciamiento génico
Inserción al azar
(expresión variable)
Inserción en sitio conocido
elimina este problemaEfectos de posición
MonocistrónicosOperonesGenes y expresión
Por lo general bajos
Entre 0,001-0,1%
Altos
Entre el 2-7% (hasta 47%)Niveles de expresión
Pocas copias~10.000/célulaNúmero de copias
NuclearPlastídico
Glicosilación No Si
B’ C’5’UTRPr selector X 3’UTR
B C DA
B C DA 5’UTRPr selector X 3’UTR
Genoma
Plastídico
Plásmido de
transformación
Recombinación
homóloga
Plastoma Transformado
Transformación de cloroplastos:
sitio específica, recombinación homologa
Control de selección Control de regeneraciónBombardeo
N tabacum cv Pettit Havana
Transformación por biobalística
Se obtiene
homoplastía
por sucesivas
rondas de
regeneración
en medio de
selección
Nicotiana tabacum
cloroplasto
155.393 pb
Sitio de inserción
Secuencias flanqueantes
Construcción del vector:
clonado de las secuencias flanqueantes
Nde I
Prrn
aadA
uidA
Trps16Xba ItrnI
Sac I
Sac II
16S
trnA
5’ UTRpBSWUTRGUS(8357 pb)
Prrn
aadA
uidA
Trps16Xba ItrnI
Sac I
Sac II
16S
trnA
RBSpBSWGUS(8163 pb) Nde I
5’ UTR
(psbA)
Plásmidos para la transformación de
cloroplastos de tabaco
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
0 5 10 15 20 25 30
time (minutes)
UF/n
an
og
ram
ST
P
PH
GUSnucl. 2
BSW 2 3R
UTR 2 2R
UTR 3 4R
Expresión de -glucuronidasa en plantas transplastómicas de tabaco
M WT Nu R1 R3 R5 R1 BSA
SUBUNIDAD
MAYOR
RUBISCO
0,1 1 2 ug
GUS P1GUS
Prrn
aadA
hegf
Trps16
Xba ItrnI
Sac I
Sac II
16S
trnA
RBSpBSWEGF(6528 pb)
Nde I
Prrn
aadA
hegf
Trps16
Xba ItrnI
Sac I
Sac II
16S
trnA
5’ UTRpBSWUTREGF(6721 pb)
Nde I
Construcción de los plásmidos para la
expresión de hEGF
Wirth et al. 2006
16S
Sac II
103235
Prrn aadA
cloroFw cloroRv1450 pb
pBSWUTREGFpBSWEGF
n = 29
n = 45
Análisis de las plantas: PCR
a)
pBSWUTREGF (1520 pb)
pBSWEGF (1385 pb)
16S
Sac II103235
Avr II
trnI trnA
Sac I105419
Nco I105790
Nco I99365
6425 pb
trnI/A
8458
7242
6369
5686
C 21 27 35 37 43 43 58 23 21 37
3R 2R 4R 2R 3R 4R 3R 2R T1 T1
hE
GF
trn
I/A8458
7242
6369
5686
pBSWEGF
C 13 14 17 18 19 46 51 13 14 18
4R 4R 2R 3R 3R 4R 4R T1 T1 T1
8458
7242
6369
5686
8458
7242
6369
hE
GF
trn
I/A
pBSWUTREGF
EGF
trnI/A
EGF
trnI/A
4 mg ADN total, cortado Nco I sonda: hegf o trnI/A
No transformado
Homoplastía
C 14 14
(2R) (3R)
Heteroplastía
Verificación de la homoplastía por Southern blot
16S aadA Trps16 trnIhegf
2001489 165 165164 819
Prrn Prrn 5’UTR
3
2
1
13 14 19 46 13
C 4R 4R 2R 2R T1
pBSWEGF pBSWUTREGF
1
2
1
2
3
5 mg ARN total sonda: hegf
Análisis de las plantas: Northern blot
Mecanismos de control genético en cloroplastos
Degradación proteolítica
No se detectó hEGF en
ninguna de las plantas
analizadas
A pesar que:
ARN m
NO se edita
Expresión en E. coli (pBSWUTREGF)
GUS se expresa
Traducción (especialmente el inicio)
Nuevas construcciones
Expresión de hEGF
Virus de la
fiebre aftosa
Lentz et al. 2010
<<
Caracterización molecular de las plantas VP-βGUS
Northern blot
Virus de la
fiebre aftosa
Southern blot
Expresion de VP-βGUS en las plantas transplastómicas
Virus de la
fiebre aftosa
Coomasie Western blot
Cuantificación de la expresión
VP- βGUS
Rubisco L
Virus de la
fiebre aftosa
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Fenotipo de las plantas VP-βGUS
Virus de la
fiebre aftosa
wild-type
Inmunización
transplastómicaVP-βGUS
vacuna VFA
Virus de la
fiebre aftosa
Lentz et al. 2010
VP5* VP8*
Responsable del 60% de las
Gastroenteritis de bovinos
Genoma mulipartito (11dsRNA)
Rotavirus
bovino
Lentz et al 2011
VP8*
Rotavirus
bovino
Inmunización y
desafío
Protección de
los lactantes
VP8 fusionada a Lumazina sintasa de Brucella spp. (BLS)
Estructura teórica del dímero de pentámeros de BLSVP8d-Bov (Bellido et al. 2009)
- BLS forma dímeros de pentámeros altamente estables.
- Permite acomodar polipéptidos o dominios proteicos en su extremo N-terminal.
- Es un inmunomodulador funciona como adyuvante en inmunización sistémica y oral.
Introducción - Parte II
Transformación e integración de BLSVP8
Transcriptos y expresión de BLSVP8
probe: BLS
BLSVP8d acumulación a lo largo del desarrollo, expresión y
estabilidad
Inmunización y respuesta inmune en gallinasAntibodies Titers
Viral Neutralization Assay
Inmuniización de gallinas con extracto fresco o liofilizado
Biomasa total / planta (g de hojas/ planta) 20 gramos
Total de proteínas (%) tejido fresco hojas 3%
Total de proteínas en tejido fresco/planta 600 mg
Nivel de expresión de la proteína recombinante 10 % 60 mg
En una hectárea (20.000 plantas) 1,2 kg
1 dosis = 5ug 240 10 6 dosis/ha
Dosis de vacuna por hectárea de tabaco transplastómico
Las plantas como
biorreactores
Aspectos de
bioseguridad • Bioseguridad:
En el caso de producción de proteínas terapéuticas o con actividad
biológica, se deben establecer condiciones de bioseguridad aún
más estrictas que las adoptadas para otros OGMs, ya que éstas no
deben ingresar a la cadena alimentaria humana.
• Recomendaciones:
- Utilizar cultivos que no participen de las cadenas alimentarias
humana o animal.
- Utilizar cultivos de estructura floral cerrada (autopolinización).
- Tener en cuenta el aislamiento temporal (época de
polinización diferente en cultivos relacionados) y
espacial (barreras de cultivos no transgénicos).
- Si la expresión es en hojas, cosechar las plantas antes
de la floración.
- Si es posible, implementar la transformación de cloroplastos.
Ezequiel Matías Lentz
María Eugenia Segretin
Mauro Miguel Morgenfeld
Sonia Alejandra Wirth
Federico Alfano
Noelia Boccardo
Fernando Bravo Almonacid
María José Dus Santos
Marina Valeria Mozgovoj
Andrés Wigdorovitz
Demian Bellido
INGEBI-CONICET
INTA-CASTELAR
Instituto de Virología
