PROIZVODNJA BUTANOLA IN 2,3-BUTANDIOLAweb.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/Butanol.pdf · Vendar pa je naftna kriza leta 1973 ponovno obudila interes za bioprodukcijo

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNI�KA FAKULTETA �IVILSKA TEHNOLOGIJA

PROIZVODNJA BUTANOLA IN 2,3-BUTANDIOLA

Katja JUG, Tadeja JUTER�EK, Petra KARO, Alenka KLEINDIENST

(�tudentke tretjega letnika �tudija �ivilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Pa� (mentorja)

Ljubljana, 2001 *Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Industrijski bioprocesi: Proizvodnja butanola in 2,3-butandiola, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2001 2

POVZETEK Butanol se uporablja pri proizvodnji plastike, kot ekstrakt v �ivilski industriji z različnimi okusi in kot raztopina v zavornih tekočinah. Kemikalija se kemično proizvaja iz petroleja. Uporablja se pri brezalkoholnih in alkoholnih pijačah, sladoledih, ledih, bombonih, kremah. 2,3-butandiol, znan tudi kot 2,3-butilen glikol, je zelo cenjena kemična sestavina. Uporabljamo ga kot raztopino, tekoče gorivo in kot prekurzor za veliko sintetičnih polimerov in topil. 2,3-butandiol nastaja med fermentacijo, limitirano s kisikom, fermentacija je znana kot me�ano kislinsko-butandiolska pot. Ta seminar opisuje mikrobiolo�ke osnove procesa, posamezne rodove in mikroorganizme. Prikazanih je nekaj zahtev za čim večje izkoristke bioprocesov. Z mikrobi povezan je biokemijski del, ki opisuje osnovne poti razgradnje substrata, opisan je tudi metabolizem posameznih komponent. Prikazan je osnovni proces pridobivanja � fermentacija, viri različnih organskih snovi, parametri, ki vplivajo na rast in zagon bioprocesa. SUMMARY Butanol is used in plastics production, as a food grade extractant in the food and flavor industry and as a solvent in brake fluids. The chemical is currently made from petroleum. It is used in non-alcoholic beverages, alcoholic beverages, ice cream, ices, candy, cream. 2,3-butanediol, otherwise known as 2,3-butylene glikol, is a valuable chemical feedstock because of its application as a solvent, liquid fuel, and as a prekursor of many synthetic polymers and resins. 2,3- butanediol is produced during oxygen-limited growth by a fermentative pathway known as the mixed acid-butanediol pathway. This seminar is describing microbiological fundamentals of proces, families and individual microorganisms. There are shown some reqirements for higher explitation of bioproces. This is linked with biochemical part wich is describing basic paths of substrate decay, so as metabolism of some components. Shown is basic proces of fermentation, sources of different organic compounds, parameters which are important for growth and possible ways to claim the final product.

1. UVOD 5


2. ZGODOVINA BIOPROCESA 6 2.1. ZGODOVINA PROIZVODNJE BUTANOLA 6 2.1.1 NOVEJ�A ZGODOVINA 6 2.2 ZGODOVINA PROIZVODNJE 2,3-BUTANDIOLA 6 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA 7 3.1 MIKROBIOLO�KE OSNOVE BUTANOLA 7 3.1.1 ROD CLOSTRIDIUM 7 3.1.1.1 Clostridium acetobutylicum 7 3.2 MIKROBIOLO�KE OSNOVE 2,3-BUTANDIOLA 8 3.2.1 MIKROORGANIZMI 8 3.2.1.1 Rod Aeromonas 8 3.2.1.2 Rod Bacillus 8 3.2.1.3 Rod Klebsiella 9 3.2.1.4 Rod Serratia 9 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 9 4.1 BUTANOL 9 4.1.1 IZKORI�ČANJE SUBSTRATOV 9 4.1.2 RAZGRADNJA OGLJIKOVIH HIDRATOV 9 4.1.2.1 Pretvorba sladkorja v piruvat 10 4.1.3 TVORBA PRODUKTOV 12 4.1.3.1 Tvorba kislin 12 4.1.3.2 Tvorba topil 12 4.2 2,3-BUTANDIOL 13 4.2.1 NASTANEK PIRUVATA, PRETVORBA PIRUVATA V ACETOLAKTAT IN REAKCIJE PRETVORBE ACETOLAKTATA V ACETOIN 13 4.2.2 PRETVORBA ACETOINA V 2,3-BUTANDIOL 14 4.2.3 MEHANIZEM NASTANKA RAZLIČNIH STEREOIZOMEROV 14 5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 16 5.1 PRIPRAVLJALNI POSTOPKI 16 5.1.1 PRIPRAVA BIOKULTURE 16 5.1.1.1 Izolacija biokultur pri proizvodnji butanola 16 5.1.1.2 Priprava inokuluma 18 5.1.1.3 Pomen sterilnosti 18 5.1.2 PRIPRAVA SUBSTRATA 18 5.1.2.1 Priprava substratov za butanol 18 5.1.2.2 Priprava substratov za 2,3-butandiol 19 5.2 POTEK BIOPROCESA 20 5.2.1 PARAMETRI, KI VPLIVAJO NA RAST 20 5.2.1.1 Temperatura 20 5.2.1.2 pH 20 5.2.1.3 Kisik 20 5.2.1.4 Začetna koncentracija sladkorja 21 5.2.1.5 Vpliv acetata in ostalih stranskih produktov 21 5.2.1.6 Vpliv produktov na bioproces 22 5.2.1.7 Rastni limitni faktorji pri proizvodnji butanola 22 5.2.2 POTEK FERMENTACIJE 23 5.2.2.1 Fermentacija pri butanolu 23 5.2.2.2 Fermentacija pri 2,3-butandiolu 26 5.3 ZAKLJUČNI POSTOPKI 27 5.3.1 POSTOPKI IZOLACIJE BUTANOLA 27 5.3.2 POSTOPKI IZOLACIJE 2,3-BUTANDIOLA 28 6. EKOLO�KI VIDIK 29


6.1 BUTANOL 29 6.1.1 VPLIV NA OKOLJE 29 6.1.2 VPLIV NA ČLOVEKA 29 6.1.2.1 Strupenost v okolju 29 6.1.3 SKLADI�ČENJE 29 6.2 2,3-BUTANDIOL 30 6.2.1 VPLIV NA OKOLJE 30 6.2.2 VPLIV NA ČLOVEKA 30 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE 30 7.1 BUTANOL 30 7.2 2,3-BUTANDIOL 30 8. REFERENCE 31


1. UVOD Butanol je alifatski, nasičen, C4 alkohol. Ima �tiri izomerne oblike: dve primarni, eno sekundarno in eno terciarno (Gerhard, 1985). Butanol je naravni produkt anaerobnih bakterij. V prvi polovici prej�njega stoletja je bila njegova sinteza večinoma dose�ena s fermentacijo. Bioprodukcija aceton/butanola je po obsegu postala druga najobse�nej�a fermentacija na svetu, ki jo je presegla le etanolna fermentacija kvasovk. Po letu 1950 je pomembnost procesa hitro upadala, saj je proizvodnja acetona in butanola iz nafte postala bolj ekonomična. Vendar pa je naftna kriza leta 1973 ponovno obudila interes za bioprodukcijo aceton/butanola in za bakterijo, ki jo povzroča. Letno ga po svetu s petrokemičnimi metodami proizvedejo 5 milijonov ton (Dürre in Bahl, 1996). 2,3-butandiol, znan tudi kot 2,3-butilen glikol, 2,3-dihidroksi butan ali dimetilen glikol, je zelo cenjena kemična spojina. Uporabljamo ga kot topilo, tekoče gorivo in kot prekurzor za veliko sintetičnih polimerov in rastlinskih smol (Saha, 1999). Industrijsko se D,L- oblika pripravlja iz cis-2,3-epoksibutana, mezooblika pa iz trans-2,3-epoksibutana. D(-) in L(+) obliki pa iz D- in L-manitola (Biebl s sod., 1998). 2,3-butandiol se proizvaja tudi s fermentacijo. Nastanek optičnega izomera je odvisen od vrste bakterije. 2,3-butandiol pridobivamo iz melase sladkorne pese in iz sladkorja koruze. Zaradi toplotne vrednosti 27,200 J/g lahko 2,3-butandiol ugodno primerjamo z etanolom ( 29,100 J/g ) in metanolom ( 22,100 J/g ) za uporabo kot tekoče gorivo ali kot dotatek h gorivom. Z dehidracijo 2,3-butandiola lahko dobimo industrijsko raztopino metil etil keton. Z nadaljno dehidracijo dobimo 1,3-butandien, ki je začetni material za sintetične gume, pomemben pa je tudi kot monomer v polimerni industriji (Maddox, 1996). Tabela 1: Kemične in fizikalne značilnosti butanola in 2,3-butandiola (Gerhard s sod., 1985, Richardson, 1992).

Značilnosti Butanol 2,3-butandiol Sinonimi 1-butil alkohol, n-butanol, butil alkohol 2,3-butilen glikol, dimetilen glikol Kemijska formula CH3CH2-CH2�CH2-OH H0-CH2-(CH)2-CH2-OH Videz brezbarvna, bistra tekočina brezbarvna, bistra tekočina Vonj značilen , rahlo po alkoholu brez vonja Topnost 9ml/100ml vode (T=25 °C)

topen v vodi

Specifična te�a 0,81 (T=20 °C) 1.017 Molekulska te�a 74,12 90,12 Tali�če 90,2 °C, (P=101,3 kPa) 35.5-36.5 °C (P=101,3 kPa) Vreli�če 117,7 °C (P=101,3 kPa)

182 °C (P=101,3 kPa)

Pritisk pare 0,63 kPa (T=20°C) 0.13 kPa ( T=37°C)


2. ZGODOVINA BIOPROCESA 2.1 ZGODOVINA PROIZVODNJE BUTANOLA Tvorbo butanola s fermentacijo je prvi opazil Pasteur pri preučevanju bioprodukcije butirata. Organizem, ki povzroča to fermentacijo je bil imenovan Vibrion butyriquen. Kasneje je Fitz opravil podrobnej�o �tudijo bakterije, ki proizvaja butanol. Opisal je organizem, ki fermentira glicerol v butanol, butirat, CO2, H2 in majhne količine ocetne kisline, etanola, laktata in propandiola. Organizem je bila anaerobna, sporogena, paličasta bakterija, ki je kazala tipične klostridne oblike. Fitz jo je imenoval Bacillus butylicus. Weizmannu je uspelo izolirati organizem, kasneje imenovan Clostridium acetobutylicum, ki proizvaja aceton in butanol iz �krobnih surovin. Zato je tudi fermentacijska industrija začela pridobivati aceton in butanol iz �krobnih surovin. Včasih so uporabljali največ acetona, butanola pa ne. Tako so ga spravljali v ogromne kadi. Ob naglo rastoči avtomobilski industriji se je povečevala poraba lakov, za katere sta butanol in njegov ester butil acetat odlični topili. S tem je butanol pridobil na pomenu (Dürre in Bahl, 1996). 2.1.1 NOVEJ�A ZGODOVINA Po 2. svetovni vojni je butanol postal iskan proizvod, medtem ko se je poraba acetona zmanj�ala. V Ameriki je v zgodnjih 30-tih letih �ito kot surovino nadomestil melasin substrat, saj je bila melasa veliko cenej�a od �ita. Dodatno so odkrili vrsto Clostridium acetobutylicum, ki fermentira do 6,5% sladkorja, s tem pa pridobili 2% topil. Fermentacija z bakterijo C. acetobutylicum je postala neekonomična zaradi visoke cene substratov, majhnega pridobitka topil, velike količine odpadkov in zaradi nizke tolerance bakterije na butanol. Butanol pri začetni koncentraciji 200 mM popolnoma prepreči rast bakterije, medtem ko aceton in etanol v podobnih koncentracijah ne poka�eta nobenega vpliva na bakterijo (Dürre in Bahl, 1996). 2.2 ZGODOVINA PROIZVODJE 2,3-BUTANDIOLA 2,3 butandiol je kot bakterijski fermentacijski produkt znan �e od začetka 20. stoletja. Med 2. svetovno vojno so v ZDA in Kanadi raziskovali njegovo vlogo pri pridobivanju strate�ke kemikalije 1,3-butandiena. Iz 2,3-butandiola ga lahko pridobivamo z dehidracijo in ga uporabimo pri proizvodnji umetne gume. Ta način pridelave so začeli opu�čati, ker so sintetični 1,3-butandien lahko pridobivali iz petrokemijskih virov. Kljub temu pa so nadaljevali temeljne raziskave o fiziologiji in biokemiji organizmov, ki so sposobni producirati 2,3-butandiol. Prednost 2,3-butandiola pred etanolom in butanolom je, da je dosti manj toksičen za organizme, ki ga proizvajajo. Zato ga lahko v fermentacijski brozgi proizvajamo v večjih koncentracijah. Trenutno se raziskave o fermentaciji z uporabo različnih mikroorganizmov in substratov nadaljujejo na različnih koncih sveta (Maddox, 1996).


3.MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA 3.1 MIKROBIOLO�KE OSNOVE BUTANOLA 3.1.1 ROD Clostridium Rod po Gramu pozitivnih, anaerobnih, sporogenih, peritrihnih, paličastih bakterij ( Banič, 1994). Pod mikroskopom so vidne kot ravne ali rahlo krive palčke z izboklino na terminalnem koncu. Rod Clostridium optimalno raste na krvnem agarju pri telesni temperaturi človeka. V stresnem okolju bakterija tvori spore, ki tolerirajo ekstremne pogoje, kakr�nih aktivne bakterije ne morejo tolerirati. Najdemo jih predvsem v tleh in v črevesju človeka in �ivali. Kadar redoks potencial Eh ni primerno nizek, spore ne kalijo in tudi rast ne poteka normalno. Ta bakterija v aktivni obliki skriva močne nevrotoksine, ki so povzročitelji raznih bolezni (http://www.geocities.com/SouthBeach/Port/3008/clost.html, 2.1.2001).

3.1.1.1 Clostridium acetobutylicum Clostridium acetobutylicum (C. acetonobutylicum, C. acetobuyricum) je anaerobna, proteolitična bakterija, ki je bila izolirana iz �tevilnih okolij. Bakterija tvori endospore, ki ji omogočajo dolgotrajno pre�ivetje celo v okolju, kjer je prisoten kisik. Čeprav druge vrste rodu tvorijo nekatere najnevarnej�e poznane smrtonosne nevrotoksine, bakterija Clostridium acetobutylicum ni nevaren organizem. Skozi njegovo dolgo zgodovino uporabe za proizvodnjo butanola in acetona ni bilo nobenih poročil o neugodnih efektih na člove�ko zdravje in okolje (http://iubio.bio.indiana.edu/R219380-227064-/news/bionet/microbiology/9506.newsm, 17.12.2000). Tabela 2:Lastnosti klostridijev, ki proizvajajo butanol (Dürre in Bahl, 1996). C.acetobutylicum C.aurantibutyricum C.beijerinckii C.butyricum Hidroliza �elatine - + - - Gibljivost + + + ± Lipaza - + - - Hidroliza �kroba + + ± + Uporaba sladkorjev Glukoza + + + + Fruktoza + + + + Laktoza + + + + Maltoza + + + + Saharoza + + + + 3.2 MIKROBIOLO�KE OSNOVE 2,3-BUTANDIOLA Veliko je organizmov, ki v zmernih količinah proizvajajo 2,3-butandiol, razlikujejo se le po stereoizomerah. Največ �tudij o produkciji 2,3-butandiola je bilo izvedenih na vrstah iz dru�ine

http://www.geocities.com/SouthBeach/Port/3008/clost.html

http://iubio.bio.indiana.edu/R219380-227064-/news/bionet/microbiology/9506.newsm


Enterobactericeae. Ti organizmi so fakultativno anaerobni, energijo za rast dobijo aerobno z respiracijo ali anaerobno s fermentacijo (Maddox, 1996). Tabela 3: Izomeri 2,3-butandiola nastali iz različnih bakterij (Maddox,1996). Organizem L(+) D(-) mezo Klebsiella oxytoca + - + Aeromonas hydrophila - + - Bacillus polymyxa - + - Bacillus subtilis - + + Bacillus amyloliquefaciens - + + Serratia marcescens - - + 3.2.1 MIKROORGANIZMI

3.2.1.1 Rod Aeromonas Rod je po Gramu negativna, fakultativno anaerobna, kemoorganotrofna, ravna, paličasta ali kokoidna bakterija z zaokro�enimi konci in polarnim bičkom ali brez njega. Celice se lahko pojavljajo posamično, v parih ali kot kratke veri�ice. Večina vrst najbolje raste pri temperaturi 37 °C. V rod uvr�čamo tri vrste, ki �ive v vodi, odplakah in drugod. Za človeka je patogena vrsta A. hydrophila, ki se uporablja tudi za pridobivanje 2,3-butandiola (Banič, 1994).

3.2.1.2 Rod Bacillus Rod je po Gramu pozitivna, aerobna ali fakultativno aerobna, sporogena, peritriha ali atriha paličasta bakterija. Nekatere vrste proizvajajo antibiotike. Tipska vrsta je B. subtilis (Banič, 1994). Bakterija B. polymyxa se v anaerobnih pogojih v prisotnosti fermentirajočega ogljikovega hidrata močno razmno�uje, pa tudi reakcija pa Gramu je običajno negativna. Tako jo lahko zmotno uvrstimo v dru�ino Enterobactericeae, (Holt s sod., 1994). Bakterija B. subtilis se od bakterije B. polymyxa razlikuje po tem, da producira me�anico D(-) in mezo stereoizomere ( v razmerju 3:2 ) in kot stranski produkt nastaja več glicerola kot etanola. Bakterija B. amyloliquefaciens je podobna bakteriji B. subtilis vendar se razlikuje po tem, da pri reakcijah nastaja toplota. Bakterija B. licheniformis se, čeprav je drugačna vrsta, obna�a podobno kot bakterija B. polymyxa in kot stranski produkt producira laktat. Bakteriji K. oxytoca in B. polymyxa sta organizma, ki so jima v preteklih �tudijah posvečali največ pozornosti. Trdili so, da je ena izmed prednosti bakterije B. polymyxa tvorba samo D (-) izomera, pa tudi zmo�nost brez predhodne obdelave fermentirati polimerične substrate, ki jih najdemo v kmetijskih odpadkih. (Maddox, 1996).


Slika 1: Bakterija B. subtilis (Madigan s sod.,1997). 3.2.1.3 Rod Klebsiella Rod je po Gramu negativna, fakultativno anaerobna, negibljiva paličasta bakterija s polisaharidnimi ovojnicami. Tipska vrsta je bakterija K. pneumoniae, ki je zelo raz�irjena v naravi (Banič, 1994).

3.2.1.4 Rod Serratia

Rod je po Gramu negativna, fakultativno anaerobna, kemoorganotrofna, ravna, peritriha palčka z zaokro�enimi konci, iz dru�ine Enterobacteriaceae. Vrste tega rodu so zelo raz�irjene v naravnem okolju (tla, voda, povr�ina rastlin), včasih so patogene kot oportunisti. Kolonije so bele, rdečkaste ali rdeče. Rod vsebuje �est vrst. Tipska vrsta je bakterija S. marcescens, ki navadno ustvarja rdeč endopigment prodigiozin (Banič, 1994). 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 4.1 BUTANOL 4.1.1 IZKORI�ČANJE SUBSTRATOV Pestra izbira monosaharidov, disaharidov in sorodnih sestavin se uporablja za rast bakterije C.acetobutylicum. Od polisaharidov se uporabljata tudi �krob in ksilan. Vendar pa ksilan lahko uporabimo le pod specifičnimi pogoji. Ne moremo ga uporabiti pri kislosti pod pH 5,2, ker so ksilanolitični encimi pri tej pH vrednosti inhibirani. Pri kontroliranem pH (5,2 ali 6,0) se izkoristi 50% ksilana (Awnag s sod., 1988). Proces pridobivanja substratov lahko obravnavamo v treh korakih:

1. razgradnja polimernih substratov z encimi; 2. odvzem razgrajenih produktov ali drugih substratov z majhno molekulsko maso; 3. intracelični metabolizem ogljikovih hidratov (Dürre in Bahl, 1996).

4.1.2 RAZGRADNJA OGLJIKOVIH HIDRATOV Razgradnjo ogljikovih hidratov z bakterijo C.acetobutylicum lahko razdelimo na tri faze. Za prvo, acidogeno fazo, je značilna hitra rast in padec pH vrednosti iz 6,0 na pod 4,5 zaradi tvorbe ocetne in maslene kisline. Med drugo fazo, fazo nastanka topil, se ti dve kislini skupaj s preostankom


ogljikovih hidratov preoblikujeta v aceton, butanol in etanol; pH začne nara�čati. Mikrobiolo�ka aktivnost se konča v tretji, stacionarni fazi, zaradi kopičenja toksičnih koncentracij topil. Ocetna in maslena kislina sta torej intermediata v razgradnji, glavni končni produkti pa so aceton, butanol, etanol, ogljikov dioksid in vodik. Med industrijsko bioprodukcijo so topila tvorjena v razmerju butanol:aceton:etanol= 6:3:1 (Awang s sod., 1988). Med rastjo bakterije C. acetobutylicum na �krobu, se proizvajata α-amilaza in glikoamilaza, originalno imenovana maltaza. Sintezo teh encimov običajno povzroči �krob ali kateri njegovih razgradnih produktov. Pred kratkim so α-amilazo pridobljeno iz bakterije C. acetobutylicum očistili in ji določili njene lastnosti. Ta encim ima molekulsko maso 84 kDa, optimalen pH 5,6 in je zelo občutljiv na termično inaktivacijo. Najbolj je aktivna pri visokih molekulskih masah substratov (Dürre in Bahl,1996).

4.1.2.1 Pretvorba sladkorja v piruvat Transport substratov v bakteriji C. acetobutylicum �e ni popolnoma raziskan. Heksozo v celico transportirajo specifične fosfotransferaze. Večina obligatnih anaerobov uporablja fosfotransferazne sisteme za transport sladkorjev. Pentoza (ksiloza) je transportirana v celico s permeazo. Če imamo kot substrat zmes glukoze in ksiloze, se ksiloza začne izkori�čati �ele, ko se količina glukoze izčrpa (Awang s sod.,1988). Disaharidi, kot je na primer maltoza, se razcepijo ob prisotnosti fosforilaz. Na primer : MALTOZA + FOSFAT MALTOZA FOSFORILAZA GLUKOZA + GLUKOZA-1-FOSFAT Rod Clostridium običajno uporablja proces glikolize za razgradnjo heksoze fosfatov. To velja tudi za bakterijo C. acetobutylicum. Sladkorne kisline, kot na primer glukonat, se razgradijo preko prilagojene Entner-Doudoroff poti. D-glukonat se dehidrira in odda 2-keto-3-deoksiglukonat, ki se kasneje fosforilira in razcepi na piruvat in 3-fosfogliceraldehid. Pentoze se pretvorijo v ribozo-5-fosfat in ksilulozo-5-fosfat, ki nato vstopita v pentoza fosfat ciklus. Produkti heksoza fosfati se dodatno razgradijo z glikolizo (Dürre in Bahl, 1996).

COOH

HC

CH

HC

HC

CH

OH

OH

OH

OH

OH

OH2

Glukonat

COOH

C

CH

HC

HC

CH

OHOH

OH

OH2

2-keto-3-deoksi glukonat

H O2

2

COOH

C

CH

HC

HC

CH

OHOH

OH

O2

2-keto-3-deoksi 6-fosfoglukonat

2

ADP ATP

COOH

C

CH 3

HC

HC

CH

OO

OH

O2

Gliceraldehid 3-fosfat

Piruvat

1 2 3

Slika 2: Razgradnja glukonata po Entner-Doudoroffovi poti: (1) glukonat dehidrogenaza; (2) 2-keto-3-deoksiglukonat kinaza;(3)2-keto-3-deoksi-6-fosfoglukonat aldolaza (Dürre in Bahl, 1996).


Ogljikov hidrat

EMP

Piruvat

Acetil-CoA

H2 CO2

Acetaldehid

NADH + H+ NAD+

Etanol

34

NADH + H+ NAD+

5Acetoacetil-CoA

Acetil-P1

CoA P

Ocetna kislina2

ATP ADP

Acetil-CoA

Acetoocetna kislina

6

7

Aceton

CO2

-Hidroksi-butiril-CoAβ

8NADH + H+

NAD+

Krotonil-CoAH O2

9

NADH + H+ NAD+

Butiril-CoA

Acetil-CoA

Ocetna kislina11

Maslena kislina

P CoA

12 ATP

13

NAD+

NADH + H+

14

Butirilaldehid

Butanol

NAD+

NADH + H+

15

Slika 3: Metabolna pot ogljikovih hidratov v bakteriji C. acetobutylicum: (1)fosfat:acetil transferaza; (2) acetat kinaza; (3) acetaldehid dehidrogenaza; (4) etanol dehidrogenaza; (5) tiolaza; (6) acetat:CoA transferaza; (7) acetoacetat dekarboksilaza; (8) β-hidroksi-butiril CoA dehidrogenaza; (9) krotonaza; (10) butiril CoA dehidrogenaza; (11) CoA transferaza; (12) fosfat: butiril transferaza; (13) butirat kinaza; (14) butiraldehid dehidrogenaza in (15) butanol hidrogenaza (Awang s sod., 1988). 4.1.3 TVORBA PRODUKTOV

4.1.3.1 Tvorba kislin Glavni encim za razgradnjo piruvata je piruvat ferodoksin oksidoreduktaza. Produkti te reakcije so acetil-CoA, ogljikov dioksid in reduciran ferodoksin. Acetil-CoA se delno spremeni v acetat in delno butirat. Razmerje, v katerem sta ta dva produkta oblikovana, variira do neke stopnje. Tvorba acetata vključuje encime fosfotransacetilaze in acetat kinaze, medtem ko je produkcija butirata katalizirana z dodatnim delovanjem tiolaze, L(+)-3-hidroksibutiril-CoA dehidrogenaze, fosfotransbutirilaze, butiril-CoA dehidrogenaze in butirat kinaze. Produkcija obeh kislin je povezana z ATP sintezo v reakcijah kinaze. Ureditev C4-komponent se začne s sintezo dveh molekul acetil-CoA. Acetoacetil-CoA se odda. Ta reakcija je katalizirana s tiolazo. Acetoacetil-CoA se nato pretvori v butiril-CoA ob delovanju


3-hidroksibutiril-CoA dehidrogenaze, krotonaze in butiril-CoA dehidrogenaze. Končni koraki tvorbe butirata iz butiril-CoA so katalizirani s fosfotransbutirilazo in butirat kinazo. NADH, proizveden ob reakciji z 3-fosfogliceraldehid dehidrogenazo, je oksidiran v reakciji ß-hidroksibutiril-CoA in butiril-CoA dehidrogenaze. To se odra�a v naslednjem redoks ravnote�ju:

GLUKOZA + 2 NAD+ 2 PIRUVAT + 2 NADH + 2 H+

2 PIRUVAT 2 ACETIL-CoA +2 CO2 + 2 H

2 ACETIL-CoA + 2 NADH + 2 H+ BUTIRAT + 2 NAD+

GLUKOZA BUTIRAT + 2 CO2 + 2 H2

Ko se NADH iz zgornje enačbe oksidira in sprosti H2, se ves acetil-CoA ne spremeni v butirat. To je razlog, zakaj je acetat dodaten produkt poleg butirata (Dürre in Bahl, 1996).

4.1.3.2. Tvorba topil Urejevalni mehanizmi, ki kontrolirajo prehajanje iz acidogene faze do faze nastanka topil �e niso popolnoma znani. Veliko je vplivov v okolju, ki spro�ijo tvorbo butanola ali pa so potrebni, za potek tvorbe (Awang s sod., 1988). Vplivi, ki so potrebni za tvorbo so: nizek pH, prese�ek substrata, meja koncentracije butirata in/ali acetata ter primerne sestavine, ki omejujejo rast, kot naprimer fosfat ali sulfat. Pred začetkom faze nastanka topil se na novo sintetizirajo encimi. Tvorba butanola je katalizirana z butiraldehid dehidrogenazo in butanol dehidrogenazo iz butiril-CoA. Oba encima dajeta prednost koencimu NADH pred NADHP. Butiril-CoA pa je bolj�i substrat kot acetil-CoA (Dürre in Bahl , 1996). V zadnjih poročilih je bilo zapisano, da ogljikov dioksid lahko učinkovito poveča butanolno bioprodukcijo. Najbolj učinkovito bioprodukcijo butanola pa dose�emo z me�anjem med acidogeno fazo (za povečanje rasti bakterij in tvorbe kislin), ki ji sledi fermentacija med fazo nastanka topil. Ena osnovnih omejitev v bioprodukciji butanola je strupenost topila za bakterijo. Previsoka koncentracija butanola lahko povzroči popolno inhibicijo mikrobiolo�ke aktivnosti. Toksični vplivi so posledica poru�itve membranskega delovanja v interakciji s celičnimi membranskimi elementi (Awang s sod., 1988). 4.2 2,3-BUTANDIOL Največ �tudij je bilo narejenih z uporabo bakterij iz dru�ine Enterobactericeae.


Slika 4: Metabolna pot produkcije 2,3-butandiola iz glukoze (Madox, 1996). 4.2.1 NASTANEK PIRUVATA, PRETVORBA PIRUVATA V ACETOLAKTAT IN REAKCIJE PRETVORBE ACETOLAKTATA V ACETOIN Iz glukoze med glikolizo nastane piruvat. Obstajajo tudi teoretične �tudije o organizmih, v katerih bi bila vključena pot heksoze monofosfata. Pretvorba pentoz v piruvat poteka po poti pentoze fosfata. Katabolični encim α-acetolaktat katalizira kondenzacijo in dekarboksilacijo dveh piruvatnih molekul v acetoacetat. Velikost encima je 60 kDa in optimum delovanja je pri pH 6. Acetolaktat dekarboksilaza katalizira dekarboksilacijo acetolaktata do acetoina. Produkt stereokemijske reakcije je D(-) acetoin. Ta se lahko ob prisotnosti kisika v mediju neencimsko oksidira do diacetila, ali encimsko reducira do 2,3-butandiola. Acetolaktat reduktaza kot induktor potrebuje acetat (Maddox, 1996). 4.2.2 PRETVORBA ACETOINA V 2,3-BUTANDIOL Končno reakcijo tvorbe 2,3-butandiola katalizira encim 2,3-butandiol dehidrogenaza. V bakteriji A. aerogenes redukcijo diacetila v acetoin in acetoin v 2,3-butandiol katalizira isti encim. Vendar je prva redukcija ireverzibilna in zadnja reverzibilna. Kot prej�nji encimi je butandiol dehidrogenaza inducirana z acetatom. Obratno se pri oksidaciji 2,3-butandiola v acetoin acetat obna�a kot inhibitor. Ta inhibicija nara�ča s padanjem pH (Maddox, 1996).


4.2.3 MEHANIZEM NASTANKA RAZLIČNIH STEREOIZOMEROV D(-), L(+) in mezo-izomere 2,3-butandiola proizvajajo različni organizmi. Razmerje nastalega izomera pa je odvisno od organizma. Za produkcijo različnih stereoizomerov so bili postavljeni trije modeli. Prvi, ki sta ga razvila Taylor in Juni l.1960 uporabljal pa Voloch s sod. l. 1983, temelji na delovanju racemaze acetoina.

Slika 5: Model, ki sta ga razvila Taylor in Juni. E1: D(-) dehidrogenaza; E2: L(+)-dehidrogenaza; E3: racemaza acetoina. (Madox, 1996). Produkt stereokemične reakcije acetolaktat dehidrogenaze je vedno D(-) acetoin in ta se lahko reducira v D(-) butandiol s stereospecifično D(-) butandiol dehidrogenazo. Stereospecifična L(+) butandiol dehidrogenaza po drugi strani pretvarja D(-) acetoin v mezo-butandiol. Racemaza acetoina pretvarja D(-) acetoin v L(+) acetoin, ki je nato reduciran v L(+) butandiol in/ali mezo-butandiol z L(+) in/ali D (-) butandiol dehidrogenazo. Bakterija K. oxytoca npr. vsebuje racemazo acetoina in L(+) butandiol dehidrogenazo in zato lahko formira L(+) in mezo-butandiol. Obratno vsebujejo neketeri rodovi Bacillus racemazo acetoina in D(-) butandiol dehidrogenazo in producirajo D(-) in mezo- butandiol, ne pa L(+) butandiol. Pomanjkljivost v tem modelu je, da prisotnost racemaze acetoina �e ni bila eksperimentalno demonstrirana. Tako sta Hohnbentz in Radler l. 1978 predlagala drugi dve poti za pridobitev različnih spektrov izomerov 2,3-butandiola. (1) majhna količina L(+) acetoina nastane s stereospecifično acetolaktat dekarboksilazo (2) L(+) acetoin nastane iz diacetila Drugi model je postavil Ui s sod. l 1986 za rod Bacillus. Temelji na eksperimentalno dokazani prisotnosti encima diacetil reduktaze (Maddox, 1996).


Slika 6: Model, ki ga je razvil Ui s sod. Za produkcijo različnih stereoizomerov z bakterijo B. polymyxa. E1: NADH-odvisna D(-)butandiol dehidrogenaza; E2: NADPH-odvisna diacetil reduktaza (Madox, 1996). Na ta način diacetil nastane neencimsko iz acetolaktata in/ali D(-) acetoina. Potem se uspe�no reducira do D(-) acetoina in D(-) butandiola z NADH-odvisno D(-) butandiol dehidrogenazo. L(+) acetoin nastane iz NADH-odvisne diacetil reduktaze, vendar ta encim ne more reducirati acetoina v 2,3-butandiol. Tako D(-) butandiol dehidrogenaza reducira L(+) acetoin v mezo-butandiol. Ui s sod. l. 1984 ni uspel demonstrirati prisotnosti acetoinske ali butandiolske racemaze. Končno je Ui s sod. l. 1984 postavil model za bakterijo K. pneumoniae, ki ne potrebuje racemaze acetoina. V tem modelu se uporabljajo trije encimi butandiol dehidrogenaze, tako da se D(-) acetoin uspe�no pretvori v mezo- butandiol, L(+) acetoin in L(+) butandiol.

Slika 7: Tretji model, ki predstavlja produkcijo različnih stereoizomerov z bakterijo K. pneumoniae. E1: mezo-butandiol dehidrogenaza; E2: mezo-butandiol dehidrogenaza; E3: L(+)-butandiol dehidrogenaza (Maddox, 1996).


Jasno je torej , da je za bakterijo, ki proizvaja samo D(-) izomer, potrebno samo ena D(-) butandiol dehidrogenaza. Za produkcijo L(+) in/ali mezo-izomera pa mora biti prisoten vir L(+) acetoina, predvsem zaradi stereospecifičnosti butandiol dehidrogenaze (Maddox, 1996).

5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 5.1 PRIPRAVLJALNI POSTOPKI 5.1.1 PRIPRAVA BIOKULTURE Biokultura je ena izmed najpomembnej�ih parametrov v biotehnolo�kem procesu, zato moramo biti �e pred njim pozorni na skrben izbor in pripravo biokulture. Priprava aktivne industrijske biokulture vključuje postopke, s katerimi trajno ali začasno shranjeno biokulturo privedemo v stanje, v katerem je direktno uporabna za inokulacijo v industrijskem bioprocesu. S prvim korakom �elimo predvsem izbrati industrijsko biokulturo, katere izbira temelji na izbiri mikroorganizmov in iskanju aktivnosti. Po izolaciji izbranega mikroorganizma moramo zagotoviti čim bolj�o pre�ivelost in fenotipsko ter genotipsko identično kopijo biokulture. To dose�emo z začasnim ali trajnim shranjevanjem in revitalizacijo (Smole -Mo�ina, 1996).

5.1.1.1 Izolacija biokultur pri proizvodnji butanola Proizvodnjo butanola vodimo izključno z bakterijo Clostridium acetobutylicum (Perdih, 1992). Bakterijo C. acetobutylicum lahko izoliramo iz različnih naravnih virov: iz zemlje, korenin stročnic, p�enice, r�i, koruznih stor�ev in tudi iz različnih odpadkov. Večina izolacijskih protokolov temelji na postopku, ki ga je opisal Weizmann (slika 8), s tem da so se določene tehnike do danes izpopolnile. Vir bakterije C. acetobutylicum lahko maceriramo v sterilni vodi ali damo direktno na izolacijski medij med samo inokulacijo. Mediji so različni; �krobni, koruzni, krompirjev-glukozni, uporabljajo pa se tudi različni sintetični mediji. Temperaturni �ok izvedemo z 10 minutno imerzijo kulture v vroči vodni kopeli, katere temperatura je 80ºC ali pa z imerzijo v vreli vodi 1 do 2 minuti. Temperaturni �ok ubije nesporulentne kontaminente in inducira razvoj vegetativnih celic iz spor. Za to je potrebna iniciacijska inkubacija 4 do 5 dni. S tem smo dosegli revitalizacijo bakterije C. acetobutylicum. Kasnej�e precepljanje nam omogoča izolacijo dobre biokulture in dobro inokulacijo (Awang s sod., 1988).


Vir inokuluma izolacijski medij Temperaturni �ok Inkubacija 4-5 dni pri temperaturi 37°C Subkulturo cepimo na sve�, izolacijski medij Temperaturni �ok Inkubacija 24 h pri temperaturi 37°C Dvakratno cepljenje subkulture na izolacijski in produkcijski medij Analiza zadnje subkulture na butanol po 5-6 dneh Selekcija najbolj�ega proizvajalca butanola Temperaturni �ok Odvzem kulture in kolonij, inkubacija Inokulacija proizvodnega medija, izpostavitev 4 subkultur pri temperaturi 37°C za 24 h Analiza na proizvodnjo butanola Slika 8: Protokol izolacije bakterije C. acetobutylicum iz naravnih virov (Awang s sod., 1988).


5.1.1.2 Priprava inokuluma Revitalizaciji sledi stopnja, ki vključuje stopenjsko pripravo inokuluma od revitalizirane laboratorijske biokulture do inokulacije industrijskega bioreaktorja. Namen teh aktivnosti je proizvesti dovolj veliko količino biomase, kar pomeni, da sku�amo doseči maksimalno produktivnost bioprocesa. Z vnosom biomase, ki je praktično lahko �e enaka količini biomase v proizvodni fazi, močno skraj�amo začetno fazo biokulture v bioreaktorju in s tem pripomoremo k bolj�i izkori�čenosti proizvodnih kapacitet ter s tem tudi k bolj�i produktivnosti. Volumen inokuluma je odvisen od večih parametrov. Če so v produkcijskem mediju prisotni inhibitorji rasti, kot na primer pri butanolu, uporabimo velike inokulume. Da bi preprečili razredčevanje, ali kakr�nekoli spremembe sestave medija, biomaso inokuluma predhodno koncentriramo s centrifugiranjem ali sedimentacijo (Smole -Mo�ina, 1996).

5.1.1.3 Pomen sterilnosti Pri pripravi na biotehnolo�ki proces moramo biti posebej pozorni na sterilnost delovanja in postopkov. Sterilnost je zagotovitev stanja brez prisotnosti kateregakoli mikroorganizma oziroma samo s prisotnostjo produkcijskega mikroorganizma. Tak�ne pogoje je v industriji včasih te�ko doseči. Glede na to, kje so najpogostej�i vzroki te�av pri zagotavljanju sterilnosti, so izdelali različne sezname kritičnih mest v bioreaktorjih, ki so ključnega pomena pri zagotavljanju sterilnega obratovanja. Tako moramo biti posebej pozorni na: sterilno izvajanje inokulacije, dodajanj med procesom, tesnenje bioreaktorja in vseh priključkov, vstop in izstop zraka iz fermentorja, me�ala, tesnenje osi, vzorčenje, posegov ob energetskih motnjah (Rade�, 1992). 5.1.2 PRIPRAVA SUBSTRATOV

5.1.2.1 Priprava substratov za butanol Bakterija C. acetobutylicum lahko izkori�ča nekatere heksoze, pentoze ter njihove �tevilne oligomere in polimere, razen celuloze. Le ta ima kompleksno sestavo in je za bakterijo C. acetobutylicum nedostopna. Vir ogljika so skoraj vsi sladkorji, melasa, sulfitna lu�nica, hidrolizati rastlin, �krob, predvsem pa �itarice in otrobi. Sirotka predstavlja v mlečni industriji velik problem in je odpadek pri sirarstvu. Vsebuje 4 do 5 % laktoze, ki jo je bakterija C. acetobutylicum sposobna direktno fermentirati. Koncentracije substratov naj bi bile med 3 in 8 %. Med viri du�ika so najpomembnej�e aminokisline in proteini. Amonijeve soli lahko le delno krijejo potrebe po du�iku. Vsebnost topnih fosfatov naj bi bila pod 1 g/l, pomembna pa je zadostna količina kalija in vitaminov. Proizvodnja butanola ima, gledano iz ekonomskega vidika, dve �ibki točki :ceno surovin in ceno izolacije. Prva je posledica nizkih dobitkov produktov, druga pa njihove nizke koncentracije. Zato bi imela proizvodnja perspektivo le pri predelavi odpadnih raztopin (sirotke, sulfitne lu�nice), ki bi jih dobili zastonj (Perdih, 1992).


V proizvodnji butanola so za�eljeni in iskani drugi alternativni viri. Med njimi so tropine, ki vsebujejo veliko fruktoze, glukoze in ostale fermentativne produkte. Ker je bakterija C. acetobutylicum anaerobna sporogena bakterija, se poslu�ujemo anaerobnega procesa, kjer pa lahko nastopi pomanjkanje CO2. S prepihavanjem z du�ikom ne izpihamo le kisika, temveč tudi CO2. Zato je koristno v hranilni medij dodati vsaj toliko hidrogenkarbonata, kolikor ga je v pitni vodi; ali pa v samem postopku medij prepihavati z me�anico N2 in CO2 (Awang s sod., 1988). Substrat po sterilizaciji hranimo v CO2 atmosferi (Perdih, 1992). 5.1.2.2 Priprava substratov za 2,3-butandiol Najcenej�i in najbogatej�i vir surovin za fermentacijo je lignoceluloza, ki vsebuje celulozo in hemicelulozo. Celulozo dobimo iz lesa in industrijskih odpadkov, pri čemer moramo les �e obdelati s paro, da se sprostita ti dve komponenti. Bakterije Klebsiella oxytoca in Bacillus polymyxa fermentirajo sladkorje, ki jih izoliramo iz hemiceluloze. Bakterija K. oxytoca lahko fermentira glukozo, manozo, galaktozo, ksilozo, arabinozo, celobiozo in laktozo, medtem ko bakterija B. polymyxa fermentira ksilan, inulin in �krob. Bakteriji ne moreta razgraditi celuloze in hemiceluloze, zato je predhodno potrebno izvesti hidrolizo substratov. Tudi �krob je zelo primerna surovina za fermentacijo. Hidrolizirajo ga amilaze: α-amilaza, pululanaza in glukoamilaza (De Mas, 1988). Prav tako kot pri proizvodnji butanola lahko pri proizvodnji 2,3-butandiola za substrat uporabimo sirotko, ki je stranski produkt pri proizvodnji mlečnih izdelkov. Le da pri fermentaciji laktoze uporabljamo drugo bakterijo, K. oxytoca (Maddox, 1996).

Eden izmed načinov priprave hemiceluloze in celuloze je sočasen proces fermetacije in razgradnje sladkorjev, pri čemer uporabimo za hidrolizo substratov bakterijo Trichoderma harzianum, za fermentacijo prostih sladkorjev pa bakterijo Klebsiella pneumoniae (Maddox, 1996). Pri kislinski hidrolizi najpogosteje uporabljamo HCl, H2SO4 in HF. Močnej�a kot je kislina, večja je stopnja razgradnje. Za obdelavo hemiceluloze so zaradi njene strukture in nizke stopnje polimerizacije dovolj �e mili pogoji. Ksiloza, ki je glavna komponenta hemiceluloze, se razgradi v furfural, glukoza in hemiceluloza pa v hidroksimetilfurfural. Ti produkti razgradnje so za fermentacijo kvasovk toksični, zato furfural in lignin odstranjujemo s pomočjo pare.

Kislinsko hidrolizo lahko izvajamo na dva načina: ! visoka temperatura in tlak, uporaba razredčene kisline ! nizka temperatura in tlak, uporaba koncentrirane kisline

Problem pri kislinski hidrolizi je homogenost substratov, saj se hemiceluloza la�je hidrolizira kot celuloza. To pomeni, da so nekateri sladkorji �e hidrolizirani, medtem ko se celuloza �e razkraja v monomere. Posledica tega so toksični produkti, kot je furfural. Problem kislinske hidrolize je tudi v tem, da se sprostijo vodotopne snovi lignina, kot so derivati vanilila in siringila, le ti pa so inhibitorji nastanka 2,3-butandiola (De Mas, 1996).

Drug primeren način razgradnje surovin je encimska hidroliza. Njena prednost je, da dobimo ogljikove hidrate, ki vsebujejo malo toksičnih snovi. Vendar pa hitrost procesa omejuje dostop encimov do celuloznih substratov. Vzrok za to je matriks lignina, ki deluje kot fizična ovira,


prispeva pa tudi kristaliničnost in velikost por same celuloze. Zato je bolje, da se lignoceluloza obdela �e pred encimsko hidrolizo. Optimalni pogoji pri encimski hidrolizi so pH vrednost 5,0 in temperatura 50oC, pri kombinaciji fermentacije in hidrolize pa pH 6,5 in temperatura 30oC. Stopnja proizvodnje je pri kombiniranem procesu za 30 do 40% vi�ja kot pri posameznih procesih (Maddox, 1996). 5.2. POTEK BIOPROCESA 5.2.1 PARAMETRI, KI VPLIVAJO NA RAST

5.2.1.1 Temperatura Običajno je optimalna temperatura za razmno�evanje bakterij od 30ºC do 37oC. Pri proizvodnji butanola se temperatura bioprocesa giblje med 33ºC in 37°C (Dürre in Bahl, 1996). Pri fermentaciji z bakterijo K. pneumoniae pomeni povi�anje temperature iz 33ºC na 37oC zmanj�anje bioprodukcije 2,3-butandiola za 66%. Bakterija B. polymyxa, ki raste na sirotki ima optimalno temperaturo pri 35oC, pri temperaturi 40oC pa je produkcija 2,3-butandiola dosti manj�a (Maddox, 1996).

5.2.1.2 pH

pH vrednost pri odprtem bioprocesu proizvodnje butanola je odvisna od izbire seva bakterije C. acetobutylicum. Giblje se med 4,3 in 5 (Dürre in Bahl, 1996). Optimalen pH za razmno�evanje bakterije K. oxytoca je 5,2, pod pH 4,2 pa bakterija ne raste. Bakterija K. aerogenes pa najbolje raste pri pH 6,2 (Maddox, 1996).

5.2.1.3 Kisik

Bakterija C. acetobutylicum se razmno�uje v anaerobnih pogojih (Perdih, 1992). 2,3-butandiol je produkt anaerobne fermentacije. Kljub temu odsotnost kisika ni nujno potrebna, saj so bakterije K. pneumoniae fakultativni anaerobi. Tako lahko z zračenjem le �e pospe�imo proizvodnjo 2,3-butandiola. S količino dovedenega kisika v bioreaktor lahko uravnavamo razmerje produktov. Pri zadostni oskrbi s kisikom zavzemata večji del produktov acetat in 2,3-butandiol, v primeru zmanj�anja količine kisika pa prevladuje nastanek etanola in laktata. Problem so tudi laktat, acetat in etanol, saj s svojo inhibicijo negativno vplivajo na rast celic in nastajanje 2,3-butandiola. Prav zaradi tega je potrebno zmanj�ati količino stranskih produktov, ki v večini primerov zavirajo nastanek 2,3-butandiola. Pri tem si pomagamo s kontrolo oskrbe s kisikom, kar dose�emo z različno stopnjo zračenja in s tresenjem kulture (Maddox, 1996).


Graf 1: Vpliv prisotnosti kisika na nastanek različnih produktov (Maddox, 1996).

V zaprtih procesih imamo dve tipični fazi: v prvi je količina kisika zadostna za vzdr�evanje visoke vrednosti DOT (ang. dissolved oxygen tension), tako da količina biomase raste eksponentno. V tem času se 2,3-butandiol ne proizvaja. Biomasa preide v linearno fazo rasti, takrat ko postanejo zaloge kisika omejene. V tam primeru je vrednost DOT manj�a od 3% nasičenja. Ko koncentracija biomase naraste toliko, kolikor ji dovoljuje kisik, pade vrednost DOT na nič (Maddox, 1996).

5.2.1.4 Začetna koncentracija sladkorja Vpliv začetne koncentracije sladkorja v zaprtih procesih je odvisen od sestave medija. Npr.: v tehničnih medijih se dvig koncentracije odrazi v povečanju koncentracij ostalih sestavin, nekaterih med njimi tak�nih z inhibicijskim delovanjem, zato koncentracijo sladkorja omejimo. V sintetičnem mediju, kjer nimamo prisotnih inhibitornih sestavin, se lahko fermentira do 200 g/L sladkorja. Maksimalna produktivnost 2,3-butandiola je pri koncentraciji sladkorjev okoli 100 g/L. Pri vi�jih koncentracijah produktivnost pada, saj zahteva celotna kultura več kisika (Maddox, 1996).

5.2.1.5 Vpliv acetata in ostalih stranskih produktov Pri enterobakterijah vplivajo nizke koncentracije acetata (od 1 do 5 g/L) pozitivno na izkoristek sladkorja in produkcijo 2,3-butandiola. Pri visokih koncentracijah se hitrost rasti zmanj�a zaradi nizkega pH, do katerega pride zaradi neraztopljene ocetne kisline (Maddox, 1996).


Tabela 4: Stranski produkti, ki pri določeni koncentraciji z inhibicijo vplivajo na razmno�evanje mikroorganizmov (Maddox, 1996). STRANSKI PRODUKT c [g/L] VRSTA Laktat 3 � 15 K. oxytoca > 20 B. polymyxa Etanol 5 � 60 E. aerogenes 5 � 60 B. polymyxa Aceton > 20 B. polymyxa

5.2.1.6 Vpliv produktov na bioproces Butanol je v vi�jih koncentracijah za bakterijo C. acetobutylicum toksičen, zato se zaprti bioproces dandanes skoraj več ne uporablja. Prednost odprtega bioprocesa pa je v tem, da omogoča stalen odvzem butanola in onemogoči vpliv njegove toksičnosti (Dürre in Bahl, 1996). 2,3-butandiol je mnogo manj toksičen za mikroorganizme kot etanol in butanol. Učinek toksičnosti se bolj odra�a na samem razmno�evanju mikroorganizmov kot pa na produkciji 2,3-butandiola. Pri koncentraciji 2,3-butandiola nad 65 g/L se razmno�evanje bakterije K. oxytoca ustavi, negativno pa vpliva tudi na razmno�evanje bakterije B. polymyxa pri koncentraciji nad 60 g/L. Na lastno produktivnost pa 2,3-butandiol nima vpliva niti pri koncentraciji 100 g/L (Maddox, 1996).

5.2.1.7 Rastni limitni faktorji pri proizvodnji butanola Pri proizvodnji butanola ni skoraj nobenega rastnega limitnega faktorja, ki bi sam vplival na produkcijo butanola z bakterijo C. acetobutylicum. Fosfat in sulfat sta edina, ki omogočata manj intenzivno razmno�evanje mikroorganizmov in tvorbo večjih količin produktov. Uporaba fosfata kot rastnega limitnega faktorja je pri odprtem bioprocesu podvojila produktivnost v primerjavi z zaprtim bioprocesom (Dürre in Bahl, 1996).


Tabela 5: Koncentracija produktov in poraba substratov pri dvostopenjskem zaprtem bioprocesu, s kulturo C. acetobutylicum in fosfatom kot rastnim limitnim faktorjem (Dürre in Bahl, 1996). Faza 1 Faza2 Procesni parameter pH 4.3 4.3 Temperatura (°C) 37 33 Hitrost razredčevanja (h-1) 0.125 0.03 Produkti (gl-1) Butanol 3.6 12.6 Aceton 1.6 4.8 Etanol 0.3 0.8 Butirat 1.3 0.8 Acetat 0.4 0.5 Poraba substratov (%) 40 99.7 Izkoristek (g prod./g gluk.) 0.25 0.34 Produktivnost (g prod.l-1h-1) 0.08 0.44 5.2.2 POTEK FERMENTACIJE 5.2.2.1 Fermentacija pri butanolu

Potek bioprocesa ni odvisen le od pripravljalnih postopkov, temveč tudi od kontrolnih mehanizmov in same izbire bioreaktorja. Model bioreaktorja mora biti zasnovan tako, da omogoča dober fermentacijski proces in hkrati nizke stro�ke procesa. Fermentacija butanola spada med tako imenovano ABE fermentacijo (aceton/butanol/etanol fermentacija) (Awang s sod., 1988). Več kot petdeset let se je za fermentacijo butanola uporabljal zaprti bioproces, pri katerem na začetku dodamo vse reaktante, na koncu pa iz bioreaktorja odvzamemo produkte (Raspor, 1992). Fermentacija ogljikovih hidratov z bakterijo C. acetobutylicum v zaprtem sistemu poteka v treh stopnjah. V prvi stopnji nastane maslena kislina, značilna je hitra rast in padec pH iz 6,0 na 4,5. V drugi stopnji pride do pretvorbe kislin in ostalih ogljikovih hidratov v butanol. V zadnji stopnji, stacionarni fazi pa mikrobna aktivnost začne padati, pojavijo se �e toksični efekti koncentracij nastalih produktov (Dürre in Bahl, 1996). Zaprti bioproces traja od 48 do 72 ur, pri temperaturi od 30ºC do 37°C. Dostop kisika je potrebno preprečiti, zato smo substrat po sterilizaciji hranili v CO2 atmosferi. Me�anje ne sme biti premočno, da ne po�koduje celic. Pri tem dobimo iz 100 kg �kroba 11 kg acetona, 22 kg butanola in 3 kg ostalih snovi. Topila nato izoliramo z destilacijo, vendar povzročajo nizke koncentracije visoke stro�ke večstopenjskega rektifikacijskega postopka. Klostridij prenese namreč le okoli 1% butanola v raztopini (Perdih, 1992). Kljub temu, da so razvili določene mutante oziroma seve bakterije C. acetobutylicum, ki so bolj tolerantni na vi�je koncentracije butanola, to �e vedno predstavlja eno prvih omejitev, ki daje procesu noto neučinkovitosti (Dürre in Bahl, 1996). Drugo omejitev predstavlja cena substratov (koruzni �krob), saj je ta narasla do točke, kjer so stro�ki celotnega procesa večji kot dobiček, dobljen s produkti (Awang s sod., 1988). Izkoristek


topljencev je le 0.38 g na gram glukoze. To je maksimum, ki pa ni bil vedno dose�en (Dürre in Bahl, 1996). Zadnjo omejitev pa predstavljajo visoki stro�ki energije zaradi zaključnih postopkov (Awang s sod., 1988). Vse te omejitve sicer lahko zmanj�amo z uporabo odpadnih raztopin (sirotke, sulfitne lu�nice,...), ki bi jih dobili zastonj, z načrtno modeliranim bioreaktorjem in novimi separacijskimi metodami (Perdih, 1992, Dürre in Bahl, 1996). Pa vendarle se klasični, tradicionalni, zaprti bioproces za pridobivanje butanola skoraj ne uporablja več (Dürre in Bahl, 1996). Da bi katerikoli drug proces postal ekonomsko zanimiv, mora doseči vsaj tolik�no koncentracijo butanola, kot ga dose�emo pri zaprtem bioprocesu. Zato je bilo veliko raziskav narejenih v smeri pogojev, limitirajočih rastnih faktorjev, predvsem pa sprotnemu odstranjevanju produktov. Prihodnost proizvodnje butanola se ka�e v dvostopenjskem odprtem bioprocesu (Dürre in Bahl, 1996). Med samim bioprocesom v bioreaktor dodajamo reaktante in odvzemamo produkte, tako da se volumen vsebine v bioreaktorju s časom ne spreminja (Pavko, 1996). Proces ima dve fazi. V prvi celice rastejo v tolik�ni meri, da se lahko spro�i mehanizem tvorbe produktov. V drugi fazi pa pride do pretvorbe sladkorjev v produkte. Fermentacijski čas skraj�amo tako, da v prvi fazi zmanj�amo nastajanje kislin in z določenimi znanimi parametri dr�imo celice v drugi fazi konstantno in čim dlje. Odprti bioproces ima veliko prednosti pred zaprtim. Za dolgo produkcijsko dobo je potrebna le ena serija inokulirane kulture. Mrtva sezona, ki vključuje polnjenje, sterilizacijo in či�čenje opreme se zmanj�a. Toksičnih učinkov butanola na bakterijo C. acetobutylicum praktično ni. Pomembno pa je predvsem, da se poveča produktivnost omenjenega bioprocesa. Napredne tehnike fermentiranja pri proizvodnji butanola vključujejo celično reciklacijo in celično imobilizacijo. Imobilizirane celice so ujete v trden medij ali gel (Dürre in Bahl, 1996). S tak�nim postopkom dose�emo vi�je koncentracije butanola, aerobni pogoji v matriksu so la�je dose�eni, hkrati pa dose�emo manj�o kontaminacijo končne brozge s celično biomaso (Awang s sod., 1988). �e uporabljeno celično biomaso pa lahko vodimo nazaj v bioproces s postopkom celične reciklacije (Dürre in Bahl, 1996). Z recikla�o biomase med odprtim načinom gojenja dose�emo večjo stabilnost sistema, rezultat se ka�e tudi v večji produktivnosti (Pavko, 1996).


Slika 9: Dvostopenjski odprti bioproces z zaključnimi postopki (Dürre in Bahl, 1996).


5.2.2.2 Fermentacija pri 2,3-butandiolu Teoretični produkti: Nastanek 2,3-butandiola iz glukoze in ksiloze: glukoza # 2CO2 + NADH2 + 2ATP + 2,3-butandiol ksiloza # 5/3CO2 + 5/6NADH2 + 5/3ATP + 5/6 2,3-butandiol Iz celotnega ogljika, ki ga dobimo iz sladkorja, se porabi 2/3 za 2,3-butandiol in 1/3 za ogljikov dioksid. Za proizvodnjo 2,3-butandiola je najprimernej�a tehnika fermentiranja s polodprtim sistemom. To je proces fermentacije s stalnim dotokom substrata, med katerim kontroliramo stopnjo rasti in porabo substrata. Prednost pred zaprtim sistemom je, da primerna izbira pretoka in koncentracije limitnega substrata omogoča kontrolo procesa. Danes uporabljamo polodprti sistem z namenom, da povečamo koncentracijo končnega produkta in izbolj�amo produktivnost bioreaktorja. 2,3-butandiol nima na lastno produkcijo nikakr�nega vpliva, pomembno pa je, da koncentracija sladkorja ne presega 20 g/L, saj bi to povzročilo inhibicijo proizvodnje 2,3-butandiola. To koncentracijo moramo čez celoten potek bioprocesa vzdr�evati tako dolgo, dokler produkcija 2,3-butandiola močno ne pade. Prav tako je potrebno zmanj�evati stopnjo vnosa kisika, saj so zahteve po njem vedno manj�e. Polodprti sistem fermentacije sta pri svoji raziskavi uporabila Olson in Johnson. Kot biokulturo sta uporabila bakterijo A. aerogenes na sintetičnem goji�ču na osnovi glukoze. Napajalni substrat je vseboval glukozo (450 g/L), fosfate in du�ik v enakem razmerju kot glukoza na goji�ču. Začetna koncentracija sladkorja 100 g/L je po končanem procesu padla na 30g/L. Proizvodnja 2,3-butandiola je trajala 108 ur, s tem da je bila najvi�ja dose�ena koncentracija 99 g/L 2,3-butandiola. Dosegla sta produktivnost 2,3-butandiola 0,91 g/L, kar je precej visoko v primerjavi s produktivnostjo v zaprtem sistemu, ki je zna�ala 0,66 g/L (Maddox, 1996).

Za izbolj�anje produktivnosti bioreaktorjev in s tem povečanje ekonomičnosti procesa, je potrebno izpopolniti samo tehniko, kot npr.: spremembe pri stalnem dotoku hrane, fiksiranje celic, recikliranje celic,� Pirt in Callow sta pri raziskavi o vplivih iz okolja uporabila kulturo v odprtem sistemu. Na ta način sta dosegla zelo dobro produktivnost bioreaktorja, mnogo bolj�o od katerekoli v zaprtem sistemu. Pri zaprtem sistemu nastopa problem procesa zaradi dolgega časovnega zamika od inokulacije do maksimalne produktivnosti, medtem ko pri odprtem sistemu traja maksimalna produktivnost dalj časa. Vendar so optimalni pogoji, ki jih potrebujemo za maksimalno rast, drugačni od tistih, ki so za rast sploh potrebni. Zato sta uporabila dvostopenjsko odprti sistem, kjer so bili v prvi stopnji pogoji optimalni za produkcijo biomase, v drugi stopnji pa za produkcijo 2,3-butandiola. Ugotovljeno je bilo, da sta rast celic in produkcija 2,3-butandiola nezdru�ljivi in da bi visoko produktivnost bioreaktorja dosegli z uporabo tehnik recikliranja in fiksiranja celic. Recikliranje celic je tehnika (uporabljamo jih v odprtem sistemu za proste celice), pri kateri ločimo celice, ki odtekajo s centrifugiranjem ali z mikrofiltriranjem in jih nato vrnemo nazaj v proces fermentiranja. Na ta način dose�emo zelo visoko koncentracijo biomase in hkrati so lahko �e dose�eni optimalni pogoji za produkcijo 2,3-butandiola. Shazer in Speckman sta s to tehniko dosegla vi�jo produktivnost 2,3-butandiola (za substrat sta uporabila sirotko in za biokulturo bakterij B. polymyxa) od tiste, dobljene s tradicionalnim zaprtim sistemom (Maddox, 1996).


5.3 ZAKLJUČNI POSTOPKI 5.3.1 POSTOPKI IZOLACIJE BUTANOLA Produktivnost in bolj�i izkoristek topljencev nista odvisna le od izbire substrata, dobre biokulture in skrbno načrtovanega bioprocesa, temveč tudi od različnih, dobro izbranih separacijskih metod. Butanol pa ni edini produkt, ki nastane s pomočjo fermentacije različnih substratov. Zato ga je od prisotnih kislin in drugih snovi potrebno ločiti. Tabela 6: Snovi, ki jih bakterija C. acetobutylicum tvori iz glukoze (Perdih, 1992).

PRODUKT KONCENTRACIJA (mol/100 molov glukoze)

Aceton 22 n-butanol 56 Etanol 7 Maslena kislina 4 Ocetna kislina 14 3-hidroksi-2-butanon 6 CO2 221 H2O 135

Pridobivanje butanola z zaprtim tipom bioprocesa se, kot smo �e omenili, ne uporablja več pogosto. Eden od razlogov je tudi drag postopek separacije (destilacije). Uspe�nost odprtega procesa zagotavlja učinkovita tehnika odstranjevanja butanola �e med samim bioprocesom. Na tak način se izognemo inhibiciji s strani produkta (Dürre in Bahl, 1996). Preizku�enih separacijskih metod je veliko. Nekatere so v laboratoriju, v pilotskem bioreaktorju, izbolj�ale produktivnost samega bioprocesa, a so se za uporabo v industriji izkazale za neuporabne. Katera metoda je primernej�a za ločevanje butanola in ostalih produktov, je �e vedno odprto vpra�anje. Najbolj�e rezultate dajeta pervaporacija in ekstrakcija tekoče-tekoče. Ena pomembnih separacijskih metod je solventna ekstrakcija ali ekstrakcija tekoče-tekoče. Lahko je izvedena in situ v fermentacijski koloni ali pa zunaj nje v posebnem ekstraktorju. Lahko jo dose�emo tudi z različnimi kombinacijami destilacije in membranske separacije. Najenostavnej�a je uporaba organskih ekstrahentov (Awang s sod., 1988). Koruzno olje, parafinsko olje, kerozin in dibutil-ftalat zelo dobro ekstrahirajo butanol, hkrati pa ne vplivajo na celično razmno�evanje in aktivnost (Dürre in Bahl, 1996). Po ekstrakciji dobimo dve fazi, organsko in vodno. Učinkovitost ekstrakcije je odvisna od topnosti butanola v obeh fazah. Zato so pomembne lastnosti ekstrahenta. Za bakterijo C. acetobutylicum mora biti netoksičen, hkrati pa mora imeti nizek parni tlak in visoko afiniteto za butanol. Pomembno je, da se v vodi ne topi (Awang s sod., 1988).


Slika 9: Pridobivanje butanola in ostalih snovi (http://che.eng.ohiostate.edu/�ce_baker/proposal.html 22.12.2000). Pervaporacija je separacijska metoda, kjer molekule butanola selektivno prehajajo skozi membrano, postopku sledi odparevanje in nato kondenzacija (Awang s sod., 1988). Selektivnost procesa je odvisna od razlik v permeabilnosti komponent v membrani in parnega tlaka na obeh straneh membrane (Kogej, 1996). Ta separacijski postopek je učinkovitej�i, ker omogoča uporabo selektivnih membran za butanol in ostalih kislin, hkrati pa postopek separacije poteka z majhnimi energijskimi stro�ki (Awang s sod., 1988). Pri odprtem bioprocesu z imobiliziranimi celicami so s pomočjo pervaporacije dosegli večji izkoristek in produktivnost kot z uporabo katere druge separacijske metode (Dürre in Bahl, 1996). Uporaba drugih membransko separacijskih metod je za industrijsko uporabo velik stro�ek (Awang s sod., 1988). Odpadka proizvodnje sta vodik, ki ga lahko uporabimo za kurjavo, in destilacijska brozga, ki jo lahko koncentriramo in uporabimo kot vitaminski dodatek krmi ali biotehnolo�kim substratom (Perdih, 1992). 5.3.2 POSTOPKI IZOLACIJE 2,3-BUTANDIOLA Na tej stopnji se soočimo z dvema problemoma: visoko vreli�če 2,3-butandiola (od 180oC do 184oC) in visoka afiniteta za vodo. Predelava z destilacijo vsebuje odstranitev velikih količin vode, pri čemer dobimo debelo plast katrana, iz katere 2,3-butandiol te�ko izpari. Predlagali so solventno ekstrakcijo z etil acetatom, dietil etrom, n-butanolom ali z estrom fosforne kisline. Ti estri imajo vi�je vreli�če kot 2,3-butandiol, zelo nizko topnost v vodi in nikakr�ne te�nje po tvorbi azeotropov z 2,3-butandiolom. Po raztapljanju 2,3-butandiola z estrom ga je potrebno �e predestilirati. Na voljo je mnogo načinov, kako odstraniti 2,3-butandiol iz fermentacijske brozge. Po enem izmed njih odstranijo 2,3-butandiol z uporabo kalijevega karbonata. Brozgo najprej segrevajo do vrenja, sledi odstranjevanje trdnih delcev, nato pa ob dodatku kalijevega karbonata dobimo dve fazi. Tako dobimo v zgornji fazi 97 % 2,3-butandiola.


Mo�en pristop k predelavi produkta je, da predelajo 2,3-butandiol v metil etil keton takrat, ko je �e v fermentacijski brozgi. Keton je mo�no pridelati mnogo la�je na dva načina; z destilacijo ali s solventno ekstrakcijo. Le tega lahko uporabijo za predelavo v 2,3-butandiol ali kot gorivo (Maddox, 1996). 6. EKOLO�KI VIDIK 6.1 BUTANOL Butanol je gorljiva tekočina ali para, �kodljiv, če ga pogoltnemo, vdihnemo ali absorbiramo skozi ko�o. Učinkuje na centralni �ivčni sistem (http://www.jtbaker.com/msds/b5860.htm 5.1.2001). 6.1.1 VPLIV NA OKOLJE Če butanol pride v tla, se bo brez te�av biorazgradil, lahko pa se tudi izlu�i v podtalno vodo ali izhlapi. V primeru, ko pride v vodo, hitro izhlapi. Kadar izhlapeva v zrak, butanol reagira s fotokemično tvorjenimi hidroksi radikali. V zraku ostane 1 do 10 dni (http://www.jtbaker.com/msds/b5860.htm 5.1.2001). 6.1.2 VPLIV NA ČLOVEKA INHALACIJA: Butanoli so povzročili nekaj primerov zastrupitve v industriji zaradi njihove nizke hlapljivosti. Povzročajo dra�enje zgornjega dihalnega trakta, te�ko dihanje, ka�elj, glavobole, omotičnost in zaspanost. Lahko se absorbirajo v krvni obtok. UČINEK NA KO�O: Dra�ilo ko�e povzroča izgubo naravnih olj. UČINEK NA OČI: Hlapi so lahko moteči, povzročajo solzenje in bolečine. Brizg butanola v oči povzroči vnetje in nejasen vid. KRONIČNI UČINKI: Dalj�i kontakt s ko�o lahko povzroči izsu�itev in bolečino. Butanol lahko pri kronični izpostavljenosti povzroči izgubo sluha, vpliva na čut za ravnote�je, jetra in ledvice (http://www.jtbaker.com/msds/b5860.htm 5.1.2001).

6.1.2.1 Strupenost v okolju

LC50/96h vrednost za ribe je nad 100 mg/l. EC50/48h vrednost za ni�je rake nad 100 mg/l. 6.1.3 SKLADI�ČENJE Butanol moramo za�čititi pred mehaničnimi po�kodbami. Potrebno je skladi�čenje v hladnem, suhem, dobro zračnem prostoru, stran od področja, kjer je nevarnost ognja. Med prevozom naj bodo posode ozemljene. S tem se izognemo statični iskri. Prazne posode butanola so lahko nevarne, če ohranijo ostanek produktov (hlapi, tekočine) (http://www.jtbaker.com/msds/b5860.htm 5.1.2001).

http://www.jtbaker.com/msds/b5860.htm





6.2 2,3-BUTANDIOL 6.2.1 VPLIV NA OKOLJE 2,3-butandiol je naravna sestavina koruznega sladkorja in melase sladkorne pese. Med njuno proizvodnjo in uporabo lahko pride v okolje. V okolje lahko pride tudi med predelavo raztopin za barve in umetne smole. Če se spusti v atmosfero, se bo razgradil z reakcijo s hidroksilnimi radikali, ki nastanejo fotokemično. V vodi in zemlji se biolo�ko oksidira do acetoina in če je ta izpostavljen zraku, se sčasoma oksidira v diacetil. Vodna oksidacija s hidroksilnimi radikali je zelo počasna. Pribli�na polovična doba je 1,7 leta pri pH vrednosti vode 7. Z vodo ne reagira in se ne polimerizira. Iz vode izhlapeva počasi. Izhlapevanje iz modelne reke je trajalo pribli�no 17 dni. Je lahko nevaren, v stiku s podtalnico. V anaerobnih sedimentih naj bi se biorazgradil, po osmih tednih pa bi nastalo več kot 75 % metana (Clayton, 1982). 6.2.1 VPLIV NA ČLOVEKA Če 2,3-butandiol pride v stik z očmi in ko�o, jih moramo nemudoma sprati z veliko količino vode. Če 2,3-butandiol zau�ijemo, moramo piti vodo ali mleko. Povzroči lahko bruhanje in drisko. Lahko po�koduje ledvice in vpliva na �ivčni sistem (Richardson, 1992). 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE 7.1 BUTANOL Butanol je prisoten v jabolčnem soku, bananah, govedini, siru, breskvah in krompirju.Uporablja se kot aditiv v brezalkoholnih in alkoholnih pijačah, sladoledu, sladkarijah in kremah. Nastane kot vmesni produkt pri fermentaciji vina in pri proizvodnji piva (http://www.ag.uiuc.edu/news/articles/search.cgi?source=Hans+Blaschek). 7.2 2,3-BUTANDIOL 2,3-butandiol je hlapljiva sestavina sladke koruze. Prisoten je tudi v melasi sladkorne pese. 2,3-butandiol se v �ivilstvu malo uporablja. V literaturi se omenja kot aditiv (Afschar, 1993), vendar se v komercialne namene zelo malo uporablja, saj ga tudi zelo malo proizvedejo. 2,3-butandiol nastaja kot stranski produkt pri fermentaciji vina. V industriji je zelo cenjena kemična sestavina, uporablja se lahko kot tekoče gorivo, topilo in umetno smolo (Maddox, 1996).


8. REFERENCE Afschar, A.S. s sod. 1993. Mikrobial production and downstream processing of 2,3.butanediol. Jurnal of Biotechnology, 27, s. 317-329. Awang, G.M., Jones, G.A., Ingledew, W.M. 1988. The acetone-butanol ethanol fermentation. CRC Crit. Rev. Microbiol., Vol. 15 (Suppl. 1), s.33-67. Banič, S. ur. 1994. Mikrobiolo�ki slovar. Ljubljana, Slovensko mikrobiolo�ko dru�tvo, s. 54, 91, 112, 188. Biebl, H., Zeng, A. P., Menzel, K. 1998. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol and 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae. Appl microbiol biotechnol, 50, s. 24-29. Clayton, D.G ur., Glayton, E. F. ur. 1982. Patty`s industrial hygiene and toxicology. Vol.2. New York. A Wiley-Interscience publication, s. 3872. De Mas, C. 1988. Solvent production by microorganisms. Crit. Rev. Microbiology, Vol.7, Issue 2, s. 141-171. Dürre, P., Bahl, H.1996. Microbial production of aceton, butanol, isopropanol. V: Roerr, M. ur. Biotechnology,Vol. 6. Products of primary metabolisms. VCH, Weinheim, s. 230-257. Holt, J.G. ur. s sod. 1994. Bergey`s manual of deterninantive bakteriology. Ninth edition. Baltimore, Williams&Wilkins, s.190-191. Gerhard, W. ur. 1985. Ullmann´s encyclopedia of industrial chemistry. 5th ed.Vol A1:Deerfield Beach, FL: VCH Publishers, s. VA4 460,461. Kogej, S. 1996. Mehanski separacijski postopki. V:Raspor, P.ur. Biotehnologija, osnovna znanja. Ljubljana, Bia,d.o.o, s. 580. Madigan, M. T., Matinko, J.M., Parker, J.1997. Brock biology of microorganisms. Eight edition. New Yersey, Prentice Hall, Inc, s.723-724, 875. Madox, I.S. 1996. Microbial production of 2,3-butanediol. V: Roehr,M. ur. Biotechnology, Vol6. Products of primary metabolisms. VCH, Weinheim, s. 269-291. Pavko, A.1996. Masne bilance in načini vodenja bioprocesov. V:Raspor, P.ur. Biotehnologija, osnovna znanja. Ljubljana, Bia,d.o.o, s. 426, 432, 433. Perdih, A. 1992. Proizvodnja topil in goriv. V:Raspor, P.ur. Biotehnologija. Ljubljana, Bia,d.o.o, s. 472, 473. Rade�, T. 1992. Priprava in sterilizacija substratov. V:Raspor, P.ur. Biotehnologija. Ljubljana, Bia,d.o.o, s. 186.


Richardson, M.L ur.1992. The dictionary of substances and their effects. Vol.1. Royal sociaty of chemistry, s. 772. Saha, S.C., Bothast, R.J. 1999. Production of 2,3-butandiol by newly isolated Enterobacter cloacae. Appl microbiol biotechnol, 52, s.321-326. Sax, N.I. 1984. Dangerous properties of industrial materials. 6th ed. New York, NY: Van Nostrand Reinhold, s.547. Smole -Mo�ina, S. 1996. Pripravljalni procesi v biotehnologiji. V: Raspor, P.ur. Biotehnologija, osnovna znanja. Ljubljana, Bia,d.o.o, s. 350, 356. http://www.ilcorn.org/vec/ICMB_ICGA_Projects/reports/97011102mbi.html 25.11.2000 http://iubio.bio.indiana.edu/R219380-227064-/news/bionet/microbiology/9506.newsm 17.12.20000 http://www.epa.gov/opptintr/biotech/proposed/clost.txt 17.12.2000 http://www.jtbaker.com/msds/b5860.htm 5.1.2001 http://www.geocities.com/SouthBeach/Port/3008/clost.html 2.1.2001 http://www.siri.org/msds/mf/dd/fish/dev/fa3/365 17.12.2000 http://che.eng.ohio-state.edu/�ce_baker/proposal.html 22.12.2000 http://www.ag.uiuc.edu/news/articles/search.cgi?source=Hans+Blaschek 17.12.2000

http://www.ilcorn.org/vec/ICMB_ICGA_Projects/reports/97011102mbi.html

http://iubio.bio.indiana.edu/R219380-227064-/news/bionet/microbiology/9506.newsm

http://www.epa.gov/opptintr/biotech/proposed/clost.txt


http://www.geocities.com/SouthBeach/Port/3008/clost.html

http://www.siri.org/msds/mf/dd/fish/dev/fa3/365

Documents

PROIZVODNJA BUTANOLA IN 2,3-BUTANDIOLAweb.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/Butanol.pdf · Vendar pa je naftna kriza leta 1973 ponovno obudila interes za bioprodukcijo