Practicas recogida, preparación y conservación de muestras biológicas humanas

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Practicas recogida, preparacin y conservacin de muestras biolgicas humanas

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03/04/08

03/04/08Ttulo de la prctica:

Determinacin cuantitativa de urea

Fundamento:

La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, presente en la muestra, en amonaco (NH3) y anhdrido carbnico (CO2). El amonaco formado se incorporan al -cetoglutarato por accin de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidacin paralela de NADH a NAD+ :

Ureasa

Urea + H2O + 2 H+

2 NH3 + CO2

2 NH3 + -Cetoglutarato + NADH H2O + NAD+ + L-Glutamato GLDH

La disminucin de la concentracin de NAD+ en el medio es proporcional a la concentracin de urea de la muestra ensayada.

Material:- Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 340 nm.

-Micropipeta de 1000 l. -Micropipeta de 10 l.

- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.

- Equipamiento habitual de laboratorio.

MUESTRAS - Suero o plasma heparinizado1: No usar sales de amonio o fluoruro como anticoagulantes.

- Orina: Diluir la muestra al 1/50 con agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilucin); Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4.

La urea es estable 5 das a 2-8C.REACTIVOS R 1 Tampn TRIS pH 7,8 -Cetoglutarato 80 mmol/L 6 mmol/L

R 2 Enzimas Ureasa Glutamato deshidrogenasa (GLDH) NADH 3750 U/L 6000 U/L 0,32 mmol/L

UREA CAL Patrn primario acuoso de Urea 50 mg/dL

Procedimiento: 1. 1. Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampn. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8C) o 10 das a temperatura ambiente. 2. Condiciones del ensayo:

Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 37C / 15-25C 3. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada. 4. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrn Muestra

RT (mL) 1,0 1,0 1,0

Patrn (Nota2-3) (L) -- 10 --

Muestra (L) -- -- 10

5. Mezclar y leer las absorbancias a los 30 s (A1) y a los 90 s (A2). 6. Calcular: A= A1 A2.

Resultados:

(A Muestra) x 50 (Conc. Patrn) = mg/dL de urea en la muestra

(A Patrn)

10 mg/L urea BUN dividido por 0,466 = 21 mg/L de urea = 0,36 mmol/L urea.

Factor de conversin: mg/dL x 0,1665 = mmol/L

Realizada la prctica los resultados son los siguientes:

(0,894-0,890) x 50 (Conc. Patrn) =50 mg/dL de urea en la muestra (0,883-0,879)Dos das despus se volvi a realizar la tcnica pero con una muestra distinta los resultados fueron:

(0,957-0,945) x 50 (Conc. Patrn) =15 mg/dL de urea en la muestra

(0,965-0,961)Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L) Orina: de 20 a 35 gr/24 horas Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

Por lo tanto los resultados estn el primero un poco por encima y el segundo un poco por debajo de los rangos normales.Interpretacin clnica de los resultados:

La urea es el resultado final del metabolismo de las protenas; se forma en el hgado a partir de su destruccin.

Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso de protenas, enfermedades renales, insuficiencia cardiaca, hemorragias gstricas, hipovolemia y obstrucciones renales.

El diagnstico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio.03/04/08

Ttulo de la prctica:Determinacin cuantitativa de cido rico

Fundamento:El cido rico es oxidado por la uricasa a alantona y perxido de hidrgeno (2H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosceo:

Uricasa

cido rico + 2H2O + O2 Alantona + CO2 + 2H2O2

2H2O2 + 4-AF + DCPS

Quinonaimina + 4H2O

POD

La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentracin de cido rico presente en la muestra ensayada

Materiales:

- Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 520 nm.

- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.

- Equipamiento habitual de laboratorio.-Micropipeta

MUESTRAS - Suero o plasma: Estabilidad 3-5 das a 2-8C y 6 meses a 20C.

- Orina (24 h): Estabilidad 3 das a temperatura ambiente a pH > 8. Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilucin); Si la muestra es turbia, calentarla a 60C 10 min para disolver los precipitados de urato y cido rico. No refrigerar.

REACTIVOS R 1 Tampn Fosfatos pH 7,4 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) 50 mmol/L 4 mmol/L

R 2 Enzimas Uricasa Peroxidasa (POD) Ascorbato oxidasa 4 - Aminofenazona (4-AF) 60 U/L 660 U/L 200 U/L 1 mmol/L

URIC ACID CAL Patrn primario acuoso de cido rico 6 mg/dL

Procedimiento:1. Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampn. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8C) o 10 das a temperatura ambiente. 2. Condiciones del ensayo:

Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . .520 nm (490-550) Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37C / 15-25C

3. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada. 4. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrn Muestra

RT (mL) 1,0 1,0 1,0

Patrn (Nota1-2) (L) -- 25 --

Muestra (L) -- -- 25

5. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C 10 min. 15-25C. 6. Leer la absorbancia (A) del Patrn y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mnimo 30 minutos.

Interpretacin clnica de los resultados:El cido rico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una insuficiencia renal progresiva hay una retencin en sangre de urea, creatinina y cido rico. Niveles altos de cido rico son indicativos de patologa renal y generalmente se asocia con la gota.

El diagnstico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio.Resultados:

Suero o plasma

A(Muestra) x 6 (Conc. Patrn) = mg/dL de cido rico en la muestra

A (Patrn)

Orina 24 h (A)Muestra x 50 (dilucin) x 6 x vol. (dL) orina/24h = mg/24 h de cido rico(A) Patrn Factor de conversin: mg/dL x 59,5= mol/L.

Suero o plasma:

Mujeres 2,5 - 6,8 mg/dL 149 405 mol/L

Hombres 3,6 - 7,7 mg/dL 214 458 mol/L

Orina: 250 - 750 mg/24 h 1,49 - 4,5 mmol/24 h

Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.06/05/08

Ttulo de la prctica:

Esterilizacin en autoclave

Fundamento:

Accin del vapor hmedo sobre el material queremos esterilizar

Procedimientos:

1. Se condiciona en paquetes las placas Petri que queremos esterilizar, se envuelven en papel de filtro. 2. El interior de autoclave se llena de agua hasta la rejilla. 3. Se colocan encima de est regido una pota y en su interior se introducen los paquetes de placas Petri, se cierra la autoclave girando la manibela.4. Se introducen los datos que ha de procesar y realiza en autoclave, 15 minutos, 120C, 11 atm.. Se cierran adornos de salida del vapor y bravo.

5. Una vez que sea terminado sobre la vlvula del vapor para que sal, previamente sea para autoclave

Material:

Autoclave

Papel de filtro

Tira adhesiva

Pota

11/04/08

Ttulo de la prctica:Realizacin de un cultivo faringeo

Fundamento:

Investigacin de procesos infecciosos a travs de cultivos en placa en garganta.

Materiales:

Placa Petri con agar o agar sangre Hisopo

Mechero

Asa de siembra

Depresor lingual

Procedimiento:1. Con una luz colocada de forma que enfoque la cavidad oral del paciente dirigimos un hisopo hacia la porte posterior de la faringe, se le indica al paciente que respire profundamente y se deprime la lengua con un depresor, luego se extiende ese hisopo por los pilares de las amgdalas, pero con cuidado de no tocar los laterales de la boca, se debe pedir al paciente que diga A para que levante la vula.2. El hisopo debe moverse de atrs hacia delante para que la muestra sea idnea.

3. Inoculamos en un extremo del medio de cultivo con el hisopo que est impregnado con la muestra faringea y lo colocamos en un medio de transporte y lo reservamos.

4. Se esteriliza un asa de siembra en la llama y se deja enfriar. Con el asa en posicin ligeramente horizontal hacemos unas estras, haciendo oscilar esa asa sobre una porcin del agar moviendo suavemente y rpido la mueca.

5. Volvemos a esterilizar el asa, la dejamos enfriar y rozamos el asa con las estras sembradas y sobre otra porcin virgen de agar hacemos otra tanda de estras procurando que no toque con la primera. No se debe hacer mucha presin sobre el agar, y el asa no debe estar rota.

6. Se lleva la placa a la estufa de cultivo de 24-48 horas en posicin invertida, y observamos. Se deben ver colonias aisladas.Interpretacin clnica de los resultados:

Los cultivos de garganta se obtienen sobre todo para poder detectar estreptococos - hemolticos del grupo A. Clnicamente se puede sospechar de una faringitis estreptoccica si se observa una mucosa enrojecida en una paciente que adems presenta dolor y dificultad para deglutir. Existe una flora comensal que est formada por un grupo de bacteri