przemysl_skrobiowy_2005_2006

Przemysª Skrobiowy2005/2006

16 maja 2006

1

2

Spis tre±ci1 Kwasowa hydroliza skrobi 4

1.1 Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.2 Mechanizm procesu hydrolizy kwasowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.3 Analityczne metody kontroli procesu hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . 71.4 Produkty uboczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.5 Przemysªowy proces hydrolizy skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.6 �wiczenia laboratoryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.6.1 Oznaczenie suchej masy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.6.2 Przeprowadzenie hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.6.3 Oznaczenie redukcyjno±ci hydrolizatu . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.6.4 Wykonanie krzywej wzorcowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.6.5 Wykonanie oznaczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.6.6 Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2 Enzymatyczna hydroliza skrobi 142.1 Podstawy katalizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.2 Enzymy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.3 Enzymy hydrolizuj¡ce skrobi¦ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.3.1 Endoamylazy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.3.2 Egzoamylazy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.4 Enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.4.1 Izoamylaza; glikogen 6-glukanohydrolaza; EC 3.2.1.68 . . . . . . . . 21

2.5 Pomiar degradacji skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.6 Przemysªowe zastosowanie hydrolizy enzymatycznej skrobi. . . . . . . . . . 23

2.6.1 Produkcja maltodekstryn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.6.2 Produkcja syropów glukozowych/glukozy krystalicznej . . . . . . . 242.6.3 Produkcja syropów maltozowych i syropu wysokoscukrzonego. . . . 252.6.4 Inne zastosowania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.7 �wiczenia laboratoryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.7.1 Oznaczenie suchej masy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.7.2 Przeprowadzenie hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.7.3 Wykonanie oznaczenia redukcyjno±ci . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.7.4 Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3

3 Chemiczna mody�kacja skrobi: utlenianie 313.1 Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.1.1 Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu . . . . . . . . . . . . 323.1.2 Utlenianie skrobi w obecno±ci jodanu(VII) sodu . . . . . . . . . . . 333.1.3 Utlenianie skrobi w obecno±ci H2O2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343.1.4 Przemysªowe metody utleniania skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.2 Wykonanie ¢wiczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.2.1 Oznaczenie suchej masy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.2.2 Przeprowadzenie reakcji utleniania . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.2.3 Reakcja utleniania skrobi przy pomocy H2O2 . . . . . . . . . . . . . 363.2.4 Reakcja utleniania skrobi przy pomocy NaClO . . . . . . . . . . . . 363.2.5 Oznaczenie zawarto±ci grup karboksylowych w skrobi utlenionej . . 373.2.6 Oznaczenie zawarto±ci grup karbonylowych w skrobi utlenionej . . . 37

3.3 Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4 Chemiczna mody�kacja skrobi: estry�kacja 384.1 Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384.2 Octany skrobiowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384.3 Fosforany skrobiowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394.4 Inne estry skrobiowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.5 Wykonanie ¢wiczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.5.1 Oznaczenie suchej masy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.5.2 Acetylowanie skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.5.3 Oznaczenie stopnia zacetylowania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.6 Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4 Kwasowa hydroliza skrobi


1.1 Wst¦pSkrobia, jako w peªni odtwarzalny materiaª biologiczny zyskuje coraz wi¦ksze znaczenieprzemysªowe, i to zarówno w szeroko rozumianej technologii »ywno±ci i »ywienia jak iw tzw. zastosowaniach nie»ywno±ciowych. Stosunkowo niewielkie zastosowanie (ok. 3%)ma tzw. skrobia natywna, wydzielona z materiaªu pochodznia ro±linnego i nie poddana»adnym dodatkowym mody�kacjom. Pozostaªa cz¦±¢ otrzymywanego materiaªu jest prze�twarzana ró»nymi metodami:

• �zycznymi,

• chemicznymi,

• biologicznymi

• na drodze kombinacji kilku procesów (na przykªad hydroliza kwasowo-enzymatyczna).

Skrobia, jako biopolimer zbudowany z powtarzaj¡cych si¦ jednostek glukozowych ulega,podobnie jak dwucukry i inne oligosacharydy, reakcjom hydrolizy. Pod nazw¡ t¡ rozumiesi¦ rozpad wi¡zania glikozydowego w ±rodowisku wodnym w obecno±ci katalizatorów kwa�sowych (hydroliza kwasowa) lub enzymatycznych (hydroliza enzymatyczna), poª¡czonydodatkowo z przyª¡czeniem cz¡steczki wody do ka»dego zhydrolizowanego wi¡zania. Re�akcja hydrolizy kwasowej skrobi prowadzi do jej depolimeryzacji z utworzeniem D-glukozyoraz wytworzeniem szerokiej grupy produktów po±rednich zawieraj¡cych wi¦cej ni» jedn¡cz¡steczk¦ glukozy (disacharydy np. maltoza, dekstryny itp.). Bardziej podatny na proceshydrolizy jest polimer nierozgaª¦ziony, a wi¦c amyloza.

Proces hydrolizy jest reakcj¡ stopniow¡. W jej pierwszym etapie zachodzi rozpad wi¡�za« wodorowych pomi¦dzy poszczególnymi ªa«cuchami polimeru poª¡czony ze wst¦pn¡depolimeryzacj¡. Powoduje to zwi¦kszenie rozpuszczalno±ci polimeru, a co za tym idzie,znaczne obni»enie lepko±ci. Zainicjowany w ten sposób proces zaczyna przebiega¢ corazszybciej z wytworzeniem produktów po±rednich o zró»nicowanej dªugo±ci ªa«cuchów czylidekstryn. Wielko±¢ oraz morfologia dekstryn wynika przede wszystkim z faktu, »e proce�sowi hydrolizy ulegaj¡ zarówno cz¡steczki amylozy jak i amylopektyny. W miar¦ wzrostust¦»enia glukozy w mieszaninie reakcyjnej, pod wpªywem kationów wodorowych, zaczy�naj¡ zachodzi¢ tak»e ró»nego rodzaju reakcje wtórne i uboczne, niekorzystnie wpªywaj¡cena proces hydrolizy. W±ród nich niew¡tpliwie najwa»niejsze to rewersja oraz tworzenie5-hydroksymetylofurfuralu wraz z produktami jego rozkªadu lub polimeryzacji (Rysunek

Kwasowa hydroliza skrobi 5

SKROBIA HYDROLIZA−−−−−−−→oligosacharydy

dekstryny HYDROLIZA−−−−−−−→ GLUKOZArewersja−−−−⇀↽−−−−hydroliza

Produkty rewersjiy

Kwas mrówkowy←−−−−− 5-hydroksymetylofurfural −−−−−→ Produkty polimeryzacjiy

Kwas 4-okso-pentanowy

Rysunek 1: Reakcje chemiczne zachodz¡ce w trakcie kwasowej hydrolizy skrobi.

1.1). Szybko±¢ procesu hydrolizy zale»na jest przede wszystkim od st¦»enia czynnika kata�lizuj¡cego (kwasu) oraz temperatury procesu. Prawdopodobnie czynnikiem wpªywaj¡cymna globaln¡ szybko±¢ hydrolizy jest te» budowa, a szczególnie wielko±¢ ziarenek skrobio�wych.

1.2 Mechanizm procesu hydrolizy kwasowej

W sensie samego mechanizmu reakcji chemicznej proces hydrolizy przebiega dwutorowo(Rysunek 1.2):

• �cie»ka A:Protonowanie tlenu pier±cienia glukopiranozowego (A1) powoduje jego rozpad z wy�tworzeniem karbokationu na w¦glu C-1 (A2). W takiej sytuacji do karbokationuprzyª¡cza si¦ cz¡steczka wody (A3). Przesuni¦cie ªadunków w obr¦bie otrzymanegokompleksu (A4) powoduje, z jednej strony, ponowne zamkni¦cie pier±cienia, a zdrugiej odszczepienie, zarówno kationu wodorowego, jak i cz¡steczki glukozy (lubfragmentu ªa«cucha polimerowego w zale»no±ci od lokalizacji procesu w cz¡steczcepolimeru).

• �cie»ka B:Reakcja rozpoczyna si¦ protonowaniem mostkowego atomu tlenu przy wi¡zaniuα-1,4-glikozydowym (B1). Przeniesienie ªadunku na ten atom umo»liwia rozerwa�nie wi¡zania glikozydowego i rozszczepienie ªa«cucha polimeru na dwa krótsze, lubodszczepienie cz¡steczki glukozy, je±li reakcja ma miejsce na ko«cu ªa«cucha. Porozpadzie ªa«cucha na pozostaªej jego cz¦±ci odtworzony zostaje karbokation (B2)umo»liwiaj¡cy w kolejnym etapie przyª¡czenie cz¡steczki wody (B3). Odszczepienie


glukoza glukoza

O H

O

OH

OH

O

CH2OH H

+ H+

O

O

OH

OH

O

CH2OH HH

glukozaglukoza

glukoza glukoza

O

O

OH

OH

O

CH2OH HO

H

H

H2O

O

O

OH

OH

O

CH2OH HO

H

H

glukozaglukoza

O H

OOH

OH

O

CH2OH

Hglukoza

glukozaHO+

+ H+

O H

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

O H

O

OH

OH

O

CH2OH

H

glukozaglukoza

HO glukoza-

O H

OH

OH

O

CH2OH

glukoza

H2O

O H

OH

OH

O

CH2OH

O

H

Hglukoza

- H+

O H

OH

OH

O

CH2OH

OHglukoza

A

A1

A2

A3

B

B1

B2

B4

B3

A4

Rysunek 2: Mechanizm hydrolizy kwasowej skrobi.


od tak utworzonego kationu jonu H+ umo»liwia wytworzenie na w¦glu C-1 stabilneji trwaªej grupy hydroksylowej (B4).

1.3 Analityczne metody kontroli procesu hydrolizyProces kwasowej hydrolizy skrobi powoduje zmniejszenie masy cz¡steczkowej, lepko±cioraz przede wszsytkim struktury chemicznej w¦glowodanów w próbce poddanej tej prze�mianie. Wykorzystuj¡c zmiany tych wªa±ciwo±ci, mo»na kontrolowa¢ przebieg hydrolizyna kilka sposobów:

• Badanie zmian redukcyjno±ci: Zarówno jak i amylopektyna zawieraj¡ nie�wielkie ilo±ci wolnych grup hydroksylowych o charakterze póªacetalowym (jednawolna grupa na pojedyncz¡ makrocz¡steczk¦). Produkty caªkowitej hydrolizy cz¡�steczki skrobi o stopniu polimeryzacji skªadaja sie tylko i wyª¡cznie z cz¡steczekglukozy, z których ka»da posiada woln¡ grup¦ póªacetalow¡ podatn¡ na reakcje re�doks.Je±li wi¦c, na przykªad, czasteczka skrobi wykazuje stopie« polimeryzacji 500 (skªadasi¦ z 500 jednostek anhydroglukozowych) to po caªkowitej hydrolizie w ±rodowiskureakcyjnym znajdzie si¦ 500 wolnych cz¡steczek glukozy, a wi¦c 500 wolnych gruphydroksylowych o charakterze póªacetalowym. W przypadku hydrolizy niecaªkowi�tej zachodzacej do stadium dekstryn liczba grup póªacetalowych bedzie mie±cic¢ si¦w zakresie 1-500, w zale»no±ci od stopnia hydrolizy (scukrzenia).W celu ujednolicenia pomiaru redukcyjno±ci wprowadza si¦ tzw. równowa»nik gluko�zowy (ang. Dextrose Equivalent; DE) jako ilo±¢ wi¡za« glikozydowych, które ulegªyhydrolizie (oznaczonych na drodze okreslenia zmian redukcyjno±ci) do caªkowitejilo±ci wi¡za« glikozydowych obecnych w 100g materiaªu (skrobi) wyj±ciowego, coilustruje Równanie 1. Dla uproszczenia zale»no±¢ t¡ oblicza si¦ najcz¦±ciej korzysta�j¡c z Równania 2.

DE =w.h.

w.c· 100% (1)

DE =m.g.

s.m.s· 100% (2)

gdzie:

� w.h. - ilo±¢ zhydrolizowanych wi¡za« glikozydowych,

� w.c. - caªkowita ilo±¢ wi¡za« glikozydowych obecna w skrobi wyj±ciowej,

� m.g. - masa glukozy okre±lona na podstawie redukcyjno±ci hydrolizatu,

� s.m.s. - masa skrobi poddana hydrolizie w przeliczeniu na such¡ mas¦.


Oznaczenie ilo±ci substancji redukuj¡cych z reguªy bazuje na zastosowaniu zasado�wego roztworu soli miedzi (II) jako ±rodka utleniaj¡cego. Ró»nice pomi¦dzy poszcze�gólnymi metodami wynikaj¡ za± gªównie z ilo±ciowego oznaczenia wytr¡conego poreakcji Cu2O.

• Próba jodowa: Oznaczenie z zastosowaniem próby jodowej wynika ze zdolnmo�±ci do tworzenia przez skrobi¦ kompleksów z jodem o ró»nej barwie, w zale»no±ciod stopnia jej polimeryzacji. W pocz¡tkowej fazie hydrolizy zwi¡zki wysokocz¡stecz�kowe (tzw. amylodekstryny) barwi¡ roztwór jodu na niebiesko�oletowo. Gª¦bszahydroliza, a wi¦c wytworzenie produktów o ni»szej masie cz¡steczkowej (tzw. ery�trodekstryny), daje kompleksy barwy czerwonej. Ko«cowe produkty hydrolizy, tzw.achrodekstryny oraz maltodekstryny, nie daj¡ barwnych reakcji z jodem podobniejak sama glukoza.

• Badania zmian rozpuszczalno±ci w alkoholu: Badania tego typu opie�raj¡ si¦ na wzrastaj¡cej, wraz z post¦pem hydrolizy, rozpuszczalno±ci produktów roz�padu. Podczas gdy skrobia niezhydrolizowana wykazuje w roztworach alkoholowychzm¦tnienie oraz wypadanie z roztworu, to produkty jej rozkªadu s¡ lepiej rozpusz�czalne w alkoholu (mniejsze zm¦tnienie) lub tak, jak to jest w przypadku glukozy iwi¦kszo±ci oligosacharydów, s¡ w tym rozpuszczalniku caªkowicie rozpuszczalne.

• Badania sk¦calno±ci wªa±ciwej: Rozpuszczona skrobia wykazuje skr¦cal�no±¢ wªa±ciw¡ +200◦, podczas gdy czysta glukoza w roztworze skr¦ca pªaszczyzn¦±wiatªa spolaryzowanego o k¡t +52,5◦. Powstaj¡ce w trakcie hydrolizy po±rednie pro�dukty rozkªadu skrobi wykazuj¡ równie» po±redni¡ warto±¢ skr¦calno±ci, co umo»li�wia polarymetryczne monitorowanie procesu hydrolizy.

1.4 Produkty uboczneW toku reakcji hydrolizy powstaj¡ cz¡steczki o coraz ni»szym stopniu polimeryzacji (ma�sie cz¡steczkowej). Hydroliza tych poª¡cze« zachodzi szybciej ni» wyj±ciowego materiaªuskrobiowego, tak wi¦c po stosunkowo niedªugim czasie w mieszaninie reakcyjnej obecnes¡ ju» znaczne ilo±ci trimerów, dimerów a przede wszystkim glukozy. Fakt ten, impli�kuje niestety zainicjowanie, ju» na wst¦pnym stadium hydrolizy, niepo»¡danych procesówubocznych z udziaªem glukozy:

• Rozpad glukozy: Pod wpªywem kationów wodorowych, a wi¦c w ±rodowiskukwa±nym, podobnie jak ma to miejsce przy gªównej reakcji hydrolizy, glukoza ulega


C

H

O

CH OH

CHO H

CH OH

CH OH

CH2OH

C

H

O

C O

CHO H

CH OH

CH OH

CH2OH

H

H

- H2O

- H2O

CH CH

CO

C

OH

CHOHHOH2C

CH CH

CHO

C

OH

CHOHOH2C

- H2O

CH CH

CO

C CHOHOH2C5-hydroksymetylofurfural

H2O+

CH2

C

CH2

HOH2C

O

C CHO

O

CH2

C

CH2

HOH2C

O

C OH

O

+ HCOOH

kwas 4-okso-pentanowy(kwas lewulinowy)

kwasmrowkowy

CH CH

CO

CH

HO OH

CHOHHOH2C

.

Rysunek 3: Mechanizm reakcji z udziaªem 5-hydroksymetylofurfuralu.

przegrupowaniu do 5-hydroksymetylofurfuralu (Rysunek 1.4). W warunkach reakcji,zwi¡zek ten mo»e, b¡d¹ to ulega¢ procesom polimeryzacji (z wytworzeniem smoli�stych trudno usuwalnych zwi¡zków makrocz¡steczkowych) lub dalszej degradacjiz wytworzeniem kwasu 4-okso-pentanowego (kwas lewulinowy) oraz toksycznegokwasu mrówkowego. Reakcji powstawania 5-hydroksymetylofurfuralu sprzyja wy�soka temperatura (ok. 130◦C), niskie pH (a wi¦c po±rednio wysokie st¦»enie kwasu)oraz wysokie st¦»enie glukozy.

• Rewersja glukozy: Jony wodorowe katalizowa¢ mog¡ tak»e reakcje konden�sacji dwóch (Rysunek 1.4) lub kilku (Rysunek 1.4) cz¡steczek glukozy. Zjawisko toznane pod nazw¡ rewersji zachodzi gªównie przy wi¦kszych st¦»eniach glukozy i wprzypadku otrzymywania syropów wysokoscukrzonych jest wysoce niekorzystne. Re�wersja mo»e spowodowa¢, »e w czasie hydrolizy, prowadzonej na skal¦ techniczn¡,wydajno±¢ glukozy spada z warto±ci teoretycznej 110kg ze 100kg skrobi do warto±ci90kg. Gªównymi oligosacharydami powstaj¡cymi w trakcie rewersji s¡: izomaltoza,gencjobioza, soforoza, trehaloza i celebioza. Dodatkowo w procesie tym powstaj¡bardziej odporne na proces hydrolizy wi¡zania α- i β- 1,6-glikozydowe. W trakciereweresji powstawa¢ mog¡ tak»e oligosacharydy, w których jednostki glukozowe po�


O

OH

CH2OH

OH

OH

O H

O

OH

CH2

OH

OH

OH

OH

O

OH

CH2OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

CH2

OH

O

H2O-

Izomaltoza

wiazanie α-1,6 glikozydowe

wiazanie β-1,6 glikozydowe

Gencjobioza

H2O-

O

OH

CH2

OH

OH

OH

OH

O

OH

CH2OH

OH

OH

O H

OH

OH

OH

CH2

OH

O

O

OH

OH

CH2OH

OH

O

Rysunek 4: Reakcja rewersji, powstawanie dimerów glukozy

O

OH

CH2OH

OH

OH

O

O

OH

CH2

OH

OH

OH

O

OH

OH

CH2

OH

O

O

OH

CH2OH

OH

OH

O H

O

OH

CH2

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

CH2

OH

O

H2O-

Izomaltotriozaα-D-glukopiranozylo-α-D-glukopiranozylo-O-6-D-glukopiranoza

Rysunek 5: Rewersja glukozy, trimeryzacja


ª¡czone s¡ wi¡zaniami 1,1-, 1,2-, 1,3- glikozydowymi.

• Reakcja Maillarda: Procesowi hydrolizy mo»e towarzyszy¢ tzw. reakcja Ma�illarda prowadz¡ca poprzez stadium zasad Schi�'a do barwnych produktów nazywa�nych melanoidami. Reakcja Maillarda przebiega mi¦dzy cz¡steczk¡ cukru (np. glu�koz¡) oraz aminokwasu. Zwi¦kszona zawarto±¢ aminokwasów wynikaj¡ca, na przy�kªad z niedokªadnego, wst¦pnego oczyszczenia skrobi, sprzyja temu procesowi, nie�korzystnie wpªywaj¡c na efektywno±¢ hydrolizy ze wzgl¦du na straty glukozy orazpowstawanie trudno usuwalnych barwnych produktów.

1.5 Przemysªowy proces hydrolizy skrobi

W praktyce przemysªowej proces hydrolizy kwasowej stosuje si¦ gªównie do produkcji syro�pów skrobiowych i dekstryn (Rysunek 1.5). Znacznie rzadziej metoda ta sªu»y do produk�cji glukozy gdzie wyparta zostaªa przez hydroliz¦ enzymatyczn¡. Podstawowym surowcemdo produkcji syropów jest tzw. krochmal zielony czyli skrobia zawieraj¡ca ok. 50% wody.Ze wzgl¦du na dªu»szy okres przechowywania surowca i mo»liwo±¢ zachodzenia procesówgnilnych i fermentacyjnych surowiec oczyszcza si¦ i dezynfekuje. Oczyszczony surowiecpoddaje si¦ nast¦pnie konwersji w ±rodowisku kwa±nym oraz podwy»szonej temperaturze.Po osi¡gni¦ciu wymaganej wielko±ci równowa»nika glukozowego proces hydrolizy przerywasi¦ przez zoboj¦tnienie, a mieszanin¦ reakcyjn¦ oczyszcza, �ltruje i zag¦szcza. W zale»no±ciod stopnia scukrzenia, a wi¦c warto±ci równowa»nika glukozowego, rozró»nia si¦ syropy: ni�skoscukrzony (DE 30-38), normalnie scukrzony (DE 38-45), ±rednioscukrzony (DE 45-50)i wysokoscukrzony (DE 50-55). Podobn¡ metod¦ mo»na stosowa¢ do produkcji glukozy

u p ³ y n n i a n i e s k r o b i

h y d r o l i z a ( H C l )

z o b o j ê t n i a n i e( w ê g l a n s o d u )

o c z y s z c z a n i e( w ê g i e l a k t y w n y )

z a g ê s z c z a n i e

S Y R O PS K R O B I O W Y

z a g ê s z c z a n i e w i r o w a n i e c u k r z y c y

G L U K O Z AZ E S T A L O N AG L U K O Z AK R Y S T A L I C Z N A

k r y s t a l i z a c j a p r z e r ó bo d c i e k ó w

H Y D R O L

Rysunek 6: Przemysªowy proces hydrolizy skrobi


krystalicznej. Reakcj¦ hydrolizy prowadzi si¦ wtedy przy ni»szym st¦»eniu mleczka skro�biowego. W przypadku produkcji glukozy reakcj¦ prowadzi si¦ a» do osi¡gni¦cia warto±ciDE na poziomie 92. W opisywanym procesie, oprócz tzw. glukozy zestalonej oraz glukozykrystalicznej, uzyskuje si¦ tak»e, jako produkt odpadowy, hydrol. Wariacj¡ metody kwaso�wej otrzymywania glukozy jest proces kwasowo-enzymatyczny, w którym po pocz¡tkowejhydrolizie surowca obni»a si¦ temperatur¦ procesu, zoboj¦tnia mieszanin¦ reakcyjn¡ orazdodaje enzym glukoamylaz¦ w celu jej scukrzenia metod¡ enzymatyczn¡.

1.6 �wiczenia laboratoryjne

1.6.1 Oznaczenie suchej masy

Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi zdokªadno±ci¡ do 0,0001g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦C przez 1godz.Nast¦pnie przenie±¢ próbk¦ do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicymas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢z dokªadno±ci¡ do 0,1% wraz z analiz¡ statystyczn¡.

1.6.2 Przeprowadzenie hydrolizy

Na wadze analitycznej odwa»y¢ 2,5g skrobi w przeliczeniu na such¡ mas¦ (zaªo»y¢ pocz¡t�kow¡ zawarto±¢ wody równ¡ 20%, a po okre±leniu suchej masy uwzgl¦dni¢ odpowiedni¡poprawk¦). Skrobi¦ przenie±¢ ilo±ciowo do kolby miarowej o pojemno±ci 250cm3 i uzupeª�ni¢ do kreski wod¡ destylowan¡. Zawiesin¦ dobrze wymiesza¢ i pobra¢ z niej 10 próbekpo 25cm3 ka»da. Próbki umie±ci¢ w kolbkach Erlenmayera o pojemno±ci 100cm3. Do 9próbek doda¢ 12,5cm3 przygotowanego roztworu kwasu solnego (st¦»enia 5%, 10% lub15% w zale»no±ci od grupy). Próbka 10 stanowi prób¦ zerow¡. Kolbki kolejno umie±ci¢ wªa¹ni wodnej o temperaturze 90◦C na czas: 2, 3, 4, 6, 8, 15, 20, 30 i 40min. Po wyj¦ciu zªa¹ni, w celu zatrzymania reakcji hydrolizy, kolbki umieszcza¢ w ªa¹ni wodnej chªodzonejlodem. Próbk¦ zerow¡ (nie zawieraj¡c¡ kwasu) ogrzewa¢ przez okres 40min, schªodzi¢ apo ozi¦bieniu doda¢ do niej 12,5cm3 kwasu. Ochªodzone próbki natychmiast zoboj¦tni¢30% NaOH (wobec papierka uniwersalnego) i umie±ci¢ w kolbach miarowych o pojemno±ci100cm3. Zawarto±¢ kolbek uzupeªni¢ do kreski wod¡ destylowan¡, wymiesza¢.


1.6.3 Oznaczenie redukcyjno±ci hydrolizatu

1.6.4 Wykonanie krzywej wzorcowej

W 10 probówkach odmierzy¢ 5cm3 mieszaniny pªynów Fehlinga I i II, po czym doda¢ od1 do 10cm3 roztworu glukozy o st¦»eniu 2,78·10−3mol/dm3 i uzupeªni¢ wod¡ do 25cm3.Po wymieszaniu zawarto±¢ ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni wodnej przez 5min i przela¢ doprobówek wirówkowych i odwirowa¢ (2min, 5000rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofo�tometryczny, stosuj¡c ±wiatªo o dªugo±ci fali λ=640nm, u»ywaj¡c jako odniesienia wodydestylowanej. Wykre±li¢ krzyw¡ wzorcow¡, obliczy¢ metod¡ regresji liniowej równanie tejkrzywej (Cglukozy = f(Abs.)) oraz podstawowe parametry statystyczne.

1.6.5 Wykonanie oznaczenia

Z próbek otrzymanych hydrolizatów pobra¢ do kolbek po 10cm3, doda¢ 5cm3 mieszaninypªynów Fehlinga I i II i uzupeªni¢ wod¡ destylowan¡ do 25cm3. Po wymieszaniu zawarto±¢ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni wodnej przez czas 5min, przenie±¢ do probówek wirówkowychi odwirowa¢ (2min, 5000rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofotometryczny jak opisanoto dla krzywej wzorcowej. Okre±li¢ zawarto±¢ glukozy i na jej podstawie warto±¢ DE dlakolejnych próbek i sporz¡dzi¢ wykres jego warto±ci w zale»no±ci od czasu.

1.6.6 Sprawozdanie

Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, wynikibada«, obliczenia, krzyw¡ wzorcow¡, wykres zale»no±ci DE od czasu. Wszystkie otrzymanedane nale»y skomentowa¢ i wyci¡gn¡¢ wnioski. Porówna¢ tak»e dynamik¦ zmian DE wzale»no±ci od st¦»enia u»ytego kwasu.

14 Hydroliza enzymatyczna

2 Enzymatyczna hydroliza skrobi

2.1 Podstawy katalizy

Reakcje chemiczne charakteryzuj¡ si¦ ró»nymi szybko±ciami (staªymi szybko±ci) a co zatym idzie ró»n¡ dynamik¡ procesu. Warto±¢ staªej szybko±ci reakcji chemicznej zale»ymi¦dzy innymi od st¦»enia substratów i temperatury. W wielu przypadkach procesów za�równo o znaczeniu technicznym jak i laboratoryjnym, nie istnieje praktyczna mo»liwo±¢zwi¦kszania dynamiki reakcji poprzez zwi¦kszenie temperatury (ze wzgl¦du na np. de�gradacj¦ substratów/produktów). Procesy chemiczne mog¡ równie» charakteryzowa¢ si¦niewielk¡ warto±ci¡ staªej równowagi (procesy odwracalne), wysok¡ energi¡ aktywacji iwieloma innymi, niekorzystnymi z punktu widzenia efektywno±ci procesu, parametrami.W przypadkach takich, rozwi¡zaniem problemu zwi¦kszenia wydajno±ci i selektywno±cireakcji oraz skrócenia jej czasu jest zastosowanie katalizatora.

Jak wiadomo z termodynamiki procesy chemiczne b¦d¡ przebiega¢ samorzutnie tylkowtedy, gdy zmiana energii swobodnej reakcji ∆G (∆G = G20 - G10 ; G20 - energia swo�bodna produktów, G10 - energia swobodna substratów) b¦dzie mniejsza od zera. Za zmianyenergii swobodnej zgodnie z Równaniem 3

∆G = ∆H − T∆S (3)

odpowiada b¡d¹ to zmiana entalpii procesu (∆H) b¡d¹ te» zmiana uporz¡dkowania ukªadu(zmiana entropii, ∆S).

Dodatkowo jednym z najistotniejszych czynników limituj¡cych przebieg reakcji jest wy�soko±¢ bariery aktywacji (energii aktywacji) zgodnie z równaniem Arrheniusa (Równanie4).

k = A · e− EaRT (4)

gdzie:

• k - staªa szybko±ci reakcji,

• A - tzw. wspóªczynnik przedekspotencjalny,

• R - staªa gazowa,

• Ea - energia aktywacji,

• T - temperatura.

Hydroliza enzymatyczna 15

Zastosowanie wªa±ciwego katalizatora umo»liwia zwi¦kszenie szybko±ci reakcji chemiczneji/lub skierowanie jej na jedn¡ z kilku mo»liwych termodynamicznie dróg prowadz¡cych doró»nych produktów. Substancje b¦d¡ca katalizatorem, tworz¡c nietrwaªe poª¡czenia przej�±ciowe (kompleksy przej±ciowe), nie s¡ ¹u»ywane"w reakcji i nie wyst¦puj¡ w jej równaniustechiometrycznym. Katalizator nie zmienia przy tym poªo»enia równowagi chemicznej,wpªywa jedynie na szybko±¢ dochodzenia ukªadu do tego stanu poprzez zmniejszenie ener�gii aktywacji. Mechanizm dziaªania katalizatora polega na zast¡pieniu reakcji z równania5

S1 + S2 = P (5)

Procesem:

S1 + K = S1K (6)S1K + S2 = P + K (7)

Gdzie:

• S1,S2 - substraty

• P - produkt

• K - katalizator

• S1K - kompleks przej±ciowy

Je»eli dla reakcji (5) energia aktywacji wynosi EN to dla procesu katalizowanego wynosiona odpowiednio Ek1 (dla reakcji 6) i Ek2 (dla reakcji 7). Zmiany energii aktywacji procesukatalitycznego obrazuje Rysunek 3.

2.2 EnzymySpecy�cznymi katalizatorami reakcji chemicznych s¡ enzymy, grupa biaªek dziaªaj¡cych wkomórkach i pªynach ustrojowych »ywych organizmów i bior¡cych udziaª w procesach syn�tezy lub rozkªadu istotnych z biochemicznego punktu widzenia substancji organicznych.

Enzymy rzadko zbudowane s¡ z samego biaªka (np. trypsyna). W znakomitej wi¦kszo�±ci skªadaj¡ si¦ one z cz¦±ci biaªkowej (tzw. apoenzym) oraz niebiaªkowej, grup prostetycz�nych i koenzymów (maªocz¡steczkowe zwi¡zki nieorganiczne, atomy metali). Niebiaªkowecz¦±ci enzymu peªni¡, w reakcjach enzymatycznych, funkcj¦ przeno±ników elektronów,okre±lonych atomów lub ich ugrupowa« w trakcie katalizowanych procesów. Bior¡ oneudziaª w cyklu reakcji enzymatycznych: w pierwszej jego fazie umo»liwiaj¡ dysocjacj¦


S 1 + S 2 + K

P + K

S 1 - - S 2

S 1 K

S 1 - - K

S 1 K - - S 2

E n e r g i a

P o s t ê p r e a k c j i

E k 1

E N

E k 2

Rysunek 7: Przemiany energetyczne podczas zachodz¡ce podczas procesów chemicznych (S1�S2 -kompleks aktywny reakcji niekatalizowanej; S1�K, S1�K�S2 - kompleksy aktywne poszczególnychetapów reakcji katalizowanej.

okre±lonych wi¡za« substratu oraz ich zwi¡zanie z enzymem. W fazie drugiej nast¦pujenatomiast zwi¡zanie atomów pochodz¡cych od substratu w produkt, oraz odtworzeniecz¦±ci niebiaªkowej w pierwotnej postaci, po czym proces si¦ powtarza. Poª¡czenie koenzy�mów z przenoszon¡ grup¡ funkcyjn¡¡ odznacza si¦ du»¡ reaktywno±ci¡. Dzi¦ki cykliczno±ciprocesu przenoszenia, koenzymy mog¡ wyst¦powa¢ w »ywej komórce w ilo±ciach równo�wa»nych ilo±ciom enzymów, cho¢ reaguj¡ z substratami stechiometrycznie. Trwaªo±¢ po�ª¡czenia apoenzymu w koenzymami jest ró»na; je±li koenzym ªatwo dysocjuje, reakcjeprzenoszenia grup chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje ukªad zªo»ony z 2enzymów o wspólnym koenzymie; je±li koenzym jest zwi¡zany z enzymem trwale, enzymten katalizuje kolejno obie reakcje.

Cz¦±¢ biaªkowa odpowiada natomiast za kon�guracj¦ przestrzenn¡ enzymu oraz zazmiany hydrofobowo±ci centrum aktywnego. Budowa taka powoduje »e enzymy zawiera�j¡ce t¡ sam¡ grup¦ prostetyczn¡ ale ró»ne cz¦±ci biaªkowe bed¡ katalizowa¢ ró»ne reakcjejednostkowe.

Zgodnie z równaniami 6 i 7 podstaw¡ reakcji enzymatycznej jest wytworzenie odwra�calnego kompleksu pomi¦dzy enzymem i substratem reakcji. Kompleks ten ulega nast¦p�nie nieodwracalnej przemianie z odtworzeniem enzymu oraz wytworzeniem �nalnego pro�duktu. Tak jak w przypadku wi¦kszo±ci katalizatorów st¦»enie enzymów w trakcie procesujest znacz¡co mniejsze niz st¦»enie substratów. Wynika st¡d i» mo»na przyj¡¢, »e st¦»eniekompleksu S1K jest staªe w czasie i zale»y tylko od st¦»enia enzymu.


Szybko±¢ reakcji enzymatycznej zale»na jest tak»e od wielu innych czynników (pH,temperatura, st¦»enie koenzymów itp.), w tym przede wszystkim od st¦»enia substratu.Zale»no±¢ szybko±ci procesu od tego st¦»enia opisuje równanie Michaelisa-Menten'a:

v =vmax · [S]

Km + [S](8)

Gdzie:

• v - chwilowa szybko±¢ reakcji

• vmax - maksymalna szybko±¢ reakcji

• [S] - st¦»enie substratu

• Km - staªa Michaelisa-Menten'a

Staªa Michaelisa-Menten'a jest to takie st¦»enie substratu (wyra»one w mol/dm3), przyktórym szybko±¢ reakcji osi¡ga poªow¦ szybko±ci maksymalnej.

Innym wska»nikiem aktywno±ci enzymu s¡ tzw. jednostki aktywno±ci na przykªad tzw.jednostka mi¦dzynarodowa (ilo±¢ enzymu, która zdolna jest wytworzy¢ 1 mmol produktuw temp. 30◦C i w optymalnych dla enzymu pozostaªych warunkach reakcyjnych), katal(aktywno±¢ enzymu zdolnego do przeksztaªcenia 1mol substratu w czasie 1s w temp.30◦C i w optymalnych dla enzymu pozostaªych warunkach reakcyjnych lub tzw. ilo±¢obrotów (liczba moli substratu która mo»e przereagowa¢ w ci¡gu 1min z 1 molem centrumaktywnego enzymu w temp. 30◦C i w optymalnych dla enzymu pozostaªych warunkachreakcyjnych).

Liczba znanych dotychczas enzymów znacznie przekracza 3000, st¡d te» wprowadzonajest ich klasy�kacja (wprowadzona przez Komisj¦ Enzymow¡ IUB). Wszystkie enzymypodzielone zostaªy na sze±¢ klas gªównych (1. Oksyreduktazy, 2. Transferazy, 3. Hydrolazy,4. Liazy, 5. Izomerazy, 6. Ligazy.) W czteroliczbowej klasy�kacji enzymów kolejne liczbyoznaczaj¡ klasy, podklasy, podpodklasy oraz numer enzymu w podpodklasie.

2.3 Enzymy hydrolizuj¡ce skrobi¦Oprócz celulozy skrobia jest gªównym polisacharydem pochodzenia ro±linnego. Z prze�mysªowego punktu widzenia istotne znaczenie maj¡ przede wszystkim produkty jej hy�drolizy umo»liwiaj¡ce produkcj¦ syropów glukozowych, dekstryn, cyklodekstryn, glukozy(krystalicznej i zestalonej) i innych produktów wykorzystywanych gªównie w przemy±lespo»ywczym. Stosowana do niedawna kwasowa hydroliza skrobi wraz z post¦pem w dzie�dzinie biotechnologii coraz cz¦±ciej ust¦puje miejsca procesom enzymatycznym. Enzymy


stosowane do hydrolizy skrobi podzieli¢ mo»na na 5 grup: endoamylazy, egzoamylazy,enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia, izomerazy oraz glikozylotransferazy cyklodekstryn (Ry�sunek 2.3).

Rysunek 8: Najcz¦±ciej stosowane enzymy hydrolizuj¡ce skrobi¦

2.3.1 Endoamylazy

α-amylaza, 4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu - EC 3.2.1.1Enzymy z tej grupy umo»liwiaj¡ hydroliz¦ wi¡za« α-1,4-glikozydowych zarówno w amy�

lozie jak amylopektynie a nie s¡ aktywne w stosunku do wi¡za« α-1,6- (np. w amylo�pektynie). Produktami hydrolizy w tym przypadku s¡ oligosacharydy posiadaj¡ce kon��guracje α przy w¦glu C1. Enzymy te dziaªaj¡ w ±rodku ªa«cucha polimerowego co po�woduje gwaªtowny spadek lepko±ci hydrolizowanego kleiku skrobiowego. Znane s¡ dwarodzaje α-amylazy: termostabilna i termolabilna. α-amylaza termostabilna jest enzymempochodzenia bakteryjnego. Enzym ten w przypadku pochodzenia ze szczepu Bacillus sub�tilis wykazuje optimum temperaturowe pomi¦dzy 65 a 70◦C w obecno±ci jonów wapnia,i ze wzgl¦du na swoj¡ nisk¡ stabilno±¢ nie jest stosowana w zastosowaniach komercyj�nych. α-amylaza pochodz¡ca ze szczepu Bacillus licheniformis (Rysunek 2.3.1) jest na�tomiast aktywna i stabilna w temperaturach powy»ej 90◦C, a dodatkowo jej aktywno±¢w znacznie mniejszym stopniu zale»ny od obecno±ci jonów Ca2+ oraz stosowanego pH.


Rysunek 9: α-amylaza zeszczepu Bacillus licheniformis

Dziaªanie opisywanego enzymu sprowadza si¦ gªównie dogenerowania z ªa«cucha polisacharydowego jednostek zawie�raj¡cych 5 jednostek glukozowych. Powoduje to, »e szybko±¢hydrolizy jest bardzo wysoka na pocz¡tku procesu a potemwraz z post¦pem reakcji spada. Na dalszych etapach pro�cesu generowane s¡ jednostki o mniejszej liczbie merów. Ter�molabilne α-amylazy s¡ enzymami pochodznie grzybowego.Produktami hydrolizy skrobi w tym przypadku s¡: maltozai maltotrioza. Enzymy pochodzenia grzybowego wykazuj¡wi¦ksz¡ w porównaniu do swoich bakteryjnych odpowied�nikow odporno±¢ na zmiany pH ±rodowiska reakcji. Znane

s¡ te» αamylazy immobilzowane (osadzane) na no±nikach. Taki proces heterogenizacjienzymu umo»liwia przynajmniej cz¦±ciowe odzyskiwanie katalizatora oraz mo»liwo±¢ po�nownego jego u»ycia co istotne jest z punktu widzeni ekonomiki procesu. Enzymy immobi�lizowane na no±nikach wykazuj¡ jednak z ni»sza aktywno±¢, a to ze wzgl¦du na utrudnionewarunki dyfuzji pomi¦dzy katalizatorem w fazie staªej a rozpuszczonymi/skleikowanymiªa«cuchami polisacharydowymi.

2.3.2 Egzoamylazy

Enzymy z grupy egzoamylaz dziela si¦ na ukªady dziaªaj¡ce z wytworzeniem glukozy lubmaltozy.

γ-amylaza, 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu, glukoamylaza; EC 3.2.1.3Glukoamylaza zwana tak»e γ-amylaz¡ umo»liwia wysoce efektywn¡ reakcj¦ hydrolizy

wi¡za« α-1,4-glikozydowych z wytworzenim glukozy jako produktu ko«cowego.

Rysunek 10: γ-amylaza zeszczepu Aspergillus niger

Atak enzymu rozpoczyna si¦ na nieredukuj¡cym ko«cu ªa«�cucha polimerowego a powstaj¡ca glukoza posiada kon�gu�racj¦ β. Enzym ten dziaªa na skrobi¦ odcinaj¡c po jede�nej jednostce glukozowej, a» do miejsca rozgaª¦zienia. Hy�droliza wi¡za« 1,6-glikozydowych z udziaªem glukoamylazyrównie» jest mo»liwa cho¢ proces ten przebiega z bardzo ni�sk¡ szybko±ci¡. W przypadku wysokich st¦»e« glukozy lubenzymu mo»liwa jest tak»e podobnie jak w przypadku hy�drolizy kwasowej reakcja repolimeryzacji (rewersji) glukozyz wytworzeniem maltozy i izomaltozy. Glukoamylaza cha�rakteryzuje si¦ du»¡ odporno±ci¡ na zmiany pH (stabilno±¢


w zakresie 1,8-8,8 dla enzymu z Aspergillus niger oraz 1,8-10,5 dla ukªadu pochodz¡cegoz Aspergillus awamori). Enzym ten najwy»sz¡ aktywno±¢ przejawia przy pH z zakresu4,0-5,6 w temperaturze 40-65◦C. Odwrotnie ni» w przypadku α-amylazy jony Ca2+ wyka�zuj¡ inhibicyjne dziaªanie na proces enzymatycznej hydrolizy z udziaªem glukoamylazy.

Rysunek 11: β-amylaza z Hor�deum vulgare

β-amylaza, maltohydrolaza-α-1,4-glukanu; EC 3.2.1.2β-amylaza jest enzymem dziaªaj¡cym na skrobi¦ z wy�

tworzeniem maltozy jako produktu �nalnego. Gªównym¹ródªem tego enzymu s¡ zbo»a takie jak: pszenica i j¦cz�mie« oraz soja. Znane s¡ jednak tak»e bakteryjne ¹ró�dªa β-amylazy. β-amylaza umo»liwia degradacj¦ ªa«cu�chów amylozy i amylopektyny poprzez hydroliz¦ wi¡za«α-1-4- glikozydowych pomi¦dzy drug¡ a trzeci¡ jednostk¡glukozow¡ licz¡c od nieredukuj¡cego ko«ca ªa«cucha. Wy�tworzona w ten sposób maltoza jest beta-anomerem. Po�niewa» enzym ten nie umo»liwia hydrolizy wi¡za« 1,6-gli�kozydowych produktami hydrolizy skrobi z jego udziaªems¡ maltoza (w przypadku amylozy) oraz mieszanina oligosacharydów o ró»nym stopniurozgaª¦zienia, tzw. dekstryny graniczne (dla amylopektyny). Optimum kwasowo±ci ±rodo�wiska reakcji dla tego enzymu wynosi okoªo 5 a optymalna temperatura dziaªania 55 -60◦C. Je±li chodzi o budow¦ enzymu to w odró»nieniu od innych enzymów hydrolitycz�nych skrobi beta-amylaza nie zawiera w centrum aktywnym jonów metali a jedynie grupymerkaptanowe (-SH). Wszystkie beta-amylazy trac¡ swoj¡ aktywno±¢ w obecno±ci takichzwi¡zków jak HgCl2, AgNO3 oraz jodu. Oba opisywane rodzaje egzoenzymów mog¡ by¢immobilizowane na no±nikach aczkolwiek tak jak w przypadku α-amylazy obni»a to efek�tywno±¢ dziaªania enzymów ze wzgl¦dów kinetycznych.

2.4 Enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia

α, β i γ - amylazy to enzymy które b¡d¹ to s¡ nieaktywne w stosunku do wi¡za« 1,6-gli�kozydowych b¡d¹ te» reakcja hydrolizy tych wi¡za« zachodzi przy ich udziale z niezo�dawalaj¡ca szybko±ci¡. Enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia dziaªaj¡ natomiast selektywniewªa±nie na wi¡zania α-1,6 glikozydowe w ªa«cuchach polisacharydowych, umo»liwiaj¡cpeªniejsz¡ hydroliz¦ skrobi. Najwa»niejszymi przedstawicielami tej grupy s¡ pullulanazaoraz izoamylaza.


Pullulanaza, pullulan-6-glukanohydrolaza; EC 3.2.1.41Enzym ten umo»liwia usuni¦cie rozgaª¦zie« zarówno amylopektyny jak i amylozy. Efek�

tem �nalnym jego dziaªania s¡ oligo- i poli- sacharydy o stopniu polimeryzacji z zakresu115 - 2300. Enzym ten jest z reguªy stosowany w kombinacji z α, β lub γ - amylazami.Optimum temperaturowe dla pullulanazy wynosi ok 60◦C. Chocia» enzym ten zidenty��kowano w takich ro±linach jak: baweªna, ry» i szpinak to jednak w celach przemysªowychizoluje si¦ go gªównie ze szczepów bakterii (np. Bacillus stearothermophilus). Pullulanazaumo»liwia hydroliz¦ wi¡za« 1,6- glikozydowych jedynie gdy wi¡zanie to scala ªa«cuchy po�lisacharydowe poª¡czone wi¡zaniem 1,4-glikozydowym (np. w pullulanie st¡d nazwa). Wzale»no±ci od zdolno±ci pollulanazy do hydrolizy oprócz wi¡za« 1,6-, tak»e ukªadów 1,4-rozró»nia si¦ dwa typy pollulanaz: I (nieaktywne w hydrolizie wi¡za« 1,4-) i II (aktywnew hydrolizie wi¡za« 1,4-).

2.4.1 Izoamylaza; glikogen 6-glukanohydrolaza; EC 3.2.1.68

Rysunek 12: Izomylaza ze szczepuPseudomonas amyloderamosa

Izoamylaza podobnie jak opisywana wy»ej pullula�naza jest enzymem umo»liwiaj¡cycm hydroliz¦ roz�gal¦zie« ªa«cuchów polisacharydowych tam gdzie wy�st¦puj¡ wi¡zania 1,6-glikozydowe. W odró»nieniu odpullulanazy izoamylaza nie hydrolizuje jednak wi¡�za« 1,6- w pullulanie lecz w glikogenie. Dziaªanie obuwymienionych anymów na skrobi¦ (amylopektyn¦)jest natomiast zbli»one. Opisane enzymy nie wyczer�puja wszystkich mo»liwo±ci enzymatycznej hydrolizyskrobi. Jednak to α, β i γ amylaza wraz z pullula�naz¡ i izoamylaz¡ maj¡ najwi¦ksze znaczenie przymy�sªowe.

2.5 Pomiar degradacji skrobiStopie« hydrolizy a wi¦c rozªo»enia skrobi mierzy sie z reguªy przy pomocy metod �zycz�nych lub chemicznych.

Metody �zyczne obejmuj¡ przede wszystkim pomiary zwiazane z okresleniem ±rednichmas cz¡steczkowych polimeru oraz rozrzutu mas cz¡steczkowych (najcz¦±ciej w formietzw. RCC czyli ró»niczkowego rozrzutu mas cz¡steczkowych. Do metod takich nale»¡:

1. pomiary wiskozymetryczne: lepko±¢ graniczna roztworów polimerów zwi¡zana jest


ze ±redni¡ mas¡ cz¡steczkow¡ równaniem Marka-Houwinka

η = K ·Mα (9)

gdzie K i α s¡ staªymi empirycznymi dla danego polimeru.

2. turbidymetryczne: wykorzystanie zjawiska rozproszenia ±wiatªa widzialnego przezcz¡stki bardzo rozcie«czonej zawiesiny lub roztworu koloidalnego (ukªadu dyspersyj�nego). Dokonuj¡c pomiarów w wi¡zce promieniowania przechodz¡cego przez ukªaddyspersyjny, otrzymuje si¦ wielko±¢ charakteryzuj¡c¡ rozproszenie (tzw. turbidan�cj¦), która jest proporcjonalna do st¦»enia cz¡stek zawiesiny. Pomiary mog¡ by¢wykonane za pomoc¡ zwykªych spektrofotometrów.

3. nefelometryczne: na podstawie pomiaru nat¦»enia ±wiatªa rozproszonego przez zawie�sin¦, pod okre±lonym (ró»nym od 180◦) k¡tem wzgl¦dem wi¡zki padaj¡cej, oznaczasi¦ st¦»enie tej zawiesiny lub rozmiary tworz¡cych j¡ cz¡stek.

4. osmometryczne: wykorzystuj¡c osmometri¦ parow¡

5. kriometryczne: obni»enie temperatury krzepni¦cia rozpuszczalnika w roztworze po�limeru.

6. jodometryczne: helisy skrobi o dªugo±ci powy»ej 20 DP, tworz¡ z jonami polijod�kowymi kompleksy inkluzyjne o zabarwieniu niebieskim. Intensywno±¢ barwy tychkompleksów wzrasta z dªugo±ci¡ ªa«cuchów amylozy i zale»y od temperatury i pH.Wad¡ metody jest brak jednoznacznego zwi¡zku mierzonej absorbancji ze st¦»eniemproduktów o okre±lonym DP.

7. spektroskopowe: widmo skrobi w podczerwieni ulega zmianom podczas hydrolizyza pomoc¡ glukoamylazy. Najwyra¹niejsze ró»nice obserwuje si¦ przy liczbie falowej1078 cm−1, gdzie nast¦puje znacz¡cy wzrost absorpcji, jak równie» przy 1020 cm−1,gdzie obserwowane jest zmniejszenie jej intensywno±ci. Pierwsza zmiana zwi¡zanajest z powstawaniem β-D-glukozy, druga natomiast z rozerwaniem wi¡zania α-1,4,które blokuje drgania s¡siednich wi¡za« C-O oraz C-C .

Do metod chemicznych nale»y przede wszystkim oznaczanie wytworzonych cukrówredukuj¡cych.

Bezpo±redni¡ metod¡ oznaczania aktywno±ci enzymów amylolitycznych jest pomiarszybko±ci tworzenia produktów hydrolizy. Poniewa» podczas amylolizy tworz¡ si¦ grupyredukuj¡ce, w oparciu o ich oznaczenie mo»na wnioskowa¢ o ilo±ci powstaªych cukrów.Wykorzystuje sie oznaczenia:


1. z heksacyjano»elazianem(III) potasu (redukuje si¦ do heksacyjano»elazianu(II) po�tasu)

2. Somogyi-Nelsona (jony miedzi(II) redukuj¡ si¦ do miedzi(I), daj¡c barwn¡ reakcj¦z arsenomolibdenianem)

3. z DNS (kwas 3,5-dinitrosalicylowy jest redukowany do kwasu 3-amino-5-nitrosalicylowego)

4. z CuSO4 i bichinolin¡ (jony miedzi(II) redukuj¡ si¦ do miedzi(I), daj¡c barwn¡reakcj¦ z 4,4'-dikarboksy-2,2'-bichinolin¡

Oznaczanie produktów hydrolizy skrobi mo»liwe jest tak»e przy u»yciu nowoczesnychmetod instrumentalnych, gªównie chromatogra�cznych. W szczególno±ci nale»y wymieni¢tutaj:

1. TLC - chromatogra�¦ cienkowarstwow¡

2. HPLC - wysokosprawn¡ chromatogra�¦ cieczow¡ wraz z jej odmiana chromatogra�¡»elow¡ (GPC)

3. HPAE-PAD - wysokosprawn¡ chromatogra�¦ jonowymienn¡ z impulsow¡ detekcj¡amperometryczn¡

2.6 Przemysªowe zastosowanie hydrolizy enzymatycznej skrobi.Metoda enzymatycznej hydrolizy skrobi umo»liwia otrzymywanie szerokiej gamy mody��katów skrobiowych z du»¡ wydajno±ci¡ i efektywno±ci¡. Spo±ród produktów o najwi¦k�szym tona»u wyró»nia si¦ produkcj¦: syropów skrobiowych, maltodekstryn, syropu glu�kozowego i glukozy krystalicznej oraz syropów maltozowych a po dalszej przeróbce tak»etakich nowoczesnych produktów jak syropy o wysokiej zawarto±ci fruktozy (High-FructoseCorn Syrup; HFCS)

2.6.1 Produkcja maltodekstryn.

Produkcja maltodekstryn przebiega zgodnie ze Rysunkiem 2.6.1. Przygotowana suspen�sja skrobi w wodzie jest zakwaszana do pH odpowiedniego dla zastosowanego enzymu anast¦pnie uzupeªniana o jony wapnia oraz pierwsz¡ porcj¦ enzymu. Tak otrzymana zawie�sina poddawana jest dziaªaniu wysokiej temperatury, co z jednej strony uªatwia szybkieskleikowanie skrobi z drugiej jednak powoduje inaktywacj¦ cz¦±ci dodanego enzymu. Poskleikowaniu mieszanina reakcyjna jest ochªadzana do wªa±ciwej temperatury pracy en�zymu oraz uzupeªniana o kolejn¡ jego porcj¦. Po zako«czeniu procesu, czyli osiagni¦ciu


warto±ci DE 20-40 w zale»no±ci od zakªadanego stopnia hydrolizy enzym jest inaktywo�wany poprzez zakwaszenie ±rodowiska oraz podwy»szenie temperatury a otrzymany syroppoddawany �ltracji i oczyszczaniu na w¦glu aktywnym. Otrzymane w ten sposób malto�

w o d n a z a w i e s i n a s k r o b i( 3 0 - 4 0 % w / v ; p H 6 . 5C a 2 + ; a - a m y l a z a )

k l e i k o w a n i e1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m i n

h y d r o l i z a( a - a m y l a z a ; 9 0 - 9 5 d e g9 0 - 1 2 0 m i n )

f i l t r a c j a i o c z y s z c z a n i e( w ê g i e l a k t y w n y )i n a k t y w a c j a e n z y m u( p H 3 - 5 ; 1 0 0 d e g ;5 m i n )

S Y R O PS K R O B I O W Y M A L T O D E K S T R Y N Y

Rysunek 13: Enzymatyczna produkcja maltodekstryn

dekstryny posiadaj¡ nast¦puj¡cy ±redni skªad: 0,3-1,6% glukozy, 0,9-5,8% maltozy, 4-11%maltotriozy i 1,4-6,1% maltotetraozy. Reszt¦ stanowi¡ poli- i oligo-sacharydy o DP > 4.Maltodekstryny charakteryzuj¡ si¦ mi¦dzy innymi takimi wªa±ciwo±ciami jak: niska higro�skopijno±¢, wysoka lepko±¢, a tak»e bardzo niska sªodko±¢ (w sensie sensorycznym) orazwªasno±ci hamuj¡ce wzrost kryszatªów w takich substancjach spo»ywczych jak lody. Impli�kuje to ich szerokie zastosowanie w przemy±le spo»ywczym (produkcja lodów i cukierków)i farmaceutycznym (powlekanie tabletek i produkcja syropów). Ponadto ze wzgl¦du naskªonno±¢ do kapsuªkowania aromatów wykorzystywane by¢ mog¡ do ochrony zwi¡zkówmaªocz¡steczkowych (np. aromatów »ywno±ci, skªadników leków itp.) przed utlenianiem.Nowoczesne zastosowania maltodekstryn w przemy±le spo»ywczym skupiaj¡ si¦ na stoso�waniu ich jako zamienników tªuszczy, od»ywkach dla sportowców oraz ±rodkach spo»yw�czych dla niemowl¡t.

2.6.2 Produkcja syropów glukozowych/glukozy krystalicznej

Produkcja syropów glukozowych metod¡ enzymatyczn¡ jest procesem wielostopniowym(Rysunek 2.6.2). Etapy wst¦pne, a wi¦c otrzymywanie suspensji skrobi oraz jej kleikowanie


s¡ identyczne z procesem otrzymywania maltodekstryn podobnie jak wst¦pne upªynnieniekleiku skrobiowego przy u»yciu α-amylazy. Kolejnym etapem procesu jest w przypadkusyropów glukozowych scukrzanie upªynnionej skrobi a» do warto±ci DE ok 95 w celuotrzymania maksymalnej wydajno±ci glukozy. Warto±¢ graniczna DE = ok. 95 wynika zmo»liwej reakcji repolimeryzacji glukozy przy wysokich jej st¦»eniach w obecno±ci amy�loglukozydazy. Kolejne etapy procesu obejmuj¡ oczyszczanie produktu (usuwanie biaªeki tªuszczy), dekoloryzacj¦ (na w¦glu aktywnym) oraz usuwanie skªadników mineralnych(kolumny jonowymienne). Syropy glukozowe produkowane metod¡ enzymatyczn¡ zawie�

w o d n a z a w i e s i n a s k r o b i( 3 0 - 4 0 % w / v ; p H 6 . 5C a 2 + ; a - a m y l a z a )k l e i k o w a n i e1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m i n

h y d r o l i z a( a - a m y l a z a ; 9 0 - 9 5 d e gD E < 1 5 )

f i l t r a c j a i o c z y s z c z a n i e( w ê g i e l a k t y w n y )

s c u k r z a n i e ( D E > 9 6 ; a m y l o g l u k o z y d a z a , p u l l u n a l a z a ;p H 4 . 5 ; 5 5 - 6 0 d e g ; 4 8 - 9 6 h

S Y R O PG L U K O Z O W Y

Rysunek 14: Produkcja syropu glukozowego.

raj¡ 94-98% glukozy, 1-3% maltozy, 0,3-0,5% maltotriozy i do 2% wy»szych polisachary�dów. Syropy te wykorzystywane s¡ w procesach biotechnologicznych bez udziaªu dro»d»y(produkty farmaceutyczne, synteza organiczna, produkcja witamin), do produkcji glukozykrystalicznej oraz syropów fruktozowych (np. HFCS). Z glukozy otrzymuje si¦ te» tzw.polidekstroz¦ o niskiej kaloryczno±ci oraz sorbitol.

2.6.3 Produkcja syropów maltozowych i syropu wysokoscukrzonego.

Zarówno syropy maltozowe jak i syrop wysokoscukrzony produkowane s¡ metod¡ enzyma�tyczn¡ dwustopniow¡. W pierwszym etapie po otrzymaniu suspensji skrobiowej poddajesi¦ j¡ kleikowaniu a nast¦pnie upªynnieniu (do DE max. 10 w przypadku syropów mal�tozowych i DE = 38-40 w przypadku syropu wysokoscukrzonego). Drugi etap procesupolega zwykle na procesie scukrzania enzymatycznego i de facto prowadzi do otrzymaniawªa±ciwego ko«cowego produktu. W przypadku syropów maltozowych proces ten prowa�dzi¢ mo»na na dwa sposoby (Rysunek 2.6.3) stosuj¡c ró»ne enzymy i warunki prowadze�


w o d n a z a w i e s i n a s k r o b i( 3 0 - 4 0 % w / v ; p H 6 . 5C a 2 + ; a - a m y l a z a )

k l e i k o w a n i e1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m i n

h y d r o l i z a D E 5 - 1 0( a - a m y l a z a ; 9 0 - 9 5 d e g9 0 - 1 2 0 m i n )

f i l t r a c j a i o c z y s z c z a n i e( w ê g i e l a k t y w n y )i n a k t y w a c j a e n z y m u( 8 0 - 8 5 d e g ;1 5 m i n )

S Y R O PM A L T O Z O W YO W Y S O K I E JZ A W A R T O � C IM A L T O Z Y( 7 0 - 8 5 % )

h y d r o l i z a D E 3 8 - 4 0( a - a m y l a z a ; � r o d . k w a � n e )

s c u k r z a n i e D E > 9 6 ; ( a - m y l a z a l u b b - a m y l a z a ;p H 5 . 0 - 5 . 5 ; 5 0 - 5 5 d e g )s c u k r z a n i e D E 4 5 - 6 0 ( a - m y l a z a l u b b - a m y l a z a ;p u l l u l a n a z a l u b i z o a m y l a z ap H 6 . 0 ; 5 0 - 5 5 d e g )

f i l t r a c j a i o c z y s z c z a n i e( w ê g i e l a k t y w n y )

s c u k r z a n i e D E 6 0 - 7 0 ( a - m y l a z a l u b b - a m y l a z a ;a m y l o g l u k o z y d a z ap H 6 . 0 ; 7 5 d e g )

S Y R O PM A L T O Z O W Y

S Y R O PW Y S O K O S C U K R Z O N Y

Rysunek 15: Proces otrzymywania syropu wysokoscukrzonego i syropów maltozowych.

nia procesu otrzymuj¡c syropy o ró»nej zawarto±ci maltozy. Zastosowanie enzymów usu�waj¡cych rozgaª¦zienia (pullulanaza lub izoamylaza) umo»liwia peªn¡ hydroliz¦ zarównoamylozy jak i amylopektyny, co skutkuje wysok¡ zawarto±ci¡ zwi¡zków niskocz¡steczko�wych (zwªaszcza maltozy). W produkcji syropu wysokoscukrzonego równie» stosuje si¦mieszanin¦ enzymów (α-amylaza i amyloglukozydaza) w celu zwi¦kszenia stopnia kon�wersji. Syropy maltozowe otrzymywane metod¡ enzymatyczn¡ znajduj¡ zastosowanie wpiwowarstwie, produkcji napojów, konserw i wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do »yw�no±ci uªatwia kontrol¦ wodochªonno±ci. Syropy te stosuje si¦ tak»e jako wypeªniacze istabilizatory »ywno±ci przetworzonej. Mo»na je, podobnie jak maltodekstryny, stosowa¢do opó¹niania wzrostu krysztaªów. Dodatkowo z syropu o wysokiej zawarto±ci maltozyprodukuje si¦ maltoz¦ krystaliczn¡ wykorzystywan¡ do w produkcji leków jako zamiennikglukozy dla diabetyków, maltitolu, maltulozy. Syropy te charakteryzuj¡ si¦ nisk¡ lepko±ci¡w roztworach, nisk¡ higroskopijno±ci¡ oraz stabilno±ci¡ w podwy»szonych temperaturach.

2.6.4 Inne zastosowania

Wytwarzanie polialkoholi Cukry otrzymywane w syropiarniach mog¡ by¢ poddawanekatalicznemu uwodornieniu, poª¡czonemu z rozdziaªem chromatogra�cznym. Umo»liwia tow miare efektywn¡ produkcj¦ polialkoholi, takich jak sorbitol, ksylitol, maltitol i erytritol.


Produkcja kwasów organicznych

Kwas cytrynowy jest najwa»niejszym kwasem organicznym, produkowanym w du�»ych ilo±ciach i wykorzystywanym w przemy±le spo»ywczym i farmaceutycznym. Wi¦kszacz¦±¢ produkcji opiera si¦ na Aspergillus niger. �ródªem w¦gla mog¡ by¢ mi¦dzy innymihydrolizaty skrobiowe i inne po»ywki oparte na skrobi

Kwas mlekowy produkowany jest gªównie w oparciu o maltoz¦ i glukoz¦. Bezpo�±rednia hydroliza skrobi jest mo»liwa przy udziale bakterii kwasu mlekowego: Lactobacillusthermophillus oraz Lactobacillus amylophillus.

Inne kwasy organiczne produkowane w syropiarniach to kwas itakonowy (do pro�dukcji tworzyw sztucznych, farb i lakierów) i glukonowy (prepearaty do czyszczenia, gluko�niany wapnia, magnezu i »elaza wykorzystywane s¡ jako dodatki wzbogacaj¡ce produktyspo»ywcze w odpowiednie sole mineralne).

Piekarstwo Preparaty amylolityczne s¡ wykorzystywane przy produkcji pieczywa wcelu zwi¦kszenia zawarto±ci cukrów w cie±cie, zintensy�kowania fermentacji, a co za tymidzie zwi¦kszenia obj¦to±ci mi¦kiszu i porowato±ci, poprawy koloru skórki, oraz polepszeniasmaku i zapachu pieczywa. Powstaj¡ce w wyniku dziaªania α-amylazy niskocz¡steczkowedekstryny wpªywaj¡ na przedªu»enie trwaªo±ci pieczywa, gdy» utrudniaj¡ powstawaniepoª¡cze« pomi¦dzy skrobi¡ i glutenem oraz spowalniaj¡ retrogradacj¦ skrobi.

Gorzelnictwo i browarnictwo �ródªem skrobi do produkcji etanolu mog¡ by¢ ró»nero±liny, np. kukurydza, pszenica, ziemniaki, maniok. Poniewa» dro»d»e zazwyczaj nie s¡zdolne do hydrolizy skrobi, u»ywa si¦ do tego celu preparatów enzymatycznych. Du»eilo±ci preparatów amylolitycznych zu»ywane s¡ tak»e przez browary, przy produkcji piwa,podczas zacierania (przy stosowaniu surowców niesªodowanych) i klarowania. Zastosowa�nie w browarnictwie surowców niesªodowanych i preparatów enzymatycznych zwi¦kszawydajno±¢ warzelni i obni»a koszty zwi¡zane z budow¡ i eksploatacj¡ sªodowni.

Produkcja acetonu i butanolu W roku 1914 Chaim Weizmann wyizolowaª Clostri�dium acetobutylicum, bakteri¦ zdoln¡ do przetwarzania skrobi w aceton i butanol. Zewzgl¦du na znaczenie militarne (produkcja nitrocelulozy) proces Weizmanna zostaª szybkowdro»ony i byª powszechnie wykorzystywany do ko«ca drugiej wojny ±wiatowej. Obecnie


(2003) technologia ta stosowana jest jeszcze w niektórych zakªadach na terenie Federa�cji Rosyjskiej. Ze wzgl¦dów ekologicznych technologia ta ma pewne szanse na powtórnewprowadzenie w innych krajach.

Produkcja pasz Dodatek odpowiednich enzymów do pasz mo»e poprawia¢ ich przyswa�jalno±¢, co obni»a wska¹nik zu»ycia pasz na przyrost ci¦»aru ciaªa. Do produkcji prepara�tów dla celów paszowych szczególnie nadaje si¦ Aspergillus oryzae, wytwarzaj¡cy enzymyamylolityczne i proteolityczne. Preparaty enzymatyczne mog¡ by¢ stosowane w procesieich produkcji lub jako bezpo±redni dodatek do gotowych mieszanek paszowych.

Biodegradacja α-Amylaza jest wykorzystywana jako dodatek przyspieszaj¡cy bio�degradacj¦ na skªadowiskach odpadów oraz w oczyszczalniach ±cieków.

Usuwanie zanieczyszcze« skrobiowych Zanieczyszczenia skrobiowe mog¡ by¢ usu�wane z ró»nego rodzaju produktów spo»ywczych i niespo»ywczych. Glukoamylaza jest wy�korzystywana do klarowania wina i soków owocowych. Wytªoki jabªkowe, u»ywane jakosurowiec w produkcji pektyny zawieraj¡ pewne ilo±ci skrobi. Ich obecno±¢ powoduje silnezm¦tnienie soku pektynowego i wpªywaj¡ niekorzystnie na proces �ltracji. Usuwanie skrobimo»na przeprowadza¢ ró»nymi metodami, (samosklarowanie, dodatek taniny, ozi¦bianie,�ltracja), jednak najkorzystniejsze jest u»ycie do tego celu α-amylazy o optimum pH 3�4.W przemy±le wªókienniczym u»ywa si¦ substancji sklejaj¡cych osnow¦ zawieraj¡cych skro�bi¦ lub jej hydrolizaty. W procesie odklejania tkanin konieczne jest dokªadne usuni¦cieklejonki, która przeszkadza w dalszych etapach technologicznych (bielenie, farbowanie,tªoczenie). W tym celu u»ywa si¦ preparatów α-amylazy. Podobne preparaty mog¡ by¢u»ywane tak»e do innych celów (oczyszczanie papieru, mycie naczy«, proszki do praniaitp.).

Zastosowania analityczne Badanie produktów hydrolizy skrobi ma istotne znaczeniew poznaniu budowy ziarenek skrobiowych, jak i wewn¦trznej struktury amylopektyny.Najcz¦±ciej wykorzystywane s¡ w tym celu egzoamylazy, gªównie β-amylaza, bowiem po�zostaj¡ce po ich dziaªaniu dekstryny graniczne dostarczaj¡ istotnych informacji na tematrozgaª¦zie«. Przykªadem zastosowania skrobi pozbawionej rozgaª¦zie« do celów analitycz�nych jest wykorzystanie jej jako wzorca do kalibracji mas cz¡steczkowych w chromatogra��i »elowej. α-Amylaza wykorzystywana jest tak»e przy oznaczaniu niestrawnego bªonnikapokarmowego (non-digestible �ber)


2.7 �wiczenia laboratoryjne2.7.1 Oznaczenie suchej masy

Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobiz dokªadno±ci¡ do 0,0001 g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦C przez1 godz. Nast¦pnie przenie±¢ próbk¦ do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢.Z ró»nicy mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynikprzedstawi¢ z dokªadno±ci¡ do 0,1%.

2.7.2 Przeprowadzenie hydrolizy

Na wadze analitycznej odwa»y¢ 1,75g skrobi w przeliczeniu na such¡ mas¦ (zaªo»y¢ zawar�to±¢ wody równ¡ 20% a po okre±leniu suchej masy uwzgl¦dni¢ odpowiedni¡ poprawk¦).Odwa»on¡ skrobi¦ przenie±¢ ilo±ciowo do wytarowanej kolby sto»kowej o poj. 300cm3.Zawarto±¢ uzupeªni¢ wod¡ destylowan¡ do masy 200g. Kolb¦ umie±ci¢ na wrz¡cej ªa¹niwodnej na okres 5 minut intensywnie mieszaj¡c zawarto±¢ (w celu otrzymania homogenicz�nego kleiku). Nast¦pnie otrzymany kleik gotowa¢ (stosuj¡c palnik gazowy) pod chªodnic¡zwrotn¡ przez kolejne 5minut. Caªo±¢ schªodzi¢ do temperatury 60◦C (50◦C lub 40◦C wzale»nosci od grupy) i po wytarciu kolby z zewn¡trz uzupeªni¢ ewentualne ubytki wodydo caªkowitej masy mieszaniny 200g. Caªo±¢ starannie wymiesza¢ i pobra¢ próbk¦ zerow¡do oznaczenia redukcyjno±ci (5 cm3). Do pozostaªej próbki doda¢ 0,5 cm3 roztworu en�zymu i zawarto±¢ intensywnie wymiesza¢. Hydroliz¦ prowadzi¢ w temperaturach 60◦C50◦C i 40◦C (zale»nie od grupy). Przed ka»dorazowym pobraniem próbki zawarto±¢ kolbywymiesza¢. Próbki do bada« pobra¢ po 2, 5, 8 15, 25, 45, 65, 80 i 90 minutach.

2.7.3 Wykonanie oznaczenia redukcyjno±ci

W badaniach posªu»y¢ si¦ krzyw¡ wzorcow¡ otrzyman¡ w trakcie ¢wicze« nt. hydrolizykwasowej. Do próbówek odmierzy¢ 5 cm3 mieszaniny pªynów Fehlinga, 5 cm3 próbki oraz15 cm3 wody. Próbk¦ ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni przez 5min, przenie±¢ do probówek wirów�kowych i odwirowa¢ (2 min, 5000 rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofotometryczny jakopisano to dla krzywej wzorcowej w ¢wiczeniu nt hydrolizy kwasowej. Okre±li¢ warto±¢DE dla kolejnych próbek i sporz¡dzi¢ wykres jego warto±ci w zale»no±ci od czasu.

2.7.4 Sprawozdanie

Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, wynikibada«, wykres zale»no±ci DE od czasu. Wszystkie otrzymane dane nale»y skomentowa¢ i


wyci¡gn¡¢ wnioski. Porówna¢ tak»e dynamik¦ zmian DE w zale»no±ci od rodzaju hydrolizy(kwasowa, enzymatyczna) oraz temperatury.

Utlenianie skrobi 31

3 Chemiczna mody�kacja skrobi: utlenianie

3.1 Wst¦p

Skrobie uzyskiwane bezpo±rednio z materiaªu biologicznego (tzw. naturalne lub natywne)maj¡, ze wzgl¦du na swoje cechy funkcjonalne, ograniczone zastosowanie praktyczne.Znacznie cz¦±ciej w procesach technologicznychuzywa si¦ skrobi zmody�kowanych, w któ�rych surowiec ten poprzez poddanie go procesom �zycznym, chemicznym, biologicznymlub innym dostosowuje si¦ do wymogów procesów technologicznych. Mody�kacja taka wznacz¡cy sposób wpªywa na polepszenie warto±ci u»ytkowych produktu oraz trwaªo±ci istabilno±ci wyrobu podczas jego przechowywania. Mody�kacja chemiczna poprzez stosun�kowo ªatwe wprowadzenia do polimeru nowych atomów lub grup funkcyjnych stanowi uni�wersalne narz¦dzie zmiany wªa±ciwo±ci polimerów i biopolimerów, w tym skrobi. Jednostkiglukozowe wchodz¡ce w skªad ªa«cuchów skrobiowych posiadaj¡ wolne grupy hydroksy�lowe, które s¡ podatne na dziaªanie wielu klas zwi¡zków organicznych i nieorganicznych.Mody�kacjom chemicznym poddawa¢ mo»na zarówno skrobi¦ ziarnist¡, skleikowan¡ jakrównie» wytr¡con¡ przed reakcj¡ (np. alkoholem etylowym). Mody�kacja skrobi ziarnistejpowoduje, »e reakcji ulegaj¡ jedynie zewn¦trzne warstwy ziarenek skrobi a szczególnieich powierzchnia. Procesy chemicznej mody�kacji skrobi bez wzgl¦du na stosowane czyn�niki mody�kuj¡ce oraz metod¦ ich przeprowadzania mo»na sprowadzi¢ do trzech zasad�niczych reakcji: estry�kacji, etery�kacji i utleniania. Proces utleniania skrobi sprowadzasi¦ do utleniania pierwszo- lub drugo-rz¦dowych grup hydroksylowych jednostek glukozo�wych z wytworzeniem grup karboksylowych lub karbonylowych. Ilo±¢ utworzonych grupzale»na jest mi¦dzy innymi od rodzaju utleniacza, warunków prowadzenia procesu orazpochodzenia botanicznego polisacharydu. Reakcji utleniania mo»e towarzyszy¢ cz¦±ciowadepolimeryzacja ªa«cuchów polimerowych lub/oraz rozlu¹nienie wi¡za« mi¦dzycz¡steczko�wych. Reakcje utleniania skrobi prowadzi¢ mo»na stosuj¡c jako czynniki utleniaj¡ce takiesubstancje jak: tlen lub powietrze (z zastosowaniem jako katalizatorów jonów metali przej�±ciowych), nadtlenki nieorganiczne np. H2O2 lub organiczne, utleniacze na bazie zwi¡zkówchlorowców (Br2, NaClO NaIO4 itp.), zwi¡zki azotu (N2O4, HNO3), zwi¡zki metali (np.CrO3) oraz utleniacze organiczne. Szczególnym przypadkiem utlenienia, któremu mo»epodlega¢ ka»dego materiaª organiczny a wi¦c i skrobia jest reakcja spalania prowadz¡cado tlenku w¦gla (IV) i wody. Spo±ród wy»ej wymienionych poª¡cze« o charakterze elek�tronatorów najwi¦ksze znaczenie maj¡: chloran(I) sodu, jodan(VII) sodu oraz nadtlenekwodoru.

32 Utlenianie skrobi

3.1.1 Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu

Skrobia utleniona chloranem (I) sodu znana jest jako tzw. skrobia chloranowana (ang.chlorinated starch) pomimo, »e w struktur¦ ªa«cucha skrobiowego nie zostaj¡ wbudo�wane atomy chloru. Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu prowadzi si¦ w roz�tworach skleikowanego polimeru. W reakcji tej utlenieniu do grup karboksylowych ulegacz¦±¢ pierwszorz¦dowych grup hydroksylowych (przy w¦glu C1). Grupy te ulegaj¡ utlenie�niu zarówno do grup karbonylowych (aldehydowych) jak i karboksylowych. W zale»no±ciod warunków prowadzenia procesu utlenienie ulega jedna grupa hydroksylowa na 35 do50 jednostek glukozowych. W wi¦kszo±ci wypadków procesowi utleniania chloranem (I)sodu towarzyszy cz¦±ciowa depolimeryzacja (degradacja) ªa«cuchów polisacharydowych.Stopie« utlenienia skrobi zale»y gªównie, oprócz st¦»enia utleniacza, od pH ±rodowiska

O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

COOH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CHO

glukozaglukoza

NaClO

Rysunek 16: Utlenianie skrobi przy pomocy NaClO

i pochodzenia botanicznego skrobi. Wysokie st¦»enie utleniacza umo»liwia transformacj¦wi¦kszej ilo±ci grup podobnie jak ni»sze pH (reakcje prowadzi¢ jednak nale»y przy pHlekko zasadowym). Ró»n¡ ilo±¢ utlenionych grup hydroksylowych otrzymuje si¦ te» w za�le»no±ci od pochodzenia botanicznego skrobi co wynika¢ mo»e z ró»nej zawarto±ci biaªekw materiale wyj±ciowym. Przyjmuje si¦, i» w warunkach reakcji najpierw utleniane s¡biaªka a dopiero potem skrobia. Wªasno±ci skrobi utlenionej NaClO ró»ni¡ si¦ od tychobserwowanych dla skrobi naturalnej. Wykazuje ona mi¦dzy innymi wi¦ksz¡ stabilno±¢ wwysokiej temperaturze, jest bardziej oporna na dziaªanie enzymów (α, β i γ amylaz) orazwykazuje zdolno±¢ do kompleksowania jonów wapnia, zachowuj¡c si¦ przy tym jako po�lielektrolit. Skrobia utleniona NaClO daje tak»e roztwory, pozbawione charakterystycznejdla skrobi natywnej opalizacji a kleiki ze skrobi utlenionej wykazuj¡ mniejsz¡ lepko±¢. Kle�iki te nie retrograduj¡. Spo±ród skrobi utlenionych tylko skrobia utleniona NaClO (E 1404)


mo»e by¢ stosowana jako dodatek do »ywno±ci. Preparaty zawieraj¡ce skrobi¦ utlenian¡chloranem(I) sodu stosuje si¦ jako stabilizatory przy produkcji ketchupów i do produkcjinadzie« do ciast, jak równie» jako zag¦stniki i pomocnicze ±rodki »eluj¡ce mi¦dzy innymido sosów, galaretek, budyniów i kremów. Tak zmody�kowana skrobia sªu»y tak»e jako±rodek pomocniczy w przemy±le papierniczym w celu zwi¦kszenia odporno±ci papieru nazrywanie.

3.1.2 Utlenianie skrobi w obecno±ci jodanu(VII) sodu

Dziaªaj¡c na skrobi¦ jodanem(VII) sodu (lub kwasem jodowym(VII)) otrzymuje si¦ tzw.skrobi¦ dialdehydow¡ (DAS). W mody�kacie tym wi¡zanie pomi¦dzy w¦glem C2 i C3ulega rozerwaniu z wytworzeniem na ka»dym z tych atomów grup karbonylowych (aldehy�dowych). Utlenianie skrobi DAS na przykªad przy u»yciu Br2 lub NaClO2 prowadzi nato�miast do powstania tzw. skrobi dikarboksylowej (DCS) w której wspomniane grupy alde�hydowe utlenione s¡ do grup karboksylowych. Obok procesu z udziaªem NaClO utlenianieNaIO4 jest gªówn¡ metod¡ przemysªowego utleniania skrobi. Skrobi¦ dialdehydow¡ wyko�

O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

NaIO4

O

O

CHO

O

CH2OH

CHO

glukozaglukoza

O

O

COOH

O

CH2OH

COOH

glukozaglukoza

[O]

Rysunek 17: Utlenianie skrobi przy pomocy NaIO4

rzystuje si¦ jako substancj¦ zag¦szczaj¡c¡ w po»ywkach dla bakterii tlenowych i dro»d»yjak równie» jako czynnik utrwalaj¡cy zapach (matryca do mikrokapsuªkowania). Skrobi¦DAS wykorzystuje si¦ tak»e jako dodatek w przemy±le tworzyw sztucznych zwi¦kszaj¡cywytrzymaªo±¢ i rozpuszczalno±¢ w wodzie materiaªów pomocniczych. Skrobia dialdehy�dowa charakteryzuje si¦ spadkiem lepko±ci i masy cz¡steczkowej w porównaniu do skrobinaturalnych a zmiany te zale»ne s¡ od stopnia utlenienia oraz od warunków prowadzeniaprocesu. Skrobi¦ utlenion¡ wykorzystuje si¦ tak»e w produkcji jadalnej folii skrobiowejoraz jako skªadnik ±rodków czysto±ci i tworzyw biodegradowalnych jak równie» substancji


spowalniaj¡cych korozj¦.

3.1.3 Utlenianie skrobi w obecno±ci H2O2

Nadtlenek wodoru jest jednym z coraz cz¦±ciej stosowanych utleniczy. Dzieje si¦ tak przedewszystkim ze wzgl¦du na jego walory proekologiczne: brak toksycznych odpadów poreak�cyjnych czy te» bezpiecze«stwo stosowania. Spo±ród utleniaczy H2O2 wykazuje jedn¡ znajwi¦kszych zawarto±ci aktywnego tlenu - 47% (odpowiednio dla NaClO - 21,6%, dlaNaIO4 - 7,0%) oraz bardzo wysoki potencjaª utleniania - 1,77V (odpowiednio dla NaClO- 1,63V, dla NaIO4 - 1,6V). Pomimo swojej atrakcyjno±ci nie jest on na razie powszech�nie stosowany jako utleniacz co wynika z jego niskiej reaktywno±ci wzgl¦dem wi¦kszo±ciorganicznych grup funkcyjnych oraz faktu, »e w obecno±ci poª¡cze« o charakterze elektro��lowym zachowuje si¦ jako nukleo�l nieprzejawiaj¡cy wªasno±ci utleniaj¡cych. Ta nieko�rzystna z punktu widzenia technologicznego wªa±ciwo±¢ wyeliminowana mo»e by¢ poprzezaktywacj¦ nadtlenku wodoru gªównie poprzez zastosowanie katalizatorów na bazie solimetali grup przej±ciowych (Cu, Fe, W, Pd, Ni, itp.). Reakcja utleniania przy u»yciu H2O2

katalizowana przez zwi¡zki metali mo»e mie¢ charakter jonowy lub rodnikowy. W przy�padku zwi¡zków »elaza i miedzi dominuje mechanizm rodnikowy. Proces ten nosi nazw¦reakcji Fentona. Utleniona w ten sposób skrobia zawiera grupy aldehydowe, które mog¡

O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

+ + H2O

+ Fe3+ O

O

OH

OH

O

CHO

glukozaglukoza+

H+

Fe2+

H2O2+O

O

OH

OH

O

CHO

glukozaglukoza

+ H2O

+

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH

OHO

O

OH

OH

O

CHOH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CHOH

glukozaglukoza

+

O

O

OH

OH

O

CHOH

glukozaglukoza OH

Rysunek 18: Utlenianie skrobi w procesie Fentona

tak»e by¢ utleniane "gª¦biej" a» do stadium kwasów karboksylowych. W metodzie utle�


niania skrobi przy u»yciu nadtlenku wodoru podobnie jak jest to w przypadku NaClOobserwuje si¦ depolimeryzacj¦ ªa«cucha polisacharydowego. Porównuj¡c oba opisywanesposoby utleniania obserwuje si¦ tak»e wy»szy stosunek zawarto±ci grup karboksylowych-COOH do karbonylowych -CHO ni» dla skrobi utlenionej NaClO.

3.1.4 Przemysªowe metody utleniania skrobi

Najbardziej popularn¡ i najszerzej stosowan¡ metod¡ przemysªowego utleniania skrobijest proces wykorzystuj¡cy jako utleniacz chloran (I) sodu. Proces utleniania przebiega wªagodnym re»imie temperaturowym (do 35◦C) i w ±rodowisku alkalicznym. Proces prowa�dzi si¦ do zaniku reakcji na chlor lub cz¦±ciej przerywaj¡c j¡ po osi¡gni¦ciu odpowiedniejlepko±ci przez zastosowanie ±rodka redukuj¡cego (tiosiarczan sodu, tlenek siarki(IV)). Po�niewa» utlenianie skrobi NaClO jest reakcj¡ egzotermiczn¡ temperatur¦ procesu regulujesi¦ szybko±ci¡ dodawania utleniacza lub przez bezpo±rednie chªodzenie reaktora. Otrzy�man¡ mieszanin¦ reakcyjn¡ zoboj¦tnia si¦, suszy i pakuje. Tak otrzymana skrobia utle�niona (ang. Oxidised starch) stosowana jest jako dodatek do »ywno±ci (E1404). Skrobie

w o d n a z a w i e s i n a s k r o b i( o k . 3 8 % w / v ; p H 9 - 1 03 0 - 3 5 o C , ; 3 % N a O H )

r e a k c j a u t l e n i e n i aN a C l O( 3 - 4 5 g C l /1 k g s m s k r o b i )

z o b o j ê t n i a n i e( H C l ; p H o k . 6 )

p r z e r w a n i e r e a k c j i( N a 2 S O 3 )

S K R O B I AU T L E N I O N A

P r z e m y w a n i e w o d ¹( d o z a n i k u r e a k c j i n a C l - )o d w a d n i a n i e ,s u s z e n i e

Rysunek 19: Przemysªowy proces utleniania skrobi chloranem(I) sodu

dwuladehydow¡ otrzymuje si¦ w zbli»onych temperaturach jednak w silnie kwa±nym ±ro�dowisku (pH ok. 1) zadaj¡c zawiesin¦ ziaren skrobiowych w wodzie kwasem jodowym(VII).


3.2 Wykonanie ¢wiczenia3.2.1 Oznaczenie suchej masy

Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi zdokªadno±ci¡ do 0,0001 g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦C przez 1godz.Nast¦pnie przenie±¢ próbki do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicymas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢z dokªadno±ci¡ do 0,1%.

3.2.2 Przeprowadzenie reakcji utleniania

3.2.3 Reakcja utleniania skrobi przy pomocy H2O2

Sporz¡dzenie roztworu katalizatoraOdpowiedni¡ ilo±¢ pi¦ciowodnego siarczanu(VI) miedzi(II) lub siedmiowodnego siar�

czanu(VI) »elaza(II) rozpu±ci¢ w 150ml wody destylowanej. Ilo±¢ katalizatora dobra¢ wten sposób aby stanowiª on 0,1% u»ytej w reakcji skrobi (100g).

Reakcja utlenianiaZe 100g (w przeliczeniu na such¡ mas¦) skrobi, roztworu katalizatora oraz wody de�

stylowanej sporz¡dzi¢ 40%w/w dyspersj¦ skrobi w wodzie. Naczynie z zawiesin¡ umie±ci¢w ªa¹ni wodnej o temperaturze 40◦C i ogrzewa¢ przez okres 60min stosuj¡c mieszaniemechaniczne i wkraplaj¡c przy tym 10% roztwor H2O2 w takiej ilo±ci aby ko«cowe st¦�»enie tego zwi¡zku w mieszaninie wynioslo 2%. Po wkropleniu utleniacza caªo±¢ miesza¢w temperaturze reakcji przez dalsze 30min. Po zako«czeniu procesu skrobi oddzieli¢ odroztworu na lejku Buechnera (intensywnie przepªukuj¡c materiaª wod¡ destylowan¡) i wy�suszy¢ w temperaturze 40◦C. W otrzymanym materiale oznaczy¢ zawarto±¢ suchej masyoraz zawarto±¢ grup karbonylowych i karboksylowych.

3.2.4 Reakcja utleniania skrobi przy pomocy NaClO

Ze 100g (w przeliczeniu na such¡ mas¦) skrobi oraz wody destylowanej sporz¡dzi¢ 40%dyspersj¦ skrobi w wodzie. pH zawiesiny nale»y ustali¢ na 10 przy pomocy roztworu NaOH(o st¦»eniu 2mol/dm3) korzystaj¡c z pehametu elektronicznego. Otrzyman¡ suspensj¦ mie�sza¢ przy u»yciu mieszadªa mechanicznego w temperaturze pokojowej wkraplaj¡c do niejroztwór chloranu(I) sodu (15% roztwór wodny o aktywno±ci 98gCl/1000g roztworu) wilo±ci takiej by byªa ona równowa»na 20g chloru na 100g skrobi. Po zako«czeniu wkra�plania caªo±¢ miesza¢ przez 50min. Nast¦pnie przy pomocy roztworu H2SO4 (1mol/dm3)


obni»y¢ pH suspensji do 7. Otrzymany produkt oddzieli¢ na lejku Buechnera (intensywnieprzepªukuj¡c materiaª wod¡ destylowan¡) i wysuszy¢ w 30◦C. W otrzymanym materialeoznaczy¢ zawarto±¢ suchej masy oraz zawarto±¢ grup karbonylowych i karboksylowych.

3.2.5 Oznaczenie zawarto±ci grup karboksylowych w skrobi utlenionej

W kolbce sto»kowej o pojemno±ci 100cm3 odwa»y¢ 5g skrobi wyj±ciowej z dokªadno±ci¡ do0,0001 g (w przeliczeniu na such¡ substancj¦), doda¢ 25cm3 HCl (o st¦»eniu 0,1mol/dm3),a nast¦pnie otrzyman¡ zawiesin¦ wytrz¡sa¢ przez 30minut w temperaturze pokojowej.Po tym czasie zawarto±¢ kolbki prze�ltrowa¢ pod pró»ni¡ przez lejek Schotta i przemy¢porcjami wod¡ destylowan¡ (okoªo 400cm3) do momentu zaniku reakcji na chlorki (próbaz AgNO3). Po przemyciu przenie±¢ próbk¦ do zlewki o pojemno[ci 500cm3 i doda¢ 300cm3

wody destylowanej intensywnie mieszaj¡c. Zlewk¦ umie±ci¢ we wrz¡cej ªa¹ni wodnej na15minut, mieszaj¡c od czasu do czasu zawiesin¦. Skleikowan¡ próbk¦ skrobi miareczkowa¢na gor¡co 0,1M roztworem NaOH do warto±ci pH = 8,3. Tak samo post¡pi¢ w przypadkuskrobi utlenionej. Obliczy¢ procentow¡ zawarto±¢ grup karboksylowych wiedz¡c »e na 1molgrup karboksylowych w skrobi przypada 1mol NaOH.

3.2.6 Oznaczenie zawarto±ci grup karbonylowych w skrobi utlenionej

Sporz¡dzi¢ roztwór chlorowodorku hydroksyloaminy przez rozpuszczenie 0,69g chlorowo�dorku hydroksyloaminy w 100cm3 wody destylowanej. Odwa»y¢ 3g skrobi wyj±ciowej. Donawa»ki doda¢ 40cm3 sporz¡dzonego roztworu NH2OH·HCl oraz 50cm3 roztworu NaOH(o st¦»eniu 0,1mol/dm3). Zawiesin¦ umie±ci¢ na mieszadle magnetycznym i miesza¢ przez30min w temperaturze pokojowej. Nadmiar NaOH odmiareczkowa¢ roztworem HCl (ost¦»eniu 0,1mol/dcm3) do pH=4 (z zastosowaniem pehametru elektronicznego). Pomiarpowtórzy¢ dla otrzymanych próbek skrobi utlenionej. Równolegle wykona¢ ±lep¡ prób¦dla próbki niezawieraj¡cej chlorowodorku hydroksylaminy. Obliczy¢ zawarto±¢ procentow¡grup karbonylowych.

3.3 SprawozdanieSprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, aprzede wszystkim wynikami bada«. Wszystkie otrzymane dane prosz¦ skomentowa¢ i wy�ci¡gn¡¢ wnioski. Nale»y zwróci¢ uwag¦ na zale»no±¢ ilo±ci grup karbonylowych i karbok�sylowych otrzymanych w produktach utleniania ró»nymi utleniaczami.

38 Estry�kacja skrobi

4 Chemiczna mody�kacja skrobi: estry�kacja

4.1 Wst¦p

Skrobia jako w¦glowodan nale»y do grupy polialkoholi. Wszystkie poª¡czenia z tej grupyzawieraj¡ grupy hydroksylowe podatne na reakcje z kwasami lub ich pochodnymi. Pro�duktami takich transformacji s¡ estry. W skrobi skªadaj¡cej si¦ z powtarzalnych jednostekglukozowych dla reakcji estry�akcji dost¦pnych jest dwie lub trzy grupy hydroksylowe (wtym jedna pierwszorz¦dowa a pozostaªe drugorz¦dowe) na jedn¡ jednostk¦ glukozow¡ coimplikuje mo»liwo±¢ syntezy szerokiej gamy tzw. estrów skrobiowych. Nale»y doda¢ »e es�try�kacji ulega¢ mog¡ zarówno pierwszorz¦dowe jak i drugorz¦dowe grupy hydroksylowechocia», zwªaszcza przy ni»szym stopniu podstawienia estry�kacji ulegaj¡ gªównie grupypierwszorz¦dowe (przy w¦glu C6). Estry�kacja skrobi zachodzi zarówno w przypadku or�ganicznych jak i nieorganicznych kwasów i ich pochodnych. Pochodne kwasowe zdolnedo reakcji estry�akcji ze skrobi² to gªównie: bezwodniki kwasowe, chlorki i tlenochlorki.Zmiana wªa±ciwo±ci skrobi estry�kowanej w porównaniu ze skrobi¡ natywn¡ umo»liwiaszerokie zastosowanie tego typu mody�katów w wielu dziedzinach przemysªu. Najistotniej�szymi estrami nieorganicznymi skrobi s¡: azotany(V), siarczany(VI) a przede wszystkimfosforany(V). Estry organiczne o szerszym zastosowaniu to gªównie pochodne acylowe,karbaminiany i ksantogeniany.

4.2 Octany skrobiowe

Octany skrobiowe otrzymuje si¦ najcz¦±ciej w zawiesinie wodnej poprzez dziaªanie napolisacharyd bezwodnikiem octowym (Rysunek 20) lub reakcje z octanem winylu (Rysu�nek 21). Proces przebiega w ±rodowisku alkalicznym ze wzgl¦du na konieczno±¢ wi¡zaniapowstaj¡cego kwasu octowego, który mo»e powodowa¢ degradacj¦ ªa«cucha polisachary�dowego. Uzyskiwany w tym procesie stopie« podstawienia wynosi ok. 0,1 przy czym wpierwszej kolejno±ci reakcji ulegaj¡ pierwszorz¦dowe grupy hydroksylowe. Co istotne, wprzypadku kleików otrzymanych z octanów skrobiowych o niskim stopniu podstawieniawykazuj¡ one mniejsz¡ tendencj do retrogradacji i synerezy. Octany skrobiowe znajduj¡zastosowanie w przemysªach wªókienniczym i spo»ywczym.W przemy±le spo»ywczym skro�bia acetylowana (o kodzie mi¦dzynarodowym E1420) znajduje zastosowanie jako dodatekdo sosów saªatkowych i majonezów o obni»onej zawarto±ci tªuszczu. Pochodna skrobiacetylowanej, acetylowany fosforan dwuskrobiowy (E1414) stosowany jest przy produkcjilodów i ich koncentratów a acetylowany adypinian dwuskrobiowy (E1422) u»ywany jestprzy produkcji majonezów.

Estry�kacja skrobi 39

O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

CH3

CH3

O

O

O

NaOH

O

O

OH

OH

O

CH2

O

CO

CH3

glukozaglukoza

CH3COONa H2O

+ +

+ +

Rysunek 20: Reakcja estry�kacji skrobi bezwodnikiem octwoym (substytucja grupy pierwszorz¦�dowej)

4.3 Fosforany skrobiowe

Grup¡ skrobi mody�kowanych o najszerszym zastosowaniu s¡ estry skrobiowe kwasu fosfo�rowego. W zale»no±ci od sposobu wbudowywania si¦ reszt kwasu fosforowego w struktur¦polimeru rozró»nia si¦ fosforany jednoskrobiowe (Rysunek 22) i dwuskrobiowe (Rysunek23). Stosowane w produktach »ywno±ciowych fosforany skrobi musz¡ wykazywa¢ si¦ niskimstopniem podstawienia. Wynika to z faktu, »e zbyt wysoka ilo±c fosforu mo»e negatywniewpªywa¢ na wzajemny stosunek wapnia do fosforu w organizmie konsumenta. Z tego po�wodu dopuszczone do zastosowa« spo»ywczych s¡ fosforany jednoskrobiowe o zawarto±cifosforu poni»ej 0,4% i dwuskrobiowe o zawarto±ci tego pierwiastka do 0,04%. Fosforany jed�noskrobiowe otrzymuje si¦ poprzez dziaªanie na skrobi¦ fosforanami (V) sodu lub potasulub te» dziaªanie trójpolifosforanami tych metali. W tym drugim przypadku otrzymuje si¦produkt uboczny w postaci pirodwufosforanu trisodowego, który musi by¢ usuni¦ty przezwymywanie. Reakcja estry�akcji przebiegaj w podwy»szonej temperaturze.

Fosforany jednoskrobiowe w stosunku do skrobi naturalnej charakteryzuj¡ si¦ przedewszystkim zdolno±ci¡ do p¦cznienia w zimnej wodzie oraz skªonno±ci¡ do tworzenia lep�kich dyspersji. Bardzo istotn¡ cech¡ tych mody�katów jest równie» wysoka zdolno±¢ wi¡�zania wody i to zrówno po zamro»eniu jak i po rozmro»eniu. Fosforany jednoskrobiowes¡ szeroko stosowane w przemy±le spo»ywczym jako zag¦stniki, dodatki do tzw. deserówbªyskawicznych (E1410 - fosforan jednoskrobiowy). Zastosowanie w przemy±le farmaceu�tycznym znajduj¡ natomiast sole estrów skrobiowych zawieraj¡ce wap«, magnez lub glin.


O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

O

CO

CH3

glukozaglukoza

+

+

CH2 CH O C

O

CH3

CH2 CH OH CH3 CHO

Rysunek 21: Reakcja estry�kacji skrobi octanem winylu (substytucja grupy pierwszorz¦dowej)

O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

OP

O ONa

OH

glukozaglukoza

Na2HPO4Na5P3O10

O

O

OH

OH

O

CH2

OP

O ONa

ONa

glukozaglukoza

H2O Na3HP2O7

+ +

Rysunek 22: Reakcja otrzymywania fosforanów jednoskrobiowych

Fosforany dwuskrobiowe s¡ przykªadem skrobi usieciowanej. Sieciowanie w znacz¡cysposób wpªywa na wªasno±ci otrzymanego mody�katu. Podobnie jak w przypadku wszyst�kich innych polimerów usieciowanie skrobi powoduje wzrost odporno±ci chemicznej i me�chanicznej jak równie» spadek rozpuszczalno±ci. Jako sieciowanie rozumie si¦ poª¡czenieprzy pomocy zwi¡zków dwu- lub wielo-funkcyjnych dwóch lub wi¦cej ªa«cuchów polime�rowych. Prowadzi to do znacz¡cego wzrostu masy cz¡steczkowej polimeru. Fosforany dwu�skrobiowe otrzymuje si¦ poprzez dziaªanie na skrobi¦ tlenochlorkiem fosforu lub te» trój�metafosforanem sodu. Reakcja z udziaªem tlenochlorku fosforu jest bardziej efektywna i


O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2OH

glukozaglukoza

POCl3

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

OP

O

OH

O

CH2

O

OH

OH

O

O

glukozaglukoza

+ + HCl

Rysunek 23: Reakcja otrzymywania fosforanów dwuskrobiowych z udziaªem tlenochlorku fosforu

zachodzi z wieksz¡ szybko±ci¡ chocia» stosowanie tego zwi¡zku stwarza niebezpiecze«stwoze wzgl¦du na toksyczno±¢ wydzielaj¡cych si¦ produktów gazowych oraz samego tleno�chlorku fosforu. W zale»no±ci od stopnia usieciowania skrobi dwufosforanowej zmienia si¦mi¦dzy innymi zdolno±¢ jej p¦cznienia. Niski stopie« usieciowania umo»liwia otrzymaniemateriaªu o wysokiej zdolno±ci p¦cznienia a sp¦czniaªe ziarna wykazuj¡ zwi¦kszon¡ odpor�no±¢ na oddziaªywania mechaniczne i wysok¡ temperatur¦. Wzrost stopnia usieciowaniaskrobi powoduje natomiast spadek podatno±ci na p¦cznienie a» do caªkowitej utraty tejwªa±ciwo±ci. Wraz ze stopniem usieciowania wzrasta tak»e temperatura kleikowania skrobioraz lepko±¢ kleików. Wªa±ciwo±¢ ta jednak równie» drastycznie spada przy wysokich stop�niach usieciowania ze wzgl¦du na zahamowanie p¦cznienia. Wykorzystuj¡c te wªa±ciwo±cimo»na otrzyma¢, poprzez regulacj¦ stopnia usieciowania, zag¦stniki o wysokiej stabilno�±ci. Dodatkowo fosforany dwuskrobiowe s¡ ukªadami odpornymi na podwy»szone tempe�ratury oraz stabilnymi podczas procesów zamra»ania i rozmra»ania nie wykazuj¡c przytym skªonno±ci do retrogradacji i synerezy. W Polsce produkawany jest preparat Fremix(oznaczony jako E1414, acetylowany fosforan dwuskrobiowy). Oprócz tego w przemy±lespo»ywczym wykorzystuje si¦ tak»e takie fosforany jak: fosforan dwuskrobiowy E1412,fosforowany fosforan dwuskrobiowy E1413 (stosowany przy produkcji ketchupu), hydrok�sypropylofosforan dwuskrobiowy E1442 (wykorzystywany przy produkcji knedli, pierogów,wyrobów z ciasta ziemniaczanego itp). Oprócz fosforanów dwuskrobiowych skrobie usiecio�wane uzyskuje si¦ tak»e w reakcjach skrobi naturalnej z czynnikami zawieraj¡cymi grupyadypinowe, glicerynowe itp.


O

O

OH

OH

O

CH2

OC

OH

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

OC

ONH2

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

ONO2

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

OSO3

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

OC

SS Me

glukozaglukoza

O

O

OH

OH

O

CH2

OC

SS S C

O

CH2

O

OH

OH

O

O

S

glukozaglukoza

glukozaglukoza

A B

C D

EF

Rysunek 24: Inne estry skrobiowe: A - mrówczan skrobi (skrobia formylowana); B - karbaminianskrobi; C - nitroskrobia; D - siarczan skrobi; E - ksantogenian skrobi; F - skrobia ksantydowa

4.4 Inne estry skrobiowe

Podatno±¢ skrobi na dziaªanie czynników estry�kuj¡cych umo»liwia syntez¦ wielu innychestrów skrobiowych wykorzystywanych w mniejszym lub wi¦kszym zakresie zarówno wprzemy±le spo»ywczym jak i tzw. zastosowaniach niespo»ywczych. I tak dziaªanie na skro�bi¦ kwasem mrówkowym powoduje otrzymanie mrówczanów skrobiowych. Produkty for�mylowania skrobi maj¡ jednak do±¢ ograniczone znaczenie. Ogrzewaj¡c skrobi¦ z moczni�kiem w obecno±ci odpowiedniego katalizatora uzyskuje si¦ tzw. karbaminiany skrobiowe.Cech¡ charakterystyczn¡ takich karbaminianów jest ich rozpuszczalno±¢ w zimnej wo�dzie i tworzenie ukªadów o bardzo wysokiej lepko±ci. Mieszanina karbaminianów i fos�foranów skrobiowych znajduje zastosowanie w przemy±le papierniczym i wªókienniczymjako ±rodek klej¡cy. Dziaªaj¡c na skrobi¦ tzw. mieszanin¡ nitruj¡c¡ (mieszanina H2SO4

i HNO3) otrzyma¢ mo»na niejednorodne pod wzgl¦dem budowy i struktury nitroskrobiewykorzystywane jako skªadniki mieszanin wybuchowych dla górnictwa i wojska. Przy u»y�ciu samego kwasu siarkowego (VI) lub tlenku siarki (VI) uzyskuje si¦ siarczany skrobiowe


sªu»¡ce jako koloidy ochronne, dodatki do klejów oraz jako ±rodek heparynopodobny. Wreakcji z disiarczkeim w¦gla w ±rodowisku zasadowym skrobia ulega transformacji do od�powiednich ksantogenianów. Ksantogeniany skrobi umo»liwiaj¡ mi¦dzy innymi usuwaniejonów metali ci¦»kich z wód i ±cieków. Stosowane s¡ tak»e w przemy±le papierniczymzwi¦kszaj¡c wytrzymaªo±¢ papieru i jego wodochªonno±¢. Utlenianie ksantogenianów skro�biowych prowadzi natomiast do tzw. skrobi ksantydowych równie» wykorzystywanych wprzemy±le papierniczym.

4.5 Wykonanie ¢wiczenia4.5.1 Oznaczenie suchej masy

Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi zdokªadno±ci¡ do 0,0001g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦C przez 1godz.Nast¦pnie przenie±¢ próbki do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicymas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢z dokªadno±ci¡ do 0,1%.

4.5.2 Acetylowanie skrobi

Do zlewki o pojemno±ci 500cm3 odwarzy¢ 100g skrobi (w przeliczeniu na such¡ mas¦). Dozlewki doda¢ wod¦ destylowan¡ do caªkowitej masy 300g. Caªo±¢ dokªadnie wymiesza¢ anast¦pnie zalkalizowa¢ do pH ok. 8-9 przy pomocy wodnego roztworu NaOH o st¦»eniu 3%.Próbk¦ umie±ci na mieszadle magnetycznym. Reakcj¦ prowadzi¢ w temperaturze pokojo�wej wkraplaj¡c powoli bezwodnik octowy (w ilo±ci 1mol, 2,5mola lub 3,5mola w zale»no±ciod grupy) przy ci¡gªym mieszaniu zawiesiny. Po zako«czeniu wkraplania mieszanin¦ reak�cyjn¡ miesza¢ przez dodatkowe 30min a nast¦pnie zakwasi¢ 10% roztworem kwasu solnegodo pH ok. 5,3. Mieszanin¦ ods¡czy¢ pod pró»ni¡ na lejku Schotta (G-3) a nast¦pnie prze�my¢ du»¡ ilo±ci¡ wody destylowanej. Otrzyman¡ skrobi¦ acetylowan¡ umie±ci¢ na szalcePetriego i suszy¢ w temperaturze 30◦C przez okres 1 godz. Ze wst¦pnie wysuszonej skrobipobra¢ ok. 12g materiaªu do oznaczenia stopnia zacetylowania. Pozostaª¡ cz¦±¢ materiaªuzwa»y¢, pozostawi¢ do wysuszenia na okres 1 tygodnia. Po wysuszeniu próbk¦ zwa»y¢ wcelu okre±lenia suchej masy próbki u»ytej do oznaczenia stopnia zacetylowania.

4.5.3 Oznaczenie stopnia zacetylowania

Odwa»one 12g skrobi zmody�kowanej przenie±¢ ilo±ciowo do kolby Erlenmayera o pojem�no±ci 250cm3 posªuguj¡c si¦ 65cm3 wody destylowanej. Caªo±¢ wymiesza¢ i doda¢ 3 kro�


ple wska¹nika alkacymetrycznego (fenoloftaleina). Do zawiesiny wkropli¢ 0,1mol roztwórNaOH a» do zmiany zabarwienia fenoloftaleiny utrzymuj¡cego si¦ przez czas dªu»szy ni» 1minuta. Do zawiesiny doda¢ dokªadnie 25cm3 0,5mol roztworu NaOH, wymiesza¢ i wytrz¡�sa¢ na wytrz¡sarce przez 35min. Po upªywie tego czasu caªo±¢ zmiareczkowa¢ 0,5mol mia�nowanym roztworem HCl. Równocze±nie zmiareczkowa¢ dokªadnie 25cm3 0,5mol NaOHprzy pomocy mianowanego, 0,5mol roztworu HCl. Na podstawie uzyskanych wynikówobliczy¢ stopie« zacetylowania.

4.6 SprawozdanieSprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, aprzede wszystkim wynikami bada«. Wszystkie otrzymane dane prosz¦ skomentowa¢ i wy�ci¡gn¡¢ wnioski. Nale»y zwróci¢ uwag¦ na zale»no±¢ stopnia zacetylowania otrzymanychproduktów od ilo±ci zastosowanego bezwodnika octowego.

Indeksα-amylaza, 4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu,

18α-amylaza termolabilna , 19α-amylaza termostabilna, 18β-amylaza, maltohydrolaza-α-1,4-glukanu,

20β-amylaza, 20γ-amylaza, 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu,

19γ-amylaza, 19beta-anomer, 20±rednia masa cz¡steczkowa, 215-hydroksymetylofurfural, 4, 9

achrodekstryny, 8amylodekstryny, 8amyloza, 4, 7apoenzym, 15Aspergillus awamori, 20Aspergillus niger, 19, 20, 27

bªonnik pokarmowy, 28Bacillus licheniformis, 18Bacillus stearothermophilus, 21Bacillus subtilis, 18

celebioza, 9chromatogra�a »elowa, 23chromatogra�a cienkowarstwowa, 23Clostridium acetobutylicum, 27Cu2O, 8

D-glukoza, 4dekstryny, 4dekstryny graniczne, 20Dextrose Equivalent, 7

disacharydy, 4DNS, 23

egzoamylaza, 18endoamylaza, 18energia aktywacji, 14energia swobodna, 14entalpia, 14entropia, 14enzym, 15enzym usuwaj¡cy rozgaª¦zienia, 18enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia, 20erytrodekstryny, 8

gencjobioza, 9glikogen 6-glukanohydrolaza, 21glikozylotransferaza cyklodekstryn, 18glukoamylaza, 19glukoza krystaliczna, 23GPC, 23grupa prostetyczna, 15

heksacyjano»elazian(III) potasu, 23Hordeum vulgare, 20HPAE-PAD, 23HPLC, 23hydrol, 12hydrolazy, 17hydroliza enzymatyczna, 4hydroliza kwasowa, 4

ilo±¢ obrotów, 17immobilizowanie, 20immobilzowanie, 19izoamylaza, 21izomaltoza, 9

45


izomerazy, 17

jednostka mi¦dzynarodowa, 17jednostki aktywno±ci, 17jodometria, 22jon wodorowy, 9

kapsuªkowanie, 24karbokation, 5katal, 17katalizator, 14, 15koenzym, 15kompleks przej±ciowy, 15kompleksy inkluzyjne, 22kon�guracja α, 18kriometria, 22krochmal zielony, 11kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 23kwas 3-amino-5-nitrosalicylowy, 23kwas 4-okso-pentanowy, 9kwas cytrynowy, 27kwas itakonowy, 27kwas lewulinowy, 9kwas mlekowy, 27kwas mrówkowy, 9

Lactobacillus amylophillus, 27Lactobacillus thermophillus, 27lepko±¢ graniczna, 21liazy, 17ligazy, 17

maltodekstryna, 23maltodekstryny, 8maltotrioza, 19maltoza, 4, 19merkaptan, 20metoda Somogyi-Nelsona, 23

nefelometria, 22nieredukuj¡y koniec ªa«cucha, 19

oksyreduktazy, 17osmometria parowa, 22

pier±cienia glukopiranozowy, 5polialkohol, 26próba jodowa, 8procesy odwracalne, 14pullulan-6-glukanohydrolaza, 21pullulanaza, 21

ró»niczkowy rozrzut mas cz¡steczkowych,21

równanie Arrheniusa, 14równanie Marka-Houwinka, 22równanie Michaelisa-Menten'a, 17równowa»nik glukozowy, 7reakcja Maillarda, 11reakcja redoks, 7rewersja, 9, 19rozpad glukozy, 8rozpuszczalno±¢ w alkoholu, 8

skr¦calno±¢ wªa±ciwa, 8skrobia, 4skrobia natywna, 4soforoza, 9sorbitol, 26staªa gazowa, 14staªa Michaelisa-Menten'a, 17staªa równowagi, 14staªa szybko±ci, 14syrop ±rednioscukrzony, 11syrop glukozowy, 17, 23syrop maltozowy, 23syrop niskoscukrzony, 11


syrop normalnie, 11syrop o wysokiej zawarto±ci fruktozy, 23syrop skrobiowy, 11, 23syrop wysokoscukrzony, 11

TLC, 23transferazy, 17trehaloza, 9trypsyna, 15turbidymetria, 22

wi¡zanie α- i β- 1,6-glikozydowe, 9wi¡zanie α-1,4-glikozydowe, 18wi¡zanie α-1,6 glikozydowe, 20wspóªczynnik przedekspotencjalny, 14wysokosprawna chromatogra�a cieczowa,

23wysokosprawna chromatogra�a jonowymienna

z impulsow¡ detekcj¡ amperome�tryczn¡, 23

Documents

przemysl_skrobiowy_2005_2006