técnica, del Knockin donde, en vez de eliminar una característica genética, susti-tuimos un gen endógeno por otro que puede proceder de cualquier especie.

Aunque la transgénesis de animales es muy llamativa, se está creando mucha más polémica con la manipulación genética de plantas; concretamente en aquellos casos destinados al consumo humano (Figura 3). Después de varios escándalos por culpa de soja y maíz transgénicos, la sociedad está mucho más sensibilizada y presta mucha más atención a los alimentos que ingiere. No obs-tante, la ciencia parece estar indicando no ya la necesidad de manipular alimen-tos que garantice la mejor distribución y conservación, sino la seguridad de los mismos. Sobre los métodos de manipulación de plantas trataremos al final del presente libro.

Figura 3.

¿QUÉ DATOS HISTÓRICOS RELEVANTES SE PODRÍAN CITAR?

Como cabría suponer, la manipulación genética de seres vivos es un hecho de absoluta actualidad, ¿no? ¡No! De hecho, datos sobre la creación de variantes de especies tanto en animales como en plantas se remontan práctica-mente a la historia escrita del hombre. Muchas de las razas actuales de perros, palomas y otros animales que hoy día convive con el hombre son fruto de la selección genética cuidadosa, mediante cruces muy concretos, durante años y años.

Se podría decir que la técnica de transgénesis realiza en poco tiempo y bajo condiciones muy precisas la labor que, de otra forma, llevaría años, en caso de ser factible.

Para las técnicas de transgénesis han tenido que converger una serie de logros científicos más o menos recientes. Podría empezar por citar los prime-ros logros en la transferencia de embriones in vitro hace ya más de un siglo. Concretamente, las primeras publicaciones al respecto datan de 1880, siendo de especial relevancia, los éxitos logrados en el campo por W. Heape en 1891. Poco a poco se fue consiguiendo el desarrollo parcial de un óvulo fecundado en medios de cultivo. Incluso, a mediados del siglo pasado ya se podían «crear» Quimeras, es decir, mezclar embriones en fase temprana de diferente proceden-cia para producir un «monstruo» procedente de varios padres (simultáneamen-te). Actualmente también se obtienen quimeras con la esperanza de que, en un porcentaje alto, la manipulación realizada aparezca en la línea germinal y, por lo tanto, la siguiente generación procedente de dicha quimera estaría constituida en su totalidad por animales transgénicos con modificación genética en todas y cada una de sus células.

Otro logro indispensable para la elaboración de animales, o plantas, trans-génicos se produjo en 1966. El método más empleado actualmente para la trans-ferencia de genes exógenos dentro de la célula se puso a punto por el grupo de T.P. Lin: La microinyección. En un principio bastó con la inoculación intracelular de gotitas de aceite. Mientras una micropipeta sujetaba un cigoto, otra aguja mu-cho más fina, capaz de penetrar en el interior celular, depositaba el aceite fácil-mente distinguible al microscopio. Esta técnica, fundamental para que unos cuantos años más tarde se obtuviera el primer transgénico, sigue siendo hoy día básica para cualquier proceso de transferencia genética en el interior celular, tan-to en el citoplasma como en el núcleo.

Apenas once años después del avance de la microinyección, J.B. Gurdon logró transferir material genético dentro de huevos de una especie de rana de-nominada Xenopus, muy utilizado a la hora de estudiar la expresión de genes, observando cómo el ADN era capaz de migrar hasta el núcleo y procesarse de forma correcta hasta dar lugar a la síntesis de proteínas concretas. Aún más llamativo fue el logro de R.L. Brinster (1980) de conseguir que el gen de la glo-bina de conejo se expresara en óvulos fecundados de ratón.

Simultáneamente a estos avances tecnológicos, hay que sumar otros mu-chos en biología molecular. En 1928, F. Griffith estableció al ADN como el principio transformante de pneumococos a formas virulentas. Dicho descu-

brimiento fue explicado y ampliado quince años más tarde por los O. Avery, C. McLeod y M. McCarty, reafirmando al ADN como el material genético guar-dián de nuestra herencia como seres vivos. Otro paso de gigante en el desarro-llo de la biología molecular tuvo lugar a mediados del siglo pasado: los trabajos de J. Watson, F. Crick y R. Franklin permitieron conocer a fondo la estructura del ADN (1953). Seis años más tarde, Severo Ochoa y A. Kornberg recibían el premio Nobel en medicina por sus trabajos en los mecanismos de síntesis de los ácidos nucleicos. En 1966, los brillantes trabajos de H.G. Nirenberg y M.W. Khorana permitieron descifrar el código genético: un diccionario compuesto por cuatro letras básicas (A, T, C, G) cuya combinación en grupos de tres en tres van nombrando los aminoácidos que son la unidad constitutiva de las pro-teínas, el armazón estructural y metabólico de la vida.

Para no hacer exhaustivo (eufemismo de «aburrido») este recorrido por la genética molecular, simplemente mencionar algunos de los más grandiosos descubrimientos acontecidos en el último tercio del siglo pasado: el descubri-miento de los retrovirus y, con ellos, de la enzima Transcriptasa Inversa o Retro-transcriptasa, herramienta indispensable en biología molecular (Temin, Baltimo-re, Dulbecco. 1969). Durante este mismo año, T.D. Brock y H. Freeze aislaron la bacteria termófila Thermus aquaticus, bacteria que vive a muy altas temperatu-ras y que es la fuente de la ADN polimerasa Taq, a su vez necesaria para que 20 años más tarde K. Mullis pusiera a punto la técnica que le aseguró el Nobel en 1993 denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction. Con esta técnica, prácticamente omnipresente en cualquier labo-ratorio moderno de biología molecular, se incrementa enormemente la capaci-dad de amplificación, identificación y manipulación del material genético.

Por supuesto, no se me olvida mencionar que hace unos años se hizo pú-blica la secuencia de la totalidad del genoma humano, a cargo de un gran núme-ro de empresas y laboratorios de todo el mundo unidos para dicho fin. ¡Y pen-sar que sólo cinco años antes, J.C. Venter y H.O. Smith hicieron pública la se-cuencia de la primera bacteria!

Todavía queda pendiente un enorme trabajo hasta que estos datos sobre la secuencia del genoma humano publicados acaben ordenados e indicando exactamente los genes que el ser humano dispone, su expresión en proteínas y, algo mucho más importante, su regulación.

En cualquier caso, todos estos descubrimientos y avances en biología molecular permitieron la transferencia de material genético de un ser vivo a

otro, así como la modificación parcial o total de genes concretos dentro de un organismo dado.

En resumen, gracias al desarrollo de las técnicas de biología molecular que acabo de mencionar, así como a los logros de microinyección de finales de los sesenta, se pudieron desarrollar con éxito, apenas 15 años después de los trabajos pioneros de Lin en 1966, las primeras transferencias génicas (Gordon y colegas, 1980; Brinster y colegas, 1981; Constantini y Lacy, 1981, entre otros).

Para terminar este minirrecorrido por algunos de los hitos más destaca-dos en genética y biología molecular, quería mencionar el que ha supuesto el mayor espaldarazo a la tecnología de transgénesis: la obtención del Nobel de Medicina y Fisiología, 2007, de los estadounidenses Mario Capecchi (por su-puesto, de origen italiano) y Oliver Smithies (de origen británico) y el británico (que se resistió a la nacionalidad norteamericana, por lo que se ve...) Sir Martin Evans. Tal y como reza en la Fundación para los premios Nobel (http://nobelprize.org), el prestigioso reconocimiento se otorgó por sus des-cubrimientos sobre «los principios para la introducción de modificaciones es-pecíficas de genes en ratones mediante el uso de células madre embrionarias»; una vía que, como veremos, permite la modificación (o inactivación) de cual-quier gen del animal estudiado de forma específica. Se estima que más de la mitad de los genes de un ratón (más de 10.000) han sido manipulados mediante este método. Gracias a esta técnica específica se han podido crear modelos murinos de enfermedades humanas, por poner el ejemplo más llamativo.

Actualmente se editan más de 200 revistas diferentes dedicadas, total o parcialmente, a la publicación de trabajos relacionados con la manipulación genética de animales y plantas. Del mismo modo, basta escribir palabras claves como transgenic ó genetic manipulation en cualquier buscador bibliográfico de in-ternet para perderse en las profundidades cibernéticas de la transgénesis. Al final del libro se indicarán, a modo de ejemplo, algunas de las páginas Web que considero más interesante sobre temas de manipulación genética en animales y plantas, tanto escritas en castellano como en inglés.

¿QUÉ APLICACIONES TIENE LA MANIPULACIÓN GENÉTICA?

Antes de contestar a esta pregunta habría que responder a otras tales como: ¿Qué necesidad tenemos realmente de manipular genéticamente nada?; ¿Compensan los supuestos beneficios de la manipulación genética de animales y plantas? y, ante todo, ¿qué necesidad hay de escribir un libro como éste?

Para justificar la necesidad de dedicar el presente «trabajo literario» a la descripción y caracterización de organismos transgénicos, baste con acudir a cualquier medio de comunicación actual donde se pueden tratar temas como la polémica sobre el etiquetado de alimentos genéticamente modificados, la crea-ción de animales «humanizados productores de leche con proteínas humanas», con precios de hasta varios miles de millones… ¡la unidad!, elaboración de animales transgénicos aptos para xenotrasplantes de sus órganos a humanos o la creación de peces decorativos fluorescentes, entre otros. En definitiva, el jugar a ser dioses creando especies con herencia genética propia y susceptibles de ser patentadas. Seguro que el fantasma de Frankenstein vaga por la mente de más de uno aunque, al contrario que en el monstruo creado por M. Shelley, en la transgénesis se crearía vida nueva a partir de organismos preexistentes vivos (Figura 4).

En contra de lo que podría parecer, la transgénesis juega un papel muy importante a favor de la ética en la manipulación de animales. ¡Ha leído bien! El hecho de alterar genéticamente las características de animales, permitiría ade-cuarlos a sistemas próximos a los humanos, de forma que no haría falta utilizar un gran número de individuos para que, estadísticamente, los resultados se pue-dan considerar relevantes. Es decir, podemos tener modelos de estudio de en-fermedades humanas en ratones, ratas o conejos. Por lo tanto, y al contrario de lo que podría parecer en un principio, la técnica de transgénesis hace disminuir en los laboratorios el número necesario de animales de experimentación, pues el hecho de poder introducir genes funcionales en dichos animales permite acotar mucho más ciertos procesos y sistemas biológicos.

Figura 4: Éste no es un transgénico...

La tecnología de transgénesis proporciona un modelo excelente de estu-dio de la regulación de la expresión génica y de procesos celulares tanto en condiciones fisiológicas como patológicas convirtiendo, a esta técnica, en la herramienta más empleada prácticamente en cualquier centro de investigación científica del mundo. De hecho, si hace apenas una década cualquier elabora-ción de un animal o planta transgénicos constituía un hallazgo publicable por sí mismo, en la actualidad dicha técnica constituye una herramienta más, aunque en muchos casos proporcione resultados concluyentes y definitivos de la inves-tigación que se esté desarrollando.

La metodología de la transgénesis ejerce una gran influencia sobre mu-chas disciplinas y áreas de investigación tales como biología, bioquímica, biolo-gía molecular, inmunología, microbiología, virología o medicina.

Para desarrollar en todas sus posibilidades dicha técnica se requieren, asimismo, amplios conocimientos de biología molecular, bioquímica, anatomía y fisiología animal, así como algunos conocimientos básicos de técnicas quirúr-gicas. Hay que tener en cuenta que prácticamente cualquier especie es suscepti-ble de ser manipulada genéticamente y que no es lo mismo manipular y reali-zar, por ejemplo, una transferencia de embriones en ratones que en una vaca.

Por todo ello, la producción de organismos transgénicos representa la convergencia de avances previos en el área de las tecnologías del ADN recom-binante, manipulación de cultivos celulares y embriones e, incluso, técnicas de reproducción asistida. El uso de esta técnica en disciplinas tan alejadas entre sí como la biomedicina o la agricultura hacen necesario el control de la expresión de los genes manipulados para dirigir y garantizar el correcto procesamiento en la célula, tejido, órgano e, incluso, organismo completo.

Entre las aplicaciones más importantes de la tecnología de transgénesis caben destacar las siguientes:

BASES GENÉTICAS DE ENFERMEDADES HUMANAS Y ANIMALES.

Muchas enfermedades, sino todas, tienen componentes genéticos implica-dos total o parcialmente en el desarrollo de la misma, así como en la susceptibili-dad del individuo a padecer dicha enfermedad. Procesos de hipersensibilidad o alergias, de autoinmunidad, como artritis, diabetes o lupus, incluso susceptibili-dad a desarrollar determinados tumores, tienen claras connotaciones genéticas. En muchos casos, el agente etiológico responsable último del establecimiento y desarrollo de la enfermedad sigue siendo desconocido. ¡Parece mentira que se siga desconociendo el causante último de la artritis, por ejemplo! En otros casos,

hay claros indicios de diferentes genes implicados en el desarrollo de determina-das enfermedades, pero se sigue desconociendo la interrelación entre ellos en la evolución del proceso. Es el caso de la enfermedad de Alzheimer, donde hay descritos más de 15 posibles genes implicados en mayor o menor medida en la susceptibilidad de padecer la enfermedad, tanto su forma presenil, antes de los 50 años, como la patología denominada propiamente Demencia senil. (Figura 5).

Figura 5

Asimismo, se sabe que determinados genes, que podrían tener un origen

vírico, juegan un papel destacado en la aparición y desarrollo de determinados tipos de cáncer. Proteínas esenciales en el proceso de división celular tales co-mo p53, Retinoblastoma, p16, c-Myc, c-Fos o la familia de oncoproteínas Bcl pueden intervenir, y de hecho lo hacen, cuando se produce la desregulación de su expresión, en el desarrollo de algunos de los tipos de tumores más frecuen-tes, tales como carcinomas, mielomas, linfomas o melanomas.

Mediante las técnicas de transgénesis se pueden elaborar modelos anima-les con la presencia en su genoma de aquellos genes humanos implicados en la susceptibilidad a padecer determinados procesos patológicos (knockin). Se pueden recrear, por ejemplo, enfermedades humanas en ratones. Cualquier gen sería susceptible de ser introducido en esta especie. Si dicha manipulación no es incompatible con la vida, podremos desarrollar animales con el potencial de

en la piel como en los ojos. Otras mutaciones conocidas son: Agouti, que pro-porciona un pelo negro con bandas subapicales amarillentas o la Brown (Ma-rrón), con pelaje más claro que el caso anterior (Figura 9).

En cualquier caso, no todas las cepas de ratón, como de cualquier otro animal, son aptas para experimentos de transgénesis. Entre las más utilizadas hay que destacar la cepa CBA, la C57BL/6, o cruces entre ambas que originan un ratón de pelaje marrón con reflejos amarillentos, y la cepa albina BALB/c. Por diferentes razones, no siempre conocidas, hay cepas que son muy poco recomendadas para su uso en técnicas de manipulación genética. Como ya vi-mos al principio del presente libro, personalmente pude comprobar esta reali-dad cuando intentaba transgenizar ratas. Después de varios años intentando conseguir ratas Lewis modificadas genéticamente, tuvimos que abandonar el proyecto. Actualmente, la cepa de rata más utilizada en transgénesis sigue sien-do la Wistar. ¡Lástima que para nuestra investigación en artritis no fuera un buen modelo!

Figura 9: Diferentes cepas de ratones utilizadas en investigación.

¿CÓMO OBTENEMOS EL MATERIAL GENÉTICO QUE VAMOS A INTRODUCIR EN EL EMBRIÓN?

Antes, incluso, de que tengamos claro qué cepa de ratón vamos a utilizar en nuestras investigaciones, obviamente tenemos que saber qué modificación genética vamos a producir y mediante qué técnica vamos a llevar a cabo dicha modificación.

Como ya analizaremos más adelante, algunas de las técnicas de biología molecular y manipulación genética permiten modificar de forma muy selectiva un gen concreto del ratón. Entre ellas, el cultivo y manipulación de células plu-ripotenciales de embrión está muy desarrollado actualmente siendo, en la me-dida de lo posible, la técnica de preferencia para muchos investigadores. No obstante, cuando no se requiere una inserción precisa del material genético para introducir se recurre a la microinyección. Con un buen microscopio de microinyección y no necesariamente mucho ADN purificado, en una tarde, ¡incluido el descanso para el cigarrillo, café o refresco!, se puede microinyectar hasta un centenar de óvulos recién fecundados. Más tarde, aquellos embriones que sean viables y capaces de seguir un desarrollo normal, podrán ser transferi-dos a una hembra para obtener la posible progenie transgénica.

Las técnicas de transferencia génica han avanzado, y lo siguen haciendo, mucho y cada vez la eficacia, y eficiencia, es mayor y la modificación realizada mucho más precisa (Figura 10).

En un principio, la microinyección era el único procedimiento de inser-ción nuclear de ADN exógeno. Las labores de purificación de ese material ge-nético eran tremendamente arduas, tediosas y no exentas de algún riesgo ya que se utilizaban sustancias corrosivas, tóxicas o cancerígenas como el fenol, cloroformo, ácido sódico o bromuro de etidio. Básicamente se tenía que «pes-car» del ADN cromosómico aquella secuencia que nos interesaba en nuestra investigación. A continuación, vamos a desarrollar un hipotético caso de puri-ficación de un gen (X):

Figura 10: Algunos aparatos propios de un laboratorio de Biología Molecular.

Imaginemos que queremos introducir en un ratón la proteína humana

«X», que podría ser la hormona de crecimiento, insulina, o un enzima específi-

co. Aunque prácticamente idéntico, el procedimiento a seguir puede variar según si se dispone o no de anticuerpos contra la proteína de nuestra elección:

En el caso de disponer de anticuerpos, preferentemente monoclonales, dirigi-dos contra diferentes epítopos o secuencias de aminoácidos de la proteína X, el punto de partida debería ser una Genoteca de expresión, que nos permitiría tener en vectores específicos todos los genes posibles listos para expresarse en dife-rentes tipos celulares. Es como tener una librería en casa donde cada libro con-sistiría en un trozo de ADN con instrucciones para fabricar una proteína. Aunque no tenemos necesidad de conocer la secuencia del gen de la proteína X, podemos purificar todos los ARN mensajeros que en un momento dado se producen en una célula:

a) Si nuestra proteína X no se expresara constitutivamente, es decir, la célula no la produjera a todas horas, podría darse la situación que, en el mo-mento concreto de la obtención y purificación de los ARNm no «pescáramos» dicho mensajero. En estos casos se puede recurrir a un «truco» científico muy elegante y socorrido. Se obtiene la totalidad de los mensajeros celulares en dife-rentes fases, garantizando que en una de ellas se expresa la proteína X. Median-te la enzima transcriptasa inversa procedente de los retrovirus, como el virus del Sida, se puede pasar todo ese material ARN a ADN. Una vez que hemos pasado todo el ARNm a ADN, podemos «mezclar» las moléculas de dos célu-las en distintas fases y favorecer la hibridación entre cadenas. Si se controlan bien las condiciones del ensayo, aquellas moléculas que no encuentren pareja quedarán «huérfanas» y corresponderán a aquellos mensajeros que se expresan diferencialmente sólo en uno de los tipos celulares. A continuación purificare-mos las cadenas que no han hibridado, entre las cuales deben encontrarse los mensajeros de nuestra proteína X. Esta técnica cada vez más en desuso, deno-minada Hibridación Sustractiva, permite delimitar muchísimo el material genético a tratar.

b) Si, por el contrario, nuestra proteína X se expresara constitutivamente, habría que manejar la totalidad de los ARNm pero, por otra parte, no sería necesario el procedimiento de hibridación detallado anteriormente. Cualquier población celular sería válida para expresar el mensajero de nuestra elección. En este caso, tenemos que elaborar una Genoteca de Expresión con los men-sajeros purificados entre los cuales, necesariamente, se debe encontrar el que codifica para la proteína X. Para elaborar esta Genoteca, tenemos que pasar todo el ARNm a ADN. Una vez que tenemos moléculas de ADN de doble cadena codificantes para todas las proteínas celulares, debemos utilizar un vec-

tor donde «pegar» dicho material. De esta forma, podremos manipular más cómodamente cada fragmento de ADN creciéndolo, incluso, en el interior de bacterias. Los vectores más eficaces suelen ser plásmidos de expresión o tam-bién bacteriófagos, como más tarde veremos. La sencillez de cultivo, creci-miento y manipulación de bacterias con respecto a células eucarióticas facilitan muchísimo la búsqueda del ADN codificante para nuestra proteína X. (Figuras 11a, b y c)

Existen diversos y cada vez más avanzados métodos de introducción y posterior expresión de material genético exógeno en bacterias. Obviamente, llevaría otro libro, ¡o varios!, detallarlos. En cualquier caso, uno de los primeros y más utilizados métodos descritos de introducción de ADN es la transforma-ción bacteriana. Sin embargo, este proceso tenía escasa eficiencia. Para aumen-tar la eficacia de expresión, el ADN se inserta en unos plásmidos especiales y comerciales que disponen de todos los elementos necesarios para la inserción del ADN y posterior «fabricación» de proteínas en el interior bacteriano. Estos plásmidos pueden introducirse en la bacteria por cualquiera de los métodos de transferencia genética detallados normalmente por las mismas casas comercia-les que nos proporcionan dicho vector. En otros muchos casos, se utilizan vectores virales para el «transporte» y protección del ADN. El bacteriófago más utilizado, casi, casi a exclusividad, es el Lambda (λ).

Figura 11a: Diseño de plásmidos utilizados en biología molecular.

Fig. 11b: Medios para el crecimiento y manipulación de bacterias.

Figura 11c: Fermentador para crecimiento de bacterias a gran escala.

El fago λ puede infectar bacterias, entre ellas E. coli, que es la especie

bacteriana más utilizada en biología molecular, y seguir dos caminos distintos. Por una parte puede actuar líticamente, destruyendo el cultivo bacteriano. Otras veces entra en un proceso muy regulado denominado lisogenia durante el transcurso del cual, el ADN viral se inserta en el genoma bacteriano, que-dando sujeto a la regulación de la maquinaria bacteriana, así como a un riguro-so y complicado control interno que lo mantiene en este estado de lisogenia. En un momento dado, y por factores no del todo esclarecidos, el fago abando-na la lisogenia y prosigue con su ciclo de infección, traduciendo sus genes y produciendo las proteínas estructurales que configurarán nuevos viriones, em-paquetando dentro de la cabeza viral una copia de su genoma completo. Fi-nalmente, la progenie vírica madura abandona su huésped bacteriano mediante lisis.

¿Por qué he tenido que realizar este alarde virológico y contar el ciclo vi-ral de un bacteriófago? Por dos razones: durante el empaquetamiento del ADN dentro de la cápsida, o cabeza del fago, queda espacio extra para poder añadir

ADN exógeno, como por ejemplo el gen de nuestra proteína X. Por otra parte, se puede eliminar ADN viral no esencial y aumentar la cantidad de ADN exó-geno para introducir. Incluso, aunque no me extenderé en este punto, se puede eliminar prácticamente todo el ADN del fago, dejar sólo los extremos, necesa-rios para la replicación viral, e insertar entre dichos extremos cantidades ingen-tes de ADN exógeno, constituyendo una estructura denominada Cósmido. En cualquier caso, el tener ADN exógeno empaquetado en una cápsida vírica le protege de ser degradado inespecíficamente y le permite llegar a un gran núme-ro de bacterias como si fuera una infección normal. Se puede alcanzar hasta el 100% de eficiencia según las condiciones y la cantidad de virus añadido.

En los últimos años, no obstante, se está utilizando el bacteriófago P1 para construir los denominados Cromosomas derivados del bacteriófago P1 o PACs, del inglés P1 bacteriophage-Associated Chromosomes. Estos fagos son parecidos, en su ciclo viral, al fago λ, con la diferencia que tras la infección de E.coli, el fago se circulariza pero no se integra en la bacteria, permaneciendo como un elemen-to episomal, es decir, independiente del cromosoma bacteriano. Es un virus con mayor capacidad de almacenar material exógeno que otros vectores (alre-dedor de 80-90 kb) y es uno de los elementos utilizados para expresión génica más extendido.

Tanto si hemos decidido emplear plásmidos de expresión o fagos como vectores, podemos insertar todo el ADN obtenido y purificado como previa-mente vimos y construir una Genoteca de expresión, esperando que todas y cada una de las moléculas de ADN acaben insertadas en el vector, entre las que suponemos se encuentra el gen de nuestra proteína X.

Suponiendo que tenemos la Genoteca empaquetada en el fago λ, pode-mos utilizar este virus para infectar un cultivo bacteriano susceptible. Utilizan-do las diluciones de virus correctas podemos llegar a tener infección bacteriana por fagos que contengan la mayoría de los ADN insertados. Si todo va bien, estas moléculas de ADN pueden ser correctamente procesadas y expresadas en las bacterias, produciéndose las respectivas proteínas recombinantes, entre las que seguimos esperando encontrar a nuestra querida X. Como suponemos que contamos con anticuerpos capaces de reconocer a X, podremos localizar al fago concreto que tiene insertado en su genoma el gen de dicha proteína X.

Si piensan que aquí se acaba el proceso, y el sufrimiento, ¡nada más lejos de la realidad! Una vez que hemos identificado el ADN codificante para la pro-teína X capaz de expresarse en bacterias, lo podremos utilizar para «pescar» el gen «real» dentro del genoma humano. Como comentamos al principio de este

apartado, hemos partido del ARN mensajero, no del gen existente en el cro-mosoma. Normalmente, el genoma humano tiene una gran cantidad de ADN que no codifica para proteínas pero que es necesario si queremos hacer un transgénico y queremos que se exprese una característica genética correctamen-te. Este ADN genómico será, por lo tanto, el que debamos microinyectar en el huevo recién fecundado de ratón, como más tarde veremos. Para ello, debe-mos contar con una Librería Genómica, análoga a la genoteca descrita para el ADN procedente del ARNm, consistente en el empaquetamiento de todo el genoma humano en fagos. Por supuesto, este empaquetamiento se ha realizado al azar. El ADN total se trocea con diferentes enzimas de restricción, capaces de reconocer secuencias concretas de ADN y cortar ambas cadenas, y se inser-ta aleatoriamente en ADN de fago. Con esta mezcla de fagos volvemos a infec-tar un césped bacteriano y, mediante extracción del ADN y posterior hibrida-ción con un fragmento pequeño del ADN codificante para nuestra proteína X, podremos pescar parte del gen. A partir de este punto, y de forma rutinaria, se localizará todo el ADN genómico codificante para X. Mediante técnicas estan-darizadas de biología molecular lo podremos amplificar, purificar y concentrar para el paso final: la introducción en el huevo fecundado de ratón y elabora-ción del animal transgénico.

Si a pesar de su complejidad, el lector ha seguido el desarrollo de la téc-nica descrita de clonación molecular, recordará que hemos partido de la posibi-lidad de disponer de anticuerpos contra la proteína X pero, como ya se estará temiendo, no siempre es así. ¡No tema, ya ha leído lo peor!

En el caso de no disponer de anticuerpos que nos permitan «pescar» el clon con el ADN deseado, se puede recurrir a una herramienta algo imprecisa pero ne-cesaria: la secuenciación de la proteína X y la deducción de la secuencia genéti-ca que codificará dicha cadena de aminoácidos.

Cada aminoácido está codificado por tres nucleótidos del ARNm de-nominados codón. En otras palabras, de los cuatro posibles nucleótidos que componen el ADN, un código formado por uniones de tres en tres, van con-figurando la secuencia de aminoácidos que forman una proteína. Por lo tanto, conociendo la secuencia de aminoácidos se podrá saber la secuencia que los codifica, ¿no?, ¡Pues no! Al menos, no tan obvio. Teniendo en cuenta los 4 nucleótidos distintos, cuyas iniciales son A, G, U, C, que constituyen el ARNm y que los codones están constituidos por tripletes (3 nucleótidos, 1 aminoácido), en teoría se pueden originar 64 combinaciones con capacidad para codificar 64 aminoácidos distintos. Puesto que sólo existen unos 20

aminoácidos constituyentes de proteínas, queda claro que más de un codón tiene que codificar para un mismo aminoácido. A este fenómeno se le deno-mina Deriva Genética. Cuando varios tripletes van a codificar para un mismo aminoácido, los dos primeros nucleótidos suelen ser idénticos, y la deriva se produce siempre con el último.

Por lo tanto, dada una secuencia de aminoácidos concreta existirá, teóri-camente, varias secuencias de nucleótidos codificantes posibles. Sin embargo, sólo una secuencia será la que se encuentre en el ARNm de la proteína X. ¡Sólo una secuencia será la verdadera!

Tendremos que construir diferentes sondas de ADN con secuencias posi-bles que pudieran codificar para la proteína que buscamos, y con ellas intenta-remos «pescar» del genoma el gen original por métodos análogos a los descri-tos en el caso anterior. En este caso, el número de falsos positivos y de «arte-factos» suele ser mucho mayor que cuando podemos disponer de anticuerpos.

Desde que se empezaron a utilizar todas estas técnicas de biología mole-cular hace ya varias décadas, los conocimientos del genoma humano se han disparado hasta el punto de que, hace pocos años, ha sido anunciado el final del proceso de secuenciación de dicho genoma. Conocemos cómo están orde-nados los nucleótidos y empezamos a conocer el número real de genes que poseemos (unos 25.000), pero todavía queda mucho para tener todos los datos, así como la regulación de la expresión génica o el significado de porqué más del 90% del genoma no tenga, aparentemente, función alguna.

Actualmente, para conocer la secuencia de un gran número de proteínas y de los genes que las codifican no hace falta más que tener un ordenador per-sonal conectado a la red. Existe un gran número de bancos de datos aptos para ser consultados desde cualquier rincón del mundo, siendo el del Laboratorio Europeo de Biología Molecular, EMBL, de Heidelberg, Alemania, uno de los más conocidos en Europa. A estos logros hay que sumarle el ya comentado anteriormente y que le supuso el premio Nobel a K. Mullis hace una década, la invención del PCR, nombre dado a la técnica y al aparato. Con él y utilizando ciclos de diferentes temperaturas, una polimerasa resistente al calor, la Taq, y procedente de una bacteria termófila, podrá copiar y amplificar n veces la se-cuencia de ADN que deseemos. Para ello no hará falta más que consultar el ordenador para poder confeccionar unos oligos, que nos permitan amplificar, purificar y concentrar el material genético que vayamos a utilizar en la transfe-rencia génica. Los oligos no son más que secuencias cortas de nucleótidos que reconocen e hibridan con la secuencia complementaria presente en el genoma y

que actúan de cebadores o iniciadores para que trabaje la polimerasa Taq. Utili-zando secuencialmente un número específico de oligos diseñados para cada caso, seremos capaces de amplificar la totalidad del gen deseado, por ejemplo el que codifica para la famosa proteína X, directamente de un extracto de ADN genómico.

Con este «curso intensivo» de técnicas de biología molecular para clona-ción genética con el que he bombardeado al lector a lo largo del presente capí-tulo, seremos capaces de obtener la cantidad adecuada, pura y concentrada, del gen con el que deseamos realizar nuestro trabajo de transgénesis.

Como ya hemos comentado anteriormente, la microinyección es la técni-ca de transferencia génica más utilizada. Permite la transferencia de una canti-dad casi ilimitada de ADN. En un principio, el tamaño del fragmento a transfe-rir estaba impuesto por el vector de clonaje utilizado. Los primeros plásmidos permitían la inserción hasta un máximo de 12 kb. Posteriormente, los cósmi-dos, consistentes en el máximo empaquetamiento posible dentro de una cápsi-da de fago λ, facilitaban la ampliación y clonación de hasta 45 kb.

La microinyección no favorece la inserción específica del fragmento de ADN exógeno en el genoma autóctono. Sin embargo, mediante el uso de fragmentos con secuencias específicas homólogas, idénticas a otras existentes en el genoma celular, sí se podrían producir estas inserciones en sitios contro-lados y concretos.

Existen otros procedimientos de inserción de grandes cantidades de ADN exógeno, aparte del fago P1 descrito anteriormente, que están ya muy estandarizados. De entre todos ellos, los YACs (Yeast Artificial Chromosomes) consisten en ADN procedente de levaduras con capacidad de admitir enormes cantidades exógenas de nuevo ADN. Estos YACs constituyen prácticamente pequeños cromosoma (¡hasta varias Mb de ADN!) que puede microinyectarse en un huevo fecundado.

Además de los YACs, actualmente se están elaborando los denominados BAC (Bacterial Aritifical Chromosomes) más fáciles de manejar que los YAC pues-to que trabajar con bacterias siempre resulta mucho más factible que con orga-nismos eucariotas. En este caso, hay que tener siempre en cuenta a la hora de la microinyección que podemos estar introduciendo material genético de proca-riota en núcleos de animales superiores, pero muchos investigadores despre-cian esta pequeña cantidad de ADN bacteriano, insignificante si la compara-mos con el genoma celular. Sin embargo, en otros muchos casos y para evitar

problemas, a la hora de la microinyección se extrae el inserto, es decir, el ADN que nos interesa introducir en el óvulo, de la estructura del BAC (Figura 12).

Figura 12: Matraces para cultivo bacteriano.

Mucho más reciente y espectacular que los vectores que acabo de descri-

bir, es el empleo de estructuras parecidas a los YACs, pero con ADN y ele-mentos de regulación de mamíferos denominados MACs, del inglés Mammalian Artificial Chromosomes. En este caso, realmente podemos estar hablando de pe-queños cromosomas que podrían actuar de forma autónoma dentro del óvulo manipulado.

Resulta, pues, fascinante el camino que la transferencia de genes desde un organismo a otro está emprendiendo ya que, al poder contar con elementos de regulación y expresión independientes y estables, se reducirá drásticamente la posibilidad de inserción al azar con el peligro de mutaciones y efectos no desea-dos que eso conlleva.

Muchos son los factores a tener en cuenta a la hora de garantizar el éxito en la producción de animales (o plantas) transgénicos. Los que respectan al ADN que vamos a insertar en un cigoto son:

• Aunque se sabe que el tamaño del inserto no es crítico, se ha demos-trado que ADN lineal con extremos cohesivos, es decir, cortados no

afectada por la manipulación y, de esta forma, la generación F1 puede estar formada ya por transgénicos completos (Figura25).

Debido a las peculiaridades de las células ES, se requiere mucha práctica en el manejo de cultivos celulares y mucho cuidado, además de tiempo y dine-ro, para conseguir su perfecto desarrollo in vitro sin que degeneren y pierdan su capacidad como «vehículo» de transgénesis o sin que se diferencien en la mis-mísima placa de Petri perdiendo su capacidad como células pluripotenciales con capacidad de regenerar cualquier tejido, órgano e individuo entero.

Figura 25.

Las células ES suelen derivar de la masa interna de blastocistos de 3.5-6

días postcoito, y una de las mayores dificultades para su estudio fue la selección del mejor medio de cultivo. En un principio (1981-89) se utilizaba medio condi-cionado de carcinomas embrionarios. Puesto que las células en cultivos pueden acu-mular muchas anomalías cromosómicas cuando no hay presión tisular, los pri-meros cultivos de ES se congelaban tan pronto como crecían y se iban descon-gelando según la necesidad.

Figura 26: Medio de cultivo DMEM.

Actualmente, los medios de cultivos están mucho más definidos y con-

trolados, siendo el denominado DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dul-becco) (Figura 26) suplementado con Suero Fetal Bovino uno de los más utiliza-dos. No obstante, se mantiene la congelación rutinaria por motivos de seguri-dad, esto es, para evitar la degeneración señalada anteriormente así como que una posible infección nos pudiera mandar al traste el trabajo de muchas sema-nas. Aún así, para evitar acumulación de mutaciones las ES no deberían man-tenerse en cultivo más de unas pocas semanas antes de la manipulación (Figura 27).

Figura 27: Campanas de flujo laminar para el cultivo de células.

Estas células ES tienen una morfología pequeña, son células que crecen

agregadas y no polarizadas. Tienen un núcleo y nucleolo grandes y una gran actividad de síntesis de proteínas.

Teniendo en cuenta la capacidad de diferenciación hacia diferentes tipos de tejidos que poseen las células ES, como estructuras epiteliales, musculares o nerviosas, deberemos asegurar la presencia de inhibidores de dicha diferencia-ción en el medio de cultivo. De esta forma, la modificación genética de estas células en placas de Petri no impedirá que tras su reimplantación en un blasto-cisto puedan llegar a formar parte de los futuros tejidos y órganos del nuevo animal. Esta inhibición de la diferenciación espontánea de células ES se consi-gue de varias formas. Por un lado, podremos añadir directamente Factor Inhibi-dor de Leucemia purificado, LIF, del inglés Leukemia Inhibitory Factor. LIF es una citoquina polipeptídica secretada por fibroblastos embrionarios primarios y líneas celulares fibroblásticas embrionarias tales como STO. También se puede disponer de una línea celular transfectada establemente con un plásmido de expresión para LIF. Sin embargo, LIF purificado resulta caro para tener que añadirlo durante el tiempo que dura el proceso de manipulación genética. Por ello, se suele recurrir directamente a la línea celular STO o a fibroblastos em-brionarios primarios de ratón, MEFs, del inglés Mouse Embryo Fibroblasts. Estos fibroblastos constituirán lo que se denomina Feeder Layer. Aunque prefiero uti-lizar el término en inglés, se podría hacer una traducción libre más o menos como Estrato alimenticio. La feeder layer producirá LIF y otros factores indispen-sables para mantener las células ES en cultivo.

La línea celular STO se estableció en 1975 y produce óptimas cantidades de LIF. Sin embargo, y debido a su excesiva capacidad para crecer, tenemos que irradiarla para evitar su proliferación en las placas de Petri. Por todos estos inconvenientes, muchos grupos de investigadores prefieren extraer sus propios MEFs de embriones murinos de entre 12.5 y 14.5 días, empleando DMEM como medio de cultivo. Como nada puede ser perfecto en ciencia, estas células MEFs padecen el fenómeno opuesto a las STO. No es una línea inmortal y tenemos que proceder a una obtención rutinaria y periódica de estos fibroblas-tos primarios (¡con lo que esto cansa!).

Tanto si utilizamos LIF purificado o feeder layer, las células ES obtenidas de blastocistos se mantendrán indiferenciadas. Tras varios pases y selección de las colonias adecuadas, ya podemos utilizar este material para la transferencia genética.

Dependiendo del resultado final que queramos obtener, existen dife-rentes métodos de transferencia de genes a células ES. Además, dependiendo del procedimiento deseado, el diseño del vector con el fragmento de ADN que hay que introducir también variará. En cuanto a los métodos de creci-miento, caracterización y purificación del ADN, éstos pueden ser los mismos que describí para la microinyección.

Como ya comenté anteriormente, la gran ventaja de los cultivos de ES es la posibilidad de introducir de forma precisa, mediante recombinación homó-loga, el fragmento exógeno de ADN. De hecho, podemos conseguir introducir un gen nuevo o bien sustituir uno ya existente por otro mutado, consiguiendo su pérdida funcional. En este último caso, obtendremos animales knockout con una posible deficiencia genética. No sólo no se utiliza una traducción al caste-llano para knockout (o knockin), sino que en algunos laboratorios se llega a em-plear el verbo knockear como la cosa más natural del mundo. Para esta inser-ción específica, el fragmento de ADN que vamos a utilizar tiene que contener amplias zonas de homología con el gen endógeno que queremos modificar. La inserción se suele producir mediante la formación de un doble entrecruzamien-to, consistente en la recombinación entre los extremos del fragmento deseado y la zona homóloga del cromosoma celular.

De entre todos los métodos utilizados en biología molecular para la inser-ción de material genético en el interior celular, La Electroporación es el que mejor resultados suele dar en el caso de cultivos ES. Para ello, tras despegar dichas ES de la superficie de la feeder layer y producir la disgregación de las colonias hasta tener células individuales, las colocaremos en cubetas especiales para este tipo de ensayo. En la misma cubeta añadiremos el ADN lineal que queremos introducir en las células ES. A continuación, mediante un electroporador que, por cierto, es bastante más barato que un microscopio de micromanipulación, sometemos la cubeta a un breve pulso de campo eléctrico que va desde los 200 V (unos 500 microfaradios) hasta los 800 V (3 microfaradios). A partir de este momento, volveremos a incubar las células electroporadas sobre la feeder layer, cambiando el medio regularmente para garantizar una óptima condición de crecimiento. Una vez que las células han superado la crisis que produce la electroporación y crecen aceptablemente, procederemos a seleccionar clones individualizados, por ejem-plo mediante técnicas sencillas de dilución límite. Si garantizamos que un cultivo ES procede de una única célula inicialmente electroporada, ya estaremos en con-diciones de comprobar si el ADN que hemos introducido ha sido correctamente incorporado. Normalmente, junto con el fragmento de ADN fruto de nuestra

investigación se puede añadir otro fragmento Marcador que nos sirve de control del ensayo. Por ejemplo, se puede añadir de marcador el gen de resistencia a determinadas drogas. De esta forma, añadiendo en el medio de cultivo la droga en cuestión (neomicina suele ser la más utilizada) podremos confirmar el éxito o no de la electroporación; asimismo, nos permitirá la selección de las células ES modificadas genéticamente por su resistencia a dicho antibiótico.

Posteriormente, estas células serán reintroducidas en un blastocisto y de aquí al útero de una hembra pseudopreñada la cual, dicho sea de paso, suele ser de color diferente a la hembra donadora del blastocisto. Así, podremos dife-renciar fácilmente a la progenie manipulada de aquella que proviene de un em-brión que no admitió el reimplante. Dicha progenie deberá ser analizada para ver la diferente expresión del transgén según tejidos y, tras cruces entre herma-nos, poder llegar a obtener una línea transgénica homocigótica.

A pesar de que la electroporación es el método más utilizado, no hay que obviar otras formas de transferencia de ADN en células eucarióticas. Ya hemos descrito cómo la microinyección en un pronúcleo de un huevo recién fecunda-do nos permite la producción de transgénicos puros. Aunque pocos son los grupos de investigadores que lo utilizan, en el caso de cultivos de ES también se puede utilizar la microinyección para introducir el fragmento de ADN de-seado. En este caso, la microinyección se realizará en un núcleo verdadero, no en pronúcleos, pero el esfuerzo nunca será recompensado con la producción de transgénicos completos, sino con animales quimeras.

Otro método con casi la misma aceptación que la electroporación es la transfección por coprecipitación de ADN/fosfato cálcico. Es un método muy estandarizado y que se utiliza rutinariamente en los laboratorios de biología molecular para introducir en muchos tipos celulares uno o varios fragmentos distintos de ADN. La eficiencia suele ser algo menor que la electroporación y, mucho más importante, se puede controlar menos el número de copias de ADN que se introduce así como el sitio de integración. Por ello, podemos con-cluir que cuando se desea producir modificaciones genéticas precisas la elec-troporación ha de ser nuestra elección principal.

Tal y como se ha indicado anteriormente, también se pueden utilizar para la transferencia génica vectores retrovirales. Con ellos podemos conseguir fre-cuencias de transferencia génica cercanas al 100% garantizando, por otra parte, la inserción de copias simples de ADN. Además, ¡y aunque parezca mentira!, la utilización de virus recombinante como vector proporciona un método mucho menos agresivo que la electroporación o la precipitación con fosfato cálcico.

Las células se recuperan de la infección con facilidad y no presentan más crisis que la que podemos producir con el fragmento de ADN que deseamos intro-ducir. El gran pero (¡cómo no!) de los vectores retrovirales nuevamente consiste en la arbitrariedad con la que el virus elige el sitio de integración en el genoma celular. Por ello, para la producción de recombinación homóloga, nuevamente deberemos echar mano de la electroporación.

Sin embargo, la facilidad del método, su alta eficiencia y el control del número de copias a introducir, hace de los virus recombinantes una herramien-ta muy valiosa no solamente para infectar células ES, sino también para susti-tuir en algunos casos la mismísima microinyección. En cualquier caso, el uso de estos vectores retrovirales nuevamente suele producir animales mosaicos o quimeras, dependiendo de si la infección la hacemos a huevos fecundados, mórulas o blastocistos que transferiríamos a nuevas hembras adoptivas o si, por el contrario, infectamos células ES que reimplantaremos en un blastocisto de un animal diferente.

Para poder utilizar un virus como vector de transferencia génica, éste de-be ser susceptible de manipulación originándose lo que hemos denominado Virus Recombinante. Esto se consigue sustituyendo algunos genes virales para insertar, en su lugar, el fragmento de ADN que desearemos transferir a la célu-la que infectemos. Los genes virales a sustituir serán aquellos que le pudieran conferir virulencia y, por lo tanto, pudieran producir la muerte por lisis o cual-quier otro mecanismo de la célula. También se pueden sustituir genes impor-tantes para el ciclo viral ya que, en la mayoría de los casos, no nos va a interesar que el virus sea viable intracelularmente, sino simplemente que sea capaz de penetrar y «descargar» el transgén para su inserción o expresión independiente de la replicación viral.

Muchos son los virus que actualmente son investigados para su potencial manipulación. Algunos virus recombinantes utilizados en biología molecular y terapia génica son: Herpes Simplex (HSV)(Figura 28), Virus de la Vacuna (Vaccinia), Adenovirus, Parvovirus, que es un virus muy prometedor en la lucha contra al-gunos tumores, y, por supuesto, Retrovirus (Figura 29). Éste último constituye el vector más utilizado para insertar en el genoma de la célula que infecta ADN exógeno, alcanzando una eficiencia próxima al 100%. Dentro de estos vectores víricos, los Lentivirus –retrovirus que pueden infectar tanto células en división como en reposo– ganan día a día nuevos adeptos.

El uso de retrovirus recombinantes como vía segura para la transferencia génica se viene utilizando desde la década de los 80, al principio en protocolos

de terapia génica, pero cada vez se emplea más como vector de transgénesis. Uno de los retrovirus más utilizados sigue siendo el de la leucemia murina (MuLV).

Figura 28: HSV-1.

Como ya se ha comentado, estos virus recombinantes garantizan la inte-

gración al azar de una sola copia de ADN por célula. Si necesitamos que nues-tro inserto se exprese, se puede incorporar un promotor propio con sus ele-mentos de regulación. Normalmente, se elaboran virus recombinantes donde el fragmento de ADN a insertar se encuentre bajo el control de las largas repeti-ciones terminales (LTR) del virus como único promotor y elementos de regu-lación de la transcripción. En este caso, se consigue una expresión constitutiva del ADN deseado.

Figura 34: Transferencia de células a la cavidad del Blastocele.

Por lo tanto, a la hora de elegir el mejor método de transferencia genética

tenemos que valorar las ventajas y desventajas de cada uno de ellos, según las características específicas de nuestra investigación. Inserción específica por recombinación homóloga para sustituir o mutar un gen concreto, inserción no necesariamente específica pero garantizando un mínimo de copias del transgén por célula o, simplemente, estudio del efecto de la expresión de un gen exóge-no concreto independientemente del sitio y número de copias insertadas.

¿CÓMO SABREMOS SI TENEMOS UN TRANSGÉNICO?

Considerando que hemos seguido la lectura de todos los procesos de manipulación genética en animales con detenimiento, a estas alturas estaríamos en disposición, por lo menos teóricamente, de emprender el proceso de trans-génesis.

Si se realizan todos los pasos correctamente y hemos tenido suerte (que tampoco está de más en ciencia...), al cabo de unas tres semanas de gestación nacerá «el resultado de nuestra manipulación». Según los casos, puede llegar hasta el final de su desarrollo hasta un 70-80% de los embriones.

Ahora llega el momento de la «gran verificación»: determinar si la cría nacida es transgénica o no (Figura35). Asimismo podremos observar si tenemos un transgénico completo, un mosaico o una quimera. En estos dos últimos casos rezaremos para que la línea germinal determinante de las gónadas haya asimilado el transgén, en cuyo caso, esa característica genética podrá ser trans-

mitida a la siguiente generación, pudiéndose establecer (¡y hasta patentar!) una nueva línea de transgénicos.

Figura 35

La forma de verificar qué tipo de animal tenemos es bastante sencilla y es-

tándar. En muchos casos, el fenotipo del animal recién nacido nos puede dar directamente pistas sobre su naturaleza. Por ejemplo, en el caso de transgénicos para la enzima Tirosinasa, enzima que participa, entre otras cosas, en la forma-ción de la melanina, si los huevos microinyectados pertenecían a una cepa de ratón albina, viendo el color de la piel y ojos de los recién nacidos sabremos si son transgénicos o no. Poco más tarde, viendo si el color del pelo es homogé-neo o hay mezcla de colores, sabremos si tenemos un mosaico.

Figura 36: En muchos casos se pueden elegir ratones de cepas y colores diferentes para facilitar

el seguimiento del transgén.

Obviamente, no siempre queda tan patente la inserción o no del transgén (Figura 36). En cualquier caso, para hacer un estudio genotípico más profundo extraeremos, mediante cualquiera de los métodos estandarizados con productos comerciales, una pequeña cantidad de ADN de la cola del neonato donde, a las tres semanas de vida, con apenas unos milímetros tendríamos suficiente. Nue-vamente hay que señalar que este método traumático podría ser sustituido por otros más éticos, como análisis de pelo, células de la mucosa bucal o heces… A continuación, analizaremos la presencia o no del inserto. Este análisis puede ser realizado mediante técnicas de hibridación de ADN:

• Southern blot: Tras purificar el ADN de la cola, separarlo en un gel de

agarosa, que consiste en un polímero que forma un entramado a tra-vés del cual se separan los fragmentos de ADN por tamaños, y trans-ferirlo a un filtro de nitrocelulosa como soporte sólido, se hibrida con una sonda de ADN marcada que reconocerá la secuencia del transgén produciendo una banda característica.

• Slot o Dot blot: Parecido al Southern, pero mediante diluciones seria-das del ADN a hibridar se puede cuantificar el número de copias del transgén integradas en el genoma celular (Figura 37).

• PCR: Método cada vez más utilizado para analizar la integración y cuantificación del transgén en diferentes tejidos. Es rápido pero puede

introducir muchos contaminantes y falsos positivos. Hacen falta ce-badores apropiados.

Figura 37: Ejemplo de Dot y de Southern blot. Cada mancha representa el reconocimiento de

una porción determinada de material genético).

• Digestión con endonucleasas de restricción y comparación con con-troles no transgénicos o, si la inserción ha sido por recombinación homóloga, mediante secuenciación del gen insertado o del celular.

Finalmente, también podremos (y deberemos) analizar diferentes tejidos

del animal si sospechamos la producción de un mosaico o si tenemos un ani-mal quimera por transferencia de células ES. Si el transgén tiene capacidad de expresión, podremos también analizar la producción de proteínas transgénicas en los diferentes tejidos animales, por ejemplo mediante técnicas tales como inmunohistoquímica o hibridación in situ, o bien mediante la técnica denomi-nada RT-PCR, consistente en purificar los ARN mensajeros, convertirlos en ADN mediante la transcriptasa inversa y realizar un ensayo por PCR, a ver si «pillamos» nuestro inserto y constatamos la transgénesis.

A partir de este momento, ya estaremos en disposición de utilizar esta nueva línea de ratones para cualquiera de los posibles estudios detallados al principio del presente libro: modelos de enfermedades, estudio de expresión génica o estudios biotecnológicos, entre otros.

¿QUÉ TIPO DE ANIMALES PODEMOS TRANSGENIZAR?La respuesta es más rápida si contestamos qué animales no podemos

transgenizar: ¡A nosotros!, y por motivos éticos y legales (espero que por ese orden...). Aunque el ratón es el animal estrella en las investigaciones sobre y con transgénicos, utilizándose en estudios de lo más variado e interesante, cada día aparecen nuevos casos de manipulación en animales de lo más variopinto, desde invertebrados (aéreos, terrestres o marinos) hasta mamíferos tan conoci-dos por todos nosotros como el caso de los cinco cerditos clónicos, varias ve-ces presentados en este libro, que han sufrido supresión de la expresión de algunas de sus proteínas implicadas en el reconocimiento inmune. Todavía no tengo constancia de que se haya publicado la transgénesis de las grandes espe-cies de mamíferos, como cetáceos o paquidermos pero, puestos a contar curio-sidades, ya se ha filtrado a la prensa la intención de un grupo de científicos de «resucitar» una especie extinta, el Tilacino (Figura 38), también llamado Lobo de Tasmania o Lobo Marsupial, utilizando una especie completamente distinta, el Dingo, es decir, una especie de perro salvaje de Australia y Tasmania, como donador de óvulos dentro de cuyo núcleo se insertaría el material genético del animal extinto. ¡Todavía está por ver lo que puede salir de aquí...!

Figura 38: Lobo de Tasmania, extinguido en 1936.

A lo largo del presente apartado voy a describir algunas curiosidades y di-ferencias más notables en el proceso de transgénesis de diferentes animales, en comparación con lo visto para ratones. RATAS:

Como ya hemos comentado, dejándome llevar en ocasiones por la pa-sión científica, hace unos años estuve empeñado en conseguir un modelo de ratas transgénicas en el estudio de artritis reumatoide. Partíamos de la expe-riencia en transgénesis en ratones, y pronto (con bastante dolor, por cierto) descubrimos el error de considerar extrapolable la puesta a punto de uno a otro sistema (Figura 39). El primer artículo científico sobre ratas transgénicas fue firmado por J. Mullins y colaboradores (1990) estudiando la hipertensión. Ela-boraron unas ratas transgénicas para el gen de ratón Ren-2 que sufrían de hiper-tensión. El doctor Mullins, consciente de las dificultades y diferencias de elabo-ración de ratas transgénicas con respecto al ratón, organizó e impartió un curso sobre manipulación genética de ratas en la universidad de Heidelberg (1990) y de-ntro del programa europeo Trans-gen-eur. En dicho curso, al que tuve el honor de ser invitado junto a cuatro afortunados más de diferentes laborato-rios europeos, se hizo hincapié en los aspectos diferenciales más notables del proceso: superovulación inducida por minibomba osmótica cargada con la hormona FSH o transferencia a una hembra pseudopreñada utilizando epine-frina como agente vasoconstrictor. Asimismo, debido a la mayor resistencia de las membranas del huevo fecundado, la microinyección en esta especie es algo más problemática. Y si encima tenemos la «suerte» de escoger una cepa con tendencia a tener un nucleoli diseminado por todo el pronúcleo, mejor dejar-lo...

Figura 39

El estudio con ratas se hace necesario cuando queremos modelos animales

en algunos trabajos de bioquímica o fisiología. Por su mayor tamaño con respec-to al ratón, en el caso de necesitar enzimas, proteínas o sangre, el sustrato de partida es mayor. También es más fácil manejarla a la hora de buscar venas u órganos pequeños, o si estamos haciendo un estudio de larga duración donde necesitamos muestras periódicas. Sin embargo, es lo suficientemente pequeña para poder manejarla bajo la lupa y para su mantenimiento en el animalario.

CONEJOS:

Junto a ratones y ratas, quizá sea el conejo el animal más abundante en cualquier animalario (Figuras 40a y 40b). Además de ser muy útiles para la ob-tención de anticuerpos, pueden ser utilizados como banco de pruebas de di-ferentes toxinas o drogas. El primer conejo transgénico apareció antes que la primera rata, en 1985, elaborado por R.E. Hammer y colaboradores. Una excelente ventaja de estos animales, que pueden ser maduros sexualmente a partir del 5º ó 6º mes, es su capacidad de tener ovulación inducida, es decir, las hembras ovulan al cruzarlas con un macho. Otro aspecto para destacar es la presencia de una gruesa capa de mucopolisacárido que rodea al embrión. La gestación dura alrededor de seis semanas, pero es bastante normal que antes del parto natural las crías se obtengan por cesárea.

Figuras: 40a y 40b.

Su gran tamaño y su sencillez en la microinyección (como en ratones)

convierten al conejo no sólo en un modelo de experimentación, sino en un animal querido biotecnológicamente hablando. Conejos han sido utilizados,

¿DEBEMOS TENER MIEDO A LAS PLANTAS Y ALIMENTOS TRANSGÉNICOS?

Si cualquiera de los lectores se pasea por su supermercado favorito, difí-cilmente va a encontrar, de momento, unas chuletas de un cordero transgénico, o un pollo que haya sido transgenizado con la hormona de crecimiento de va-ca. Hormonado seguro que sí, pero no transgénico. Tampoco encontrará una botella de leche con proteínas distintas a las de la vaca que la produjo. Este panorama podría cambiar en los próximos años si el desarrollo de la tecnología de transgénesis, los controles y las leyes siguen su curso.

Sin embargo, algo que usted sí podría encontrar hoy mismo en algún su-permercado es chocolate con algún ingrediente modificado genéticamente, aceite, maíz, tomates (en constante desarrollo), arroz o soja procedentes de plantas transgénicas.

En principio, la modificación genética permitiría crear plantas más nutri-tivas o resistentes a diversos organismos perjudiciales (Figura 53). También podrían utilizarse para producir vacunas o compuestos de interés industrial, como la materia prima para plásticos biodegradables. Asimismo, mediante transgénesis se espera obtener en un futuro próximo productos de consumo humano tan apetecibles como uvas con piel fina (para las campanadas…), ta-baco sin nicotina o café con menos cafeína, pongamos por caso…

Sin embargo, pocas noticias sobre alimentación están suscitando en los tiempos que corren tanta polémica y discusiones entre los diferentes sectores de la sociedad como aquellas sobre manipulación genética de alimentos. Hace unos años presentaba un pequeño programa de televisión (Con.Ciencia) en una aún más pequeña emisora local de Madrid sobre temas de actualidad cien-tífica como clonación, sol y cáncer o manipulación genética de animales y plantas. En uno de dichos programas pude comprobar «en vivo y en directo», entrevistando a vecinos de Madrid, el rechazo que, de entrada, provocaba la palabra Manipulación. Sin embargo, al realizar dichas entrevistas comprobé que el rechazo estaba básicamente provocado por la ignorancia. Muy pocos de los entrevistados alcanzaban a comprender en qué consistía dicha manipulación. No obstante, cuando enumerábamos algunas de las virtudes de la transgénesis de plantas, el rechazo frontal inicial daba paso a una duda razonable. La mis-ma duda que, por qué no decirlo, podemos tener los propios investigadores. De hecho, no hay que olvidar que La Ciencia navega y avanza siempre sobre un mar de dudas. Dichas dudas tienden a desaparecer cuando el método cientí-fico va comprobando y verificando las hipótesis iniciales de trabajo.

Figura 53.

¡El comercio de plantas y la ingesta de alimentos transgénicos es ya una

realidad! El debate entre defensores y detractores puede llegar a ser muy «apa-sionado», eufemísticamente hablando... Una vez más hay que señalar que la presión social, estatal y de grupos ecologistas no solamente no está de más, sino que es absolutamente necesaria para el perfecto seguimiento de cualquier innovación en ciencia. Sin embargo, y también lo pude constatar en mis pro-gramas televisivos, algunos de estos «grupos de presión» tienden a mezclar conceptos y a «coleccionar» errores científicos, que los hay, ¡y muchos!, para atacar indiscriminadamente cualquier proceso biotecnológico nuevo, mostrán-dolo como algo que conduce irremediablemente a la destrucción del planeta. En algún debate sobre transgénesis se ha llegado a mencionar, como argumen-to en contra, los lamentables resultados de aquel famoso aceite manipulado hacia 1981, pero no genéticamente, de colza o los casos de vacas locas comedo-ras de piensos de dudosa procedencia. Por el contrario, pocos defensores de «lo tradicional» parecen hacerse eco de los grandes avances de la sociedad mo-derna, aún teniendo en cuenta las diferencias entre países del norte y del sur, que, entre otras cosas, han llevado al hombre actual a una longevidad que su-pera en más de un 25 % a la de principio de siglo.

Como científico, soy el primer escéptico a la hora de lanzar a los cuatro vientos las virtudes de una pócima mágica que salve al mundo de la miseria, el hambre, las guerras, ¡y que, además, hiciera crecer el pelo!.. Considero que siempre se pueden efectuar más pruebas, siempre más controles. Como hom-

bre, considero que una sociedad avanza hacia la bruma que supone el descono-cimiento del futuro que se aproxima. Cada paso que damos hace retroceder en la misma proporción, pero nunca desaparecer, dicha bruma. Pero esos pasos que damos no están exentos de riesgo. El método científico bien aplicado pro-cura que ese riesgo esté lo más controlado posible.

Como profano en manipulación de plantas voy a permitir que expertos en la materia opinen. No hay más que utilizar un buscador de internet y teclear términos como «transgénico», «manipulación genética» o «alimentos transgéni-cos» para darse uno cuenta del verdadero calado que el tema presenta en la sociedad en este principio de milenio. Por citar un ejemplo, con el término «transgénico» aparecen en el buscador www.google.com más de 620.000 citas, ¡y en castellano! Muchas de estas páginas han sido creadas por expertos que defienden ardientemente su postura tanto a favor como en contra de la mani-pulación genética.

Los argumentos en ambos sentidos cuentan con todo mi respeto. Algu-nos de ellos están realizados por profesores y científicos de reconocido presti-gio. Muchos de dichos discursos están muy bien documentados y abarcan to-dos los temores y dudas que la sociedad pudiera tener sobre el tema aunque, si debo ser sincero, considero que cada vez quedan menos rincones para los... temores. He elegido dos páginas Web como representativas de posturas diame-tralmente opuestas y a continuación paso a resumir y comentar algunos de los puntos de mayor interés.

Comenzaré por los argumentos CONTRARIOS A LA TRANSGÉNE-SIS. Para ello, me centraré en el trabajo realizado por el Profesor Miguel Altieri de la Universidad de California sobre los Mitos más extendidos referentes a la manipulación genética de plantas y alimentos. Es un documento que se puede encontrar en diferentes páginas de internet aunque, como referencia, sugiero la siguiente URL (pidiendo perdón por la parrafada…): http://www.ambiente-ecologico.com/ediciones/070-05-2000/070-miguelaltieri-biotecnologia.html

Algo que preocupa especialmente es la Cuestión Económica. En principio, una de las premisas de la manipulación genética de plantas sería poder acabar, o reducir, los grandes periodos de hambruna en el mundo. Sin embargo, para el autor del documento denominado «Mitos de la biotecnología agrícola», el principal interés de las empresas biotecnológicas que desarrollan tecnología de transgénicos en plantas se basa en el económico personal, es decir, el enrique-cimiento a costa de los recursos naturales del planeta. Personalmente, conside-ro bastante aceptable que una empresa privada quiera hacer negocio con su

producción. Su supervivencia depende de ello. Lo que consideraría alarmante y es hacia donde apunta el documento que describe Altieri, es si ese proceso de productividad rentable prevalece sobre el fin inicial que debería perseguir la modificación genética de plantas: favorecer el desarrollo de la CIVILIZA-CIÓN, ¡con mayúsculas!

Teniendo en cuenta los posibles riesgos y beneficios a obtener, se plan-tean los siguientes interrogantes:

• ¿Quién se beneficia de la manipulación genética? • ¿Cuáles son las consecuencias para el Medio Ambiente y la Salud? • ¿A qué necesidades responde esta tecnología? • ¿Cómo, para qué y para quiénes está concebida? • ¿Cuáles son los criterios éticos que guían la investigación con transgé-

nicos? Las corporaciones de agroquímicos que buscan la innovación agrícola

mediante el uso de manipulación genética de plantas persiguen la resolución de los problemas de baja productividad, pobreza y hambre del tercer mundo. A finales de los 80, una de las mayores empresas sobre manipulación de plantas, Monsanto, indicaba que la agricultura del futuro elaboraría productos basados en los métodos propios de la naturaleza, con un sistema agrícola amigable para el medio ambiente y más provechoso para el agricultor. Desde entonces, mu-chas otras empresas han venido prometiendo éstas y otras recompensas para el uso de plantas transgénicas. Sin embargo, mediante comparación de las buenas intenciones con la realidad, Altieri pretende estar derribando uno a uno los su-puestos mitos sobre las «bondades» de la biotecnología sobre transgénicos, con-cluyendo que:

• La Biotecnología sobre transgénicos no beneficiará a los agricultores: Las empre-sas destinadas a este tipo de «negocio» controlan todo el proceso y obligan a los agricultores a pagar precios exagerados hasta por las se-millas, muchas de las cuales tienen que adquirirse año tras año. Algo que parecería obvio si no implicara el sustento de muchas familias de campesinos es que las compañías intentarán obtener el mayor prove-cho posible de su inversión. Asimismo, la maquinaria biotecnológica estará controlada por grandes corporaciones que tenderán al aumento de la productividad dejando fuera del negocio a pequeños agricultores, aunque esta realidad de «pez grande, pez chico» la podemos contem-plar en cualquier ámbito de nuestra sociedad. Por otra parte, y ahora

estoy interpretando mi papel de consumidor, solo aquellos productos que le reporten beneficios al agricultor y le sean rentables serán adqui-ridos año tras año, como ocurre en EEUU, primer productor mundial de plantas transgénicas. El agricultor debería ser responsable de su de-cisión acerca del tipo de productos que cultiva, ¿o no?

• La transgénesis de plantas no beneficiará a los hambrientos y pobres del tercer mundo: El mundo seguirá sufriendo contaminación por pesticidas y el tercer mundo seguirá careciendo de alimentos. Las corporaciones multinacionales no son compañías altruistas, como ya se ha indicado. En general, y esto sí considero que es de especial importancia, las em-presas biotecnológicas trabajan sólo con un rango limitado de cultivos dirigidos a sistemas de producción de grandes capitales. Por decirlo en otros términos, interesa poco elaborar tomates de larga resistencia y de lenta maduración adecuados para trasportarlos o criarlos en lugares austeros, mientras que las mayores producciones van encaminadas a cereales resistentes a plagas con semillas patentadas que obligarían al agricultor a su compra anual, entre otras razones por el uso de la «fa-mosa» tecnología «Terminator», consistente en desarrollar plantas transgénicas que producirán semillas incapaces de germinar aunque, al parecer, esta tecnología no se lleva a cabo y sí otra consistente en la obtención de híbridos que complican, por las simples reglas de Men-del, la productividad de sucesivas cosechas. Con este panorama, según Altieri, es difícil concebir cómo favorecer a los agricultores pobres del tercer mundo. Como ejemplo de este empobrecimiento, en lugar de las mejoras que la biotecnología prometía, el autor del trabajo cita el caso de más de 10 millones de agricultores de caña de azúcar que vie-ron peligrar su modo de vida debido a la elaboración de fructosa en empresas biotecnológicas que provocaron la caída de los precios en el mercado.

• La transgénesis de plantas no ayudará a la conservación de la biodiversidad: Las empresas multinacionales tienden a crear amplios mercados interna-cionales para la semilla de un solo producto. Se tiende a formar mer-cados uniformes para pocos productos.

• La transgénesis de plantas sí es ecológicamente dañina: Uno de los mayores problemas con los que se enfrenta el agricultor actual es la resistencia adquirida por los insectos y agentes patógenos de plantas a los diferen-tes pesticidas utilizados. Muchas de estas compañías son las que están

desarrollando, mediante manipulación genética, variantes vegetales re-sistentes a un potente insecticida. Los cultivos transgénicos elaborados para el control de plagas siguen haciendo hincapié en el mismo meca-nismo que ha fallado reiteradamente contra insectos, patógenos y male-zas. El poder de la naturaleza para adaptarse y superar cualquier obstá-culo que el biotecnólogo ponga en su camino ha quedado siempre de manifiesto. Además, otro de los principales riesgos asociados con las plantas transgénicas consistiría en la transferencia no intencional del in-serto a parientes de vegetales silvestres (Figura 54) con efectos ecológi-cos impredecibles. Las estructuras genéticas existentes han evoluciona-do a través de millones de años formando un ecosistema infinitamente complejo e interconectado. La transgénesis de plantas podría romper este equilibrio delicado con cambios que no podrían ocurrir mediante evolución natural. Se podrían crear, accidentalmente, microorganismos resistentes a antibióticos o producir nuevos venenos y enfermedades. Las plantas, al elaborarlas resistentes a determinados pesticidas, podrían acumular cantidades tóxicas para el hombre que la ingiriera.

Figura 54

Como resumen, y aunque la biotecnología podría ayudar a mejorar la

agricultura, dada su condición de empresa que busca beneficios rápidos, podría causar daños al medio ambiente y una intrusión más profunda de intereses pri-vados en la investigación del sector público. Para Altieri, la dominación econó-