Áramlási citometria, sejtszeparációsÁramlási citometria, sejtszeparációstechnikáktechnikák

Immunológiai és BiotechnológiaiImmunológiai és BiotechnológiaiIntézetIntézet

ÁOK, PTE ÁOK, PTE

Az áramlási citometria elveAz áramlási citometria elve

Az áramlási citometria („Flow cytometria”) sejtek gyors,multiparaméteres vizsgálatára alkalmas laboratóriumimódszer. Segítségével kevert sejtpopulációkban az egyessejttípusok külön mérhetőek, analizálhatók és szeparálhatóakfenotípusuk, vagy funkcionális állapotuk szerint.

A rutinban használt áramlási citométerek segítségével egymintában, egyidőben mérhető a sejtek nagysága, granuláltsága,és 4-6 fluoreszcens molekula jele. Így egy-egy sejttípusról 4-6különböző paramétert tudunk egyszerre meghatározni.

Direkt immunfluorescens jelölésDirekt immunfluorescens jelölés

1.1. Adj 50 Adj 50 µµl vért a már ell vért a már előőkészített antitest-készített antitest-keverékekhez, inkubáld 30 percig.keverékekhez, inkubáld 30 percig.

2.2. Adj 1 ml RBC lízis puffert a mintákhoz,Adj 1 ml RBC lízis puffert a mintákhoz,inkubáld 10 percig.inkubáld 10 percig.

3.3. Mosd 2 ml PBS-sel, centrifugáld 1000 rpm-Mosd 2 ml PBS-sel, centrifugáld 1000 rpm-en, 5 percig.en, 5 percig.

4.4. Öntsd el a felülúszót, a pelletetÖntsd el a felülúszót, a pelletetreszuszpendáld 500 reszuszpendáld 500 µµl FACS-Fix-benl FACS-Fix-ben(0.5 % PFA - PBS).(0.5 % PFA - PBS).

5.5. Mérés FACSCalibur áramlási citométerrel,Mérés FACSCalibur áramlási citométerrel,analízis a CellQuest programmal.analízis a CellQuest programmal.

MintákMinták

1.1. autofluorescens próba (v. izotípus ktrl.)autofluorescens próba (v. izotípus ktrl.)2.2. anti-CD3-FITC + anti-CD4-PEanti-CD3-FITC + anti-CD4-PE3.3. anti-CD3-FITC + anti-CD8-PEanti-CD3-FITC + anti-CD8-PE4.4. anti-CD3-FITC + anti-CD56-CyCanti-CD3-FITC + anti-CD56-CyC5.5. anti-CD19-FITC + anti-CD5-PEanti-CD19-FITC + anti-CD5-PE6.6. anti-CD3-FITC + anti-CD25-PEanti-CD3-FITC + anti-CD25-PE

CD-markerekCD-markerek(Cluster of Differentiation)(Cluster of Differentiation)

•• SejtvonalmarkerekSejtvonalmarkerek: pl. CD3 T-sejtek; CD56: pl. CD3 T-sejtek; CD56NK sejtekNK sejtek

•• Érési markerekÉrési markerek: CD1 thymociták, CD10: CD1 thymociták, CD10(CALLA)(CALLA)

•• Aktivációs markerekAktivációs markerek: CD25(IL-2R: CD25(IL-2Rαα))T- B-sejtek, monocitákT- B-sejtek, monociták;;CD11a(LFA-1) monocyták, granulocytákCD11a(LFA-1) monocyták, granulocyták

FACS Calibur áramlási citométerFACS Calibur áramlási citométer

FACS VantageFACS Vantage(sorter)(sorter)

FACS Aria FACS Aria (digitális áramlási citométer)(digitális áramlási citométer)

Az áramlási citométer fAz áramlási citométer főő komponensei komponensei

•• Folyadékok Folyadékok –– köpenyfolyadék (sheath köpenyfolyadék (sheathfluid); hidrodinamikus fókuszálásfluid); hidrodinamikus fókuszálás

•• Optika Optika –– lézerek, lencsék, detektorok lézerek, lencsék, detektorok

•• Komputer Komputer –– kontroll és analízis kontroll és analízis

Az áramlási citométer felépítéseAz áramlási citométer felépítése

Hidrodinamikai fókuszálásHidrodinamikai fókuszálás

Méret és granularitás (FSC, SSC)Méret és granularitás (FSC, SSC)

Size

Gra

nula

rity

Humán perifériás vér

MonocitákMonociták

GranulocitákGranulociták

Limfociták

FluoreszcenciaFluoreszcencia

Gerjesztés (excitation) - Lézerek:Gerjesztés (excitation) - Lézerek:•• Argon-ion (488 nm) - kékArgon-ion (488 nm) - kék•• HeNe (633 nm) HeNe (633 nm) –– piros piros•• UVUV•• Dye-lasers Dye-lasers –– pl. zöld pl. zöld

Emisszió Emisszió –– Detektorok: Detektorok:FL1: 515-545 nmFL1: 515-545 nmFL2: 560-600 nmFL2: 560-600 nmFL3: 610-660 nmFL3: 610-660 nmFL4: 670 nm <FL4: 670 nm <

FL1 FL2 FL3 FL4

hullámhossz

Emisszió

α12∗I1 α32∗I3

I1 I2 I3 I4

488 nm

Gerjesztés

A fluoreszcens spektrumA fluoreszcens spektrum

FACS Calibur flow cytométer felépítéseFACS Calibur flow cytométer felépítése

Fluoreszcens jelek detektálásaFluoreszcens jelek detektálása

fluorescentsignal

detector

laser

detector

laser fluorescentsignal

FluorokrómokFluorokrómok

CD45 expresszió (humán vér)CD45 expresszió (humán vér)

SSC

CD

45 C

yC

Limfociták

Granulociták

Monociták

Helper és citotoxikus T sejtekHelper és citotoxikus T sejtek(humán vér)(humán vér)

CD

8-PE

CD3 FITC CD3 FITCC

D4

PE

I. ~28%

II.

II. ~47%

I.

I. - CD8+ (citotoxikus) T limfociták

II. - CD4+ (helper) T limfociták

NK sejtek (humán vér)NK sejtek (humán vér)

CD3 FITC

CD

56-C

yC

T-limfociták

CD5+ B sejtek

CD19 FITC

CD

5 PE

T sejtek

CD5- B sejtek

CD45RA / RO (humán vér)CD45RA / RO (humán vér)

CD3 PE CD3 PE

CD

45R

A F

ITC

CD

45R

O C

yC

CD45RA+ limfociták CD45RO+ limfociták

IL2R IL2R α−α−lánc lánc ((CDCD25) 25) expresszióexpresszió(humán vér)(humán vér)

CD3 FITC

CD

25 P

E

Aktivált limfociták

CD14 expresszió (humán vér)CD14 expresszió (humán vér)C

D45

CyC

CD14 PE

Limfociták

Granulociták

Monociták

Vizsgálati irányok, lehetVizsgálati irányok, lehetőőségek:ségek:1. Immunfenotipizálás:

•Malignus hematológiai kórképek diagnosztikája és differenciál diagnosztikája

•Immunhiányos állapotok diagnosztikája és differenciál diagnosztikája

•Autoimmun betegségek aktivitásának nyomonkövetése

•Pre- és posttranszplantációs állapotok nyomonkövetése

•HLA-haplotipus vizsgálata

•Tumorsejtek vizsgálata:

Proliferációs antigének vizsgálata

Adhéziós molekula expresszió kimutatás

•Fertőző betegségek diagnosztikája és nyomon követése

•Sejtfelszíni fehérje (vagy egyéb) struktúrák távolságának meghatározása(energia transzfer)

2. Quantitativ mérési lehetőségek•Vizsgált markert expresszáló sejtek mennyiségének quantitativmeghatározása•Sejtfelszinen expresszálódó antigének quantitativ meghatározása

2. DNS és RNS tartalom mérése2. DNS és RNS tartalom mérése•Sejtciklus analízis•Apoptózis mérés•Reticulocyta szám meghatározás

4. Funkcionális vizsgálatok•Phagocytáló képesség vizsgálata•Intracellularis Ca++ koncentráció meghatározás•Intracellularis pH meghatározás•Enzim mennyiség, aktivitás ill. lokalizáció mérés•Reaktív oxigén intermedierek (ROI) termelődésének detektálása(pl. H2O2)•Kemotaxis vizsgálat•Proliferációs index meghatározása / nyomonkövetése•Egyéb

5. Sejtszeparálás

MMononuononukkleleáárrisis sseejtekjtek izolálása vérbizolálása vérbőőll

FizikaiFizikai param paraméétertereken alapuló eljárásokeken alapuló eljárások::- Filtr- Filtrácáciióó ( (vérsejtek eltérvérsejtek eltérőő mérete mérete))- Centrifug- Centrifugálásálás ( (Ficoll gradiens: vérsejtek eltérFicoll gradiens: vérsejtek eltérőősszzedimentedimentációsációs állandójaállandója))

Adhéziós tulajdonságokon alapuló eljárásokAdhéziós tulajdonságokon alapuló eljárások::--Nylon Nylon vattavatta: Mo: Monocitáknociták, B-, B-sejteksejtek kitapadnakkitapadnak--MMűűanyag/üvegfanyag/üvegfeelszínlszín: monoc: monociittákák kitapadnak, akitapadnak, alliimmffocociitták eltávolíthatókák eltávolíthatók

Ficoll1.077

FicFicolloll--gradiengradienss ccentrifugentrifugálásálás

VVT

Szérum

Mononukleárissejtek

Percoll

centrifugálás

Perifériás vér

Mononukleáris sejtek citopreparátumonMononukleáris sejtek citopreparátumon

SSeejtjtsszzepareparálásálás áramlási citometriávaláramlási citometriával(FACS)(FACS)

FACS = fluorescence activated cell sortingFACS = fluorescence activated cell sortingC

D4P

E

CD8CyC

CD8CyC

CD

4PE CD8CyC

CD8CyCCD8CyC

CD

4PE

CD

4PE

CD

4PE

Teljes thymus

Double positive (DP)Double negative (DN)

CD4 SP CD8 SP

tisztaság: 90%<

egér thymociták elkülönítése CD4/CD8 jelölés után