T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

RATLARDA SİKLOFOSFAMİD İLE İNDÜKLENEN HEMORAJİK SİSTİTTE KAFEİK ASİT FENETİL

ESTER’İN KORUYUCU ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Dr. Ersin UYSAL

İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI

UZMANLIK TEZİ

TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. Ş. Ercan TUNÇ

Bu tez Süleyman Demirel Üniversitesi Araştırma Projeleri Yönetim Birimi tarafından 1518-TU-07 proje numarası ile desteklenmiştir.

ISPARTA - 2009

i

TEŞEKKÜR

Uzmanlık eğitimim süresince ve tez çalışmamda bana her türlü desteklerini

esirgemeyen tez danışmanım Doç. Dr. Ş. Ercan TUNÇ başta olmak üzere değerli

hocalarım Prof. Dr. M. Numan TAMER, Prof. Dr. M. Tuğrul SEZER, Prof. Dr.

Mehmet İŞLER, Prof. Dr. Ülkü SARITAŞ, Prof. Dr. Yıldıran SONGÜR, Doç. Dr.

M. Cem KOÇKAR, Doç. Dr. Mehmet ŞAHİN, Yrd. Doç. Dr. Güçhan ALANOĞLU,

Yrd. Doç. Dr. Z. Dilek AYDIN, Yrd. Doç. Dr. Altuğ ŞENOL, Yrd. Doç. Dr. Banu

Kale KÖROĞLU’na, histopatolojik değerlendirmelerle çalışmamıza katkı sağlayan

patolog Uzm. Dr. Yetkin AĞAÇKIRAN’a, laboratuar imkanlarını kullandıran Tıbbi

Biyoloji Anabilim Dalı başkanı Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK’e ve laboratuar

çalışmalarımda bana yol gösteren ve laboratuar çalışmamda emeği geçen başta Doç.

Dr. H. Ramazan YILMAZ, Yrd. Doç. Dr. Efkan UZ, Dr. Hakan ÇAM, Dr. Ali

KUTLUCAN, Dr. Ali Rıza BAYKAL ve Dr. Kemal TÜRKER olmak üzere tüm

asistan arkadaşlarıma ve projemizi destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi

Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimine ve bu çalışmalarım

sırasında manevi desteği ile hep yanımda olan sevgili eşim Sadiye’ye şükranlarımı

sunarım.

Dr. Ersin UYSAL

ii

KISALTMALAR

HS : Hemorajik Sistit

CP : Siklofosfamid

Mesna : 2-Mercaptoethane sulfonate

CAPE : Kafeik asit fenetil ester

VUR : Vezikoüreteral reflü

DNA : Deoksiribonükleik asit

RNA : Ribonükleik asit

SLE : Sistemik lupus eritematozus

NO : Nitrik oksit

NOS : Nitrik oksit sentaz

iNOS : İndüklenebilen nitrik oksit sentaz

eNOS : Endotelyal nitrik oksit sentaz

nNOS : Nöronal nitrik oksit sentaz

NO2+ : Nitronyum iyonu

NO2 - : Azot dioksit

OH - : Hidroksil iyonu

NF-κB : Nükleer transkripsiyon faktör kappa-B

ROD : Reaktif oksijen deriveleri

RND : Reaktif nitrojen deriveleri

SOD : Süperoksit dismutaz

CAT : Katalaz

GSH-Px : Glutatyon peroksidaz

MPO : Myeloperoksidaz

MDA : Malondialdehit

O2 - : Süperoksit anyonu

H2O2 : Hidrojen peroksit

i.p. : İntraperitoneal

SF : Serum fizyolojik

iii

İÇİNDEKİLER

TEŞEKKÜR ................................................................................................................ i

KISALTMALAR ....................................................................................................... ii

İÇİNDEKİLER .........................................................................................................iii

1. GİRİŞ ve AMAÇ .................................................................................................... 1

2. GENEL BİLGİLER............................................................................................... 3

2.1. Hemorajik Sistit ................................................................................................ 3

2.1.1. Sıklık ve Mortalite-Morbidite .................................................................... 3

2.1.2. Hemorajik Sistit Etyolojisi......................................................................... 3

2.1.2.1. Enfeksiyonlarla İlişkili HS.................................................................. 4

2.1.2.2. Radyasyon ile İlişkili HS .................................................................... 4

2.1.2.3. Siklofosfamid ile İlişkili HS ............................................................... 4

2.1.3. Hemorajik Sistitte Histolojik Bulgular ...................................................... 5

2.1.4. Hemorajik Sistit Patogenezi....................................................................... 6

2.1.5. Hemorajik Sistit Profilaksisi ve Mesna..................................................... 7

2.2. Serbest Oksijen Radikalleri ve Oksidatif Stres ................................................. 8

2.3. Serbest Oksijen Radikal Kaynakları ............................................................... 10

2.4. Serbest Oksijen Radikal Türleri ...................................................................... 11

2.5. Serbest Radikallerin Hücreler Üzerinde Etkileri............................................. 12

2.5.1. Lipidlerde Meydana Gelen Yapısal Değişiklikler ................................... 12

2.5.2. Proteinlerde Meydana Gelen Yapısal Değişiklikler................................. 13

2.6. Enzimatik ve Non-enzimatik Antioksidanlar.................................................. 13

2.6.1. Non-Enzimatik Antioksidanlar ................................................................ 13

2.6.2. Enzimatik Antioksidanlar ........................................................................ 15

2.6.2.1. Glutatyon Peroksidaz ........................................................................ 15

2.6.2.2. Katalaz .............................................................................................. 15

2.6.2.3. Süperoksit Dismutaz ......................................................................... 16

2.7. Kafeik Asit Fenetil Ester................................................................................. 16

2.7.1. CAPE’nin Yapısı ve Kimyasal Özellikleri .............................................. 17

2.7.2. CAPE’nin Antioksidan Etkisi .................................................................. 17

3. MATERYAL ve YÖNTEM.................................................................................. 18

3.1. Materyal .......................................................................................................... 18

iv

3.1.1. Deney Hayvanları .................................................................................... 18

3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ................................................................ 18

3.1.3. Kullanılan Malzeme ve Aletler ................................................................ 18

3.2. Yöntem............................................................................................................ 19

3.2.1. Deney Protokolü ...................................................................................... 19

3.2.2. Histolojik Değerlendirme......................................................................... 20

3.2.3. Biyokimyasal Ölçümler ........................................................................... 21

3.3. İstatistiksel Analiz........................................................................................... 21

4. BULGULAR ......................................................................................................... 22

4.1. Histolojik Değerlendirme................................................................................ 22

4.2. Biyokimyasal Ölçümlerin Değerlendirilmesi ................................................. 25

4.2.1. Mesane Dokusunda Antioksidan Enzim Aktiviteleri............................... 25

4.2.1.1. Mesane Dokusunda SOD Aktivitesi ................................................. 25

4.2.1.2. Mesane Dokusunda CAT Aktivitesi ................................................. 25

4.2.2. Mesane Dokusunda MDA Düzeyleri ....................................................... 26

4.2.3. Mesane Dokusunda NO Seviyeleri ......................................................... 26

5. TARTIŞMA .......................................................................................................... 28

7. ÖZET..................................................................................................................... 34

8. ABSTRACT.......................................................................................................... 35

9. KAYNAKLAR ..................................................................................................... 36

1

1. GİRİŞ ve AMAÇ

Siklofosfamid { (2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro - 2H - 1 ,3 ,2

oxazaphosphorine 2-oxide), (CP) }; nitrojen mustard grubundan alkilleyici

antineoplastik kemoterapötik bir ilaçtır. Tek başına veya diğer kemoterapötik

ilaçlarla kombine edilerek birçok neoplastik ve non-neoplastik hastalığın tedavisinde

kullanılır. Hemorajik sistit (HS) en büyük potansiyel toksik etkisi olup bu doz

kısıtlayıcı bir yan etkidir (1, 2). Bu nitrojen mustard grubu sitostatik ilaçların

ürotoksisitesi sadece alkilleyici aktivitelerine bağlanmamıştır. Bununla beraber

ürotoksisiteden CP’nin hepatik mikrozomal enzimatik hidroksilasyon yoluyla

üretilen 4-hidroksi metabolitlerinin ve özellikle de renal akrolein salınımının sorumlu

olduğu bilinmektedir. Ancak yine de akrolein detoksifikasyonu HS semptomlarını

tamamen engellemez (2-4).

Bir sülfidril bileşiği olan 2-Mercaptoethane sulfonate (mesna) üriner

sistemde akroleine bağlanarak onu detoksifiye eder. Böylece etkisiz bir tiyoeter

bileşiği haline gelen akrolein üroepitelyumdaki hasarlanmayı tetikleyemez (5, 6).

Mesna CP’nin indüklediği sistite karşı yaygın şekilde kullanılmasına karşın; klinikte

makroskopik veya mikroskopik hematüri ya da sık idrara çıkma, dizüri gibi

semptomlarla tanımlanan önemli sayıda HS’li olgularla da karşılaşılmıştır (2).

Son yapılan çalışmalar CP’nin mesane üzerindeki toksik etkilerinin ortaya

çıkması için artmış nitrik oksit (NO) üretimine ihtiyaç duyduğunu göstermiştir (7-9).

CP toksisitesi muhtemelen reaktif nitrojen radikallerinden (reaktif nitrojen deriveleri,

RND) kaynaklanır. Özellikle NO ve süperoksitin (O2 -) reaksiyonu sonucu oluşan

peroksinitrit oksidan strese neden olan inflamatuvar süreçle ilgilidir (10).

Kafeik asit fenetil ester (CAPE) yapıca flavonoidlere benzer ve balarısı

propolisinin major komponentidir. Normal hücrelerde herhangi bir zararlı etkisi

yoktur (11). Ayrıca antioksidan, antiinflamatuvar, antikarsinogenik, antiviral ve

immunomodülatör etkileri vardır (12, 13). Mikromolar konsantrasyon aralığında

linoleik asit ve araşidonik asitin 5-lipooksijenaz tarafından oluşturulan

oksijenasyonunu inhibe etmektedir. On μmol/L konsantrasyonda in vitro koşullarda

nötrofiller veya ksantin/ksantin oksidaz sistemi tarafından oluşturulan reaktif oksijen

türlerini (reaktif oksijen deriveleri, ROD) tamamen bloke ettiği bildirilmiştir (14).

2

Daha önceki deneysel modellerde CP ile indüklenen HS’de oksidatif stres

markerları ile serbest oksijen ve serbest nitrojen radikallerinin inhibisyonunu

sağlayan çeşitli antioksidan ajanlar arasındaki ilişki gösterilmiştir. Biz de bu

çalışmamızda ratlarda CP ile indüklenen HS’nin antioksidan bir ajan olan CAPE ile

önlenip önlenemeyeceğini araştırmayı ve varsa CAPE’nin koruyucu etkinliğini

mesna ile karşılaştırmayı amaçladık.

3

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Hemorajik Sistit

HS; ilaçların, toksinlerin, enfeksiyöz ajanların veya radyasyonun mesane

transizyonel epitel hücrelerini ve kan damarlarını harap etmeleri sonucunda

oluşmaktadır (15). HS; en çok CP ve onun sentetik analoğu olan ifosfamid gibi

ilaçların kullanılmaları sonucu ortaya çıkan doza bağımlı major bir toksisitedir (2).

HS insidansı dozajla ilişkilidir ve yüksek doz intravenöz ilaç tedavisi

alanlarda %75’lere ulaşmaktadır. HS’de semptomlar sık idrara çıkma, dizüri, idrarını

tam yapamama hissi, suprapubik ağrı, ağrılı mikrohematüri gibi kişiyi rahatsız eden

geçici işeme semptomlarından hayatı tehdit edici ağır HS’ye kadar geniş bir

spektruma sahiptir (3).

HS hastaları çeşitli derecelerde hematüriyle karşımıza çıkabilmektedir.

Hastalarda boyutları artmış, hassas, palpable mesane bulunabilir. Pıhtı retansiyonu

sıktır. Üriner inkontinans genelde mevcuttur (1). Masif mesane kanamalı hastalarda;

mesane fibrozisi, mesane nekrozu, mesane kontraktürü, vezikoüreteral reflü (VUR)

ve %4 oranında mortalite görülmektedir (2).

2.1.1. Sıklık ve Mortalite-Morbidite

Birleşik Devletler’de CP alan hastaların % 2-40’ında ürolojik yan etkiler

görülmektedir. Pelvik radyasyon alan hastalarda ise bu oran %10 civarındadır. Yaş

ve cinsiyet ayrımı söz konusu değildir. HS tanısı almış hastalarda morbidite

hastalığın seyri ve tedavisiyle ilişkilidir. Bilinen tedavi modalitelerine refrakter HS

yaygın olmamakla beraber mortalite ile ilişkili olabilir. (16).

2.1.2. Hemorajik Sistit Etyolojisi

HS etyolojisi

• Enfeksiyöz

• Radyasyon

• İlaçlar, Toksinler

4

2.1.2.1. Enfeksiyonlarla İlişkili HS

Rapor edilen enfeksiyon ajanları Escherichia coli; adenovirus 7, 11, 21 ve

35, papvoavirus ve influenza A dır (17).

-Adenovirüs: En sık izole edilen ve üriner traktüse afinitesi olan tip 11 dir.

İmmunsüpresyonla reaktive olur. Sağlıklı çocukta HS’ nin en sık sebebidir (18, 19).

-Polyoma virüs: Çocukluk çağında çocukların çoğunu etkileyen bir

virüstür. Primer enfeksiyondan sonra böbrekte persistan halde kalır. Baskılanmış

hücresel immünite durumlarında reaktive olur (20).

2.1.2.2. Radyasyon ile İlişkili HS

Radyasyon ilişkili HS genellikle pelvik radyasyona maruziyette görülür.

Erişkinlerde çocuklara göre daha az sıklıkta görülür. HS akut olarak veya uzun

zaman sonra ortaya çıkar. Bu hastalarda hematüri radyasyon aldığı sırada veya aylar

yıllar sonra görülebilir. Radyasyon hasarına bağlı mukozal hasarlanma buradaki

arterlerin inflamasyonuna sekonder gelişen hipoksik yüzey hasarına, ülserasyon ve

kanamaya bağlı olarak ortaya çıkar. Radyasyon sistitinin oluşumuna neden olan

faktörler arasında mesane çıkış obstrüksiyonu, daha önceden radyasyon alımı veya

cerrahi öyküsü ve aşırı radyasyon dozajı yer almaktadır (15, 21-23).

2.1.2.3. Siklofosfamid ile İlişkili HS

CP nitrojen mustard grubundan alkilleyici antineoplastik bir ilaçtır.

Alkilleyici antineoplastik ajanlar genel olarak hücre fonksiyonlarını amino,

karboksil, sülfidril ve fosfat gruplarına kovalent bağlanarak bozarlar. En sık

bağlandıkları hücre bölgeleri hücrenin deoksiribonükleik asit (DNA), ribonükleik asit

(RNA) ve protein kısımlarıdır. Etkili olabilmeleri için hücre proliferasyonu

gerekirken faz spesifik etki göstermezler. Glutatyon konjugasyonu ve DNA tamir

mekanizmalarındaki değişiklikler ilaç rezistansında önemlidir (24).

CP onkolojide hematolojik malignite ve solid tümörlerin tedavisinde

kullanılan bir ilaç olmakla birlikte özellikle vaskülitler, Behçet hastalığı, SLE

(Sistemik lupus eritomatozus), Sjögren, Skleroderma, Romatoid artrit gibi otoimmün

hastalıklarda ve nefrotik sendromda da kullanılmaktadır.

5

CP yan etkileri arasında

• Myelosüpresyon

• Bulantı-kusma

• Reprodüktif sistem yan etkileri (amenore, oligomenore, azospermi,

infertilite vs),

• Hiperürisemi

• Allerjik reaksiyon

• Alopesi

• Sekonder lösemi bulunmaktadır (25).

CP; HS’nin en sık sebebidir. %2-40 arasında görülür. Semptom ve bulgular

içerisinde sık idrara çıkma, dizüri, boşalamama hissi, suprapubik ağrı, mikroskopik

veya gros hematüri bulunur. Nadir vakalarda mukozal nekroz, mesane fibrozisi,

kontraktür, VUR ve tümör formasyonu görülebilir. Risk faktörleri dehidratasyon ve

CP’nin intravenöz infüzyonudur (26).

Laboratuar hayvanlarında CP verilmesine bağlı ciddi sistit oluşumu pek çok

yayında bildirilmiştir (27, 28).

2.1.3. Hemorajik Sistitte Histolojik Bulgular

Nonspesifik bulgular olan kanama, inflamatuvar infiltratlar, kronik

inflamasyon ve fibrozis görülebilir. HS’nin ana özelliği epitelyal hasarlanma,

transmural ödem, hemoraji, mukozal ülserasyon ve epitelyal nekrozistir. Bunlar tek

doz CP enjeksiyonundan sonraki 24 saat içinde görülür. Mukozal dökülme sıklıkla

akut ve kronik hemoraji ile ilişkilidir. İlk birkaç saat içinde mesanenin süperfisyal

tabakasındaki epitelyal hücrelerde dejenerasyon ve nekroz başlar. 18. saat sonunda

genellikle erozyon veya ülserasyon ilerleyerek mukoza-submukoza sınırına ulaşır ve

bazal membranda ve subpitelyal kapillerler çevresinde harabiyete neden olur.

Bundan sonra mukozal hiperplazi ve papiller proliferasyonla seyreden

iyileşme dönemi başlar. Takip eden günlerde lökosit infiltrasyonu ve

neovaskülarizasyon görülür (2, 29).

6

2.1.4. Hemorajik Sistit Patogenezi

CP ve benzeri olan nitrojen mustard grubu ilaçların ürotoksik etkileri tek

başına direk alkilleyici aktiviteden kaynaklanmayıp karaciğer mikrozomal enzim

hidroksilasyonundan elde edilen 4-hidroksi metabolitleri ve özellikle böbrekten

salınan akrolein aracılığı ile meydana gelmektedir. Mesane en çok bu ajanla temas

ettiğinde hasar görmektedir (6).

Son yapılan çalışmalar CP’nin mesane üzerindeki toksik etkilerinin ortaya

çıkması için artmış NO üretimine ihtiyaç duyduğunu göstermiştir (6-8). Başka bir

çalışmada da CP ile indüklenen HS’de gelişen inflamatuvar olaylarda ve ürotelyal

hasarlanmada en önemli mediatörün NO olduğu belirtilmiştir (30). Bu toksisite

muhtemelen RND’ler ile ilgilidir. Özellikle NO ve O2– ’nin reaksiyonu sonucu

oluşan peroksinitrit oksidan strese neden olan inflamatuvar süreçle ilgilidir.

Peroksinitrit, NO toksisitesinin başlıca sorumlusudur. Peroksinitritin proteinlere

doğrudan zararlı etkileri vardır ve azot dioksit (NO2-), hidroksil radikali (OH-),

nitronyum iyonu (NO2+) gibi toksik ürünlere dönüşür (9, 10).

Akut ve kronik inflamasyonda NO seviyelerinin artış gösterdiğine dair pek

çok kanıt vardır. NO sentezinin insanda vasküler tonüsün düzenlenmesinde önemli

rol oynadığı, kan basıncı ve böbrek fonksiyonunun kontrolünde kesin bir role sahip

olduğu bilinmektedir. NO vasküler endotelyal hücrelerde oluşturulan önemli bir

vazodilatördür. NO ; nitrik oksit sentaz (NOS) olarak isimlendirilen bir izoenzim

ailesi tarafından L-arginin metabolizması sırasında ortama salınan serbest radikal bir

gazdır. NOS’un ; nöronal NOS (tip I, nNOS), endotelyal NOS (tip II, eNOS) ve

indüklenebilir NOS (tip III, iNOS) olmak üzere farklı lokalizasyon ve düzenlenmeye

sahip üç izoenzimi vardır. Bu enzim ailesinden ilk 2 tanesi olan nNOS ve eNOS

vücudun yapısal enzimleridir ve düşük miktardaki bazal NO seviyelerini sağlarlar ve

kalsiyum bağımlıdırlar. Üçüncü enzim olan iNOS ise kalsiyumdan bağımsızdır ve

hemen hemen makrofajlar, fibroblastlar ve epitelyal hücreleri de içeren tüm

hücrelerde bulunur. iNOS normal şartlar altında NO salgılamaz. iNOS tümör

nekrozis faktör alfa, interlökin-1 ve interferon-gama gibi immunolojik stimulatörler

yoluyla aktive edilir. Nörokinin 1 reseptör aktivasyonunun da NO sentezini ve

salınımını arttırdığı bilinmektedir. Buna ek olarak farklı ajanlar (kimyasal, biyolojik

7

ve fiziksel), nükleer transkripsiyon faktör kappa-B (NF-κB) gibi transkripsiyon

faktörlerini ya da interlökin-1, tümör nekrozis faktör alfa ve platelet aktive edici

faktör gibi immun aracılı mediatörleri uyararak inflamatuvar sinyali başlatırlar. iNOS

tarafından sentezlenen NO toksiktir ve iNOS seviyesini arttırdığı bilinen bu

faktörlerin artışı, aşırı miktarda NO üretimine neden olur. Sonuç olarak

vazodilatasyon ve ödem meydana gelir ve inflame mesane dokusunda ROD ve RND

üretimi membran lipidlerinin peroksidasyonu, protein denatürasyonu ve DNA hasarı

gibi çeşitli mekanizmalarla önemli bir oksidan stres, selüler hasar ve nekroza

öncülük eder (10, 31-36).

Son yıllarda yapılan çalışmalarda CP ile indüklenen HS’nin patogenezinde

inflamatuvar mediatörlerin de rolü gösterilmiştir. Özelikle de tümör nekrozis faktör

alfa ve interlökin-1 gibi medyatörlerin mesane mukozasındaki erozyon, hemoraji,

ödem, lökosit infiltrasyonu, fibrin birikimi ve mukozal ülserasyonlara neden olan

inflamatuvar süreçde kritik medyatörler olduğu gösterilmiştir (37).

Serbest radikal ve reaktif derivelerin neden olduğu hasara karşı antioksidan

korunma sistemi bulunmaktadır. Bu sistem süperoksit dismutaz (SOD), katalaz

(CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) gibi enzimleri içermektedir (38).

2.1.5. Hemorajik Sistit Profilaksisi ve Mesna

CP ile ilişkili ürotoksisiteyi önleyen birtakım yaklaşımlar mevcuttur. Bu

yaklaşımların temel prensibi akroleinin nötralizasyonu ve detoksifikasyonu

şeklindedir. Birçok onkoloji merkezi bu ilacı kullanan hastalarına bol su içme ve sık

idrara çıkmayı önermekte ya da mesane içine mesane ile akroleinin temasını

azaltacak bir kateter yerleştirme işlemi yapmaktadır. Akroleini bağlayıp

nonürotoksik hale çeviren en önemli ilaç mesnadır.

Skinner ve arkadaşları (39) intravenöz bolus olarak verilen mesnanın CP ile

oluşan hasarın azaltılmasında devamlı infüzyon uygulamasına göre daha üstün

olduğunu göstermişlerdir. Mesna kendisi küçük bir molekül olmakla birlikte

üzerinde bir sülfidril grubu taşır ve ROD’ları etkisiz hale getirir. Bu etkisizleştirme

üzerindeki iki adet sülfidril grubu tarafından gerçekleştirilir (40).

8

İntravenöz olarak verildiğinde mesna kanda direkt olarak nonreaktif disülfid

formuna dönüşür ve bu form dimesna olarak isimlendirilir (39, 41). Dimesna renal

tübüler hücreler tarafından alınarak intrasellüler glutatyonla tekrar mesnaya

dönüştürülür. Hem mesna hem de dimesna vasküler kompartmandan glomerüler

filtrasyonla temizlenirler. Plazma yarı ömrü 16.5 dakikadır. Mesna verilmesinden 20

dakika sonra en yüksek doku konsantrasyonuna ulaşır (42).

Mesna sistemik olarak verildiğinde akroleini diğer terapötik etkilerine

karışmadan spesifik olarak bağlar. Mesnanın rutin profilaktik olarak kullanımı CP

alan hastalarda önerilmektedir. HS hastalarında hematürinin durması için ilk

yapılması gereken CP’nin kesilmesidir. (39-43).

Mesna üriner toplayıcı sistemden akroleini bağlayarak onu detoksifiye eder

ve sonuç olarak tioeterin idrardan zararsız geçmesini sağlayarak üroepitelyumun

hasarlamasını önler (5, 6, 39, 41). CP aracılı sistit için kullanılan mesnanın halen

efektif bir ajan olmasına karşın idrarda yanma, idrar yapma sıklığında artma gibi

semptomlardan oluşan HS klinik olarak hala karşımıza çıkmaktadır (7-9).

Bunların yanında enzim özelliği olmayan ve üzerinde çalışmalar olan beta

karoten, alfa tokoferol ve melatonin de antioksidan özelliktedir (44, 45). Bu ajanlar

ROD ve RND ile oluşan moleküler hasarı azaltmada önemli antioksidan

moleküllerdir ve CP’nin indüklediği HS’de bunların etkilerini gösteren geniş bir

çalışma arşivi bulunmaktadır.

Mesnanın akroleine bağlı HS semptomlarını tamamen düzeltemediği ve NO

artışının HS patogenezinde önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle

CP ile indüklenen HS’de oluşan hasarın sadece akroleinin mesane yüzeyi ile temasla

meydana gelmediği, bunda ROD ve RND’lerin de rol oynadığı bildirilmiştir (46).

2.2. Serbest Oksijen Radikalleri ve Oksidatif Stres

Atomlarda elektronlar orbital adı verilen uzaysal bölgede çiftler halinde

bulunurlar. Elektronlar orbital denen bölgelerde dönerler. Her orbital normal

şartlarda birbirine zıt yönde dönen 2 elektron ihtiva eder. Atomlar arasında etkileşim

ile bağlar meydana gelmekte ve moleküler yapı oluşmaktadır. Serbest radikal, atomik

ya da moleküler yapılarda çiftlenmemiş tek elektron bölümlerine verilen isimdir.

9

Başka moleküller ile çok kolayca elektron alışverişine giren bu moleküllere oksidan

moleküller veya ROD da denmektedir (46).

Serbest radikaller ortaklanmamış elektron içerir. Bu da en sık olarak

elektron transfer zincirinde oluşan elektronların transferi ile veya oksidazlar ile tek

elektron transferi ile oluşur. Serbest radikallerin bir başka oluşma şekli de

moleküldeki bağların homolitik olarak parçalanması sonucu elektronlardan her

birinin farklı atomlar üzerinde kalmasıyla olur (47, 48). Ayrıca iyonize radyasyon da

serbest radikal oluşumuna sebep olabilir.

Oksijen, iki elektronu eşleşmemiş şekilde bir elektron dağılımına sahiptir.

Bu yüzden serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal)

olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş

reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer.

Moleküler oksijen, biradikal doğasının bir sonucu olarak ROD veya diğer adıyla

reaktif oksijen türleri oluşturma eğilimindedir (47, 49).

Organizmada pek çok türde ROD oluşabilir (Tablo 1). Ancak en sık olarak

lipid yapılarla oluşur. Oksijen molekülü, orbitalinde çiftlenmemiş elektron taşıyorsa

O2– radikali olarak adlandırılır. Diğer ROD grubunda ise normal oksijenden çok daha

hızlı bir biyolojik molekül olan "singlet oksijen" bulunmaktadır. Singlet oksijen

molekülü yapısında iki adet çiftlenmemiş elektron taşır. Singlet oksijen hücre

membranındaki poliansatüre yağ asidleriyle doğrudan reaksiyona girerek lipid

peroksitlerin oluşumuna yol açar (46).

10

Tablo 1. Reaktif Oksijen Partikülleri

1. Radikaller

• Süperoksit radikali (O2 -)

• Hidroksil radikali (OH-)

• Alkoksil radikali (LO-)

• Peroksil radikali (LOO-)

2. Radikal Olmayanlar

• Hidrojen peroksit (H2O2)

• Lipid Hidroperoksit (LOOH-)

• Hipoklorik Asit (HOCl)

3. Singlet Oksijen

Oksidatif stres; serbest radikaller ve antioksidanlar arasındaki dengenin

serbest radikaller lehine bozulmasıdır. Oksijenden tek elektron indirgenmesi sonucu

oluşan serbest oksijen radikallerinin neden olduğu oksidan yıkım; iskemi,

hipooksijenizasyon ve doku inflamasyonu gibi birçok olayda yer alarak hastalıkların

patogenezinde rol oynar. Oksidan ajanlara karşı organizmada bulunan veya diyetle

alınan antioksidanların tedavide ve korunmada yer aldığı uzun yıllardır bilinmektedir

(50-52).

2.3. Serbest Oksijen Radikal Kaynakları

Mitokondrilerdeki oksijenli solunumda olduğu gibi birçok anabolik ve

katabolik işlemler sırasındaki reaksiyonlarda moleküler düzeyde elektron kaçışları

olur ve bu sırada ROD’lar oluşur. Tablo 2 de ROD’ların in vivo ortamda kaynakları

görülmektedir (53).

11

Tablo 2. ROD’ların in vivo ortamda kaynakları

1. Oksidatif stres yapıcı durumlar

• İskemi-hemoraji-travma-radyoaktivite-intoksikasyon

• Ksenobiyotikler: Hava kirliliği, hiperoksi, pestisitler, solventler,

anestezik maddeler, aromatik hidrokarbonlar, sigara dumanı vb.

• Oksidan Enzimler: Ksantin oksidaz, İndolamin dioksigenaz, Triptofan

dioksigenaz, Galaktoz oksidaz, Siklooksijenaz, Lipooksijenaz,

Monoamino oksidaz

• Stres ile artan katekolaminlerin oksidasyonu

• Fagositik inflamasyon hücrelerinden salgılanma: nötrofil, monosit,

makrofaj, eosinofil, endotelyal hücreler

• Uzun süreli metabolik hastalıklar,

• Diğer nedenler: Sıcak şoku, güneş ışını, sigara

2. Normal biyolojik işlemler

• Katabolik ve anabolik işlemler,

• Oksijenli Solunum

3. Yaşlanma Süreci

2.4. Serbest Oksijen Radikal Türleri

Doğal oksijen molekülünün başka bir molekülden elektron almış hali olan

O2- mitokondriyal elektron transfer zincirinde redükte nikotinamid adenin

dinükleotidin okside nikotinamid adenin dinükleotide okside olması ile üretilir.

Ayrıca pek çok oksidaz tarafından da üretilir (54).

NADPH Oksidaz

O2 + e - O2 -

Elektron transport zinciri

12

O2– , bir serbest radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak fazla zarar

vermez. Asıl önemli olan, hidrojen peroksit (H2O2) kaynağı ve geçiş metal

iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Doğal oksijen molekülü başka bir molekülden iki

elektron almışsa peroksit molekülü oluşur. Peroksit molekülü iki H molekülü ile

birleşirse H2O2 oluşur. H2O2, O2– nin SOD ile dismutasyonu sonucu veya spontan

olarak da üretilebilmektedir. H2O2 aslında radikal değildir. Ancak üretildiği bölgede

kalan O2– ’nin aksine membranları geçen, sitozole diffüze olan ve uzun ömürlü bir

oksidan olarak bilinir. Bu nedenle O2– ’ nin ulaşamadığı membranla korunan yapılara

kolaylıkla ulaşabilir. Burada O2– ile reaksiyona girerek en reaktif ve zarar verici

radikal olan OH- radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir (48).

O2 + 2e- + 2H+ H2O2

H2O2 başka bir şekilde de serbest Fe+2 ile reaksiyona girerse demir okside

olurken OH- radikali oluşur. Bu da doku hipoksisi ve endotel hasarına yol açabilen

vazokonstriksiyona neden olur.

H2O2 + Fe2+ .OH + OH- + Fe3+

Bu ifade edilen reaksiyon demir katalizli Haber-Weiss (Fenton) reaksiyonu

olarak adlandırılmaktadır (55).

NO hem fizyolojik hem patofizyolojik süreçlerde önemli bir role sahip

serbest radikaldir. NO, NOS olarak bilinen sitozolik bir enzimin aktivitesi ile oluşur.

Vasküler tonusun regülasyonunda guanilat siklazı aktive eden NO major rol oynar.

Oksijen bağlanan bölgeye kompetetif bağlanarak direkt olarak sitokrom oksidazın

inhibisyonu ile hücresel solunumu düzenler. NO bazı durumlarda bir antioksidan gibi

davranır ve lipid peroksidasyonundan korur. Bununla birlikte O2– düzeylerinin arttığı

durumlarda O2– ile reaksiyona girer ve bir prooksidan olan peroksinitriti oluşturur

(56).

2.5. Serbest Radikallerin Hücreler Üzerinde Etkileri

2.5.1. Lipidlerde Meydana Gelen Yapısal Değişiklikler

Hücre membranında bulunan yağ asitleri ve kolesterolün doymamış bağları

serbest radikallerle reaksiyona girip peroksidasyona neden olabilir. İlk önce yağ asidi

13

hidrojen ve kendi üzerinde birer elektron kalacak şekilde parçalanır ve lipid

radikalini oluşturur. Lipid radikali de oksijenle reaksiyona girerek lipid peroksil

radikalini oluşturur. Lipid peroksil radikali de diğer doymamış yağ asitleriyle

reaksiyona girer. Böylece zincirleme bir reaksiyon başlamış olur. Ayrıca lipid

peroksiller ortamdaki hidrojen atomları ile de reaksiyona girerek lipid

hidroperoksitlerini oluştururlar (48, 57, 58).

Lipid peroksitler daha sonra malondialdehid (MDA) ve 4-hidroksi nonenal

gibi yıkım ürünlerine dönüşürler. Bu yıkım ürünleri de DNA veya proteinlerle

reaksiyona girebilirler ve mutajeniktirler. Üç veya daha fazla çift bağa sahip yağ

asidlerinin peroksidasyonu sonucu MDA oluşmaktadır. Bu da tiyobarbutirik asid gibi

reaktif maddeler olarak ölçülmektedir. MDA lipid peroksidasyonunun şiddetiyle

orantılı olarak artar, ancak spesifik değildir. Aynı zamanda membran bileşenlerinin

polimerizasyonuna ve çapraz bağlanmasına neden olabilir (48, 58, 59).

2.5.2. Proteinlerde Meydana Gelen Yapısal Değişiklikler

Doymamış ve sülfür içeren moleküllerin serbest radikallerle reaktivitesi

yüksek olduğu için triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metionin, sistein gibi

amino asitleri içeren proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Papain ve

gliseraldehit- 3-fosfat dehidrogenaz gibi aktiviteleri için yukardaki amino asitlere

bağımlı olan enzimler; serbest radikallere maruz kaldıklarında inhibe edilirler (60,

61).

2.6. Enzimatik ve Non-enzimatik Antioksidanlar

2.6.1. Non-Enzimatik Antioksidanlar

E Vitamini:

Yağda eriyen bir vitamindir. Hem sellüler hemde subsellüler membranlarda

ve lipoproteinlerde bulunur. Membranlardaki oksijen radikallerinin başlıca

temizleyicisidir. En aktif formu alfa tokoferoldür. Zincir kırıcı antioksidan olarak

fonksiyon görür. Hidrofobik kısmına hidrojenini kolaylıkla verebilen grubu OH-

bağlıdır. Bu yüzden lipid peroksidasyonu sırasında oluşan peroksil ve alkoksil

radikalleri yağ asidi yerine α-tokoferolle birleşerek reaksiyon zinciri kırılmış olur.

14

Lipid peroksidasyonuna karşı ilk sıradaki korunma mekanizmasıdır (62-66). Sadir S

ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada CP ile indüklenen HS’de; sistiti engelleyici

olarak mesna yerine ratlara alfa tokoferol verilmiş ve sonuçta MDA seviyelerinde

istatistiksel olarak belirgin azalma saptanmış ve histopatolojik olarakda mesane

hasarlanmasında belirgin düzelme olduğu gösterilmiştir (67).

C Vitamini:

Sitokrom a, sitokrom c ve moleküler oksijen gibi moleküllerin

indirgenmesinde görev alan suda eriyen bir vitamindir. Plazmada oksidan ajanlara

karşı ilk antioksidan defansı oluşturur. Düşük dansiteli lipoprotein (LDL)

kolesterolün oksidasyonunu önleyerek ateroskleroza karşı korumada yardımcı olur.

O2– ve OH- radikalleriyle reaksiyona girip onları temizleyen bir antioksidandır (63).

Beta-Karoten:

A vitamini oksidatif nedenlerle oluşan hücre yıkımının tamirinde rol

oynayan önemli bir vitamindir. Vitamin A eksikliği olan ratlarda SOD ve GSH-Px

enzim düzeylerinde azalma ve lipit peroksidasyonunda artma saptanmıştır. Bazı

epidemiyolojk çalışmalarda ateroskleroz ve kanser insidansının uygun miktarda beta

karoten ve diğer karotenoidleri alan kişilerde daha düşük olduğu saptanmıştır (68,

69).

Melatonin:

Bilinen en reaktif radikal olan OH- radikali ile reaksiyonu sonucu indolil

katyon radikalini oluşturur. Bu radikal de ortamdaki O2– ’yi tutarak etkisizleştirir.

Lipofilik bir antioksidandır. Tümör oluşumunun sınırlandırılması, immun sistemin

düzenlenmesi, reprodüktif fonksiyonların kontrolü gibi fonksiyonlara sahip olan ve

pineal bezden salgılanan bir hormondur (70-72).

Topal ve arkadaşlarının bir çalışmasında ratlarda CP ile indüklenen HS’de

melatoninin koruyucu etkisi gösterilmiştir. Bu çalışma da melatonin verilen grupta

MDA seviyelerinde düşme sağlanmasının yanında CP ile indüklenen HS’nin

patogenezinde önemli role sahip olan NO seviyelerinin iNOS enziminin aktivitesinin

baskılanarak düşürüldüğü ve melatoninin bu mekanizma ile mesane hasarını

engellediği belirtilmiştir (73).

15

Yine Zupancic ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada da ratlarda CP ile

indüklenen HS’de sadece CP alan gruba göre CP ve melatonin alan grupta

apoptozisin azaldığı, ürotelyal proliferasyonun arttığı ve mesane hasarına karşı

melatoninin koruyucu etkisi olduğu gösterilmiştir (74).

Glutatyon:

Glutatyon; karaciğerde genetik bilgiye ihtiyaç olmadan sentezlenebilen bir

tripeptitdir. Glutatyon çok önemli bir antioksidandır. Serbest radikaller ve

peroksitlerle reaksiyona girerek hücreleri oksidatif hasara karşı korur. Hemoglobinin

oksitlenerek methemoglobine dönüşümünün engellenmesinde rol alır. Ayrıca

proteinlerdeki sülfhidril (-SH) gruplarını redükte halde tutarak bu grupları

oksidasyona karşı korur, böylece fonksiyonel proteinlerin ve enzimlerin

inaktivasyonunu engeller. Glutatyon yabancı bileşiklerin detoksifikasyonu ve amino

asitlerin membranlardan transportunu da sağlar. Glutatyon eritrositleri, lökositleri ve

göz lensini oksidatif strese karşı korumada hayati öneme sahiptir (75).

2.6.2. Enzimatik Antioksidanlar

Başlıca antioksidan enzimler; GSH-Px, CAT ve SOD’dur (76).

2.6.2.1. Glutatyon Peroksidaz

Her birinde selenosistein içeren 4 alt birimden oluşur. Redükte glutatyonu

yükseltgerken H2O2’yi de suya çevirir ve böylece membran lipidlerini ve

hemoglobini oksidan strese karşı korur (76). E vitamini yetersiz olursa membranı

peroksidasyona karşı korur. Eritrositlerde en kuvvetli antioksidandır. GSH-Px

yetersizliği selenyum eksikliği sonucu olabilir. Çünkü selenyum bu enzimin bir

integral parçasıdır (61, 63).

Reaksiyon şu şekildedir:

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O

2.6.2.2. Katalaz

CAT yapısında dört tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. CAT esas

olarak peroksizomlarda daha az olarak da sitozolde ve mikrozomal fraksiyonda

16

bulunur. CAT, H2O2 ’yi suya ve oksijene parçalar. Granülamatöz hücrelerde CAT,

hücreyi kendi solunumsal patlamasına karşı koruma işlevini de görür. Hücrede

oluşan H2O2, OH- oluşumunu önlemek için ortadan kaldırır (77-79).

CAT enziminin katalizlediği reaksiyon şu şekildedir:

2H2O2 2H2O + O2

2.6.2.3. Süperoksit Dismutaz

SOD, O2– ’nin H2O2’ye dismutasyonunu katalize eden bir metalloenzimdir.

İnsan hücrelerinde özellikle sitozolde bulunan bakır ve çinko iyonu içeren SOD ile

manganez iyonu içeren mitokondrial SOD olmak üzere SOD’un iki izoenzimi

bulunur. Metalloprotein olan SOD bir O2– molekülünü O2 molekülüne yükseltger,

diğer O2– molekülünü de H2O2’e indirger.

Katalizlediği reaksiyon şu şekildedir:

2O2 - + 2H+ H2O2 + O2

Hücreyi radikallerin etkisinden koruyan savunma mekanizması arasında

SOD enzimi ilk rolü oynar. SOD’un fizyolojik fonksiyonu oksijeni metabolize eden

hücreleri O2– ’nin lipid peroksidasyonu gibi zararlı etkilerine karşı korumaktır. SOD,

fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar (54, 80).

2.7. Kafeik Asit Fenetil Ester

Son yıllarda doğal bazı maddelerin tıbbi özelliklerine yönelik artan bir ilgi

vardır. Özellikle bal ve propolis gibi arı ürünleri bu ilginin merkezi konumundadır.

Propoliste yaklaşık 100 çeşitten fazla bileşen bulunmuştur. CAPE yapıca

flavonoidlere benzeyen bal arısı propolisinin aktif bir bileşenidir (81).

Yapılan çalışmalarda CAPE’nin antioksidan, antiinflamatuvar, antiviral ve

immünomodülatör etkileri olduğu gösterilmiştir (12-14, 81-83).

Bunların yanında hem in vitro hem de in vivo olarak yapılan çalışmalarda

CAPE’nin transforme olmuş hücrelerde sitostatik özellikleri olduğu fakat normal

hücrelerin büyümesini değiştirmediği gösterilmiştir (84, 85).

17

2.7.1. CAPE’nin Yapısı ve Kimyasal Özellikleri

Yapıca flavonoidlere benzeyen CAPE’nin iki halkasal yapısı vardır (83).

Halkalardan bir tanesinde molekülün hemen hemen bütün kimyasal özelliklerini

gösteren ve fonksiyonel olan iki "–OH" grubu vardır. Hidroksil grupları, aktif bir

şekilde elektron alıp vererek oksitleyici ve redükleyici özellik gösterirler. Çok uzun

aromatik ve alifatik yapıda karbon grupları taşıdığı için aynı zamanda lipofilik

özelliktedir (14, 81). Böylece molekülün kolayca hücre membran yapılarından

geçmesi ve etki edeceği bölgeye ulaşması kolaylaşır. Yapılan araştırmalarda CAPE

her türlü yoldan rahatlıkla verilebilmekte ve ilgili vücut bölgesine ulaşımı kolay

olmaktadır (86).

2.7.2. CAPE’nin Antioksidan Etkisi

CAPE, linoleik asit ve araşidonik asitin 5-lipooksijenaz tarafından

oluşturulan oksijenasyonunu inhibe eder. On μmol/L konsantrasyonda in vitro

koşullarda nötrofiller veya ksantin dehidrogenaz/ksantin oksidaz sistemi tarafından

oluşturulan ROD’ları tamamen bloke ettiği bildirilmiştir (14, 87).

Yılmaz ve arkadaşları streptozosinle diyabet geliştirilen ratların karaciğer

MDA seviyesi, SOD ve CAT aktivitelerini araştırdıkları çalışmalarında, diyabetik

ratların karaciğerindeki MDA seviyesinin kontrol grubuna göre arttığını, fakat CAPE

grubunda kontrol grubu düzeyinde kaldığını; CAPE tedavisi verilen diyabetik rat

karaciğerinde SOD ve CAT aktivitelerinin azaldığını bildirmişlerdir. Yazarlar,

CAPE’nin serbest oksijen radikallerini süpürücü etkisinden dolayı diyabetik rat

karaciğerinde SOD ve CAT aktivitelerinde yükselmeyi engellediğini öne sürmüştür

(88).

18

3. MATERYAL ve YÖNTEM

Bu çalışma, Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel

Araştırma Merkezi, Tıbbi Biyoloji ve Patoloji Laboratuvarlarında gerçekleştirildi.

Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu’ndan onay alındı ve

çalışmamız etik kurul kurallarına uygun olarak yapıldı.

3.1. Materyal

3.1.1. Deney Hayvanları

Bu çalışmada; 8-12 haftalık ağırlıkları 220-295 gram arasında olan 40 adet

erkek Wistar-albino rat kullanıldı. Hayvanlar deney süresince standart nem, ışık (12

saat gün ışığı/12 saat karanlık) ve ısı koşullarında (23°C) bulunduruldu ve standard

rat yemi ile beslendi.

3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler

CAPE Sigma firmasının, Endoxan® ve Uromitexan® ampul İbrahim Ethem

ULAGAY firmasının üretimidir. Genel anestezi için Ketalar® (Eczacıbaşı)

kullanıldı. Ayrıca biyokimyasal ölçümler için kullanılan kimyasal maddeler

şunlardır: Folin & Ciocalteu’s Phenol Reagent; nitroblue tetrazolium, Xanthine,

CuSO4 (bakırsülfat), Sodyum sitrat, Na2CO3, NaOH, EDTA, BSA, CuCl2, NH4SO4

(amonyum sülfat), NaCN, TCA (Trikloroasetik asit), TBA (Tiobarbitürik asit),

Kadmiyum granülleri, Glisin-NaOH tamponu, Sülfanilamid, NNDA(N-

Naphthyhethylene), CuS04, H2S04, ZnS04.

3.1.3. Kullanılan Malzeme ve Aletler

Deneyde kullanılan malzemeler ve markalarıyla üretildikleri ülkeler Tablo 3

de özetlenmiştir.

19

Tablo 3. Deneyde kullanılan malzemeler

1 Soğutmalı santrifüj Hettich-D 78532 (Almanya)

2 Derin dondurucu İndesit 6SF 2200 (İtalya)

3 Hassas terazi Shimadzu AX200 (Japonya)

4 Vorteks (karıştırıcı) Nüve NM 100 (Türkiye)

5 Otomatik pipetler Eppandörf (Almanya)

6 UV spektrofotometre Shimadzu UV 1700 (Japonya)

7 Homojenizatör Heidolph Diax 900 (Almanya)

3.2. Yöntem

3.2.1. Deney Protokolü

Çalışmada genç sağlıklı 8-12 haftalık 40 erkek Wistar Albino rat kullanıldı.

Ratlar 220-295 gram arası ağırlıklara sahip olup randomize olarak onarlı 4 grupa

ayrıldı.

Grup 1 (Kontrol grubu): Sadece CP dozu kadar intraperitoneal (i.p.)

SF(serum fizyolojik) verildi.

Grup 2 (CP grubu): Ürotoksik doz olan 100 mg/kg tek doz i.p. CP verildi

(73).

Grup3 (CP+mesna grubu): Bu grupta ise yine 100 mg/kg tek doz i.p. CP

enjeksiyonuna ek olarak mesna 21.5 mg/kg dozunda CP enjeksiyonundan 20 dakika

önce ve CP enjeksiyonundan sonraki 4. ve 8. saatlerde olmak üzere 3 kez i.p. olarak

verildi (45, 73).

Grup 4 (CP+CAPE grubu): Bu grupta da yine 100 mg/kg tek doz i.p. CP

enjeksiyonu ile HS oluşturuldu. CAPE 10 μmol/kg dozunda CP enjeksiyonundan 48

saat önce, 24 saat önce ve 20 dakika önce olmak üzere (toplam 3 doz) i.p. olarak

verildi (73, 88)

20

Tablo 4. Deney protokolü

Gruplar

CP enjeksiyonu

öncesi 48.saat

CP enjeksiyonu

öncesi 24.saat

CP enjeksiyonu

öncesi 20.dk

CP enjeksiyonu

CP enjeksiyonu

sonrası 4.saat

CP enjeksiyonu

sonrası 8.saat

CP enjeksiyonu

sonrası 24.saat

Grup1 SF SF SF 100 ml/kg SF

SF SF sakrifiye

Grup 2 SF SF SF 100 mg/kg CP (ip)

SF SF sakrifiye

Grup 3 SF SF 21.5mg/kg mesna (ip)

100 mg/kg CP (ip)

21.5mg/kg mesna (ip)

21.5 mg/kg mesna (ip)

sakrifiye

Grup 4 10 μmol/kg CAPE (ip)

10 μmol/kg CAPE (ip)

10 μmol/kg CAPE (ip)

100 mg/kg CP (ip)

SF SF sakrifiye

Deney başlangıcında ve sakrifiye etme işlemlerinden önce ratların

ağırlıkları tartıldı. İlaç uygulamaları hayvanların ağırlıklarına göre yapıldı.

Hayvanların sakrifiye edilmesi genel anestezi ile gerçekleştirildi. Genel anestezi için

1 mg/kg xylazine ve 0.5 ml/kg ketamin i.p. olarak yapıldı. İki eşit parçaya ayrılan

mesanenin yarısı -80°C de enzim ölçümleri için saklanmak üzere soğutucuya

kaldırıldı.

3.2.2. Histolojik Değerlendirme

Mesanenin diğer kısmı ise %10’luk tamponlanmış formalinde 24 saat fikse

edildikten sonra parafin bloklara gömülen mesane dokularından yaklaşık 5µ’luk en

az 4 kesit alınarak hematoksilen eozinle boyandı. Ödem, hemoraji ve inflamasyon ve

mukozal ülserasyon değerlendirildi (tablo 5 ve tablo 6).

Tablo 5. Ödem, hemoraji ve inflamasyon sınıflaması(45).

Evre 0 Normal bulgular

Evre 1 Minimal ödem, hemoraji ya da inflamasyon

Evre 2 Hafif ödem, hemoraji ya da inflamasyon

Evre 3 Orta düzeyde ödem, hemoraji ya da inflamasyon

Evre 4 Şiddetli ödem, hemoraji ya da inflamasyon

21

Tablo 6. Mukozal Lezyonun Sınıflandırılması (3).

Evre 0 Mesane mukoza hücreleri normal görünüm, şekil, yoğunluk ve yerleşimde

Evre 1 Mesane mukoza hücrelerinde epitelyal dökülme

Evre 2 Mesane mukozasında fokal ülserasyon

Evre 3 Mesane mukozasında yaygın epitelyal ülserasyon

Evre 4 Mesane mukozasında yaygın epitelyal ülserasyona ilaveten submkozal ülserasyonlar

3.2.3. Biyokimyasal Ölçümler

Tüm ratlardan biyokimyasal olarak mesane dokusunda SOD ve CAT

aktivitesi ile MDA ve NO seviyeleri çalışıldı. Aebi’nin (89) metoduna göre CAT

aktivitesi, Sun ve arkadaşlarının (90) metoduna göre SOD enzim aktivitesi çalışıldı.

MDA ölçümü ise Draper ve Hadley’in (91) metoduna göre yapıldı. NO ise Cortas ve

Wakid’in (92) 1990’da tanımladığı gibi çalışıldı. Protein tayini ise Lowry ve

arkadaşlarının (93) tanımladığı gibi yapıldı.

3.3. İstatistiksel Analiz

Çalışmanın analizi SPSS 9.05 istatistik programında yapıldı. Gruplarda yer

alan sonuçların normal dağılıma sahip olup olmadıklarını belirlemek için non-

parametrik testlerden one-sample Kolmogorov-Smirnov testi kullanıldı.

Biyokimyasal parametreler normal dağılım gösteriyordu. Elde edilen veriler ortalama

± standart sapma şeklinde ifade edildi ve p değeri 0.05 ve daha küçük olan veriler

istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Biyokimyasal parametrelerin

değerlendirilmesinde ise parametrik bir test olan olan tek yönlü varyans analizi

(ANOVA) ve Least Significant Difference Test (LSD Test) kullanıldı.

Histolojik bulguların değerlendirilmesinde ise non-parametrik testlerden

Kruskall Wallis ve grupların karşılaştırılmasında ise Mann Whitney U testi

kullanıldı. Elde edilen veriler ortalama ± standart sapma şeklinde ifade edildi ve

yine p değeri 0.05 ve daha küçük olan veriler istatistiksel olarak anlamlı kabul

edildi.

22

4. BULGULAR

4.1. Histolojik Değerlendirme

Tablo 7. Ödem, hemoraji, inflamasyon ve mukozal ülserasyon açısından grupların

ortalama, standart sapma ve p değerleri.

Ödem Hemoraji İnflamasyon

Mukozal

ülserasyon

1-Kontrol 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

2-CP 2.00 ± 1.05 1.90 ± 0.99 2.10 ± 1.28 1.90 ± 1.10

3-CP+mesna 0.50 ± 0.52 0.60 ± 0.69 0.40 ± 0.51 0.40 ± 0.51

4-CP+CAPE 1.60 ±1.42 1.80 ±1.31 1.40 ± 1.34 1.40 ± 1.07

P değerleri

1-2 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001

1-3 0.012 0.012 0.029 0.029

1-4 0.002 0.001 0.002 0.001

2-3 0.001 0.004 0.001 0.001

2-4 AD AD AD AD

Veriler ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. AD:Anlamlı değil.

CP grubuna göre CP ve mesna alan grupta ödem, hemoraji, inflamasyon ve

mukozal ülserasyon skorlarında belirgin düşüş oldu ve istatistiksel olarak anlamlık

mevcuttu. CP ve CAPE alan grupta da CP grubuna göre özellikle ödem, inflamasyon

ve mukozal ülserasyon skorlarında kısmi düzelme saptanmasına rağmen istatistiksel

olarak anlamlılık yoktu.

23

Resim 1: Normal kontrol grubu örneklerinden normal mesane (H.E.;X100).

Resim 2: CP grubu örneklerinden submukozal ülserasyon ve hemoraji (H.E.;X200).

24

Resim 3: CP-mesna grubu örneklerinden epitelyal dökülme ve ödem (H.E.;X100).

Resim 4: CP-CAPE grubu örneklerinden yaygın epitelyal ülserasyon (H.E.;X100).

25

4.2. Biyokimyasal Ölçümlerin Değerlendirilmesi

4.2.1. Mesane Dokusunda Antioksidan Enzim Aktiviteleri

4.2.1.1. Mesane Dokusunda SOD Aktivitesi

CP verilerek HS geliştirilen ratlardan CP grubunda SOD aktivitesinde artış

saptandı, istatistiksel olarak anlamlılığa çok yakındı (p=0.058). Sadece CP alan grup

ile CP ve mesna verilen grup kıyaslandığında mesna önleme tedavisinin SOD enzim

aktivitesinin azalmasına neden olduğu görüldü ama istatistiksel olarak anlamlılık

saptanmadı. CP grubu ile CP ve CAPE alan grup kıyaslandığında ise sistiti önleme

amacıyla verilen CAPE, SOD enzim aktivitesinde azalmaya neden oldu ama

istatistiksel olarak yine anlamlılık saptanmadı (Tablo 8).

Tablo 8. Mesane dokusunda SOD aktivitesi.

Gruplar SOD

(U/mg protein)

Kontrol 0.126 ± 0.01

CP 0.142 ± 0.01 1

CP+mesna 0.126 ± 0.02 2

CP+CAPE 0.131 ± 0.01

Veriler, ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. . 1 Kontrol grubuna göre p= 0.058, 2 CP grubuna

göre p=0.052

4.2.1.2. Mesane Dokusunda CAT Aktivitesi

CP grubunda CAT aktivitesi kontrol grubuna göre artmış bulundu ve

istatistiksel olarak anlamlılık mevcuttu. CP grubuna göre CP ve mesna verilen grupta

CAT aktivitesi önemli oranda düşük saptandı ve bu istatistiksel olarak anlamlıydı.

Ayrıca CP ve CAPE verilen grupta da CP grubuna göre CAT aktivitesinde azalma

saptandı ve istatistiksel olarak yine anlamlılık bulundu (Tablo 9).

26

Tablo 9. Mesane Dokusunda CAT aktivitesi.

Gruplar CAT

(k/g protein)

Kontrol 0.110 ± 0.01

CP 0.134 ± 0.01 1

CP+mesna 0.090 ± 0.03 2

CP+CAPE 0.097 ± 0.02 3

Veriler, ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 1 Kontrol grubuna göre p= 0.041, 2 CP grubuna

göre p=0.0001, 3 CP grubuna göre p=0.003.

4.2.2. Mesane Dokusunda MDA Düzeyleri

CP verilen grupta MDA düzeyleri anlamlı olarak yüksek bulundu

(p=0.008). CP ve mesna verilen grupta ise CP grubuna göre MDA düzeylerinde

azalma saptandı ama istatistiksel olarak anlamlılık saptanmadı. CP ve CAPE tedavisi

alan grupta da CP grubuna göre MDA seviyelerinde düşüş saptandı ama yine

istatistiksel olarak anlamlılık yoktu (Tablo 10).

Tablo 10. Mesane Dokusunda MDA düzeyleri.

Gruplar MDA

(nmol/mg protein)

Kontrol 4.327 ± 1.15

CP 6.387 ± 2.37 1

CP+mesna 5.562 ± 1.60

CP+CAPE 5.790 ± 1.14

Veriler, ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 1 Kontrol grubuna göre p= 0.008.

4.2.3. Mesane Dokusunda NO Seviyeleri

CP grubu ile CP ve mesna tedavisi alan grup kıyaslandığında CP ve mesna

alan grupta NO seviyelerinde anlamlı bir azalma yoktu. CP ve CAPE alan grupta ise

CP grubuna göre belirgin düşüş vardı ve istatistiksel olarak anlamlılık mevcuttu

(Tablo 11).

27

Tablo 11. Mesane dokusunda NO seviyeleri.

Gruplar NO

(mikromol/g protein)

Kontrol 0.329 ± 0.08

CP 0.392 ± 0.106

CP+mesna 0.385 ± 0.07

CP+CAPE 0.272 ± 0.07 1

Veriler, ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 1 CP grubuna göre p=0.006.

28

5. TARTIŞMA

CP; nitrojen mustard grubundan alkilleyici antineoplastik kemoterapötik bir

ajandır. Pek çok neoplastik hastalıkta tek başına ya da diğer kemoterapötiklerle

beraber kullanılmaktadır. HS ise CP ve onun sentetik analoğu olan ifosfamid’in

major potansiyel toksik etkisi ve doz kısıtlayıcı yan etkisidir (1, 94).

Mesna 1970’lerin sonundan itibaren klinik çalışmalara giren ve kısa zaman

içinde CP’nin yaptığı mesane hasarına karşı koruyucu etkisi ispatlanan ve halen

günümüzde de ilk sırada kullanılmakta olan sistemik üroprotektif bir ajandır (95).

CP’nin HS yapıcı etkisi direkt alkilleyici aktiviteden ziyade renal akrolein salınımına

bağlanmıştır (96). Mesna ise böbreklerden salgılanan bu akroleine bağlanarak onu

detoksifiye eder ve HS’yi engeller ancak yine de buna rağmen klinikte makroskopik

ya da mikroskopik hematüri ya da sık idrara çıkma, dizüri gibi semptomlarla

tanımlanan önemli miktarlarda HS ile de karşılaşılmakta olup yeni tedavi

yöntemlerine ihtiyaç vardır (3, 5).

Daha önceki çalışmalarda ratlarda deneysel HS oluşturmak için CP’nin dozu

genellikle 100-200 mg/kg olarak kullanılmıştır ve ratlar siklosfamid enjeksiyonu

sonrası 6-48 saat içinde sakrifiye edilmiştir (7, 8, 97, 98). Biz de çalışmamızda en sık

kullanılan doz olan 100 mg/kg dozunu tercih ettik ve enjeksiyonu takip eden 24 saat

sonunda ratları sakrifiye ettik. Mesna ise klasik kemoterapi protokolündekine benzer

şekilde CP dozunun yaklaşık %20 si olacak şekilde 21,5 mg/kg dozunda CP

enjeksiyonundan hemen önce ve enjeksiyon sonrası 4.saat ve 8.saat olmak üzere 3

eşit dozda uygulandı (45, 99, 100).

CAPE antioksidan ve antiinflamatuvar özellikleri ile ön plana çıkan bir

molekül olarak pek çok çalışmada kullanılmıştır. Diyabetik rat karaciğerinde

oksidatif hasarı CAPE’nin önlediği gösterilmiştir (88). Diyabetik ratların

karaciğerinde MDA seviyelerinin kontrol ratlarına göre arttığı ve CAPE grubunda

kontrol grubu düzeyinde kaldığı gösterilmiştir. CAPE tedavisi verilen diyabetik rat

karaciğerinde SOD ve CAT aktivitelerinin azaldığı görülmüştür. Rat ince barsağında

reperfüzyon hasarını önlemede CAPE’nin etkisini araştıran Koltuksuz ve arkadaşları,

CAPE’nin SOR oluşumunu önlediğini ve lökosit infiltrasyonunu inhibe ederek

dokuyu hasardan koruduğunu bildirmişlerdir (101).

29

CAPE 10 μmol/L konsantrasyonda nötrofillerden SOR üretimini inhibe

etmiştir (14). Ayrıca CAPE, NF-κB aktivasyonunu potent ve spesifik olarak

engellemektedir. NF-κB inhibisyonu CAPE’nin anti inflamatuvar, antioksidan,

antikanserojen etkileri için oldukça önemlidir. Bilindiği gibi NF-κB proinflamatuvar

sitokinler (interlökin-1 ve tümör nekrozis faktör alfa vb), bakteriyel ürünler, oksidatif

stres gibi birçok faktör tarafından indüklenmektedir (102).

CAPE daha önceden antioksidan etkinliği gösterilen doz olan 10 μmol/kg

dozunda (88, 101) CP tedavisi öncesi 48.saat, 24.saat ve 20 dakika önce olmak üzere

3 doz verildi.

Bugüne kadar CP’nin indüklediği HS’yi engellemek amacıyla ratlarda pek

çok antioksidan denenmiştir (67, 99, 103). Literatür taramalarımızda ratlarda CP’nin

indüklediği HS modellerinde CAPE tedavisi verilen çalışma bulunmamaktadır. Bu

çalışma ratlarda CP ile indüklenen HS’yi önlemede CAPE ile yapılan ilk çalışmadır.

Son yıllarda HS patogenezinde serbest radikal üretiminin önemli yer

tuttuğuna ilişkin pek çok kanıt vardır. Son yapılan çalışmalar CP’nin mesane

üzerindeki toksik etkilerinin ortaya çıkması için artmış NO üretimine ihtiyaç

duyduğunu göstermiştir (6-8). İnflamatuvar mesane dokusunda toksisiteden özellikle

RND’ler sorumludur. Özellikle aşırı miktarlardaki NO ve O2– ’nin reaksiyonu sonucu

oluşan peroksinitrit oksidan strese neden olan ve doku hasarı ile sonuçlanan

inflamatuvar süreçle ilgilidir (10, 32). ROD ve RND’lerin inflamatuvar süreç

içerisinde aşırı üretimi oksidatif strese neden olur ve bu da hücresel ve DNA

hasarlanması, protein denatürasyonu ve membran lipidlerinde peroksidasyonu da

içeren mekanizmalar yoluyla nekroza yol açar (104).

Souza-Filho ve arkadaşları; CP verilen ratların mesane dokularında

kalsiyum bağımlı NOS aktivitesinin azaldığını ve kalsiyum bağımlı olmayan NOS

(iNOS) aktivitesinin arttığını göstermişlerdir (30). Vizzard ve arkadaşları da ratların

mesane dokusundaki primer afferent kapsaisin sensitif sinir liflerinde nNOS

ekspresyonun arttığını bildirmişlerdir (105).

Alfieri ve arkadaşları da CP verilen ratların mesane dokusundaki epitelyal

hasarlanma, aşırı lökosit birikimi, ödem, vasküler konjesyon ve plazma protein

ekstravazasyonu gibi HS bulgularından özellikle iNOS ve onun ürettiği NO’nun

30

sorumlu olduğunu göstermişlerdir (106). Başka bir çalışmada da iNOS enziminin

artmış olduğu CP’ye bağlı HS’de ratlara anti-tümör nekrozis faktör alfa serumu

verilmesinin vezikal ödemi azalttığı ve bunun da NOS enziminin indüklenebilmesi

için inflame mesane dokusunun tümör nekrozis faktör alfa ve platelet aktive edici

faktör gibi mediatörlere ihtiyaç duyduğunu göstermiştir (104). Yine son zamanlarda

çeşitli NOS inhibitörleri kullanılarak NOS enziminin bloke edildiği deneysel HS

modellerinde CP’ye bağlı hasarlanmanın histopatolojik olarak belirgin azaltıldığı

gösterilmiştir (8, 30, 72).

Bizim çalışmamızda mesane dokusunda NO seviyelerine bakılacak olursa

CP ve mesna alan grupta sadece CP alan gruba göre anlamlı bir düşüş olmadı. CP ve

CAPE alan grupta ise sadece CP grubuna göre belirgin düşüş vardı ve istatistiksel

olarak anlamlıydı. Bu bulgular neticesinde ratlarda CP ile indüklenen HS’de

CAPE’nin dokudaki oksidatif hasarı önlemek amacıyla NO seviyesini azalttığı ve

böylece ortamda aşırı miktarda bulunan O2– radikalinin artmış NO ile birleşerek HS

patogenezinde kritik öneme sahip olan peroksinitrit gibi RND’lerin oluşumunu

engelleyerek oksidatif stresi engellemeye çalıştığı düşünülebilir. CAPE

antiinflamatuvar etkisini NOS’un gen oluşumu ve katalitik aktivitesini inhibe ederek

oluşturmaktadır (107). Çalışmamızda CAPE’nin bu özelliği ile NO düzeyini azaltmış

olabileceğini düşünmekteyiz. Fakat CAPE’ nin HS’de NO seviyesini hangi

mekanizma ya da mekanizmalar aracılığı ile azalttığına dair ayrıntılı bilgiler için yeni

çalışmalara ihtiyaç vardır.

Bilindiği üzere tek bir elektronun transfer yoluyla oksijene verilip

redüklenmesi O2 - oluşturmaktadır. Oksijenin 2 elektronla redüklenmesi ise H2O2

oluşturur. SOD enzimi O2 - radikalini H2O2’ye dönüştürerek ortadan kaldırırken,

CAT enzimi ise H2O2’yi H2O’ya dönüştürerek temizleyen antioksidan enzim

sistemleridir. Ortamda O2 - radikalinin artması SOD enzim aktivitesini, H2O2’in

artmış olması CAT enzim aktivitelerini dolaylı olarak arttırmaktadır (108, 109).

Çalışmamızda CP verilerek HS oluşturulan grupta SOD ve CAT

aktivitesinde artış mevcuttu. Ancak SOD artışı istatistiksel olarak anlamlı değildi.

CAT artışı istatistiksel olarak anlamlıydı. Mesane dokusundaki CAT ve SOD

aktivitesindeki artış, oksidatif stres artışına adaptif bir cevap olabilir. Böylece CAT

31

aktivite artışı endojen H2O2 artışı ile birlikte olan yüksek derecede oksidatif stresin

belirteci olabilir. Mesna verilen grupta CAT aktivitesinde belirgin azalma vardı ve

istatistiksel olarak anlamlılık saptandı. SOD aktivitesindeki azalma ise anlamlı

değildi. CAPE ön tedavisi verilen grupta ise CAT enzim aktivitesi belirgin olarak

düşük saptandı ve istatistiksel olarak da anlamlılık bulundu. SOD enzim seviyesinde

de düşme olsa da istatistiksel olarak anlamlılık saptanmadı. Yılmaz ve arkadaşları

streptozosinle diyabet geliştirilen ratların karaciğer MDA seviyesi, SOD ve CAT

aktivitelerini araştırdıkları çalışmalarında, CAPE tedavisi verilen diyabetik rat

karaciğerinde SOD ve CAT aktivitelerinin azaldığını bildirmişlerdir. Yazarlar,

CAPE’nin serbest oksijen radikallerini süpürücü etkisinden dolayı diyabetik rat

karaciğerinde SOD ve CAT aktivitelerinde yükselmeyi engellediğini öne sürmüştür.

(88). Bizim çalışmamızda da CAPE tedavisi ile ortamdaki serbest radikallerin

süpürülmesi CAT ve SOD enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir.

Oksidatif stres SOR miktarındaki artışla seyreden bir durumdur. Bu artış

membranlarda lipid peroksidasyonuna neden olur. Lipid peroksidasyonu

organizmada moleküler hasarlara sebep olarak önemli hücresel yapıları ve

fonksiyonları etkiler. Serbest oksijen radikalleri ile lipid peroksidasyonu sonucunda

oluşan son ürün MDA’dır. Dolayısıyla bir dokuda MDA düzeyinin artması serbest

oksijen radikallerinin arttığını gösterir (110). ROD üretiminin artması dokuda MDA

birikimine neden olur (3, 31). CP’nin indüklediği HS’de oksidatif stres sonucu

mesane dokusunda MDA seviyelerinin yükseldiği gösterilmiştir. Melatonin, alfa-

tokoferol ve beta-karoten MDA seviyelerini anlamlı olarak azaltmıştır (73, 111).

Bizim çalışmamızda da beklenildiği gibi CP alan grupta MDA düzeyleri anlamlı

olarak yüksekti. CP ve mesna alan grupta MDA seviyesinde kısmi azalma vardı

ancak istatistiksel anlamlık yoktu. CP ve CAPE alan grupta da MDA seviyelerinde

azalma mevcuttu ancak istatistiksel anlamlılık bu grupta da saptanmadı.

Çalışmamız sonucunda mesane histopatolojisi değerlendirildiğinde CP’nin

i.p. olarak 100 mg/kg dozunda verildiği CP grubunda HS geliştiği gözlendi. Kontrol

grubunda ödem, hemoraji, inflamasyon ya da mukozal ülserasyon saptanmadı. CP ve

mesna alan grupta histopatolojik olarak ödem, hemoraji, inflamasyon ve mukozal

ülserasyonda anlamlı derecede azalma saptandı. CP ve CAPE alan grupta ise

histolojik parametrelerin aritmetik ortalamalarına bakılacak olursa CP grubuna göre

32

ödem, inflamasyon ve mukozal ülserasyon da azalma olmakla beraber istatistiksel

olarak anlamlık yoktu. Bunun nedeni; bizim çalışmamızda deneysel HS’de CAPE ilk

kez kullanılmış olduğundan henüz standart bir CAPE dozu bulunmaması ve deneysel

HS’de CAPE’nin hangi sürede verileceğinin tam olarak bilinememesi olabilir.

Histopatolojik iyileşme sağlanabilmesi için ise CAPE ‘nin hangi dozda ve hangi

sürede verileceğine yönelik yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.

33

6. SONUÇ

Sonuç olarak CP ile oluşturulan HS’de histolojik değişiklikleri önlemede

mesnanın oldukça etkin olduğu, CAPE’nin ise yetersiz kaldığı gösterildi.

Antioksidan enzimler üzerinde ise hem mesna hem de CAPE’nin CAT aktivitesini

azalttığı, NO üzerine mesnanın etkisiz kaldığı buna karşın CAPE’nin NO’i anlamlı

derecede azalttığı tespit edilmiştir. Ratlarda CP ile indüklenen HS patogenezinde

artmış NO’in kritik öneme sahip olduğunu gösteren çalışmalar dikkate alındığında

histolojik hasarın önlenmesi için mesna ile CAPE’nin birlikte kullanılmasının daha

faydalı olacağını düşünmekteyiz.

34

7. ÖZET

AMAÇ: Siklofosfamid (CP) ile indüklenen hemorajik sistitte (HS), Kafeik asit fenetil ester’in koruyucu etkisini araştırmak ve varsa kafeik asit fenetil ester’in koruyucu etkinliğini mesna ile karşılaştırmak.

MATERYAL VE METOD: 8-12 haftalık 40 erkek Wistar albino rat randomize olarak onarlı dört gruba ayrıldı. Ürotoksik doz olan 100 mg/kg siklofsfamid (CP) enjeksiyonu ile hemorajik sistit (HS) oluşturuldu. Grup 1 (Kontrol) hayvanlar kontrol grubu olarak kabul edildi ve CP dozu kadar saline enjekte edildi. Grup 2 (CP) hayvanlara sadece CP verilirken, grup 3’e (CP+mesna) 100 mg/kg CP yanında, CP enjeksiyonundan 20 dakika önce, 4 saat ve 8 saat sonra olmak üzere 3x21.5 mg/kg dozunda mesna verildi. Grup 4’e (CP+CAPE) ise 100 mg/kg dozunda CP enjeksiyonu uygulanmakla beraber CP enjeksiyonu öncesi 48.saat, 24.saat ve 20 dakika önce olmak üzere 10 μmol/kg dozunda CAPE ön tedavisi verildi. Tüm ilaçlar i.p. olarak verildi. Mesane dokuları iki eşit parçaya ayrıldı. Bir kısmı SOD ve CAT aktivitesi ve MDA ile NO seviyelerinin saptanması için -80 C de muhafaza edildi. Diğer kısmı ise histolojik değerlendirme için 24 saat boyunca %10’luk formaldehid solusyonunda bekletildi.

BULGULAR: Kontrol grubundaki tüm ratlarda mesane histolojileri normaldi. CP uygulanan grupta mikroskopik olarak ciddi mukozal hasar saptandı. Mesnanın CP ile indüklenen mesane hasarına karşı anlamlı derecede koruma sağladığı gösterildi. CAPE’nin ise histolojik hasara karşı minimal koruyucu etkisi oldu. CP verilerek HS oluşturulan grupta oksidatif stresin göstergesi olan MDA seviyeleri yüksek saptanmakla beraber CAPE tedavisi MDA seviyelerini azalttı ancak istatistiksel anlamlık yoktu (P>0.05). SOD ve CAT aktiviteleri CP ve mesna ile CP ve CAPE tedavisi alan gruplarda doku örneklerinde azalmıştı. Bununla beraber sadece CAT aktivitesindeki azalma anlamlı bulundu (CP+mesna ve CP+CAPE için p<0.05). Sadece CP alan grup ile CP ve CAPE tedavisi alan grup kıyaslandığında CP ve CAPE grubunda NO seviyesi anlamlı olarak düşük bulundu (p<0.01)

SONUÇ: Ratlarda CP ile indüklenen HS patogenezinde artmış NO’in kritik öneme sahip olduğunu gösteren çalışmalar dikkate alındığında histolojik hasarın önlenmesi için mesna ile CAPE’nin birlikte kullanılmasının daha faydalı olacağını düşünmekteyiz.

35

8. ABSTRACT

AIM: We investigated the protective effect of Caffeic asit phenyl ester

(CAPE) on cyclophosphamide (CP) induced hemorrhagic cystitis (HC) in rats in

comparison with the protective effect of mesna.

MATERIALS AND METHODS: Forty male Wistar rat ages between 8-12

weeks were divided into four groups by random sampling method. Hemorrhagic

cystitis induction was performed using an urotoxic dose of 100 mg/kg CP. Group 1

(Control) animals were injected with the same amount of saline and served as

controls. Group 2 (CP) received only CP, group 3 (CP+mesna) received 100mg/kg

CP and mesna in dosage of 21,5 mg/kg was given 20 minutes before, 4 and 8 hours

after CP injection. Group 4 (CP+CAPE) received 100mg/kg CP and pretreated with

CAPE (10 μmol/kg/day) two days and also 20 minutes before CP injection. All drugs

were administered i.p. The bladder tissues were cut into two equal pieces from top to

the bottom. One half was stored at -80 C for determination of SOD and CAT

activities with MDA and NO concentration and the other half was fixed for 24 hr in

10% buffered formaldehyde for histological evaluation.

RESULTS: Control animals had histologically normal bladders. CP caused

severe microscopic bladder mucosal injury. Mesna exhibited significant histological

protection against bladder damage of CP. CAPE had minimal protective effect on

histological damage. Cyclophosphamide injection which caused HC increased MDA

levels indicating oxidative stres while CAPE ameliorated MDA levels in the bladder

(P>0.05). SOD and CAT activities were decreased in the tissue samples of

CP+mesna and CP+CAPE group. However, only CAT activities were decreased

significantly (CP+mesna and CP+CAPE p<0.05). Pretreatment with CAPE (p<0.01)

resulted in significant decrease in NO level when compared with CP group.

CONCLUSION: When we consider the studies which show the critical

importance of increased NO levels in the pathogenesis of cyclophosphamide

induced hemorrhagical cystitis, we suggest that it would be more benefical to use

mesna with CAPE to prevent the histological damage.

36

9. KAYNAKLAR

1. Levine LA, Richie JP. Urological complications of cyclophosphamide. J Urol 1989;141(5):1063–1069.

2. West NJ. Prevention and treatment of hemorrhagic cystitis. Pharmacotherapy 1997;17(4):696–706.

3. Gray KJ, Engelmann UH, Johnson EH, Fishman IJ. Evaluation of misoprostol cytoprotection of the bladder with cyclophosphamide (cytoxan) therapy. J Urol 1986;136(2):497–500.

4. Brock N, Pohl J, Stekar J. Studies on the urotoxicity of oxazaphosphorine cytostatics and its prevention --III. Profile of action of sodium 2-mercaptoethane sulfonate (mesna). Eur J Cancer Clin Oncol. 1982;18(12):1377-87.

5. Goren MP, McKenna LM, Goodman TL. Combined intravenous and oral mesna in outpatients treated with ifosfamide. Cancer Chemother Pharmacol 1997; 40(5):371–375.

6. Kurowski V, Wagner T. Urinary excretion of ifosfamide, 4-hydroxyfosfamide, 3- and 2-dechloroethylifosfamide, mesna, and dimesna in patients on fractionated intravenous ifosfamide and concomitant mesna therapy. Cancer Chemother Pharmacol.1997; 39(5):431–439.

7. Korkmaz A, Oter S, Deveci S, Ozgurtas T, Topal T, Sadir S, Bilgic H. Involvement of nitric oxide and hyperbaric oxygen in the pathogenesis of cyclophosphamide induced hemorrhagic cystitis in rats. J Urol 2003;170:2498–2502.

8. Oter S, Korkmaz A, Oztas E, Yildirim I, Topal T, Bilgic H. Inducible nitric oxide synthase inhibition in cyclophosphamide induced hemorrhagic cystitis in rats. Urol Res 2004;32(3):185–189.

9. Ribeiro RA, Freitas HC, Campos MC, Santos CC, Figueiredo FC, Brito GA, Cunha FQ. Tumor necrosis factor-a and interleukin-1b mediate the production of nitric oxide involved in the pathogenesis of ifosfamide induced hemorrhagic cystitis in mice. J Urol 2002;167(5):2229–2234.

10. Szabo C. The pathophysiological role of peroxynitrite in shock, inflammation, and ischemia-reperfusion injury. Shock 1996; 6(2):79–88.

11. Ilhan A, Koltuksuz U, Ozen S, Uz E, Ciralik H, Akyol O. The effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on spinal cord ischemia/reperfusion injury in rabbits. Eur J Cardiothorac Surg 1999;16(4):458–463.

12. Pascual C, Gonzalez R, Torricella RG. Scavenging action of propolis extract against oxygen radicals. J Ethnopharmacol 1994;41(1-2):9-13.

37

13. Dobrowolski JW, Vohora SB, Sharma K, Shah SA, Naqvi SA, Dandiya PC. Antibacterial, antifungal, antiameboic, antiinflamatory and antipyretic studies on propolis bee products. J.Ethnopharmacol 1991;35(1);77-82.

14. Sud’ina GF, Mirzoeva OK, Pushkareva MA, Korshunova GA, Sumbatyan NV, Varfolomeev SD. Caffeic acid phenethyl ester as a lipoxygenase inhibitor with antioxidant properties. FEBS Lett 1993;23;329:21–24.

15. Del Pizzo JJ, Chew BH, Jacobs SC, Sklar GN. Treatment of radiation induced hemorrhagic cystitis with hyperbaric oxygen: long-term followup. J Urol. 1998;160(3 Pt 1):731-733.

16. deVries CR, Freiha FS. Hemorrhagic cystitis: a review. J Urol. Jan 1990;143(1):1-9.

17. Barouch DH, Faquin WC, Chen Y, Koralnik IJ, Davis BT. BK virus-associated hemorrhagic cystitis in a Human Immunodeficiency Virus-infected patient. Clin Infect Dis 2002;1;35(3):326-9.

18. Lee HJ, Pyo JW, Choi EH, Ha IS, Cheong HI, Choi Y, Kasel JA, Piedra PA. Isolation of adenovirus type 7 from the urine of children with acute hemorrhagic cystitis. Pediatr Infect Dis J 1996;15(7):633-4.

19. Raboni SM, Siqueira MM, Portes SR, Pasquini R. Comparison of PCR, enzyme immunoassay and conventional culture for adenovirus detection in bone marrow transplant patients with hemorrhagic cystitis. J Clin Virol 2003;27(3):270-5.

20. Youn T, Trachtman H, Gauthier B. Clinical spectrum of gross hematuria in pediatric patients. Clin Pediatr (Phila) 2006;45(2):135-41.

21. Duncan W, Williams JR, Kerr GR, Arnott SJ, Quilty PM, Rodger A, MacDougall RH, Jack WJ. An analysis of the radiation related morbidity observed in a randomized trial of neutron therapy for bladder cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1986;12(12):2085-92.

22. Farquharson DI, Shingleton HM, Sanford SP, Soong SJ, Varner RE Jr, Hester S. The short-term effect of pelvic irradiation for gynecologic malignancies on bladder function. Obstet Gynecol. 1987;70(1):81-4.

23. Corman JM, McClure D, Pritchett R, Kozlowski P, Hampson NB. Treatment of radiation induced hemorrhagic cystitis with hyperbaric oxygen. J Urol 2003;169(6):2200-2.

24. Yagoda A, Mukherji B, Young C, Etcubanas E, Lamonte C, Smith JR, Tan CT, Krakoff IH. Bleomycin an antitumor antibiotic. Clinical experience in 274 patients. Ann Intern Med 1972 ;77(6): 861-870.

38

25. Edward Chu, M.D. Physicians’ Cancer Chemoterapy Drug Manual 2007. Pages:98-102

26. Arnold M, Schrieber L and Brooks P. Immunosupressive drugs and corticosteroids in the treatment of rheumatoid artritis. Drugs 1988; 36(3): 340-63.

27. Ahluwalia A, Maggi CA, Santicioli P, Lecci A, Giuliani S. Characterization of the capsaicin-sensitive component of cyclophosphamide-induced inflammation in the rat urinary bladder. Br J Pharmacol 1994;111(4):1017–1022.

28. Alfieri A, Gardner C. The NK1 antagonist GR203040 inhibits cyclophosphamide-induced damage in the rat and ferret bladder. Gen Pharmacol 1997;29(2):245–250.

29. Assreuy AM, Martins GJ, Moreira M, Brito GA, Cavada BS, Ribeiro RA, Flores CA. Prevention of cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis by glucose-mannose binding plant lectins. J Urol 1999;161(6):1988-93.

30. Souza- Fiho MV, Lima MV, Pompeu MM, Ballejo G, Cunha FQ, Riberio Rde A. Involvement of nitric oxide in the pathogenesis of cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Am J Pathol 1997;150(1):247–256.

31. Virag L, Szabo E, Gergely P, Szabo C. Peroxynitrite-induced cytotoxicity: mechanism and opportunities for intervention. Toxicol Lett 2003 11;140-141:113-24.

32. Förstermann U, Schmidt HH, Pollock JS, Sheng H, Mitchell JA, Warner TD, Nakane M, Murad F. Isoforms of nitric oxide synthase. Characterization and purification from different cell types. Biochem Pharmacol 1991 24;42(10):1849-57.

33. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J 1992;6(12):3051-3064.

34. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43(2):109–142.

35. Regoli D, Boudon A, Fauchere JL. Receptors and antagonists for substance P and related peptides. Pharmacol Rev 1994;46(4):551–599.

36. Maggi CA. The effects of tachykinins on inflammatory and immune cells. Reg Peptide 1997 18;70(2-3):75–90.

37. Gomes TN, Santos CC, Souza-Filho MV, Cunha FQ, Ribeiro RA. Participation of TNF-α and IL-1 in the pathogenesis of cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Braz J Med Biol Res 1995 28(10): 1103–1108.

38. Mates JM, Perez-Gomez C, Nunez de Castro I. Antioxidant enzymes and human disease. Clin Biochem 1999;32(8):595–603.

39

39. Skinner R, Sharkey IM, Pearson AD, Craft AW. Ifosfamide, mesna and nephrotoxicity in children. J Clin Oncol 1993;11(1): 173–190.

40. Gressier B, Lebegue N, Brunet C, Luyckx M, Dine T, Cazin M, Cazin JC. Scavenging of reactive oxygen species by letosteine, a molecule with two blocked-SH groups. Comparison with free-SH drugs. Pharm World Sci 1995 26;17(3): 76–80.

41. Schoenike SE, Dana WJ. Ifosfamide and mesna. Clin Pharm Drug Reviews 1990; 9(3): 179–191.

42. Shaw IC, Graham MI, Jones MS. The fate of [14C]-mesna in the rat. Arzneimittelforschung 1986; 36(3): 487–489.

43. Cohen MH, Dagher R, Griebel DJ, Ibrahim A, Martin A, Scher NS, Sokol GH, Williams GA, Pazdur RA. U.S. Food and Drug Administration drug approval summaries: imatinib mesylate, mesna tablets, and zoledronic acid. Oncologist 2002;7(5):393-400.

44. Cuzzocrea S, Reiter RJ. Pharmacological action of melatonin in shock, inflammation, and ischemia/reperfusion injury. Eur J Pharmacol 2001:24;426(1-2):1–10.

45. Yildirim I, Korkmaz A, Oter S, Ozcan A, Oztas E. Contribution of antioxidants to preventive effect of mesna in cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis in rats. Cancer Chemother Pharmacol 2004; 54(5): 469–473.

46. Halliwell B. Drug antioxidant effects. Drugs 1991; 42(4): 569 – 605.

47. Cherubini A, Ruggiero C, Polidori MC, Mecocci P. Potential markers of oxidative stress in stroke. Free Radical Biology & Medicine 2005 1;39: 841 – 852.

48. Young IS, Woodside JV. Antioxidants in health and disease. J Clin Pathol 2001;54(3):176-186.

49. Vincent AM, Russell JW, Low P, Feldman EL. Oxidative stress in the pathogenesis of diabetic neuropathy. Endocrine Reviews 2004; 25(4):612-28.

50. Basaga HS. Biochemical aspects of free radicals. Biochem Cell Biol 1990;68(7-8):989-98.

51. Bulkley GB . The role of oxygen free radicals in human disease processes. Surgery 1983;94(3):407-11.

52. De Bono DP. Free radicals and antioxidants in vascular biology: the roles of reaction kinetics, environment and substrate turnover. OJM 1994;87(8):445-53.

40

53. Cross CE, Halliwell B, Borish ET, Pryor WA, Ames BN, Saul RL, McCord JM, Harman D. Oxygen radicals and human disease. Ann Intern Med 1987; 107: 526 – 545.

54. Memisogullari R, Taysi S, Bakan E, Capoglu I. Antioxidant Status and Lipid Peroxidation in Type II Diabetes Mellitus. Cell Biochem Func 2003;21(3): 291-296.

55. Scheibmeir HD, Christensen K, Whitaker SH, Jegaethesan J, Clancy R, Pierce JD. A review of free radicals and antioxidants for critical care nurses. Intensive Crit Care Nurs 2005;21(1):24-8.

56. Pratic`o D. Antioxidants and endothelium protection. Atherosclerosis 2005;181(2):215-24.

57. Niki E, Yoshida Y, Saito Y, Noguchi N. Lipid peroxidation: Mechanisms, inhibition, and biological effects. Biochemical and Biophysical Research Communications 2005 9;338(1): 668–676.

58. Sekeroglu MR, Sahin H, Dulger H, Algun E. The effect of dietary treatment on erythrocyte lipid peroxidation, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and serum lipid peroxidation in patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Biochem 2000;33:669-674.

59. Masella R, Di Benedetto R, Varı R, Filesi C, Giovannini C. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. J Nutr Biochem 2005;16: 577–586.

60. Buchanan JD, Armstrong DA. The radiolysis of glyceraldehyde-3-phosphata dehydrogenase. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 1978;33(5):409-418.

61. Lin WS, Armstrong DA, Lal M. Effects of superoxide dismutase, dithiothreitol and formate ion on the inactivation of papain by hydroxyl and superoxide radicals in aerated solutions. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 1978;33(3):231-243.

62. Steinberg FM, Chait A. Antioxidant vitamin supplementation and lipid peroxidation in smokers. Am J Clin Nutr. 1998 ;68(2): 319-327.

63. Jialal I, Grundy SM. Effect of combined supplementation with alpha-tocopherol, ascorbate, and beta carotene on low-density lipoprotein oxidation. Circulation 1993;88(6): 2780-2786.

64. Van Haaften RI, Evelo CT, Penders J, Eijnwachter MP, Haenen GR, Bast A. Inhibition of human glutathione S-transferase P1-1 by tocopherols and alpha-tocopherol derivatives. Biochim Biophys Acta 2001;1548(1): 23-28.

41

65. Singh U, Jialal I. Anti-inflammatory effects of alpha-tocopherol. Ann N Y Acad Sci 2004;1031:195-203.

66. Chao JC, Huang CH, Wu SJ, Yang SC, Chang NC, Shieh MJ, Lo PN. Effects of beta-carotene, vitamin C and E on antioxidant status in hyperlipidemic smokers. J Nutr Biochem 2002 ;13:427-434.

67. Sadir S, Deveci S, Korkmaz A, Oter S. Alpha-tocopherol, beta-carotene and melatonin administration protects cyclophosphamide-induced oxidative damage to bladder tissue in rats. Cell Biochem Funct 2007 ;25(5):521-6.

68. Niki E. Antioxidants in relation to lipid peroxidation. Chem Phys Lipids 1987;44(2-4):227-53.

69. Di Mascio P, Murphy ME, Sies H. Antioxidant defense systems: the role of carotenoids, tocopherols, and thiols. Am J Clin Nutr 1991 ;53(1 Suppl):194S-200S. Review

70. Cam M, Yavuz O, Guven A, Ercan F, Bukan N, Ustundag N. Protective effects of chronic melatonin treatment against renal injury in streptozocin-induced diabetic rats. J Pineal Res 2003 ;35(3):212–20.

71. Anvar MM, Meki AR. Oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats: effects of garlic oil and melatonin. Comp Biochem Physiol A Mol İntegr Physiol 2003 ;135(4);539-47.

72. Guerrero-Romero F, Rodrı´guez-Mora´n M. Complementary therapies for diabetes:The case for chromium, magnesium, and antioxidants. Arch Med Res 2005 ;36(3):250-57.

73. Topal T, Oztas Y, Korkmaz A, Sadir S, Oter S, Coskun O and Bilgic H. Melatonin ameliorates bladder damage induced by cyclophosphamide in rats. J. Pineal Res 2005 ;38(4):272–277.

74. Zupancic D, Jezernik K, Vidmar G. Effect of melatonin on apoptosis, proliferation and differentiation of urothelial cells after cyclophosphamide treatment. J Pineal Res 2008 ;44(3):299-306.

75. Urso ML, Clarkson PM. Oxidative stress, exercise and antioxidant supplementation. Toxicol 2003 ;189(1-2): 41-54.

76. Akkus I, Kalak S, Vural H, Caglayan O, Menekse E, Can G, Durmus B. Leukocyte lipid peroxidation, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and serum and leukocyte vitamin c levels of patients with type II diabetes mellitus. Clin Chim Acta 1996 ; 244(2):221-227.

77. Taysi S, Polat F, Gul M, Sari RA, Bakan E. Lipid peroxidation, some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology International 2002 ;21(5): 200–204.

42

78. Taysi S, Gul M, Sari RA, Akcay F, Bakan N. Serum oxidant/antioxidant status of patients with systemic lupus erythematosus. Clin Chem Lab Med 2002;40(7): 684–688.

79. Habif S, Turgan N, Mutaf I, et al. Plasma catalase, glutathione peroxidase and selenium levels in adult diabetic patients. Tr J Med Sci. 27:139–141, 1997.

80. Komosinska-Vassev K, Olczyk K, Olczyk P, Winsz-Szczotka K. Effects of metabolic control and vascular complications on indices of oxidative stress in type 2 diabetic patients. Diabetes Research and Clinical Practice 2005;68(3): 207–216

81. Russo A, Longo R, Vanella A. Antioxidant activity of propolis: role of caffeic acid phenethyl ester and galangin. Fitoterapia 2002; Suppl 1:S21-9.

82. Michaluart P, Masferrer JL, Carothers AM, Subbaramaiah K, Zweifel BS, Koboldt C, Mestre JR, Grunberger D, Sacks PG, Tanabe T, Dannenberg AJ. Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester on the activity and expression of cyclooxygenase-2 in human oral epithelial cells and in a rat model of inflammation. Cancer Res 1999;59(10):2347– 2352.

83. Fesen MR, Pommier Y, Leteurtre F, Hiroguchi S, Yung J, Kohn KW. Inhibition of HIV-1 integrase by flavones, caffeic acid phenethyl ester (CAPE) and related compounds. Biochem Pharmacol 1994;48(3): 595–608.

84. Grunberger D, Banerjee R, Eisinger K, Oltz EM, Efros L, Caldwell M, Estevez V, Nakanishi K. Preferential cytotoxicity on tumor cells by caffeic acid phenethylester isolated from propolis. Experientia 1988;44(3): 230-232.

85. Su ZZ, Lin J, Grunberger D, Fisher PB. Growth suppression and toxicityinduced by caffeic acid phenethyl ester (CAPE) in type 5 adenovirus-transformed rat44embriyo cells correlate directly with transformation progression. Cancer Res 1994 ;54(7): 1865-1870.

86. Da Cunha FM, Duma D, Assreuy J, Buzzi FC, Niero R, Campos MM, Calixto JB. Caffeic acid derivatives: in vitro and in vivo anti-inflammatory properties. Free Radic Res 2004 ;38(11): 1241-1253.

87. Sahin S, Sogut S, Ozyurt H, Uz E, Ilhan A, Akyol O. Tissue xanthine oxidase activity and nitric oxide levels after spinal cord ischemia/reperfusion injury in rabbits: comparison of caffeic acid phenethyl ester and metylprednisolone. Neurosci Res Com 2002; 31: 111-121

88. Yilmaz HR, Uz E, Yucel N, Altuntas I, Ozcelik N. Protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in diabetic rat liver. Biochem Mol Toxicol 2004; 18(4): 234-238.

89. Aebi H. Catalase In: Bergmeyer U, ed. Methods of enzymatic analysis. New York and London: Academic Pres 1974;673-677.

43

90. Sun Y, Oberley LW, Li Y. A simple method for clinical assay superoxide dismutase. Clin Chem 1988 ;34(3):497-500.

91. Draper HH, Hadley M. Malondialdehyde determination as index of lipid peroksidation. Methods Enzymol 1990;186: 421-431.

92. Cortas NK,Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method. Clin Chem 1990;36:1440-3.

93. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-75.

94. Grinberg-Funes DJ, Sheldon C and Weiss M. The use of prostaglandin F2 alpha for the prophylaxis of cyclophosphamide induced cystitis in rats. J Urol 1990 ;144(6):1500-4.

95. Katz A, Epelman S, Anelli A, Gorender EF, Cruz SM, Oliveira RM, Marques LA. A prospective randomized evaluation of three schedules of mesna administration in patients receiving an ifosfamide-containing chemotherapy regimen: sustained efficiency and simplified administration. J Cancer Res Clin Oncol 1995;121(2): 128–131.

96. Cox PJ. Cyclophosphamide cystitis- identification of acrolein as the causative agent. Biochem Pharmacol 1979 Jul;28(13):2045–2049.

97. Matsuoka Y, Masuda H, Yokoyama M, Kihara K. Protective effects of heme oxygenase-1 against cyclophosphamide-induced haemorrhagic cystitis in rats. BJU İnternational 2007 ;100(6):1402-8.

98. Alfieri AB, Malave A, Cubeddu LX. Nitric oxide synthases and cyclophosphamide-induced cystitis in rats. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol 2001 ;363(3):353–357.

99. Vieira MM, Macêdo FY,Filho JN, Costa AC, Cunha AN, Silveira ER, Brito GA, Ribeiro RA. Ternatin, a flavonoid, prevents cyclophosphamide and ıfosfamide-induced hemorrhagic cystitis in rats. Phytother Res 2004 ;18(2) 135-141.

100. Kanat O, Kurt E, Yalcinkaya U, Evrensel T, Manavoglu O. Comparison of uroprotective efficacy of mesna and amifostine in Cyclophosphamide- induced hemorrhagic cystitis in rats. Indian J Cancer 2006 ;43(1)12-5.

101. Koltuksuz U, Ozen S, Uz E, Aydinc M, Karaman A, Gultek A, Akyol O, Gursoy H, Aydın E. Caffeic acid phenethyl ester prevents intestinal reperfüzyon injury in rats. J Pediatr Surg. 1999 ; 34(10): 1458-1462.

102. Natarajan K, Singh S, Burke TR, Grunberger D, Aggrawal BB. Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of nuclear transcription factor NF-kappa B. Proc Natl Acad Sci U S A 1996:20;93(17): 9090–9095.

44

103. Ozcan A, Korkmaz A, Oter S, Coskun O. Contribution of flavonoid antioxidants to the preventive effect of mesna in cyclophosphamide-induced cystitis in rats. Arch Toxicol 2005 ; 79(8): 461–465.

104. Ribeiro RA, Souza Fiho MVP, Santos CC. Involvement of nitric oxide and tumor necrosis factor in the pathogenesis of cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. International Cancer Congress, Italy, 1998. Proceedings, 227–231

105. Vizzard MA, Erdman SL, de Groat WC. Increased expression of neuronal nitric oxide synthase in bladder afferent pathways following chronic irritation. J Comp Neurol 1996 ;370 (2) : 191–202.

106. Alfieri AB, Cubeddu LX. Nitric oxide and NK(1) tachykinin receptors in cyclophosphamide-induced cystitis in rats. J Pharmacol Exp Ther 2000;295(2):824-9.

107. Parlakpınar H, Tasdemir S, Polat A, Bay-Karabulut A,Vardi N, Ucar M, Acet A. Protective role of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on gentamicin-induced acute renal toxicity in rats. Toxicology 2005 14;207(2):169-177

108. Agar NS, Sadrzadeh SM, Hallaway PE, Eaton JW. Erythrocyte catalase. A somatic oxidant defense? J Clin Invest 1986 ;77(1): 319-321.

109. McCord JM, Fridowich I. Superoxide dismutase: an enzymatic function for erythrocuprein. J Biol Chem 1969; 244(22): 6049-6055.

110. Akkus I. Serbest radikaller ve fizyopatolojik etkiler. Mimoza Yayınları, Konya. 1995; 1-132.

111. Klotz LO, Sies H. Defenses against peroxynitrite: selenecompounds and flavonoids. Toxicol Lett 2003; 140–141: 125–132.