UNIVERSIDAD DE LASFUERZAS ARMADAS ESPE

Analisis de la viabilidad deSaccharomyces cerevisiae empleada en

la fermentacion de cerveza en la empresaQuinde Brewery Co. mediante pruebas

microbiologicas y fısico-quımicas para sureutilizacion en nuevos procesos

fermentativos.

Autores:

Yanara Naranjo

Carlos Caiza

Tutores:

Lcda. Silvana Granda

Ing. Marco Taipe

Departamento de Ciencias de la Vida

Carrera de Ingenierıa en Biotecnologıa

Sangolquı-Ecuador

Diciembre, 2014.

Indice general

Resumen IV

1. Introduccion 1

1.1. Tıtulo del Protecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2. Definicion y justificacion del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.3. Objeto de Estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.4. Campo de accion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.5. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.5.1. General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.5.2. Especıficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.6. Hipotesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2. Marco Teorico 4

2.1. Levaduras cerveceras: Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2. Recuperacion de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.3. Saccharomyces: dos grupos, dos estilos de cerveza . . . . . . . . . . . . . . 5

2.4. Fermentacion alcoholica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.5. Elaboracion de lotes de cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.5.1. Maceracion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.5.2. Filtrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

i

Contenidos ii

2.5.3. Lavado del grano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.4. Hervido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.5. Enfriado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.6. Fermentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.7. Envasado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3. Metodologıa 9

3.1. Recoleccion de muestras de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . 9

3.2. Recuperacion de colonias puras de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.2.1. Tincion Gram: Identificacion morfologica . . . . . . . . . . . . . . 9

3.2.2. Aislamiento y purificacion de colonias . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.2.3. Siembra mediante diluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.3. Preparacion de medios de cultivo mınimos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.4. Inoculacion y crecimiento en medios de cultivo mınimos . . . . . . . . . . 11

3.4.1. Medio Solido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.4.2. Medio Lıquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.5. Recuento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.5.1. Conteo en Camara de Neubauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.6. Estimacion de la viabilidad de celulas de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . 12

3.7. Elaboracion de lotes de cerveza con S. cerevisiae recuperadas . . . . . . . 12

3.8. Medicion de la densidad y pH de la cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.9. Estimacion de contenido de etanol en la cerveza . . . . . . . . . . . . . . . 13

4. Resultados y Discusion 14

4.1. Recuperacion y aislamiento de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.2. Conteo celular en Camara de Neubauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.3. Viabilidad celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Contenidos iii

4.4. Analisis Fısico-Quımicos de Cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.4.1. Analisis de grados Brix en cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.4.2. Analisis de pH en cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.4.3. Analisis del contenido de alcohol en cerveza . . . . . . . . . . . . . 21

5. Conclusiones y recomendaciones 22

Resumen

Este proyecto presento el analisis y factibilidad para la reutilizacion de S. cerevisiae

recuperadas de los tanques fermentadores en la microcervecerıa Quinde Brewery Co.

ubicada en la parroquia de Conocoto, ası como la evaluacion de la calidad de la cerveza

elaborada con estas hasta el tercer proceso de fermentacion.

S. cerevisiae se recolectaron de muestras lıquidas que fueron debidamente almacenadas y

dirigidas al Laboratorio de Docencia de la Carrera de Ingenierıa en Biotecnologıa donde

se las trato y analizo debidamente de acuerdo a protocolos estandarizados.

El primer paso en laboratorio fue la purificacion de las cepas de S. cerevisiae presentes

en todas las muestras recolectadas, para ello se utilizo medios selectivos para hongos y

levaduras; luego se procedio a la formulacion de medios de cultivo mınimos, tanto lıquido

como solido. En dichos medios se inoculo las colonias puras y se incubo los cultivos por

siete dıas a temperatura ambiente (17 ± 2 oC). Al cabo de los siete dıas de incubacion

los cultivos en medio solido sirvieron para la determinacion de la morfologıa de Sac-

charomyces cerevisiae, mientras que los cultivos en medio lıquido se utilizaron para la

cuantificacion del numero de celulas totales y el numero de celulas viables, posterior a

esto, el medio lıquido inoculado, tambien fue utilizado para la realizacion de un nuevo

proceso de fermentacion en la microcervecerıa Quinde Brewery Co. Una vez que se con-

cluyo la etapa, nuevamente se procedio a tomar las muestras y repetir el proceso.

Al cabo de seis semanas de trabajo tanto en la planta cervecera como en el laboratorio

se obtuvo tres generaciones de levaduras recuperadas y tres lotes de cervezas elaboradas

con estas. A cada lote de cerveza se le realizaron pruebas fısico-quımicas para evaluar la

calidad del producto obtenido y se encontraron resultados positivos.

iv

Resumen v

Para la cuantificacion celular de cada generacion se demostro un 95.3 %, 91.4 % y 82.3 %

de celulas viables para la primera, segunda y tercera generacion de S. cerevisiae respec-

tivamente, datos que estan en el rango aceptable para levaduras recuperadas. Por otro

lado se concluyo que al cabo de siete dıas de incubacion el numero total de celulas de S.

cerevisiae, en promedio, fue del 20,8 millones, 12 millones y 8,33 millones de celulas por

mililitro de medio lıquido en cada generacion; respecto a las pruebas fısicas y quımicas se

obtuvo que la densidad final de la cerveza expresada en grados Brix fueron de 6.2, 5.7 y

5.3 oBrix en la tercera, segunda y primera generacion, los valores de pH medios obtenidos

fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generacion y finalmente los

valores medios del contenido de alcohol para la primera, segunda y tercera generacion

fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivamente. Todos los valores obtenidos estan en el rango

permitido segun la normas para cerveza; por lo que se concluyo que la reutilizacion de

S. cerevisiae recuperadas de los tanques de fermentacion es una medida factible y viable

en una cervecerıa.

Capıtulo 1

Introduccion

1.1. Tıtulo del Protecto

Analisis de la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae empleada en la fermentacion de

cerveza en la empresa Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiologicas y fısico-

quımicas para su reutilizacion en nuevos procesos fermentativos.

1.2. Definicion y justificacion del proyecto

El uso de Saccharomyces cerevisiae en la produccion de cerveza se ha dado desde hace

varios miles de anos y hoy en dıa esta bebida alcoholica de moderacion es una de las

mas consumidas mundialmente. El desarrollo tecnologico ha permitido que en el ultimo

siglo se creen pequenas empresas, denominadas microcervecerıas, encargadas de elabo-

rar cervezas de alta calidad pero a una escala mucho menor que las grandes cervecerıas

industriales. En Ecuador, desde hace ya 25 anos, se han creado varias microcervecerıas

las cuales ofrecen al mercado una amplia variedad de cervezas y, en los ultimos cinco

anos se ha experimentado un acelerado aumento de las mismas.

La recuperacion y reutilizacion de levaduras luego de varios procesos de fermentacion

es una practica que se ha implementado en la mayor parte de las grandes cervecerıas a

nivel mundial y en una menor proporcion en las microcervecerıas. En Ecuador existe una

companıa multinacional, Cervecerıa Nacional, que produce el 98 % de cerveza consumida

(cerca de 300 millones de litros anuales, pero la produccion neta es de 450 millones de

litros por ano) y poco mas de 45 microcervecerıas que generan aproximadamente 8 mi-

llones de litros al ano, la gran empresa multinacional tiene un programa de recuperacion

1

Introduccion 2

y reutilizacion de levaduras con lo cual puede ahorrar cerca de 45 millones de dolares

anuales mientras que las pequenas empresas no cuentan con este tipo de programas. El

proceso de recuperacion de levaduras es simple y representa un ahorro de diez centavos

por cada dolar de inversion para la elaboracion de cerveza, lo que genera una conside-

rable cantidad de dinero que podrıa ser destinado para otros procesos en las empresas

y, tambien se disminuye la produccion de desechos lıquidos [?, ?, ?].

Segun varios autores, una companıa cervecera puede reutilizar levaduras hasta por ocho

etapas de fermentacion siempre que se mantenga procesos muy bien controlados y el

almacenamiento de levaduras sea adecuado [?, ?].

Debido al aumento del consumo de cervezas de mejor calidad, es decir, cervezas elabo-

radas por microcervecerıas; y en funcion del cambio de la Matriz Productiva Nacional

se ha pensado crear un protocolo para que estas pequenas empresas puedan aprovechar

levaduras recuperadas y utilizarlas en futuros procesos de fermentacion.

1.3. Objeto de Estudio

Saccharomyces cerevisiae empleadas en el proceso de fermentacion alcoholica en una

cervecerıa local.

1.4. Campo de accion

El proyecto se oriento en primera instancia al area microbiologica donde se desarrollo la

purificacion, conteo celular y analisis de la viabilidad de las celulas de levaduras recupe-

radas para posteriormente dirigirlo al area industrial cuando se optimizo el proceso de

fermentacion al reutilizar las levaduras recuperadas de procesos anteriores.

1.5. Objetivos

1.5.1. General

Analizar la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae empleada en la fermentacion de cerve-

za en la empresa Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiologicas y fısico-quımicas

para su reutilizacion en nuevos procesos fermentativos.

Introduccion 3

1.5.2. Especıficos

Recuperar muestras lıquidas de Saccharomyces cerevisiae de la etapa final del

proceso de fermentacion como material de estudio del proyecto.

Determinar medios lıquido y solido mınimos e ideales para el cultivo y propagacion

de Saccharomyces cerevisiae.

Identificar analisis microbiologicos adecuados para la determinacion de la viabili-

dad de las celulas de S. cerevisiae posterior a la fermentacion.

Plantear metodos de control de calidad para cerveza.

1.6. Hipotesis

Saccharomyces cerevisiae recuperada de los tanques de fermentacion puede ser reutili-

zada para nuevos procesos de elaboracion de cerveza.

Capıtulo 2

Marco Teorico

2.1. Levaduras cerveceras: Saccharomyces cerevisiae

La habilidad de S. cerevisiae para leudar y generar etanol en la fermentacion ha sido

aprovechada por la humanidad desde hace miles de anos. Ademas desde su identificacion

como responsable de estos y otros procesos han sido ampliamente estudiadas, y hoy en

dıa existen muchas aplicaciones de levaduras en diversas areas industriales, principal-

mente en el area de alimentos y bebidas [?].

El uso de S. cerevisiae para la produccion de bebidas alcoholicas, vinos y cervezas en

especial, ha constituido una empresa muy rentable. En la industria cervecera, estas le-

vaduras, constituyen un aspecto fundamental en el proceso de obtencion de productos

de buena calidad por ello que el estudio de esta especie se ha desarrollado enormemente

hasta el punto de manipulaciones a nivel genetico para el mejoramiento de cepas es-

pecıficas de S. cerevisiae.

S. cerevisiae son organismos unicelulares de forma esferica, elipsoide u ovoide. Su ta-

mano varıa con la edad de la celula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras que

toman azucares simples como glucosa o maltosa de su entorno y los utilizan como fuente

de energıa para sobrevivir, como resultado de este proceso producen etanol y dioxido de

carbono [?].

4

Marco Teorico 5

2.2. Recuperacion de S. cerevisiae

S. cerevisiae recuperadas de los tanques de fermentacion pueden ser reutilizadas de

inmediato en nuevos procesos fermentativos sin necesidad de tratamientos, siempre y

cuando las condiciones de fermentacion y separacion hayan sido muy asepticas [?, ?].

Este proceso puede ser repetido hasta siete ocasiones pero en cada recuperacion se

obtienen generaciones distintas y con ello se tiene problemas para elaborar una misma

cerveza [?]. Esto se debe a la presencia de celulas de S. cerevisiae no viables, a las

mutaciones geneticas en las distintas generaciones y otros factores que hacen que las

nuevas generaciones no actuen de una manera homogenea.

2.3. Saccharomyces: dos grupos, dos estilos de cerveza

Se ha descrito el mecanismo de obtencion de etanol utilizando la especie S. cerevisiae que

es una levadura conocida como levadura tipo Ale. Este termino tiene su origen a prin-

cipios del siglo XIX en varios paıses europeos donde se utilizaba estas porque trabajan

en rangos de temperatura que van desde 15 a 22 oC y por ello las llamaban levaduras1

de alta fermentacion. Existe otro tipo de levaduras, S. carlsbergensis por ejemplo, que

fermentan a temperaturas bajas, desde 8 a 12 oC, a estas se las conoce como levaduras

tipo Lager o de baja fermentacion [?, ?].

Las variedades de levaduras de alta y baja fermentacion, que han dado su fama a los

dos grandes grupos de cervezas Ale y Lager respectivamente, tienen una caracterısti-

ca importante desde el punto de vista industrial y artesanal; al finalizar el proceso de

fermentacion estas tienden a agruparse y depositarse en el fondo del tanque, esta pro-

piedad se conoce como floculacion, esto se atribuye a la composicion de la pared celular

de estos microorganismos y su potencial hidrofobico. Gracias a esto es posible separar

a las levaduras por simple decantacion y con ello se las puede reutilizar en posteriores

fermentaciones [?].

2.4. Fermentacion alcoholica

Gracias al metabolismo de levaduras como S. cerevisiae se puede generar etanol a partir

de una fuente de compuestos de carbono. En el proceso de produccion de cerveza o vino

se utiliza ciertos cereales o frutas para obtener azucares simples, ademas se obtienen

1La palabra levadura es ampliamente utilizada en referencia del organimo del genero Saccharomyces

Marco Teorico 6

otros compuestos nitrogenados y fosfatados, todos ellos estan presentes en el mosto o

caldo azucarado extraıdo de frutas y cereales, que sirve como medio de crecimiento para

las levaduras ya que este contiene todo lo necesario, fuente de carbono (azucares sim-

ples), proteınas (compuestos nitrogenados) y gran variedad de sales (fosfatos, sulfatos,

etc.) para que estos microorganismos se multipliquen y generen etanol, dioxido de car-

bono y otros compuestos propios de las bebidas alcoholicas.

El proceso de conversion de azucar en etanol y dioxido de carbono se conoce como fer-

mentacion alcoholica, o simplemente fermentacion, y ocurre en recipientes donde se tiene

el mosto y las levaduras bajo ciertas condiciones controladas. Los recipientes adecuados

para este proceso son tanques fermentadores disenados especıficamente para cuando el

proceso finalice se pueda separar el lıquido fermentado y las levaduras. El proceso de

fermentacion tiene un tiempo de duracion que varıa segun las condiciones de crecimien-

to y estado de las levaduras. En la produccion de cerveza el tiempo de fermentacion va

desde tres dıas hasta varios meses dependiendo del tipo y estilo de cerveza que se desea

obtener. Para cervezas Ale, elaboradas con levaduras de alta fermentacion, se puede fijar

el tiempo de fermentacion en siete dıas [?, ?, ?]. Al cabo de este tiempo se separan las

levaduras y, el lıquido resultante se conoce como cerveza verde que se almacena en otros

fermentadores para su maduracion y posterior acondicionamiento. La levadura separada

puede ser tratada y almacenada en bancos criogenicos para posteriores fermentaciones

[?].

2.5. Elaboracion de lotes de cerveza

La elaboracion de cerveza es un proceso sencillo que consta de varias operaciones. Se

puede resumir brevemente dicho proceso en los siguientes pasos [?, ?, ?].

2.5.1. Maceracion

Aquı se mezcla los granos de cebada malteada previamente triturados con agua a 72 oC,

la mezcla se deja en agitacion por 90 minutos. En esta etapa las enzimas presentes en

los granos como beta-glucanasas, amilasas y maltasas se activan y degradan el almidon

en azucares simples como maltosa, glucosa, fructosa, maltotriosa, etc.; estos compuestos

son disueltos en el agua y forman una solucion azucarada conocida como Mosto.

Marco Teorico 7

2.5.2. Filtrado

Luego de la maceracion se debe separar o filtrar el mosto del grano. El lıquido es con-

ducido a la olla de hervido. El proceso de filtardo se lo realiza gracias a un tamiz en el

fondo de la olla de maceracion.

2.5.3. Lavado del grano

El grano que se separo del mosto es lavado con agua caliente a 82 oC para recoger los

azucares restantes e inactivar las enzimas catalıticas que aun se encuentren presentes.

Nuevamente se filtra el agua que es conducida a la olla de hervido.

2.5.4. Hervido

El mosto que se filtro es almacenado en una olla para someterlo a temperaturas elevadas

hasta alcanzar el punto de ebullicion, esta etapa puede durar entre dos a cinco horas

dependiendo del volumen manejado. La ebullicion debe mantenerse por al menos 70

minutos y durante este tiempo se anade dosis alternadas de flores de lupulo2 y se consigue

la esterilizacion completa del mosto.

2.5.5. Enfriado

Al terminar el proceso de ebuillicion el mosto se encuentra aproximadamente a 110 oC

por lo que es necesario enfriarlo rapidamente a temperaturas entre 25-30 oC para lo cual

se utilizan intercambiadores de calor de distintas formas segun sea el volumen, para el

caso de pequenas cervecerıas los intercambiadores de placas son utilizados por su bajo

costo economico y alta eficiencia.

2.5.6. Fermentacion

Una vez que se tiene el mosto frıo se lo inocula con una cantidad especıfica de S. cerevisiae

para que esta transforme los azucares en etanol y dioxido de carbono. Este proceso puede

durar unos pocos dıas e incluso anos en funcion del estilo de cerveza que se desea obtener.

2Planta trapadora de la familia de las cannabinaceas que otorga a la cerveza su amargor caracterıstico.

Marco Teorico 8

2.5.7. Envasado

Finalizada la fermentacion se separa la levadura y la cerveza es almacenada, ya sea en

botellas o barriles, para que madure y gane dioxido de carbono y efervescencia.

Capıtulo 3

Metodologıa

3.1. Recoleccion de muestras de Saccharomyces cerevisiae

La recoleccion de muestras de S. cerevisiae fue realizada directamente de los tanques de

fermentacion en la planta de operacion de la cervecerıa Quinde Brewery Co. y con la

ayuda del jefe de planta.

En frascos de plastico esteriles se tomo 100 mL de muestra lıquida directamente de las

llaves de salida de los fermentadores, el uso de mascarilla y guantes es obligatorio, los

recipientes son sellados con parafilm y trasladados al laboratorio en un lapso no mayor

de una hora donde se los almacena en refrigeracion a 4 oC para realizar todas las pruebas

previstas.

3.2. Recuperacion de colonias puras de S. cerevisiae

Una vez que se tiene las muestras en el laboratorio primero se procede a identificar los

microorganismos presentes para luego aislar y purificar las cepas de S. cerevisiae.

3.2.1. Tincion Gram: Identificacion morfologica

Para la identificacion de microorganismos presentes en muestras de cerveza artesanal,

primero se debe identificar la morfologıa general de los microorganismos de interes y

clasificarlos segun su respuesta a la tincion Gram. Las celulas de S. cerevisiae son orga-

nismos Gram Positivos y tienen una forma ovoide caracterıstica [?].

9

Metodologıa 10

3.2.2. Aislamiento y purificacion de colonias

Identificadas los organismos presentes en las muestras se preparo un medio selectivo para

hongos y levaduras para lograr aislar las colonias puras de S. cerevisiae y verificar que

no existen organismos contaminantes. El medio utilizado es conocido como PDA (por

sus siglas en ingles, Potato Dextrose Agar) [?, ?].

3.2.3. Siembra mediante diluciones

La tecnica de dilucion consiste en inocular 10 tubos de ensayo que contienen 9 mL agua

destilada. Se obtiene 1 mL de la muestra usando una micro pipeta esteril, se inocula el

primer tubo de ensayo, sin retirar la punta se agita el mismo luego se invierte y se retira

1 mL que se inocula en el segundo tubo de ensayo y ası se sigue sucesivamente hasta

llegar al tubo 10. Cada una de los tubos con las distintas diluciones se agita y se toma 1

mL de esta solucion que se vierte en cajas de Petri que contienen el medio PDA solido

preparado.

Una vez que se inocula el medio con las diluciones se incuba las cajas de Petri por cinco

dıas a temperatura promedio de 17±2 oC. Finalmente se tiene colonias aisladas y puras

de S. cerevisiae para continuar con los analisis correspondientes.

3.3. Preparacion de medios de cultivo mınimos

Existen varios medios apropiados para el crecimiento de S. cerevisiae, sin embargo, en

el presente trabajo se quiere estandarizar un medio de cultivo mınimo. Este medio debe

poseer los nutrientes basicos y necesarios para el adecuado desarrollo y crecimiento de

S. cerevisiae como son una fuente de carbono (generalmente un disacarido), nitrogeno

y fosforo; a continuacion las tablas 3.1 y 3.2 muestran la composicion para los medios

lıquidos y solidos, respectivamente:

Cuadro 3.1: Composicion de reactivos para un litro de medio lıquido.

Reactivo Cantidad

Caldo Nutritivo 8 gramos

Sacarosa 20 gramos

Agua destilada 1000 mL

Metodologıa 11

Cuadro 3.2: Composicion de reactivos para un litro de medio solido.

Reactivo Cantidad

Caldo Nutritivo 8 gramos

Sacarosa 20 gramos

Agar agar 15 gramos

Agua destilada 1000 mL

3.4. Inoculacion y crecimiento en medios de cultivo mıni-

mos

3.4.1. Medio Solido

Al aislar y purificar correctamente colonias de S. cerevisiae se procede a preparar medio

solido en tubos de ensayo de 25 mL, estos se colocan de manera inclinada para conseguir

una buena area de sembrado. Los tubos son inoculados con la muestra recuperada y

la ayuda de una asa bacteriologica en forma de estrıas e incubados por siete dıas a

temperatura promedio de 17±2 oC y luego almacenados en refrigeracion a 4 oC. Estos

cultivos en medio solido sirviran posteriormente para llevar un control de la morfologıa

de las levaduras y posibles contaminaciones a lo largo de todos los analisis.

3.4.2. Medio Lıquido

En 250 mL de medio lıquido se inocula 1 mL de la levadura recuperada. Estos medios se

incuban a temperatura de 17±2 oC en Erlenmeyer de 500mL con agitacion durante siete

dıas. Al finalizar la incubacion se debe tomar 50 mL de cultivo lıquido para realizar las

pruebas de control, conteo y viabilidad de las celulas de S. cerevisiae, los restantes 200

mL seran trasladados a la planta de la cervecerıa con los cuales se elaborara cerveza.

3.5. Recuento bacteriano

Para el conteo del numero total de celulas de S. cerevisiae presentes en las muestras se

utiliza el metodo de recuento en Camara de Neubauer.

3.5.1. Conteo en Camara de Neubauer

El recuento en camara de Neubauer es un metodo directo ya que cuenta directamente las

celulas presentes en las diferentes diluciones. De las diluciones preparadas se toma una

Metodologıa 12

pequena alıcuota para colocarla sobre la camara de Neubauer, se cubre con un cubreob-

jetos y se lleva al microscopio donde se cuenta las celulas individuales a una amplificacion

de 40x. Se utiliza el metodo corto de conteo por el cual se cuenta unicamente las celulas

presentes en ciertos cuadrantes, al final del conteo se aplica una relacion numerica para

obtener el numero de celulas presentes en la muestra. La relacion utilizada es: [?]

Ncel

mL= Ncont ∗ n ∗ fd ∗ 103 (3.1)

Donde, Ncel es el numero total de celulas presentes en la muestra, Ncont el numero de

celulas contadas en los cuadrantes, n es el numero de cuadrantes contados y fd el factor

de dilucion.

3.6. Estimacion de la viabilidad de celulas de S. cerevisiae

La viabilidad de las celulas de S. Cerevisiae es primordial para su utilizacion en nuevos

procesos de fermentacion, por ello se debe estimar su valor. Se encuentra la relacion

entre el numero total de celulas y el numero de celulas vivas presentes en las muestras

recolectadas. Para cuantificar el numero de celulas vivas se utiliza una modificacion

del metodo de conteo en Camara de Neubauer en el que se toma una alıcuota de las

diferentes diluciones y se las tine con una solucion al 0.1 % de Azul de Metileno, luego

se cuenta de manera identica a la descrita en el apartado anterior, la diferencia es que

esta vez se debe contar unicamente las celulas coloreadas de azul ya que estas son las

que estan metabolicamente activas. El porcentaje de viabilidad se calcula como:

V =Nvivas

Ncelx100 (3.2)

3.7. Elaboracion de lotes de cerveza con S. cerevisiae re-

cuperadas

Luego que las celuas de S. cerevisiae recuperadas son propagadas y cuantificadas en el

medio lıquido por siete dıas deben ser trasladas a la planta de la cervecerıa en recipientes

de vidrio ambar esteriles y sellados donde se elabora un lote con cada generacion de

las mismas. Cada lote de cerveza contiene aproximadamente 18 litros los cuales son

preparados siguiendo la metodologıa antes descrita y con los ingredientes que se muestran

en la tabla 3.3.

Metodologıa 13

Cuadro 3.3: Cantidad de materias primas para elaborar 18 litros de cerveza.

Insumo Cantidad

Agua 26 L

Malta de cebada 5 Kg

Lupulo en pellets 40 g

Levadura lıquida 150 mL

3.8. Medicion de la densidad y pH de la cerveza

Al finalizar la fermentacion se procede a tomar muestras de la cerveza para medir su

densidad y pH. Para la densidad se utiliza un metodo indirecto que consiste en medir

los grados Brix de la muestra con ayuda de un equipo calibrado llamado Brixometro,

para ello se toma una gota de muestra y se coloca en el lector optico del aparato, se

anota el valor marcado en grados Brix. Tambien se mide el pH en la muestra de cerveza,

para este paso se toma cerca de 50 mL de muestra y con el pH-metro se mide el valor

medido.

3.9. Estimacion de contenido de etanol en la cerveza

Para cuantificar la cantidad de etanol presente en las muestras de cerveza se realiza una

destilacion rapida en la cual se debe utilizar 100 mL de cerveza que se calienta en el

equipo destilador a 78 oC y por vaporizacion y condensacion se recolecta el etanol en

una probeta graduada. El porcentaje de etanol se lo estima con la relacion [?, ?]:

ABV =VetOH

Vcx100 (3.3)

Donde, VetOH es el volumen de etanol recuperado en la destilacion y Vc es el volumen

de cerveza utilizado. Las siglas ABV significan el volumen de alcohol por volumen de

cerveza (Alcohol By Volumen, por sus siglas en ingles).

Capıtulo 4

Resultados y Discusion

4.1. Recuperacion y aislamiento de S. cerevisiae

En las figuras 4.1 y 4.2 se observa las colonias puras de S. cerevisiae aisladas y cultivadas

en medio selectivo PDA, ası como la tincion Gram de dichas colonias.

Figura 4.1: S. cerevisiae aisladas en medio selectivo PDA (Caiza, 2014).

Figura 4.2: S. cerevisiae aisladas. 100x (Caiza, 2014).

14

Resultados y Discusion 15

Segun [?] y [?], el crecimiento de S. cerevisiae en medio de cultivo solido PDA es rapido

ya que las colonias empiezan a ser visibles aproximadamente a las 48 horas de ino-

culacion y la morfologıa de estas es muy caracterıstica, presentandose siempre como

discos redondos de color blanco y borde regular. De esta manera se logro tener una idea

concreta que los organismos que crecieron en tales medios, efectivamente eran levaduras.

La identificacion con tincion Gram permitio observar la morfologıa de los organismos

que crecieron en el medio PDA, los mismos que presentaron formas ovoides de color

morado-azul demostrando que son microorganismos Gram Positivos. Las celuas de S.

cerevisiae poseen estas caracteısticas inconfundibles bajo el microscopio a un aumento

de 100x [?, ?, ?].

4.2. Conteo celular en Camara de Neubauer

Al finalizar la etapa de purificacion y aislamiento de colonias de S. cerevisiae se inoculo es-

tas cepas en los medios mınimos preparados previamente como se muestra en la figura

4.3. La incubacion duro siete dıas y al cabo de esto se conto las celulas presentes en el

medio lıquido.

Figura 4.3: Inoculacion de S. cerevisiae recuperadas en medios mınimos solido y lıqui-do (Caiza, 2014).

A continuacion en la figura 4.4 se muestra el conteo en Camara de Neubauer, para esto

se realizaron dilusiones consecutivas del medio lıquido, se encontro que la dilucion 10−2

fue la mas apta para efectuar el conteo.

La tabla 4.1 muestra el conteo de celulas para la dilusion 10−2, como se indico en la

metodologıa, el conteo se realizo en cinco cuadrantes y se aplico la ecuacion 3.1 para

estimar el numero de celulas por mL.

Resultados y Discusion 16

Figura 4.4: Celulas de S. cerevisiae en Camara de Neubauer vistas al microscopio.40x (Caiza, 2014).

Cuadro 4.1: Datos observados en Camara Neubauer para las celulas por mL.

fd Generacion Repeticion Ncont n Ncel

100 Primera 1 45 5 2,25 ∗ 107

100 Primera 2 38 5 1,90 ∗ 107

100 Primera 3 42 5 2,10 ∗ 107

100 Segunda 1 24 5 1,20 ∗ 107

100 Segunda 2 27 5 1,35 ∗ 107

100 Segunda 3 21 5 1,05 ∗ 107

100 Tercera 1 14 5 7,00 ∗ 106

100 Tercera 2 19 5 9,50 ∗ 106

100 Tercera 3 17 5 8,50 ∗ 106

Como indica la tabla 4.1 el numero de de celulas de S. cerevisiae por mililitro disminuye

de una generacion a otra. Este resultado era de esperar, segun [?], [?] y [?] con cada

proceso fermentativo las celulas pierden la capacidad de multiplicacion por algunos fac-

tores como la mutacion espontanea o la temperatura de fermentacion.

El analisis estadıstico muestra las diferencias que existen entre cada generacion de S.

cerevisiae recuperadas.

La figura 4.5 muestra graficamente como el numero de celulas de levadura disminuye en

cada generacion. El analisis de varianza ANOVA para este grafico se indica en la figura

4.6.

Se observa que hay diferencias significativas para las generaciones de S. cerevisiae (p-

valor=0.0001479) en relacion al numero de celulas presentes en las muestras, aunque la

segunda y tercera generacion resultan ser iguales estadısticamente hablando. La primera

generacion serıa la mejor en relacion a este parametro.

Resultados y Discusion 17

Figura 4.5: Variaciones del numero de celulas por mL para las diferentes generaciones.

Figura 4.6: Analisis de la varianza para el numero de celulas de lS. cerevisiae.

Debido a esta diferencia se realizo una prueba de Duncan para las medias, la figura 4.7

muestra el rango de diferencias entre generaciones y ademas se observo que la primera

generacion presento el mayor numero de celulas por mL.

De acuerdo con la prueba de Duncan se obtuvo valores promedios de 20,8 millones, 12

millones y 8,3 millones de celulas de S. cerevisiae por mL. Dichos valores concuerdan

con datos rerportados por [?, ?, ?].

Ademas segun [?] y [?], el numero de celulas por mL aceptable para iniciar un proceso

fermentativo es de 10-20 millones, los datos reportados en el presente trabajo estan

Resultados y Discusion 18

Figura 4.7: Prueba Dunca para el numero de celulas de S. cerevisiae (α = 0,01).

dentro de este rango para la primera y segunda generacion de S. cerevisiae recuperadas.

4.3. Viabilidad celular

Posterior al conteo de celulas en los medios lıquidos se tino una alıcuota de muestra

de cada generacion de S. cerevisiae para estimar la viabilidad de celulas, es decir, para

estimar que porcentaje de celulas estuvieron metabolicamente activas. Ası la viabilidad

se calculo con la ecuacion 3.2 y los resultados se indican en la figura 4.8 y la tabla 4.2 .

Figura 4.8: S. cerevisiae tenidas con Azul de Metileno vista bajo el microscopio. 100x,(Caiza, 2014).

La figura 4.9 muestra que el porcentaje de celulas vivas disminuye en cada generacion,

es decir, en cada proceso de recuperacion y fermentacion la supervivencia de las levadu-

ras es menor; en otras palabras con el transcurso del tiempo las celulas de S. cerevisiae

disminuyen sus procesos metabolicos y mueren rapidamente [?, ?].

Resultados y Discusion 19

Cuadro 4.2: Estimacion de la viabilidad celular.

Generacion Repeticion Ncel Nvivas V ( %)

Primera 1 2,25 ∗ 107 2,10 ∗ 107 93.3

Primera 2 1,90 ∗ 107 1,85 ∗ 107 97.4

Primera 3 2,10 ∗ 107 2,00 ∗ 107 95.2

Segunda 1 1,20 ∗ 107 1,05 ∗ 107 87.5

Segunda 2 1,35 ∗ 107 1,30 ∗ 107 96.3

Segunda 3 1,05 ∗ 107 9,50 ∗ 106 90.5

Tercera 1 7,00 ∗ 106 6,00 ∗ 106 85.7

Tercera 2 9,50 ∗ 106 7,50 ∗ 106 78.9

Tercera 3 8,50 ∗ 106 7,00 ∗ 106 82.4

Figura 4.9: Variaciones de la viabilidad para las diferentes generaciones.

Ademas el analisis de varianza ANOVA para el porcentaje de viabilidad V mostro que

existen diferencias significativas entre las generaciones de S. cerevisiae recuperadas (p-

valor=0.00954) segun la figura 4.10. Tambien se realizo la prueba de Duncan para esta

variable y se mostro que el mejor tratamiento se da en la primera generacion con un

mayor porcentaje de viavilidad de celulas, pero de acuerdo a [?], [?], [?] y [?] el por-

centaje de celulas vivas mınimo aceptado para un proceso de fermentacion es de 70 %

lo que significa que cualquiera de las tres generaciones de S. cerevisiae recuperadas son

aptas para un proceso de fermentacion ya que en promedio los porcentajes de viabilidad

Resultados y Discusion 20

obtenidos en este trabajo fueron de 95,3 %, 91,4 % y 82,3 % para la primera, segunda y

tercera generacion, respectivamente. Esto se muestra explıcitamente en la figura 4.11.

Figura 4.10: Analisis de la varianza para la viabilidad de celulas de S. cerevisiae.

Figura 4.11: Prueba Dunca para la viabilidad de celulas de S. cerevisiae (α = 0,01).

4.4. Analisis Fısico-Quımicos de Cerveza

Con las tres generaciones de S. cerevisiae recuperadas se elaboro tres lotes de cerveza,

cada lote de aproximadamente 18 litros de cerveza. De cada lote se tomo tres muestras

que fueron analizadas en el laboratorio para medir los grados Brix, pH y porcentaje de

alcohol (ABV) y tener una referencia de la calidad de cerveza que se obtuvo con cada

generacion de S. cerevisiae. Los datos medidos se muestran en la tabla 4.3.

El comportamiento de las variables grados Brix, pH y porcentaje de alcohol (ABV) en

funcion de la generacion se muestra en las figuras 4.12, 4.13 y 4.14.

Resultados y Discusion 21

Cuadro 4.3: Analisis Fısico-Quımicos de la cerveza elaborada con S. cerevisiae.

Generacion Repeticion oBrix pH ABV ( %)

Primera 1 5.3 4.2 5.2

Primera 2 5.4 4.2 5.2

Primera 3 5.3 4.5 5.1

Segunda 1 5.5 4.3 4.8

Segunda 2 5.7 4.6 4.5

Segunda 3 6.0 4.6 4.5

Tercera 1 6.2 4.8 4.2

Tercera 2 6.2 4.7 4.3

Tercera 3 6.2 4.8 4.0

Figura 4.12: Porcentaje de etanol presente en las cervezas.

Las propiedades fısico-quımicas de la cerveza varıan en relacion a la generacion utilizada

para su elaboracion. Segun [?], la capacidad fermentativa de S. cerevisiae disminuye en

cada generacion, es decir que S. cerevisiae de cada generacion asimilan en forma dife-

rente los compuestos presentes en el caldo a fermentar. Ademas el metabolismo de cada

generacion disminuye lo que explica las diferentes medidas de las variables estudiadas

[?, ?, ?, ?, ?].

Resultados y Discusion 22

Figura 4.13: Grados Brix medidos en las cervezas.

Figura 4.14: pH medido en las cervezas.

Resultados y Discusion 23

Gracias al analis estadıstico se logro establecer claramente las diferencias que existen

entre cada generacion de S. cerevisiae y con ello determinar que generacion produjo una

mejor cerveza.

4.4.1. Analisis de grados Brix en cerveza

Para la variable de grados Brix las figuras 4.15 y 4.16 indican diferencias significativas

entre cada generacion de S. cerevisiae (p-valor=0.00118) para el analisis de varianza,

mientras que la prueba de Duncan indica que la gerneracion tercera presenta el mejor

valor medio. Se debe mencionar que respecto a la variable de grados Brix, los valores

mas bajos son los mejores ya que esto significa que la densidad de la cerveza es menor

para dichos valores.

Segun indica la figura 4.16 los valores medios para los grados Brix fueron de 6.2, 5.7

y 5.3 oBrix para la tercera, segunda y primera generacion. De acuerdo a [?], [?] y [?],

la densidad expresada en grados Brix al finalizar la fermentacion puede ir de 2.5 hasta

6.5 grados Brix por lo que los valores obtenidos de las muestras de S. cerevisiae en este

trabajo estan en el rango aceptable.

Figura 4.15: Analisis de la varianza para la densidad expresada en grados Brix.

Figura 4.16: Prueba Dunca para la densidad expresada en grados Brix (α = 0,01).

Resultados y Discusion 24

4.4.2. Analisis de pH en cerveza

Las figura 4.17 indica que no hay diferencias estadısticas (p-valor=0.0215) para el pH

entre las tres muestras de cervezas. Los valores medios obtenidos para esta variable

fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generacion respectivamente,

esto se muestra en la figura 4.18. La prueba de Duncan mostro claramente que las tres

generaciones de S. cerevisiae presentan valores de pH dentro de un mismo rango.

Figura 4.17: Analisis de la varianza para el pH de las cervezas.

Figura 4.18: Prueba Dunca para el pH de las cervezas (α = 0,01).

Los valores medidos para el pH de todas las muestras de cerveza estan de acuerdo con

la norma ecuatoriana para bebidad alcoholicas, donde se indica que el pH de cerveza

esta en el rago de 3.5 a 5.0, estos valores tambien se referencian en otros estudios y

normas internacionales [?, ?, ?].

4.4.3. Analisis del contenido de alcohol en cerveza

Finalmente se realizo una destilacion rapida con cada muestra de cerveza para estimar

el contenido de alcohol en la cerveza (ABV). Los resultados para la prueba de varianza

mostraron que sı existen diferencias significativas (p-valor=0.000341) para cada lote de

cerveza elaborados con cada generacion de levadura, esto se indica el la figura 4.19. A

Resultados y Discusion 25

continuacion la figura 4.20 indica los valores medios del contenido de alcohol para la

primera, segunda y tercera generacion, los valores fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectiva-

mente. Tambien se muestra que las generaciones estan distribuidas en distintos rangos,

siendo la primera generacion la mejor ubicada con el valor mas alto.

Segun [?], el rango permitido de alcohol en una cerveza va desde 2.0 a 5.0 ABV, esto

indica que solo las cervezas elaboradas con la segunda y tercera generacion estan del

rango permitido. Por otro lado, segun normas internacionales indicadas en [?], [?], [?],

[?], [?] y [?] los valores para el contenido de alcohol en cervezas van de 1 a 12 ABV.

Figura 4.19: Analisis de la varianza para el porcentaje de alcohol en cervezas.

Figura 4.20: Prueba Dunca para el porcentaje de alcohol en cervezas (α = 0,01).

Capıtulo 5

Conclusiones y recomendaciones

Saccharomyces cerevisiae es el organismo unicelular responsable de la fermentacion al-

coholica en la elaboracion de cerveza. Cada dıa hay mas demanda de esta levadura

debido al incremento de empresas cerveceras alrededor del mundo.

La recuperacion y posterior reutilizacion de esta levadura representa un ahorro de recur-

sos economicos para las empresas cerveceras multinacionales y para las microcervecerıas.

Ademas el proceso para esta recuperacion y reutilizacion es sencillo pero requiere de un

correcto uso de tecnicas de asepsia y manejo adecuado de materiales de laboratorio.

En este trabajo se recupero y reutilizo levaduras de primera, segunda y tercera fer-

mentacion con las cuales se elaboro lotes estandar de cerveza, se encontro que existen

diferencias respecto a ciertos parametros fısico-quımicos evaluados en la cerveza, ası co-

mo diferencias a nivel microbiologico en el crecimiento de las mismas.

Se estandarizo el protocolo para dos medios mınimos: uno solido y uno lıquido, en los

cuales se realizaron todos los analisis. Estos medios contienen una fuente de carbono

20 gramos (sacarosa), fuente de nutrientes especıficos 8 gramos (caldo nutritivo), agua

destilada 1000 mL y para el caso del medio solido agar 15 gramos.

Durante el trabajo se determino parametros necesarios en levaduras cerveceras y parame-

tros requeridos en la cerveza elaborada. Respecto al crecimiento celular se determino que

a los siete dıas de incubacion a 17±2 oC existıan 20,8 millones de celulas por mL para

la primera generacion, 12 millones de celulas por mL para la segunda generacion y 8,33

millones de celulas en la tercera generacion, datos que estan en concordancia con otros

26

Conclusiones y recomendaciones 27

estudios y datos bibliograficos.

Respecto a la viabilidad se calculo 95.3 %, 91.4 % y 82.3 % para la primera, segunda y

tercera generacion de S. cerevisiae respectivamente. La viabilidad mınima recomendada

es de 70 %.

Los valores fısico-quımicos para la densidad final de la cerveza expresada en grados Brix

fueron de 6.2 5.7 y 5.3 oBrix en la tercera, segunda y primera generacion, los valores de

pH medios obtenidos fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera genera-

cion y finalmente los valores medios del contenido de alcohol para la primera, segunda

y tercera generacion fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivamente.

Por lo tanto se pudo concluir que la recuperacion y reutilizacion de S. cerevisiae es

posible dentro de una cervecerıa local.

La recomendacion para un futuro proyecto esta en la recuperacion de S. cerevisiae de

hasta una octava generacion.