Reflexió-opinió€¦ · Mínim (µmol/L) 18 18 18 18 0,0 Màxim (µmol/L) 1592 1601 1476 1606 4,0 Percentil 1 (µmol/L) 43 43 41 43 2,4 Percentil 99 (µmol/L) 489 488 471 462 2,8

© Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic http://www.acclc.cat/continguts/ivv146.pdf 1

__________________________________________________________________________________________

Descripció estadística de l´evolució dels valors mesurats

de diverses magnituds biològiques

Cristina Ruiz Iruela1, María José Castro Castro1, Xavier Fuentes

Arderiu2

1 Laboratori Clínic, Hospital Universitari de Bellvitge , L’Hospitalet de Llobregat

2 Consultor en ciències de laboratori clínic , Barcelona

_________________________________________________________________________________________

Introducció

Els estudis descriptius poblacionals s’han consolidat

com una eina fonamental per analitzar diferents

variables, formular hipòtesis i inferir causalitat (1).

Els avenços tecnològics que s’han produït en les

últimes dècades han ajudat a realitzar anàlisis

automatitzades de grans quantitats de dades per

extreure’n patrons interessants fins ara desconeguts.

Aquest procés és conegut com "mineria de dades"

(data mining) (2).

En els laboratoris clínics es generen una gran

quantitat de dades que no s’exploten i que podrien

ser de gran utilitat per conèixer, entre d’altres

aspectes, l’evolució d’una malaltia en un grup de

pacients o d’un esdeveniment epidemiològic, a més

de proveir informació sobre la distribució d’algunes

alteracions en una comunitat o regió.

L’aprofitament d’aquestes bases de dades pels

professionals del laboratori clínic es pot materialitzar

fent una descripció estadística dels valors mesurats

de les magnituds biològiques que es desitgi estudiar.

Així es poden obtenir dades que permetin orientar o

ajudar a adoptar diferents decisions, com

l’establiment o ajust dels límits d’alerta a partir dels

quals es realitza la revisió final dels valors mesurats

(3), o un estudi de la demanda relacionada amb les

noves necessitats que es poden produir en el

laboratori clínic. Un dels punts clau per realitzar una

anàlisi de les dades del laboratori clínic, és valorar

In vitro veritas 2013; 14:1-17

ISSN: 1697-5421

Reflexió-opinió

2 Ruiz et al. In vitro veritas 2013; 14:1-17

© Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic http://www.acclc.cat/continguts/ivv146.pdf

l’evolució metrològica relacionada amb les magnituds

biològiques en estudi al llarg del temps estudiat, per

la qual cosa seria necessari tenir en compte aspectes

relacionats amb les noves tecnologies i les seves

prestacions, l’envelliment dels sistemes de mesura o

el manteniment del biaix durant el temps.

En base a aquestes premisses, s’ha realitzat una

descripció estadística dels valors mesurats de les

principals magnituds biològiques mesurades al

Laboratori Clínic de l’Hospital Universitari de

Bellvitge.

Material i mètodes

S’han utilitzat els valors mesurats acumulats en el

sistema informàtic del Laboratori Clínic de l’Hospital

Universitari de Bellvitge (Omega 3000, Roche

Diagnostics S.L., Suïssa) entre els anys 2008 i 2011

en el cas de les magnituds bioquímiques, i entre els

anys 2009 i 2011 per a les magnituds hematològiques

que apareixen en la Taula 1. No s’inclou l’any 2008

en les magnituds hematològiques degut a canvis en el

sistema informàtic. Durant aquests anys s’han

utilitzat els mateixos sistemes de mesura i s’han

complert els requisits establerts per a les propietats

metrològiques (la imprecisió interdiària, el biaix i

l’error de mesura) en el Laboratori Clínic.

La descripció estadística de les dades s’ha realitzat

amb el programa informàtic SPSS Statistics Base 17.0

(SPSS, Chicago, EUA), prenent, per a cada magnitud

biològica i per a cada any, el primer valor mesurat de

cada pacient.

Per a cada magnitud i any s’han estudiat els següents

estadístics: la mitjana, la mediana, la desviació

estàndard, el coeficient de variació, el coeficient

d’asimetria, el coeficient de curtosi, els valors mínim i

màxim i els percentils 1 i 99. Aquests estadístics són

útils per reflectir la distribució de les dades (4).

També s’ha obtingut la fracció, expressada en

percentatge, de valors mesurats que estan fora de

l'interval de referència biològic corresponent per a

cada magnitud; aquests intervals de referència no

han canviat durant el període de temps estudiat.

A més, s’ha realitzat el càlcul del coeficient de

variació interanual de cadascun dels estadístics

estimats.

Resultats i discussió

Els resultats d’aquestes descripcions estadístiques

s’exposen a les taules 2 a 16 (magnituds

bioquímiques) i taules 17 a 27 (magnituds

hematològiques). En totes les taules s’exposen, per a

cada any, els valors obtinguts dels estadístics

estudiats i la fracció dels valors mesurats que estan

fora de l’interval de referència biològic corresponent,

a més del coeficient de variació interanual de cada

una d’aquestes variables.

Les diferents taules obtingudes es poden utilitzar

com una eina més d’informació per als professionals

del laboratori clínic. Els valors de la mitjana i de la

mediana informen sobre la tendència central de la

població estudiada, mentre que el coeficient

d’asimetria i el coeficient de curtosi, així com els

percentils i els valors extrems, poden servir

d’orientació sobre la distribució dels valors mesurats,

per tal de saber on se situen la majoria d’aquests

valors.

S’ha de tenir en compte que aquests estadístics (a

excepció dels percentils, inclosa la mediana) es veuen

clarament influïts pels valors mesurats extrems.

In vitro veritas 2013; 14:1-17 Ruiz et al. 3


Taula 1. Magnituds biològiques estudiades, descrites seguint les recomanacions internacionals [5].

Magnituds biològiques

Pla—Creatinini; c.subst. Pla—Tirotropina; c.subst.arb.

Pla—Urea; c.subst. Pla—Tiroxina(lliure); c.subst.

Pla—Fosfatasa alcalina; c.cat. San—Eritròcits; c.nom.

Pla—Albúmina; c.massa San—Hemoglobina; c.massa

Pla—Alanina-aminotransferasa; c.cat. San—Eritròcits; fr.vol.(―hematòcrit‖)

Pla—Aspartat-aminotransferasa; c.cat. San—Eritròcits; vol.entític (―VCM‖)

Pla—Ferro; c.subst. San—Plaquetes; c.nom.

Pla—Ferritina; c.massa San—Leucòcits; c.nom.

Pla—-Glutamiltransferasa; c.cat. Lks(San)—Neutròfils(segmentats); fr.nom.

Pla—Glucosa; c.subst. Lks(San)—Limfòcits; fr.nom.

Pla—Ió potassi; c.subst. Lks(San)—Monòcits; fr.nom.

Pla—Ió sodi; c.subst. Lks(San)—Eosinòfils; fr.nom.

Pla—Proteïna; c.massa Lks(San)—Basòfils; fr.nom.

Taula 2. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Albúmina; c.massa

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011

Nombre de valors mesurats 44 496 45 374 43 646 43 528 1,9

Mitjana (g/L) 41 41 42 42 1,7

Mediana (g/L) 42 43 44 43 1,9

Desviació estàndard (g/L) 5,7 5,9 5,6 5,3 4,4

Coeficient de variació (%) 14,0 14,3 13,2 12,6 2,8

Coeficient d’asimetria (1) -1,3 -1,3 -1,4 -1,5 6,7

Coeficient de curtosi (1) 2,1 1,9 2,4 2,9 19,3

Mínim (g/L) 6 10 7 2 52,9

Màxim (g/L) 55 57 57 58 2,2

Percentil 1 (g/L) 22 22 24 24 5,0

Percentil 99 (g/L) 50 50 51 50 1,0

Fracció de valors fora de l’interval de referència (%) 10,2 10,8 8,8 7,7 14,9

CV; coeficient de variació.



Taula 3. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Alanina-aminotransferasa; c.cat.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µkat/L) 0,54 0,55 0,48 0,48 7,4

Mediana (µkat/L) 0,36 0,36 0,32 0,31 7,8

Desviació estàndard (µkat/L) 1,382 1,768 1,260 1,950 20,3


Coeficient d’asimetria (1) 48,0 64,1 48,3 65,5 17,1


Mínim (µkat/L) 0,08 0,08 0,08 0,08 0,0

Màxim (µkat/L) 155,80 227,00 142,69 220,32 4,6

Percentil 1 (µkat/L) 0,13 0,12 0,11 0,11 8,1

Percentil 99 (µkat/L) 3,28 3,23 2,79 2,70 9,9



Taula 4. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Aspartat-aminotransferasa; c.cat.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µkat/L) 0,67 0,69 0,57 0,61 8,7

Mediana (µkat/L) 0,40 0,39 0,35 0,36 6,3





Mínim (µkat/L) 0,08 0,08 0,08 0,08 0,0

Màxim (µkat/L) 279,20 376,90 129,60 491,55 48,0

Percentil 1 (µkat/L) 0,18 0,18 0,16 0,17 5,6

Percentil 99 (µkat/L) 4,43 4,87 3,92 3,57 13,6





Taula 5. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Creatinini; c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µmol/L) 92 94 91 91 1,6

Mediana (µmol/L) 76 78 75 76 1,7

Desviació estàndard (µmol/L) 77,0 77,3 75,7 73,4 2,4




Mínim (µmol/L) 18 18 18 18 0,0

Màxim (µmol/L) 1592 1601 1476 1606 4,0

Percentil 1 (µmol/L) 43 43 41 43 2,4

Percentil 99 (µmol/L) 489 488 471 462 2,8



Taula 6. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Ferritina; c.massa

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µg/L) 235,9 223,6 208,1 195,5 8,2

Mediana (µg/L) 100,0 105,1 107,4 107,0 3,2

Desviació estàndard (µg/L) 994,03 552,95 344,78 310,52 57,1




Mínim (µg/L) 1,2 2,4 3,0 3,1 36,0

Màxim (µg/L) 89414,0 32971,0 7321,6 6213,5 114,7

Percentil 1 (µg/L) 6,1 5,9 5,4 6,0 5,3

Percentil 99 (µg/L) 1892,9 1731,4 1708,1 1422,3 11,6





Taula 7. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Ferro; c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µmol/L) 14 14 14 14 1,8

Mediana (µmol/L) 13 13 13 13 0,0

Desviació estàndard (µmol/L) 7,4 7,3 7,4 7,6 1,9




Mínim (µmol/L) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,0

Màxim (µmol/L) 84 75 99 75 13,6

Percentil 1 (µmol/L) 2 2 2 2 0,0

Percentil 99 (µmol/L) 38 37, 38, 39, 2,1



Taula 8. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Fosfatasa alcalina; c.cat.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µkat/L) 1,5 1,4 1,4 1,4 2,6

Mediana (µkat/L) 1,2 1,2 1,2 1,2 0,0





Mínim (µkat/L) 0,1 0,1 0,2 0,2 38,5

Màxim (µkat/L) 103,4 51,0 51,7 44,7 43,6

Percentil 1 (µkat/L) 0,6 0,5 0,5 0,6 10,5

Percentil 99 (µkat/L) 6,3 6,2 5,9 5,7 4,4





Taula 9. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de

Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—-Glutamiltransferasa; c.cat.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (µkat/L) 0,97 0,97 0,95 0,92 2,5

Mediana (µkat/L) 0,43 0,43 0,42 0,42 1,4





Mínim (µkat/L) 0,01 0,01 0,06 0,06 82,5

Màxim (µkat/L) 92,40 79,79 76,80 107,17 15,5

Percentil 1 (µkat/L) 0,14 0,12 0,13 0,13 6,3

Percentil 99 (µkat/L) 9,42 9,80 9,39 9,22 2,6



Taula 10. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Glucosa; c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (mmol/L) 6,0 6,0 6,1 5,9 1,3

Mediana (mmol/L) 5,4 5,3 5,5 5,4 1,5

Desviació estàndard (mmol/L) 2,14 2,09 2,13 2,01 2,8




Mínim (mmol/L) 1,2 1,2 0,1 1,1 59,5

Màxim (mmol/L) 49,0 33,6 65,0 55,6 26,0

Percentil 1 (mmol/L) 3,9 3,8 4,0 3,8 2,5

Percentil 99 (mmol/L) 15,3 15,1 15,2 14,5 2,4





Taula 11. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Ió potassi; c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (mmol/L) 4,51 4,47 4,44 4,4 0,7

Mediana (mmol/L) 4,49 4,45 4,42 4,42 0,7





Mínim (mmol/L) 2,17 2,08 1,98 1,89 6,0

Màxim (mmol/L) 7,70 7,98 7,79 7,63 2,0

Percentil 1 (mmol/L) 3,36 3,35 3,33 3,36 0,4

Percentil 99 (mmol/L) 5,82 5,77 5,71 5,71 0,9

Fracció de valors fora de l’interval de referència (%) 15,2 14,4 15 14,6 2,5


Taula 12. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Ió sodi; c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (mmol/L) 142 141 141 141 0,4

Mediana (mmol/L) 143 142 141 141 0,7





Mínim (mmol/L) 114 111 113 116 1,8

Màxim (mmol/L) 180 173 177 182 2,2

Percentil 1 (mmol/L) 134 133 133 133 0,4

Percentil 99 (mmol/L) 149 148 147 147 0,6





Taula 13. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Proteïna; c.massa

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (g/L) 72 71 70 68 2,2

Mediana (g/L) 73 73 71 70 2,1

Desviació estàndard (g/L) 9,3 9,3 9,0 8,5 4,2




Mínim (g/L) 19 21 23 16 1,8

Màxim (g/L) 168 142 140 142 2,2

Percentil 1 (g/L) 44 44 43 42 2,2

Percentil 99 (g/L) 90 90 88 85 2,7



Taula 14. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Tirotropina; c.subst.arb.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (mint.u./L) 3,06 3,30 3,12 3,26 3,6

Mediana (mint.u./L) 1,90 1,96 1,92 2,00 2,3

Desviació estàndard (mint.u./L) 8,450 12,340 9,940 10,710 15,6




Mínim (mint.u./L) 0,01 0,01 0,01 0,01 0,0

Màxim (mint.u./L) 327,79 697,40 364,90 601,60 36,1

Percentil 1 (mint.u./L) 0,01 0,01 0,01 0,01 0,0

Percentil 99 (mint.u./L) 23,09 23,55 19,81 24,03 8,5





Taula 15. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Tiroxina(lliure); c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (pmol/L) 15,5 15,7 16,0 15,5 1,4

Mediana (pmol/L) 15,0 15,2 15,4 15,0 1,3

Desviació estàndard (pmol/L) 4,46 5,02 4,97 5,00 5,5




Mínim (pmol/L) 0,3 0,4 0,3 0,3 15,3

Màxim (pmol/L) 180,2 275,0 186,8 192,1 21,3

Percentil 1 (pmol/L) 7,4 7,7 8,0 8,1 4,1

Percentil 99 (pmol/L) 28,4 28,7 29,4 28,5 1,6



Taula 16. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2008, 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Pla—Urea; c.subst.

Anys CV (%)

2008 2009 2010 2011


Mitjana (mmol/L) 8,1 8,0 7,4 7,3 5,8

Mediana (mmol/L) 6,8 6,7 6,3 6,2 4,5





Mínim (mmol/L) 0,6 0,9 0,9 0,5 28,4

Màxim (mmol/L) 72,5 78,6 68,6 82,3 8,1

Percentil 1 (mmol/L) 2,4 2,4 2,2 2,3 4,1

Percentil 99 (mmol/L) 29,5 29 26 25 8,1





Taula 17. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud San—Eritròcits; c.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011

Nombre de valors mesurats 54 152 52 322 50 065 3,9

Mitjana (x1012/L) 4,5 4,4 4,4 0,9

Mediana (x1012/L) 4,5 4,5 4,4 0,9

Desviació estàndard (x1012/L) 0,63 0,62 0,62 0,9

Coeficient de variació (%) 14,1 14,0 14,1 0,3

Coeficient d’asimetria (1) -0,3 -0,4 -0,3 9,4

Coeficient de curtosi (1) 1,3 1,3 1,3 3,6

Mínim (x1012/L) 1,1 1,0 1,2 9,1

Màxim (x1012/L) 9,7 8,9 8,6 6,1

Percentil 1 (x1012/L) 2,7 2,7 2,7 0,6

Percentil 99 (x1012/L) 5,9 5,8 5,8 0,9

Fracció de valors fora de l’interval de referència (%) 20,3 21,2 21,4 2,8


Taula 18. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud San—Hemoglobina; c.massa

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (g/L) 133 134 134 0,7

Mediana (g/L) 134 136 136 0,9

Desviació estàndard (g/L) 18,8 19,2 19,1 1,0




Mínim (g/L) 16 4 33 82,5

Màxim (g/L) 240 223 214 5,8

Percentil 1 (g/L) 81 81 82 0,7

Percentil 99 (g/L) 170 173 172 0,9





Taula 19. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud San—Eritròcits; fr.vol.(“hematòcrit”)

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (1) 0,40 0,40 0,40 0,0

Mediana (1) 0,40 0,41 0,41 1,4

Desviació estàndard (1) 0,550 0,550 0,560 1,0



Coeficient de curtosi (1)s 0,6 0,7 0,1 68,2

Mínim (1) 0,12 0,11 0,10 9,0

Màxim (1) 0,71 0,69 0,71 1,6

Percentil 1(1) 0,25 0,25 0,25 0,0

Percentil 99 (1) 0,51 0,52 0,52 1,1



Taula 20. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Lks(San)—Basòfils; fr.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (%) 0,5 0,6 0,5 4,7

Mediana (%) 0,5 0,5 0,4 12,4

Desviació estàndard (%) 0,42 0,51 0,54 12,7


Coeficient d’asimetria (1) 27,6 16,7 39,5 40,7


Mínim (%) 0,0 0,0 0,0 0,0

Màxim (%) 46,3 45,0 67,7 24,0

Percentil 1 (%) 0,0 0,0 0,0 0,0

Percentil 99 (%) 1,7 2,1 2,0 10,8





Taula 21. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Lks(San)—Eosinòfils; fr.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (%) 3,0 3,1 3,0 0,9

Mediana (%) 2,6 2,7 2,6 2,2





Mínim (%) 0 0 0 0,0

Màxim (%) 51 60 66 12,8

Percentil 1 (%) 0,0 0,0 0,0 0,0

Percentil 99 (%) 9,8 10,2 10,1 2,1



Taula 22. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud San—Leucòcits; c.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (x109/L) 7,3 7,2 7,3 0,3

Mediana (x109/L) 6,6 6,5 6,6 0,9





Mínim (x109/L) 0,0 0,2 0,1 0,0

Màxim (x109/L) 234 264 267 7,1

Percentil 1 (x109/L) 2,8 2,8 2,7 2,1

Percentil 99 (x109/L) 19,2 18,9 19,5 1,6





Taula 23. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Lks(San)—Limfòcits; fr.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (%) 30 30 30 0,5

Mediana (%) 30 30 30 0,3





Mínim (%) 0 0 0 0,0

Màxim (%) 100 99 99 0,6

Percentil 1 (%) 5 5 6 4,4

Percentil 99 (%) 59 60 61 1,2



Taula 24. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Lks(San)—Monòcits; fr.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (%) 7,5 7,2 7,3 2,1

Mediana (%) 7,2 6,9 7,0 2,2





Mínim (%) 0 0 0 0,0

Màxim (%) 85 92 88 4,0

Percentil 1 (%) 2,6 2,5 2,4 4,0

Percentil 99 (%) 15,0 14,8 15,0 0,7





Taula 25. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud Lks(San)—Neutròfils(segmentats); fr.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (%) 59 59 59 0,1

Mediana (%) 59 59 59 0,2





Mínim (%) 0 0 0 0,0

Màxim (%) 99 100 99 0,6

Percentil 1 (%) 29 28 28 1,5

Percentil 99 (%) 89 89 88 0,4



Taula 26. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud San—Plaquetes; c.nom.

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (x109/L) 245 239 234 2,3

Mediana (x109/L) 234 230 225 2,0





Mínim (x109/L) 1 1 1 0,0

Màxim (x109/L) 3470 3310 1606 36,9

Percentil 1 (x109/L) 61 61 57 3,9

Percentil 99 (x109/L) 572 543 539 3,3

Fracció de valors fora de l’interval de referència (%) 19,8 18,7 19 3,0




Taula 27. Descripció estadística dels valors mesurats obtinguts al Laboratori Clínic de l’Hospital de Bellvitge durant els anys 2009, 2010 i 2011 per a la magnitud San—Eritròcits; vol.entític (“VCM”)

Anys CV (%)

2009 2010 2011


Mitjana (fL) 90 92 92 1,5

Mediana (fL) 90 92 93 1,7

Desviació estàndard (fL) 6,8 6,8 6,8 0,5


Coeficient d’asimetria (1) -0,4 -0,5 -0,5 -3,8


Mínim (fL) 49 45 53 8,1

Màxim (fL) 140 138 138 0,8

Percentil 1(fL) 69 70 71 1,4

Percentil 99 (fL) 106 108 109 1,4

Fracció de valors fora de l’interval de

referència (%) 20,0 25,7 28,5 17,5


En aquesta descripció estadística s’han inclòs totes

les dades validades pel Laboratori Clínic. En alguna

de les taules es poden observar valors mesurats

màxims molt elevats. En diversos casos, el valor

mínim que consta a les taules coincideix amb el límit

de detecció del sistema de mesura en qüestió.

Aquests valors (màxim i mínim) podrien resultar de

gran utilitat per establir els límits d'inversemblança

per a cada laboratori clínic.

Els percentils 1 i 99 mostren els valors per sobre i

per sota, respectivament, dels quals es troba aquest

percentatge de valors mesurats. En aquesta

descripció estadística s’han escollit aquests percentils

ja que poden ser una important font d’informació

per establir els límits d’alerta a partir dels quals es

realitza la revisió final dels valors mesurats

corresponents a una magnitud biològica

determinada.

La fracció, expressada en percentatge, de valors

mesurats que estan fora de l'interval de referència

biològic corresponent pot ser de gran utilitat per

observar l’evolució d’una alteració poblacional o d’un

esdeveniment epidemiològic. El nombre de dades

amb el que s’ha treballat pot donar una idea de la

demanda que suposa la mesura de les magnituds

biològiques al laboratori clínic. A partir d’aquesta

informació es poden fer previsions i establir nous

plans organitzatius.



L’evolució que experimenta cada estadístic al llarg del

temps podria ser útil, juntament amb el coeficient de

variació d’aquests estadístics per treure conclusions

sobre les variacions que requereixin una actuació dels

professionals del laboratori clínic. Alguna d’aquestes

actuacions podrien estar dirigides a detectar

variacions en les propietats metrològiques durant el

temps, degut per exemple a l’envelliment o el canvi

d’un sistema de mesura, i que podrien influir en els

valors mesurats.

En algunes magnituds, com és el cas de la

concentració de fosfatasa alcalina, d’aspartat-

aminotransferasa o de tiroxina en el plasma1, crida

l’atenció la variació que experimenta el coeficient de

curtosi al llarg dels anys estudiats, el qual,

contràriament, es manté constant en altres magnituds

biològiques, com és el cas de la concentració d’ió

potassi en el plasma o la concentració d’eritròcits en

la sang.

En aquelles magnituds en les que es troben valors

màxims molt elevats, com és el cas de la

concentració de ferritina en el plasma, resulta de

major utilitat la mediana que no pas la mitjana, ja que

la variació que experimenta la mitjana al llarg dels

anys és major degut a aquests valors màxims.

____________________________________________

1 Al llarg d’aquest article quan apareix el terme ―plasma‖ es refereix al sistema biològic. La utilització del terme ―plasma‖ queda justificat en aquest article en base a l’article Candás B, Valero J, Huguet J, Fuentes X. Nomenclatura i unitats de les propietats biològiques. In vitro veritas 2011;12:15-78. [ISSN:1697-5421]. <http://www.acclc.cat/continguts/ivv125.pdf> (accés 2013-01-07).

Bibliografia

1. García Salinero J. Estudios descriptivos. Nure Investigación 2004;7 <http://www.fuden.eu/FICHEROS_ADMINISTRADOR/F_METODOLOGICA/formacion%207.pdf> (accés: 2012-11-13).

2. Zhu X, Davidson I. Knowledge discovery and data

mining: challenges and realities. Hershey: IGI Global; 2007.

3. Castro-Castro MJ, Dot-Bach D, Candás-Estebánez

B, Cano-Corres R, Fuentes-Arderiu X. Estimation of alert and change limits and its application in the plausibility control. Accred Qual Assur 2011;16:643–7.

4. Manual del usuario de SPSS Statistics Base 17.0

<http://web.udl.es/Biomath/Bioestadistica/SPSS/v17/SPSS%20Statistcs%20Base%20User's%20Guide%2017.0.pdf> (accés: 2012-11-13).

5. Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic.

Nomenclatura i unitats de les propietats biològiques. In vitro veritas 2011;12:15-78.


__________________________________________________________________________________________

Les ciències de laboratori clínic, fa trenta anys i a

l'actualitat

Joan Nicolau Costa

Departament d'Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció, Institut Universitari Dexeus,

Barcelona

_________________________________________________________________________________________

Introducció

En aquest article es fa una revisió de les actes de les

diverses jornades organitzades pel Comitè Europeu

de Normes per al Laboratori Clínic (d'ara endavant,

ECCLS) que van tenir lloc entre 1981 i 1982 (1).

El contingut d'aquests documents permet albirar,

més enllà dels avenços tecnològics, l'estat de les

ciències de laboratori clínic fa tres dècades i

comparar-lo amb el present.

La meva mirada al llibre d'actes és inevitablement

parcial i esbiaixada, però trobarem propostes i

preocupacions encara vigents.

El Comité Europeu de Normes per al laboratori clínic

Creat a imatge del Comitè Nacional de Normes per

al Laboratori Clínic dels Estats Units d'Amèrica,

l'ECCLS es va constituir legalment el 1979 (2). El seu

objectiu era aplegar les organitzacions professionals

relacionades amb el laboratori clínic, l'administració

sanitària i la indústria del diagnòstic in vitro.

Els estatuts reflecteixen la importància concedida a

aquests col·lectius (3, 4). En efecte, els membres de

ple dret podien ser:

"Qualsevol organització pública o privada,

acadèmica, científica o professional relacionada

amb les ciències de laboratori clínic...

Qualsevol organització governamental, o

intergovernamental o agència relacionada amb

la sanitat.

Qualsevol corporació, companya o organització

relacionada amb el subministrament de material

pels laboratoris clínics."


ISSN: 1697-5421

Història

19 Joan Nicolau Costa In vitro veritas 2013; 14:18-24


Reprodueixo també el paràgraf inicial dels estatuts

que tracta dels fins de l'ECCLS, on es fa èmfasi en el

desenvolupament de normes i la intenció pedagògica

i de diàleg.

«Promoure el desenvolupament, avaluació, aprovació

i implementació de normes voluntàries per a les

ciències de laboratori clínic per assolir i mantenir el

rendiment del laboratori clínic als nivells requerits

per a un manteniment òptim de la salut... Mantenir

un fòrum per a la comunicació i educació mútua

entre les organitzacions professionals, les agències

governamentals i la indústria, en relació a la qualitat

del laboratori clínic i la utilització de les normes».

El 1983, l'ECCLS va publicar un document

anomenat Les ciències de laboratori clínic a Europa. El

paper de la indústria, les organitzacions professionals i les

autoritats sanitàries (1) que reunia les actes de tres

jornades que havia organitzat.

La primera reunió es va dedicar a La indústria i el

laboratori clínic i va tenir lloc el 1981 a Canterbury,

Regne Unit. La segona es va titular Les societats

professionals i les ciències de laboratori clínic i va tenir lloc

el mateix any a Lió, França. La tercera es va dedicar a

L'administració sanitària i les ciències de laboratori clínic; va

tenir lloc el 1982 a Veldhoven, Holanda.

En aquestes jornades es van presentar diferents

comunicacions relacionades amb les ciències de

laboratori clínic. Les presentacions van ser molt

variades, algunes van ser didàctiques, altres van tenir

una vessant més filosòfica; d'altres encara, van ser

més aviat pràctiques presentant casos i exemples

concrets.

La Figura 1 presenta un diagrama, sorgit en una de

les discussions (5). Aquesta figura il·lustra l'estreta

vinculació de l'activitat del laboratori clínic amb

altres àmbits.

Figura 1. L’àmbit del laboratori clínic.

El desenvolupament del laboratori clínic

La intervenció de W. C. Love, del Trinity College de

Dublín, fa referència a la història del laboratori clínic

i fa una crítica del seu estat actual (6).

Històricament, les primeres anàlisis clíniques eren

realitzades pels metges clínics a costat del pacient. Al

voltant de la dècada dels anys 1920, les anàlisis

clíniques van requerir una major habilitat i

coneixement. En els hospitals, es va fer èmfasi en la

vessant científica, la qual cosa va permetre els

avenços en el diagnòstic i el seguiment de les

malalties i la recerca dels seus mecanismes.

En la dècada dels anys 1950 i 1960 va augmentar el

nombre i varietat dels exàmens sol·licitats. La

simplificació dels mètodes de mesura i la demanda

d'un gran nombre d'exàmens va portar a un èmfasi

en l'automatisme. La importància de les habilitats

tècniques va anar augmentant progressivament. Va

millorar el rendiment del laboratori clínic i,

necessàriament, la seva qualitat analítica.

En els curs d'aquests anys s'ha produït, en resum,

una ràpida automatització dels instruments de

mesura, la centralització del laboratori i la

informatització de les dades. Els problemes logístics

In vitro veritas 2013; 14:18-24 Joan Nicolau Costa 20


que s'han derivat són: un temps excessiu en el

lliurament dels resultats, una rebuda de tipus

d'espècimens inadequats, uns colls d’ampolla entre

els centres d'extracció i el laboratori central, i uns

horaris massa rígids per a les extraccions.

Per a fer-hi front, el camí que apunta el ponent és el

desenvolupament de les anàlisis clíniques prop del

pacient, de la qual cosa es tracta en l'apartat següent.

Per altra banda, els facultatius especialistes del

laboratori clínic han rebut una intensa formació

mèdica, científica, i tecnològica. Però,

malauradament, s'han obsessionat i emmirallat per la

tecnologia. Malgrat que les ciències de laboratori

clínic són una disciplina íntimament relacionada amb

moltes branques de la medicina, s'ha produït un

distanciament poc beneficiós amb el metge clínic. El

trencament del lligam de la comunicació amb el

metge clínic fa que aquest s'hagi convertit en un

usuari allunyat del servei.

El remei senyalat és el l'aprofundiment del vessant

semiològic del laboratori clínic que es tracta més

endavant en aquest article.

Les anàlisis clíniques prop del pacient com a oportunitat

El ponent apunta que les anàlisis clíniques prop del

pacient són la solució per molts dels problemes

logístics esmentats anteriorment. Es tracta, diu,

d'entendre-les com una nova transició del laboratori

clínic. Tant és així, que si els facultatius especialistes

no s'adapten, es corre el perill que els fabricants

d'instruments de mesura els ofereixin directament als

metges clínics. La funció del laboratori clínic ha

d'incloure el control de qualitat dels sistemes de

mesura emprats per aquests tipus d'anàlisis i tenir

cura de la formació del personal que els utilitza.

Amb el pas del temps, aquests tipus d'anàlisis no han

perdut importància, ans al contrari. Al nostre país, es

pot recordar l'atenció que s'hi ha dedicat. El Consell

Assessor sobre Laboratoris Clínics del Departament

de Sanitat i Seguretat Social de la Generalitat de

Catalunya ha elaborat especialment un document

consultable en línia (7). L'Associació Catalana de

Ciències de Laboratori Clínic (d'ara endavant,

ACCLC) hi ha dedicat un document (8) i una sessió

de discussió (9). L'enfocament és equiparable a

l'apuntat per l'ECCLS. En el document de

l'associació es diu textualment: «En la implantació

d'un sistema d'anàlisis clíniques prop del pacient és

important, doncs, l'aspecte formatiu a més del

control de la qualitat» (8).

El vessant semiològic del laboratori clínic

La intervenció de L. Eldjarn, de l'Institut de

Bioquímica Clínica de la Universitat d'Oslo, tracta

àmpliament de la col·laboració dels professionals

especialistes del laboratori clínic amb els metges

clínics (10). A continuació enuncio els aspectes dels

quals s'ocupa el ponent, encara que admetent que hi

pot haver un èmfasi diferent en els diversos països

europeus:

En un futur proper, a més del desenvolupament

de nous mètodes de mesura de les magnituds

biològiques, és previsible la cerca de propietats

biològiques que aportin un major significat

semiològic.

En la incorporació d'una nova propietat

biològica al catàleg de prestacions, a més de la

millora des del punt de vista semiològic, cal

tenir en compte l'abaratiment dels costos

respecte a altres procediments, que cal eliminar

del catàleg de prestacions quan queden obsolets.



Del consens entre els metges clínics i els

responsables del laboratori clínic en resulten els

protocols i els algorismes. Un objectiu és

aconseguir que al laboratori se li demani l'estudi

de les entitats nosològiques que interessi.

Com que una gran part de la càrrega de treball

és ocasionada per les sol·licituds d'exàmens dels

metges clínics, el laboratori clínic ha de fer una

tasca pedagògica per evitar el mal ús o l'ús

excessiu dels recursos. Les causes d'aquests

abusos podrien ser els mals hàbits, una educació

deficient o una estratègia per a cobrir-se

legalment. Fins i tot, podria ser convenient

introduir en la pràctica quotidiana l'anàlisi entre

el cost i el benefici d'una petició.

En l'informe de laboratori clínic, a més dels

valors de referència, cal afegir la significació

d'un canvi entre dos valors consecutius quan

això sigui possible. Es tracta d'aconsellar sobre

la interpretació dels valors mesurats.

Avís: si els professionals no endeguen una

reducció controlada de l'ús dels recursos gràcies

a la millora de la interpretació dels valors

mesurats, els governs intervindran a fi d'amortir

el que consideren un malbaratament.

La preocupació per les activitats semiològiques, en

ocasions, també anomenades activitats clíniques, no

ha estat aliena als facultatius al nostre país.

L'exemple més clar de la col·laboració amb els

metges clínics és l'edició del llibre commemoratiu del

Segon Congrés Català de Ciències de Laboratori

Clínic. En ell, a banda d'especialistes de diverses

àrees del laboratori clínic (bioquímica, hematologia,

immunologia, microbiologia, anàlisis clíniques)

intervenen deu metges clínics (11). En el mateix

Segon Congrés Català de Ciències de Laboratori

Clínic s'hi dedica una taula rodona: El laboratori clínic:

el futur que volem (12).

Per altra banda, diversos articles a In vitro veritas, la

revista de l'ACCLC, s'ocupen de l'activitat clínica

(13), els comentaris interpretatius (14, 15),

l'establiment dels límits d'alarma i valors alarmants

(16) i finalment una orientació per satisfer els

requisits de la norma ISO 15189 (17). Aquesta

norma reconeix com activitat pròpia del laboratori

clínic, l'assessorament sobre l'ús apropiat dels

exàmens de les propietats biològiques i la

interpretació dels resultats d'aquests exàmens. En

l'article, aquestes activitats reben el nom de consultoria

semiològica.

La crisi identitària en el laboratori clínic

El mateix ponent, L. Eldjarn, constata que

l'organigrama organitzatiu i les responsabilitats dintre

el laboratori clínic estan poc definits. Coexisteixen

diferents àrees independents definides de forma

arbitrària en els diversos establiments sanitaris (per

exemple, una àrea especialment dedicada a la

immunologia o una altra dedicada al mesurament de

determinades hormones). Seria convenient, per tant,

definir una estructura racional i les responsabilitats

del personal sanitari facultatiu i no facultatiu.

La fragmentació excessiva del laboratori clínic es va

originar, segons el ponent, a les facultats, on la

investigació i la complexitat administrativa podia

justificar la divisió. Però aquest fet no està justificat

en el camp de la sanitat. La solució passaria per una

estructura més centralitzada des del punt de vista

organitzatiu, no geogràfic. A més, això permetria una

educació bàsica en el laboratori clínic seguit d'una

subespecialització. El canvi, afirma, no és senzill i a la



dificultat hi contribueix un excés de personal amb un

fort caràcter, poc flexible, que ha creat el seu nínxol

en el camp del laboratori clínic.

Els aspectes organitzatius i docents han estat una

preocupació constant dels professionals del

laboratori clínic. Com a prova es pot citar el discurs

inaugural del Primer Congrés Català de Ciències de

Laboratori Clínic. Joan Colomines afirma: « [...]

aquest Congrés es mou, en totes les ponències menys

una, en el món de la infraestructura, de

l'organització, de la millora de la qualitat, de

l'ensenyament i la docència, i del concepte que sobre

el laboratori clínic tenen els seus professionals.» (18).

En el transcurs d'aquest congrés, una taula rodona es

va dedicar al l'ensenyament. Pot ser convenient

també recordar que en el Llibre blanc del laboratori clínic

a Catalunya es fan diverses propostes dirigides a la

universitat, com la creació d'una llicenciatura (grau)

específica (19).

Una tasca inacabada

C. H. de Verdier, de l'Hospital Universitari

d'Uppsala, es pregunta com facilitar al metge clínic la

interpretació dels valors mesurats de les magnituds

biològiques i la presa de decisions clíniques (20).

Raona que els valors mesurats van acompanyats dels

intervals de referència fisiològics però els informes

de laboratori clínic haurien d'incloure més estadístics

i en posa l'exemple presentat en la Figura 2.

Figura 2. Proposta de format de l’informe de laboratori clínic de C. H. Verdier.

En la proposta, el valor mesurat va acompanyat de la

incertesa de mesura expressada com a desviació

estàndard. El metge clínic també rebria informació

sobre la imprecisió i l'error sistemàtic (biaix de

mesura) del valor mesurat lliurat en l'informe. A més,

s'especifica un error preanalític (premetrològic), que

no es defineix. En una etapa posterior, el ponent

proposa afegir, quan s'escaigui, una referència al

valor discriminant.

Al nostre país, caldria recordar que una directriu del

Comitè d'Homologació de Dades i Procediments

recomana que els valors mesurats vagin acompanyats

de la incertesa de la mesura, expressada com el doble

del valor de la desviació estàndard interserial precedit

del signe +. A continuació es recomana que figuren

els límits de referència corresponents, segons les

característiques biològiques del pacient, o els valors

discriminants. També s'hauria d'indicar a l'informe si

un resultat actual és significativament diferent del

que es va observar l'última vegada, dins d'un període

de temps preestablert (21).

Conclusió

Els assistents a les reunions de l'ECCLS esmentaven

instruments de mesura arraconats en la memòria

d'algun analista clínic, o en publicacions d'un paper

groguenc. Empraven una terminologia encara poc

desenvolupada. Però ja se sentien immersos en la

mateixa onada de canvis que ha afectat tota l'activitat

del laboratori clínic.

La sorpresa de la lectura del llibre d'actes rau en la

vigència del què deien els assistents. Hem vist, amb

el pas de 30 anys, desenvolupar propostes ja

apuntades en embrió i manifestar preocupacions que

després s'han anat repetint.



Referències

1. European Committee for Clinical Laboratory Standards. Clinical Laboratory Science in Europe. The roles of industry, the professions and health authorities. [Preparat per Brown SS, Calam DH, Gloag EA]. Beckenham; 1983. [ISBN 0 9508977 0 1].

2. Announcement. The Setting up of a European Committee for Clinical Laboratory Standards. J Clin Chem Clin Biochem 1979;17:269-76.

3. European Committee for Clinical Laboratory Standards. Revised Bylaws. J Clin Chem Biochem 1980;18:637-45.

4. European Committee for Clinical Laboratory Standards. ECCLS Bylaws 1988. J Clin Chem Clin Biochem 1988;26:355-63.

5. Mitchell FL. ECCLS Seminar on Professional Societies and Clinical Laboratory Science: Concluding Remarks. A: European Committee for Clinical Laboratory Standards. Clinical Laboratory Science in Europe. The roles of industry, the professions and health authorities. [Preparat per Brown SS, Calam DH, Gloag EA]. Beckenham; 1983. p. 162-3 [ISBN 0 9508977 0 1].

6. Love WC. Some Outstanding Problems in Clinical Biochemistry. A: European Committee for Clinical Laboratory Standards. Clinical Laboratory Science in Europe. The roles of industry, the professions and health authorities. [Preparat per Brown SS, Calam DH, Gloag EA]. Beckenham; 1983. p. 160-1 [ISBN 0 9508977 0 1].

7. Generalitat de Catalunya. Departament de Sanitat i Seguretat Social. Anàlisis prop del pacient. <http://www.gencat.es:8000/salut/depsalut/html/ca/dir2164/labclinic.htm> (accés: 2012-12-19).

8. Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic. Recomanacions sobre les anàlisis clíniques prop del pacient. In vitro veritas 2002;3: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv039.pdf> (accés: 2012-12-19).

9. Fernández Delclós MD. Actes del Club de Gestió: "Anàlisis prop del pacient". In vitro veritas 2003;4: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv051.pdf> (accés: 2012-12-19).

10. Eldjarn L. The Needs of Clinical Laboratories in Europe as Seen by a Chemical Pathologist. A: European Committee for Clinical Laboratory Standards. Clinical Laboratory Science in Europe. The roles of industry, the professions and health authorities. [Preparat per Brown SS, Calam DH,

Gloag EA]. Beckenham; 1983. p. 13-5 [ISBN 0 9508977 0 1].

11. Fuentes Arderiu X, dir. Funcions assistencials dins de l'àmbit de les ciències de laboratori clínic. Un recull d'opinions. L'Hospitalet de Llobregat: Subdivisió d'Atenció Primària Costa de Ponent-Tarragona-Tortosa (Institut Català de la Salut), 1996. [ISBN 84-688-6838-8] (B-9099-1996).

12. Planells Torres P, dir. Actes del II Congrés Català de Ciències de Laboratori Clínic. Barcelona: Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic; 1997. [ISBN 84-688-6850-7] (B-23430-1997).

13. Fuentes Arderiu X, Castiñeiras Lacambra MJ. L'activitat clínica dins del laboratori clínic. In vitro veritas 2001;2 : <http://www.acclc.cat/continguts/ivv030.pdf> (accés: 2013-01-02).

14. Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic. A propòsit dels comentaris interpretatius. In vitro veritas 2006;7: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv082.pdf> (accés: 2013-01-02).

15. Reial Col·legi de Patòlegs del Regne Unit. Guia per a la provisió de comentaris interpretatius en els informes de bioquímica clínica. In vitro veritas 2000;1: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv003.pdf> (accés: 2013-01-02).

16. Comissió d'Harmonització dels Laboratoris Clínics, Direcció Adjunta d'Afers Assistencials, Institut Català de la Salut. Criteris per establir límits d'alarma i valors alarmants. In vitro veritas 2011;12:160-164. <http://www.acclc.cat/continguts/ivv136.pdf> (accés: 2013-01-02).

17. Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic. Guia per satisfer els requisits de la norma ISO 15189:2003 relacionats amb la consultoria semiològica. In vitro veritas 2006;7: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv084.pdf> (accés: 2013-01-02).

18. Colomines Puig J. Discurs inaugural. A: Fuentes Arderiu X, dir. Actes del I Congrés Català de Ciències de Laboratori Clínic. Barcelona: Direcció General de Recursos Sanitaris; 1995. p. 11-6. [ISBN: 84-393-3394-3] (B-17884-1995).

19. Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic. Llibre blanc del laboratori clínic a Catalunya. Barcelona: Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic; 2006. (B. 14.365-2006). <http://www.acclc.cat/continguts/marge2006a.pd> (Accés: 2013-01-05).



20. De Verdier CH. Interpretation and Clinical Relevance of Laboratory Tests: a Laboratory Scientist's Viewpoint. A: European Committee for Clinical Laboratory Standards. Clinical Laboratory Science in Europe. The roles of industry, the professions and health authorities. [Preparat per Brown SS, Calam DH, Gloag EA]. Beckenham; 1983. p. 150-2. [ISBN 0 9508977 0 1].

21. Fuentes Arderiu X. Directius per a la preparació dels informes de laboratori clínic. A: Miró Balagué J, Fuentes Arderiu X, dirs. Documents del Comitè d'Homologació de dades i Procediments. Barcelona: Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic; 1998. p. 71-6. [ISBN 84-688-6837-X] (B-10061-1998).


__________________________________________________________________________________________

Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic

Secció d’Estadística i Metrologia1

Estadística i ciències de laboratori clínic

Preparat per:

Xavier Fuentes Arderiu

Consultoria en Ciències de Laboratori Clínic, Barcelona

_________________________________________________________________________________________

Ciència i tecnologia

Un dels conceptes més bàsics és el d’objecte. Un

objecte és allò que un ésser humà pot percebre o

concebre (1). A un objecte, en el llenguatge comú,

també se'l denomina cosa, entitat, ens, element, etc. Els

objectes poden ser individus o col·lectius, i es

divideixen en imaginaris (com ara el nombre natural

7, el teorema de Thales o un analitzador perfecte) o

reals, que al seu torn poden ser materials (ja siguin

naturals, com una mostra d'orina o un pacient, o

artificials, com una pipeta o un bloc de paper) o

immaterials (com el l'electromagnetisme o un pla

estratègic). Aquest sentit tan ampli del concepte

d’objecte inclou tota mena de «coses».

La humanitat sempre ha volgut conèixer els objectes

existents, saber què són, de què estan fets, com

funcionen, perquè serveixen, quin és el seu origen,

quin és el sentit de la seva existència, etc., etc. Aquest

és el perquè de l’aparició de la ciència, o, filant més

prim, de la ciència bàsica (o pura), que no és altra cosa

que el conjunt de coneixements adquirits d’una

manera particular —el mètode científic, que

comentarem més endavant— la finalitat del qual és la

comprensió de l’Univers motivada per la curiositat

(2).

_____________________________________________

1 Membres de la Secció d’Estadística i Metrologia durant la

preparació d’aquest document: A. Blanco Font, B. Candás

Estébanez, X. Fuentes Arderiu (president), M. Martínez

Casademont, M. Mosquera Parrado, J.M. Queraltó

Compañó, L. Rami Brualla, R. Rigo Bonnin, H. Valbuena

Parralejo.

_____________________________________________


ISSN: 1697-5421

Document docent

26 Xavier Fuentes Arderiu In vitro veritas 2013; 14:25-30


Les idees anteriors sobre ciència i tecnologia són

extremes i la seva finalitat és eminentment

pedagògica. En realitat, sol haver-hi un espai de

trànsit conceptual entre elles, és l’anomenada ciència

aplicada que, com el seu nom indica, és ciència

bàsica (o pura) dedicada a la producció de

coneixement de possible ús pràctic.

No obstant això, val a dir que, malgrat l’interès que la

humanitat ha tingut al llarg de la història per la

ciència i la tecnologia, les creences també han tingut

una importància extraordinària. Una gran part de la

humanitat considera veritables moltes coses que no

estan comprovades o demostrades; és a dir que no

pertanyen ni a la ciència ni a la tecnologia i, per tant,

no són coneixements rigorosos.

Ciències de la salut i ciències de laboratori

clínic

Dins les ciències aplicades i les tecnologies, les

ciències de la salut, són especialment notòries

perquè tracten de la preservació i restauració de la

salut (3). Entre elles destaquen històricament (per

ordre alfabètic) la farmàcia, la infermeria, la

medicina, l’odontologia i la veterinària, entre d’altres.

Encara que, en el context d’aquest document, hem

de destacar de forma especial les ciències de

laboratori clínic. Aquest concepte es defineix com

la branca de les ciències de la salut que, mitjançant

les tècniques de la química i de la biologia, estudia in

vitro les propietats biològiques el valor de les quals és

útil per a la prevenció, diagnòstic, pronòstic, control

del tractament i coneixement de les malalties (4).

El mètode científic

Tant la ciència com la tecnologia tenen en comú el

mètode científic. Les activitats que integren el

mètode científic permeten obtenir coneixements que

es consideren veritables, si més no, provisionalment.

El mètode científic es pot definir com el conjunt

d’activitats sistemàtiques i reproduïbles destinades a

l’obtenció de coneixement contrastable i compatible

amb el coneixement cientificotecnològic existent (5).

Les «veritats» cientificotecnològiques no han de ser

definitives, sinó que poden anar canviant a mesura

que passa el temps i són substituïdes per altres

«veritats» fruit de nous estudis i noves

demostracions. Aquest procés s’anomena falsació, i un

dels principis del mètode científic és la falsabilitat de

les conclusions (6).

En tot procés intel·lectual, com és la creació de

coneixement científic, per arribar a una conclusió cal

disposar d’una informació adquirida prèviament, és a

dir, d’unes dades inicials sobre l’assumpte que es

tracti. Una dada és allò que s’admet sense dubtar-ne

i que serveix de punt de partida per a les

interpretacions o les demostracions (7). Així, una

dada és un antecedent necessari per arribar al

coneixement d’alguna cosa o per deduir les

conseqüències d’un fet. El concepte de dada, en ser

tan general, és molt fàcil d’exemplificar, així, són

dades: un nombre (amb significat aritmètic o sense),

una lletra, un acrònim, una paraula, un sintagma, una

frase, un document textual, un document gràfic

(tècnic o artístic), una gravació d’àudio, una gravació

de vídeo, etc., etc. Sempre que sigui possible, per

facilitar el procés de creació de coneixement científic,

aquesta informació (el conjunt de dades) es

representa en un format adequat perquè pugui ser

tractada en un procés informàtic o en un sistema

automàtic en general.

En el cas de les ciències de laboratori clínic, les dades

són els valors de les propietats biològiques

mesurades o identificades en les mostres clíniques i,

també, les malalties que pateixen els pacients i les

propietats demogràfiques d’aquests pacients.

In vitro veritas 2013; 14:25-30 Xavier Fuentes Arderiu 27


A partir de les dades es construeixen hipòtesis

(suposicions), la confirmació o rebuig de les quals

conduirà a unes conclusions susceptibles de ser

falsades posteriorment, com ja s’ha comentat més

amunt.

Les activitats fonamentals que formen part del

mètode científic pertanyen a dues grans famílies: les

observacions i els experiments. Una observació és

una percepció deliberada (8), i es considera el

procediment empíric bàsic, com ara un mesurament

o una identificació, mentre que un experiment

consisteix en una alteració deliberada d’algunes

propietats d’un objecte per tal d’esbrinar com

aquesta alteració afecta les propietats d’altres

objectes (8). Segons es basin en observacions o en

experiments, els estudis realitzats quan s’aplica el

mètode científic es divideixen en estudis

observacionals i estudis experimentals. En la

pràctica assistencial quotidiana del laboratori clínic,

majoritàriament es fan estudis observacionals i

només en alguns casos —com les anomenades proves

funcionals— es fan estudis experimentals.

Els estudis observacionals poden ser longitudinals o

transversals. Un estudi longitudinal consisteix en

fer observacions en un individu o en un grup al llarg

del temps i comparar-les entre si; mentre que un

estudi transversal consisteix en fer observacions en

individus o en grups i comparar-les amb les

observacions fetes en altres grups, prescindint del

temps. En les ciències de laboratori clínic se’n fan

dels dos tipus, com es pot veure als exemples

següents: estudi de la utilitat d’una magnitud

biològica en el control del tractament d’una malaltia

(estudi longitudinal); estudi de la utilitat diagnòstica

d’una propietat biològica (estudi transversal).

Aplicant el mètode científic s’obtenen conclusions

gràcies a les inferències. La inferència és un mètode

discursiu que permet obtenir una conclusió a partir

d’unes premisses (8). Dins les ciències de laboratori

clínic, la conclusió principal que es pretén inferir a

partir dels valors de les propietats biològiques (les

premisses) és informació per a la prevenció,

diagnòstic, pronòstic, control del tractament i

coneixement de les malalties (la conclusió). Cal

destacar que de vegades es pretén (equivocadament)

fer inferències pseudocientífiques com:

Els laboratoris clínics que treballen bé solen

tenir instruments molt bons; aquest laboratori

clínic té instruments molt bons; així, doncs,

aquest laboratori clínic treballa molt bé.

Els resultats fiables solen anar firmats per un

facultatiu especialista; aquests resultats els firma

un facultatiu especialista; així, doncs, aquests

resultats són fiables.

Aquestes «pseudoinferències» no tenen cap validesa i

no s’han d’utilitzar mai científicament.

Les inferències poden ser inductives o deductives.

Una inferència deductiva, o simplement una

deducció, és un raonament lògic que va de les

generalitats a les particularitats, mentre que una

inferència inductiva, o simplement inducció, és

un raonament lògic que va de les particularitats a les

generalitats (8). Quan es raona inductivament s’arriba

a una conclusió a partir d’observacions diverses, però

aquesta conclusió podria ser veritable o falsa, raó per

la qual s’ha de sotmetre a un procés de verificació o

de falsació a partir de noves observacions. En canvi,

quan es raona deductivament no es necessita ni

verificació ni falsació, ja que en una inferència

deductiva correcta des del punt de vista lògic, si les

premisses són veritables la conclusió també ho és.



Exemples d’inferència deductiva:

1. Per a la magnitud biològica específica MB, l’error

de mesura relatiu màxim permès en el laboratori

clínic és x % (a una concentració determinada); el

sistema de mesura A genera un error de mesura

relatiu inferior al màxim permès; així, doncs, el

sistema de mesura A és apte per al seu ús al

laboratori clínic.

2. Les mostres de plasmes vermellosos provenen de

sang hemolitzada; aquesta mostra de plasma és

vermellosa; així, doncs, aquest mostra de plasma

prové de sang hemolitzada.

3. Els pacients anèmics tenen una concentració

d’hemoglobina en la sang inferior al límit inferior de

l’interval de referència biològic [magnitud biològica

patognomònica]; aquest pacient té una concentració

d’hemoglobina en la sang inferior al límit inferior de

l’interval de referència biològic; així, doncs, aquest

pacient està anèmic.

Exemples d’inferència inductiva:

1. Per a una magnitud biològica específica, el 95 %

dels pacients hospitalitzats que tenen valors dins de

l’interval de referència biològic corresponent

presenten un canvi entre els resultats de dos

mesuraments consecutius inferior a un x %; el canvi

del pacient XYZ és superior a x %; així, doncs,

aquest canvi és rellevant clínicament.

2. El 95 % d’una mostra de persones presumptament

sanes tenen una concentració de substància de

«nosequantina» en el plasma inferior a x mmol/L;

aquest pacient té una concentració de substància de

«nosequantina» en el plasma superior a x mmol/L;

així, doncs, el resultat d’aquest pacient probablement

és «patològic».

3. Hi ha pacients en els què la concentració catalítica

de -glutamiltransferasa en el plasma augmenta quan

tenen una neoplàsia hepàtica; aquest pacient té una

concentració catalítica de -glutamiltransferasa en el

plasma augmentada; així, doncs, aquest pacient

potser tingui una neoplàsia hepàtica.

Pel que fa a les mesures i exàmens de les propietats

biològiques que es fan al laboratori clínic amb finalitat

assistencial, no té sentit parlar ni d’induccions ni de

deduccions, ja que no són processos inferencials.

El mètode científic utilitza les ciències formals

(matemàtiques i lògica) com eines bàsiques per

aconseguir el rigor que li és propi. La lògica li permet

fer els raonaments adequats i les matemàtiques,

fonamentalment l’estadística, li permet arribar a

conclusions amb una certa fiabilitat. En els propers

paràgrafs es tracta dels conceptes generals

d’estadística que es troben en qualsevol tractat

d’aquesta disciplina.

L’estadística és la branca de les matemàtiques que

facilita la presa, organització, recopilació, presentació

de les dades i, gràcies als estudis probabilístics,

permet inferir conclusions i prendre decisions

raonables.

L’estadística descriptiva s’ocupa de descriure

poblacions o mostres mitjançant paràmetres o

estadístics de tendència central o de dispersió,

principalment. Una població es pot definir com un

conjunt constituït per tots els objectes a considerar,

com ara el conjunt de les concentracions d’eritròcits

en la sang de totes les dones postmenopàusiques

censades al municipi de Barcelona; mentre que una

mostra poblacional es pot definir com un subconjunt

dels objectes d’una població, destinat a subministrar

informació o a ser la base d’una decisió sobre

aquesta població, com ho és el conjunt de les



concentracions d’eritròcits en la sang de 1000 dones

postmenopàusiques triades a l’atzar del cens del

municipi de Barcelona. El nombre d’objectes que

componen la mostra poblacional és inferior al de la

població, però ha de tenir una mida suficient per tal

de poder treure conclusions sobre la població

corresponent.

En estadística, s’anomena paràmetre a cadascuna de

les magnituds utilitzades per descriure una població,

com ara la mitjana aritmètica, una proporció o la

desviació estàndard d’una població (de les que es

tractarà en un altre document), i s’anomena

estadístic a cadascuna de les magnituds utilitzades

per descriure una mostra. Qualsevol estadístic pot

adquirir diferents valors numèrics segons la mostra

poblacional a partir de la qual s’obtingui, i cada un

d’aquests valors numèrics pot ser utilitzat com una

aproximació (estimació) d’un paràmetre d’una

població, com ara les esmentades mitjana aritmètica,

proporció o desviació estàndard (aquesta utilització

d’un estadístic dóna lloc al concepte d’estimador,

que és un estadístic usat per estimar un paràmetre

d’una població).

L’estadística inferencial es dedica a obtenir

conclusions probabilístiques sobre poblacions a

partir de les dades obtingudes de mostres de les

poblacions en qüestió. Existeixen diferents maneres

de fer inferències estadístiques, entre les que

destaquen les estimacions puntuals o intervalars de

paràmetres o estadístics i els contrastos d'hipòtesis.

De tot això, se’n parlarà properament en diversos

documents docents.

Per al tractament estadístic dels valors de les

propietats biològiques («les dades») és convenient

que aquestes propietats es representin mitjançant

variables. Una variable o, més rigorosament, una

variable matemàtica, és un símbol que representa una

propietat; així, doncs, el concepte matemàtic de

variable és similar al concepte ontològic de propietat

(9). Com és natural, cada valor possible de la

propietat és un valor possible de la variable que la

representa. Les variables matemàtiques poden ser

controlades i aleatòries. Una variable controlada

pot tenir només els valors que se li permeti tenir (per

això també s’anomena variable dependent), mentre que

una variable aleatòria és una variable capaç

d’adoptar qualsevol valor d'un conjunt determinat de

valors (raó per la qual també se la coneix per variable

independent), a la qual hi ha associada una llei de

probabilitat (10).

Les variables aleatòries poden ser continues o

discretes. Una variable contínua és una variable

aleatòria que pot adoptar tots els valors compresos

en un interval finit o infinit (10) (prescindint de

l’arrodoniment); en les ciències de laboratori clínic

aquestes variables prenen qualsevol valor dins d’un

interval finit de valors numèrics reals (els valors

compatibles amb la vida). D’altra banda, una

variable discreta és una variable aleatòria que

només pot adoptar valors aïllats (10); aquests valors

són nombres naturals, valors numèrics ordinals o

valors no numèrics, ordenables o no per la seva

grandària, inclosos els nombres sense significat

numèric o ordinal, les categories, els codis, etc.

Tot aplicant les idees exposades anteriorment sobre

observacions i experiments, es pot afegir que un

problema de relació entre dues o més variables

aleatòries, ja siguin contínues o discretes, és un estudi

observacional, i un estudi de relació entre una o més

variables controlades (o variables dependents) i una o

més variables aleatòries (o variables independents) és

un estudi experimental.



Per acabar de lligar els conceptes, cal destacar que les

variables contínues representen propietats

biològiques amb valors pertanyents a escales

racionals, intervalars, logaritmicointervalars,

fraccionals i algunes ordinals, mentre que les

variables discretes representen propietats biològiques

amb valors pertanyents a escales absolutes,

qualitatives i algunes ordinals (9).

Bibliografia

1. International Organization for Standardization. Terminology work — Vocabulary — Part 1: Theory and application. ISO 1087-1 Geneva: ISO; 2000.

2. Bunge M. Epistemología. Ciencia de la ciencia. Barcelona: Ariel; 1980.

3. Bunge M. Filosofía para médicos. Barcelona: Gedisa; 2012.

4. Fuentes Arderiu X. Systematic terminology for specialities and disciplines related to clinical laboratory. Clin Chem Lab Med 2005;43:667–9.

5. Bunge M. La investigación científica. Barcelona: Ariel; 1985.

6. Popper KR. The Logic of scientific discovery. London: Hutchinson; 1959. [Existeix una traducció al català publicada a Barcelona per Laia el 1985. També existeix una traducció a l’español d’accés lliure a https://rapidshare.com/files/237642066/LA_LOGICA_DE_LA_INVESTIGACION__CIENTIFICA_-_KARL_R._POPPER.pdf (Consultat 2012-12-12)]

7. Fundació Barcelona, Centre de Terminologia TERMCAT. Diccionari de teoria del coneixement. Barcelona: Fundació Barcelona; 1994.

8. Bunge M. Diccionario de filosofia. México: SigloXXI; 2007.

9. Fuentes Arderiu X, Miró Balagué J. Naturalesa de les propietats biològiques examinades al laboratori clínic. In vitro veritas 2011;12:150-9. <http://www.acclc.cat/continguts/ivv135.pdf> (Consultat 2012-12-12).

10. International Organization for Standardization. Statistics — Vocabulary and symbols — Part 1: Probability and general statistical terms. ISO 3534-1. Geneva: ISO; 1993.


__________________________________________________________________________________________

Validació i control de la plausibilitat dels resultats

Xavier Fuentes Arderiu1, María José Castro Castro2, Lourdes Sánchez

Navarro2, Dolors Dot Bach2

1 Consultoria en ciències de laboratori clínic, Barcelona

2 Laboratori Clínic, Hospital Universitari de Bellvitge , L’Hospitalet de Llobregat

_________________________________________________________________________________________

Introducció

Segons els diccionaris generals de la llengua, validar és

«donar per vàlid», «fer vàlid», «donar per bo», i

validació és l’«acció i efecte de validar» (1, 2). D’altra

banda, la norma ISO 9000:2005 defineix validació

com una «confirmació mitjançant l’aportació de

proves objectives de l’acompliment dels requisits per

a una utilització específica o una aplicació prevista»

(3) i el Vocabulari Internacional de Metrologia la defineix

com «verificació en la qual els requisits especificats

són adequats per a un ús determinat» (4). Així,

segons els documents esmentats, en un procés de

validació cal demostrar la validesa, no el contrari; els

subjectes sobre els quals recau el procés són

«presumptes culpables» dels quals s’ha de demostrar

la seva «innocència».

Des del punt de vista qualitològic, qualsevol

inspecció (incloent-hi el control intern de la qualitat)

és un procés capaç de generar dos tipus de

productes: producte conforme (producte vàlid) o producte

no conforme (producte no vàlid). Contràriament, ateses

les diverses definicions, la validació és un procés que

només pot generar un producte: producte vàlid

(producte conforme). Per aquesta raó, hi ha

expressions col·loquials utilitzades al laboratori clínic

que són conceptualment incorrectes. En són

exemples:

—Has «validat» les «glucoses» ?

—És molt tard i encara no he «validat» els

hemogrames.

Aquestes frases, si les llegís algú amb formació

científica (o jurídica), però no iniciat en l’argot del

laboratori clínic, podrien ser interpretades de la


ISSN: 1697-5421

Reflexió-opinió



manera següent:

—Ja has donat per conformes totes les «glucoses» ?

—És molt tard i encara no he donat per conformes

tots els hemogrames.

Però algunes vegades, en aquest procés, pot ser que

alguna «glucosa» o algun hemograma no es donin per

conformes, és a dir, no es validin. Això és degut a

que, com s’ha dit més amunt, els termes validar i

validació s’usen com sinònims d’inspeccionar o inspecció,

respectivament. Aquesta «validació»/inspecció pot

acabar en un resultat1 validat i, per tant, apte per ser

lliurat a qui l’hagi sol·licitat, o en un resultat sospitós

que requereix unes accions finals per tal de decidir si

és vàlid i es lliura, malgrat haver estat sospitós, o si

cal repetir la mesura en una mostra clínica nova.

Òbviament, els termes derivats validació tècnica i

validació facultativa, força utilitzats en el nostre àmbit,

en els que la paraula validació té el sentit d’inspecció,

tampoc són adequats per les raons exposades. Però,

a més a més, aquests termes tenen altres

inconvenients. D’una banda, cap dels dos està

reconegut, ni definit, en cap document consensuat a

escala internacional o nacional. D’altra banda, el

terme «validació tècnica» és inadequat perquè

l’adjectiu tècnica indueix a confusió, ja que es pot

entendre com una inspecció no subjectiva (o no

intuïtiva; relacionada amb la tecnologia), quan en

realitat fa referència a la inspecció de les mostres

clíniques, les accions conseqüents a les alarmes dels

sistemes de mesura i el control intern de la qualitat,

activitats, que habitualment fan els tècnics de

laboratori (encara que aquest estament professional

no sempre és qui s’encarrega de fer-les).

1 En aquest article, per raons de simplicitat, a un valor mesurat, malgrat

no vagi acompanyat de la seva incertesa de mesura, se l’anomenarà

resultat.

Pel que fa al terme «validació facultativa»,

l’ambigüitat terminològica encara és més gran.

L’adjectiu facultatiu/va, es pot utilitzar, i s’utilitza, amb

un sentit totalment diferent, el d’optatiu, com ara

aeròbic facultatiu, que podria donar a algú no iniciat en

l’argot del laboratori clínic una informació totalment

contrària a la que es pretén; i a més, aquesta validació

pot fer-la un sistema informàtic.

L’alternativa terminològicament vàlida per a

«validació facultativa» és control de la plausibilitat. En el

cas de «validació tècnica» és millor abandonar el seu

ús i parlar separadament de l’activitat a què es vulgui

fer referència, com ara les accions derivades de les

alarmes instrumentals.

Així, doncs, tant la denominació «validació tècnica»

com la denominació «validació facultativa» són

totalment inadequades i no aconsellables. No obstant

això, l’ús dels termes validat i validar s’ha de reservar

per indicar la validesa d’un resultat de laboratori

clínic i el permís per al seu lliurament. En la pràctica,

pel que fa als resultats individuals o a un informe de

laboratori clínic, «validar» o «firmar» és el mateix.

La finalitat del control de plausibilitat esmentat és

detectar els resultats sospitosos de ser incorrectes.

Els fets que poden falsejar el resultat de mesura

d’una magnitud biològica i que poden no detectar-se

fins el control de la plausibilitat es descriuen en la

Taula 1 (5). En cap cas el control de la plausibilitat

està relacionat amb els comentaris interpretatius que

es poden incloure en alguns informes de laboratori

clínic.

Abans de fer les mesures, les mostres clíniques

s’inspeccionen per tal de detectar alguns dels fets

esmentats a la Taula 1. Després, durant el procés de

mesura, es tenen en compte els eventuals

advertiments del sistema de mesura (alarmes),



s’aplica el control intern de la qualitat i es comproven

les transcripcions. Si en alguna d’aquestes activitats

es detecta algun error, el procés s’atura i es fan les

correccions oportunes per poder continuar.

Malgrat totes les activitats descrites, poden haver

passat desapercebuts alguns resultats erronis a causa

d’algun dels fets relacionats en la Taula 1, o algun

altre, per la qual cosa cal fer un control que tingui en

compte la plausibilitat dels resultats, entenent per

resultat plausible aquell resultat que es considera

acceptable.

El control de la plausibilitat es pot classificar en

funció del grau d’estandardització del procés:

Sense estandardització o amb estandardització parcial.

L’especialista revisa tots els resultats del

laboratori i aplica els seus propis criteris i límits

per detectar resultats sospitosos i donar per bons

els que no ho siguin. Aquest procés té una part

molt subjectiva i intuïtiva i està basat en un

conjunt de límits d’alerta, de canvi i de predicció

propis, que variaran d’un especialista a un altre, i

d’un moment a un altre del dia. D’altra banda, el

procés pot estar estandarditzat parcialment

aplicant uns límits d’alerta constants, que poden

ser per exemple, els valors de referència

biològics, de manera que l’especialista aplica la

revisió a una sèrie de resultats ja acotats. En

aquest procés, la part subjectiva i intuïtiva

continua encara sent molt gran.

Amb estandardització total. Aplicant uns límits

d’alerta, de canvi i de predicció (o altres eines

que puguin ser útils en el control de la

plausibilitat) fixats de manera objectiva en el

laboratori. Aquest és un sistema de control de la

plausibilitat més sofisticat i que, perquè sigui

efectiu, s’ha d’informatitzar.

Després de cada una d’aquestes formes de control de

la plausibilitat, es produeixen unes accions amb la

finalitat de decidir si un resultat sospitós és erroni o

no.

Control de la plausibilitat no estandarditzat (o parcialment estandarditzat)

El control de la plausibilitat no estandarditzat (o

parcialment estandarditzat) és un procés d’inspecció,

basat en el coneixement, l’experiència i la intuïció

professionals (una mena d’«ull clínic»), realitzat per

un especialista, amb la finalitat de detectar resultats

sospitosos de ser erronis. Cal destacar que cap

organisme científic nacional o internacional ha

recomanat cap sistema control de la plausibilitat de

resultats no estandarditzat (o parcialment

estandarditzat) en l’àmbit de les ciències de laboratori

clínic. Però sí que generalment es recomana, o

s’exigeix legalment, que el procés d’inspecció dels

resultats estigui referendat per la firma de

l’especialista que ha considerat vàlids els resultats que

es lliuren a qui els ha sol·licitat (6).

Aquest control de la plausibilitat s’aplica als resultats

que han superat satisfactòriament el control intern de

la qualitat i als resultats procedents de processos de

mesura als què sovint els laboratoris clínics no

apliquen un control intern de la qualitat (com, per

exemple, les «fórmules leucocítiques manuals»).

El control de la plausibilitat no estandarditzat (o

parcialment estandarditzat) s’acostuma a fer

immediatament abans de firmar (real o virtualment)

el conjunt de resultats corresponents a cada

magnitud biològica (informe de laboratori clínic).

Aquest control de la plausibilitat, com ja s’ha dit més

amunt, sovint és una activitat poc reproduïble degut

a la subjectivitat que envolta aquest procés. Així, en



general cada especialista, segons l’àrea on treballi i els

seus criteris individuals, aplica la inspecció visual de

la forma que creu més adequada.

Durant aquest control de la plausibilitat, solen

buscar-se aquells resultats que criden l’atenció per ser

molt alts o molt baixos, perquè no «lliguen» amb un

altre resultat o perquè no «lliguen» amb el diagnòstic

del pacient o l’origen de la petició. En alguns casos, o

en algunes àrees del laboratori clínic, es compara el

resultat actual amb el resultat anterior, si existeix. Tot

aquest procés es fa d’una manera subjectiva i, per

tant, potencialment diferent per a cada especialista.

Per dur a terme el control de la plausibilitat no

estandarditzat, l’especialista ha de decidir els criteris

que ha d’utilitzar. Hi ha especialistes per als quals el

primer criteri, el més elemental, és tenir en compte si

el resultat inspeccionat és «normal», dins de l’interval

de referència biològic, o «patològic», fora de l’interval

de referència biològic (és el cas freqüent de control

de la plausibilitat parcialment estandarditzat). Si és

«normal» es dóna per bo, es valida, a no ser que

estigui en contradicció aparent amb un altre resultat

o amb el diagnòstic, presumpte o cert, del pacient. Si

és «patològic», cal decidir si és sospitós o no. Això

s’acostuma a decidir segons el judici professional de

cada especialista, sense consultar cap llista on hi

figurin els límits a partir dels quals un resultat es

consideri sospitós. L’esquema habitual de la

inspecció visual dels resultats és:

1. Detecció visual i de resultats sospitosos, basada

en:

a. avaluació intuïtiva de la quantia del

resultat inspeccionat (molt alt o molt

baix);

b. avaluació intuïtiva del canvi respecte al

resultat anterior corresponent a la

magnitud biològica que es tracti, en el

mateix pacient, si n’hi ha;

c. avaluació intuïtiva de la concordança

entre el resultat inspeccionat i altres

resultats obtinguts en la mateixa mostra

clínica;

d. avaluació intuïtiva de la concordança

entre el resultat inspeccionat i el

diagnòstic (presumpte o cert) del

pacient o, en el seu defecte,

l’especialitat del metge sol·licitant o

l’origen de la petició;

2. Si es troba un resultat sospitós, es fa una

inspecció final, duent a terme les accions

següents:

a. repetició de la mesura en la mateixa

mostra clínica i avaluació intuïtiva de la

diferència entre els resultats;

b. accions correctives sobre els sistemes

de mesura en el cas de sospita d’algun

problema durant el procés de mesura;

c. sol·licitud d’informació sobre

l’obtenció de la mostra clínica i

avaluació d’aquesta informació;

3. Avaluació intuïtiva conjunta de totes les

avaluacions anteriors i, com a conseqüència,

validació del resultat sospitós o no validació i

sol·licitud d’una mostra clínica nova.

Pel que fa al punt 1, com ja s’ha comentat més

amunt, una pràctica habitual d’alguns especialistes és

donar per vàlids els resultats «normals». Això

implica que, qui ho fa, dedica més atenció als

resultats patològics que els fisiològics la qual cosa, al

seu torn, implica que es considera més perillós un

fals positiu que un fals negatiu. Però, hi ha raons

perquè això sigui així? En realitat no existeix cap raó

perquè un resultat que estigui dins de l’interval de



referència biològic deixi de ser sospitós d’estar

falsejat. És per aquest motiu que tots els resultats

s’han de sotmetre al control de la plausibilitat.

Del punt 1d s’ha de destacar que, en general, la

concordança va a favor de validar el resultat (5). En

el cas particular dels resultats fisiològics, qualsevol

d’aquests resultats és compatible amb qualsevol

diagnòstic o procedència, excepte si es tracta de

magnituds biològiques patognomòniques. En la

Taula 2 es presenten tres exemples ficticis de

resultats validats tenint en compte aspectes

clinicobiològics.

Control de la plausibilitat estandarditzat

Actualment hi ha força laboratoris clínics que

generen més de mil informes de laboratori clínic

diàriament, els quals contenen milers de resultats. És

obvi que aquests laboratoris clínics només poden

aplicar un control de la plausibilitat estandarditzat als

milers de resultats esmentats.

Però fins i tot els laboratoris clínics que maneguin

quantitats de resultats molt més petites, haurien de

fer un control de la plausibilitat no subjectiu, no

intuïtiu, científic, és a dir estandarditzat. Per això cal

que aquest control estigui informatitzat, tal com ho

recomana la norma ISO 15189:2012 (7). Però només

una minoria d’aquests laboratoris clínics tenen

implantat un control de la plausibilitat informatitzat.

Quan existeix un control intern de la qualitat, des del

punt de vista metrològic un resultat es pot considerar

vàlid si el sistema de mesura amb què s’ha obtingut

genera un error de mesura inferior o igual al màxim

permès en el laboratori clínic que es tracti. I des del

punt de vista general —no només el metrològic— es

pot considerar validat si, a més a més, ha superat

satisfactòriament el control de la plausibilitat.

El control de la plausibilitat estandarditzat i

informatitzat s’aplica als resultats que han superat

satisfactòriament el control intern de la qualitat i

també als resultats procedents de processos de

mesura als que sovint els laboratoris clínics no

apliquen un control intern de la qualitat (com per

exemple les «fórmules leucocítiques manuals»).

D’acord amb el concepte de validació definit per la

norma ISO 9000:2005 (3), per donar per bo un

resultat cal aportar proves objectives de

l’acompliment dels requisits. Fent una analogia

jurídica, cal demostrar que un resultat és «innocent»,

és a dir, que «no és sospitós» (aquí la presumpció

d’innocència no funciona!). Es pot interpretar que les

proves objectives són les següents:

1. Absència de no conformitats en la inspecció de

les mostres.

2. Absència de no conformitats en el control intern

de la qualitat (aplicat a resultats no relacionats

amb no conformitats del punt anterior).

3. Absència de no conformitats en el control de la

plausibilitat (aplicat a resultats no relacionats

amb no conformitats dels punts 1 i 2).

En primera instància tots els resultats, malgrat hagin

superat satisfactòriament els punts 1 i 2 descrits al

paràgraf anterior, són sospitosos de ser erronis i, per

tant, a tots ells se’ls ha d’aplicar el control de la

plausibilitat estandarditzat i informatitzat. A partir

d’aquest control, uns deixen de ser sospitosos i es

lliuren a qui els ha sol·licitat, i altres continuen sent

sospitosos i cal sotmetre’ls a una inspecció final.

En aquest context, s’entén per control de la

plausibilitat el «conjunt de procediments usats per

decidir amb criteris clinicobiològics si un resultat és

vàlid o és sospitós de ser erroni». El control de la

plausibilitat informatitzat, tal com ho reconeix la



norma ISO 15189:2012 (7), és una activitat científica,

basada en decisions convencionals, arbitràries però

consensuades. Els resultats que superen

satisfactòriament el control de la plausibilitat

estandarditzat són resultats plausibles, acceptables,

sobre els que no hi ha cap raó objectiva per no

lliurar-los a qui els ha sol·licitat.

El control de la plausibilitat estandarditzat i

informatitzat consisteix, essencialment, en un

algorisme que comprova si cada resultat:

1. està dins d’un interval d'alerta preestablert (8),

2. té una diferència relativa amb el corresponent

resultat anterior, si n’hi ha, que està dins d’un

interval preestablert (correspon a l’anomenat

delta check en la bibliografia anglòfona) (8),

3. està dins de l’interval de predicció preestablert

per a cada magnitud biològica correlacionada, si

s’escau (correspon a l’anomenat

konstellationkontrolle en la bibliografia

germanòfona) (9),

4. si hi ha concordança amb el diagnòstic

(presumpte o cert) del pacient, o la procedència

de la petició; encara que sempre que es considera

que aquesta concordança existeix va a favor de

donar per bo el resultat (5), per la qual cosa, i per

la dificultat de construir aquesta part de

l’algorisme, probablement seria millor no tenir

en compte aquest punt. [Una possibilitat per

decidir la concordança amb el diagnòstic seria

utilitzar el llibre de Young i Friedman sobre

variabilitat deguda a malalties (10).]

Si aquests criteris s’apliquen de forma no

informatitzada, com és el cas de la inspecció visual

feta pels especialistes, les decisions són subjectives;

no es consulten llistes amb els límits esmentats per

decidir si un resultat és sospitós o no ho és. D’altra

banda, en cas que aquestes llistes existissin, evitarien

la subjectivitat però caldria invertir en aquest procés

una quantitat de temps de dedicació enorme

(habitualment no disponible) per part dels

especialistes. Des d’aquest punt de vista, l'única

manera d’aconseguir un control de la plausibilitat

factible és informatitzant-lo.

Cal insistir en que la finalitat del control de la

plausibilitat és detectar resultats sospitosos de ser erronis

degut a alguna causa no detectada anteriorment.

Posteriorment a la detecció d’aquests resultats

sospitosos de ser erronis, cal esbrinar, amb una

inspecció final en la que es buscarà informació

addicional, si els resultats sospitosos són erronis o no

ho són.

Dissortadament, hi ha alguns processos de mesura

que no solen estar sotmesos al control intern de la

qualitat esmentat, com ara els mesuraments

relacionats amb el sediment urinari o les «fórmules

leucocítiques manuals», entre d’altres. En aquests

casos el control de la plausibilitat informatitzat pot

ajudar a garantir la fiabilitat dels mesuraments.

Actualment el control de la plausibilitat és d’interès

en el camp de la informàtica aplicada al laboratori

clínic tal i com es va posar de manifest en el IV

Simpòsium Europeu sobre El Laboratori clínic i la

Indústria del diagnòstic in vitro, en el que un 66 %

dels assistents van manifestar el seu interès per

disposar d’un sistema informàtic que els permetés fer

un control de la plausibilitat informatitzat (11). Així

mateix l’any 2012, al X Congrés Català de Ciències

de Laboratori Clínic va haver-hi una ponència

titulada Informatització de la revisió final dels resultats de

mesura en el laboratori clínic (12).



Bibliografia

1. Institut d’Estudis Catalans. Diccionari de la llengua catalana. <http://dlc.iec.cat> (accés: 2013-01-18).

2. Enciclopèdia Catalana. Gran Diccionari de la Llengua Catalana. <http://www.enciclopedia.cat> (accés: 2013-01-18).

3. Organització Internacional de Normalització. Sistemes de gestió de la qualitat. Principis bàsics i vocabulari. ISO 9000:2005. Madrid: AENOR; 2006.

4. Comissió Electrotècnica Internacional, Cooperació Internacional per a l’Acreditació de Laboratoris, Federació Internacional de Química Clínica i Ciències de Laboratori Clínic, Oficina Internacional de Pesos i Mesures, Organització Internacional de Metrologia Legal, Organització Internacional per a la Normalització, Unió Internacional de Física Pura i Aplicada, Unió Internacional de Química Pura i Aplicada. Vocabulari internacional de metrologia. Conceptes fonamentals i generals i termes associats. VIM 3a ed. Barcelona: ACCLC; 2012.

5. Associació Catalana de Ciències de Laboratori Clínic. Guia per a la revisió final dels resultats de mesura en el laboratori clínic. In vitro veritas 2008;9: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv102.pdf> (accés: 2013-01-18).

6. Generalitat de Catalunya. Decret 76/1995, de 7 de març, pel qual s'estableixen el procediment específic d'autorització administrativa dels laboratoris clínics i les normes reguladores de les activitats que s'hi realitzen. Diari Oficial de la Generalitat 1995; (2031): 2555-7.

7. International Organization for Standardization. Medical laboratories – particular requirements for quality and competence. ISO 15189:2012. Geneva: ISO, 2012.

8. Castro-Castro MJ, Dot-Bach D, Candás-Estébanez B, Cano-Corres R, Fuentes-Arderiu X. Estimation of alert and change limits and its application in the plausibility control. Accred Qual Assur 2011;16:643-7.

9. Castro-Castro MJ, Candás-Estébanez B, Solé-Enrech G, Fuentes-Arderiu X. Use of prediction equations for reviewing measurement results in the clinical laboratory. Accred Qual Assur 2009;14:525–8.

10. Young D, Friedman E. Effects of disease on clinical laboratory test. Washington: AACC; 1997.

11. Queraltó Compañó JM, Bosch Ferrer MÀ, Bedini Chesa JL, Raventós Monjo J, Fuentes Arderiu X. Informe del IV Simpòsium Europeu sobre El Laboratori Clínic i la Indústria del diagnòstic in vitro: «Informàtica al Laboratori Clínic» Barcelona, 1 i 2 de març de 2007. In vitro veritas 2008;9: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv105.pdf> (accés: 2013-02-12).

12. Solé Enrech G, dir. Actes del X Congrés Català de Ciències de Laboratori Clínic. Barcelona: ACCLC; 2013.

http://dlc.iec.ca/

http://www.enciclopedia.cat/

http://www.acclc.cat/continguts/ivv102.pdf


__________________________________________________________________________________________

El centenari del Primer Congrés de Metges i

Biòlegs de Llengua Catalana

Joan Nicolau Costa

Departament d'Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció, Institut Universitari Dexeus,

Barcelona

_________________________________________________________________________________________

Introducció

El 1903 se celebra el Primer Congrés de Metges i

Biòlegs de Llengua Catalana. El fet que les ponències

estiguin dedicades al valor semiològic de l'examen de

la sang, o, d'acord amb la parla de l'època, la «Valúa

semeiológica del examen de la sang», pot ser d'interès

pels professionals de les ciències de laboratori clínic.

Des d'aquesta perspectiva, i no des de la perspectiva

de l'historiador, en aquest article comentaré diversos

aspectes del congrés.

El Context

A principis del segle vint, s'inicia a Catalunya el

període conegut com el Noucentisme, el qual abasta

tots els àmbits de la vida pública durant el primer

terç del segle. És un moviment polític i cultural que

es manifesta en molts camps: el polític, el social,

l’artístic, l’urbanístic i també el sociosanitari (1).

Així, al llarg d'aquest període, es creen nous

hospitals, per exemple: l'Hospital de la Santa Creu i

Sant Pau, la Quinta de Salut "La Alianza", l'Hospital

Clínic i Provincial, la Casa Provincial de Maternitat,

l'Hospital Creu Roja i l'Hospital de l'Esperança (2).

La medicina també inicia un període de

transformacions i avenços que és conegut per alguns

estudiosos amb el nom de la medicina noucentista. El

col·lectiu mèdic té un ideal de progrés i

modernització i utilitza la llengua catalana per a la

comunicació científica, tant en les publicacions com

en els congressos.

Publicacions, congressos i normalització lingüística

De les diverses publicacions mèdiques d'aquest

període, destaquen els Annals de Medicina. Butlletí de


ISSN: 1697-5421

Història



l'Acadèmia i Laboratori de Ciències Mèdiques de Catalunya,

que s'imprimeix des del 1907 fins el 1938. La primera

revista escrita en llengua catalana, però, és anterior.

Es tracta de La Gynecologia Catalana apareguda el 1898

i de curta durada (3). En aquest mateix any també es

lliura la primera comunicació en aquesta llengua, a

l'Acadèmia i Laboratori de Ciències Mèdiques de

Catalunya, titulada «La sífilis a l'Edat Mitjana» (4).

Pel que fa als congressos, encara que no són

estrictament mèdics, en primer lloc cal citar el Primer

Congrés Universitari Català de l'any 1903, que agrupa

més de mil dos-cents congressistes (3). L'any 1906,

amb la participació de tres mil congressistes, se

celebra el Primer Congrés Internacional de la

Llengua Catalana. En aquest congrés es presenta la

ponència «Necessitat de reconstituir el llenguatge

mèdich-biològic catalá».

Ja en l'àmbit de les ciències de la salut, també el 1906,

se celebra el Primer Congrés d'Higiene de Catalunya,

organitzat per l'Acadèmia d'Higiene de Catalunya,

amb una orientació social (5). A les tres seccions del

congrés s'estudia la sanitat a les comarques, les

malalties infeccioses i la higiene social.

En relació a la utilització de la llengua, manquen les

normes ortogràfiques i manca el lèxic que ha estat

creat pel progrés científic arreu del món. El

llenguatge científic emprat és arcaic i amb moltes

deficiències. A fi de normalitzar-ne l'ús, l'any 1913,

l'Institut d'Estudis Catalans publica les Normes

ortogràfiques. L'any 1917, publica el Diccionari ortogràfic,

sota la direcció de Pompeu Fabra. L'enginyer

industrial i filòleg és l'autor de la Gramàtica Catalana,

adoptada per l'Institut d'Estudis Catalans, i

finalment, el 1932, del Diccionari general de la llengua

catalana, considerat normatiu (4).

El Primer Congrés de Metges i Biòlegs de

Llengua Catalana

Abans de la celebració del congrés, l'Acadèmia i

Laboratori de Ciències Mèdiques de Catalunya

aprova el reglament de la convocatòria. En l'article

primer es precisa el seu abast.

«Poden ser reunionistes: A, numeraris i tots els

metjes, farmacéutics y veterinaris residents en a)

qualsevol lloc de Catalunya, Valencia, Balears,

Roselló, Provença, Alguer (Cerdenya) y en els

d'Aragó que s'hi parli [ ... ]. B, reunionistes adjunts; a)

els estudiants de Medicina y Farmacia de les Escoles

de Barcelona, Valencia, Montpeller y Tolosa; b)

tothom que s'interessi pel progrés de les Ciències

Médiques [ ... ]» (4).

Aquest primer congrés s'anomena inicialment

Primera Reunió de Metges de Llengua Catalana. Però

la convocatòria no va dirigida únicament als metges.

Es repeteix aquesta intenció en l'encapçalament de la

Lletra de Convit, on es diu literalment: «Lletra de

convit, adressada als metges, farmacéutics y

veterinaris [...]» (6).

El congrés se celebra els dies 22, 23, 24 i 25 de juny

de 1913, a la Facultat de Medicina de Barcelona.

Consta d'un tema general dedicat al valor semiològic

de l'examen de la sang, unes comunicacions sobre la

febre tifoide i les complicacions sèptiques dels

traumatismes, i unes comunicacions lliures (5).

En el discurs inaugural, el President, Miquel A.

Fargas i Roca, constata el canvi que s'està produint

en l'àmbit de l'investigació mèdica. S'està

evolucionant de l'estudi de l'estructura dels teixits a

l'estudi de la sang en sentit ampli, incloent del seu

valor semiològic i els seus components.



El tema general es divideix en nou capítols dedicats a

la «història», la «citologia i hemoglobina», la

«viscosimetria», la «coagulació», l'«examen químic»,

l'«hematologia comparada», l'«examen legal», el

«paràsit i bacterioscòpia» i la «serologia, immunitat i

anafilaxia». A l'època, les subespecialitats mèdiques i

quirúrgiques no estan encara desenvolupades, i, per

tant, els temes són presentats habitualment per

metges internistes o cirurgians generals experts.

Entre les ponències es troben, per exemple, el «Valor

semeiològic de la glucosa de la sang», o el «Valor

semeiològic de l'examen de l'urea de la sang» o la

«Contribució a l'estudi de la reacció de Wassermann»,

entre d'altres.

Hi assisteixen més de cinc-cents congressistes. La

presència dels congressistes valencians queda

il·lustrada per la seva pertinença a la Presidència

d'Honor i per l'autoria de diverses ponències. Per

exemple, la primera, de caràcter històric, titulada «Un

hematòleg valencià del segle XV», o altres, com les

titulades «La leucocitosi leucoblàstica-

promielocítica», «L'hematologia comparada» o «La

parasitologia de qualques febres palúdiques

irregulars» (7). Una representació de La Gazette

Catalane de Perpinyà figura entre els signants dels

estatuts de l'Associació de Metges de Llengua

Catalana que es crea en clausurar el congrés i que és

l'encarregada d'organitzar els congressos següents (8).

En aquests estatuts es fa constar que poden ser socis

els metges i els biòlegs (9). En la primera meitat de

segle, a les universitats encara no existeixen els

estudis de biologia amb el nom que tenen avui en

dia. Però s'aplica el nom de biologia, en sentit ampli,

a la branca de la ciència que estudia les funcions dels

organismes. La utilització del nom permet incloure

professionals relacionats amb la pràctica mèdica. La

mateixa associació passarà a dir-se posteriorment

Associació de Metges i Biòlegs de Llengua Catalana.

Fins i tot els congressos canvien, més endavant, el

nom.

L'evolució dels congressos

Les dates de celebració dels congressos posteriors

reflecteixen les circumstàncies polítiques, incloent

dos períodes de suspensió. Les dates i seus de

celebració són les següents: 1917, Barcelona; 1919,

Tarragona; 1921, Girona; 1923, Lleida; 1930,

Barcelona; 1932, Ciutat de Mallorca; 1934,

Barcelona; 1936, Perpinyà; 1976, Perpinyà; 1980,

Reus; 1984, Benicàssim-Castelló de la Plana; 1988,

Andorra; 1992, Ciutat de Mallorca; 1996, Lleida;

2000, Barcelona; 2004, València (10).

En una primera etapa dels congressos hi participen

principalment metges acompanyats, en alguns casos,

per uns pocs farmacèutics i veterinaris.

Posteriorment, s'hi incorpora un ventall de

professions incloent biòlegs, farmacòlegs,

bioquímics, estadístics, informàtics, etc. Aquest canvi

reflecteix l'evolució de l'assistència sanitària, que

requereix la col·laboració progressiva de

professionals provinents d'àmbits diversos (11).

També, en els congressos es tracten temes socials i

sanitaris més generals, a la vegada que les

especialitats i subespecialitats mèdiques es van

desenvolupant.

Conclusió

En la comunicació titulada «El futur dels

Congressos: cap a on podem anar», llegida en l'acte

commemoratiu "Els Congressos de Metges i Biòlegs

de Llengua Catalana: passat, present i futur", del

2012, es fa una anàlisi de la situació actual d'aquestes

reunions. A continuació cito els problemes tractats

(12).



Els progressos dels coneixements mèdics han anat en

direcció a una especialització creixent i per tant els

congressos generals tindrien menys interès i, en

canvi, els de les especialitats estan creixent. Les

ciències bàsiques, no estrictament mèdiques, també

han adquirit tal importància que poden convocar els

seus propis congressos (per exemple, la genètica o la

immunologia). A més, la llengua anglesa s'imposa

arreu en el món de la comunicació científica en

detriment d'altres llengües. Tots aquests fets fan que,

possiblement, s'hagi de reflexionar sobre el format de

les properes convocatòries per garantir la seva

continuïtat. Entre les opcions hi ha, per exemple,

convocar congressos en un format més petit, utilitzar

el format digital més àmpliament, o agrupar els

congressos d'àrees especialitzades.

En aquest article, a banda del fet commemoratiu del

Primer Congrés de Metges i Biòlegs de Llengua

Catalana i de l'interès del programa, he volgut insistir

en la pluridisciplinarietat dels assistents i l'abast del

seu origen geogràfic. Però, també, les consideracions

sobre l'evolució dels congressos són rellevants en

l'àmbit de les ciències de laboratori clínic.

Referències

1. Sabaté Casellas, F. Noucentisme: ciutat i salubritat (Barcelona 1900-1929). Gimbernat: revista catalana d'història de la medicina i de la ciència 2007;48:39-47.<http://www.raco.cat/index.php/Gimbernat/article/view/123315/171106> (Accés: 2013-01-23).

2. Sabaté Casellas F. Trets característics de la medicina noucentista. Gimbernat: revista catalana d'història de la medicina i de la ciència 1988;10:291-302 <http://www.raco.cat/index.php/Gimbernat/article/view/44003/54019> (Accés: 2013-01-23).

3. Casassas O. Els antecedents: la presa de consciència del tombant de segle. De Valentí Almirall a Prat de la Riba. Del Primer Congrés Internacional de la Llengua Catalana al Primer Congrés d'Higiene de Catalunya. A: Ramis J, dir. Els congressos de metges i biòlegs de llengua catalana: gairebé un segle.

Barcelona: Fundació Uriach; 1996. p. 35-41. [ISBN 84-87452-26-4] (B-19.103-96).

4. Sans Sabrafen J. L'evolució de l'ús del català en medicina a Catalunya durant el segle XX. Barcelona: Institut d'Estudis Catalans; 2002. [ISBN 84-7283-621-5] (B. 20426-2002).

5. Casassas O. La medicina catalana del segle XX. Barcelona: Edicions 62; 1970. (B. 22.803-1970).

6. Calbet Camarasa JM. L'Associació General de Metges de Llengua Catalana. Gimbernat: revista catalana d'història de la medicina i de la ciència 1999;31:133-48 <http://www.raco.cat/index.php/Gimbernat/article/view/44742/54506> (Accés: 2013-01-23).

7. Balaguer E. L'aportació valenciana als Congressos de Metges de llengua Catalana. A: Ramis J, dir. Els congressos de metges i biòlegs de llengua catalana: gairebé un segle. Barcelona: Fundació Uriach; 1996. p. 367-83. [ISBN 84-87452-26-4] (B-19.103-96).

8. D'Oc M. La Catalunya del Nord i més enllà, encara. A: Ramis J, dir. Els congressos de metges i biòlegs de llengua catalana: gairebé un segle. Barcelona: Fundació Uriach; 1996. p. 394-7. [ISBN 84-87452-26-4] (B-19.103-96).

9. Casassas O. Aportació dels congressos de metges i biòlegs de llengua catalana a la història de la medicina i a qüestions sanitàries i de medicina col·lectiva. A: Ramis J, dir. Els congressos de metges i biòlegs de llengua catalana: gairebé un segle. Barcelona: Fundació Uriach; 1996. p. 328-38. [ISBN 84-87452-26-4] (B-19.103-96).

10. Fundació Alsina i Bofill. Congressos de Metges i Biòlegs de Llengua Catalana (CMBLC). <http://blocs.iec.cat/fab/congressos-de-metges-i-biolegs-de-llengua-catalana-cmblc/>(Accés: 2013-02-08)

11. Laporte J. L'abast de les convocatòries: de les ciències de la salut a les ciències de la vida. La pluridisciplinarietat. A: Ramis J, dir. Els congressos de metges i biòlegs de llengua catalana: gairebé un segle. Barcelona: Fundació Uriach; 1996. p. 343-5. [ISBN 84-87452-26-4] (B-19.103-96).

12. Corbella J. Els Congressos de Metges de Llengua Catalana. Podem permetre una nova aturada? Enfocament de futur. Revista de la Reial Acadèmia de Medicina de Catalunya 2012;27:110-2. [ISSN: 1133-32866].


__________________________________________________________________________________________



Estadístics i paràmetres usats en les ciències de

laboratori clínic per a variables contínues

Preparat per:

José Manuel González de Aledo Castillo, Ariadna Arbiol Roca

Laboratori Clínic, Hospital Universitari de Bellvitge, L’Hospitalet de Llobregat

_________________________________________________________________________________________

Estadístics i paràmetres de tendència central

Els estadístics i els paràmetres de tendència central

mostren quins són els valors numèrics al voltant dels

quals s’agrupen les dades d’una mostra poblacional o

d’una població i es classifiquen com s’indica a la

Figura 1.

Com que la situació més freqüent és tractar amb

mostres poblacionals, i no amb poblacions, en aquest

text es parlarà només d’estadístics, donant per entès

que si es tracta d’una població, s’està fent referència a

un paràmetre.

_____________________________________________ 1

Membres de la Secció d’Estadística i Metrologia durant la preparació d’aquest document: A. Blanco Font, B. Candás Estébanez, X. Fuentes Arderiu (president), M. Martínez Casademont, M. Mosquera Parrado, J.M. Queraltó Compañó, L. Rami Brualla, R. Rigo Bonnin, H. Valbuena Parralejo. _____________________________________________

Figura 1. Esquema dels estadístics o paràmetres de tendència central més utilitzats al laboratori clínic per a les variables contínues.

Mitjana aritmètica simple

La mitjana aritmètica simple o, simplement, mitjana

és la «suma de valors numèrics dels ítems d’una

mostra poblacional, o d’una població, dividida pel

nombre d’aquests valors» (1). Només és aplicable pel


ISSN: 1697-5421

Document docent

43 José Manuel González de Aledo Castillo In vitro veritas 2013; 14:42-48


tractament de valors pertanyents a escales racionals,

intervalars, fraccionals i absolutes, encara que la

mitjana en aquestes últimes és fictícia, ja que els

integrants de les escales absolutes han de ser

nombres enters (3), i es calcula de la forma següent:

n

xxxxx

nx ni

n

i

i

......1 21

1

on x és la mitjana mostral, (si fos poblacional el

símbol seria µ), ix és qualsevol dels valors numèrics

individuals i n és el nombre d’aquests valors.

La mitjana és l’estadístic de tendència central més

utilitzat. És sensible a qualsevol canvi en les dades; és

per això que és útil com a detector de les seves

variacions. Degut al seu rigor matemàtic, és emprada

sovint en altres càlculs estadístics, i representa el

centre de gravetat d’un conjunt de dades. Pel

contrari, és sensible als valors numèrics extrems i no

és recomanable utilitzar-la quan la distribució de les

dades és asimètrica.

Una de les aplicacions més destacades de la mitjana

aritmètica al laboratori clínic està relacionada amb el

control intern de la qualitat. A l’hora d’assignar valors

numèrics a les magnituds que es mesuren en un

material de referència (de control) no valorat, el

laboratori obté una mitjana aritmètica [així com una

desviació estàndard i un coeficient de variació dels

que es tractarà més endavant]. A partir d’aquesta

mitjana es pot establir l’interval de control amb el

que s’haurà de comparar el valor mesurat en el

material de control.

Exemple:

Es vol saber la mitjana de la concentració en

substància d’ió sodi en el plasma d’un pacient que

porta tres dies ingressat a l’hospital i durant aquest

temps se li han fet deu extraccions de sang. Les

concentracions en substància d’ió sodi en plasma

són: 140, 140, 135, 147, 141, 140, 128, 138, 120 i 159

mmol/L. La mitjana aritmètica és 138,8 mmol/L.

Mitjana aritmètica ponderada

La mitjana aritmètica ponderada o, simplement,

mitjana ponderada, és la «suma dels productes de

cada valor numèric pel nombre de valors

corresponent, dividit per la suma de tots els nombres

de valors numèrics» (1). La mitjana ponderada

s’utilitza quan no hi ha el mateix nombre de valors

numèrics de cadascuna de les dades considerades, i

per calcular-la s'empra la fórmula següent:

ni

nnii

n

i

i

n

i

ii

nnnn

nxnxnxnx

n

nx

x

......

......·

21

2211

1

1w

on wx representa la mitjana ponderada, ix són els

valors numèrics individuals i in és el nombre de

cadascun d’aquests valors.

Un exemple d’ús és l’estimació de la mitjana

aritmètica anual a partir de les mitjanes mensuals dels

valors mesurats d’una magnitud en un material de

control, quan cada mes s’obté un nombre de valors

mesurats diferent.

En el cas que hi hagi el mateix nombre de valors

numèrics de cadascuna de les dades, aquesta mitjana

pot ser una mitjana de mitjanes.

Pel que es refereix a la seva aplicació, aquesta mitjana

té les mateixes limitacions que la mitjana aritmètica

simple.

In vitro veritas 2013; 14:42-48 José Manuel González de Aledo Castillo 44


Mitjana aritmètica truncada

La mitjana truncada és la mitjana aritmètica

obtinguda després d’eliminar una part dels valors

numèrics més baixos i més alts. Així, una mitjana

truncada al 10 %, és la mitjana aritmètica del 90 %

dels valors numèrics centrals, descartant el 5 % dels

valors numèrics més elevats i el 5 % dels més baixos.

És útil per eliminar l’efecte de possibles valors

numèrics aberrants.

Pel que es refereix a la seva aplicació, aquesta mitjana

té les mateixes limitacions que la mitjana aritmètica

simple.

Mitjana geomètrica

La mitjana geomètrica d’un conjunt d’n valors

numèrics és l’arrel n-èssima del producte de cadascun

d’ells en valor absolut. La mitjana geomètrica d’un

conjunt de nombres positius és sempre menor o

igual que la mitjana aritmètica. Considera tots els

valors numèrics del conjunt i és menys sensible als

valors numèrics extrems que la mitjana aritmètica.

Presenta un significat estadístic menys intuïtiu que la

mitjana aritmètica i el seu càlcul és més laboriós.

La seva fórmula és la que es presenta a continuació:

nni

nn

i

i xxxxxx1

21

1

1

g ·...··...··

on gx representa la mitjana geomètrica, ix és

qualsevol dels valors numèrics (prescindint del seu

signe) i n és el nombre d’aquests valors.

Una de les poques aplicacions de la mitjana

geomètrica al laboratori clínic, recomanada pel

Comitè Internacional de Normalització en

Hematologia i el Comitè Internacional de Trombosi i

Hemostàsia, és l’assignació d’un temps mitjà de

coagulació del plasma induït pel factor tissular

(«temps de protrombina») a una barreja de 20 o més

mostres de plasma procedents de voluntaris

presumptament sans. Aquesta barreja de plasmes

serveix per calibrar els sistemes de mesura

corresponents. .

Mitjana quadràtica

La mitjana quadràtica d’un conjunt d’n valors

numèrics és l’arrel quadrada de la suma de valors

numèrics elevats al quadrat dels ítems d’una mostra

poblacional, o d’una població, dividida pel nombre

d’aquests valors. La seva fórmula és:

n

xxxxx

nx ni

n

i

i

222

2

2

1

1

2q

......1

on qx és la mitjana quadràtica, ix és qualsevol dels

valors numèrics individuals i n és el nombre

d’aquests valors.

La mitjana quadràtica és molt útil quan es vol obtenir

informació d'una variable que pot adoptar valors

positius i negatius, i per tant donar lloc a una mitjana

de valor nul o pròxim a zero. En les ciències de

laboratori clínic, la mitjana quadràtica té interès

aplicat en el camp del control intern de la qualitat i és

la base del control estadístic de la qualitat aplicat

oficialment al laboratori clínic a Alemanya (5).

Mediana

La mediana és el valor que divideix un conjunt de

valors ordenats en dues parts, amb el mateix nombre

de valors a cada part. La mediana coincideix amb el

fractil 0,5 (1), com es comentarà més endavant.

Només es pot calcular per a variables quantitatives.



Si el nombre de valors (n) és senar, la mediana és el

valor que ocupa la posició (n + 1) / 2 una vegada que

les dades han estat ordenades (en ordre creixent o

decreixent).

Si n és parell, la mediana és la mitjana aritmètica de

les dues dades que estan al centre de la mostra

poblacional i ocupen les posicions n / 2 i (n / 2) + 1.

No és sensible als valors extrems, inclosos els

eventuals valors aberrants. L’ús d’aquest estadístic és

recomanable per a distribució de dades asimètriques,

encara que no té el rigor matemàtic de la mitjana

aritmètica.

Partint de les dades de l’exemple anterior de la

mesura de la concentració en substància de l’ió sodi

en el plasma, els valors mesurats ordenats de menor a

major són: 120, 128, 135, 138, 140, 140, 140, 141,

147 i 159 mmol/L. Com que el nombre de valors

numèrics és parell la mediana serà la mitjana

aritmètica entre els valors numèrics de les posicions 5

i 6, és a dir, 140 mmol/L.

Moda

La moda indica el valor més freqüent d’un conjunt de

valors numèrics. En el cas de que dos valors

presentin la mateixa freqüència, es diu que la mostra

poblacional, o la població, és bimodal; si hi hagués

més de dues modes la mostra poblacional, o la

població, seria multimodal.

L’interval modal és aquell interval que presenta la

major freqüència absoluta. La moda, quan les dades

estan agrupades, és un punt que divideix a l’interval

modal en dues parts.

La moda es pot estimar per un càlcul senzill i

d’interpretació molt clara. Al dependre només de les

freqüències, pot estimar-se per a tota mena de

variables, incloses les discretes. És per això que és

l’estadístic més utilitzat quan al descriure una mostra

poblacional no és possible calcular altres estadístics

de tendència central. No sempre es situa cap al centre

de les dades.

En l’exemple citat anteriorment la moda és 140

mmol/L, el valor més repetit.

Estadístics o paràmetres de dispersió

Tal com s’ha dit en el primer apartat d’aquest

document docent, es parlarà només d’estadístics de

dispersió, donant per entès que si es tracta d’una

població, s’està fent referència a un paràmetre de

dispersió.

Des del punt de vista estadístic, la dispersió és el grau

de distanciament d’un conjunt de valors respecte la

seva tendència central. Els estadístics de dispersió

mostren la variabilitat de les dades dins d’una mostra

poblacional, és a dir, permeten conèixer

quantitativament si els diferents valors numèrics

d’una variable estan molt allunyats entre si. A la

Figura 2 es presenta una classificació d’aquests

estadístics.

Els estadístics de dispersió donen una perspectiva

sobre un conjunt de valors numèrics complementària

a la que donen els estadístics de tendència central.

Per exemple, si en un conjunt de dades numèriques

Figura 2. Esquema dels estadístics o paràmetres de

dispersió més utilitzats al laboratori clínic per a les

variables contínues.



d’una població particular on la mitjana de la

concentració de substància d’ió potassi en el plasma

és 4,64 mmol/L, es pot arribar a pensar que hi ha

persones dins de la mateixa en les que aquesta

concentració pot ser 7,01 mmol/L i d’altres en les

que pot ser 1,93 mmol/L. Si en aquest cas, a més a

més de la mitjana aritmètica, es disposés d’un

estadístic de dispersió, la informació seria molt més

completa.

En les ciències de laboratori clínic els estadístics de

dispersió són imprescindibles per tal de comprendre

teories i conceptes fonamentals com ara la teoria dels

errors de mesura, la incertesa de mesura, el control

de la qualitat, la variabilitat biològica, la teoria dels

valors de referència biològics, entre d’altres.

Desviació

Per a un conjunt de valors numèrics, la desviació és

la diferència entre un valor obtingut i la mitjana

aritmètica. És un estadístic de dispersió de cada valor

numèric que té en compte tots els valors numèrics

del conjunt en qüestió. Matemàticament:

xxDesviació i

on ix representa qualsevol valor numèric i x la

mitjana mostral.

En metrologia el concepte d’error de mesura és molt

proper al concepte estadístic de desviació.

Variància

Per a un conjunt de valors numèrics, la variància

(símbol 2s quan és un estadístic o

2 quan és un

paràmetre) queda definida per la fórmula següent (1):

n

i

i xxn

s1

22 )(1

on 2s representa la variància mostral, ix cadascun

dels valors numèrics, x la mitjana mostral i n el

nombre de valors.

La variància és un estadístic (o un paràmetre) molt

relacionat amb el concepte metrològic de precisió de

mesura, propi dels valors mesurats i dels sistemes de

mesura. Des d’aquest punt de vista, destaquen les

propietats homoscedasticitat i heteroscedasticitat dels

sistemes de mesura. Si la variància és constant sigui

quin sigui el valor de la magnitud mesurada, la

propietat d’un sistema de mesura s’anomena

homocedasticitat; si pel contrari, la variància varia

segons el valor de la magnitud mesurada, la propietat

s’anomena heteroscedasticitat.

Desviació estàndard

Per a un conjunt de valors numèrics, la desviació

estàndard (símbol s quan és un estadístic—que

també s’anomena desviació estàndard

experimental— o quan és un paràmetre) queda

definida per la fórmula següent (1):

2ss

on s representa la desviació estàndard i 2s la

variància.

La desviació estàndard és l’estadístic de dispersió més

utilitzat en les ciències de laboratori i en la ciència i

tecnologia en general. Des del punt de vista

metrològic, cal destacar el seu ús per quantificar la

precisió de mesura, és a dir, per estimar la imprecisió.

Seguint amb l’exemple presentat pels estadístics de

tendència central, podem calcular la desviació

estàndard dels valors mesurats de la concentració en

substància de l’ió sodi en el plasma (en mmol/L)

com segueix:



2s =[(140-138,8)2 + (140-138,8)2 + (135-138,8)2 +

(147-138,8)2 + (141-138,8)2 + (140-138,8)2 + (128-

138,8)2 + (138-138,8)2 + (120-138,8)2 + (159-138,8)2]

/ 10 = 96,96 (mmol/L)2 i per tant, s = 9,85

mmol/L.

Quan es parteix de dades duplicades, una altra

manera de calcular la desviació estàndard és

mitjançant la fórmula de Dahlberg (6):

n

d

s

n

i

i

2

1

2

on s és la desviació estàndard, 2

id és la diferència al

quadrat entre un parell de valors mesurats duplicats i

n és el nombre de parells de valors numèrics.

En el laboratori clínic, aquesta fórmula s’utilitza en

l’estudi de la imprecisió d’un sistema de mesura quan

es treballa a partir de la mesura de duplicats d’una

mateixa mostra dins d’un conjunt de mostres.

En (7) es calcula la imprecisió intraserial de

l’eritrosedimentació en l’analitzador TEST-1

mitjançant la fórmula de Dahlberg. Per fer-ho es

mesuren diverses mostres per duplicat en un interval

de temps determinat i es calcula la diferència entre els

valors mesurats de la magnitud en estudi. El sumatori

d’aquestes diferències es fa servir per calcular la

desviació estàndard mitjançant la fórmula de

Dahlberg.

La desviació estàndard també es pot estimar a patir

dels fractils 0,25 ( 25,0x ) i 0,75 ( 75,0x ), dels quals es

tractarà més endavant), segons la fórmula (8):

s = ( 75,0x - 25,0x ) /1,349

Coeficient de variació

El coeficient de variació (CV) és la desviació

estàndard d’un conjunt de valors numèrics dividida

per la mitjana aritmètica d’aquests valors, que

habitualment es multiplica per cent per expressar-lo

com a percentatge (1):

100·x

sCV

on CV representa el coeficient de variació, s la

desviació estàndard i x la mitjana mostral.

A major valor del coeficient de variació, major

heterogeneïtat dels valors del conjunt que es tracti; i a

menor coeficient de variació, major homogeneïtat.

El coeficient de variació és útil per comparar la

variabilitat d’un o més conjunts de dades entre ells,

encara que tinguin valors numèrics molt diferents.

Per exemple, permet comparar la imprecisió de

diferents sistemes de mesura.

Seguint amb l’exemple anterior, el

%1,7100·8,138

85,9CV

Amplitud

L’amplitud és la diferència entre el valor màxim i el

valor mínim d’un conjunt de valors numèrics (1). És

l’estadístic de dispersió menys robust i és per això

que s’utilitza poc.

En l’exemple anterior citat, l’amplitud és: 159

mmol/L – 120 mmol/L = 39 mmol/L

Fractils

Tal com s’ha dit en el primer apartat d’aquest En un

conjunt de valors numèrics ordenats de menor a

major, un fractil (o quantil) és el valor, existent o

calculat, d’aquest conjunt que deixa a la seva esquerra



una fracció determinada de valors més petits que ell.

El fractil d’ordre 0,50 ( 5,0x ) correspon a la mediana.

En general, els fractils són uns estadístics de

dispersió molt importants a l’hora de decidir valors

numèrics decisoris, així els fractils 025,0x i 975,0x

tenen una gran transcendència en la teoria dels valors

de referència biològics.

Quartils

El quartil és el fractil d’ordre 0,25 o fractil d’ordre

0,75 (2).

La distància interquartílica, és a dir, la diferència

entre 75,0x i 25,0x , també s’utilitza com a estadístic de

dispersió.

Percentils

En un conjunt de valors numèrics ordenats de menor

a major, un percentil és el valor, existent o calculat,

d’aquest conjunt que deixa a la seva esquerra un

percentatge determinat de valors més petits que ell.

En són exemples el percentil 1 ( %1x ) que deixa a la

seva esquerra l’1 % de les dades, el percentil 50

( %50x ) que deixa a la seva esquerra el 50 % de les

dades (i coincideix amb la mediana) i el percentil 99

( %99x ) que deixa a la seva esquerra el 99 % de les

dades.

Bibliografia

1. International Organization for Standardization. Statistics — Vocabulary and symbols — Part 1: General statistical terms and terms used in probability. ISO 3534-1:2006. Geneva: ISO; 2006.

2. International Organization for Standardization. Statistics — Vocabulary and symbols — Part 2: Applied statistics. ISO 3534-2:2006. Geneva: ISO; 2006.

3. Fuentes-Arderiu X, Miró Balagué J. Naturalesa de les propietats biològiques examinades al laboratori clínic. In vitro veritas 2011;12:150-9. <http://www.acclc.cat/continguts/ivv135.pdf> (accés: 2013-02-26).

4. World Health Organization. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Guidelines for thromboplastins and plasma used to control oral anticoagulant therapy. WHO Technical Report Series. No. 880. Geneva, Switzerland: World Health Organization; 1999.

5. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen. <http://www.bundesaerztekammer.de/downloads/RiliBAEKLabor201205.pdf> (accés: 2013-02-26).

6. Dahlberg G. Statistical methods for medical and biological students. New York: Interscience Publications; 1940.

7. A. Padró-Miquel, X. Fuentes-Arderiu. Quality control strategy to verify day-to-day imprecision of length of blood sedimentation reaction measurements with the TEST-1 analyzer. Clin Chem Lab Med 2007;45(7):930-1.

8. Centre Suisse de Contrôle de Qualité. Parmètres statistiques utilisés dans les rapports de CQE. 2009. <http://www.cscq.ch/SiteCSCQ/FichierPDF_FR/z-score-f.pdf>(accés: 2013-02-26).


__________________________________________________________________________________________


Secció de Gestió del Laboratori Clínic i

Secció de Qualitologia i Normalitzacióa

Guia per a la selecció d’un sistema de mesura

Preparat per:

Aurora Blanco Font 1, Glòria Sòria Guerrero 2

1 Laboratori Clínic, Hospital Universitari de Bellvitge, L’Hospitalet de Llobregat

2 Laboratori de Referència de Catalunya, El Prat de Llobregat

_________________________________________________________________________________________

1. Introducció

La selecció dels sistemes de mesura és una de les

activitats pròpies del laboratori clínic que més

determina la qualitat dels resultats que produeix i que

alhora influeix en d’altres activitats relacionades amb

el procediment de mesura que també són crítiques.

Així, el sistema de mesura condicionarà no solament

aspectes purament metrològics (propietats

metrològiques, traçabilitat dels valors assignats als

calibradors, etc.) sinó també aspectes premetrològics

(com per exemple, les interferències degudes a

l’hemòlisi o la coagulació de la mostra i la possibilitat

de la seva detecció) o postmetrològics (com la

inserció automàtica de comentaris interpretatius o

l’aplicació d’algorismes de validació). Així mateix, la

selecció del sistema de mesura afectarà a processos

col·laterals, també crítics, com la capacitació del

personal o la participació en programes d’avaluació

externa de la qualitat, de manera que també acaba

repercutint en l'organització i gestió del laboratori

clínic.

_____________________________________________

a Membres d’aquestes Seccions de l’ACCLC durant la

preparació d’aquest document: - Secció de Gestió del Laboratori Clínic: L. Álvarez

Domínguez, A. Blanco Font, L. Juan Pereira, G. Soria Guerrero (presidenta), M.C. Pastor Ferrer.

- Secció de Qualitologia i Normalització: F. Canalias Reverter (presidenta), A. Blanco Font, X. Fuentes Arderiu, R.M. López Martínez, A. Noguera Bennaser.

_____________________________________________


ISSN: 1697-5421

Recomanació

50 Aurora Blanco Font In vitro veritas 2013; 14:49-57


Dins el marc legal, el decret d’autorització

administrativa dels laboratoris clínics (1) recull, com

a requisits d’equipament:

Article 7. Els laboratoris hauran de disposar dels

aparells i l'instrumental necessaris per als tipus

d'anàlisis que realitzin. En tot cas, aquests han de

tenir un manual de manteniment, que ha d'estar

dipositat en el laboratori i a disposició dels serveis

d'inspecció. En el manual de manteniment hi ha

de constar el programa de revisions periòdiques

amb especificació del procediment que s'ha de

seguir en cada revisió. Així mateix, ha d'haver-hi

un registre històric de totes les revisions i de les

avaries o altres incidències de cada instrument.

És a dir, emfatitza només els aspectes relatius al

manteniment preventiu o correctiu dels sistemes de

mesura.

Des del punt de vista normatiu, la norma ISO 15189

(2) dedica tot el seu apartat 5.3 a aspectes relacionats

amb els “equips de laboratori”, incloent dins aquest

terme els diversos components dels sistemes de

mesura.

Aquest apartat és molt heterogeni i recull des

d’aspectes relatius a la seguretat de l’usuari fins a la

identificació i control dels equips. Quant als aspectes

generals, diu:

5.3.1.1 The laboratory shall have a document

procedure for the selection, purchasing and

management of equipment.

5.3.1.2 The laboratory shall verify upon installation

and before use that the equipment is capable of

achieving the necessary performance and that it

complies with requirements rellevant to any

examinations concerned.

La norma, com el decret, considera que el sistema de

mesura emprat ha de ser l’adient per poder garantir la

qualitat dels resultats emesos. És el laboratori clínic qui

ha d’establir quins són els requisits pertinents. El com

fer això ja ha estat objecte d’altres documents (3, 4),

però aquesta guia pretén ajudar a la selecció d’un

sistema de mesura, recollint no només el compliment

dels requisits metrològics, sinó aquells criteris no

metrològics que poden influir en la presa de decisions.

Aquesta guia pretén revisar els factors més rellevants

a considerar per fer aquesta selecció, tot i que cada

laboratori clínic, en funció de les seves particularitats,

sigui qui decideixi el pes que ha de tenir cadascun

d’ells i pugui aplicar aquests criteris sobre cadascun

dels sistemes de mesura avaluats, per tal d’obtenir

una puntuació final concreta que faciliti la tasca de

decisió.

2. Objecte i camp d’aplicació

Aquest document proporciona una guia per a la

selecció de sistemes de mesura, ja siguin per a la

realització de mesures múltiples, com ara la majoria

d'analitzadors, o de mesures individuals, com ara un

glucòmetre dels emprats en anàlisis prop dels

pacients.

És aplicable a tots els tipus de laboratori clínic que

realitzen mesures de magnituds biològiques i als

àmbits clínics on es realitzin anàlisis prop del pacient.

3. Vocabulari

En aquest document són aplicables els termes i les

definicions recollides en el Vocabulari Internacional

de metrologia (5). A més, s’utilitzen els termes

següents:

intercanviabilitat: aptitud d’un producte o d’un

procés de poder ser utilitzat en lloc d’un altre

satisfent els mateixos requisits (6)

practicabilitat: conjunt de qualitats que aporten

informació sobre les prestacions de l’analitzador en

In vitro veritas 2013; 14:49-57 Aurora Blanco Font 51


les condicions particulars de treball en un laboratori

determinat (7)

4. Selecció de sistemes de mesura

La necessitat de la selecció d’un sistema de mesura pot

sorgir com a conseqüència de diverses situacions i

aquest context també s’ha de contemplar. A grans

trets, la iniciativa pot partir del propi laboratori o bé

aquest pot haver d’adaptar-se a un canvi aliè (per

exemple, el cessament en el subministrament d’un

reactiu). Considerant, doncs, quina és la situació que

origina la necessitat de la selecció del sistema de

mesura, es poden donar tres supòsits:

- ampliació: el laboratori vol incorporar al seu catàleg

una anàlisi nova, utilitzant uns instruments ja

existents al laboratori;

- actualització: es vol substituir un analitzador existent

per un altre, afectant a un conjunt d’anàlisis ja

incloses al catàleg, sense modificar substancialment

el mètode de mesura, ni canviar de principi de

mesura;

- canvi: es vol substituir un analitzador existent per un

altre, afectant a un conjunt d’anàlisis ja incloses al

catàleg, però en aquest cas canviant de principi de

mesura;

En el primer supòsit, s’han de valorar les propietats

metrològiques, econòmiques i de practicabilitat per

poder decidir en quin dels instruments ja existents

s’incorporarà la nova anàlisi.

En el segon cas, s’entén que es decideix canviar el

sistema de mesura perquè això suposa una millora, bé

perquè es tracta d’una actualització simple del model

d’un analitzador que el laboratori utilitzava fins el

moment, bé perquè són canvis en l’equip de reactius

determinats pel fabricant. Els aspectes metrològics

s’han de comparar amb els de l’analitzador ja existent,

tot i que teòricament se suposa que el canvi serà per

millorar. L’estudi d’intercanviabilitat en aquest cas serà

important des del punt de vista semiològic, per a

l’adequació dels valors de referència, però inicialment

no ha de condicionar la decisió del canvi al sistema de

mesura seleccionat perquè aquesta obeeix a criteris de

renovació i actualització dels sistemes ja en ús.

Al tercer cas, quan el laboratori pren la decisió d’un

canvi que modifica el principi de mesura és perquè

espera una millora en les característiques

metrològiques, una reducció dels costos, una més gran

traçabilitat, etc., especialment quan afecta a un conjunt

important d’anàlisis. En aquest supòsit, la valoració del

laboratori ha de ponderar tots els aspectes

conjuntament, doncs unes anàlisis poden millorar o

abaratir-se, mentre que d’altres poden empitjorar o

encarir-se. El laboratori haurà també d’estudiar la

intercanviabilitat i prendre les decisions conseqüents,

doncs és freqüent que aquesta no existeixi.

Com hem vist, un cop donada la necessitat de la

selecció del sistema de mesura, aquesta comporta la

valoració d’un seguit de factors o criteris, que van des

de les característiques metrològiques (veracitat,

exactitud, precisió, traçabilitat...), fins a les

prestacions afegides d’un instrument (detecció de

possibles interferències en la mostra, incorporació de

validació automàtica de resultats...) i l’impacte

econòmic i organitzatiu de la seva implementació.

Tot seguit parlarem sobre aquests criteris, tot i que

no per ordre d’importància, doncs serà cada laboratori

clínic qui l’estableixi segons el seu cas.

4.1 Criteris metrològics

El fet que un sistema de mesura estigui validat pel seu

fabricant facilita la tasca del laboratori clínic, perquè



aquest fet garanteix la seva adequació a l'ús previst. Els

fabricants estan obligats a proporcionar les dades

relatives a les propietats metrològiques dels seus

productes, inclosa la traçabilitat metrològica dels

valors assignats als calibradors.

Tot i això, el laboratori ha de contrastar si aquestes

propietats metrològiques declarades pels proveïdors

són les adequades per a les seves necessitats, les quals

es poden o no concretar en requisits metrològics

definits prèviament. Fonamentalment, fan referència a

l’error, la veracitat i la precisió de mesura, respecte dels

quals el laboratori pot haver fixat els màxims

permesos. Si el laboratori no té definits requisits

metrològics previs, pot utilitzar com a referència les

propietats metrològiques del sistema de mesura

existent que es planteja canviar o, si l’anàlisi és de nova

incorporació, els requisits aplicats a anàlisis anàlogues

realitzades al laboratori.

Els criteris metrològics poden incloure també aspectes

per als quals el laboratori no tingui declarats

prèviament uns requisits, com ara el límit de detecció,

el límit de quantificació, l’interval analític, o d’altres.

Per a aquests, les dades de la literatura o l’experiència

del professional del laboratori permeten valorar si les

prestacions del sistema de mesura són suficients. En

alguns casos, la millora en aquests aspectes és

precisament el que motiva el canvi de sistema de

mesura.

Tot i que els criteris metrològics són importants des

del punt de vista teòric, pot ser que no siguin els

decisius, especialment quan la millora metrològica

prevista no és clínicament massa rellevant. Hi ha

publicacions que concreten quines especificacions

metrològiques poden ser més importants en funció de

les necessitats analítiques del laboratori (8).

Un aspecte a incloure dins la selecció dels sistemes de

mesura és el coneixement de la traçabilitat metrològica

dels valors assignats als calibradors i si aquesta es pot

seguir fins al procediment de mesura de referència, o

millor encara, si el propi sistema de mesura que es

proposa adoptar és de referència, o proper a aquest,

per a les anàlisis d’interès. Quant als materials de

control, és preferible que disposin també de valors

assignats traçables i que tinguin concentracions o

valors que siguin d’interès clínic.

El proveïdor del sistema de mesura ha de complir la

Directiva Europea sobre productes sanitaris per a

diagnòstic in vitro que li és d’aplicació (9). Cal

considerar que, d’acord amb els criteris de la norma

ISO 15189:2012, quan el sistema de mesura seleccionat

s’utilitza sense cap modificació, és suficient amb que el

laboratori clínic verifiqui les especificacions declarades

pel fabricant i no és necessari que realitzi la seva

validació.

4.2 Criteris semiològics i d’interpretació

Corresponen a criteris relacionats amb els valors

discriminants o els límits de referència biològics

utilitzats pel laboratori, i la decisió a prendre pel

laboratori respecte a la informació que lliura per a la

interpretació dels resultats pot variar en funció de

l’origen d’aquests criteris. Per exemple, si són valors de

referència universals, no es modificaran com a

conseqüència d’un canvi en el sistema de mesura, si

són establerts pel propi laboratori, s’hauran de revisar.

Davant d’una actualització del sistema de mesura, s’ha

de fer un estudi d’intercanviabilitat entre els valors

mesurats obtinguts amb el sistema de mesura utilitzat

fins el moment i els obtinguts amb el sistema candidat

a substituir-lo. Aquest estudi és anàleg al que cal fer

quan s’utilitzen dos o més sistemes de mesura diferents

per a la mateixa magnitud biològica (per exemple, en



diferents àrees del laboratori, per a mostres clíniques

urgents o programades, per a diversos analitzadors

similars —però no idèntics— que s’utilitzen

indistintament, etc.). En funció dels resultats de l’estudi

d’intercanviabilitat (10) i la transcendència mèdica de la

possible significació estadística, el laboratori ha de

valorar la conveniència de canviar els valors

discriminants o intervals de referència no universals,

transformar els valors mesurats obtinguts amb el nou

sistema de mesura, etc.

Per a aquelles anàlisis que es vulguin incorporar de novo

a l’activitat del laboratori clínic, la provisió per part del

proveïdor de valors de referència biològics fiables —i

obtinguts per a una població similar a la del laboratori

clínic— és també un factor important a considerar,

especialment quan les dades procedents de la

bibliografia no siguin concloents.

4.3 Criteris econòmics i comercials

Davant la proposta de canvi, el laboratori clínic ha de

fer una estimació i comparar el cost teòric per

determinació en cadascun dels sistemes de mesura

candidats. Per poder fer això correctament, ha de

considerar costos directes i indirectes.

D’una manera directa, els criteris econòmics inclouen

no solament el cost de reactius per a les mesures de les

mostres clíniques, sinó el cost afegit derivat del control

de la qualitat (intern i extern) i dels calibratges, el cost

d’altres materials fungibles i el derivat dels

manteniments preventius i correctius, quan s'escaigui.

Per a una valoració més acurada dels costs dels

reactius, s’ha de tenir en compte la seva caducitat, dins

o fora de l’analitzador; l’estabilitat, la presentació i la

possibilitat d’adquisició independent dels reactius, els

calibradors i els materials de control.

D’una forma més indirecta, s’ha d’avaluar que els

costos esmentats es poden modular en funció d’altres

aspectes que poden repercutir sobre ells, com ara les

condicions d’ús i possibilitat d’amortització de

l’instrument o les possibles contraprestacions ofertes

pel proveïdor (per exemple, la provisió d’aplicatius

informàtics, equips annexos o auxiliars, connexions i

adaptacions informàtiques, manteniment, etc.).

L’estudi de tots els factors econòmics d’interès es pot

realitzar mitjançant un quadre comparatiu que presenti

els diferents costos per determinació, per a cadascun

dels sistemes a avaluar (11). Òbviament, es pot fer amb

d’altres formats o models, però sempre de forma

sistemàtica i considerant els mateixos factors per a tots

els sistemes candidats.

Finalment, els costos que deriven de la necessitat de

modificar la infraestructura o de redimensionar els

recursos humans es poden deduir dels aspectes

recollits en els apartats concrets dedicats a aquests.

4.4 Criteris estratègics

A banda d’aspectes sobre el motiu que origina la

necessitat del canvi en el sistema de mesura, que ja

han estat esmentats, n’hi ha d’altres aspectes

estratègics rellevants.

El laboratori ha de valorar la proximitat d’altres

centres amb sistemes de mesura iguals al seu, que

permetin, davant una manca de reactius o

consumibles, sol·licitar ajuda al laboratori proper o,

si fos necessari derivar les mostres, tenir proper un

sistema de mesura idèntic o molt similar al seu. El

laboratori també valora la possibilitat de disposar de

més d’un equip idèntic, per resoldre pics en el volum

de treball o potencials avaries que inutilitzin un d’ells.

Un altre aspecte estratègic és la fidelització d’un

determinat proveïdor, de manera que la congruència



entre tots els instruments del laboratori facilita la

comunicació informàtica, la instal·lació d’aplicatius de

gestió, la creació de «cadenes d’analitzadors» o

simplement millora les condicions econòmiques de

cost o de finançament.

Relacionat amb la participació en programes

d’intercomparació per a l’assegurament de la qualitat,

s’ha de valorar si existeix un número suficient de

laboratoris participants que utilitzen el mateix sistema

de mesura o el mateix mètode que el que està sent

avaluat.

Per últim, hi ha un seguit de criteris estratègics que

venen determinats pel volum d’activitat del laboratori

clínic. Aquest ha de saber seleccionar l’analitzador amb

prestacions que s’adeqüin, tant pel que fa a la capacitat

productiva, com a la velocitat (temps de resposta entre

mostres; temps morts deguts a la reconstitució de

reactius, els calibratges o ajustos automàtics, etc.) a

aquesta activitat. El volum de mostres diàries i el temps

en què és necessari analitzar-les condicionaran la

selecció preferent de sistemes de mesura automatitzats

i amb instruments ràpids. Altres elements a valorar

són: la possibilitat de càrrega contínua i la d’analitzar

mostres urgents de forma prioritària, sempre que es

donin aquestes necessitats.

Aquests factors modulen principalment la selecció

d’analitzadors, que alhora condicionaran els mètodes

de mesura de les anàlisis. Tanmateix, també poden ser

rellevants en la selecció de sistemes de mesura per a

anàlisis individuals que es vulguin incorporar al catàleg

de prestacions.

4.5 Criteris d’infraestructura i instal·lacions

Aquests criteris s’han de considerar especialment per

als grans equipaments, contrastant les necessitats de

l’instrument i les disponibilitats del laboratori quant a:

- espai físic: respecte a les dimensions de

l’instrument, però també a la necessitat d’espai

per l’accés per a manteniments o recanvis, la

connexió a equips informàtics, impressores. Pot

ser que comporti l’ocupació d’un espai més gran

que el derivat estrictament de les seves

dimensions;

- adequació de les instal·lacions: reforçament del terra

per suportar el pes de l’instrument, requeriments

quant a anivellació, desguàs de l’equip, protecció

contra vibracions, llum, etc.;

- pressa de corrent independent o amb unes

característiques d’alimentació específiques (tensió,

intensitat); necessitat d’equips auxiliars per al

subministrament d’alimentació ininterrompuda;

necessitat d’aïllament;

- aigua destil·lada, incloent cabdal suficient i

alternatives davant la seva fallida;

- sistemes de subministrament de buit, o de

subministrament i extracció de gasos (nitrogen,

diòxid de carboni, oxigen, acetilè, hidrogen);

- aspectes particulars d’alguns instruments, com ara

aïllament (llum, calor, vibracions), necessitat de

prevenció / contenció de riscos biològics,

radioprotecció, etc.

Tot i que no sempre massa considerats, recordem els

aspectes relacionats amb la protecció mediambiental,

tenint en compte el consum d’energia i la futura

eliminació de l’equip. També s’ha d’avaluar el tipus i

quantitat de residus tòxics que produeix. La previsió i

oferta, per part del proveïdor, d’un tractament adient

dels residus generats és un factor important que el

laboratori no ha de menysprear.

4.6 Criteris de practicabilitat



Sota aquest epígraf, s’inclouen un seguit d’aspectes que

han estat detallats exhaustivament en alguns

documents (7). Entre aquests aspectes, remarquem

alguns rellevants, tot i que estan especialment orientats

a la selecció d’analitzadors, com són els equips que

tenen possibilitat de:

- fer dilucions / repeticions automàtiques, crear

automàticament anàlisis condicionades;

- realitzar anàlisis amb el tub primari, utilitzar tubs

de diferents mides o copes, tubs tapats, fer servir

mostres pediàtriques;

- detectar coàguls, mostres clíniques insuficients,

hemolitzades;

- utilitzar codi de barres amb lectura automatitzada,

per a mostres clíniques i reactius;

- facilitat en la preparació, substitució i conservació

de reactius, de materials de calibratge, controls;

- calibratges estables i versàtils;

- fer manteniments senzills i no massa freqüents;

- adaptar mètodes o sistemes de mesura no

previstos inicialment;

- presentar, arxivar i utilitzar les dades relatives al

control de la qualitat;

- emmagatzematge i exportació de dades.

Un aspecte molt important, tot i que també orientat a

la selecció d’analitzadors, és que aquests analitzadors

disposin de la capacitat d’incorporar-se a sistemes

d’automatització global, incloent també

l’automatització de la fase pre i postmetrològica.

Aquests aspectes s’han recollit en un document molt

estructurat que dóna recomanacions per a la selecció

d’un model d’automatització (12).

4.7 Servei postvenda

El servei postvenda és un aspecte essencial pel que fa

al manteniment preventiu i correctiu. Entre els

aspectes a considerar —sempre que sigui pertinent—

s’inclouen, per exemple:

- durant els dies laborables, hora fins que es pot

disposar d’un tècnic de l’empresa proveïdora, en

cas de necessitat;

- servei durant els caps de setmana o festius;

- tipus de cobertura fora d’horaris: línia de servei

telefònic de 24 hores, etc.;

- disponibilitat de recanvis o peces, quan aquests

són necessaris per a una reparació;

- experiència prèvia del laboratori amb el servei

postvenda del mateix proveïdor.

Altres aspectes postvenda poden ser, per exemple,

actualitzacions de l’aplicació informàtica de

l’analitzador, de la presentació o preparació dels

reactius; provisió de formació inicial i continuada del

personal, etc.

4.8 Criteris de personal

Els criteris relacionats amb el personal plantegen

problemes que són comuns a tots els sistemes de

mesura, excepte per a canvis mínims de model en els

analitzadors.

El factor primer i més important a considerar són els

requisits quant a recursos de personal: si és o no

suficient amb els existents al laboratori clínic i quantes

persones addicionals seran necessàries o, pel contrari,

quantes s’hauran de derivar a d’altres tasques. En

l’estimació del temps de personal s’han d’incloure

també els temps morts (incubació, reconstitució de

reactius, rentats automàtics, tancaments, etc.), així com



el temps destinat a la realització dels manteniments

preventius programats.

A banda dels aspectes merament quantitatius, serà

precís actualitzar els coneixements per poder habilitar

adientment el personal que utilitzi el nou sistema de

mesura. La qualificació del personal és un aspecte

eminentment pràctic, però també imprescindible per a

l’acreditació del laboratori clínic segons la norma

15189. Entre d’altres aspectes, el laboratori clínic ha de

considerar:

- la facilitació per part del proveïdor de la formació

del personal que ha d’utilitzar l’instrument quan

aquest és nou (documentada i al propi lloc de

treball);

- la disponibilitat i flexibilitat del seu personal per a

l’adquisició de nous aprenentatges, per a la

modificació dels torns (per la preparació de

l’analitzador a l’inici de jornada, o el seu

tancament al final), etc.;

Relacionats també amb el capítol de personal estan tots

els aspectes de seguretat i higiene i prevenció de riscos

laborals. El proveïdor ha de subministrar tota la

informació necessària dels seus productes (fitxes de

seguretat, etc.), i els analitzadors han d’estar dotats de

les proteccions que siguin pertinents, per exemple, per

prevenir atrapaments per parts mòbils. Això,

inicialment, ha d’estar garantit per la marca CE del

propi instrument, però també és important que els

usuaris no puguin inutilitzar fàcilment les barreres de

protecció mecànica, ni puguin realitzar maniobres

perilloses, a banda que estiguin desaconsellades per les

especificacions del fabricant. En aquest sentit, una

correcta formació serà molt important

5. Conclusions

En resum, tant per a la incorporació de nous sistemes

de mesura, com per a la renovació dels ja existents, el

laboratori clínic ha de contemplar els factors descrits

que li siguin d’aplicació i assignar el pes individual a

cadascun d’ells, en funció de les pròpies

característiques, necessitats i limitacions del seu cas

particular, per tal d’arribar a valoracions més

quantificables i prendre la decisió final de la forma més

objectiva possible.

Aquesta decisió dependrà de l’avaluació conjunta dels

criteris seleccionats, per a cadascun dels sistemes de

mesura potencials que entrin en l’estudi, corregint

aquests criteris per un factor de ponderació.

A l’annex 1 s’exposa un exemple de la taula o guia, que

es pot utilitzar pel laboratori clínic.

Bibliografia

1. Generalitat de Catalunya. Decret 76/1995, de 7 de març, pel qual s'estableixen el procediment específic d'autorització administrativa dels laboratoris clínics i les normes reguladores de les activitats que s'hi realitzen. Diari Oficial de la Generalitat 1995; (2031): 2555-7.

2. International Organization for Standardization. Medical laboratories — particular requirements for quality and competence. ISO 15189. Geneva: ISO; 2012.

3. Fuentes Arderiu X. Requisits metrològics per als laboratoris clínics. In vitro veritas 2001;2, art. 12:<http://www.acclc.cat> (accés: 2013-02-16).

4. Rigo R. Resum de la tercera sessió del I Curs de Benchmarking sobre la Gestió dels Laboratoris Clínics: “Requisits metrològics: establiment i utilització”. In vitro veritas 2011; 12:118-125 <http://www.acclc.cat> (accés; 2013-02-16).

5. Barwick VJ and Prichard E (dirs), Terminologia per a les anàlisis. Introducció als VIM 3. 1a edició. In vitro veritas 2012; <http://www.acclc.cat> (accés: 2013-02-16).

6. International Organization for Standardization. Standardization and related activities — General vocabulary. ISO / IEC Guide 2:2004. Geneva: ISO; 2004.

7. Sociedad Española de Química Clínica. Criterios para la evaluación de la practicabilidad. Quím Clín 1993;12:102-5.



8. Eurachem. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics; 1998. [ISBN 0-948926-12-0] <http://www.eurachem.org> (accés: 2013-02-16).

9. Directiva 98/79/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 27 de octubre de 1998 sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro. DOCE 1998-12-7;(L 331):1.

10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Method Comparison and Bias Estimation using patients

samples; Approved Guideline. Document 88 EP9-A2. CLSI, Pennsylvania; 2002.

11. Mayer M. Laboratory cost control and financial Management software. Clin Chim Acta 1998;270:55-64.

12. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio. Documentos de la SEQC 2009: 6-17. [ISNN 2013-5750].

Annex 1. Criteris per a la selecció de sistemes de mesura:

FACTOR DE

PONDERACIÓ* CRITERIS SISTEMA A** SISTEMA B SISTEMA C

3 Metrològics*** 3 5 9

2 Intercanviabilitat entre sistemes 10 3 1

4 Econòmics i comercials 5 4 6

2 Estratègics 2 - -

1 Volum d’activitat - - -

Infraestructura i instal·lacions

Practicabilitat

Personal

Servei postvenda

Protecció mediambientals

Altres

TOTAL TOTAL A TOTAL B TOTAL C

NOTES:

* El factor de ponderació és un número que indica la importància d’aquest criteri per al laboratori que fa la selecció del sistema de mesura: 1- mínim, 5- màxim.

** Cada criteri es puntua de l’1 al 10 en ordre creixent: 1- totalment insatisfactori; 10- totalment satisfactori.

*** Els criteris, es poden detallar en subapartats, segons els aspectes esmentats en cada apartat d’aquesta guia.

El sistema de mesura seleccionat serà aquell que tingui una puntuació total més gran.


__________________________________________________________________________________________

Marcadors tumorals en el càncer de pròstata: del

laboratori a la pràctica clínica

Xavier Filella Pla

Servei de Bioquímica i Genètica Molecular (Centre de Diagnòstic Biomèdic). Institut

d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer, Hospital Clínic, Barcelona

_________________________________________________________________________________________

1. Introducció

El càncer de pròstata ha esdevingut a Europa la

neoplàsia no cutània més freqüent, amb una

incidència que progressivament ha anat creixent en el

curs de les dues últimes dècades (1). També, segons

indica l’American Cancer Society, als Estats Units el

càncer de pròstata és el tumor no cutani més

freqüent i la segona causa de mort per càncer en el

sexe masculí (2). A Catalunya, segons assenyala el Pla

Director d’Oncologia de la Conselleria de Sanitat, el

càncer de pròstata és el primer en ordre de

freqüència i la tercera causa de mort per càncer en els

homes (3). El seu pronòstic ha millorat en els darrers

anys, en relació a una migració cap a estadis més

inicials (4), en bona part, a causa de la introducció de

la concentració d’antigen específic de la pròstata

(PSA) en el plasma1 en la seva detecció.

La utilització d’aquesta magnitud biològica, en el

càncer de pròstata és, doncs, un fet clau en el maneig

d’aquest tumor. La mesura de la concentració de

diversos marcadors tumorals en el plasma en malalts

amb càncer de pròstata es va iniciar en els anys trenta

del segle passat, quan es va observar la presència

d’una concentració elevada de fosfatasa àcida

prostàtica en el plasma de malalts amb càncer de

pròstata avançat (5). La utilització de la concentració

de fosfatasa àcida prostàtica (6) com a magnitud en

el càncer de pròstata, tanmateix, va caure anys

després en desús arran de la introducció, en els anys

80 del segle passat, de la mesura de la concentració

de PSA.

_________________________________________

1 A no ser que s’especifiqui el contrari, quan es faci referència a ―la concentració de ...‖ o ―concentracions de...‖, sempre indicarà la concentració del marcador tumoral esmentat en el plasma.

In vitro veritas 2013;14:58-74

ISSN: 1697-5421

Revisió

59 Xavier Filella Pla In vitro veritas 2013;14:58-74


Actualment, disposem de dades que avalen l’ús

d’aquesta magnitud en el diagnòstic, estadiatge i

monitorització del càncer de pròstata (7, 8), mentre

que el seu ús en el cribratge segueix sent una qüestió

polèmica.

2. Característiques del PSA

El PSA va ser identificat l’any 1979 per Wang et al.

(9), si bé anteriorment altres grups havien identificat

diverses substàncies, anomenades gamma

seminoproteïna, p30 i E1, que actualment són

reconegudes com una mateixa substància (10). El

PSA és una glicoproteïna amb aproximadament uns

33.000 daltons que forma part de la família de les

cal·licreïnes, que, entre altres substàncies, inclou la

cal·licreïna glandular de tipus 2 (hK2), també

proposada com a marcador tumoral per al càncer de

pròstata.

El PSA és produït bàsicament per les cèl·lules

epitelials de la pròstata mitjançant un procés que ve

afavorit per l’acció dels andrògens. La seva funció

primordial és promoure la liqüefacció del coàgul

seminal després de l’ejaculació. Així mateix, diversos

investigadors han assenyalat que el PSA també té

activitat antiangiogènica (11) i capacitat per regular la

producció de citocines (12). A causa de la seva

activitat enzimàtica ha de circular en el plasma

majoritàriament unit a proteïnes inhibidores de les

proteases, especialment a l’alfa-1-antiquimotripsina, i

tan sols un petit percentatge que ha estat prèviament

inactivat circula en el plasma en forma lliure.

El PSA va ser descrit inicialment com un antigen

expressat específicament per part de les cèl·lules

epitelials de la pròstata, però més endavant es va

observar que també podia ser produït tant per les

glàndules periuretrals i perirectals com per molts

altres teixits (13). Els treballs de Yu i Diamandis,

realitzats després de descriure un procediment de

mesura amb una capacitat de detecció elevada

(―ultrasensible‖) per mesurar la concentració de PSA

(14), van posar de manifest l’existència de PSA

d’origen extraprostàtic, de manera que actualment

coneixem que hi ha PSA a distints teixits que van des

de diversos tipus de tumor (com el càncer de mama,

en el qual la seva expressió és un signe de bon

pronòstic), fins a líquids biològics que abasten les

secrecions mamàries, els quists de mama, els líquids

amniòtics o els rentats broncoalveolars (15-17). La

falta d’especificitat prostàtica del PSA ha originat un

debat sobre quin hauria de ser el seu nom i s’han

proposat termes alternatius per designar-lo com

cal·licreïna humana de tipus 3 (hK-3) (18) o

semenogelasa (19).

3. Condicions del pacient que influeixen en el mesurament de la concentració de PSA

Diverses manipulacions de la glàndula prostàtica,

entre les quals la seva biòpsia, poden causar l’elevació

de la concentració de PSA. Així, es recomana esperar

6 setmanes entre la biòpsia de la pròstata i l’extracció

de sang i 3 dies entre la realització d’un massatge

prostàtic i la corresponent extracció. En canvi, el

tacte rectal, segons indica la majoria dels estudis,

causa únicament una elevació lleugera i transitòria de

la concentració de PSA. Tanmateix, és aconsellable

realitzar l’extracció de sang prèviament a la

realització d’un tacte rectal o deixar passar uns dies

entre ambdues actuacions. Igualment, encara que els

resultats publicats no són concloents, hi ha autors

que aconsellen un període d’abstinència sexual de 48

hores previ a l’extracció per mesurar aquesta

magnitud, el qual pot ser particularment útil en cas

de dubtes sobre la necessitat o no de practicar una

biòpsia en un pacient concret (20-23).

In vitro veritas 2013;14:58-74 Xavier Filella Pla 60


D’altra banda, cal tenir present que els tractaments

amb efecte antiandrogènic disminueixen la

concentració de PSA a causa de la pèrdua de

l’estímul que tenen els andrògens sobre la seva

producció. Per tant, el tractament amb finasteride i

amb dutasteride inhibidors de la 5-alfa-reductasa

que impedeixen la conversió de la testosterona en

dihidrotestosterona disminueix la concentració

d’aquest marcador tumoral fins aproximadament la

meitat de la concentració que tindria en absència

d’aquest fàrmac (23). El freqüent ús d’aquests

medicaments en el tractament de la hiperplàsia

benigna de pròstata subratlla la importància de

conèixer aquest efecte.

El tractament perllongat amb antiinflamatoris no

esteroïdals o amb paracetamol causa una disminució

mínima en la concentració de PSA (24, 25). Aquest

mínim efecte està probablement relacionat amb les

propietats antiinflamatòries d’aquests medicaments.

4. Estabilitat de les magnituds

La concentració de PSA total i de PSA unit a

proteïnes inhibidores de les proteases (i que, en bona

part, es pot mesurar amb l’ajuda d’un equip de

reactius comercial anomenat complexed PSA) tenen

una elevada estabilitat. A 2-8 ºC, l’estabilitat de la

concentració de PSA total i de PSA unit a proteïnes

inhibidores de les proteases està compresa entre 5 i 7

dies. La conservació de la mostra durant un període

de temps més prolongat requereix que sigui

congelada a -20 ºC o -70 ºC.

L’estabilitat del PSA no unit a proteïnes (PSA lliure)

és, en canvi, molt menor i es recomana congelar la

mostra si el mesurament no es pot fer en el termini

d’unes hores després de l’extracció, ja que la

concentració de PSA lliure disminueix si la mostra es

conserva a temperatura ambient o, fins i tot, a 2-8º

C. Sokoll et al. (26) recomanen congelar a -20 ºC si la

mesura de la concentració de PSA lliure no es pot fer

en el termini de 8 hores després de l’extracció. Si la

mostra ha de ser emmagatzemada durant un llarg

període de temps abans del mesurament, es

recomana congelar-la a -70ºC.

L’European Group on Tumor Markers (EGTM)

recomana la separació del sèrum del coàgul

preferiblement abans de 3 hores després de

l’extracció, especialment si cal mesurar la

concentració de PSA lliure. Aquest grup indica que

les mostres han de ser emmagatzemades a 4 ºC per

períodes curts de temps, però que han de ser

emmagatzemades a -30 ºC per períodes més llargs

(22).

5. Estandardització dels assaigs de PSA

L’any 1999 l’Organització Mundial de la Salut (OMS)

va establir el material de referència 96/670 com a

material de referència certificat per als mesuraments

de la concentració de PSA, després que la Segona

Conferència d'Estandardització de Stanford,

celebrada el 1994, recomanés que l’esmentat material

tingués una proporció 90:10 de PSA unit i PSA lliure,

respectivament (27). La introducció d’aquest material

de referència certificat havia de permetre superar els

problemes derivats de la resposta no equimolar

d’alguns procediments de mesura que, en mesurar

inadequadament la concentració de PSA total,

comportaven resultats falsament per sobre o

falsament per sota del valor discriminant (28).

Progressivament, tot i que hi ha encara excepcions,

els diversos fabricants han anat substituint el seu

propi calibrador per calibradors traçables al material

de referència de l’OMS. Un cas particular és el de

Beckman Coulter que per mesurar la concentració de

PSA en la seva plataforma Access ofereix,



juntament amb el calibrador preparat a partir del

material de referència 96/670 de l’OMS, l’antic

calibrador traçable al material de referència

d’Hybritech, al qual, de fet, estan referits els valors

discriminants d’aquesta magnitud usats en la pràctica

clínica.

Les concentracions de PSA obtingudes quan

s’empren calibradors traçables al material de

referència de l’OMS són, en termes generals, un 20

% inferiors a les obtingudes amb els calibradors

traçables al material de referència d’Hybritech. Així,

l’empresa Beckman Coulter comunica que un nou

valor discriminant de 3,1 μg/L ha de ser utilitzat en

substitució del tradicional de 4 μg/L quan s’utilitza el

calibrador de l’OMS (29). Aquests resultats han estat

corroborats per Jansen et al. (30) mitjançant un estudi

on subratllen que els valors de 3 μg/L i 4 μg/L,

indicadors de biòpsia, haurien de ser substituïts per

2,4 μg/L i 3,2 μg/L, respectivament quan s’empren

els calibradors preparats a partir del material de

referència de l’OMS.

La introducció de l’estàndard de l’OMS subratlla,

doncs, la necessitat d’ajustar el valor discriminant del

PSA i de reconsiderar la variabilitat en la

concentració mesurada d’aquest marcador tumoral

en relació a l’ús de diferents assaigs en la seva

mesura. Stephan et al. (31), en un estudi que compara

cinc dels sistemes de mesura usats amb més

freqüència per mesurar la concentració de PSA, han

confirmat que, en general, aquells que empren

calibradors traçables al material de referència de

l’OMS (AxSYM i Advia Centaur) ofereixen valors

més baixos de PSA que els que no fan servir aquests

calibradors (Access i Immulite). Una excepció a

aquesta tendència la constitueix l’analitzador

Elecsys que, tot i utilitzar calibradors traçables al

material de l’OMS, dóna unes concentracions de

PSA molt semblants a les de l’analitzador Access

usant el calibrador preparat a partir del material

d’Hybritech. Aquests resultats subratllen que

malgrat que l’estandardització promoguda per l’OMS

permet millorar l’harmonització dels sistemes de

mesura, la conformitat és encara incompleta, de

manera que els diferents resultats d'aquesta magnitud

obtinguts pels diversos sistemes continuen sense ser

intercanviables. De fet, la intercanviabilitat de

resultats entre els diferents sistemes no depèn tan

sols de la traçabilitat dels calibradors a un material de

referència determinat, sinó que també inclou altres

aspectes metodològics relacionats amb les

immunoanàlisis com són el temps d’incubació,

l’efecte matriu o els anticossos que utilitza cada

fabricant.

Així doncs, en definitiva, el valor discriminant per a

la concentració de PSA ha de ser ajustat en cada

centre segons el sistema de mesura utilitzat i, per

tant, és incorrecte usar el mateix valor discriminant

(4 μg/L) per a tots els sistemes. Igualment, per tant,

un canvi en el sistema de mesura emprat pot causar

diferències clínicament significatives en les

concentracions de PSA. Aquestes diferències hauran

de ser valorades en cada cas per interpretar

apropiadament, en cada malalt, una variació en

l’evolució de la concentració de PSA al llarg del

temps. Idealment, doncs, els pacients han de ser

monitoritzats emprant sempre el mateix sistema de

mesura. Quan un laboratori introdueix un canvi en el

sistema, haurà de valorar les diferències en les

concentracions obtingudes amb un i altre. Si les

diferències són notòries caldrà reanalitzar la mostra

anterior de cada malalt amb el nou sistema o bé, si

això no és possible, demanar una nova mostra en un



breu període de temps per establir els nous valors

basals de cada pacient.

També hi ha discrepàncies en les concentracions de

PSA lliure mesurades pels sistemes comercialitzats

pels diferents fabricants, tot i que majoritàriament

utilitzen calibradors traçables al material de

referència de l’OMS, bé sigui el 96/668, compost en

un 100 % per PSA lliure (en el cas dels analitzadors

Elecsys i Immulite), o bé sigui l’esmentat 96/670

(en el cas d’Abbott per als analitzadors Axsym i

Architect). Per la seva banda, Beckman Coulter

presenta una doble possibilitat de calibratge en el seu

analitzador Access, en què es pot usar tant els

calibradors traçables al material de referència

d’Hybritech com al 96/668 de l’OMS. Els resultats

del percentatge de PSA lliure obtinguts en els dos

casos són equivalents, sempre i quan s’utilitzin els

calibradors equivalents traçables a l’OMS o a

Hibritech tant per a la concentració de PSA com

per la de PSA lliure (31).

Les diferències obtingudes entre els diferents

sistemes usats per mesurar la concentració de PSA

lliure són, en general, prou notables, de manera que

el valor discriminant del percentatge de PSA lliure

varia en les propostes dels diferents fabricants. El

grup de Stephan, prenent com a referència els valors

de la concentració del PSA lliure i el PSA total

obtinguts en l’analitzador Access, indiquen que les

pendents corresponents als estudis d’intercanvibilitat

dels diversos percentatges de PSA lliure varien entre

1,24 per AxSYM i 0,82 per Immulite. Aquest grup

comunica, així mateix, que el valor discriminant del

percentatge de PSA lliure corresponent a una

sensibilitat diagnòstica del 95 % oscil·laria entre el

18,1 % en un analitzador Immulite (amb una

especificitat diagnòstica del 34 %) i el 27,9 % en un

analitzador AxSYM (amb una especificitat

diagnòstica del 35,5%) (32).

6. Valor discriminant

L’any 1986 Myrtle et al. (33), emprant l’equip de

reactius Tandem-R de Hybritech, van ser els

primers a proposar la coneguda concentració de 4

μg/L com valor discriminant del PSA. L’estudi,

tanmateix, contenia alguns errors metodològics,

doncs mesurava la concentració de PSA en una

població de 860 homes aparentment sans, en els

quals no s’havia descartat per cap procediment la

presència de malaltia prostàtica. Tot i això, aquest

valor discriminant va ser posteriorment ratificat per

Catalona et al. (34) en un estudi multicèntric realitzat

en 6 centres universitaris i que va incloure 6 630

homes de més de 50 anys, als quals, a més de la

mesura de la concentració de PSA, es va realitzar un

tacte rectal.

La Food and Drug Administration va aprovar l’any 1994

l’ús de la concentració de PSA en el diagnòstic

precoç del càncer de pròstata i va establir la

concentració de 4 μg/L com a valor discriminant per

recomanar la biòpsia de la pròstata. Ulteriorment, es

va introduir el concepte de ―zona grisa‖ que definia

el grup de pacients amb una concentració de PSA

entre 4 i 10 μg/L, en la qual, com veurem més

endavant, l’ús del percentatge de PSA lliure permetia

reduir el nombre de biòpsies negatives. Evidentment,

una concentració de PSA superior al valor

discriminant no significa que existeixi amb seguretat

un tumor, però sí un risc elevat de la seva existència.

Per aquest motiu, quan el resultat de la biòpsia és

negatiu, és aconsellable tornar a mesurar la

concentració de PSA en el termini de 6-12 mesos i, si

continua sent superior al valor discriminant, practicar

una nova biòpsia.



Per altra banda, també és cert que una concentració

de PSA inferior a 4 μg/L no exclou l’existència d’un

càncer de pròstata. Catalona et al. (35) han comunicat

que el 22 % dels pacients amb una concentració de

PSA entre 2,6 i 4 μg/L tenen un càncer de pròstata i,

igualment, l’European Urological Association quantifica

la presència de càncer de pròstata en pacients amb

una concentració de PSA inferior a 4 μg/L en un

percentatge que va des del 6,6 % quan és menor a

0,5 μg/L i el 26,9 % quan està entre 3,1 i 4 μg/L

(36). No ha d’estranyar, doncs, que l’European

Randomized Study of Screening for Prostate Cancer

(ERSPC) establís el 1997 la concentració de 3 μg/L

com a valor discriminant per decidir la realització

d’una biòpsia de la pròstata i que el National

Comprehensive Cancer Network (NCCN) consideri la

necessitat de practicar una biòpsia quan la

concentració de PSA és superior a 2,5 μg/L.

Evidentment, la introducció de la nova

estandardització promoguda per l’OMS demanda

que s’ajustin convenientment per a cada sistema de

mesura els diferents valors discriminants indicats en

aquest apartat i que són referits, en cada un dels

casos assenyalats, al tradicional material de referència

d’Hybritech.

7. Ús de la concentració de PSA en el cribratge del càncer de pròstata

Actualment, no hi ha unanimitat entre els experts

sobre si la concentració de PSA és útil en el cribratge

del càncer de pròstata. Certament, hi ha coincidència

en admetre que des de la introducció de la seva

mesura, els malalts són diagnosticats més

freqüentment quan la malaltia està clínicament

localitzada. Així mateix, com indica l’American Cancer

Society, s’ha observat que la supervivència als 5 anys

ha augmentat des del 76 % en els anys 1984-86,

corresponents encara a l’era pre-PSA, fins al 99 % en

els anys 1999-2006 (2). Igualment, hi ha dades que

indiquen que la pràctica del cribratge del càncer de

pròstata mitjançant la mesura bianual de la

concentració de PSA permet reduir el risc de ser

diagnosticat quan la malaltia ja està avançada (37).

Aquestes dades han afavorit que algunes societats,

com l’American Urological Association i l’American Cancer

Society, recomanin l’ús de la concentració de PSA,

juntament amb el tacte rectal, en el cribratge del

càncer de pròstata. En aquest sentit, l’American Cancer

Society recomana iniciar el cribratge als 50 anys en la

població general i a partir dels 45 anys en els grups

d’alt risc (38). El PSA Best Practice Policy 2000 de

l’American Urological Association formulava una

recomanació semblant, però l’actualització de l’any

2009 d’aquesta societat ha introduït alguns canvis,

tant en el sentit de subratllar la importància d’establir

uns valors basals per a la concentració de PSA als 40

anys com d’incloure diversos factors, com el

percentatge de PSA lliure, la velocitat de PSA, la

densitat de PSA o la història familiar, per decidir si

cal o no efectuar una biòpsia de la pròstata (39).

Ambdues societats indiquen, altrament, que cal

informar al pacient tant dels beneficis com dels

riscos que comporta la pràctica del cribratge, i que

deriven tant de la biòpsia de la pròstata (infecció,

hematúria) com del tractament que caldrà aplicar en

cas que es detecti un càncer (impotència,

incontinència urinària). Finalment, és important

subratllar que el cribratge del càncer de pròstata no

està indicat quan l’expectativa de vida és inferior als

10 anys (40).

Malgrat les recomanacions favorables a l’ús de la

concentració de PSA en el cribratge del càncer de

pròstata, no es disposem de dades definitives que



avalin aquesta pràctica. Certament, la seva utilitat en

el cribratge del càncer de pròstata permet augmentar

el nombre de tumors diagnosticats, però falta

confirmar si l’augment en la supervivència que

s’observa és a causa d’una efectiva disminució en la

mortalitat o simplement a causa d’un avenç en el

moment del diagnòstic del tumor. De fet, les dades

preliminars, publicades el març del 2009 a New

England Journal of Medicine, dels estudis europeus

(ERSPC) i nord-americà (Prostate, Lung, Colorectal and

Ovary screening trial, PLCO) sobre la validesa en la

utilitat de la concentració de PSA en el cribratge del

càncer de pròstata ofereixen resultats discordants.

Així, mentre l’estudi europeu mostra una disminució

del 20 % en la mortalitat del càncer de pròstata quan

es realitza el cribratge (41), l’estudi nord-americà

indica que la realització del cribratge no ofereix cap

benefici (42), de manera que l’editorialista de la

revista venia a concloure que es tracta d’una

polèmica que refusa morir (43). Els resultats oposats

de tots dos estudis podrien, però, ser explicats en

relació a certes diferències en el seu disseny. Així,

l’estudi europeu utilitza un valor discriminant de PSA

de 3 μg/L, mentre que l’estudi nord-americà

considera la concentració de 4 μg/L.

Addicionalment, mentre que el temps mig de

seguiment en l’estudi europeu va ser de 9 anys, en

l’estudi nord-americà va ser de tan sols 7 anys.

Aquestes diferències han justificat un editorial que

dos membres de l’estudi europeu han signat a

European Urology per defensar la pràctica del cribratge

en atenció a les dades de l’ERSPC (44). Malgrat tot,

una revisió publicada l’any 2011 a Annals of Internal

Medicine (45) subratllava que el cribratge del càncer de

pròstata emprant la concentració de PSA ofereix una

reducció en la mortalitat per al càncer de pròstata

escassa o nul·la, mentre que, per altra banda, està

associada a perjudicis relacionats amb el tractament

que, en alguns casos, pot ser innecessari.

8. Sobrediagnòstic i sobretractament del càncer de pròstata: la noció de vigilància activa del càncer de pròstata indolent

El càncer de pròstata es caracteritza per la seva

elevada prevalença, amb una incidència que

augmenta ràpidament a partir dels 50 anys. Es calcula

que entre el 30 % i el 40 % dels homes de més de 50

anys presenten evidència histològica d’aquesta

malaltia (46), si bé en la majoria dels casos el tumor

no té transcendència clínica. De fet, la remarcable

heterogeneïtat del càncer de pròstata fa que el seu

pronòstic variï des de formes indolents fins a tumors

molt agressius. En els últims anys, diversos estudis

han definit una tendència a sobrediagnosticar el

càncer de pròstata en raó de l’important nombre de

tumors indolents que es diagnostiquen sense que

signifiquin cap risc per a la vida del pacient. S’ha

suggerit que el percentatge de sobrediagnòstics, i per

tant de sobretractaments, oscil·laria entre el 30 i el 84

%, segons els estudis consultats (46, 48). El

sobrediagnòstic es relaciona en bona part amb la

introducció de la mesura de la concentració de PSA

en la detecció del tumor i augmenta en relació a

l’elecció de valors discriminants cada vegada més

baixos.

Els problemes derivats del sobrediagnòstic i

sobretractament del càncer de pròstata han impulsat

el desenvolupament de protocols de vigilància activa

per reservar el tractament únicament per a aquells

pacients que, en raó de l’agressivitat del tumor, ho

necessitin (47). Aquests protocols, dirigits a pacients

amb tumors clínicament confinats a la pròstata,

inclouen la realització regular d’un tacte rectal i la

biòpsia de la glàndula prostàtica, així com mesures

seriades de la concentració de PSA per valorar-ne



l’evolució. En aquells pacients en els quals es detecta

al llarg del seguiment la progressió del tumor s’indica

la immediata realització del tractament. No és fàcil,

però, decidir quins pacients poden beneficiar-se

d’una vigilància activa, encara que hi ha múltiples

algoritmes disponibles per definir un tumor indolent

que, addicionalment a la concentració de PSA (<10

μg/L), consideren altres dades com el volum

tumoral, el nombre de cilindres afectats pel tumor i

el grau de Gleason (<7). El grau de Gleason valora la

diferenciació del càncer de pròstata segons un

sistema que assigna una puntuació de l’1 al 5 en

funció de la major o menor semblança de les

cèl·lules canceroses al teixit prostàtic normal.

Aquesta classificació valora els tipus histològics

dominants i els secundaris del tumor i, per tant,

ofereix una puntuació màxima de 10, en la qual els

tumors amb una major puntuació són els més

indiferenciats i, en definitiva, els que tindran una

evolució més agressiva. Una adequada selecció dels

malalts en un protocol de vigilància activa requereix,

doncs, tenir en compte els diferents resultats

obtinguts en la concentració de PSA en funció del

sistema de mesura emprat, de manera que la inclusió

en relació a una concentració menor a 10 μg/L sigui

un criteri eficaç (50).

9. Especificitat diagnòstica per a la concentració de PSA

La prostatitis aguda i la hiperplàsia benigna de

pròstata són, en absència de càncer, les principals

causes de falsos positius per la concentració de PSA

(51). En els malalts amb prostatitis aguda es poden

observar concentracions molt elevades de PSA que

disminueixen al cap d’unes 6-8 setmanes, un cop

resolta la malaltia. Per altra banda, entre el 25 i el 50

% dels malalts amb hiperplàsia benigna de pròstata

tenen una concentració de PSA superior a 4 μg/L.

L’elevació de la concentració de PSA s’observa

particularment en pacients amb una pròstata de grans

dimensions o amb una hiperplàsia benigna de

pròstata complicada, bé sigui per una infecció

urinària o bé per una retenció aguda d’orina que

requereixi la col·locació d’un catèter vesical.

Eventualment, finalment, s’han observat elevacions

en els valors d’aquesta magnitud en malalts amb

pancreatitis aguda i càncer de pàncreas, mentre que

no hi ha unanimitat sobre els efectes de les

membranes d’hemodiàlisi, encara que s’ha descrit la

seva elevació en relació a l’ús de membranes de baix

flux. També, en malalts amb infart agut de miocardi,

reanimació cardiopulmonar prolongada i cirurgia

cardíaca es pot observar l’elevació de la concentració

de PSA en relació al dany causat per la isquèmia de la

pròstata (52,53).

10. Estratègies per millorar l’especificitat diagnòstica

L’elevat nombre de falsos positius de la concentració

de PSA en malalts amb hiperplàsia benigna de

pròstata ha impulsat el disseny de diferents

estratègies encaminades a millorar l’especificitat

d’aquesta magnitud biològica amb l’objectiu d’evitar

biòpsies innecessàries. L’any 1992, Carter et al. (54)

descrivien la utilitat de la velocitat de PSA en el

diagnòstic del càncer de pròstata, i suggerien que un

augment anual superior a 0,75 μg/L seria indicatiu de

la presència d'un tumor. Altres autors, en base a

l’augment fisiològic del volum de la pròstata en

relació a l’edat, han proposat la utilització d’un valor

discriminant ajustat a l’edat del pacient (55) que

aniria entre els 2,5 μg/L per als homes amb una edat

compresa entre els 40 i els 49 anys i els 6,5 μg/L per

als homes amb una edat entre 70 a 79 anys. Aquesta

opció, tanmateix, com han assenyalat Reed et al. (56),

tindria l’inconvenient de disminuir la sensibilitat per



diagnosticar tumors d’alt grau en homes grans,

mentre que, per altra banda, podria augmentar el

sobrediagnòstic en homes joves.

Per altra banda, també en relació a la influència del

volum de la pròstata en la concentració de PSA, s’ha

indicat que la densitat de PSA, que consisteix en el

càlcul del quocient entre la concentració de PSA i el

volum de la pròstata obtingut mitjançant ecografia

transrectal, podria ser una magnitud útil per

disminuir el nombre de falsos positius (57). En

general, s’estima que un valor de densitat de PSA

superior a 0,15 μg/L per centímetre cúbic és

suggestiu de càncer, encara que òbviament aquest

valor varia en relació al sistema usat per mesurar la

concentració de PSA.

L’estudi del comportament de les diferents formes

de PSA que es poden trobar en el plasma ha permès

constatar que el percentatge de PSA lliure en relació

al PSA total és menor en els malalts amb càncer de

pròstata que en els subjectes sans o en els malalts

amb hiperplàsia benigna de la pròstata (58-60).

Aquesta magnitud té un particular interès a l’hora de

decidir la necessitat d’efectuar una biòpsia en la

―zona grisa‖ de PSA definida per concentracions

d’aquest marcador tumoral compreses entre 4 i 10

μg/L. Diverses guies han introduït el càlcul del

percentatge del PSA lliure en els esquemes

diagnòstics del càncer de pròstata (61, 62) i

recomanen efectuar una biòpsia no tan sols quan el

tacte rectal és sospitós o quan la concentració de

PSA és superior a 10 μg/L, sinó també en els malalts

amb una concentració de PSA entre 4 i 10 μg/L i un

percentatge de PSA lliure inferior al valor

discriminant que, segons el sistema de mesura

utilitzat, varia aproximadament entre el 20 i el 27 %.

Alguns autors han proposat l’ús de la concentració

de PSA unit a proteïnes (complexed PSA) com una

alternativa a la de PSA total i al percentatge de PSA

lliure en el diagnòstic precoç del càncer de pròstata

(63). Segons les nostres dades, la concentració de

complexed PSA té, a igual sensibilitat diagnòstica, més

especificitat diagnòstica que la concentració de PSA

total, però la utilització del percentatge de PSA lliure

segueix sent necessari per augmentar l’especificitat en

la ―zona grisa‖ de PSA i, particularment en malalts

amb una concentració de PSA superior a 6 μg/L

(64).

La progressiva descripció de noves subformes de

PSA lliure, entre les quals el proPSA (63-67), ha

obert un nou escenari en què ràpidament es

multipliquen els sistemes de mesura disponibles i on

sorgeix un nou abordatge matemàtic que haurà

d’incorporar models de càlcul més complexos per

estimar conjuntament les diferents magnituds

disponibles i, en definitiva, calcular el risc de

presentar un càncer de pròstata a partir del qual

efectuar o no una biòpsia (68). En aquest sentit,

recentment, ha estat descrit el Prostate Health Index,

un índex multivariat que incorpora les

concentracions de PSA, PSA lliure i [-2] proPSA per

estimar la probabilitat de càncer de pròstata en

homes de més de 50 anys, tacte rectal negatiu i

concentracions de PSA total entre 2 i 10 μg/L (69).

Finalment, cal esmentar que, segons assenyalen

recents estudis, l’examen de l’expressió del mRNA

del gen PCA3 (Prostate Cancer Gene 3) en orina

després de la realització d’un massatge prostàtic

permetria reduir el nombre de biòpsies negatives i

per tant augmentar l’especificitat dels esquemes

diagnòstics del càncer de pròstata. Igualment, la

puntuació obtinguda en l’examen de l’expressió del

mRNA del gen PCA3 es relacionaria, segons els

estudis preliminars, amb l’agressivitat del tumor, de

manera que podria ajudar a decidir si és necessari



aplicar un tractament curatiu o si n’hi ha prou en

practicar una vigilància activa (70).

11. Utilitat de la concentració de PSA en el seguiment dels pacients tractats amb finalitat curativa

La prostatectomia radical, que consisteix en

l’extirpació completa de la glàndula prostàtica, la

radioteràpia externa i la braquiteràpia són els

tractaments d’elecció per aquells malalts amb tumors

inicials i que, per tant, es poden beneficiar d’un

tractament amb finalitat curativa. La mesura de la

concentració de PSA és, per totes aquestes opcions

terapèutiques, la magnitud d’elecció per avaluar la

resposta al tractament i per monitoritzar els malalts

amb l’objectiu de diagnosticar precoçment l’aparició

d’una recidiva del tumor (71, 72).

La concentració de PSA en els malalts tractats amb

prostatectomia ha de ser indetectable un mes després

de la intervenció quirúrgica. En aquests pacients, la

concentració de PSA haurà de ser mesurada cada 3

mesos durant els 2 primers anys i, seguidament, cada

6 mesos durant un mínim de 2 anys més. Una

concentració superior a 0,2 o 0,4 μg/L, segons els

autors (73), és indicativa de progressió bioquímica,

fet que precedeix, fins i tot en anys, l’aparició de

símptomes clínics. En els malalts en els quals es

detecta la progressió bioquímica, el temps de

duplicació de la concentració de PSA orienta sobre la

localització de la recidiva tumoral, de manera que si

el temps de duplicació supera els 6-12 mesos es

considera que la recidiva és local i es recomana

realitzar un tractament amb radioteràpia. El

tractament sistèmic amb bloqueig androgènic

complet es reserva per a aquells casos en què hi ha

un temps de doblatge de la concentració de PSA

curt.

En els malalts tractats amb radioteràpia externa la

concentració de PSA disminueix lentament fins

assolir un valor mínim, anomenat PSA nadir.

Aquesta concentració es relaciona amb l’èxit del

tractament, sense que hi hagi, però, unanimitat sobre

quina concentració de PSA (entre 0,5-4 μg/L) ha de

ser assolida perquè el tractament sigui considerat

efectiu. Per tant, en el plasma dels pacients tractats

amb radioteràpia és habitual trobar valors en la

concentració de PSA, ja que aquest tractament, a

diferència de la prostatectomia, no inclou l’exèresi de

la pròstata. El seguiment d’aquests malalts preveu la

mesura seqüencial de la concentració de PSA cada 3

mesos durant el primer any, semestralment dos anys

més i posteriorment anualment.

L’any 1997 l’American Society for Therapeutic Radiation

and Oncology (ASTRO) definia tres increments

consecutius de la concentració de PSA com a criteri

de l’existència de progressió bioquímica després de

realitzar un tractament del càncer de pròstata amb

radioteràpia (72). Més recentment, un comitè de

consens reunit a Phoenix l’any 2005 va proposar

acordar una definició de progressió bioquímica que

fos vàlida pels diferents tipus de radioteràpia,

incloent la braquiteràpia. Aquesta definició considera

la progressió bioquímica com un augment de la

concentració de PSA de 2 μg/L per sobre del PSA

nadir (75). Aquest criteri és útil, no tan sols per la

tradicional radioteràpia externa, sinó també per

pacients tractats amb braquiteràpia, tècnica reservada

per tumors localitzats de bon pronòstic. És

important tenir en compte que en els malalts tractats

amb braquiteràpia, pot observar-se en el segon i

tercer any després del tractament, un cert increment

de la concentració de PSA, probablement a causa

d’un infart prostàtic a conseqüència dels efectes

sobre la vascularització de la glàndula produïts per la



radiació i que cal no confondre amb un fracàs de la

braquiteràpia.

12. Utilitat de la concentració de PSA en el seguiment dels pacients amb tumors avançats

Les cèl·lules de la pròstata, incloent les cèl·lules

tumorals prostàtiques, depenen de l’acció dels

andrògens, que estimulen el seu creixement i

proliferació. En conseqüència, l’aplicació d’un

tractament hormonal que causi la inhibició de l’acció

dels andrògens, és la teràpia pal·liativa d’elecció en

els pacients amb càncer de pròstata disseminat. La

resposta a aquest tractament, que abasta des de

l’orquiectomia als antiandrògens, pot ser

monitoritzada amb la mesura seqüencial de la

concentració de PSA (76) que inclou la mesura

d’aquesta magnitud als dos mesos de l’inici del

tractament i, posteriorment, cada 6 mesos. El temps

necessari per assolir la concentració de PSA nadir

(mínima concentració de PSA mesurada després de

l’inici de l'hormonoteràpia) i la pròpia concentració

de PSA nadir tenen valor pronòstic, de manera que

permeten identificar els pacients amb un major risc

de mort a causa d’aquesta malaltia (77).

Una disminució en la concentració de PSA es

relaciona amb la resposta al tractament, encara que

també s’ha de tenir en compte que el propi

tractament també interfereix en l’acció reguladora

dels andrògens sobre la síntesi de PSA. Per tant, en

els malalts tractats amb antiandrògens augments

lleugers en la concentració de PSA poden ser causats

per una franca progressió de la malaltia. El

tractament hormonal controla simptomàticament la

malaltia durant 18-24 mesos de mitjana. Es considera

que tres increments successius de la concentració de

PSA en un interval de 2 setmanes que superin en un

50 % la concentració basal (juntament amb noves

captacions en la gammagrafia) indiquen que el tumor

s’ha tornat hormonoindependent i que cal tractar-lo

amb una nova línia de teràpia.

L’ús de la quimioteràpia està limitat al maneig de

pacients amb malaltia sistèmica refractària al

tractament amb antiandrògens. En aquests pacients

s’ha de mesurar la concentració de PSA prèviament a

cada cicle de quimioteràpia i es considera que un

descens de la mateixa superior al 50 % és indicatiu de

resposta al tractament, mentre que increments

superiors al 50 % mostren la falta de resposta.

13. Conclusions

Hi ha unanimitat en considerar la concentració de

PSA com la magnitud biològica d’elecció en el

maneig de pacients amb càncer de pròstata. La

mesura de la concentració de PSA ofereix informació

clínica indispensable per avaluar l’evolució de la

malaltia, per diagnosticar precoçment la seva

progressió i per decidir en quins casos cal optar per

una nova línia de tractament. La seva falta

d’especificitat diagnòstica, tanmateix, dificulta la seva

interpretació en el diagnòstic del càncer de pròstata,

encara que disposem de diverses estratègies

encaminades a disminuir el nombre de biòpsies

negatives. Noves magnituds o propietats biològiques,

entre les quals es troba la concentració de [-2]

proPSA i l’examen de l’expressió del gen PCA3,

poden contribuir a millorar l’eficàcia de les

estratègies actualment disponibles. En qualsevol cas,

la introducció de la mesura de la concentració de

PSA ha contribuït a la progressiva millora en el

pronòstic del càncer de pròstata observada en els

últims anys, encara que no disposem de dades

concloents que avalin el seu ús en el cribratge

d’aquest tumor. Malgrat tot, des de l’any 2009,

disposem de les dades de l’ERSPC que mostren una

disminució del 20 % en la mortalitat del càncer de



pròstata quan es realitza el cribratge. Finalment, és

important considerar que, malgrat la introducció per

part de l’OMS de nous materials de referència per

promoure l’harmonització dels sistemes de mesura

emprats per mesurar les concentracions de PSA i

PSA lliure, continuen existint diferències entre els

seus resultats. Per tant, cada laboratori ha d’ajustar

els valors discriminants d’aquestes magnituds

biològiques segons el sistema de mesura utilitzat en

el seu cas.

Referències

1. Bray F, Lortet-Tieulent J, Ferlay J, Forman D,

Auvinen A. Prostate cancer incidence and mortality

trends in 37 European countries: An overview. Eur J

Cancer 2010;46: 3040-3052.

2. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures

2012.

3. Pla Director d’Oncologia. Objectius 2010.

Departament de Salut. Generalitat de Catalunya.

<http://www20.gencat.cat/docs/cancer/MERY/R

ECTIFICAT/Pla%20director%202010.pdf> (accés:

2013-2-17).

4. Thanigasalam R, Rasiah KK, Stricker PD, Haynes

AM, Sutherland SI, Sutherland RL, Henshall SM,

Horvath LG. Stage migration in localized prostate

cancer has no effect on the post-radical

prostatectomy Kattan nomogram. BJU Int

2010;105:642-7.

5. Gutman AB, Gutman EB. An acid phosphatase

occurring in the serum of patients with

metatstasizing carcinoma of the prostate gland. J

Clin Invest 1938;17:473-8.

6. Filella X. Prostatic acid phosphatase. A: Ballesta AM,

Torre GC, Bombardieri E, Gion M, Molina R, dirs. Up

dating on tumor markers in tissue and in biological

fluid. Basic aspects and clinical applications. Torino:

Ed. Minerva Medica, 1993. p. 333-9.

7. Filella X, Molina R, Ballesta AM. Utilidad clínica del

PSA. Roche Diagnostics, Barcelona, 2000.

8. Filella X, Molina R. Utilidad clínica de los marcadores

tumorales en el cáncer de próstata. Jano 2006;1612:51-

6.

9. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM.

Purification of a human prostate specific antigen.

Invest Urol 1979;17:159-63.

10. Sokoll LJ, Chan DW. Prostate-specific antigen: its

discovery and biochemical characteristics. Urol Clin

North Am 1997;24:253-259.

11. Mattsson JM, Laakkonen P, Stenman UH, Koistinen

H. Antiangiogenic properties of prostate-specific

antigen (PSA). Scand J Clin Lab Invest 2009;69:447-

51.

12. Filella X, Molina R, Alcover J, Coca F, Zarco MA,

Ballesta AM. Influence of AFP, CEA and PSA on

the in vitro Production of Cytokines. Tumor Biology

2001;22:67-71.

13. Filella, X, Molina, Ballesta AM. PSA de origen

extraprostático. Detección e implicaciones clínicas. A:

Molina R, Ballesta AM, dirs. Biología y utilidad clínica

de los marcadores tumorales. Barcelona, 1999, p. 224-

7.

14. Yu H, Diamandis EP. Ultrasensitive time-resolved

immunofluorometric assay of prostate-spcific antigen

in serum and preliminary clinical studies. Clin Chem

1993;39: 2108-14.

15. Diamandis EP, Yu H, Sutherland DJA. Detection of

prostate-specific antigen immunoreactivity in breast

tumors. Breast Cancer Res Treat 1994;32:301-10.

http://www20.gencat.cat/docs/cancer/MERY/RECTIFICAT/Pla%20director%202010.pdf



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19751263








16. Yu H, Diamandis EP. Prostate-specific antigen in milk

of lactating women. Clin Chem 1995;41:54-8.

17. Filella X, Molina R, Alcover J, Carretero P, Ballesta

AM. Detection of nonprostatic PSA in serum and

nonserum samples from women. Int J Cancer

1996;68:424-7.

18. Diamandis EP. Prostate-specific antigen or human

kallikrein 3? Recent developments. Tumour Biol

1998;19:65-7.

19. Fuentes-Arderiu, X., The term Prostate-specific

antigen should be abandoned in favour of

semenogelase. eJIFCC 2010;21:1.

20. Yuan JJ, Coplen DE, Petros JA, Figenshau RS,

Ratliff TL, Smith DS, Catalona WJ. Effects of rectal

examination, prostatic massage, ultrasonography and

needle biopsy on serum prostate specific antigen

levels. J Urol 1992;147:810-4.

21. Klein LT, Lowe FC. The effect of prostatic

manipulation on Prostate-Specific Antigen levels.

Urol Clinics North America 1997;24:293-7.

22. Sturgeon C, Dati F, Duffy MJ, Hasholzner H,

Klapdor R, Lamerz R, Malbohan I, Martin M,

Troonen H, van Dalen A, Zwirner M. Quality

requirements and control - EGTM

recommendations.

<http://www.egtm.eu/recommendations.html>

(accés: 2013-2-17).

23. Guess HA, Heyse JF, Gormley GJ. The effect of

finasteride on prostate-specific antigen in men with

benign prostatic hyperplasia. Prostate 1993;22:31-7.

24. Singer EA, Palapattu GS, van Wijngaarden E.

Prostate-specific antigen levels in relation to

consumption of nonsteroidal anti-inflammatory

drugs and acetaminophen: results from the 2001-

2002 National Health and Nutrition Examination

Survey. Cancer. 2008;113:2053-7.

25. Algotar AM, Thompson PA, Ranger-Moore J,

Stratton MS, Hsu CH, Ahmann FR, Nagle RB,

Stratton SP. Effect of aspirin, other NSAIDs, and

statins on PSA and PSA velocity. Prostate.

2010;70:883-8.

26. Sokoll LJ, Bruzek DJ, Dua R, Dunn W, Mohr P,

Wallerson G, Eisenberger M, Partin AW, Chan DW.

Short-term stability of the molecular forms of

prostate-specific antigen and effect on percent

complexed prostate-specific antigen and percent free

prostate-specific antigen. Urology 2002;60(4 Suppl

1):24-30.

27. Stamey TA. Second Stanford conference on

international standardization of prostate-specific

antigen immunoassays: September 1 and 2, 1994.

Urology 1995;45: 173-84.

28. Anelli MC. Standardizzazione del PSA: tra

laboratorio e clinica. Ligand Assay 2006;11:129-31.

29. Jarrigue V. The need for a lower total PSA cut-off

value with PSA assays calibrated to the new WHO

standard. Clinical Laboratory International April

2007 <http://www.cli-

online.com/fileadmin/artimg/the-need-for-a-lower-

total-psa-cut-off-value-with-psa-assays-calibrated-to-

the-new-who-standard.pdf)> (accés: 26 gener 2013).

30. Jansen FH, Roobol M, Bangma CH, van Schaik RH.

Clinical impact of new prostate-specific antigen

WHO standardization on biopsy rates and cancer

detection. Clin Chem 2008;54:1999-2006.

31. Stephan C, Klaas M, Müller C, Schnorr D, Loening

SA, Jung K. Interchangeability of measurements of

total and free prostate-specific antigen in serum with

5 frequently used assay combinations: an update.

Clin Chem 2006;52:59-64.

32. Stephan C, Kramer J, Meyer HA, Kristiansen G,

Ziemer S, Deger S, Lein M, Loening SA, Jung K.






http://www.egtm.eu/recommendations.html





http://www.cli-online.com/fileadmin/artimg/the-need-for-a-lower-total-psa-cut-off-value-with-psa-assays-calibrated-to-the-new-who-standard.pdf




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jansen%20FH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roobol%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bangma%20CH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Schaik%20RH%22%5BAuthor%5D







Different prostate-specific antigen assays give

different results on the same blood sample: an

obstacle to recommending uniform limits for

prostate biopsies. BJU Int 2007;99:1427-31.

33. Myrtle JF, Klimley PG, Ivor LP, Bruni JF. Clinical

utility of prostate specific antigen in the management

of prostate cancer. Advances in Cancer Diagnostics.

San Diego, Hybritech, Inc, 1986.

34. Catalona WJ, Richie JP, deKernion JB, Ahmann FR,

Ratliff TL, Dalkin BL, Kavoussi LR, MacFarlane

MT, Southwick PC. Comparison of prostate specific

antigen concentration versus prostate specific

antigen density in the early detection of prostate

cancer: receiver operating characteristic curves. J

Urol 1994;152:2031-6.

35. Catalona WJ, Smith DS, Ornstein DK. Prostate

cancer detection in men with serum PSA

concentrations of 2.6 to 4.0 μg/L and benign

prostate examination. Enhancement of specificity

with free PSA measurements. JAMA 1997;277:1452-

5

36. Heidenreich A, Bolla M, Joniau S, Mason MD,

Matveev V, Mottet N, Schmid HP, van der Kwast

TH, Wiegel T, Zattoni F. Guidelines on Prostate

Cancer. European Urological Association, 2010.

<http://www.uroweb.org/gls/pdf/08_Prostate_Ca

ncer %20September%2022nd%202011.pdf> (accés:

2013-1-26).

37. Aus G, Bergdahl S, Holding P, Lilja H, Hugosson J.

Prostate cancer screening decreases the absolute risk of

being diagnosed with advanced prostate cancer—

results from a prospective, population-based

randomized controlled trial. Eur Urol 2007;51:659–

664.

38. Smith RA, Cokkinides V, Eyre HJ. American Cancer

Society Guidelines for the early detection of cancer,

2005. CA Cancer J Clin 2005;55:31-44.

39. American Urological Association. Prostate-Specific

Antigen Best Practice Statement: 2009 Update.

<http://www.auanet.org/content/guidelines-and-

quality-care/clinical-guidelines/main-

reports/psa09.pdf>. (accés: 2013_1_26).

40. Walter LC, Bertenthal D, Lindquist K, Konety BR.

PSA Screening Among Elderly Men With Limited Life

Expectancies. JAMA 2006;296:2336-42.

41. Schröder FH, Hugosson J, Roobol MJ, Tammela TL,

Ciatto S, Nelen V, Kwiatkowski M, Lujan M, Lilja H,

Zappa M, Denis LJ, Recker F, Berenguer A,

Määttänen L, Bangma CH, Aus G, Villers A, Rebillard

X, van der Kwast T, Blijenberg BG, Moss SM, de

Koning HJ, Auvinen A. Screening and prostate-cancer

mortality in a randomized European study. N Engl J

Med 2009;360:1320-8.

42. Andriole GL, Crawford ED, Grubb RL 3rd, Buys

SS, Chia D, Church TR, Fouad MN, Gelmann EP,

Kvale PA, Reding DJ, Weissfeld JL, Yokochi LA,

O’Brien B, Clapp JD, Rathmell JM, Riley TL, Hayes

RB, Kramer BS, Izmirlian G, Miller AB, Pinsky PF,

Prorok PC, Gohagan JK, Berg CD. Mortality results

from a randomized prostate-cancer screening trial. N

Engl J Med 2009;360:1310-9.

43. Barry MJ. Screening for prostate cancer - the

controversy that refuses to die. N Engl J Med

2009;360:1351-4.

44. Schröder FH, Roobol MJ. ERSPC and PLCO

prostate cancer screening studies: what are the

differences? Eur Urol 2010;58:46-52.

45. Chou R, Croswell JM, Dana T, Bougatsos C, Blazina

I, Fu R, Gleitsmann K, Koenig HC, Lam C, Maltz A,

Bruin Rugge J, Lin K. Screening for Prostate Cancer:
















http://www.uroweb.org/gls/pdf/08_Prostate_Cancer%20September%2022nd%202011.pdf

http://www.uroweb.org/gls/pdf/08_Prostate_Cancer%20September%2022nd%202011.pdf








A Review of the Evidence for the U.S. Preventive

Services Task Force. Ann Intern Med 2011;155:762-

771.

46. Scardino PT, Weaver R, Hudson MA. Early

detection of prostate cancer. Hum Pathol

1992;23:211-22.

47. McGregor M, Hanley JA, Boivin JF, McLean RG.

Screening for prostate cancer: estimating the

magnitude of overdetection. CMAJ 1998;159:1368-

72.

48. Etzioni R, Penson DF, Legler JM, di Tommaso D,

Boer R, Gann PH, Feuer EJ. Overdiagnosis due to

prostate-specific antigen screening: lessons from

U.S. prostate cancer incidence trends. J Natl Cancer

Inst 2002;94:981-90.

49. Bangma CH, Bul M, van der Kwast TH, Pickles T,

Korfage IJ, Hoeks CM, Steyerberg EW, Jenster G,

Kattan MW, Bellardita L, Carroll PR, Denis LJ,

Parker C, Roobol MJ, Emberton M, Klotz LH,

Rannikko A, Kakehi Y, Lane JA, Schröder FH,

Semjonow A, Trock BJ, Valdagni R. Active

surveillance for low-risk prostate cancer. Crit Rev

Oncol Hematol 2012 Aug 6.

50. Filella X, Alcover J, Molina R. Active surveillance in

prostate cancer: the need to standardize. Tumour

Biol 2011;32:839-43.

51. Filella X, Alcover J, Molina R, Carrere W, Carretero P,

Ballesta AM. Usefulness of Prostate-specific antigen

density as a diagnostic test of prostate cancer. Tumor

Biology 1996;17:20-26.

52. Secció Oncològica de l’Associació Catalana de Ciències

de Laboratori Clínic. Augments de la concentració de

marcadors tumorals en el plasma en absència de

neoplàsia. In vitro veritas 2010;11:28-59.

53. Trapé J, Filella X, Alsina-Donadeu M, Juan-Pereira L,

Bosch-Ferrer À, Rigo-Bonnin R; Oncology Section of

the Catalan Association of Clinical Laboratory Science.

Increased plasma concentrations of tumour markers in

the absence of neoplasia. Clin Chem Lab Med

2011;49:1605-20.

54. Carter HB, Pearson JD, Metter EJ et al. Longitudinal

evaluation of prostate specific antigen levels in men

with and without prostate disease. JAMA

1992;267:2215-20.

55. Oesterling JE, Jacobsen SJ, Chute GG et al. Serum

prostate-specific antigen in a community-based

population of healthy men. Establishment of age-

specific reference ranges. JAMA 1993;270:860-4.

56. Reed A, Ankerst DP, Pollock BH, Thompson IM,

Parekh DI. Current age and race adjusted prostate

specific antigen threshold values delay diagnosis of

high grade prostate cancer. J Urol 2007;178:1929-32.

57. Benson MC, Whang IS, Pantuck A et al. Prostate

specific antigen density: a means of distinguishing

benign prostatic hypertrophy and prostate cancer. J

Urol 1992;147:815-6.

58. Lilja H, Christensson A, Dahlén U et al. Prostate-

specific antigen in serum occurs predominantly in

complex with alpha-1-antichymotrypsin. Clin Chem

1991;37:1618-25.

59. Stenman UH, Leinonen J, Alfthan H et al. A complex

between Prostate-specific antigen and alfa-1-

antichymotrypsin is the major form of prostate-specific

antigen in serum of patients with prostatic cancer:

assay of the complex improves clinical sensitivity for

cancer. Cancer Res 1991;51:222-6.

60. Filella X, Alcover J, Molina R, Gimenez N, Rodriguez

A, Jo J, Carretero P, Ballesta AM. Clinical Usefulness

of free PSA fraction as an indicator of prostate cancer.

Int J Cancer 1995;63:780-4.

61. Tumour markers in prostate cancer – EGTM

recommendations.



<http://www.egtm.eu/recommendations.html>

(accés: 2013_1_26).

62. Sturgeon CM, Duffy MJ, Stenman UH, Lilja H,

Brünner N, Chan DW, Babaian R, Bast RC Jr,

Dowell B, Esteva FJ, Haglund C, Harbeck N, Hayes

DF, Holten-Andersen M, Klee GG, Lamerz R,

Looijenga LH, Molina R, Nielsen HJ, Rittenhouse H,

Semjonow A, Shih IeM, Sibley P, Sölétormos G,

Stephan C, Sokoll L, Hoffman BR, Diamandis EP.

National Academy of Clinical Biochemistry

laboratory medicine practice guidelines for use of

tumor markers in testicular, prostate, colorectal,

breast, and ovarian cancers. Clin Chem 2008;54:e11-

79.

63. Partin AW, Brawer MK, Bartsch G, Horninger W,

Taneja SS, Lepor H, Babaian R, Childs SJ, Stamey T,

Fritsche HA, Sokoll L, Chan DW, Thiel RP, Cheli

CD. Complexed prostate specific antigen improves

specificity for prostate cancer detection: results of a

prospective multicenter clinical trial. J Urol

2003;170:1787-91.

64. Filella X, Alcover J, Molina R, Corral JM, Carretero P,

Ballesta AM. Measurement of complexed PSA in the

differential diagnosis between prostate cancer and

benign prostate hyperplasia. The Prostate 2000;42:181-

185.

65. Mikolajczyk SD, Grauer LS, Millar LS, Hill TM,

Kumar A, Rittenhouse HG, Wolfert RL, Saedi MS.

A precursor form of PSA (pPSA) is a component of

the free PSA in prostate cancer serum. Urology

1997;50:710-4.

66. Khan MA, Partin AW, Rittenhouse HG, Mikolajczyk

SD, Sokoll LJ, Chan DW, Veltri RW. Evaluation of

proprostate specific antigen for early detection of

prostate cancer in men with a total prostate specific

antigen range of 4.0 to 10.0 μg/L. J Urol

2003;170:723-6.

67. Filella X, Alcover J, Molina R et al. Usefulness of

proprostate-specific antigen in the diagnosis of

prostate cancer. Anticancer Res 2007;27:607-610.

68. Mikolajczyk SD, Song Y, Wong JR, Matson RS,

Rittenhouse HG. Are multiple markers the future of

prostate cancer diagnostics? Clin Biochem

2004;37:519-28.

69. Filella X, Giménez N. Evaluation of [-2] proPSA

and Prostate Health Index (phi) for the detection of

prostate cancer: a systematic review and meta-

analysis. Clin Chem Lab Med 2012;15:1-11.

70. Filella X, Foj L, Milà M, Augé J.M., Molina R,

Jiménez W. PCA3 in the detection and management

of early prostate cancer. Tumor Biology (en premsa):

DOI:10.1007/s13277-013-0739-6.

71. Feneley MR, Partin AW. PSA and radical

prostatectomy. A: Brawer MK, dir. Prostate Specific

Antigen. Nova York: Marcel Dekker;2001. p. 189-

206.

72. Crook J. PSA and radiation therapy. A: Brawer MK,

dir. Prostate Specific Antigen. Nova York: Marcel

Dekker; 2001.p. 207-227.

73. Nielsen ME, Partin AW. The Impact of Definitions

of Failure on the Interpretation of Biochemical

Recurrence Following Treatment of Clinically

Localized Prostate Cancer. Rev Urol 2007;9:57–62.

74. American Society for Therapeutic Radiation and

Oncology Consensus Panel. Consensus statement:

Guidelines for PSA following radiation therapy. Int J

Radiat Oncol Biol Phys 1997;37:1035-41.

75. Roach M, Hanks G, Thames H Jr, Schellhammer P,

Shipley WU, Sokol GH, Sandler H. Defining

biochemical failure following radiotherapy with or

without hormonal therapy in men with clinically

localized prostate cancer: Recommendations of the

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Partin%20AW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brawer%20MK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bartsch%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Horninger%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Taneja%20SS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lepor%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Babaian%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roach%20M%203rd%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hanks%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thames%20H%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schellhammer%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shipley%20WU%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sokol%20GH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sandler%20H%22%5BAuthor%5D



RTOG-ASTRO Phoenix Consensus Conference. Int

J Radiat Oncol Biol Phys 2006;65:965-74.

76. Goldenberg SL, Ka Bianca E, Gleave ME. PSA and

hormonal therapy. A: Brawer MK, dir. Prostate

Specific Antigen. Nova York: Marcel Dekker;

2001.p. 229-260.

77. Chung CS, Chen MH, Cullen J, McLeod D, Carroll

P, D’Amico AV. Time to prostate-specific antigen

nadir after androgen suppression therapy for

postoperative or postradiation PSA failure and risk

of prostate cancer-specific mortality. Urology

2008;71:136-40.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chung%20CS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20MH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cullen%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McLeod%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carroll%20P%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22D'Amico%20AV%22%5BAuthor%5D


__________________________________________________________________________________________

Reflexions sobre els objectius i els requisits metrològics

en les ciències de laboratori clínic

Xavier Fuentes Arderiu1, Raül Rigo Bonnin2, Dolors Dot Bach2

1 Consultoria en Ciències de Laboratori Clínic, Barcelona

2 Laboratori Clínic, Hospital Universitari de Bellvitge, L’Hospitalet de Llobregat

_________________________________________________________________________________________

Introducció

El concepte de requisit s’ha de distingir clarament del

concepte d’objectiu qualitològic. Seguint

l’Organització Internacional de Normalització (ISO)

es pot dir que un objectiu qualitològic és allò que

s’ambiciona o es pretén, relacionat amb la qualitat;

mentre que un requisit és una necessitat o expectativa

establerta, generalment habitual per a l’organització

que es tracti, o obligatòria (1). En un altre document

(2), però, l'ISO defineix requisit com una disposició

que comporta criteris que cal complir. En l’àmbit de

les ciències de laboratori clínic, totes aquestes

definicions són acceptables.

Sobre els objectius metrològics

El sentit principal de l’establiment d’objectius

qualitològics en un laboratori clínic, com en

qualsevol altra organització, és la millora contínua de

la qualitat, inclosa la qualitat metrològica. Per això, és

habitual que un laboratori clínic decideixi lliurament

uns objectius metrològics, comunament anomenats

objectius analítics, per tal de millorar la mesura de les

magnituds biològiques. Com els objectius

metrològics són de lliure adopció, cada laboratori

clínic selecciona els que creu poder assolir en un

període de temps raonable.

El 1980, en una reunió escandinava d’experts, ja

s’afirmava que la precisió de mesura ha de ser prou

bona com per decidir quan una variació observada

en un individu és «normal» o «patològica», i que la

precisió també ha de permetre detectar variacions

fisiològiques individuals encara no descrites (3).

Partint d’aquestes afirmacions admeses per tota la

comunitat científica, s’infereix que la imprecisió


ISSN: 1697-5421

Reflexió-opinió

76 Fuentes Arderiu et al. In vitro veritas 2013;14:75-79


interdiària ideal hauria de ser zero. Conseqüentment,

els objectius metrològics han d’aconseguir disminuir

progressivament la imprecisió interdiària relacionada

amb cada magnitud biològica. Malauradament, en

general, la realitat està lluny de la situació ideal. Val a

dir, però, que amb el pas el temps, les propietats

metrològiques dels nous sistemes de mesura que

surten al mercat van millorant.

D’altra banda, segons la Guia per a l'expressió de la

incertesa de mesura (4), l’error sistemàtic quan es coneix

s’ha de restar de cada valor mesurat. Així, doncs,

l’error sistemàtic ideal és zero o, com a mal menor,

aquell que és conegut i es pot restar del valor

mesurat. Com que la imprecisió ideal i el biaix de

mesura ideals són zero, l’error de mesura ideal també

és zero.

En general, el grau de qualitat metrològica a que

poden arribar els laboratoris clínics està limitat pels

seus sistemes de mesura, els quals és raonable que es

mantinguin en funcionament el temps que determina

el seu període d'amortització. Per aquesta raó, sembla

prudent que l'establiment d'uns objectius metrològics

es faci d'una manera possibilista.

Pel que fa als sistemes de mesura comercial, cal tenir

en compte que, en general, la indústria del diagnòstic

in vitro es basa en un principi molt elemental, però

efectiu: les propietats metrològiques de cada sistema

de mesura han de ser millors que les dels models

anteriors i, si és possible, millors que les de la

competència. Si es revisa l’evolució dels sistemes de

mesura propis del laboratori clínic, es veu clarament

com han anat millorant les seves propietats

metrològiques.

Les entitats certificadores [Applus+, AENOR, entre

d’altres] o acreditadores [ENAC] exigeixen als

laboratoris clínics que volen ser certificats segons la

norma ISO 9001 (5), o acreditats segons la norma

ISO 15189 (6), que s’autoimposin objectius

metrològics i en facin un seguiment. Els laboratoris

clínics interessats en aquests processos solen adoptar

com a propis alguns dels diversos objectius

metrològics que es poden trobar a la bibliografia. I,

habitualment, les organitzacions esmentades es

limiten a comprovar que els laboratoris clínics

intentin aconseguir els objectius que es proposen.

Com que la situació ideal seria que no hi haguessin

errors de mesura i que la imprecisió interdiària i el

biaix de mesura fossin zero, els objectius metrològics

han de tendir a zero; tot i que en els mesuraments

químics, i encara més en els mesuraments

immunoquímics, és difícil aconseguir que el biaix de

mesura tendeixi a zero. A més, en els mesuraments

immunoquímics, en moltes ocasions, tampoc és fàcil

conèixer completament l’estructura dels components

moleculars de les magnituds individuals que s’han de

mesurar, tant en les mostres clíniques com en els

materials de referència.

Sobre els requisits metrològics

Se sap que un error de mesura és la suma d’un error

aleatori i un error sistemàtic. Quant més grans són

els errors de mesura, més difícil és la correcta

interpretació dels resultats corresponents a les

magnituds biològiques. Fins i tot aquests resultats

poden deixar de ser útils per a la finalitat mèdica que

justifica la seva sol·licitud. Idealment, els requisits

per als errors de mesura haurien d’adaptar-se als

requisits semiològics (que haurien de proposar els

metges sol·licitants) a partir dels quals s’acceptés la

idoneïtat mèdica d’una magnitud biològica.

De les diverses propietats metrològiques dels sistemes

de mesura emprats al laboratori clínic, les més

importants són la imprecisió interdiària i el biaix de

In vitro veritas 2013;14:75-79 Fuentes Arderiu et al. 77


mesura. Aquestes dues donen lloc a una de les

principals propietats metrològiques dels valors

mesurats: l’error de mesura. Així, doncs, cal establir

requisits per a aquestes tres propietats metrològiques.

Els requisits metrològics faciliten la consecució d’una

qualitat metrològica i semiològica acceptable. A més,

els requisits metrològics són necessaris per validar els

sistemes de mesura desenvolupats o modificats al

propi laboratori clínic.

Els requisits metrològics els haurien de poder

complir tots els sistemes de mesura i la gran majoria

de laboratoris clínics.

Els sistemes de mesura en venda a la Unió Europea

han estat aprovats segons una directiva europea de

l’any 1998 (7) que exigeix a la indústria del diagnòstic

in vitro que validi els sistemes de mesura que fabrica.

D’altra banda, els laboratoris clínics han de validar

els sistemes de mesura de fabricació casolana o els

comercials en cas que els hagin modificat. En aquest

procés de validació s’hauria de demostrar que els

valors de les propietats metrològiques principals

d’aquests sistemes de mesura no ultrapassen uns

certs valors, els requisits metrològics, prèviament

establerts. Però, sorprenentment, els documents

normatius —ja siguin lleis o simplement normes—

no contenen cap requisit metrològic per als sistemes

de mesura destinats al laboratori clínic, a diferència

del que passa en relació a altres productes sanitaris

dedicats als mesuraments per als que sí es descriuen

aquests tipus de requisits (8-10). A la Unió Europea

no hi ha cap requisit metrològic per a la indústria del

diagnòstic in vitro que faci referència als sistemes de

mesura dedicats al laboratori clínic.

Una altra cosa que es desprèn de la norma ISO 15189

(6) és que els laboratoris clínics només cal que facin

una verificació de les propietats metrològiques dels

sistemes de mesura validats per la indústria del

diagnòstic in vitro, sempre i quan els utilitzin seguint les

instruccions del fabricant. Si és la indústria del

diagnòstic in vitro la que ha de validar els sistemes de

mesura que comercialitza, és ella qui necessita uns

requisits metrològics per poder fer les validacions

esmentades; encara que aquests requisits metrològics

també els hauran d’aplicar a les seves validacions els

laboratoris clínics que, segons la norma ISO 15189 (6),

utilitzin sistemes de mesura no comercials o comercials

però modificats.

Amb el pas del temps, els sistemes de mesura poden

deteriorar-se, com qualsevol altre aparell, i les seves

propietats metrològiques inicials (per les quals van

ser aprovats per la Unió Europea) poden empitjorar.

Però, fins a quin punt poden empitjorar? Hauria

d’haver-hi uns requisits metrològics que limitessin

aquest empitjorament. Els laboratoris clínics, tant si

utilitzen sistemes de mesura comercials com

casolans, haurien d’estar subjectes a aquests requisits

metrològics.

Seguint aquest pensament, els requisits metrològics

han de ser més tolerants que les especificacions dels

pitjors sistemes de mesura —des del punt de vista

metrològic— aprovats per la Unió Europea.

Un altre aspecte de la norma ISO 15189 (6) relacionat

amb els requisits metrològics és que els laboratoris

clínics han de triar i participar en un o més programes

d’intercomparació, i han de satisfer els requisits

metrològics («criteris predeterminats de

funcionament», segons la norma esmentada) establerts

pels organitzadors dels programes. Habitualment, els

programes d’avaluació externa de la qualitat diuen als

laboratoris clínics participants quins són els requisits

que han de complir i les organitzacions certificadores o

acreditadores exigeixen el compliment d’aquests

78 Fuentes Arderiu et al. In vitro veritas 2013;14:75-79


requisits.

D’altra banda, en alguns països, entre els que

destaquen Alemanya (11) i Estats Units d’Amèrica

(12), els laboratoris clínics, per a algunes magnituds

biològiques, estan sotmesos legalment a requisits per

a l’error de mesura observat en un programa

d’intercomparació de valors mesurats entre

laboratoris clínics; en altres països no existeixen

requisits legals però s’han publicat recomanacions

sobre l’establiment i l’adopció de requisits

metrològics (13-15), que poden fer seves les

organitzacions certificadores o acreditadores.

Evolució històrica de l’establiment dels objectius i requisits metrològics

Durant el període comprés entre 1963 i 1999 es van fer

diverses propostes per a l’establiment d’objectius o

requisits metrològics, en molts casos difícilment

distingible si es tractava d’una cosa o una altra, (16-25).

Tot això va culminar amb una proposta de

jerarquització de les diverses propostes publicades (26),

sovint anomenada «el consens d’Estocolm». Val a dir,

però, que no tots els especialistes han estat d’acord

amb tots els punts de la proposta de jerarquització

esmentada (27, 28)

Dins l’àmbit de les ciències de la salut existeixen

precedents en l’establiment de requisits metrològics: els

fabricants de termòmetres clínics de vidre amb un bulb

de mercuri han de complir uns requisits metrològics

(8), com també ho han de fer els fabricants de sistemes

de mesura d’«autodiagnòstic» (9, 10). No obstant això,

la Unió Europea, malgrat va publicar una disposició

legal (7) sobre productes sanitaris per al diagnòstic in

vitro, fins ara no ha establert cap requisit metrològic per

als sistemes de mesura (analitzadors, en general)

específics del laboratori clínic.

Avui, l’establiment de requisits metrològics és un tema

controvertit, en el que, fonamentalment, hi ha

discrepàncies entre l’ús de dades de variabilitat

biològica o de l’estat actual de la tecnologia (29, 30).

Atès que fins ara no s’ha trobat un procediment

realment objectiu, i a l’hora factible, per a l’establiment

de requisits metrològics, el debat roman actualment

obert.

Bibliografia

1. International Organization for Standardization. Quality management systems — Fundamentals and vocabulary. ISO 9000:2005. Geneva: ISO; 2005.

2. International Organization for Standardization, International Electrotechnical Commission, Standardization and related activities — General vocabulary. ISO/IEC Guide 2:2004. Geneva: ISO; 2004.

3. Gräsbeck R. Implications of reference values in deciding upon the degree of tolerable variation in analytical procedures. A: Hørder M, dir. Assessing quality requirements in clinical chemistry. Helsinki: NORDKEM, 1980:25–7.

4. International Organization for Standardization, International Electrotechnical Commission, International Organization of Legal Metrology, International Bureau of Weights and Measures. Guide to the expression of uncertainty in measurement. Geneva: ISO; 1993.

5. International Organization for Standardization. Quality management Systems. Requirements. ISO 9001:2008. Geneva: ISO; 2008.

6. International Organization for Standardization. Medical laboratories—Particular requirements for quality and competence. ISO 15189:2012. Geneva: ISO; 2012.

7. European Parliament, Council of European Union. Directive 98/79 of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. Official Journal of European Communities 1998;(7.12.98):L331/1-L331/37.

8. Orden de 30 de diciembre de 1988, por la que se regulan los termómetros clínicos de mercurio, en vidrio y con dispositivo de máxima (BOE núm. 23, de 27 de enero de 1989). <http://www.cem.es/actualidad/legislacion/orden-de-30-de-diciembre-de-1988-sobre-termómetros-

http://www.cem.es/actualidad/legislacion/orden-de-30-de-diciembre-de-1988-sobre-term�metros-cl%C3%ADnicos-de-mercurio-en-vi

http://www.cem.es/actualidad/legislacion/orden-de-30-de-diciembre-de-1988-sobre-term�metros-cl%C3%ADnicos-de-mercurio-en-vi

In vitro veritas 2013;14:75-79 Fuentes Arderiu et al. 79


cl%C3%ADnicos-de-mercurio-en-vi>(Accés 2013-04-10).

9. European Committee for Standardisation. In vitro diagnostic test systems - Requirements for blood glucose monitoring systems for self-testing in managing diabetes mellitus (ISO/DIS 15197:2011). prEN ISO 15197:2011. Brussels: CEN; 2011.

10. International Organization for Standardisation. Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Requirements for in vitro monitoring systems for selftesting of oral-anticoagulant therapy. ISO/FDIS 17593:2006. Geneve: ISO; 2006.

11. Bundesärztekammer. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen. Beschluss des Vorstands der Bundesärztekammer vom 23.03.2012 <http://www.bundesaerztekammer.de/downloads/RiliBAEKLabor201205.pdf> [Federal Medical Board. Directive of the federal medical board for quality assurance in laboratory medicine. Deutsches Ärzteblatt 2008;105:A341–55.] (Accés 2013-04-10).

12. U.S. Department of Health and Human Services. Medicare, Medicaid, and CLIA Programs: Regulations implementing the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (CLIA). Final rule. Fed Regist 1992;57:7002–186.

13. Ricós C, Ramón F, Salas A, Buño A, Calafell R, Morancho J, Gutiérrez-Bassini G, Jou JM. Minimum analytical quality specifications of inter-laboratory comparisons: agreement among Spanish EQAP organizers. Clin Chem Lab Med 2012;50:455–61.

14. RCPA Chemical Pathology Quality Assurance Programs, Australasian Association of Clinical Biochemists. Revision of allowable límits of performance.<http://www.rcpaqap.com.au/chempath/gendocs/uploadedfiles/Allowable-Limits.pdf> (Accés 2013-04-10).

15. Commission suisse pour l’assurance de qualité dans le laboratoire médical. Concept d'assurance qualité dans le laboratoire médical.< http://www.hplus.ch/fileadmin/user_upload/Qualitaet___Patientensicherheit/Qualitaet/QUALAB/Concept_QUALAB.pdf> (Accés 2013-04-10).

16. David B. Tonks DB. A study of the accuracy and precision of clinical chemistry determinations in 170 Canadian laboratories. Clin Chem 1963;9:217–33.

17. Barnett RN. Medical significance of laboratory results. Am J Clin Pathol 1968;50:671–6.

18. Campbell DG, Owen JA. The physician’s view of laboratory performance. Aust Ann Med 1969;18:4–6.

19. Harris EK. Distinguishing physiologic variation from analytic variation. J Chron Dis 1970;23:469–80.

20. Harris EK. Statistical principles underlying analytic goalsetting in clinical chemistry. Am J Clin Pathol 1979;72:374–82.

21. Sckendzel LP. How physicians use laboratory tests. JAMA 1978;239:1077–80.

22. Elion-Gerritzen WE. Analytical precision in clinical chemistry and medical decisions. Am J Clin Pathol 1980;73:183–95.

23. Harris EK. Proposed goals for analytical precision and accuracy in single-point diagnostic testing. Arch Pathol Lab Med 1988;112:416–20.

24. Ross JW, Fraser MD. Clinical laboratory precision. The state of the art and medical usefulness based on internal quality control. Am J Clin Pathol 1982;78(4 Suppl):578–86.

25. Fraser CG, Hyltoft Petersen P, Libeer JC, Ricos C. Proposals for setting generally applicable quality goals solely based on biology. Ann Clin Biochem 34:8–12.

26. Kenny D, Fraser CG, Hyltoft Petersen P, Kallner A. Consensus agreement [Conference on Strategies to set global quality specifications in laboratory medicine. Stockholm April 24-26, 1999.] Scand J Clin Lab Invest 1999;59:585.

27. Fuentes-Arderiu X, Miró-Balagué J. State of the art instead of biological variation to set requirements for imprecision. Clin Chem 2000;46:1715–6.

28. Badrick T, Hawkins RC, Wilson SR, Hickman PE. Uncertainty of measurement: what it is and what it should be. Clin Biochem Rev 2005;26:155–8:

29. Fuentes-Arderiu X. Remembering the ―Stockholm consensus‖. Accred Qual Assur 2010;15:581–4.

30. Hyltoft Petersen P, Fraser CG. Strategies to set global analytical quality specifications in laboratory medicine: 10 years on from the Stockholm consensus conference. Accred Qual Assur 201015:323–30

http://www.rcpaqap.com.au/

http://www.hplus.ch/fileadmin/user_upload/


__________________________________________________________________________________________

La cromatografia com a principi de mesura: classificació,

fonaments teòrics i aplicació en les ciències de laboratori

clínic

Raül Rigo Bonnin


_________________________________________________________________________________________

ÍNDEX

1. Introducció

2. Vocabulari

3. Sigles i símbols

4. Classificació dels principis cromatogràfics 4.1 Classificació segons el procediment cromatogràfic desenvolupat

4.1.1 Cromatografia frontal 4.1.2 Cromatografia per desplaçament 4.1.3 Cromatografia per elució

4.2 Classificació segons el tipus de llit cromatogràfic 4.2.1 Cromatografia en columna 4.2.2 Cromatografia plana

4.3 Classificació segons l’estat físic de la fase mòbil 4.3.1 Cromatografia de gasos 4.3.2 Cromatografia de líquids 4.3.3 Cromatografia de fluids supercrítics

4.4 Classificació segons el mecanisme de separació 4.4.1 Cromatografia d’adsorció 4.4.2 Cromatografia de repartiment 4.4.3 Cromatografia de bescanvi iònic 4.4.4 Cromatografia d’exclusió 4.4.5 Cromatografia d’afinitat

5. Fonaments teòrics de la cromatografia 5.1 Paràmetres de retenció 5.2 Paràmetres de retenció 5.3 Paràmetres de separació 5.4 Paràmetres d’eficàcia


ISSN: 1697-5421

Revisió

81 Raül Rigo Bonnin In vitro veritas 2013;14:80-103


5.4.1 Teoria del plat 5.4.2 Teoria de la velocitat o cinètica

5.4.2.1 Terme A de l’equació de Van Deemter: difusió per turbulència o difusió d’Eddy; terme del camí múltiple

5.4.2.2 Terme B de l’equació de Van Deemter: difusió longitudinal 5.4.2.3 Terme C de l’equació de Van Deemter: resistència a la transferència de massa

5.4.3 Altres factors que influeixen en l’eficàcia 5.5 Paràmetres de simetria 5.6 Paràmetres de resolució

6. Aplicació de la cromatografia en les ciències de laboratori clínic 6.1 Anàlisi qualitativa 6.2 Anàlisi quantitativa

6.2.1 Procediment del patró extern 6.2.2 Procediment del patró intern 6.2.3 Procediment de normalització d’àrees

6.3 Exemple de propietats qualitatives i magnituds biològiques que poden ser examinades o mesurades mitjançant sistemes cromatogràfics 6.3.1 Cromatografia d’adsorció 6.3.2 Cromatografia de repartiment 6.3.3 Cromatografia de bescanvi iònic 6.3.4 Cromatografia d’exclusió molecular 6.3.5 Cromatografia d’afinitat

7. Bibliografia

1. INTRODUCCIÓ

El descobriment de la cromatografia com a principi

de mesura es va produir a mitjans del segle XIX quan

el químic alemany Friedrich Runge va utilitzar paper

de filtre per a la separació de diverses anil·lines.

Posteriorment, l'any 1910, el botànic rus Mikhail

Tswet va usar columnes d'adsorció de líquids per

separar pigments vegetals (clorofil·les i xantofil·les).

Twset feia passar diferents dissolucions d‟aquestes

substàncies a través d'una columna de vidre farcida

de carbonat de calci que, finament dividit, donava un

material porós que interaccionava de forma diferent

amb els components de la barreja, separant-los en

distintes bandes de colors al llarg de la columna. A

aquest procés de separació el va anomenar

“cromatografia” (del grec chroma i graphein que

signifiquen "color" i "escriure", respectivament).

Després del seu descobriment, la cromatografia va

quedar pràcticament oblidada fins l‟any 1930, any en

què va ser redescoberta per Richard Kuhn i Edgard

Lederer, els quals la van aplicar per a la separació de

diferents carotenoïds. A partir d'aquest moment, l'ús

de la cromatografia es va anar estenent cada vegada

més, alhora que es varen anar desenvolupant

diferents tipus de la mateixa: la cromatografia de

repartiment, descoberta per Archer Martin i Richard

Synge el 1941; la cromatografia de paper, descrita per

primera vegada per Ralph Consden, Andrew Gordon

i Archer Martin el 1944; la cromatografia en capa

fina, descoberta per Egon Stahl el 1958; entre altres.

Una fita important de la cromatografia va ser el

descobriment de la cromatografia de gasos,

desenvolupada per Archer Martin i Anthony James el

1952, i la cromatografia líquida d‟alta eficàcia,

descoberta per Csaba Horváth el 1962, les quals van

trobar ràpidament multitud d‟aplicacions de gran

importància a l‟àmbit de les ciències de laboratori.

Aquests descobriments van originar el

desenvolupament de les teories de la separació

In vitro veritas 2013;14:80-103 Raül Rigo Bonnin 82


cromatogràfica vigents en l‟actualitat: teoria del plat

teòric (Archer Martin i Richard Synge el 1952) i la

teoria de la velocitat (JJ Van Deemter el 1956 i

Calvin Giddings el 1965) (1-6).

Amb el temps, els sistemes amb procediments de

mesura basats en mètodes cromatogràfics (sistemes

cromatogràfics) han adquirit un paper més rellevant

en les ciències de laboratori clínic donades les seves

elevades capacitats per separar, aïllar, identificar i

quantificar diversos components d‟una mostra.

Aquestes característiques, conjuntament amb les

propietats metrològiques que presenten, ha fet que

avui dia se‟ls arribi a considerar procediments de

mesura de referència.

La cromatografia permet la separació dels

components d'una mostra degut a la influència de

dos efectes contraposats:

a) Retenció. És l'efecte produït sobre els

components d‟una mostra per una fase

estacionària, que pot ser un sòlid o un líquid

ancorat en un suport sòlid.

b) Desplaçament. És l'efecte exercit sobre els

components d‟una mostra per una fase mòbil,

que pot ser un líquid, un gas o un fluid

supercrític.

En primer lloc, en un procés cromatogràfic, la

mostra (o un extracte de la mostra) que conté els

components a separar ha de ser dissolta en la fase

mòbil. Posteriorment, la fase mòbil és impulsada a

través d'una fase immòbil, que ha de ser immiscible

(insoluble) amb ella, la qual es coneix com a fase

estacionària, i que pot ser sòlida o líquida. Les fases

són escollides de tal manera que els components de

les mostres presenten diferències quant a les seves

propietats fisicoquímiques (solubilitat, grandària,

força iònica, polaritat, afinitat, entre altres) per a cada

fase. Les interaccions químiques entre la fase mòbil i

la mostra, i entre la mostra i la fase estacionària,

determinen el grau de migració, separació i retenció

dels components continguts en la mostra. Aquells

components que són fortament retinguts per la fase

estacionària es mouen lentament amb el flux de la

fase mòbil; per contra, els components que s'uneixen

dèbilment a la fase estacionària, es mouen amb

rapidesa. Com a conseqüència de la diferent

mobilitat, els components de la mostra se separen en

zones o bandes discretes podent ser identificats i

quantificats.

Aquest document pretén donar a conèixer els

fonaments bàsics de la cromatografia, així com

enumerar els diferents tipus de cromatografia

existents en l‟actualitat i les seves principals

aplicacions en les ciències de laboratori clínic.

2. VOCABULARI

En aquest document són aplicables, entre altres, els

termes cromatogràfics o químics de la Federació

Internacional de Química Pura i Aplicada (d'ara

endavant, IUPAC) (7, 8):

Columna: tub que conté la fase estacionària i a

través del qual discorre la fase mòbil

columna farcida: tub que conté un farciment sòlid

columna oberta: columna, generalment de petit

diàmetre, en la qual tant la paret interna del tub com

un líquid o un sòlid actiu dipositat sobre aquesta

paret actuen com a fase estacionària i on existeix un

camí obert, sense restriccions, pel qual circula la fase

mòbil

cromatografia: principi de mesura físic de separació

en el qual els components a separar d‟una mostra es

distribueixen entre dues fases, una que és

estacionària (fase estacionària) mentre que l'altra, (la

fase mòbil) es mou en una direcció determinada

cromatograma: gràfic o altre tipus de representació

de la resposta d‟un detector, de la concentració del



component d‟una mostra en l‟efluent o d‟una altra

magnitud utilitzada per mesurar una propietat de

l‟efluent, enfront al volum o temps de retenció dels

components d‟una mostra

cromatògraf: sistema de mesura que permet dur a

terme la separació cromatogràfica

NOTA: L‟expressió sistema cromatogràfic, sovint

s‟empra per designar un cromatògraf.

difusió: extensió, propagació, dispersió o

disseminació d‟un material gasós o líquid

efluent: fase mòbil que surt de la columna

cromatogràfica

elució: fenomen de migració dels components d'una

mostra al llarg de la fase estacionària, impulsats per la

fase mòbil

elució isocràtica: tipus d‟elució on la composició de

la fase mòbil roman constant durant tot el procés

cromatogràfic

elució en gradient: tipus d‟elució on la composició

de la fase mòbil canvia contínuament o en diferents

passos durant el procés cromatogràfic

factor de retenció: mesura del temps que un

component d‟una mostra roman en la fase

estacionària, en relació al temps que roman en la fase

mòbil

factor de separació: valor de la retenció relativa

entre dos pics cromatogràfics pròxims

fase estacionària: una de les dues fases que formen

part d‟un sistema cromatogràfic. Pot ser un sòlid, un

gel, o un líquid. Si és un líquid, pot estar adherit

sobre un sòlid. Aquest sòlid pot o no contribuir al

procés de separació. El líquid també es pot unir

químicament al sòlid (fase unida químicament) o

immobilitzar-se sobre el sòlid (fase immobilitzada)

NOTA: L‟expressió llit cromatogràfic o sorbent, fa

referència a qualsevol de les formes en les que es

presenta la fase estacionària.

fase unida químicament: fase estacionària que es

troba covalentment unida a les partícules del suport

o a la paret interna del tub de la columna

fase immobilitzada: fase estacionària que es troba

immobilitzada sobre les partícules del suport o sobre

la paret interna del tub de la columna

fase mòbil: fluid que penetra a través o al llarg del

llit cromatogràfic en una direcció determinada. El

fluid pot ser un líquid, un gas o un fluid supercrític

flux: volum de fase mòbil que passa a través de la

columna per unitat de temps

nombre de plats: nombre que indica les prestacions

i eficàcia d‟una columna

pic cromatogràfic: part d'un cromatograma que

mostra la resposta del detector quan un component

d‟una mostra és eluït de la columna. Dos o més

components es poden eluir com un pic sense

resoldre quan la seva separació és incompleta

polaritat (química): propietat d‟un enllaç químic,

un àtom o una molècula per la qual existeix una

separació estable entre les càrregues positives i

negatives

pressió crítica: pressió mínima que seria suficient

per liquar una substància a la seva temperatura crítica

resolució: separació entre dos pics cromatogràfics

amb relació a les mitjanes de les seves amplades a la

base

sòlid actiu: sòlid porós amb propietats adsortives

que permet dur a terme una separació cromatogràfica

solut: components d‟una mostra en una

cromatografia de repartiment

suport sòlid: sòlid que sosté la fase estacionària i

que, idealment, no contribueix al procés de separació

temperatura crítica: temperatura a partir de la qual

no es pot liquar un gas

temps bàsic de retenció: temps transcorregut

requerit per eluir un component d‟una mostra on la

seva concentració en la fase estacionària és

menyspreable comparada amb la de la fase mòbil, és

dir, la fase estacionària no reté l‟esmentat

component. Així, el temps bàsic és el temps total de

retenció d‟un component que no és retingut

NOTA: Al temps bàsic de retenció també se

l‟anomena pel terme no recomanat per la

IUPAC temps mort.



temps de retenció ajustat: temps total de retenció

menys el temps bàsic de retenció

temps total de retenció: temps transcorregut des

que el component d‟una mostra és injectat fins que

arriba al detector

volum bàsic de retenció: volum de fase mòbil

requerit per eluir un component d‟una mostra on la

seva concentració en la fase estacionària és

menyspreable comparada amb la de la fase mòbil, és

dir, la fase estacionària no reté l‟esmentat

component. Així, el volum bàsic és el volum total de

retenció d‟un component que no és retingut

NOTA: Al volum bàsic de retenció també se


IUPAC volum mort.

volum de retenció ajustat: volum total de retenció

menys el volum bàsic de retenció

volum extra-columna: volum existent entre el punt

d‟injecció real d‟una mostra i els punts reals de

detecció dels components de la mateixa, excloent el

volum de la columna, és a dir, la suma dels volums

de l'injector, les línies de connexió i del detector

NOTA: Al volum extra-columna també se


IUPAC volum mort.

volum total de retenció: volum de fase mòbil que

entra en la columna des del moment de la injecció

fins el moment de la sortida del pic cromatogràfic

zona o banda cromatogràfica: regió del llit

cromatogràfic on es localitzen un o més components

d‟una mostra

3. SIGLES I SÍMBOLS

En aquest document són aplicables les sigles i els

símbols següents recomanats per la Federació

Internacional de Química Pura i Aplicada (7):

α : factor de separació (o factor de selectivitat)

: relació de fases

γ : factor d'impediment que depèn de les

característiques del rebliment d‟una columna

cromatogràfica

λ : constant que depèn de les dimensions, geometria i

uniformitat de l'empaquetament d‟una columna

cromatogràfica

: desviació estàndard d‟una corba de Laplace-

Gauss característica d‟un pic cromatogràfic

A : terme de l‟equació de Van Deemter corresponent

a la difusió d‟Eddy

Af : factor d‟asimetria

B : terme de l‟equació de Van Deemter corresponent

a la difusió longitudinal

C : terme de l‟equació de Van Deemter corresponent

a la transferència de massa

Ci(M) : concentració molar d‟un component i d‟una

mostra en la fase mòbil

Ci(S) : concentració molar d‟un component i d‟una

mostra en la fase estacionària

CM : terme C de l‟equació de Van Deemter

corresponent a la transferència de massa en la fase

mòbil

CS : terme C de l‟equació de Van Deemter

corresponent a la transferència de massa en la fase

estacionària

Df : espessor mitjà de recobriment d‟una columna

cromatogràfica

DM : coeficient de difusió de la fase mòbil

DS : coeficient de difusió de la fase estacionària

dp : diàmetre mitjà de les partícules de la fase

estacionària

Fc : flux de fase mòbil que travessa una columna

determinada

f(k) : funció matemàtica que depèn del factor de

retenció (k)

H : alçada del plat (teòric)

IUPAC : Federació Internacional de Química Pura i

Aplicada

k : factor de retenció (o factor de capacitat)

Kc : coeficient de distribució o constant de

distribució



L : longitud d‟una columna cromatogràfica

N : nombre de plats (teòrics)

RS : Resolució cromatogràfica

tM : temps bàsic de retenció

tR : temps total de retenció

t’R : temps de retenció ajustat

u : velocitat lineal mitjana de la fase mòbil

VM : volum de la fase mòbil i volum bàsic de

retenció

VR : volum total de retenció

V’R : volum de retenció ajustat

VS : volum de la fase estacionària

wb : amplada d‟un pic cromatogràfic

wh : amplada d‟un pic cromatogràfic a la meitat de la

seva alçada

Wi(M) : nombre de mols d‟un component i d‟una

mostra en la fase mòbil

Wi(S) : nombre de mols d‟un component i d‟una

mostra en la fase estacionària

4. CLASSIFICACIÓ DELS PRINCIPIS CROMATOGRÀFICS

La IUPAC classifica la cromatografia en funció del

procediment cromatogràfic desenvolupat, del tipus

de llit cromatogràfic (fase estacionària) utilitzat, de

l‟estat físic de la fase mòbil i del mecanisme de

separació que té lloc (7).

4.1 Classificació segons el procediment cromatogràfic desenvolupat

Atenent al procediment cromatogràfic desenvolupat,

la cromatografia es classifica en cromatografia

frontal, cromatografia per desplaçament o

cromatografia per elució.

4.1.1 Cromatografia frontal

La cromatografia frontal és un mètode cromatogràfic

en què la mostra (líquid o gas) s'introdueix de forma

contínua dins del llit cromatogràfic. En la

cromatografia frontal no s'utilitza cap fase mòbil

addicional.

4.1.2 Cromatografia per desplaçament

La cromatografia per desplaçament és un mètode

cromatogràfic en què la fase mòbil conté un

component (el desplaçant), que està més fortament

retingut que els components de la mostra a estudiar.

La mostra s'introdueix en el sistema cromatogràfic

en una quantitat determinada.

4.1.3 Cromatografia per elució

La cromatografia per elució és un mètode

cromatogràfic en què la fase mòbil passa

contínuament a través o al llarg d'un llit

cromatogràfic, i la mostra s'introdueix en el sistema

en una quantitat determinada.

4.2 Classificació segons el procediment cromatogràfic desenvolupat

Atenent al tipus de fase estacionària emprada, la

cromatografia es classifica en cromatografia en

columna o en cromatografia plana.

4.2.1 Cromatografia en columna

La cromatografia en columna és un mètode

cromatogràfic en què el llit cromatogràfic està dins

d'un tub. Les partícules de la fase estacionària sòlida,

o del suport recobert amb la fase estacionària líquida,

poden omplir el volum intern del tub (columna

farcida), o concentrar-se sobre o al llarg de la paret

interna del tub, deixant un camí obert sense

restricció, a la part mitjana, pel qual circula la fase

mòbil (columna oberta) (Figura 1).



Figura 1. a) Esquema instrumental de la cromatografia en columna. b)

Mecanisme de funcionament de la cromatografia en columna: 1. La

mostra es diposita sobre el llit cromatogràfic (fase estacionària), 2. La

mostra penetra en el llit cromatogràfic, 3. S’afegeix la fase mòbil, 4-6.

Els components de la mostra descendeixen amb la fase mòbil i són

separats en funció de la seva interacció amb la fase estacionària, 7-9.

S’elueixen els diferents components de la mostra.

Figura 2. a) Esquema instrumental de la cromatografia plana. b)

Mecanisme de funcionament de la cromatografia plana: 1. Aplicació

de la mostra, 2. Se submergeix l’extrem inferior del pla (paper o placa)

en la fase mòbil, 3-5. Els components de la mostra ascendeixen amb la

fase mòbil (dissolvent) i són separats en funció de la seva interacció

amb la fase estacionària, 6. S’identifica el front d’elució del dissolvent

i es deixa assecar el paper o placa, 7. Es revela els components de la

mostra ja separats i es mesura la distància recorreguda de cada un

d’ells.

4.2.2 Cromatografia plana

La cromatografia plana és un mètode cromatogràfic

en què la fase estacionària és un pla o està sobre un

pla. Aquest pla pot ser un paper utilitzat com a tal, o

impregnat amb una substància a mode de llit

estacionari (cromatografia en paper), o bé una capa

de partícules sòlides que recobreixen un suport, com

per exemple una placa de vidre (cromatografia en

capa fina). Sovint, la cromatografia en pla s'anomena

també cromatografia de llit obert (Figura 2).

4.3 Classificació segons l’estat físic de la fase mòbil

El mètodes cromatogràfics es classifiquen, sovint,

indicant l'estat físic de les dues fases utilitzades.

Segons aquesta classificació, s'utilitzen les següents

expressions:

- Cromatografia gas-líquid. La fase mòbil és un gas i

la fase estacionària és un líquid no volàtil

ancorat en un suport sòlid.

- Cromatografia gas-sòlid. La fase mòbil és un gas i la

fase estacionària és un sòlid.

- Cromatografia líquid-líquid. La fase mòbil és un

líquid i la fase estacionària és un líquid ancorat

sobre un sòlid.

- Cromatografia líquid-sòlid. La fase mòbil és un

líquid i la fase estacionària és un sòlid.

Tot i això, el més comunament emprat és la

classificació de la cromatografia atenent només a

l‟estat físic en què es troba la fase mòbil. Així, la

cromatografia es classifica en cromatografia de gasos,

cromatografia de líquids o líquida i cromatografia de

fluids supercrítics.



4.3.1 Cromatografia de gasos

La cromatografia de gasos és un mètode

cromatogràfic en què la fase mòbil és un gas. Aquest

tipus de cromatografia es duu a terme sempre en

columna.

4.3.2 Cromatografia de líquids

La cromatografia de líquids o cromatografia líquida

és un mètode cromatogràfic en què la fase mòbil és

un líquid. Aquest tipus de cromatografia es pot dur a

terme en columna o en pla.

4.3.3 Cromatografia de fluids supercrítics

La cromatografia de fluids supercrítics és un mètode

cromatogràfic en què la fase mòbil és un fluid

lleugerament per damunt de la seva temperatura i

pressió crítiques.

4.4 Classificació segons el mecanisme de separació

Atenent al tipus d‟interacció que s‟estableix entre els

diferents components d‟una mostra i les fases mòbils

i estacionàries, la cromatografia es classifica en

cromatografia d‟adsorció, de repartiment, de

bescanvi iònic, d‟exclusió i d‟afinitat.

4.4.1 Cromatografia d’adsorció

La cromatografia d‟adsorció és un mètode

cromatogràfic en què la separació dels components

d‟una mostra es basa fonamentalment en les

diferents afinitats d'adsorció dels mateixos cap a la

superfície d'un sòlid actiu (Figura 3). La fase

estacionària és un sòlid polar que és capaç d‟adsorbir

els components de la mostra mitjançant interaccions

de tipus polar.

Figura 3. Esquema de la cromatografia d’adsorció. La separació

cromatogràfica es duu a terme mitjançant una sèrie de processos

d’adsorció/desorció dels components d’una mostra sobre la

superfície d’un sòlid.

4.4.2 Cromatografia de repartiment

La cromatografia de repartiment és un mètode

cromatogràfic en què la separació dels diferents

components d‟una mostra es basa fonamentalment

en les diferències de solubilitat del mateixos en la

fase estacionària (com per exemple, en la

cromatografia de gasos) o en les diferències de

solubilitat entre la fase mòbil i la fase estacionària

(com per exemple, en la cromatografia de líquids)

(Figura 4).

Figura 4. Esquema de la cromatografia de repartiment. La

separació cromatogràfica es duu a terme mitjançant un

repartiment dels components d’una mostra entre dos líquids o

entre un gas i un líquid.

4.4.3 Cromatografia de bescanvi iònic

La cromatografia de bescanvi iònic és un mètode


d‟una mostra es basa fonamentalment en la seva

diferent susceptibilitat per a l‟intercanvi d‟ions

(Figura 5). La fase estacionària és un sòlid que



presenta grups funcionals ionitzables que

s‟intercanvien pels ions presents en la fase mòbil.

Figura 5. Esquema de la cromatografia de bescanvi iònic. La

separació cromatogràfica es duu a terme mitjançant un intercanvi

dels components iònics d’una mostra sobre la superfície d’un

sòlid ionitzat.

4.4.4 Cromatografia d’exclusió

La cromatografia d‟exclusió (molecular) és un

mètode cromatogràfic en què la separació dels

components d‟una mostra es basa fonamentalment

en un efecte d'exclusió, com ara les diferències en la

mida o forma de les molècules (Figura 6). Els termes

cromatografia de filtració sobre gel o cromatografia de

permeabilitat sobre gel, s'han utilitzat amb anterioritat

per descriure aquest procés quan la fase estacionària

és un gel inflat.

Figura 6. Esquema de la cromatografia d’exclusió molecular. La

separació cromatogràfica es duu a terme mitjançant la diferència

de mida o forma dels components d’una mostra sobre la

superfície d’un sòlid porós.

4.4.5 Cromatografia d’afinitat

La cromatografia d‟afinitat és un mètode


d‟una mostra es basa fonamentalment en la seva

interacció biològica específica amb la fase

estacionària (Figura 7). Aquestes interaccions poden

ser del tipus antigen-anticòs, enzim-substrat, metall-

agent quelant o lligand-receptor.

Figura 7. Esquema de la cromatografia d’afinitat. La separació

cromatogràfica es duu a terme mitjançant una interacció biològica

específica entre els components de la mostra i la superfície d’un

sòlid.

5. FONAMENTS TEÒRICS DE LA CROMATOGRAFIA

Donat que el tipus de cromatografia que presenta un

major nombre d‟aplicacions dins de l‟àmbit de les

ciències de laboratori clínic és la cromatografia en

columna, els diferents paràmetres i conceptes bàsics

als quals es fan referència a continuació estan dirigits,

principalment, a aquest tipus de cromatografia.

En un procés cromatogràfic es poden distingir els

processos termodinàmics, relacionats amb la

capacitat de retenció o la diferent migració dels

components d‟una mostra, i els processos cinètics,

relacionats amb l'amplada de pic cromatogràfic

produït com a conseqüència de la diferent velocitat a

la que es mouen els components d‟una mostra (1-6).

5.1 Paràmetres de distribució

Els components d'una mostra a separar, en el seu

desplaçament al llarg del sistema cromatogràfic, es

mouen a diferents velocitats depenent de l'afinitat de

cada un per la fase estacionària, respecte a la fase



mòbil. Cadascun d'ells es distribueix entre les dues

fases segons un equilibri. Pel component i:

i mòbil i estacionària

Aquest equilibri està caracteritzat per una constant

anomenada coeficient de distribució o constant de distribució

(Kc):

on Wi(S) i Wi(M) són el nombre de mols del

component i en les fases estacionària i mòbil, mentre

que VS i VM són els volums de la fase estacionària i

mòbil, respectivament. Idealment, Kc és constant en

un ampli interval de concentracions del component i

per tant, la seva concentració molar en la fase

estacionària (Ci(S)) és directament proporcional a la

seva concentració molar en la fase mòbil (Ci(M)).

Quan es dona aquesta situació, que és el més

habitual, s‟obtenen pics cromatogràfics gaussians i

temps de retenció que són independents de la

quantitat del component d‟una mostra que és

injectada.

5.2 Paràmetres de retenció

En la Figura 8 es pot observar un cromatograma

característic d‟una mostra que conté un únic

component (pic cromatogràfic gran). El pic

cromatogràfic petit, correspon a un component que

no és retingut en la columna cromatogràfica i que

sovint es troba en la mostra.

El temps total de retenció (tR) presenta dos

components: un d‟ells és el temps bàsic de retenció o

temps mort (tM), el qual és el mateix per a tots els

components en un sistema cromatogràfic determinat,

i l‟altre és el temps de retenció ajustat (t’R), que és el

temps que realment s‟inverteix en la retenció d‟un

component d‟una mostra per la fase estacionària i

per tant és específic de cada component a separar

(Figura 8):

Figura 8. Cromatograma característic d’una mostra que conté un únic

component on es poden observar els diferents paràmetres de retenció.

Les característiques de retenció dels components

d‟una mostra, en la pràctica, se solen descriure

mitjançant un factor anomenat factor de retenció

(anomenat també pel terme no recomanat per la

IUPAC factor de capacitat), k, definit per la relació

entre el nombre de mols del component i d‟una

mostra en la fase estacionària (Wi(S)) i la fase mòbil

(Wi(M)):

i relacionat amb el coeficient de distribució, Kc (equació

[1]) i els volums de les fases mòbil i estacionària per:

on VM és el volum de fase mòbil, VS és el volum de

fase estacionària. La relació VM/VS s‟anomena relació

de fases, , i és un dels paràmetres que s‟empren per

caracteritzar una columna cromatogràfica.

L‟equació [3] representa la relació entre la

probabilitat que el component d‟una mostra

romangui en la fase estacionària i en la fase mòbil.

Aquesta relació de probabilitats és també igual a la

relació entre el temps que, en mitjana, el component



d‟una mostra roman en la fase estacionària i en la

fase mòbil:

Donada aquesta situació i sabent que la mesura

directa de Wi(S) i Wi(M) sol ser difícil, el càlcul del

factor de retenció generalment es porta a terme a

partir dels temps de retenció, els quals són propietats

fàcilment mesurables en un cromatograma:

Donat que el volum de retenció és proporcional al

temps de retenció (VR = tR·Fc, sent Fc el flux de fase

mòbil que travessa la columna), qualsevol relació que

s‟expressi com un quocient de temps pot expressar-

se també com el quocient de volums corresponent:

sent, VR, el volum total de retenció; VM, el volum

bàsic de retenció o volum mort i V’R, el volum de

retenció ajustat.

Per altra banda, el volum total de retenció és una

propietat d'utilitat en moltes ocasions. De l'equació

[7] es dedueix que,

Aïllant k de l‟equació [4] i substituint-la a l‟equació

[8] es relaciona el volum total de retenció amb el

coeficient de distribució (Kc):

El factor de retenció és un paràmetre important

perquè és independent del flux de la fase mòbil i de

les dimensions de la columna, i es pot utilitzar per

comparar retencions de distints components d‟una

mostra que s‟han obtingut en sistemes

cromatogràfics diferents. Quan el factor de retenció

del component d‟una mostra és molt menor que la

unitat, l‟elució cromatogràfica té lloc tan ràpidament

que és difícil determinar amb exactitud el temps de

retenció. Pel contrari, quan el factor de retenció és

superior o igual a 20 ens indica que el temps d‟elució

és excessivament llarg. Els factors de retenció grans

afavoreixen una bona separació, però també

incrementen el temps d'elució i l'amplada del pic

cromatogràfic. Idealment, les separacions

cromatogràfiques es realitzen en unes condicions en

la que els factors de retenció dels components d‟una

mostra oscil·len entre 2 i 10 (1-6).

5.3 Paràmetres de separació

La capacitat d‟una determinada fase estacionària per

separar dos components d‟una mostra 1 i 2

s‟expressa mitjançant el factor de separació (anomenat

també pel terme no recomanat per la IUPAC, factor

de selectivitat), α, definit com:

on k1 i k2 són els factors de retenció dels

components 1 i 2, respectivament.

El factor de separació es pot calcular en un

cromatograma com el valor de la retenció relativa

entre dos pics cromatogràfics pròxims. Substituint

l‟equació [7] per a cada component en l‟equació [10]:

Normalment, es pot controlar la separació variant les

característiques del sistema, com ara la composició

de la fase mòbil (pH, força iònica, solvent orgànic

modificador), la forma d'elució (isocràtica o en

gradient) o el tipus de columna cromatogràfica.



5.4 Paràmetres d’eficàcia

Els pics cromatogràfics mostren una gran semblança

amb les corbes que segueixen la llei de Laplace-

Gauss o gaussianes, fet que pot explicar-se de la

manera següent: durant el desplaçament d‟un

component d‟una mostra per l'interior d'una

columna cromatogràfica, aquest experimenta milers

de transferències entre les fases mòbil i estacionària.

El temps de retenció en una fase donada és molt

irregular, podent ser molt petit en algunes etapes, i

relativament gran en altres degut a que algunes

partícules es desplaçaran ràpidament, a causa que

romanen més temps en la fase mòbil, mentre que

altres ho faran amb més lentitud, com a

conseqüència de la seva major permanència a la fase

estacionària. Degut a que els processos individuals

esmentats transcorren de forma aleatòria, s'obté una

dispersió dels temps de retenció en la columna al

voltant d'un valor mitjà, originant un pic gaussià com

el representat a la Figura 9, i en què gairebé un 96 %

de l'àrea sota la corba es troba dins de l'interval

comprès entre ± dues vegades la desviació estàndard

sobre el valor del màxim de la corba.

D'altra banda, l'amplada d‟un pic cromatogràfic està

directament relacionada amb el temps de retenció en

la columna, ja que a major temps, major dispersió, de

manera que els components d‟una mostra que

elueixen més tard presenten pics més amples que els

que elueixen en primer lloc. Així, l'eixamplament dels

pics dels diferents components d‟una mostra actua

en detriment de la seva separació.

El terme eficàcia, d'un sistema cromatogràfic, s'utilitza

per descriure l'eixamplament de les bandes dels

components d‟una mostra com a conseqüència del

seu moviment a través de la columna. L'eficàcia d'un

sistema cromatogràfic es pot abordar des de dos

punts de vista: la teoria del plat (teòric) i la teoria de la

velocitat o cinètica.

5.4.1 Teoria del plat

La teoria del plat (teòric), desenvolupada per Archer

Martin i Richard Synge al 1952, considera que la

columna cromatogràfica està constituïda per

nombroses, però discretes capes estretes,

denominades plats teòrics, en termes anàlegs al que

passa en la teoria de la destil·lació fraccionada o de

l'extracció en contracorrent. Es considera que en

cada plat s'estableix un equilibri del component

d‟una mostra entre la fase mòbil i la fase estacionària,

i que el seu desplaçament a través de la columna es

tracta com una transferència de la fase mòbil des

d'un plat al següent.

Existeixen dos paràmetres que descriuen l‟eficàcia

d‟un sistema cromatogràfic, el nombre de plats

teòrics, N, i l‟alçada del plat teòric, H, els quals estan

relacionats entre sí mitjançant l‟equació:

on (L) és la longitud de la columna.

L'eficàcia de la columna augmenta en fer-ho el

nombre de transferències del component d‟una

mostra entre la fase mòbil i la fase estacionària, és a

dir, en augmentar el nombre de plats teòrics i en

disminuir l‟alçada entre aquests plats teòrics.

Per altra banda, el nombre de plats teòrics, N, es

relaciona amb el temps o volum total de retenció (tR

o VR) i amb la desviació estàndard d‟una corba de

Laplace-Gauss característica d‟un pic cromatogràfic

(), mitjançant la següent equació:



Donat que existeix una relació entre i l‟amplada del

pic cromatogràfic (wb) (wb = 4·; vegeu Figura 9):

Una altra manera de calcular el nombre de plats

teòrics, que alguns autors consideren més fiable, es

basa en mesurar l‟amplada del pic cromatogràfic a la

meitat de la seva alçada (wh) (Figura 9):

Figura 9. Pic gaussià ideal degut al comportament aleatori de les

molècules del component d’una mostra entre les fases estacionària i

mòbil. wb = amplada del pic cromatogràfic; wi = amplada del pic

cromatogràfic en el punt d’inflexió de la corba; wh = amplada del pic

cromatogràfic a la meitat de la seva alçada i és la desviació

estàndard de la corba.

La teoria del plat (teòric) explica satisfactòriament la

forma gaussiana dels pics cromatogràfics i la

velocitat de desplaçament d‟un component d‟una

mostra, si bé però, falla en intentar justificar

l'eixamplament dels mateixos. D'altra banda, es basa

en unes suposades condicions d'equilibri que, en

realitat no s'assoleixen, a causa del moviment continu

de la fase mòbil. Aquests inconvenients van fer que

es descartés la teoria del plat per l‟anomenada teoria

de la velocitat o cinètica.

5.4.2 Teoria de la velocitat o cinètica

La teoria de la velocitat, desenvolupada per JJ. Van

Deemter el 1956 i millorada per Calvin Giddings el

1965, tot i emprar els mateixos paràmetres d‟eficàcia

que la teoria del plat, permet explicar l‟eixamplament

dels pics cromatogràfics. Aquesta teoria considera

que l'eixamplament dels pics es produeix com a

conseqüència que els diferents processos de

transferència de massa entre les fases mòbil i

estacionària, que es duen a terme durant el

desplaçament d'un component d‟una mostra al llarg

de la columna, ocorren a una velocitat finita. Segons

aquesta teoria, la forma dels pics depèn dels següents

factors:

la difusió per turbulència o en remolí (difusió

d‟Eddy) i les diferents trajectòries que poden

seguir les molècules d‟un component d‟una

mostra a través de la columna,

la difusió longitudinal de les molècules d‟un

component d‟una mostra al llarg de la columna,

i

el lent equilibri entre les fases mòbil i

estacionària al que es veu sotmès un component

d‟una mostra.

Els tres factors esmentats normalment s'identifiquen

amb els paràmetres A, B i C i la seva contribució a

l'eixamplament de les bandes cromatogràfiques

condueix a l„anomenada equació de Van Deemter:

on u és la velocitat lineal mitjana de la fase mòbil (u

= L/tM; L = longitud de la columna, tM = temps

bàsic de retenció).

Aquest model és el clàssic i, a dia d‟avui, es considera

obsolet perquè s‟han millorat les diferents

aproximacions per a cada un dels paràmetres A, B i

C. Tot i això, els fonaments bàsics de l‟equació de

Van Deemter encara són utilitzats actualment.



D'altra banda, la teoria es va desenvolupar

inicialment per a la cromatografia de gasos amb

columnes empaquetades, però pot estendre‟s sense

massa dificultats a altres tipus de cromatografia,

incloent les columnes tubulars obertes i, fins i tot, a

la cromatografia plana.

5.4.2.1 Terme A de l’equació de Van Deemter: difusió per turbulència o difusió d’Eddy; terme del camí múltiple

En una columna cromatogràfica, donat que està

empacada amb partícules de diferents mides i formes

acomodades de manera irregular, les molècules d‟un

component d‟una mostra que es troben en la fase

mòbil en travessar-la poden prendre multitud de

trajectòries aleatòries, fent que la distància que

recorrin sigui major o menor en funció de la

trajectòria escollida. Aquest fenomen, que es coneix

amb el nom de difusió en remolí o d‟Eddy, influeix

en l‟eixamplament dels pics cromatogràfics (Figura

10).

Figura 10. Trajectòries seguides per les molècules d’un mateix

component d’una mostra durant la seva elució en una columna

cromatogràfica. La distància recorreguda per les molècules serà

diferent degut als distints camins que poden seguir, fent que el pic

cromatogràfic s’eixampli.

El terme A de l‟equació de Van Deemter és

independent de la velocitat de la fase mòbil, però

depèn directament de la mida de les partícules de la

fase estacionària, de manera que el terme A es pot

expressar com:

on λ és una constant que depèn de les dimensions,

geometria i uniformitat de l'empaquetament de la

columna, i dp és el diàmetre mitjà de les partícules de

la fase estacionària.

A partir de l‟equació [17] es pot deduir que columnes

cromatogràfiques amb partícules més petites i

uniformement empaquetades presentaran una major

eficàcia, si bé, això implicarà utilitzar sistemes

cromatogràfiques que treballin a pressions molt més

elevades. D'altra banda, el terme A es pot considerar

negligible en el cas que s‟utilitzin columnes tubulars

obertes, a causa que la fase estacionària en aquestes

columnes es diposita directament sobre la paret de la

columna.

5.4.2.2 Terme B de l’equació de Van Deemter: difusió longitudinal

El segon factor que pot contribuir en l'eixamplament

d‟un pic cromatogràfic és la difusió longitudinal de

les molècules d‟un component d‟una mostra en la

fase estacionària. Aquest fenomen es produeix com a

conseqüència que aquestes molècules difonen des de

la part central de la zona o banda cromatogràfica, on

la seva concentració és major, cap a les regions més

diluïdes que s‟ubiquen per davant i per darrera de la

banda. Algunes molècules es quedaran endarrerides, i

eluiran més tard, mentre que unes altres aniran més

ràpides que la majoria d‟elles i, per tant, eluiran

abans. Si la velocitat de la fase mòbil és alta, llavors

les molècules del component passaran menys temps

en la columna, disminuint l'efecte de la difusió

longitudinal (Figura 11).

La difusió longitudinal es dificulta per les partícules

de la fase estacionària i pel coeficient de difusió en la

fase mòbil, DM, de manera que el terme B es pot

expressar com:

on γ és un factor d'impediment que depèn de les

característiques del rebliment de la columna (γ sol



ser 0,7 per columnes empaquetades i 1,0 per

columnes tubulars obertes).

Figura 11. Representació esquemàtica del fenomen de difusió

longitudinal que sofreixen les molècules d’un component d’una

mostra durant la seva elució en una columna cromatogràfica,

utilitzant: a) un flux lent de fase mòbil i b) un flux elevat de fase

mòbil.

La contribució del terme B al valor del plat teòric, H,

sol ser menyspreable en cromatografia líquida, pels

valors baixos dels coeficients de difusió dels líquids.

5.4.2.3 Terme C de l’equació de Van Deemter: resistència a la transferència de massa

El terme C està relacionat amb el fet que l'equilibri

per a la distribució d‟un component d‟una mostra

entre les fases mòbil i estacionària s'estableix tan

lentament que una columna cromatogràfica sempre

opera en condicions lluny de l'equilibri. És dir, les

diferents molècules d‟un component d‟una mostra

requereixen un cert temps per aconseguir l'equilibri

entre la fase estacionària i la fase mòbil. Si la velocitat

de la fase mòbil és alta, i les molècules tenen una

gran afinitat per la fase estacionària, llavors les

molècules que es troben a la fase mòbil es mouran

més ràpidament que les molècules retingudes en la

fase estacionària (Figura 12). Aquest fenomen donarà

lloc a un eixamplament del pic cromatogràfic. Quant

major sigui la velocitat de la fase mòbil, major serà

l'eixamplament produït.

Figura 12. Representació esquemàtica del fenomen de transferència

de massa: a) en condicions d’equilibri i b) en condicions de NO

equilibri.

En realitat, el terme C pot descompondre en dos, CS

i CM, segons es consideri la transferència de massa en

la fase estacionària o en la fase mòbil,

respectivament. Les equacions relacionades són:

on f(k) és una funció matemàtica que depèn del

factor de retenció, k, i del tipus de cromatografia

utilitzada, df és l‟espessor mitjà de recobriment de la

columna, dp és el diàmetre mitjà de la partícula de la

columna, DS és el coeficient de difusió de la fase

estacionària i DM és el coeficient de difusió de la fase

mòbil.

La resistència a la transferència de massa en la fase

estacionària és menyspreable per a les fases sòlides, ja

que la transferència del component d‟una mostra

sobre la superfície d'un adsorbent és molt ràpida.

A la Figura 13 es representa la variació dels tres

termes de l'equació de Van Deemter en funció de

l‟alçada del plat (H) i de la velocitat de la fase mòbil

(u). Cal destacar que la contribució del terme A és

independent de la velocitat, mentre que B augmenta

quan la velocitat disminueix i C, predomina a

velocitats elevades. Les corbes de l'equació de Van



Deemter són similars tan per la cromatografia de

gasos com per la cromatografia líquida, presentant,

en tots els casos un valor mínim d‟H per a una

determinada velocitat de la fase mòbil (condició

òptima). Es produeix un increment en l‟alçada de

plat (H) i, en conseqüència un eixamplament del pic

cromatogràfic, a velocitats inferiors a l'òptima degut

a la difusió longitudinal (terme B) i a velocitats

inferiors a l‟òptima degut a la resistència de la

transferència de massa entre les fases mòbil i

estacionària (terme C).

Figura 13. Gràfic de Van Deemter per a una columna cromatogràfica

on la fase estacionària està composada per un líquid sobre un suport

sòlid. En color marró, part superior del gràfic, es pot observar la corba

resultant com a conseqüència de les distintes contribucions dels termes

A, B i C sobre la velocitat de la fase mòbil. A la part inferior, es

mostren les corbes corresponents a la difusió d’Eddy (terme A), a la

difusió longitudinal (terme B) i a la transferència de massa (terme C).

Tenint en compte les equacions [17], [18], [19] i [20] i

substituint-les a la [16], l‟equació de Van Deemter es

pot expressar com:

5.4.3 Altres factors que influeixen en l’eficàcia

A més dels factors ja considerats que contribueixen a

l'eixamplament dels pics cromatogràfics i que es

produeixen en la pròpia columna cromatogràfica, cal

esmentar alguns que poden tenir lloc en altres zones

del sistema cromatogràfic. Entre ells, es poden

destacar els relacionats amb la introducció de les

mostres i els relacionats amb els volums extra-

columna.

En el cas de la introducció de la mostra, una injecció

excessiva pot provocar una sobrecàrrega de la

columna cromatogràfica i en conseqüència una

disminució de la seva eficàcia però, també, que part

de la mostra quedi adherida a les parets de la vàlvula

d‟injecció provocant la seva lenta però contínua

eliminació. Tenint en compte aquestes situacions,

sempre que sigui possible, s‟han de fer servir volums

de mostra petits en particular si es vol treballar amb

columnes amb una elevada eficàcia (amb un nombre

de plats teòrics elevat o amb una alçada de plat

reduïda).

Per altra banda, el volum extra-columna (anomenat

també pel terme no recomanat per la IUPAC volum

mort) pot contribuir a l‟aparició de fenòmens de

difusió i, en conseqüència, a l'eixamplament dels pics

cromatogràfics. Per aquest motiu, és necessari que

s'emprin tubs estrets per a les connexions entre el

sistema d'injecció i la columna, i entre aquesta i el

detector.

5.5 Paràmetres de simetria

L‟obtenció de pics cromatogràfics simètrics

(gaussians) s'originen quan el coeficient de

distribució, KS, (equació [1]), és constant i

independent de la quantitat del component d‟una

mostra. En realitat, gairebé sempre s'obtenen pics

asimètrics, ja que la relació de les concentracions

molars del component entre les fases estacionària i

mòbil sol variar amb la quantitat de component que

és injectat. Així, en la pràctica, els pics

cromatogràfics rarament són gaussians, i la

realització de càlculs sobre el cromatograma en base

a aquesta suposició, pot portar a errors significatius si



es treballa amb pics molt distorsionats. El model de

la corba de Gauss només és apropiat quan es treballa

amb pics on l‟anomenat factor d‟asimetria (Af) és

proper a la unitat (Figura 14).

Figura 14. Paràmetres de simetria d’un pic cromatogràfic.

A la Figura 15, es mostren els diferents pics

cromatogràfics que es poden obtenir en un

cromatograma (pics gaussians (simètrics), pics amb

cua i pics amb distorsió frontal).

a)

b) c)

Figura 15. Tipus de pics cromatogràfics: a) simètric o gaussià, b)

asimètric amb cua i c) asimètric amb distorsió frontal.

Per als pics gaussians, el factor d'asimetria és igual a

1, si els pics presenten cua, se'ls hi assigna un factor

d‟asimetria positiu, i quan els pics presenten distorsió

frontal, se‟ls hi assigna un valor negatiu. Els pics amb

cua (Figura 15b) solen presentar-se quan existeixen

buits d‟aire entre les connexions de la columna o en

algun dels components d‟un cromatògraf, quan el

pH de la fase mòbil no és l‟adequada, quan la

separació entre dos components d‟una mostra no

està ben resolta o quan la mostra reacciona

químicament amb els centres actius de la columna.

Per altra banda, els pics amb una distorsió frontal

(Figura 15c) solen aparèixer per aquells sistemes

cromatogràfics on la fase estacionària reté fortament

el component d‟una mostra degut a una saturació

dels centres actius de la columna, a una baixa

temperatura de treball de la columna o a una

columna cromatogràfica en mal estat.

5.6 Paràmetres de resolució

La resolució (RS) és el paràmetre que indica la

qualitat d'una separació d‟una columna

cromatogràfica (Figura 16), com una mesura

numèrica de la separació entre dos components

d‟una mateixa mostra, i es defineix com:

on (tR)A, (tR)B, (VR)A, (VR)B, són els temps i els

volums totals de retenció dels components A i B

d‟una mostra, wbA i wbB són les amplades dels pics

cromatogràfics A i B, respectivament.

Figura 16. Separacions cromatogràfiques que corresponen a tres

resolucions (RS) distintes (0,75, 1,0 i 1,5). Paràmetres relacionats amb

la resolució dels pics cromatogràfics, per a dos pics cromatogràfics:

wA = amplada del pic cromatogràfic A; wB = amplada del pic

cromatogràfic B; (tR)A = temps total de retenció del component A;

(tR)B = temps total de retenció del component B i tM = temps bàsic de

retenció.

L'equació [23] resulta adequada per obtenir el valor

de la resolució, però no proporciona informació

sobre les propietats cinètiques o termodinàmiques de



la columna cromatogràfica, la qual cosa és important

de cara a optimitzar la resolució. Per això, una

equació alternativa per a la mateixa és:

on N és el nombre de plats teòrics de la columna, α

és el factor de separació entre dos components A i B

i k és el valor mitjà dels factors de retenció dels dos

components. Aquesta expressió matemàtica ens

indica que la resolució depèn de l'eficàcia global de la

columna (N), de la capacitat de la fase estacionària

per retenir els components (α) i de les

característiques de retenció de cada component (k).

D‟aquesta mateixa equació també es pot deduir que,

en dependre la resolució de l'arrel quadrada de N, per

augmentar significativament el valor de la resolució

és necessari augmentar molt el valor de N. Això pot

fer-se incrementant la longitud de la columna amb

l‟inconvenient que precisa de temps d‟optimització

excessius. Per això, normalment sol ser preferible

optimitzar els valors d‟α i k. Una forma relativament

senzilla de millorar la resolució és optimitzant k, per

exemple, augmentant la temperatura (principalment

en la cromatografia de gasos) o canviant la

composició de la fase mòbil (en la cromatografia

líquida). En quant al valor d‟α, aquest es pot

modificar variant la composició de la fase mòbil, la

composició de la fase estacionària (canviant la

columna cromatogràfica), modificant la temperatura

de la columna o bé, recorrent a factors químics

especials com poden ser la incorporació d‟algun

agent complexant particular a la fase estacionària.

6. APLICACIÓ DE LA CROMATOGRAFIA EN LES CIÈNCIES DE LABORATORI CLÍNIC

Tot i que la cromatografia és el principi de mesura

més important per a la separació de diferents

components d‟una mostra, també és possible la seva

utilització en l‟anàlisi qualitativa i, sobretot, en

l‟anàlisi quantitativa (1-6).

6.1 Anàlisi qualitativa

En l‟anàlisi qualitativa, les seves aplicacions són

bastant limitades, sobretot quan es compara la

informació que proporciona un cromatograma amb

la que es pot obtenir amb altres principis de mesura

com l‟espectroscòpia infraroja, l‟espectroscòpia de

ressonància magnètica nuclear o l‟espectrometria de

masses. Tot i això, la cromatografia és un principi de

mesura important per reconèixer la presència o

absència de components en una mostra que

contingui un nombre limitat de possibles substàncies

de les que es conegui la seva identitat. D'altra banda,

en ocasions interessa conèixer si un determinat

component està absent en una mostra. En aquests

casos, moltes vegades la cromatografia proporciona

una evidència segura en aquest sentit, al no aparèixer

un pic cromatogràfic per aquest component.

6.2 Anàlisi quantitativa

Les aplicacions quantitatives de la cromatografia en

columna es basen en la comparació de l'alçada o de

l'àrea del pic cromatogràfic del component d‟una

mostra amb els corresponents a uns patrons

prèviament seleccionats. La utilització de les alçades

del pic té l'avantatge que és fàcil de mesurar, però

presenta l'inconvenient que s'ha de controlar

rigorosament la temperatura de la columna, el flux de

la fase mòbil i la velocitat d'injecció de la mostra, ja



que aquestes variables poden provocar un

eixamplament dels pics degut a que estan

inversament relacionades amb les corresponents

alçades. No obstant això, l'àrea de pic és independent

dels efectes deguts a les variables anteriorment

esmentades, pel que és la magnitud que normalment

s'utilitza en la quantificació. La seva mesura es porta

a terme amb facilitat, ja que gairebé tots els

cromatògrafs moderns estan proveïts d'integradors

electrònics digitals. No obstant això, cal tenir en

compte que la resposta del detector varia d'un

component a un altre. Així, per exemple, el detector

ultraviolat depèn de l'absortivitat dels corresponents

components i el d'ionització de flama, de la formació

d'ions. Per això, sovint s'utilitzen els anomenats

factors de resposta, obtinguts de la relació entre

l'àrea d'un component i l'àrea d'un altre component

triat com a referència.

Els procediments de quantificació que principalment

s'utilitzen en cromatografia són els procediments del

patró extern, del patró intern i de normalització

d'àrees.

6.2.1 Procediment del patró extern

El procediment del patró extern consisteix en la

utilització de materials de calibratge de composició

semblant a la de la mostra. Seguidament, s‟obtenen

els cromatogrames dels diferents calibradors i es

representen les àrees (o les alçades) de pic en funció

de la concentració. Idealment aquesta representació

hauria de ser lineal i passar per l‟ordenada en l‟origen

però en diversos casos aquestes condicions no es

compleixen. Posteriorment, per a una mostra

determinada, s‟obté el seu cromatograma, l‟àrea o

l‟alçada del pic que correspon al component en

qüestió i es calcula la seva concentració mitjançant la

interpolació de la seva àrea o alçada en l‟esmentada

representació.

En aquest procediment, la font més important

d'error és la deguda a la incertesa en el volum de la

mostra que és injectada, sobretot quan s'utilitzen

micro-xeringues. Aquests errors es poden reduir

considerablement amb l'ús de vàlvules rotatòries i

emprant el procediment del patró intern.

6.2.2 Procediment del patró intern

En el procediment del patró intern, als materials de

calibratge i a les mostres se‟ls hi 'afegeix una

quantitat exacta d'un component pur, absent en la

mostra, anomenat patró intern. Seguidament,

s‟obtenen els cromatogrames dels diferents

calibradors i els del patró intern i es representen els

quocients entre les seves àrees (o alçades) de pic

(calibradors/patró intern) en funció de la

concentració. Posteriorment, per a una mostra

determinada, s‟obté el seu cromatograma, l‟àrea o

l‟alçada del pic que correspon al component en

qüestió i del seu patró intern, es duu a terme la

relació entre aquestes àrees i es calcula la seva

concentració mitjançant la interpolació de la seva

relació d‟àrees en l‟esmentada representació.

Per poder aplicar aquest procediment en

cromatografia, cal que el pic cromatogràfic del patró

intern estigui ben aïllat dels pics dels altres

components de la mostra, però presenti temps de

retenció propers al del pic del component en qüestió.

6.2.3 Procediment de normalització d’àrees

El procediment de normalització de les àrees

consisteix en eluir tots els components de la mostra,

mesurar les seves àrees de pic i obtenir les

corresponents àrees de pic corregides (mitjançant els

factors de resposta del detector). La concentració del

component d‟una mostra s'obté de la relació entre la

seva àrea i l'àrea total dels pics de tots els

components existents en la mostra.



6.3 Exemple de propietats qualitatives i magnituds biològiques que poden ser examinades o mesurades mitjançant sistemes cromatogràfics

Com ja s‟ha comentat, l‟aplicació de la cromatografia

com a principi de mesura en les ciències de

laboratori clínic presenta dos avantatges principals.

El primer està relacionat amb la seva elevada

capacitat per separar i aïllar diversos components

d‟una mostra que estan estretament relacionats entre

sí en diferents fluids biològics, i el segon i principal

(avantatge), amb la possibilitat de mesurar la

concentració d‟aquests components (“anàlisi

quantitativa”) o bé d‟examinar-los o identificar-los

(“anàlisi qualitativa”). A continuació, i a mode

d‟exemple, es descriuen algunes propietats

biològiques que poden ser mesurades o examinades

mitjançant sistemes cromatogràfics, atenent al tipus

de cromatografia utilitzada.

6.3.1 Cromatografia d’adsorció

Alguna de les principals propietats biològiques que

poden ser mesurades o examinades mitjançant la

cromatografia d‟adsorció són:

17-Hidroxicorticoïds

Pla—17-Hidroxicorticoïds; taxon.

Uri—17-Hidroxicorticoïds; taxon.

Pla—17-Hidroxipregnenolona; c.subst.

Pla—17-Hidroxiprogesterona; c.subst.

Pla—Cortisol; c.subst.

Uri—Cortisol; c.subst.

17-Cetoesteroïds

Pla—17-Cetoesteroïds; taxon.

Uri—17-Cetoesteroïds; taxon.

Pla—Aldosterona; c.subst.

Pla—Corticosterona; c.subst.

Uri—Corticosterona; c.subst.

Pla—Pregnenolona; c.subst.

Pla—Progesterona; c.subst.

Àcids grassos

Pla—Àcids orgànics; taxon.

Pla—Araquidonat; c.subst.

Pla—Capriat; c.susbt.

Pla—Linoleat; c.susbt.

Pla—Oleat; c.susbt.

Pla—Palmitat; c.susbt.

Andrògens i estrògens

Pla—Androstenediol; c.subst.

Pla—Androstenediona; c.subst.

Pla—Estradiol; c.subst.

Pla—Estriol; c.subst.

Pla—Estrona; c.subst.

Pla—Testosterona; c.subst.

Lípids

Pla—Diglicèrids; taxon.

Pla—Monoglicèrids; taxon.

Pla—Triglicèrids; taxon.

6.3.2 Cromatografia de repartiment



cromatografia de repartiment són:

Amines biogèniques

Pla—3-metoxiadrenalini; c.subst.

Pla—3-metoxinoradrenalini; c.subst.

Uri—3-metoxiadrenalini; c.subst.

Uri—3-metoxinoradrenalini; c.subst.

Uri—3-metoxitiramini; c.subst.

Uri—4-Hidroxi-3-metoximandelat; c.subst.

Uri—5-Hidroxiindolilacetat; c.subst.

Uri—Adrenalini; c.subst.



Uri—Dopamini; c.subst.

Uri—Noradrenalini; c.subst.

Pla—Serotonini; c.subst.

Uri—Serotonini; c.subst.

Drogues d’abús

Uri—11-nor-9-tetrahidrocannabinol-11-

carboxilat; c.subst.

Uri—Amfetamines; c.arb.

Uri—Benzoïlegconina; c.subst.

Uri—Cannabinoïds; c.arb.

Uri—Cocaïna; c.subst.

Uri—Cocaïna+metabòlits; c.arb.

Uri—Fenciclidina; c.subst.

Uri—Heroïna; c.subst.

Uri—Metadona; c.subst.

Uri—Metamfetamina; c.subst.

Uri—Morfina; c.subst.

Uri—Opiacis; c.arb.

Fàrmacs analgèsics

Pla—Analgèsics; taxon.

Pla—Diclofenac; c.subst.

Pla—Ibuprofè; c.subst.

Pla—Naproxè; c.subst.

Pla—Oxicodona; c.subst.

Pla—Paracetamol; c.subst.

Fàrmacs antagonistes

Pla—Fàrmacs antagonistes; taxon.

Pla—Omeprazol; c.subst.

Pla—Ranitidina; c.subst.

Fàrmacs antiagregants

Pla—Fàrmacs antiagregants; taxon.

Pla—Warfarina; c.subst.

Fàrmacs antiarítmics

Pla—Digoxina; c.subst.

Pla—Fàrmacs antiarítmics; taxon.

Pla—Metoprelol; c.subst.

Pla—Procaïnamida; c.subst.

Pla—Propanolol; c.subst.

Fàrmacs antibiòtics

Pla—Antibiòtics; taxon.

Pla—Amoxicil·lina; c.subst.

Pla—Cefalosporina; c.subst.

Pla—Ertapemen; c.subst.

Pla—Meropenem; c.subst.

Pla—Piperacil·lina; c.subst.

Fàrmacs antibacterians

Pla—Fàrmacs antibacterians; taxon.

Pla—Minociclina; c.subst.

Pla—Sulfadiazina; c.subst.

Pla—Sulfametoxazol; c.subst.

Pla—Tetraciclina; c.subst.

Pla—Trimetroprim; c.subst.

Fàrmacs antidepressius

Pla—Amitriptilina; c.subst.

Pla—Fàrmacs antidepressius; taxon.

Pla—Fluoxetina; c.subst.

Pla—Imipramina; c.subst.

Pla—Nortriptilina; c.subst.

Pla—Verapamil; c.subst.

Fàrmacs antiepilèptics

Pla—Carbamazepina; c.subst.

Pla—Lamotrigina; c.subst.

Pla—Fàrmacs antiepilèptics; taxon.

Pla—Fenitoïna; c.subst.

Pla—Gabapentina; c.subst.

Pla—Oxcarbazepina; c.subst.

Pla—Valproat; c.subst.

Fàrmacs antifúngics

Pla—Fàrmacs antifúngics; taxon.

Pla—Fluconazol; c.subst.



Pla—Itraconazol; c.subst.

Pla—Ketoconazol; c.susbt.

Pla—Posaconazol; c.susbt.

Pla—Voriconazol; c.subst.

Fàrmacs antiretrovirals

Pla—Aciclovir; c.subst.

Pla—Atazanavir; c.subst.

Pla—Delfinavir; c.subst.

Pla—Efavirenz; c.subst.

Pla—Fàrmacs antiretrovirals; taxon.

Pla—Ganciclovir; c.subst.

Fàrmacs antineoplàsics

Pla—5-Fluoruracil; c.subst.

Pla—Carmustina; c.subst.

Pla—Cisplatí; c.subst.

Pla—Docetaxel; c.subst.

Pla—Fàrmacs antineoplàsics; taxon.

Pla—Gencitabina; c.subst.

Fàrmacs barbiturats

Pla—Barbiturats; taxon.

Uri—Barbiturats; taxon.

Pla—Butabital; c.subst.

Pla—Fenobarbital; c.subst.

Pla—Pentotal; c.subst.

Pla—Secobarbital; c.subst.

Fàrmacs benzodiazepines

Pla—Benzodiazepines; taxon.

Uri—Benzodiazepines; taxon.

Pla—Clonazepam; c.subst.

Pla—Diazepam; c.subst.

Pla—Nordiazepam; c.subst.

Pla—Oxazepam; c.subst.

Fàrmacs immunosupressors

San—Ciclosporina A; c.subst.

San—Everolimus; c.subst.

Pla—Fàrmacs immunosupressors; taxon.

Pla—Micofenolat; c.subst.

San—Sirolimus; c.subst.

San—Tacrolimus; c.subst.

Porfirines

Uri—Coproporfirina I; c.subst.

Uri—Coproporfirina III; c.subst.

Uri—Heptacarboxiporfirina; c.subst.

Uri—Hexacarboxiporfirina; c.subst.

Uri—Pentacarboxiporfirina; c.subst.

Uri—Porfirines; taxon.

Uri—Uroporfirina; c.subst.

Vitamines

Pla—α-Tocoferol; c.subst.

Pla—Ascorbat; c.subst.

Pla—Calcidiol; c.subst.

Pla—Ercalcidiol; c.subst.

Pla—Piridoxal-5‟-fosfat; c.subst.

Pla—Retinol; c.subst.

San—Riboflavina; c.subst.

San—Tiamina; c.subst.

6.3.3 Cromatografia de bescanvi iònic



cromatografia de bescanvi iònic són:

Aminoàcids i acilcarnitines

Pla—Acilcarnitines; taxon.

Uri—Acilcarnitines; taxon.

Pla—Aminoàcids; taxon.

Uri—Aminoàcids; taxon.

Pla—Alanina; c.subst.

Uri—Alanina; c.subst.



Pla—Citrul·lina; c.subst.

Uri—Citrul·lina; c.subst.

Pla—Glicina; c.subst.

Uri—Glicina; c.subst.

Pla—Leucina; c.subst.

Uri—Leucina; c.subst.

Pla—Ornitina; c.subst.

Uri—Ornitina; c.subst.

Pla—Triptòfan; c.subst.

Uri—Triptòfan; c.subst.

Hemoglobines

Hb(San)—Hemoglobina A1c; fr.subst.

Hb(San)—Hemoglobina A2; fr.subst.

Hb(San)—Hemoglobina C; fr.subst.

Hb(San)—Hemoglobina D; fr.subst.

Hb(San)—Hemoglobina E; fr.subst.

Hb(San)—Hemoglobina F; fr.subst.

Hb(San)—Hemoglobina S; fr.subst.

Fàrmacs

Pla—Valproat; c.subst.

Isoenzims

Pla—Creatina-cinasa; taxon.

Pla—Creatina-cinasa 1; c.massa



Pla—L-Lactat-deshidrogenasa; taxon.

Pla— L-Lactat-deshidrogenasa 1; c.cat.





6.3.4 Cromatografia d’exclusió



cromatografia d‟exclusió molecular són:

LAm—Acetilcolinesterasa; c.cat.

Pla—Acetilcolinesterasa; c.cat.

Pla—Angiotensina I; c.massa

Pla—Angiotensina II; c.massa

Uri—Eritropoetina; taxon.

Pla—Eritropoetina; c.subst.arb.

Uri—Eritropoetina; c.subt.arb.

Pla—Oxitocina; c.massa

Pla—Vasopressina; c.massa

6.3.5 Cromatografia d’afinitat



cromatografia d‟afinitat són:

Pla—Albúmina; c.massa

Pla—Colesterol; taxon.

Pla—Colesterol HDL; c.subst.

Pla—Colesterol IDL; c.subst.

Pla—Colesterol LDL; c.subst.

Pla—Colesterol VLDL; c.subst.

Pla—Fibrinogen; c.massa

Pla—Fosfatasa alcalina; taxon.

Pla—Fosfatasa alcalina hepàtica; c.cat.

Pla—Fosfatasa alcalina òssia; c.cat.

Hb(San)—Hemoglobina A1c; fr.subst.

Pla—Immunoglobulina A; c.massa

Pla—Immunoglobulina G; c.massa

Pla—Immunoglobulina M; c.massa

Pla—Transferrina; c.subst.



7. BIBLIOGRAFIA

1. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principios de análisis intrumental. Madrid: McGraw-Hill·Interamericana; 2001.

2. Miller JM. Chromatography: concepts and contrasts. New Jersey: Miller; 2009.

3. Heftmann E. Chromatography. Amsterdam: Elsevier; 2004.

4. Fuentes Arderiu X, Castiñeiras Lacambra MJ, Queraltó Compañó JM. Bioquímica clínica y patología molecular. Barcelona: Reverté; 1998.

5. Brown PR. High-performance liquid chromatography: past developments, present status, and future trends. Anal Chem 1990;62:995A-1008A.

6. Lough WJ, Wainer IW. High-performance liquid chromatography: fundamental priciples and practice. Londres: Blackie Academic & Professional; 1995.

7. International Union of Pure and Applied Chemistry. Nomenclature for chromatography. Pure Appl Chem 1993;65:819-72.

8. International Union of Pure and Applied Chemistry. Compendium of chemical terminology—the Gold Book:<http://goldbook.iupac.org/>(accés: 2013-04-22).


__________________________________________________________________________________________



Pipetes. Aspectes generals i metrològics

Preparat per:

Aurora Blanco Font


_________________________________________________________________________________________

ÍNDEX

1. Introducció

2. Definicions

3. Classificació de les pipetes 3.1 Pipetes de vidre 3.2 Pipetes de pistó (o d’èmbol)

4. Utilització de les pipetes 4.1 Informació general 4.2 Informació específica 4.3 Procediment per pipetejar 4.4 Errors més freqüents

5. Aspectes metrològics: descripció i estimació

6. Calibratge i verificació 6.1 Mètode gravimètric 6.2 Mètodes no gravimètrics

7. Manteniment

8. Bibliografia _____________________________________________ 1 Membres de la Secció d‟Estadística i Metrologia durant la

preparació d‟aquest document: A. Blanco Font, B. Candás Estébanez, X. Fuentes Arderiu (president), M. Martínez Casademont, M. Mosquera Parrado, J.M. Queraltó Compañó, L. Rami Brualla, R. Rigo Bonnin, H. Valbuena Parralejo. _____________________________________________

1. Introducció

Les pipetes formen part d‟un grup d‟instruments

volumètrics que s‟utilitzen per aspirar o abocar

volums concrets de líquids.

Dintre del mateix grup d‟instruments volumètrics,

s‟inclouen també les buretes, els dispensadors i els

diluïdors. El present document docent no està

orientat a aquests altres instruments de mesura, per la

qual cosa d‟ells només es donarà tot seguit una petita

descripció per permetre diferenciar-los de les pipetes.

- Bureta: és un tub de vidre, amb divisions, que té

una clau (o un pistó) que permet anar deixant

sortir un líquid i determinar el volum final que

s‟ha abocat. En les buretes clàssiques, el líquid

s‟enrasa en la divisió del nivell superior que

correspon a 0, mentre que la clau se situa en el

nivell més inferior, a on hi ha el valor màxim.


ISSN: 1697-5421

Document docent



S‟acostumen a utilitzar per a volums de 5 a 50

mL.

- Dispensador: és un instrument que permet

emetre de forma repetida un volum determinat

de líquid. Aquest volum pot ser fix o variable,

sent ajustat per l‟usuari.

Actualment, existeixen buretes i dispensadors

electrònics que tenen una gran qualitat

metrològica i que poden automatitzar part del

seu maneig (per exemple, els dispensadors poden

tenir l‟aspiració d‟ompliment automàtic i la

dispensació de buidat manual)

- Diluïdor: és un instrument que permet abocar de

forma repetida volums determinats de més d‟un

líquid, fent dilucions concretes. Els volums es

determinen per l‟usuari.

Aquests diluïdors també poden ser electrònics,

permetent utilitzar vàries xeringues d‟aspiració-

dispensació en el mateix equip, connectades per

diversos sistemes de tubs i controlades per un

dispositiu electrònic, per proporcionar diferents

combinacions d‟aspiració i de dilució.

- Pipeta: és un instrument que permet aspirar i

abocar un volum determinat de líquid. Aquest

volum pot ser fix o variable, i es pot emetre en

un o més recipients alhora.

Dels instruments volumètrics que funcionen amb

pistó (pipetes, buretes, diluïdors, dispensadors), es

pot trobar la definició i els requisits a les normes

UNE-EN ISO 8655-1, UNE-EN ISO 8655-2 i

UNE-EN ISO 8655-6 (1, 2, 3).

2. Definicions

En aquest document són aplicables els termes i les

definicions del Vocabulari Internacional de

Metrologia (VIM) (4).

Tanmateix, l'esmentada norma UNE-EN ISO 8655

no sempre utilitza el VIM com a font per a aquestes

definicions (pot fer referència a altres normes: ISO

3334-1, 5725-1, 10012-1, etc.).

calibratge: operació que, en unes condicions

determinades, estableix en una primera etapa una

relació entre els valors, amb les incerteses de mesura

associades, obtinguts mitjançant uns patrons i les

indicacions corresponents, amb les seves incerteses

associades, i que després utilitza en una segona etapa

aquesta informació per establir una relació que

permet obtenir un resultat de mesura a partir d'una

indicació

NOTA: La definició anterior és la del VIM3, però la norma ISO 8655 defineix el calibratge d‟una pipeta com la comparació entre el volum nominal d‟aquesta i el realment dispensat

error de mesura: diferència entre el valor mesurat i

de referència d‟una magnitud

incertesa de mesura: paràmetre no negatiu que

caracteritza la dispersió dels valors atribuïts a un

mesurand a partir de les informacions utilitzades

precisió de mesura: concordança entre les

indicacions o els valors mesurats obtinguts

mitjançant mesuraments repetits del mateix objecte o

objectes similars en condicions especificades

resolució d’un dispositiu visualitzador: diferència

més petita entre indicacions visualitzades que es pot

percebre de forma significativa

traçabilitat metrològica: propietat d‟un resultat de

mesura gràcies a la qual aquest resultat pot ser

relacionat amb una referència mitjançant una cadena



ininterrompuda i documentada de calibratges, que

contribueixen a la incertesa de mesura

valor nominal: valor arrodonit o aproximat d‟una

magnitud característica d‟un instrument de mesura o

d‟un sistema de mesura, que serveix de guia per al

seu ús

NOTA: Per exemple, la marca de 100 mL que podem trobar en un matràs aforat constitueix el seu valor nominal. El valor real del volum d‟aquest matràs pot no ser exactament 100,00 mL, però estarà en un interval d‟acord amb la seva classe

veracitat de mesura: concordança entre la mitjana

d‟un nombre infinit de valors mesurats repetits i un

valor de referència metrològic d‟una magnitud

verificació: provisió de proves objectives que

demostren que una entitat donada satisfà uns

requisits determinats

validació: verificació en la qual els requisits

especificats són adequats per a un ús determinat

3. Classificació de les pipetes

Al laboratori clínic es treballa principalment amb dos

tipus de pipetes: pipetes de vidre i pipetes de pistó.

Les darreres s‟acostumen a anomenar

col·loquialment com «micropipetes» o «pipetes

automàtiques».

3.1 Pipetes de vidre

Són cilindres graduats, similars a les buretes, però, a

diferència d‟aquestes, no es buiden per l‟obertura de

la clau (o pistó) situada inferiorment, sinó que es

buiden quan es deixa entrar aire pel seu extrem

superior. Habitualment, s‟omplen per aspiració

mecànica, que es pot obtenir amb sistemes

automatitzats d‟aspiració, amb èmbols o amb peres

de goma.

Les pipetes de vidre es poden subdividir en:

- Pipetes graduades: tenen diferents marques, a

volums fixos, fins a un màxim que consta a la

pipeta; també consta la resolució, és a dir, el

valor de les divisions. Permeten mesurar

qualsevol volum inferior o igual al de la seva

capacitat màxima (generalment, entre 0,1 mL i

25 mL). En funció del seu sistema de graduació,

hi ha diferents tipus:

o Tipus 1: A l‟extrem superior està marcat el

zero i la graduació no s‟estén fins a l‟extrem

inferior (no terminal). El volum màxim

s‟aconsegueix deixant buidar la pipeta només

fins a la marca de l‟extrem inferior, sense

buidar-la del tot (primera pipeta de la Figura

1).


volum màxim i la graduació arriba fins a

l‟extrem inferior (terminal). El volum a

abocar s‟aspira fins a la marca corresponent

a aquest volum (que serà a dalt de tot si és el

màxim) i es deixa buidar completament, per

gravetat, al recipient de destí (tocant la paret

interior del recipient, però sense bufar ni

forçar la caiguda de les últimes gotes, que

han de quedar a la punta cònica de la pipeta)

(segona pipeta de la Figura 1).


zero i la graduació arriba fins a l‟extrem

inferior (terminal). El volum màxim

s‟aconsegueix omplint la pipeta fins el zero i

després es deixa buidar del tot. Tant en

aquesta, com en la de tipus 1, per a volums

menors al màxim, s‟ha de deixar caure el

volum que hi ha entre la marca del zero i la

marca del volum desitjat, aturant-se en

aquesta (tercera pipeta de la Figura 1).



Figura 1. Tipus de pipetes de vidre.

Les primeres (les de tipus 1, no terminals)

s‟utilitzarien com les pipetes aforades de doble

aforament (o arrasament) que es descriuen a

continuació, i les altres dues (de tipus 2 i 3, terminals)

com les pipetes d‟aforament simple. A la Figura 2

veiem un exemple de l‟extrem inferior dels dos casos.

Figura 2. Tipus d‟extrems inferiors en pipetes de vidre.

Tradicionalment, les pipetes on la graduació no

s‟estén fins a l‟extrem inferior es poden trobar, en

alguns texts, amb la denominació de pipetes Mohr i, les

pipetes a on l‟escala arriba al final, com a pipetes

serològiques.

- Pipeta aforada: permeten mesurar exactament un

volum únic i fix (generalment, entre 0,5 mL i 200

mL). Tenen un bulb a on es recull la major part

del volum de líquid i, per sobre i per sota, tenen

forma de tub amb una o dues marques (quarta

pipeta de la Figura 1). Segons aquestes marques,

poden ser:

o D‟aforament simple: hi ha només una marca

d‟aforament a l‟extrem superior: la pipeta

s‟arrasa fins a aquest marca i després es deixa

buidar completament.

o De doble aforament: hi ha una marca

d‟aforament a cada extrem: la pipeta s‟arrasa

a la marca d‟aforament superior i després es

deixa buidar fins que s‟arrasa a la marca

d‟aforament inferior, sense buidar-la del tot.

El volum de les pipetes aforades és fix, mentre que

les pipetes graduades estan marcades al llarg del seu

cos i es poden utilitzar per abocar volums iguals o

menors al nominal.

Hi ha unes pipetes graduades denominades de blow-

out , en què s‟ha de forçar la sortida de la darrera

gota. És important conèixer la seva existència per no

confondre-les amb les anteriors. De vegades, tenen

una banda esmerilada o dues bandes fines al coll;

d‟altres vegades tenen gravat el terme anglès (Figura

3).

Figura 3. Tipus de colls i gravats en pipetes de vidre.

Hi ha normes que recullen els requisits metrològics i

de construcció, tant per a les pipetes graduades

destinades a laboratoris generals (5), com per les

pipetes aforades de vidre de volum fix (6).

Les pipetes graduades també poden ser de plàstic,

d‟un sol ús o no, estèrils o no, autoclavables, etc. En

alguns casos, porten un petit cotonet a l‟extrem

superior per evitat l‟aspiració accidental de líquid fins

a ultrapassar el nivell superior de la pipeta i per evitar

la contaminació del líquid que s‟està manipulant amb

l‟aire espirat.

Tipus 1: No terminal

Tipus 3: Terminal



Quan aquestes pipetes graduades s‟utilitzen amb un

sistema d‟aspiració i de buidament automàtic,

comunament anomenat pipetejador, aquest sistema pot

incorporar un filtre, també per prevenir aspiracions i

contaminacions accidentals. Generalment, els

sistemes automàtics permeten diferents velocitats

d‟aspiració i dispensació.

3.2 Pipetes de pistó (o d’èmbol)

Són les que utilitzen un èmbol per aspirar i abocar el

líquid. Estan compostes d‟un cos en el qual s‟acobla

un sistema pistó-cilindre; en aquest últim s‟ajusta una

punta substituïble —habitualment de plàstic però en

alguns casos de vidre— i un mecanisme per a la seva

expulsió. El pistó es pot desplaçar en un recorregut

fins a un topall superior, per aspirar el líquid, i fins a

un topall inferior (doble), per buidar-lo. El

recorregut del pistó determina el volum aspirat i

dispensat; pot ser fix, o bé graduable dintre d‟un

interval de volum especificat.

El pistó o èmbol pot entrar en contacte amb el líquid

o no; en funció d‟això, les pipetes de pistó poden ser:

- De desplaçament d‟aire (tipus A): queda un

volum d‟aire entre el pistó i la superfície del

líquid. Són les més utilitzades al laboratori clínic;

a la Figura 4, les imatges A i B mostren una

pipeta de volum fix i una de volum variable

d‟aquest tipus.

- De desplaçament positiu o directe (tipus D): el

pistó contacta directament amb el líquid. En

aquestes pipetes, la punta acostuma a ser de

tipus capil·lar.

Dintre de les pipetes de pistó amb desplaçament

d‟aire, hi ha un tipus en què s‟aspira i es dispensa a

través de diversos sistemes pistó-cilindre cada cop

que es pipeteja. Són les anomenades pipetes multicanal.

El nombre de canals acostuma a ser 8 o 12 (que

correspon al nombre habitual de pous de les plaques

estàndard d‟enzimoimmunoanàlisi), però actualment

hi ha de 6 o d‟altre nombre de canals i, també molt

important, hi ha models que permeten ajustar la

distància entre canals. Podem veure un exemple de

pipeta multicanal a la imatge C de la Figura 4. El

volum nominal d‟aquestes pipetes també pot ser fix

o variable, i poden ser manuals o electròniques.

Hi ha un altre tipus particular, també dintre de les

pipetes de pistó amb desplaçament d‟aire, en el qual

es permet l‟aspiració d‟un volum gran de líquid i la

dispensació repetida d‟un volum determinat d‟aquest

líquid, no tornant a aspirar de nou fins que es buida.

Aquestes pipetes s‟anomenen pipetes repetidores o pipetes

de repetició. En general acostumen a poder abocar més

d‟un volum fix, i utilitzen puntes tipus xeringa. La

combinació entre varis tipus de xeringa de volums

diferents i vàries posicions de dispensació fixes

possibles dóna el conjunt de volums finals de

dispensació possibles. Aquestes pipetes també poden

ser manuals (com la de la imatge D de la Figura 4) o

electròniques.

Figura 4. Tipus de pipetes de pistó (o d‟èmbol).

4. Utilització de les pipetes

A B C D



4.1 Informació general

Hi ha un seguit de consideracions generals d‟ús, que

s‟han d‟especificar pel fabricant, entre les quals

destaquen:

- la possibilitat d‟esterilització i les seves

condicions (autoclau o altres sistemes),

- la resistència química als diferents líquids,

- la possibilitat que la pipeta contamini el líquid

que aboca,

Per a les pipetes de pistó, a més, els aspectes

següents:

- la llista de possibles puntes (amb les referències

de producte) que el fabricant recomana per al

seu ús,

- la resistència a l‟exposició a les radiacions

ultraviolades, si s‟utilitzen en genètica molecular,

- el desmuntatge per a la seva neteja i

descontaminació (biològica, radioactiva, etc.),

També s‟ha de saber si la pipeta pot ser sotmesa al

tractament per calor que s‟utilitza habitualment per

destruir les ribonucleases (més llarg i a més

temperatura que amb l‟autoclau), necessari en alguns

laboratoris de genètica molecular. En aquest darrer

ús, les pipetes de pistó s‟acostumen a utilitzar amb

puntes lliures de ribonucleases. En aquests

laboratoris, també s‟utilitzen habitualment puntes

amb filtre, per evitat el pas accidental de quantitats

mínimes de mostra —o del seu producte de

reacció— al sistema pistó-cilindre durant l‟aspiració, i

la contaminació encreuada de les mostres.

4.2 Informació específica

La informació que consta en cada pipeta depèn del

seu tipus. Pel que fa a les pipetes de vidre, sol

constar: el volum (per a les pipetes aforades de

volum fix, el volum nominal; per a les pipetes

graduades, el volum nominal màxim i el volum entre

les marques de divisió); la classe (A, B, ..., que

tractarem més endavant); el fabricant i la temperatura

a la qual són vàlides les especificacions de volum

(habitualment 20 ºC). Les especificacions més

detallades es recullen a les normes UNE-EN ISO

648 i 835, per a pipetes aforades i graduades,

respectivament.

Per a les pipetes de pistó es fa constar el volum

nominal, si són de volum fix, i l‟interval de mesura, si

són de volum variable. Hi ha també pipetes amb tres

volums concrets possibles, que el fabricant fa constar

i que l‟usuari pot seleccionar. En les pipetes de

volum variable, el volum nominal és el volum més

gran que l‟usuari pot ajustar i que ve definit pel

fabricant.

Les pipetes de repetició acostumen a tenir una taula

que mostra, per a cada combinació de posició i de

punta utilitzables, el volum abocat en cada repetició i

el nombre màxim de repeticions possibles amb la

mateixa aspiració.

4.3 Procediment per pipetejar

Pipetes de vidre

Per a les pipetes de vidre graduades, el procediment

per pipetejar variarà segons siguin de tipus 1, 2 o 3.

En qualsevol cas, tant per a aquestes com per a les

aforades, i fent servir sistemes mecànics o

electrònics, s‟omple la pipeta fins el volum desitjat i

es deixa buidar al recipient de destí, bé fins a la

marca corresponent, o bé en la seva totalitat (per

gravetat), tal i com ja s‟ha dit.

L'única consideració especial és la lectura del nivell

del líquid, però també s‟han de recordar els aspectes

següents:



- sempre utilitzar pipetes de classe A amb

preferència a les de classe B (vegeu l‟apartat de

propietats metrològiques),

- per a les pipetes de buidat total, deixar passar 15

segons un cop hagi caigut tot el líquid, per a les

pipetes normals (de classe A o B), i 5 segons per

les marcades “S” (de classe AS), abans de retirar-

la del recipient,

- vigilar la lectura del menisc del líquid considerant

que:

o per a líquids transparents, es llegeix la part

inferior del menisc (imatge A de la Figura 5),

o per a líquids opacs, es llegeix la part superior

de la columna de líquid (imatge B de la

Figura 5),

o l‟ull ha d‟estar al nivell del menisc (evitar

error de paral·laxi),

o la temperatura del líquid ha de ser propera a

la del calibratge (que declara el fabricant),

o per a líquids que fan meniscs convexes (com

el mercuri), es llegeix la part superior del

menisc.

Figura 5. Tipus de meniscs que poden observarse en les pipetes de vidre com a conseqüència de la utilització de distints tipus de líquids.

Pipetes de pistó

Tot seguit es tractarà amb extensió el procediment

per pipetejar amb a les pipetes de pistó amb interfase

d‟aire (col·loquialment, pipetes automàtiques o

micropipetes), que acostumen a ser les més utilitzades

als laboratoris clínics. A més de les normes citades

d‟aplicació específica per al maneig de pipetes, alguns

fabricants proporcionen recomanacions específiques

per al seu ús.

El procediment recomanat per a l‟ús de les pipetes

de pistó amb interfase d‟aire és:

- assegurar-se que la pipeta està en disponibilitat

de ser utilitzada (neta, calibrada, etc.);

- fixar el volum desitjat, per a les pipetes de volum

variable, o revisar si és del volum adient, per a

les pipetes de volum fix;

- col·locar la punta seleccionada, assegurant-se

que la pressió amb el cilindre on s‟encaixa és

ferm, regular en tota la superfície de contacte i

que la punta està perfectament perpendicular al

cos de la pipeta;

- baixar l‟èmbol suaument fins arribar al primer

topall;

- submergir la punta de 2 a 4 mm per sota del

nivell del líquid i deixar anar l‟èmbol poc a poc

(torna a la seva posició inicial perquè té una

molla), aspirant el líquid; assegurar-se que la

pipeta està en posició vertical i que no hi ha

bombolles d‟aire al líquid que omple la punta;

- quan el volum hagi arribat al màxim, esperar un

segon;

- posar la pipeta en el recipient a on es vol passar

el líquid, inclinar lleugerament la pipeta (10º a

45º respecte a la paret del recipient) i prémer de

nou l‟èmbol fins al primer topall, deixeu

transcórrer un segon i acabeu de prémer d‟èmbol

fins al segon topall, la qual cosa permet acabar

de buidar la punta, si cal;



- eliminar la punta al recipient adient, pressionant

la peça extractora, habitualment situada al costat

de l‟èmbol (o manualment, si no es disposa

d‟aquesta peça).

Consideracions particulars:

- En algunes pipetes de volum variable, la

mateixa peça que fa d‟èmbol és la que permet

seleccionar el volum; en aquests casos, hi ha un

mecanisme de bloqueig i s‟ha d‟assegurar que el

volum seleccionat s‟ha quedat fixat amb aquest

mecanisme, abans d‟iniciar l‟aspiració de mostra,

per tal que el volum no variï mentre es pipeteja.

- S‟ha de seleccionar la pipeta de volum variable

que tingui un volum nominal més proper al

volum que s‟ha d‟abocar, perquè això

disminueix l‟error de mesura. Per exemple, si es

disposa d‟una pipeta de 100 μL i una altra de

200 μL, per abocar un volum de 80 μL,

s‟utilitzarà preferentment la primera.

- Les pipetes de volum variable acostumen a

expressar el volum en microlitres (μL) però, en

alguns casos (especialment per a les pipetes de

1000 μL), s‟omet l‟últim zero, de manera que a

la finestra on apareix el volum a què està

ajustada es visualitza “100”, quan abocarà 1000

μL. Pel contrari, en algunes pipetes que

aboquen volums menors a aquest (per exemple

de 100 o 200 μL), a la finestra apareixen un o

més decimals de μL, de manera que mostrarà

“100 0” (l‟últim “0” separat per una línia

vertical), quan aboqui 100 μL.

- Per les pipetes de volum variable, en cap cas

s‟ha d‟excedir el volum nominal que declara el

fabricant.

- Per ajustar el volum desitjat, alguns fabricants

recomanen passar tres punts del volum desitjat

(generalment, 3 o 30 μL, segons el volum

nominal), sempre sense excedir aquest volum

nominal, i tornar a baixar aquests tres punts fins

el volum desitjat.

- En el cas de líquids molt viscosos, s‟ha de

pipetejar més lentament. En cas de líquids molt

poc viscosos, per omplir la punta bé, s‟ha

d‟aspirar i deixar anar més d‟un cop el volum

desitjat perquè aquesta s‟impregni i es mulli

adequadament. Quan s‟hagi aspirat el volum de

forma correcta, s‟ha de transferir al recipient

corresponent de forma relativament ràpida, per

evitar que regalimi punta avall. Alguns

fabricants recomanen “prehumitejar” les puntes

en tots els casos. Hi ha una forma de pipetejar,

denominada inversa, que alguns fabricants

recomanen per a líquids molt viscosos o

volàtils.

- Si han quedat gotes a l‟exterior de la punta,

s‟han d‟eixugar abans de buidar el seu contingut

al recipient.

- S‟ha d‟assegurar que la punta ha quedat

totalment buida de líquid; en cas contrari es pot

pipetejar repetidament aire fins arrossegar les

gotes que hagin pogut quedar a l‟interior de la

punta; també es pot pipetejar sobre la interfase

líquid-aire o sobre les parets del recipient, de

manera que la tensió superficial afavoreixi el

buidament. Si al recipient hi ha líquid, es pot

tornar a aspirar i abocar aquest mateix, per

arrossegar les gotes de les parets de la punta.

- En cas d‟aspiració involuntària de líquid a

l‟interior del cilindre del cos de la pipeta, més

enllà de la punta, mai continuar treballant i



sempre netejar-la de seguida, desmuntant el

mecanisme d‟aspiració-dispensació.

4.4 Errors més freqüents

A banda de mals funcionaments de tipus mecànic o

calibratges dolents, les accions associades al

procediment per pipetejar que més poden repercutir

sobre l‟exactitud del volum dispensat són:

- immersió massa profunda de la punta en la

solució;

- inclinació de la pipeta durant l‟aspiració;

- aspiració d‟aire durant l‟emplenament;

- deixar restes de líquid després de buidar

(malament) la punta;

- utilització de puntes inadequades que no ajustin

fermament i homogènia al cilindre.

5. Aspectes metrològics: descripció i estimació

Com qualsevol altra sistema de mesura del laboratori

clínic, les pipetes proporcionen valors mesurats amb

una incertesa de mesura (6); Per a les pipetes de

pistó, el proveïdor dóna els valors màxims teòrics

tant per al biaix com per a la imprecisió de les seves

pipetes, per a uns volums d'abocament i unes

condicions determinades (quan s‟utilitzen amb aigua

destil·lada i a 20 ºC). També pot donar l‟error de

mesura màxim permès, expressat en valor absolut

(volum en μL) o relatiu (percentatge). Per a les

pipetes de volum variable, el valor de l‟error de

mesura màxim permès dels seus resultats és el que té

per al seu valor nominal.

Pel que fa a les pipetes de vidre (com d‟altres

materials volumètrics de vidre), es poden agrupar en

diverses classes: classe A (o AS), B, C, en funció de la

seva tolerància o interval de valors definit en les

especificacions. Aquesta tolerància és més petita per

a les pipetes de classe A, tant per al volum nominal

com per a les divisions en el cas de pipetes

graduades, i té uns valors que estan normalitzats. Les

pipetes de classe B tenen toleràncies

aproximadament del doble que les fixades per les

normes per a la classe A/AS.

- La classe de la pipeta acostuma a estar marcada

al vidre.

- En les pipetes de classe A/AS, estan marcats els

valors de la tolerància, expressats en valor

absolut, precedit per signe « » (4). Per exemple,

una pipeta aforada de classe A amb un valor

nominal de 10 mL, ha de tenir una tolerància de

0,02 mL; això vol dir que el volum real que

dispensi aquesta pipeta estarà dins l‟interval de

9,98 mL a 10,02 mL.

- El fabricant ha d‟indicar les condicions de

calibratge per al seu ús previst, que poden ser TC

(de l‟anglès to contain), TD (de l‟anglès to deliver) o

bé ambdues utilitzacions alhora. Les pipetes TC

estan calibrades perquè la línia d‟aforament

indiqui el volum contingut, mentre que en les

pipetes TD indica el volum abocat. La diferència

està en el líquid que mulla la paret interna de la

pipeta i que no es buida. La denominació ISO

per a TC és «IN» i, per a TD, és «EX» .

- La norma ISO 1769 estableix un codi de colors

en funció del volum nominal.

A la Figura 6 es mostren algunes de les informacions

que han de constar a les pipetes de vidre

normalitzades, graduades o aforades.



2

3

1

3

2

5

4

4

1

5

6

6

Figura 6. Informació que ha de constar en una pipeta de vidre: 1) Marca del fabricant; 2) Volum nominal; per a les graduades, a sota consta la resolució; 3) Normes a què s‟acull (ISO, EN, UNE); 4) Classe (A, B, AS...); 5) Temperatura de referència (20 ºC), temps d‟espera (5 s, 15 s), tipus de calibratge per a l‟ús previst (EX); 6) Tolerància.

6. Calibratge i verificació

En la majoria de laboratoris clínics, s‟acostuma a

parlar de calibratge de les pipetes de laboratori, quan,

segons la definició del Vocabulari Internacional de

Metrologia, realment s‟està realitzant la primera etapa

del calibratge, és a dir «s‟estableix una relació entre

els valors (...) obtinguts mitjançant uns patrons i les

indicacions corresponents».

En un calibratge complet hi hauria una segona etapa,

en que “la informació obtinguda s‟utilitza per establir

una relació que permet obtenir un resultat de mesura

a partir d'una indicació”. Aquesta segona part no

s‟aplica. Més aviat, si s‟ha excedit l‟error de mesura

màxim permès, s‟acostuma a corregir les causes

(generalment, ajustant l‟èmbol si és una pipeta de

pistó) i tornar a fer la verificació fins a situar la pipeta

en condicions de treball que no superin aquest error

màxim permès (en lloc de corregir els volums a

abocar en funció dels resultats del calibratge).

Tot i això, com passa també amb altres definicions,

la norma UNE-EN ISO 8655 fa una adaptació de la

definició del Vocabulari Internacional de Metrologia

i defineix calibratge per a aparells volumètrics

accionats amb pistó com el «conjunt d‟operacions

que estableixen la relació entre el volum dispensat i el

volum nominal o seleccionat corresponent de

l‟aparell» (3). Així doncs, als laboratoris clínics

s‟acostuma a usar el terme «calibratge d‟una pipeta»

per referir-se a aquesta accepció. Això correspondria

més a una verificació, amb la que s‟està estimant

realment l‟error de mesura d‟una pipeta, i el resultat

obtingut es compara amb l‟error de mesura màxim

permès que el laboratori tingui establert per a un

determinat ús o un determinat volum. Fet aquest

aclariment, en endavant, parlarem de calibratge per ser

el terme més sovint utilitzat.

En la major part de laboratoris clínics, el calibratge

només s‟aplica a les pipetes de pistó, i no a les de

vidre, en les que s‟entén que continuen calibrades

mentre no s‟incompleixin les recomanacions del

fabricant.

Per a les pipetes de pistó, el calibratge es recomana

en els casos següents:

- De manera sistemàtica: la periodicitat mínima

indicada per la norma ISO 8655-1 és anual, tot i

que es poden calibrar més freqüentment en

funció de les condicions i requeriments de l‟ús.

- Després de neteges internes, avaries o

substitució d‟algun component. També seria

recomanable calibrar una pipeta si aquesta cau al

terra.

- Si els resultats de control o dels mesuraments

pels quals s‟utilitza la pipeta fan sospitar un mal

funcionament.

Per determinar el volum real abocat, s‟han utilitzat

tradicionalment mètodes gravimètrics (per pesada),

és a dir, pesant el volum d‟aigua dispensat per a un

volum teòric (nominal). Alternativament, també es

pot fer per altres mètodes, com ara espectromètrics,

o per combinacions dels dos. La norma UNE-EN



ISO 8655-6 (3) recull els requisits per realitzar el

primer procés i la norma UNE-EN ISO 8655-7 (8),

per al segon.

A més, per a aquells laboratoris clínics que estiguin

acreditats per la norma UNE-EN ISO 15189 (9), és

d„aplicació el document d‟ENAC CGA-ENAC-LCL

(10), on diu expressament:

Los equipos utilizados para realizar las pruebas o

mediciones secundarias (por ejemplo material

volumétrico) que tengan un efecto significativo en la

exactitud o validez de los resultados de las pruebas,

deben ser calibrados antes de su puesta en

funcionamiento, garantizando la trazabilidad de las

medidas realizadas en el laboratorio a patrones

nacionales o internacionales o a unidades de medida

del SI. Los certificados de calibración externa deberán

haber sido emitidos por laboratorios de calibración

acreditados por ENAC o por cualquier organismo de

acreditación con que ENAC haya firmado un acuerdo

de reconocimiento (EA, ILAC, ...) o por laboratorios

nacionales participantes en las intercomparaciones

aceptadas por el BIPM en cada área en cuestión.

D‟altra banda, els laboratoris de calibratge, per tal

d‟oferir calibratges acreditats, s‟han d‟haver acreditat

per ENAC segons la norma UNE-EN ISO 17025

(11).

La Societat Espanyola de Bioquímica Clínica i

Patologia Molecular ha publicat un document que

recull les recomanacions per al calibratge de material

volumètric al laboratori clínic i també com estimar la

incertesa de mesura en les pipetes de laboratori (12).

També hi ha normes ISO que recullen com estimar

aquesta incertesa per a les mesures de volum

utilitzant el mètode gravimètric (13) o espectromètric

(14) i, com a document de referència en el càlcul de

la incertesa de la mesura, es pot utilitzar el document

elaborat pel Comitè Conjunt de Guies de Treball en

Metrologia (JCGM 100), editat pel Centre Espanyol

de Metrologia (7).

6.1 Mètode gravimètric

Si el calibratge es realitza mitjançant un mètode

gravimètric, el procés es pot resumir en els aspectes

següents:

- La balança utilitzada ha d‟estar calibrada de

forma periòdica amb un patró traçable i tenir

una incertesa de mesura màxima que variarà

segons quin sigui el volum que es vulgui

verificar, segons les corresponents normatives

(per exemple, per a un volum d‟1 μL, serà de

0,002 mg, i per a un volum de 1000 μL, de 0,2

mg).

- La sala o el laboratori a on es faci l‟estudi ha de

reunir unes característiques determinades

d‟humitat, temperatura, pressió baromètrica i

d‟absència de vibracions i de corrents d‟aire. Els

instruments per determinar la humitat, la pressió

i la temperatura també han d‟estar calibrats de

manera traçable i han de permetre una exactitud

respectivament de 10%, 1 kPa i 0,2 ºC.

- L‟aigua utilitzada ha de ser destil·lada o

desionitzada com a mínim de tipus III,

- Els volums a què es realitza la verificació són, si

la pipeta és de volum fix: el valor nominal i, si és

variable: el valor nominal (el màxim), el mínim i

un valor intermedi. Per a volums menors a 50

μL, s‟ha de prevenir o corregir l‟evaporació.

- El procediment es resumeix en les passes

següents:



o Col·locar el recipient adient al plat de la

balança,

o Tarar la balança, anotant el valor de tara

obtingut,

o Abocar un volum d‟aigua destil·lada

corresponent al volum nominal que es vol

comprovar, i anotar el pes obtingut,

o Repetir l'operació 10 vegades, idealment, en

menys de 60 segons.

Aquest procediment s‟ha de repetir per als diferents

volums desitjats de treball de la pipeta, tal i com s‟ha

dit, el valor nominal, mínim i intermedi, però això es

pot adaptar a l‟ús habitual de la pipeta.

Per a les pipetes multicanal, s‟ha de repetir tota

l'operació per a cadascun dels canals.

- Si s‟escau, es realitzen les correccions

corresponents a la pressió i temperatura,

utilitzant taules o factors de conversió publicats.

Per a volums petits, l‟evaporació és una font

important d‟error i es pot també haver de

corregir.

- Es calculen els resultats obtinguts per a cada

volum estudiat:

o Estimar l‟error sistemàtic relatiu, calculant el

biaix: valor mitjà dels 10 valors observats

menys el valor nominal, dividit pel valor

nominal, per cent,

100

n

nir

V

VV

o Estimar la imprecisió, calculant la desviació

estàndard dels 10 valors obtinguts,

o Estimar la incertesa de mesura u, utilitzant

la fórmula simplificada, a partir dels dos

anteriors: seguint l'ISO 8655-6, se suma

l‟error sistemàtic relatiu i la desviació

estàndard per a un factor de cobertura de

2, que equival a un nivell de confiança del

95%:

ir su 2

o Si es tracta de volums molt petits o a on es

requereix d‟una exactitud molt alta, s‟ha de

fer una estimació completa de la incertesa

relativa combinada, considerant tots els

factors que poden afectar, per exemple,

seguint l'ISO 20461.

6.2 Mètodes no gravimètrics

Alternativament al mètode gravimètric, hi ha altres

mètodes: uns espectromètrics que observen el canvi

d‟absorbància produït per la reacció que té lloc per

l‟addició d‟un volum teòric d‟una solució de

calibratge a un blanc, o bé d‟altres titrimètrics, que

observen el canvi en el pH, també a conseqüència de

l‟addició d‟un volum teòric a una solució.

Els primers estan disponibles comercialment des de

fa més d‟una dècada i aquests mètodes alternatius

estan contemplats en l'ISO 8655-7; a més ofereixen

en alguns casos traçabilitat a estàndards

internacionals i es poden utilitzar també per a pipetes

multicanal o per a sistemes automatitzats. Al nostre

país encara no estan massa introduïts ni

comercialitzats.

7. Manteniment

1

1

2

n

VV

s

n

i

ii

i



Les pipetes de laboratori s‟han de sotmetre, a més

del calibratge, a un manteniment preventiu, que ha

d‟incloure les accions següents:

- Neteja: de la superfície i sempre que al cilindre

interior hagi pogut entrar part de la mostra; el

fabricant dóna instruccions sobre si es pot

netejar amb aigua, sabó, isopropanol, etc.

Generalment, requereix del desmuntatge de la

peça ejectora de la punta.

- Lubricació: del sistema de lliscament del pistó,

amb oli de silicona.

- Revisió i reposició de la junta de goma, si

s‟escau.

El manteniment preventiu el pot realitzar el propi

personal del laboratori clínic o bé el personal de

l‟empresa proveïdora d‟altres manteniments o

calibratges.

D'igual manera que per al calibratge, seran el tipus i

la freqüència d‟ús de la pipeta, juntament amb la

necessitat d‟exactitud de l‟activitat del laboratori, els

que determinin la freqüència i tipus de

manteniments.

Bibliografia

1. Asociación Española de Normalización y Certificación. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón — Parte 1: Terminologia, requisitos generales y recomendaciones de uso (UNE-EN ISO 8655-1:2003). Madrid: AENOR; 2003.

2. Asociación Española de Normalización y Certificación. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón — Parte 2: Pipetas tipo pistón (UNE-EN ISO 8655-2:2003). Madrid: AENOR; 2003.

3. Asociación Española de Normalización y Certificación. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón — Parte 6: Métodos gravimétricos para la determinación del error de medición (UNE-EN ISO 8655-6:2003). Madrid: AENOR; 2003.

4. Comissió Electrotècnica Internacional, Cooperació Internacional per a l'Acreditació de Laboratoris, Federació Internacional de Química Clínica, Oficina Internacional de Pesos i Mesures, Organització Internacional de Metrologia Legal, Organització Internacional de Normalització, Unió Internacional de Física Pura i Aplicada, Unió Internacional de Química Pura i Aplicada. Vocabulari internacional de metrologia. Conceptes fonamentals i generals i termes associats. (VIM). 3a edició. 2008. <http://www.acclc.cat/continguts/ivv114.pdf> (accés: 2013-07-02).

5. Asociación Española de Normalización y Certificación. Material de vidrio para laboratorio. Pipetas graduadas (UNE-EN ISO 835:2007). Madrid: AENOR; 2007.

6. Asociación Española de Normalización y Certificación. Material de vidrio para laboratorio. Pipetas de uno o dos aforos de volumen fijo (UNE-EN ISO 648:2008). Madrid: AENOR; 2009.

7. International Organization for Standardization, International Electrotechenical Commission, International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, International Laboratory Accreditation Cooperation, International Organization of Legal Metrology, International Bureau of Weights and Measures, International Union of Pure and Applied Chemistry, International Union of Pure and Applied Physics. Guide to the expression of uncertainty in measurement. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement. JCGM 100:2008. <http://www.bipm.org/utils/common/documents/jcgm/JCGM 100 2008 E.pdf> (Accés 2013-07-02).

8. Asociación Española de Normalización y Certificación. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón — Parte 7: Métodos no gravimétricos para la evaluación de la aptitud al uso de los equipos (UNE-EN ISO 8655-7:2006). Madrid: AENOR; 2006.



9. International Organization for Standardization. Medical laboratories — particular requirements for quality and competence. ISO 15189. Geneva: ISO; 2012.

10. Entidad Nacional de Acreditación. Criterios generales de acreditación de laboratorios clínicos. CGA-ENAC-LCL. Madrid: ENAC; Marzo 2008. <http://www.enac.es/documents/enac/documentos/Criterios%20Generales%20de%20acreditación/CGA-ENAC%20LCL.pdf> (Accés 2013-07-02).

11. Asociación Española de Normalización y Certificación. Evaluación de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración (UNE-EN ISO 17025:2005). Madrid: AENOR; 2005.

12. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Recomendaciones para la calibración de material volumétrico en el laboratorio clínico. [Preparat per Ruíz Morer R.]. Barcelona: Publicaciones Nacionales Técnicas y Extranjeras; 2009. [B-33169/09] [ISSN: 2013-5750].

13. International Organization for Standardization. Determination of uncertainty for volume measurements made using the gravimetric method. ISO/TR 20461. Geneva: ISO; 2000.

14. International Organization for Standardization. Piston-operated volumetric instruments — Determination of uncertainty for volume measurements made using the photometric method. ISO/TR 16153. Geneva: ISO; 2004.


__________________________________________________________________________________________



Estadística descriptiva aplicada a variables discretes

Preparat per:

Henar Valbuena Parralejo, Marta Mosquera Parrado

Laboratoris Clínics, Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona

_________________________________________________________________________________________

1. Introducció

Les variables discretes són aquelles que només poden

prendre certs valors determinats pertanyents a un

conjunt numerable, per contraposició amb les

variables contínues, que poden prendre qualsevol valor

dins d’un interval determinat (1). Per exemple, el

nombre de fills d’una parella és una variable discreta

que pot ser 0, 1, 2,... però mai podrà ser 1,4. En

canvi l’alçada d’una persona pot prendre qualsevol

valor dins d’un rang (el de les alçades possibles pels

éssers humans); 1,62 m, 1,85 m, 2,06 m, etc.

_____________________________________________ 1 Membres de la Secció d’Estadística i Metrologia durant la

preparació d’aquest document: A. Blanco Font, B. Candás Estébanez, X. Fuentes Arderiu (president), M. Martínez Casademont, M. Mosquera Parrado, J.M. Queraltó Compañó, L. Rami Brualla, R. Rigo Bonnin, H. Valbuena Parralejo. _____________________________________________

Els valors de les variables discretes poden pertànyer

a escales binàries o dicotòmiques, amb dos valors

possibles, com per exemple la presència o no per

sobre d’una concentració determinada d’una droga

d’abús en l’orina; o a escales polinàries o

politòmiques, amb més de dos valors possibles, com

en l’exemple anterior el nombre de fills (2, 3).

Dins les propietats estudiades al laboratori clínic, les

que poden assimilar-se a variables discretes pel seu

estudi estadístic són les propietats qualitatives, per

exemple el grup sanguini (propietat qualitativa

polinària) o el sexe (propietat qualitativa binària); i les

propietats ordinals (o magnituds ordinals), com per

exemple la concentració de bacteris en un sediment

urinari expressat com a absent, escàs, moderat o

abundant.


ISSN: 1697-5421

Document docent

138 Valbuena et al. In vitro veritas 2013; 14:137-146


Les variables discretes no permeten cap

transformació matemàtica, tret del recompte i

transformacions monòtones en el cas de les variables

discretes assimilables a propietats ordinals, i els

estadístics que s’acostumen a calcular per a aquest

tipus de variable són la moda i algun índex de

dispersió. També permeten l’aplicació de l’estadística

de proporcions. Per tant, el “joc estadístic” que

permeten és més limitat que en el cas de les variables

contínues.

L’objectiu d’aquest text és realitzar una revisió de les

bases de l’estadística descriptiva aplicada a variables

discretes.

Estadística descriptiva aplicada a variables discretes

En l’estudi estadístic descriptiu d’una variable

discreta, ja sigui binària o polinària, les dades

obtingudes es recullen habitualment en una taula de

freqüències. Aquestes taules es poden representar de

manera gràfica amb diagrames de barres o gràfiques de

sectors. Per últim, com ja s’ha indicat, la moda i l’índex

de dispersió són els únics estadístics que s’acostumen

a aplicar quan s’estudien aquests tipus de variables.

discretes.

Taules de freqüència (1, 4, 5)

Es pren una mostra de grandària n en la què es vol

estudiar una certa variable discreta amb un nombre

de valors possibles i determinats k.

Es defineix la freqüència absoluta d’un valor i,

representada com a ni, com el nombre d’individus

dins de la mostra que presenten aquest valor i. La

suma de les freqüències absolutes de tots els valors

de la mostra ha de ser igual a n.

nnnnn k

ki

i

i

...21

1

La freqüència relativa d’un valor i, representada com a

fi, es calcula dividint la freqüència absoluta d’un valor

i en la mostra entre el nombre total d’individus, n. La

suma de les freqüències relatives de tots els valors de

la mostra ha de ser per tant igual a 1; si les

freqüències relatives s’expressen com a percentatge,

la suma haurà de ser igual a 100 (Taula 1).

n

nfi i

,

1...21

1

k

ki

i

i ffff

Les freqüències relatives també reben el nom de

proporcions (símbol: p).

Valor Freqüència

absoluta Freqüència

relativa

1 n1 f1

2 n2 f2

… … …

K nk fk

Total N 1

Taula 1. Freqüències absolutes i relatives.

Exemple 1. Variable discreta binària corresponent a una magnitud ordinal

S’estudia una mostra de 100 pacients del Servei

d’Urgències a qui se’ls demana la mesura de Uri—

Coriogonadotropina; c.arb.({negatiu; positiu}),

popularment anomenada prova d’embaràs, i el valor

mesurat és positiu en 12 de les pacients. Aquestes

proves d’embaràs es basen en la mesura de la

concentració de coriogonadotropina en l’orina;

qualsevol valor mesurat de la concentració d’aquesta

hormona en l’orina superior al límit de detecció del

sistema de mesura emprat es considera positiu, la

qual cosa indica que existeix compatibilitat biològica

entre el valor mesurat i el possible embaràs de la

pacient. Cal ressaltar que un valor mesurat negatiu no

vol dir que en la mostra d’orina es descarti la

presència de coriogonadotropina; un valor mesurat

negatiu només ens assegura que la concentració de

In vitro veritas 2013; 14:137-146 Valbuena et al. 139


coriogonadotropina es troba per sota del límit de

detecció del sistema de mesura emprat.

En aquest exemple, la grandària de la mostra és 100

pacients, els valors possibles de la variable

considerada són positiu i negatiu i les freqüències

absolutes dels resultats trobats són 12 positius i 88

negatius, corresponents a les freqüències relatives

0,12 (12 %) positius i 0,88 (88 %) negatius.

A la Taula 2 es mostra la taula de freqüències per

aquest exemple.

Uri—Coriogonadotropina; c.arb.({negatiu; positiu})

Freqüència absoluta

Freqüència relativa

Positiu 12 0,12

(12 %)

Negatiu 88 0,88

(88 %)

Total 100 1

(100 %)

Taula 2. Exemple 1. Variable discreta binària corresponent a una magnitud ordinal.

Exemple 2. Variable discreta binària corresponent a una propietat qualitativa

En el laboratori clínic d’un hospital es realitzen

cariotips a partir de mostres de biòpsies corials o de

líquids amniòtics per a la detecció prenatal de

cromosomopaties. Les cromosomopaties es

divideixen en dos grups, estructurals i numèriques.

La síndrome de Down és en el 95% dels casos

descrits una aneuploïdia numèrica que correspon a la

trisomia del cromosoma 21.

Des del punt de vista metrològic (lato sensu), la

propietat biològica identificada és: Cariotip—

Cromosoma 21; trisomia({negatiu, positiu}).

Durant un any, el laboratori clínic ha estudiat 535

cariotips per la detecció prenatal de

cromosomopaties i ha detectat 11 casos en els que el

cariotip presentava una trisomia del cromosoma 21.

A la Taula 3 es mostra la taula de freqüències per a

aquest exemple.

Cariotip—Cromosoma 21; trisomia({negatiu, positiu})



Positiu 11 0,021

(2,1 %)

Negatiu 524 0,979

(97,9 %)

Total 534 1

(100 %)

Taula 3. Exemple 2. Variable discreta binària corresponent a una propietat qualitativa.

Exemple 3. Variable discreta polinària corresponent a una propietat qualitativa

El laboratori clínic d’un hospital identifica els grups

sanguinis AB0 i Rh0. Des del punt de vista

metrològic (lato sensu), la propietat biològica en estudi

és: Ers(San)—Antígens eritrocítics; taxonalitat(ABO;

Rh). En 157 mostres s'obtenen els resultats detallats

a la Taula 4.

Ers(San)—Antígens

eritrocítics; taxonalitat(ABO; Rh D)



O, Rh positiu 57 0,363

(36,3 %)

A, Rh positiu 53 0,338

(33,8 %)

B, Rh positiu 12 0,076

(7,6 %)

AB, Rh positiu 4 0,025

(2,5 %)

O, Rh negatiu 14 0,089

(8,9 %)

A, Rh negatiu 12 0,078

(7,6 %)

B, Rh negatiu 3 0,019

(1,9 %)

AB, Rh negatiu 2 0,013

(1,3 %)

Total 157 1

(100,0 %)

Taula 4. Exemple 3. Variable discreta polinària corresponent a una propietat qualitativa.



Només en el cas que s’estudiï una variable discreta

corresponent a una magnitud ordinal amb una escala

polinària de valors possibles, és interessant calcular

també la freqüència acumulada de cadascun dels valors.

La freqüència acumulada reflectirà directament el

nombre d’individus de la mostra que presenten un

valor inferior de la variable d’estudi a un cert valor;

per aquest motiu no té sentit el seu càlcul per a

variables discretes corresponents a propietats

qualitatives.

La freqüència absoluta acumulada per a un valor i, Ni,

s’obté sumant a la freqüència absoluta del valor i les

freqüències absolutes de tots els valors de la taula de

freqüències inferiors a aquest valor i. La freqüència

absoluta acumulada de l’últim valor (Nk) de la taula

és, per tant, igual a n.

i

ij

j

ji nnnnN

...21

1

nnnnnN k

kj

j

jk

...21

1

On i és el valor pel qual es vol calcular la freqüència

absoluta acumulada i k és el nombre total de valors.

Igualment, la freqüència relativa acumulada per a un valor

i, Fi, s’obté sumant a la freqüència relativa del valor i,

les freqüències relatives dels valors inferiors. La

freqüència relativa acumulada de l’últim valor de la

taula és, per tant, igual a 1.

i

ij

j

ji ffffF

...21

1

1...21

1

k

kj

j

jk ffffF

Exemple 4. Variable discreta polinària corresponent a una magnitud ordinal

Es pren una mostra de 40 sediments que pertanyen a

40 pacients que arriben al Servei d’Urgències d’un

hospital amb simptomatologia d’infecció del tracte

urinari. El conjunt de valors possibles de

concentració arbitrària de bacteris en el sediment

urinari establert al laboratori clínic de l’hospital que

es tracta és {absents, escassos, bastants, abundants}.

Des del punt de vista metrològic, la magnitud

biològica ordinal en estudi és: Uri—Bacteris;

c.arb.(sediment; microscòpia; {absents, escassos,

bastants, abundants})

A la Taula 5 es mostren els resultats d’aquest estudi,

ordenant els valors segons la quantia que denoten.

S’han inclòs també les freqüències acumulades, tant

absolutes com relatives.

Concentració arbitrària de

bacteris en l’orina

Freqüència

absoluta


(%)


acumulada (Ni)


acumulada (Fi )

Absents 1 0,025

(2,5 %) 1

0,025 (2,5 %)

Escassos 5 0,125

(12,5 %) 6

(5+1)

0,150 (15 %)

Bastants 16 0,400 (40 %)

22 (16+5+1)

0,550 (55 %)

Abundants 18 0,450 (45 %)

40 (18+16+5+1

)

1 (100 %)

Total 40 1

(100 %)

Taula 5. Exemple 4. Variable discreta polinària corresponent a una magnitud ordinal.

Interpretant aquesta taula es pot dir, per exemple,

que 22 dels 40 pacients (el 55%) tenien una

concentració arbitrària de bacteris en l’orina menor o

igual al valor «bastants», o que només 6 pacients

(15%) tenien una concentració arbitrària de bacteris

en l’orina igual o inferior al valor «escassos».

Representacions gràfiques de les taules de freqüències (1, 5)

En l’estudi estadístic d’una variable discreta, les

representacions gràfiques de les dades es basen en la

proporcionalitat de les freqüències absolutes o

relatives dels valors a una àrea.



Es poden trobar principalment dos tipus de

representació: els diagrames de barres i els diagrames

de sectors.

Un diagrama de barres està constituït per tants

rectangles com valors presenti la variable en la

mostra estudiada. Tots els rectangles tindran una

base d’igual amplitud i l’altura serà proporcional a la

freqüència absoluta o relativa; així l’àrea del rectangle

és proporcional a la freqüència que representa.

A les figures 1 i 2 es mostren les representacions dels

diagrames de barres corresponents als exemples 1 i 4.

Figura 1. Diagrama de barres de l’exemple 1.

Figura 2. Diagrama de barres de l’exemple 4.

Un diagrama de sectors es construeix dividint un cercle

en tants sectors com valors presenti la variable en

estudi. L’angle de cada sector, i conseqüentment

l’àrea de cada sector, és proporcional a la freqüència

del valor en la mostra en estudi, tant absoluta com

relativa. Es poden acompanyar d’una llegenda de

colors que explica a quin valor correspon cada

sector.

A les figures 3 i 4 es mostren les representacions dels

diagrames de sectors corresponents als exemples 2 i

3.

Figura 3. Diagrama de sectors de l’exemple 2.

Figura 4. Diagrama de sectors de l’exemple 3.

Estadístics de tendència central (1)

La moda d’una mostra o població és el valor amb una

freqüència (absoluta o relativa) o proporció més

gran. Com ja s’ha dit, és l’únic estadístic de tendència

central que es pot aplicar a les variables discretes.

Es pot donar el cas de tenir una mostra bimodal,

trimodal, etc. si dos o més valors diferents tenen

freqüències iguals i són les més grans de la mostra.

La moda en l’exemple 1, on s’estudiava la

concentració arbitrària de l’hormona

coriogonadotropina en l’orina és el valor «negatiu».



En el cas de l’exemple 2, detecció prenatal de la

trisomia del cromosoma 21 en el cariotip, la moda

també és el valor «negatiu». En l’exemple 3, el grup

sanguini amb una freqüència més elevada és el «grup

O, Rh positiu» i per tant n’és la moda. Per últim, en

l’exemple 4, on s’estudiava la concentració arbitrària

de bacteris en l’orina, la moda és el valor

«abundants».

Estadístics de dispersió

A diferència de la importància que se li atorga a la

dispersió quan s’estudien variables contínues, la

dispersió aplicada a les variables discretes no és

freqüentment tractada als llibres d’estadística. Aquest

fet no és degut a la falta d’eines per estimar aquesta

dispersió, sinó més aviat a una manca de consens

dels experts per decidir quina aproximació, de les

moltes proposades, és la més correcta i útil.

Quan es treballa amb variables quantitatives, la

forma més habitual d’estudiar la dispersió de les

dades consisteix en calcular la variació que existeix

entre les dades d’una mostra i la seva mitjana. Però

en el cas de les variables discretes, aquest

plantejament no és possible, ja que no se’n pot

calcular la mitjana.

Per a variables discretes s’ha d’entendre la variabilitat

d’una manera alternativa; en comptes d’estudiar la

variació entre totes les dades d’una mostra i la seva

mitjana, es poden estudiar la variació de les dades de

la mostra entre sí.

En aquesta part d’aquest document docent es

presentaran algunes d’aquestes propostes per al

càlcul de diversos estadístics de dispersió per a

variables discretes i es discutirà breument la seva

aplicació.

Raó de variació

La raó de variació és un estadístic de dispersió per a

variables discretes de tota mena molt senzill de

calcular (6). El seu valor és la proporció d’individus

d’una mostra que, per a la propietat biològica en

estudi, tenen un valor diferent al de la moda.

En una mostra de grandària n amb un nombre

d’individus nmo que, per la propietat en estudi,

presenten el valor de la moda, la raó de variació (v:)

es calcula de la següent manera:

n

nv mo1:

El valor de la raó de variació serà igual a 0 si tots els

individus de la mostra presenten el mateix valor i

s’allunyarà més d’aquest valor com més repartits

estiguin els individus entre els valors possibles, és a

dir, quanta més variabilitat presenti la mostra.

La raó de variació no considera el nombre de valors

possibles ni el nombre d’individus repartits entre

aquests valors, per tant la informació que se n’extreu

és més limitada que amb altres estadístics de

dispersió presentats en aquest apartat.

Càlcul de la raó de variació per a les dades de l’exemple 2.

La moda en aquest exemple és el valor «negatiu».

12,0

100

8811:

n

nv mo

Càlcul de la raó de variació per a les dades de l’exemple 4.

La moda en aquest exemple és el valor «abundants».

55,0

40

1811:

n

nv mo

Índex de variació qualitativa

L’índex de variació qualitativa (d'ara endavant IVQ)

és un estimador de la variabilitat basat en el càlcul del



quocient entre el nombre de diferències observades

en les dades i el nombre de diferències màxim

possible. S’han proposat equacions diferents per

calcular-lo (7, 8, 9) que aplicades a una mateixa

mostra proporcionarien valors diferents. Tot i així,

totes aquestes alternatives compleixen els requisits

següents:

- El resultat de l’IVQ varia entre 0 i 1.

- L’IVQ és 0 en el cas que tots els individus de la

mostra tinguin el mateix valor i aquest sigui

l’únic valor possible.

- L’IVQ és 1 en el cas que els individus de la

mostra estiguin igualment distribuïts entre tots

els valors k possibles.

- Si es calcula l’IVQ amb la mateixa equació en

dues mostres diferents on s’estudia la mateixa

variable discreta, la mostra amb l’IVQ més

proper a 1 és la que presenta una major

dispersió de les dades.

Una de les propostes més emprades pel càlcul de

l’IVQ és la de Gibbs et al. 1975 (7). En una mostra on

es vol estudiar una variable discreta amb k valors

possibles, l’IVQ es calcula de la manera següent:

k

i

ifk

kIVQ

1

211

on fi són les freqüències relatives dels valors a la

mostra.

L’IVQ es considera actualment una bona

aproximació al càlcul de la variació per a les mostres

on s’estudia una variable discreta que correspon a

una propietat qualitativa, però no és apropiada per a

magnituds ordinals (10). L’IVQ tracta totes les

diferències entre els valors possibles de la variable

per igual. Això és correcte per a una variable discreta

que correspon a una propietat qualitativa; per

exemple per al color d’un líquid peritoneal, on

vermellós és tan diferent de groc com ho és de

verdós. Però, en canvi, els valors d’una magnitud

ordinal denoten una quantia i per tant les diferències

entre els diferents valors no són les mateixes; en

l’estudi d’un sediment d’orina no és igual la

diferència entre una concentració arbitrària de

bacteris «abundant» o «bastant» que entre una

concentració «abundant» o «absent».

Càlcul de l’IVQ amb l’equació proposada per Gibbs et al. per a l’exemple 2.

Les dades es troben en la taula 3.

082,0979,0021,0112

21

1

22

1

2

k

i

ifk

kIVQ

En aquest exemple l’IVQ és molt proper a 0, ja que

el 97,9 % dels resultats de la mostra corresponents a

la propietat biològica estudiada, Cariotip—

Cromosoma 21; trisomia({negatiu, positiu}), eren

negatius.

Càlcul de l’IVQ amb l’equació proposada per Gibbs et al. per a l’exemple 3.

La propietat biològica estudiada en aquest exemple

és Ers(San)—Antígens eritrocítics; taxonalitat (ABO;

Rh), les dades es troben a la Taula 4.

84,0013,0019,0089,0025,0076,0338,0363,0118

8

11

2222222

1

2

k

i

ifk

kIVQ

Encara que els IVQ calculats per a variables diferents

i amb escales diferents no són comparables, podem

veure que el valor de l’IVQ en aquest exemple és més

gran que en l’anterior i que efectivament això es

relaciona amb una distribució més uniforme dels

resultats entre els valors possibles.



Entropia de dispersió

L’entropia de dispersió s’utilitza com a estimador de

la variabilitat de les variables discretes corresponents

a propietats qualitatives (nominals) (11). L’entropia

de dispersió (H) d’una mostra amb k categories

possibles és igual a la suma negativa dels logaritmes

neperians de les freqüències relatives per a cada valor

de la variable, multiplicats per la mateixa freqüència

relativa:

k

i

ii ffH1

)ln(

El valor de l’entropia de dispersió presenta un valor

mínim de 0, quan tots els individus d’una mostra

presenten el mateix valor de la variable.

0)1ln(1)ln(

1

k

i

ii ffH

El valor màxim de l’entropia de dispersió depèn del

nombre de valors possibles de la variable discreta, i

es dóna quan tots els individus es reparteixen per

igual entre tots els valors possibles. Per exemple, en

una mostra amb k=4, on tots els individus es

reparteixen de manera equitativa entre els k valors

possibles, l’entropia de dispersió màxima serà:

39,1)25,0ln(25,04)ln(1

k

i

ii ffH

Quan es compara l’entropia de dispersió de dues

mostres diferents amb el mateix nombre de valors de

la variable discreta en estudi, aquella que presenti un

valor de l’entropia de dispersió més gran, és la que té

major variabilitat.

L’entropia de dispersió suposa una estratègia

alternativa a l’IVQ pel càlcul de la dispersió en

mostres on s’estudia una propietat qualitativa. Dóna

una informació complementaria, però no presenta

equivalències directes amb les fórmules de l’IVQ.

Pel mateix motiu que l’IVQ, l’entropia de dispersió

no és apropiada per a magnituds ordinals, ja que

omet en el seu càlcul que els valors d’una magnitud

ordinal denoten una quantia i que per tant no tots els

valors són igual de diferents entre si.

El quocient entre l’entropia de dispersió (H) d’una

mostra i la màxima possible (Hmàx) és

l’anomenat índex d’uniformitat de Pielou (J) (12):

màxH

HJ

El valor màxim de l’índex d’uniformitat de Pielou és

1, i es donarà quan l’entropia de dispersió d’una

mostra sigui la màxima, és a dir, quan la variabilitat és

la màxima perquè tots els individus estan

uniformement repartits entre tots els valors

possibles. En canvi l’índex d’uniformitat de Pielou

serà 0 quan l’entropia de dispersió sigui la mínima; és

en el cas que tots els individus de la mostra presentin

el mateix valor.

Càlcul de l’entropia de dispersió per a l’exemple 2.

Les dades es troben en la Taula 3.

1,0)979,0ln(979,0())021,0ln(021,0)ln(1

k

i

ii ffH

L’entropia de dispersió màxima i l’índex

d’uniformitat de Pielou en aquest cas seran:

69,0)5,0ln(5,02)ln(1

max

k

i

ii ffH

14,0

69,0

1,0J

Càlcul de l’entropia de dispersió per l’exemple 3.


57,1...)338,0ln(338,0)ln(1

k

i

ii ffH

L’entropia de dispersió màxima i l’índex

d’uniformitat de Pielou en aquest cas seran:



08,2)125,0ln(152,08)ln(1

max

k

i

ii ffH

75,0

08,2

57,1J

Índex de Simpson/ Herfindahl-Hirschman

L’índex de Simpson/Herfindahl-Hirschman () per a

variables discretes corresponents a propietats

qualitatives (nominals) es calcula com la suma

quadràtica de les proporcions (p), o freqüències

relatives, observades per a cada valor de la variable

en estudi (13):

n

i

ip1

2

El valor màxim d’aquest índex és 1, que correspon a

la mínima variabilitat, i es produeix quan tots els

individus d’una mostra presenten el mateix valor. El

valor mínim és 1/k, on k és el nombre de valors

possibles de la variable, i es produeix quan la

dispersió és màxima, és a dir, els individus es

distribueixen de manera equitativa entre tots els

valors.

Igual que l’entropia de dispersió o que l’IVQ, aquest

índex no és apropiat per a l’estudi de magnituds

ordinals.

Càlcul de l’índex de Simpson/Herfindahl-Hirschman per a l’exemple 3.


267,0...338,0363,0 22

1

2

n

i

ip

En aquest cas, el valor mínim (màxima variabilitat)

de l’índex és:

125,0

8

1125,08

1

22

n

i

ip

Estimadors de la variabilitat per a les magnituds ordinals

Ja s’ha dit que l’aplicació de l’IVQ o de l’entropia de

dispersió no resulta apropiada quan es treballa amb

variables discretes corresponents a una magnitud

ordinal. Existeixen diverses propostes publicades per

respondre a la necessitat d’un estimador de dispersió

per aquest cas (10, 14, 15). D’entre elles, una de les

més acceptades és la proposada per Blair i Lavy en la

qual es calcula un estimador de dispersió anomenat

h2:

i

ki

i

i FFk

h

14/1

1 1

1

2

On k és el nombre de valors possibles de la variable i

Fi és la freqüència acumulada per cadascun dels

valors.

Els valors de h2 oscil·len entre 0 i 1. El valor h2=1

correspon a la situació en que els individus de la

mostra estudiada es reparteixen per igual entre els

dos valors extrems de la variable (en el cas d’una

variable dicotòmica, es repartirien per igual entre els

dos valors). Per contra, el valor mínim h2=0

correspon a una mostra amb un únic valor possible

per la variable, és a dir k=1. Com en els casos

anteriors, no es recomana utilitzar h2 per comparar la

dispersió de dues mostres en les quals s’ha calculat la

dispersió en base a escales diferents.

Càlcul d’h2 per a l’exemple 1.

Les dades es troben en la Taula 2. Com es tracta

d’una variable dicotòmica, l’única freqüència

acumulada a tenir en compte és la del valor més baix

(«negatiu»).

42,0)88,01(88,04/12

11

4/1

1 1

1

2

i

ki

i

i FFk

h



Càlcul d’h2 per a l’exemple 4.


6,0)55,01(55,0)15,01(15,0)025,01(025,0

4/14

1

14/1

1 1

1

2

i

ki

i

i FFk

h

Per acabar aquest apartat val la pena recalcar que,

com ja s’ha dit al començament, existeixen altres

aproximacions a la qüestió del càlcul d'estadístics de

dispersió per a variables discretes, descrites i

discutides a la literatura especialitzada. Es recomana

consultar la bibliografia en que s’ha basat aquest

document docent per aprofundir en aquest tema.

Bibliografia

1. García Pérez A. Estadística aplicada: Conceptos básicos. Madrid: UNED; 2012.

2. Trullols E, Ruisanchez I, Rius FX. Validation of qualitative analytical methods.Trends in Anal Chem 2004;23:137-145.

3. Fuentes Arderiu X, Miró Balagué J. Naturalesa de les propietats biològiques examinades al laboratori clínic In vitro veritas 2011;12:150-159 <http://www.acclc.cat/continguts/ivv135.pdf> (Accés 2013-07-05).

4. Doménech Massons J M. Bioestadística: Métodos estadísticos para investigadores. Barcelona: Herder; 1977.

5. Forcada Plaza S, Rubió Massegú J. Elements d’estadística. Barcelona: UPC; 2007.

6. Freeman, Linton C. Elementary applied statistics, New York: John Wiley and Sons; 1965.

7. Light RJ, Margolin BH. An analysis of variance for categorical data. J Am Stat Assoc 1987;66:534-44.

8. Gibbs JP, Poston DL Jr. The Division of labor: Conceptualization and related measures. Social Forces 1975;53:468-76.

9. Wilcox AR. Indices of qualitative variation. Tennessee: Union Carbide Corporation; 1967.

10. Blair J, Lacy MG. Statisticals of ordinal variation. Sociol Method Res 2000;28;251-80.

11. Vanhoy M. An entropy estimator of population variability in nominal data. J Scien Psychol 2008;(June):25-30.

12. Pielou EC. The measurement of diversity in different types of biological collections. J Theoret Biol 1966;13:131-44.

13. Simpson EH. Measurement of diversity. Nature 1949;163:688.

14. Gadrich T, Bahkansky E. Ordanova: Analysis of ordinal variation. J Stat Plan Infer 2012;142:3174-88.

15. Gadrich T, Bahkansky E. Interlaboratory comparison of test results of an ordinal or nominal binary property: analysis of variation. Accr Qual Assur 2012;17:239-43..


http://www.ornl.gov/info/reports/1967/3445605133753.pdf

http://www.springerlink.com/content/1432-0517




__________________________________________________________________________________________

Mesurament de la concentració de micofenolat en el

plasma mitjançant cromatografia líquida d’alta i ràpida

eficàcia acoblada a l’espectrometria d’absorció molecular

a l’ultraviolat

Ariadna Arbiol Roca, José Manuel González de Aledo Castillo,

Raül Rigo Bonnin, Pedro Alía Ramos


_________________________________________________________________________________________

1. Introducció

El micofenolat mofetil (MMF; nom comercial

CellCept®, Myfortic®) és un èster del micofenolat, el

qual és produït per espècies de fongs del gènere

Penicillium. En el fetge el MMF és convertit per

hidròlisi al seu metabòlit actiu, l'acid micofenòlic

(MPA), el qual inhibeix de manera reversible i no

competitiva l'activitat de l'enzim inosina 5’-

monofosfat deshidrogenasa (IMPDH; EC 1.1.1.205)

durant la síntesi de DNA en la fase S del cicle

cel·lular. Aquest enzim juga un paper important en la

síntesi de novo de nucleòtids de guanosina en els

limfòcits T i B. Per tant, la inhibició de la IMPDH

dona lloc a una disminució de nucleòtids de

guanosina i a un augment de nucleòtids d'adenosina

fet que produeix una inhibició de la síntesi del DNA

i de la proliferació cel·lular, sent aquest el principal

mecanisme mitjançant el qual el micofenolat exerceix

les seves accions immunosupressores. Un altre

mecanisme derivat de la disminució dels nucleòtids

de guanosina és la inhibició de la glicosilació i

l’expressió de molècules d'adhesió i, per tant,

disminueix el reclutament de limfòcits i monòcits en

els llocs d'inflamació (1).

Per altra banda, el micofenolat inhibeix la forma

induïble de l’enzim òxid nítric sintetasa (iNOS; EC

1.14.13.39), la qual cosa porta a una menor

producció d'òxid nítric i conseqüentment a un menor

dany cel·lular. El micofenolat té efectes favorables en


ISSN: 1697-5421

Article original

148 Arbiol Roca et al. In vitro veritas 2013;14:147-160


la malaltia cardiovascular, ja que mitjançant la

inhibició de la iNOS disminueix l'oxidació de

lipoproteïnes i, per tant, retarda la progressió de

l'aterosclerosi en pacients amb lupus eritematós

sistèmic (1).

L’administració de MMF planteja el problema de la

seva variabilitat farmacocinètica inter i intraindividual

i a més està sotmesa a efectes indesitjables potencials,

especialment gastrointestinals, infeccions i tumors.

Per aquestes raons, és necessària una

individualització de la dosi mitjançant el seguiment

de la concentració de micofenolat en el plasma (2).

En l’actualitat, a més dels sistemes de mesura basats

en principis d’immunoanàlisis, la concentració de

micofenolat en el plasma pot mesurar-se emprant

sistemes que es basen en la cromatografia líquida

d’alta eficàcia o HPLC (acrònim de l’anglès high-

preformance liquid chromatography) acoblada a

l’espectrometria d’absorció molecular, a

l'espectrometria de masses o MS (acrònim de l'anglès

mass spectrometry) o bé a l'espectrometria de masses en

tàndem o MS/MS (acrònim de l’anglès tandem mass

spectrometry) (314). El fet que aquests sistemes

presenten unes millors propietats metrològiques que

els basats en la immunoanàlisi, ha conduït a

considerar-los sistemes de mesura de referència.

L’objectiu d’aquest treball és validar un procediment

de mesura per al mesurament de la concentració de

micofenolat en el plasma emprant un sistema de

mesura que es basa en la cromatografia líquida d’alta

i ràpida eficàcia o UPLC (acrònim de l’anglès ultra

high-preformance liquid chromatography) acoblada a

l’espectrometria d’absorció molecular a l’ultraviolat

(UV).

2. Material i mètodes

2.1. Productes químics i reactius

L’acetonitril, l’aigua i el metanol de qualitat HPLC

són proporcionats per Merck Biosciences

(Darmstadt, Alemanya).

S’utilitza l’equip de reactius ClinRep® Complete kit

for Mycophenolic Acid in plasma de Recipe®

(Munich, Alemanya). Cada equip conté: una ampolla

d’1 L de fase mòbil, un material de calibratge, una

ampolla de 20 mL d’una solució precipitant de

proteïnes i una ampolla de 2 mL d’estàndard intern.

S’empren 3 materials de control plasmàtic ClinChek®

Plasma Control for Mycophenolic Acid de Recipe®.

El material de calibratge i els materials de control es

preparen seguint les instruccions i recomanacions

descrites pel fabricant dels mateixos..

2.2. Mostres de pacients

Les mostres de sang de pacients s’obtenen

mitjançant punció venosa i es recullen en tubs amb

EDTA-K3 com anticoagulant (Vacuette,

Kremsmünster, Àustria). Les mostres són

centrifugades a 1200 g durant 10 minuts a

temperatura ambient i emmagatzemades a (2-8) ºC

fins al seu processament durant un temps inferior a

un dia.

2.3. Preparació de les mostres

La preparació de les mostres consisteix en una

precipitació de proteïnes. En un tub tipus

Eppendorf, s’afegeixen 100 μL de cada calibrador,

control o mostra de plasma i 20 μL de la solució

d’estàndard intern inclosa en l’equip de reactius. La

mescla s’agita breument en un agitador tipus vòrtex i,

posteriorment, s’afegeixen 200 μL de la solució

precipitant. Després de l’agitació de la mescla

resultant en un vòrtex durant 5 segons, els tubs se

centrifuguen durant 5 minuts a 11000 g a

temperatura ambient. A continuació, el sobrenedant

In vitro veritas 2013;14:147-160 Arbiol Roca et al. 149


es transfereix a uns vials cromatogràfics de vidre

específics per al seu processament.

2.4. Sistema de mesura

S’empra un sistema ACQUITY® UPLC® acoblat a

un detector ultraviolat ACQUITY® UV®, ambdós de

Waters Cromatografia (Milford, Estats Units).

2.5. Condicions cromatogràfiques

La separació cromatogràfica dels components de la

mostra es porta a terme a 30 ºC utilitzant una

columna analítica C18 en fase reversa Acquity UPLC®

BEH 2,1 x 50 mm; 1,7 µm de Waters a la qual se li

ha incorporat un suport que conté un filtre de 0,2

µm (Waters). Les mostres es mantenen a 15 ºC a

l’interior del mostrejador. Es treballa a un flux de 0,4

mL/min en modalitat isocràtica. El volum d’injecció

de la mostra és de 7,5 µL en un bucle de 10 µL

treballant en la modalitat d’injecció parcial amb

l’agulla sobreeixida.

2.6. Condicions del detector ultraviolat

La longitud d’ona de treball emprada és 215 nm.

2.7. Procediment de validació

El procediment de validació es duu a terme seguint

els criteris, definicions, recomanacions i guies de

l’Organització Internacional de Normalització (ISO),

la Unió Internacional de Química Pura i Aplicada

(IUPAC), la Federació Internacional de Química

Clínica i Ciències de Laboratori (IFCC), l’Agència

Europea de Medicaments (EMA) i l’Institut per a la

Normalització de Laboratoris Clínics (CLSI) (15-22).

Les propietats metrològiques estudiades són la

imprecisió intraserial, la imprecisió interdiària, el

biaix relatiu intraserial, el biaix relatiu interdiari,

l'error de mesura relatiu, la capacitat de detecció

(valor crític, límit de detecció i límit de quantificació),

l'interval de mesura, la selectivitat, la contaminació

per arrossegament o residualitat i la recuperació. Per

altra banda, també es realitza un estudi

d’intercanviabilitat de valors mesurats entre el

sistema en estudi i l’emprat habitualment al nostre

laboratori..

2.7.1. Calibratge

Cada deu mostres es processa el material de

calibratge de matriu plasmàtica inclòs a l’equip de

reactius.

La integració de les àrees sota la corba dels pics

cromatogràfics suavitzats i el càlcul de la

concentració de micofenolat es realitza utilitzant el

programa informàtic Empower versió 3.0 de

Waters. El programa informàtic calcula la

concentració de micofenolat en el plasma seguint

l’equació següent:

on [Micofenolat] = concentració de micofenolat en

les mostres o materials de control; IS = estàndard

intern; Cal = calibrador i [Cal] = Concentració del

calibrador.

2.7.2. Estudi de la imprecisió i biaix intraserials emprant materials de control

Es processen 16 vegades, en una única sèrie i en un

mateix dia, els tres materials de control de matriu

plasmàtica. Es calcula la imprecisió intraserial

mitjançant la fórmula:

100·(%)INTRA

INTRAINTRA

x

sCV



on CVINTRA, sINTRA i x INTRA són el coeficient de

variació intraserial, la desviació estàndard intraserial i

la mitjana aritmètica intraserial, respectivament.

Es calcula el biaix intraserial (rel.INTRA) relatiu

utilitzant l’equació:

100·)(

(%)INTRA

rel.INTRA

x

on µ és el valor convencional assignat pel fabricant

del material de control per un procediment i sistema

de mesura de referència (HPLC-MS/MS).

Seguint els criteris de l’EMA (22), els valors del

CVINTRA i rel.INTRA han de ser inferiors o iguals al 15

% i inferiors o iguals al 20 % a concentracions

properes al límit de quantificació.

2.7.3. Estudi de la imprecisió intraserial emprant mostres de pacients

Es realitzen tres barreges de mostres de plasmes de

pacients amb concentracions similars a les dels

materials de control. Les barreges són

homogeneïtzades, aliquotades i emmagatzemades a -

80 ºC fins al moment del seu processament.

Cada una de les barreges de plasmes de pacients es

processa 16 vegades, en una única sèrie i en un

mateix dia, prèvia descongelació i estabilització a

temperatura ambient de les mateixes. Posteriorment,

es calcula la imprecisió intraserial de la mateixa

manera que a l’apartat 2.7.2.

Seguint els criteris de l’EMA (22), els valors de

CVINTRA han de ser inferiors o iguals al 15 % i

inferiors o iguals al 20 % a concentracions properes

al límit de quantificació.

2.7.4. Estudi de la imprecisió i biaix interdiaris emprant materials de control

Es processen 27 vegades, en 27 dies repartits en cinc

mesos, els tres materials de control de matriu

plasmàtica.

Es calculen la mitjana (xINTER), la desviació estàndard

(sINTER) i el coeficient de variació (CVINTER) per

cadascun dels materials de control mitjançant

l’equació:

100·(%)INTER

INTERINTER

x

sCV

Es calcula el biaix interdiari (rel.INTER) relatiu

emprant l’equació:

100·)(

(%)INTER

rel.INTER

x

on µ és el valor convencional assignat pel fabricant

del material de control per un procediment i sistema

de mesura de referència (HPLC-MS/MS).


CVINTER i rel.INTER han de ser inferiors o iguals al 15



2.7.5. Estudi de la imprecisió interdiaària emprant mostres de pacients

Les mateixes barreges preparades a l’apartat 2.7.3 es

processen 27 vegades, en 27 dies repartits en cinc

mesos. Es calcula la imprecisió interdiària de la

mateixa manera que a l’apartat 2.7.4.


CVINTER i rel.INTER han de ser inferiors o iguals al 15



2.7.6. Estudi d’intercanviabilitat de les imprecisions emprant materials de control i mostres de pacients

Es porta a terme un estudi d’intercanviabilitat de les

imprecisions emprant materials de control i mostres



de pacients mitjançant la prova paramètrica

d’homogeneïtat de variàncies de F de Snedecor, amb

un nivell de significació estadística de 0,05 (24),

utilitzant el programa estadístic Analyse-it® Method

Evaluation Edition versió 2.14 d'Analyse-it Software

Ltd. (Leeds, Regne Unit).

Es considera que existeix intercanviabilitat entre els

diferents valors d’imprecisió quan no existeixen

diferències estadísticament significatives (P > 0,05)

entre les variàncies obtingudes emprant materials de

control i barreges de sang.

2.7.7. Estudi de l’error de mesura

S’estima l’error de mesura utilitzant tres materials de

control de matriu plasmàtica que pertanyen al

Programa Internacional d’Avaluació Externa de la

Qualitat (IPTS) de l’empresa Servei d'Avaluació

Externa de la Qualitat del Regne Unit (UK-

NEQAS).

Els materials de control es processen, aleatòriament i

en dies diferents. Es calcula l’error de mesura relatiu

(erel.) mitjançant l’equació (21, 25):

100·

)(.

xerel

on x és el valor mesurat obtingut i µ, el valor

convencional. Com a valors de µ s’utilitzen, per

ordre de preferència:

el valor assignat mitjançant un procediment i

sistema de mesura primari (pesada), o

en el seu defecte, la mitjana dels valors mesurats

en el material de control pels laboratoris

participants en el programa d’avaluació externa

de la qualitat que utilitzen un procediment i

sistema de mesura de referència (HPLC/MS o

HPLC-MS/MS).

Seguint els criteris establerts al nostre laboratori

(requisits metrològics per a l’error de mesura relatiu),

els valors d’erel. han de ser inferiors o iguals a ± 30 %.

2.7.8. Estudi de la capacitat de detecció

Per a l’estudi de la capacitat de detecció es calcula el

valor crític, el límit de detecció i el límit de

quantificació (15, 16, 18, 19). Es realitza una barreja

de mostres de pacients que no han ingerit

micofenolat (material de blanc). La barreja és

homogeneïtzada, aliquotada i emmagatzemada a -80

ºC fins al moment del seu processament. Aquesta

barreja es processa 15 vegades, en 15 dies repartits en

cinc mesos.

Es calculen el valor crític (Lc) i el límit de detecció

(LD) com segueix::

LC = t 1-, r · s0 ; LC = 1,761 · s0

LD = 2·t 1-, r · s0 ; LD = 3,522 · s0

on t1-, r és l’àrea (1-) d’una distribució de t-Student

(al nostre cas 1- = 0,95, r = 14 i l’àrea = 1,761) i s0,

és la desviació estàndard del sistema de mesura

obtinguda en la barreja del material de blanc.

Per altra banda, es calcula el límit de quantificació

(LQ) com:

100·0

y

sLQ

on y és el valor, en percentatge, d’imprecisió

interdiària considerada com a acceptable. Seguint les

recomanacions de l’EMA (22), aquest valor de y és

20 %.

2.7.9. Estudi de l’interval de mesura (linealitat)

Seguint les guies de l’EMA (22) i del CLSI EP6-A

(20), per a l’estudi de l’interval de mesura, es realitzen

tres dilucions seriades (proporcions 3:1; 2:2 i 2:3) a



partir d’un material de blanc al qual se li ha afegit una

quantitat de micofenolat determinada fins aconseguir

una solució plasmàtica del fàrmac de 15 mg/L

(material d’alt valor). Com a diluent per fer les

distintes solucions, s’utilitza el material de blanc.

Es processen, aleatòriament, per quadruplicat i en un

únic dia, les tres solucions així com els materials de

blanc i d’alt valor (proporcions 4:0 i 0:4,

respectivament). Seguint els criteris de l’EMA (22) es

comprova que, per a cada una de les solucions i per

als dos materials, els valors de les imprecisions i

biaixos obtinguts són inferiors o iguals a 15 %.

Posteriorment, es representen gràficament els valors

mesurats obtinguts de les diferents dissolucions i

calibradors (eix Y) enfront als valors teòrics esperats

(eix X) i es duu a terme un ajust mitjançant una

regressió lineal de mínims quadrats ponderats. Es

considera que els intervals de mesura són lineals si

els coeficients de determinació (r2) són superiors a

0,99 (18, 19).

2.7.10. Estudi de la contaminació per arrossegament o residiualitat

Per a l’estudi de la contaminació per arrossegament o

residualitat es processa, en una mateixa sèrie i en un

únic dia, el material de blanc (L) i el material d’alt

valor (H) preparats a l’apartat 2.7.9 seguint l’ordre

següent: H1, H2, H3, L1, L2 i L3.

Es calcula la contaminació per arrossegament o

residualitat mitjançant l’equació següent:

100·(%)ent Arrossegam13

31

LH

LL

Es considera que no existeix contaminació per

arrossegament o residualitat si el valor obtingut és

inferior o igual a 5 % (23, 24).

2.7.11. Estudi de la recuperació

Aquest estudi es realitza seguint el procediment

emprat per Matuszewski et al. (26) a una concentració

de 0,5, 2,5 i 7,5 mg/L de micofenolat. S'empren dos

grups de mostres: un grup compost per vuit mostres

de plasma de pacients que no han ingerit el fàrmac

en estudi i a les que se'ls afegeix micofenolat després

del procés d'extracció (Mostres A); i l’altre grup amb

les mateixes vuit mostres a les quals se'ls afegeix

micofenolat abans del procés d'extracció (Mostres

B). Emprant les àrees dels pics cromatogràfics

obtingudes després de processar totes aquestes

mostres, la recuperació es calcula com:

100`·

A Mostres Àrees Mitjana

B Mostre Àrees Mitjana(%) óRecuperaci

Per altra banda, es calcula el coeficient de variació

obtingut després de processar les mostres B per tal

d’estimar la variabilitat entre les diferents mostres de

plasma utilitzades. El valor del coeficient de variació

ha de ser inferior al 15 %, tal i com indica l’EMA

(22).

2.7.12. Estudi d’intercanviabilitat entre sistemes de mesura

Per a l’estudi de la intercanviabilitat es processen,

durant cinc mesos, 126 mostres de pacients que han

estat sotmesos a un trasplantament renal, hepàtic o

cardíac, amb valors representatius de tot l'interval de

mesura, pel sistema de mesura en estudi i per un

sistema que empra l'equip de reactius EMIT®

Mycophenolic Acid (Siemens Healthcare

Diagnostics, Erlangen, Alemanya) adaptat a

l'analitzador Cobas Mira® (Roche Diagnostics, Basel,

Suïssa). Posteriorment, es porta a terme un estudi

dels possibles valors aberrants individuals emprant la

prova paramètrica de Grubbs (27) i la prova

paramètrica de Bland-Altman (28) per als possibles



valors aberrants per parelles. Seguidament, es realitza

una regressió no paramètrica de Passing i Bablok (29,

30) dels valors mesurats obtinguts, emprant el

programa estadístic Analyse-it® Method Evaluation

Edition versió 2.14 (Analyse-it Software, Ltd., Leeds,

Regne Unit).

3. Resultats

En les condicions cromatogràfiques descrites en

aquest estudi, el temps de retenció per al micofenolat

i el seu estàndard intern és 1,03 minuts i 1,27 minuts,

respectivament (Figura 1).

El temps d’anàlisis (interval que transcorre entre dos

injeccions consecutives) és 3,0 minuts. El temps de

processament per a 50 mostres, incloent el temps

necessari per a la seva preparació, és 2,5 hores.

Els valors d'imprecisió intraserial, imprecisió

interdiària i biaix relatiu es mostren a la Taula 1. El

sistema de mesura avaluat presenta imprecisions i

biaixos relatius inferiors als requisits establerts per

l’EMA (15 %). Per altra banda, s’observen

diferències estadísticament significatives (P < 0,05)

entre les variàncies intraserials i interdiàries

obtingudes utilitzant materials de control i barreges

de plasmes (Taula 2 i 3).

Els errors de mesura obtinguts poden visualitzar-se a

la Taula 4 observant-se que, en cap cas, se supera el

requisit metrològic establert al nostre laboratori (30

%).

El valor crític i els límits de detecció i quantificació

són, respectivament, 0,02, 0,03 i 0,05 mg/L. Per altra

banda, l’interval de mesura és lineal entre (0,05–16,0)

mg/L (r2=0,999).

El percentatge d’arrossegament obtingut és 0,2 % i

per tant, es pot considerar que no existeix

contaminació per arrossegament o residualitat.

Els valors de recuperació són 97,3 % a una

concentració de micofenolat de 0,5 mg/L, 99,4 % a

2,5 mg/L i 99,0 a 7,5 mg/L. Els coeficients de

variació intermostrals són 5,9 %, 2,8 % i 3,5 % a una

concentració de micofenolat de 0,5 mg/L, 2,5 mg/L

i 7,5 mg/L, respectivament.

Els valors mesurats obtinguts mitjançant ambdós

sistemes de mesura no són intercanviables, existeix

un biaix proporcional i constant. Els paràmetres a

(ordenada a l’origen) i b (pendent) de la recta de

regressió (Figura 2), així com els respectius intervals

de confiança obtinguts amb una significació

estadística de 0,05 (valors entre parèntesi) són a =

0,33 (0,19 – 0,45) i b = 1,17 (1,10 – 1,24).



Taula 1. Imprecisions i biaixos intraserials i interdiaris emprant materials de control per al sistema de mesura Acquity UPLC®-UV® per a la concentració de micofenolat en el plasma.

Magnitud

xINTRA (mg/L)

nINTRA

Biaix relatiu intraserial

µ rINTRA (mg/L) (%)

Imprecisió intraserial

sINTRA CVINTRA (mg/L) (%)

xINTER (mg/L)

nINTER

Biaix relatiu

interdiari

µ rINTER (mg/L) (%)

Imprecisió interdiària

sINTER CVINTER (mg/L) (%)

Pla—Micofenolat; c.massa

0,41

2,33

4,84

16

16

16

0,46 -12,4

2,35 -1,0

4,72 2,5

0,017 4,3

0,017 0,7

0,044 0,9

0,47

2,35

4,72

27

27

27

0,46 -2,0

2,35 0,1

4,72 0,0

0,040 8,5

0,097 4,1

0,249 5,3

xINTRA, mitjana intraserial; nINTRA, nombre de materials de control processats en una mateixa sèrie; µ, valor convencional (assignat com la mitjana obtinguda per diferents laboratoris de

referència que empren sistemes de mesura de referència (HPLC-MS/MS); rINTRA, biaix relatiu intraserial; sINTRA, desviació estàndard intraserial; CVINTRA, coeficient de variació intraserial;

xINTER, mitjana interdiària; nINTER, nombre de materials de control processats en dies diferents; rINTER, biaix relatiu interdiari; sINTRA, desviació estàndard interdiària; CVINTER, coeficient de variació interdiari.

Seguint les recomanacions de la IUPAC i la IFCC (23): c.massa, concentració de massa; Pla, Plasma..



Figura 1. Cromatograma obtingut després de processar una mostra de plasma de pacient a una concentració de 2,05 mg/L.

AU, unitats d’absorbància, IS, estàndard intern.

Taula 2. Intercanviabilitat entre els valors d’imprecisió intraserial utilitzant materials de control i barreges de plasmes de pacients.

Magnitud

xINTRA (µg/L)

nINTRA

Imprecisió

intraserial emprant materials de control

sINTRA CVINTRA (µg/L) (%)

xINTRA (µg/L)

nINTRA

Imprecisió

intraserial emprant mostres de pacients


P (α=0,05)


0,41

2,33

4,84

16

16

16

0,017 4,3

0,017 0,7

0,044 0,9

0,54

2,52

4,99

16

16

16

0,028 5,2

0,073 2,9

0,150 3,0

0,0339

<0,0001

<0,0001

xINTRA, mitjana intraserial; nINTRA, nombre de materials de control processats en una mateixa sèrie; sINTRA, desviació estàndard intraserial; CVINTRA, coeficient de variació intraserial; P (α=0,05), probabilitat obtinguda en la prova paramètrica d’homogeneitat de variàncies de F de Snedecor amb un nivell de significació estadística de 0,05.

Seguint les recomanacions de la IUPAC i la IFCC (23): c.massa, concentració de massa; Pla, Plasma.



Taula 3. Intercanviabilitat entre els valors d’imprecisió interdiària utilitzant materials de control i barreges de plasmes de pacients.

Magnitud

xINTRA (µg/L)

nINTRA

Imprecisió

interdiària emprant materials de control


xINTRA (µg/L)

nINTRA

Imprecisió

interdiària emprant mostres de pacients


P (α=0,05)


0,47

2,35

4,72

27

27

27

0,040 8,5

0,097 4,1

0,249 5,3

0,61

2,46

5,07

27

27

27

0,061 10,0

0,142 5,8

0,352 6,9

0,0188

0,0276

0,0408

xINTRA, mitjana intraserial; nINTRA, nombre de materials de control processats en una mateixa sèrie; sINTRA, desviació estàndard intraserial; CVINTRA, coeficient de variació intraserial; P (α=0,05), probabilitat obtinguda en la prova paramètrica d’homogeneitat de variàncies de F de Snedecor amb un nivell de significació estadística de 0,05.


Taula 4. Errors de mesura relatius per al sistema de mesura Acquity UPLC®-UV® per a la concentració de micofenolat en el plasma del programa d’avaluació externa de la qualitat IPTS d'UK-NEQAS.

Magnitud Cicle de control /

Mostra x

(mg/L) µ (N)

(mg/L) erel. (%)


56/A 56/B

57/A 57/B

60/A 60/B

8,0 2,1

3,3 3,0

5,1

10,4

8,0 (-) 2,1 (42)

3,0 (-) 3,0 (-)

5,0 (-)

10,0 (-)

0,0 0,0

10,0

0,0

2,0 4,0

x, valor mesurat de control; µ, valor convencional: l’assignat mitjançant un procediment de mesura primari (pesada) o, en el seu defecte, la mitjana dels valors mesurats en el material de control pels laboratoris participants en el programa d’avaluació externa de la qualitat que utilitzen un sistema de mesura de referència (HPLC-MS/MS o HPLC-MS); N, nombre de valors mesurats que corresponen als laboratoris participants en el programa; emrel., error de mesura relatiu.




Figura 2. Recta de regressió dels valors mesurats de micofenolat obtinguts mitjançant el sistema de mesura Acquity UPLC®-UV® i un sistema que empra l'equip de reactius EMIT® Mycophenolic Acid adaptat a l'analitzador Cobas Mira®.

Scatter Plot with Passing & Bablok Fit

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10

Mico UPLC-UV (mg/L)

Mic

o E

MIT

(m

g/L

)

Identity

Passing & Bablok (I) f it

(0.33 + 1.17x)

4. Discussió i conclusions

En la majoria de laboratoris clínics la concentració de

micofenolat en el plasma es mesura mitjançant

sistemes basats en principis d’immunoanàlisis tot i

sabent que presenten una sèrie de limitacions

àmpliament conegudes (interferències relacionades

amb el traçador i els anticossos, interferències

analítiques, existència de reactivitat creuada deguda a

la manca d’especificitat de l’anticòs, entre d’altres).

Les millores metrològiques que comporta la

utilització de sistemes basats en la HPLC-UV

respecte als que empren les immunoanàlisis com a

principi de mesura, i la importància que suposen

aquestes millores en la monitorització

farmacoterapèutica del tractament d’aquest fàrmac

immunosupressor en pacients trasplantats, ens va

conduir a validar un sistema de mesura (Acquity

UPLC® UV®) que empra la UPLC-UV per al

mesurament de la concentració de micofenolat en el

plasma.

El procediment de mesura utilitzat, per al

mesurament de la concentració de micofenolat en el

plasma, en aquest treball està basat en les

recomanacions del fabricant de l’equip de reactius.

Tot i així, degut a que es fa servir un cromatògraf

líquid d’alta i ràpida eficàcia (UPLC) enlloc d’un

d’alta eficàcia (HPLC) i per tal d’aprofitar els



avantatges que comporta la utilització del primer —

proporciona una major resolució i eficàcia

cromatogràfiques en un menor temps permetent

escurçar els temps de retenció— les condicions

cromatogràfiques emprades varien respecte a les

recomanades pel fabricant de l’equip de reactius, fet

que ens va conduir a realitzar un estudi de validació i

no de verificació tal i com recomana l’Associació

Catalana de Ciències de Laboratori Clínic (31).

En referència a l'estudi de les propietats

metrològiques, el sistema de mesura presenta un

ampli interval de linealitat així com imprecisions,

biaixos, errors de mesura i un límit de detecció i

quantificació acceptables per al nostre laboratori.

Per altra banda, els valors d’imprecisió obtinguts

emprant materials de control i mostres de pacients

no són intercanviables. Aquest fet s’ha de tenir en

compte per a l’estimació de la incertesa d’un resultat

de mesura i quan es vol interpretar la significació

d’un canvi entre dos resultats de mesura, obtinguts

en dies diferents, d’una mateixa magnitud biològica

(32).

En conclusió, el sistema de mesura Acquity UPLC®

UV® permet mesurar la concentració de micofenolat

en el plasma amb una preparació mínima de la

mostra i utilitzant volums reduïts de mostra. Aquest

sistema de mesura és una millor alternativa als

sistemes basats en mètodes d'immunoanàlisis, i

s'adapta bé a la pràctica hospitalària diària per a la

monitorització farmacoterapèutica del micofenolat

tenint en compte el seu temps d'anàlisi, versatilitat,

flexibilitat i propietats metrològiques tals com

l’exactitud, la precisió, la veracitat, la capacitat de

detecció i l’interval de mesura.

5. Bibliografia

1. Staatz CE, Tett SE. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of mycophenolate in solid organ transplant recipients. Clin Pharmacokinet 2007;46:13-58.

2. Kuypers DRJ, Meur YL, Cantarovich M, Tredger MJ, Tett SE, Cattaneo D et al. Consensus report on therapeutic drug monitoring of mycophenolic acid in solid organ transplantation. Clin J Am Soc Nephrol 2010;5:341-58.

3. Tsina I, Chu F, Hama K, Kaloostian M, Tam YL, Tarnowski T, Wong B. Manual and automated(robotic) high-performance liquid chromatograph methods for the determination of mycophenolicacid and its glucuronide conjugate in human plasma. J Chromatogr B 1996;675:119-29.

4. Jones CE, Taylor PJ, Johnson AG. High-performance liquid chromatography determination of mycophenolic acid and glucuronide metabolite in human plasma. J Chromatogr B 1998;708:229-34.

5. Shipkova M, Niedmann PD, Armstrong VW, Schütz E, Wieland E, Shaw LM et al. Simultaneous determination of mycophenolic acid and its glucuronide in human plasma using a simple high-performance liquid chromatography procedure. Clin Chem 1998;44:1481-8.

6. Streit M, Shipkova M, Armstrong VW, Oellerich M. Validation of a rapid and sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for free and total mycophenolic acid. Clin Chem 2004;50:152-9.

7. Khoschsorur G, Erwa W. Liquid chromatographic method for simultaneous determination of mycophenolic acid and its phenol- and acylglucuronide metabolite in plasma. J Chromatogr B 2004;799:355-60.

8. Watson DG, Araya FG, Galloway PJ, Beattie TJ. Development of a high pressure liquid chromatography method for the determination of mycophenolic acid and its glucuronide metabolite in small volumes of plasma from paediatric patients. J Pharm Biomed Anal 2004;35:87-92.

9. Barzoki MA, Rouini MM, Gholami K, Lessan-Pezeshki M, Rezaee S. Determination of mycophenolic acid in human plasma by high-performance liquid chromatography. DARU 2005;13:120-6.

10. Westley IS, Sallustio BC, Morris RG. Validation of a high-performance liquid chromatography method for the measurement of mycophenolic acid and its



glucuronide metabolites in plasma. Clin Biochem 2005;38:824-9.

11. Musuamba FT, Di Fazio V, Vanbinst R, Wallemacq P. A fast ultra-performance liquid chromatography method for simultaneous quantification of mycophenolic acid and its phenol- and acyl-glucuronides in human plasma. Ther Drug Monit 2009;31:110-5.

12. Figurski MJ, Korecka M, Fields L, Waligórska T, Shaw LM. High-performance liquid chromatography–mass spectroscopy/mass spectroscopy method for simultaneous quantification of total or free fraction of mycophenolic acid and its glucuronide metabolites. Ther Drug Monit 2009;31:717-26.

13. Delavenne X, Juthier L, Pons B, Mariat C, Basset T. UPLC MS/MS method for quantification of mycophenolic acid and metabolites in human plasma: Application to pharmacokinetic study. Clin Chim Acta 2011:412:59-65.

14. Kunithala VK, Chinthakindi KK, Vemula SK, Garepally P, Bontha VK. A new rapid and simple analytical method development and validation of estimation the mycophenolate in dosage form by UPLC technique. Asian J Pharm Clin Res 2012;5:233-7.

15. Internacional Union of Pure and Applied Chemistry. Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities. Pure Appl Chem 1995;67:1699-723.

16. International Organization for Standardization, Capability of detection. Part 1: Terms and definitions. ISO-11843-1. Ginebra: ISO; 1997.

17. International Bureau of Weights and Measures, International Electrotechnical Commission, International Laboratory Accreditation Cooperation, International Organization for Standardization, International Organization of Legal Metrology, International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, International Union of Pure and Applied Chemistry, International Union of Pure and Applied Physics, International vocabulary of metrology. Basic and general concepts and associated terms (VIM). ISO/IEC Guide 99. Ginebra, 2008.

18. International Organization for Standardization, Internacional Union of Pure and Applied Chemistry, Association of Analytical Communities, International Symposium on the Harmonisation of Quality Assurance Systems in Chemical Laboratory. Harmonised guidelines for the in-house validation of methods of analysis. Budapest; 2005.<

<http://old.iupac.org/divisions/V/501/draftoct19.pdf> (accés: 2013-06-19).

19. Internacional Union of Pure and Applied Chemistry. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl Chem 2002;74:835-55.

20. Clinical and Laboratory Standard Institute. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach; approved guideline. EP6-A. Wayne: CLSI; 2003.

21. Internacional Union of Pure and Applied Chemistry, The international harmonized protocol for proficiency testing of analytical chemistry laboratories. Pure Appl Chem 2006;78:145-96.

22. Committee for Medicinal Products for Human Use. Guideline on validation of bioanalytical methods. Londres: European Medicines Agency; 2009. <http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf.> (accés: 2013-06-19).

23. International Union of Pure and Applied Chemistry, International Federation of Clinical Chemistry. Properties and units in the clinical laboratory sciences. Part X. Properties and units in general clinical chemistry. Pure Appl Chem 2000;72:747-972.

24. Xavier Fuentes-Arderiu, Bernardino González-de-la-Presa. Interchangeability of estimates of day-to-day imprecision between commercial control materials ans serum pools. Clin Chem 2002;48:573-4.

25. Fuentes Arderiu X, Castiñeiras Lacambra MJ, Queraltó Compañó JM. Bioquímica clínica y Patología Molecular. Barcelona: Reverté; 1998.

26. Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Anal Chem 2003;75:3019-30.

27. Barnett V, Lewis T. Outliers in Statistical Data. Nova York: Wiley; 1994.

28. Altman DG. Practical statistics for medical research. Londres: Chapman and Hall; 1991.

29. Passing H, Bablok WA. New biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:709-20.

30. Passing H, Bablok WA. General regression procedure for method transformation. J Clin Chem Clin Biochem 1988;26:783-90.

http://old.iupac.org/divisions/V/501/draftoct19.pdf

http://old.iupac.org/divisions/V/501/draftoct19.pdf

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf






31. Miró Balagué J, Fuentes Arderiu X, Jardi Baiges A, Martínez Casademont M, Pastor Ferrer C, Pérez Remón, et al. Guia per a la verificació dels sistemes de mesura de magnituds biològiques per a l'acreditació segons la norma ISO 15189. In vitro veritas 2009;10: <http://www.acclc.cat/continguts/ivv113.pdf> (accés: 2013-06-19).

32. Harris EK, Yasaka T. On the calculation of a ―reference change‖ for comparing two consecutive measurements. Clin Chem 1983;29:25-30.



__________________________________________________________________________________________

L’espectrometria de masses com a principi de mesura:

fonaments i aplicació en les ciències de laboratori clínic

Raül Rigo Bonnin


_________________________________________________________________________________________

ÍNDEX

1. Introducció

2. Vocabulari

3. Espectrometria de masses

3.1 Fonaments

3.2 Instrumentació

3.2.1 Sistemes d’entrada de la mostra

3.2.1.1. Sistemes d’entrada per sonda directa

3.2.1.2. Sistemes d’entrada cromatogràfics

3.2.2 Sistemes d’ionització de la mostra

3.2.2.1. Sistemes d’ionització de bombardeig amb àtoms ràpids

3.2.2.2. Sistemes d’ionització-desorció amb làser assistida per una matriu

3.2.2.3. Sistemes d’ionització a pressió atmosfèrica

3.2.3 Sistemes de buit

3.2.4 Analitzadors de masses

3.2.4.1 Analitzadors de masses de quadrupol

3.2.4.2 Analitzador de masses de trampa iònica

3.2.4.3 Analitzadors de masses de temps de vol

3.2.4.4 Analitzadors de masses de transformada de Fourier-ressonància iònica

ciclotrònica

3.2.4.5 Analitzadors de masses de sector magnètic

3.2.5 Sistemes de detecció

3.2.5.1 Detectors de copa de Faraday

3.2.5.2 Multiplicadors d’electrons secundaris

3.2.5.3 Detectors tipus Channeltron


ISSN: 1697-5421

Revisió



3.2.5.4 Detectors de conversió fotònica o de centelleig

3.2.5.5 Detectors multicanal

3.2.6 Espectrometria de masses en tàndem

4. Aplicacions de l’espectrometria de masses en les ciències de laboratori clínic

4.1 Aplicacions de l’espectrometria de masses mitjançant la utilització d’isòtops estables com a

traçadors metabòlics o estàndards interns

4.1.1 Espectrometria de masses de relació isotòpica

4.1.2 Espectrometria de masses de dilució isotòpica

4.2 Exemples d’aplicacions de l’espectrometria de masses en les ciències de laboratori clínic

5. Bibliografia

1. INTRODUCCIÓ

L'espectrometria de masses va tenir el seu origen en

els experiments desenvolupats pel físic anglès Joseph

John Thomson el 1897. Thomson va descobrir que

en aplicar descàrregues elèctriques sobre un gas es

produïen ions i que aquests podien adoptar distintes

trajectòries parabòliques d’acord amb la seva massa

quan es feien passar a través d’un camp

electromagnètic. Thomson va realitzar la construcció

del primer espectròmetre de masses, anomenat

paràbola espectrogràfica, per a la mesura de la relació

massa/càrrega d’ions. Anys més tard, un dels

estudiants de Thomson, en Francis William Aston el

1919, va ser qui va dissenyar diversos espectròmetres

de masses en els quals els ions eren dispersats per les

seves masses i enfocats d'acord a la seva velocitat. A

la dècada dels anys 20, Arthur J. Dempster, va

desenvolupar un analitzador de masses magnètic que

enfocava els ions generats per impacte electrònic

sobre un col·lector elèctric. Aquest disseny va ser

adaptat per Josef Mattauch, Richard Herzog,

Kenneth Bainbridge, Alfred Nier i altres, permetent

importants descobriments en física atòmica i nuclear

en els anys 30. Durant els anys 30 i 40, Alfred Nier

va incorporar les tecnologies de buit i d’electrònica

per millorar l'acompliment dels primers dissenys

d'espectròmetres de masses. Aquests instruments

van ser originalment desenvolupats amb el propòsit

de mesurar de forma precisa els pesos atòmics dels

elements i els seus isòtops. Tot i això, no va ser fins a

finals dels anys 40 quan es varen construir els

primers espectròmetres de masses disponibles

comercialment (1). Amb el temps, es varen anant

desenvolupant diferents analitzadors de masses com

ara l’analitzador de temps de vol a l’any 1948,

l’analitzador de quadrupol el 1953, l’analitzador de

trampa iònica el 1956 i l’analitzador de transformada

de Fourier-ressonància iònica ciclotrònica el 1974.

Als anys 80, es varen desenvolupar els sistemes

d’ionització capaços d’ionitzar molècules biològiques

com la ionització mitjançant el bombardeig amb

àtoms ràpids, la ionització mitjançant electroesprai i

la ionització-desorció amb làser assistida per una

matriu amb àtoms ràpids (1).

Els sistemes de mesura que empren l’espectrometria

de masses com a principi de mesura són els més

versàtils, robusts, específics i selectius que han

aparegut als darrers 30 anys en el camp de les

ciències de laboratori clínic. Tot i que presenten com

a principals inconvenients certa complexitat de

maneig i interpretació de resultats, la seva elevada

capacitat per poder separar, aïllar, identificar i

quantificar diversos components d’una mostra així

com el desenvolupament de sistemes d’entrada de



mostres a pressió atmosfèrica, entre els mètodes

cromatogràfics i l’espectrometria de masses, n’han

facilitat la seva incorporació en els laboratoris clínics.

(2).

Aquesta revisió pretén donar a conèixer els

fonaments bàsics de l’espectrometria de masses, així

com enumerar les seves aplicacions dins de l’àmbit

de les ciències de laboratori clínic.

2. VOCABULARI

En aquest document són aplicables, entre altres, els

termes relacionats amb l’espectrometria de masses o

químics de la Federació Internacional de Química

Pura i Aplicada (d'ara endavant, IUPAC) (3, 4):

ànode: elèctrode on té lloc un procés d’oxidació

càtode: elèctrode on té lloc el procés de reducció

col·lector: substància sòlida que s’afegeix o es forma

en una solució per recollir un micro o

macrocomponent

derivatització: procediment emprat en química que

transforma un compost químic en un altre

d’estructura química similar

desorció: disminució de la quantitat de substància

adsorbida

dínode: ànode que es troba en un multiplicador

d’electrons o fotomultiplicador

dissociació: separació d'una entitat molecular en

dues o més entitats moleculars (o qualsevol separació

similar dins d'una entitat molecular poliatòmica), per

exemple, la separació dels components d'un parell

d'ions en ions lliures.

dissociació induïda per col·lisió: dissociació d’un

ió després de la seva excitació per col·lisió

efluent : fase mòbil que surt de la columna

cromatogràfica

espectre de masses: representació de les

abundàncies relatives d’un feix d’ions enfront de la

seva relació massa/càrrega

espectròmetre de masses: instrument que permet

mesurar les abundàncies i relacions massa/càrrega

dels ions en fase gasosa

espectrometria de masses: estudi de la matèria a

través de la formació d’ions en fase gasosa que són

caracteritzats, mitjançant un espectròmetre de

masses, segons la seva massa, càrrega, estructura o

propietats fisicoquímiques

espectrometria de masses de dilució isotòpica:

mètode quantitatiu d’espectrometria de masses en

què un compost isotòpicament enriquit s’utilitza com

a estàndard intern

espectrometria de masses de relació isotòpica:

mesurament i estudi de les abundàncies relatives dels

diferents isòtops d'un element en un material

determinat mitjançant la utilització d’un

espectròmetre de masses

estàndard intern: compost que s’afegeix en una

mostra a una quantitat coneguda i que permet

mesurar la concentració d’un component de la

mostra. L’estàndard intern és un compost

químicament similar al component d’interès de la

mostra pel què les possibles pèrdues que es puguin

produir en el procediment de mesura són les

mateixes per ambdós i per tant, la mesura de la

concentració del component pot ser calculada en

relació a la de l’estàndard intern.

espín: propietat física de les partícules subatòmiques

que correspon al moment angular degut a la seva

rotació sobre el seu propi eix

fase mòbil: fluid que penetra a través o al llarg del

llit cromatogràfic en una direcció determinada

fosforescència: luminescència de llarga durada

imatge de corrent: corrent que resulta de la càrrega

d’un ió com a conseqüència del seu moviment

coherent en passar a prop d'un conductor

interfície de cinta mòbil: interfície d'un

espectròmetre de masses per a mostres líquides que

utilitza dues o més politges i un bucle continu. Les

mostres són polvoritzades i dipositades sobre una

cinta on són transportades al sistema de buit per a la

seva vaporització, desorció i ionització

interfície de feix de partícules: interfície emprada

per acoblar un cromatògraf líquid amb un



espectròmetre de masses en què es fa passar l'efluent

a través d'un capil·lar escalfat per formar un feix

d'expansió de vapor i partícules d'aerosol.

Posteriorment, el feix de partícules format es fa

incidir sobre una superfície escalfada per formar ions

mitjançant una ionització química

interfície de termoesprai o termonebulització:

interfície emprada per acoblar un cromatògraf líquid

amb un espectròmetre de masses en què l'efluent es

fa fluir a través d'un capil·lar escalfat per produir una

polvorització de gotetes i la vaporització del

dissolvent. Els ions es formen a causa del

desequilibri de les càrregues de les gotetes o

mitjançant un filament calent

introducció directa de líquid: introducció directa

d’una mostra líquida en una font d’ions d’ionització

química d’un espectròmetre de masses emprant una

lenta taxa de flux de dissolvent

ió precursor: ió que reacciona per formar ions

producte o que pateix pèrdues neutres de massa

específiques

NOTA: La reacció originada pot ser deguda a

una dissociació unimolecular, una reacció ió-

molècula o un canvi en l’estat de la càrrega com

a conseqüència d’una isometrització

ió producte: ió format com el producte d’una

reacció que implica un ió precursor en particular

NOTA: La reacció originada pot ser deguda a

una dissociació unimolecular, una reacció ió-

molècula o un canvi en l’estat de la càrrega com

a conseqüència d’una isometrització

ionització dura: formació d’ions en fase gasosa

acompanyada d’una elevada fragmentació

ionització per desorció: formació d'ions en fase

gasosa a partir d'una superfície sòlida o líquida d’una

mostra després de la seva activació per calor, per un

fort camp elèctric, per partícules o per un

bombardeig amb protons

ionització química: formació d'un nou ió en la fase

gasosa per la reacció d'un compost neutre amb un ió

NOTA: El procés pot implicar la transferència

d'un electró, d’un protó, o d’altres espècies

carregades entre els reactants.

ionització suau: formació d’ions en fase gasosa

sense que es presenti una fragmentació elevada

isòmer: una de diverses espècies (o entitats

moleculars) que tenen la mateixa composició atòmica

(fórmula molecular), però diferent fórmula empírica

o fórmula estereoquímica i per tant, presenten

distintes propietats físiques o químiques

isomerització: reacció química on el producte

principal de la reacció és isòmer amb el reactiu

principal

isòtop: núclid que presenta el mateix nombre atòmic

però diferent nombre màssic

luminiscència: emissió espontània de radiació d'una

espècie electrònicament o vibratòriament excitada

degut a que no es troba en equilibri tèrmic amb el

seu entorn

nombre atòmic: nombre de protons que presenta el

nucli d’un àtom

nombre màssic: nombre total de partícules pesades

(neutrons i protons) que presenta el nucli d’un àtom

nebulització: dispersió d’un líquid sobre un gas a

partir de la formació de partícules líquides molt

petites que romanen barrejades en suspensió amb el

gas

núclid: espècie d'àtom, que es caracteritza pel seu

nombre màssic, nombre atòmic i estat d’energia

nuclear, amb la característica que la seva vida mitjana

en aquest estat energètic és prou llarg com per a ser

observable

polaritat (química) : propietat d’un enllaç químic,

un àtom o una molècula per la qual existeix una

separació estable entre les càrregues positives i

negatives

reflectró: component d'un espectròmetre de masses

de temps de vol que utilitza un camp elèctric estàtic

per invertir la direcció de desplaçament dels ions i

millora la resolució de massa, assegurant que els ions

amb una mateixa relació massa/càrrega però amb

diferent energia de translació arriben al detector en el

mateix temps



3. ESPECTROMETRIA DE MASSES

3.1 Fonaments

L’espectrometria de masses o MS (acrònim de

l’anglès mass spectrometry) és un principi de mesura que

permet, a partir del mesurament de magnituds

bàsiques com la càrrega i la massa, separar, aïllar,

identificar i quantificar de manera inequívoca els

diferents components d’una mostra en funció de les

interaccions químiques existents entre les substàncies

que la composen (5).

Fonamentalment, l'espectrometria de masses es basa

en l'obtenció d’ions a partir de molècules en fase

gasosa que són posteriorment separats segons la seva

massa i la seva càrrega, i finalment detectats

mitjançant un dispositiu adequat. Un espectre de

masses serà, en conseqüència, una informació

bidimensional on es representa l'abundància dels

diferents tipus d'ions en funció de la relació

massa/càrrega de cada un d'ells (1, 5).

L’espectrometria de masses té molt poc en comú

amb altres principis de mesura espectromètrics, ja

que, en sentit estricte, no ho és. Des d’un punt de

vista físic, un espectre aporta una informació

bidimensional que representa i relaciona un fenomen

com l'emissió o absorció d'una radiació amb l'energia

d'aquesta radiació. En l'espectrometria de masses, no

s'utilitza cap tipus de radiació, de manera que

bàsicament, no pot ser considerada com un principi

espectromètric. Una altra diferència essencial que

presenta l'espectrometria de masses amb les

espectrometries clàssiques (per exemple, d’absorció o

d’emissió molecular) és que en aquestes últimes, els

fenòmens són purament físics, no destructius, de

manera que la mostra utilitzada per a l'obtenció de

l'espectre no es modifica químicament i, per tant, es

pot tornar a recuperar. Per contra, en

l'espectrometria de masses, durant l'obtenció de

l'espectre tenen lloc fenòmens químics, fent que la

mostra utilitzada es destrueixi i no pugui recuperar-se

(1, 5).

Com ja s'ha esmentat, els fenòmens que tenen lloc en

l’espectrometria de masses són de naturalesa química

i, en conseqüència, la presència i abundància en

l'espectre de determinats tipus d’ions, identificables a

partir de la seva massa, serà funció de l'estructura

química de cada compost. Així, la informació oferta

per un espectre de masses és comparable a

l'obtinguda mitjançant una gran quantitat de

reaccions utilitzades per a la identificació

d'estructures per via química, de manera que

l'espectrometria de masses pot oferir una enorme

quantitat d'informació sobre un compost determinat.

3.2 Instrumentació

Un espectròmetre de masses està format per diversos

components que inclouen un sistema d'entrada de la

mostra, una font d’ionització per ionitzar els

components de la mostra, un sistema de buit per

mantenir pressions molt baixes (entre 10 i 100 Pa),

un o diversos analitzadors de masses per separar els

ions produïts, un detector o comptador d’ions i

finalment, un sistema de processament de dades que

reprodueix l'espectre de masses (Figura 1) (1, 5).

Existeixen diversos sistemes tant d’ionització com

d'analitzadors dels ions que resulten en diferents

tipus d’espectròmetres de masses en funció de les

seves diferents combinacions.



Figura 1. Components d’un espectròmetre de masses.

3.2.1 Sistemes d’entrada de la mostra

La finalitat d’un sistema d'entrada és permetre la

introducció d'una mostra representativa en el sistema

d’ionització amb una mínima pèrdua de buit.

L'elecció del sistema d'entrada de la mostra en

l'espectròmetre de masses dependrà de les propietats

fisicoquímiques dels components que es vulguin

separar, identificar, aïllar i quantificar. Els

espectròmetres de masses més moderns estan

equipats amb dos tipus d'entrades capaços

d'acomodar diversos tipus de mostres, i inclouen els

sistemes d'entrada de sonda directa i els sistemes

d’entrada cromatogràfics (1, 5).

3.2.1.1 Sistemes d’entrada per sonda directa

Els líquids i sòlids no volàtils es poden introduir al

sistema d’ionització mitjançant un suport de mostra

o sonda, el qual s'insereix a través d'una càmera

intermèdia de buit. La càmera intermèdia està

dissenyada per limitar el volum d'aire que pot entrar

al sistema d’ionització durant la inserció de la sonda.

La mostra es posa generalment en la superfície d'un

vidre o en un tub capil·lar d'alumini, un filferro fi o

una copa petita i la sonda es col·loca a uns pocs

mil·límetres de la font d'ionització i d’una l'escletxa

que condueix a l'espectròmetre (1).

3.2.1.2 Sistemes d’entrada cromatogràfics

La combinació de mètodes cromatogràfiques, com la

cromatografia de gasos o la cromatografia líquida

d’alta eficàcia, i l'espectrometria de masses ha estat

sempre un objectiu desitjat al camp de la química

analítica degut a l’elevada especificitat intrínseca i la

capacitat d'anàlisi de mescles complexes que presenta

l’espectrometria de masses en comparació amb altres

sistemes de detecció cromatogràfics com els visible-

ultraviolats, els fluorimètrics o els voltamperomètrics

(electroquímics). El seu principal avantatge sobre

aquests sistemes de detecció és, d'una banda, la seva

capacitat per subministrar informació útil des d’un

punt de vista identificatiu, de manera que l'espectre

de masses es presenta així com una prova gairebé

inequívoca de la identitat del component la

concentració del qual es mesura i, d'altra banda, es

tracta d'un sistema de detecció universal basat en la

separació de substàncies carregades d'acord amb la

seva relació massa/càrrega (5).

Avui dia l'acoblament de l'espectrometria de masses

a la cromatografia de gasos, utilitzada de forma

rutinària en molts laboratoris d'anàlisi, es considera

robusta i amb una utilitat inqüestionable. Aquest fet

és degut a la utilització de l'impacte electrònic com a

sistema d’ionització el qual dóna lloc a una

fragmentació reproduïble dels components d’una

mostra independentment de la instrumentació

utilitzada, possibilitant la creació de llibreries amb

espectres de masses característics per a multitud de

substàncies. No obstant, el principal inconvenient

que presenta la cromatografia de gasos és la dificultat

en l'anàlisi de determinats compostos, com

substàncies poc volàtils, polars o termolàbils, fent

necessària la utilització de laboriosos procediments

de derivatització per dur-les a terme (1, 5, 6).



Aquesta limitació de la cromatografia de gasos va

donar lloc a la investigació sobre les possibilitats que

podria oferir l'acoblament de la cromatografia líquida

d’alta eficàcia a l'espectrometria de masses. La seva

combinació permetria aprofitar els avantatges

d'aquest versàtil mètode de separació amb la gran

especificitat i capacitat identificadora de

l’espectrometria de masses (1, 2, 5, 6). El problema

fonamental que va sorgir en l'acoblament de la

cromatografia líquida d’alta eficàcia i l’espectrometria

de masses va ser l'enorme contrast que hi havia entre

els volums relativament grans de dissolvent de la

primera i els requeriments de buit de l'última. Per

resoldre aquest problema es van desenvolupar

diverses interfícies o sistemes d’entrada de la mostra.

La primera solució per contrarestar aquest problema

va ser publicada per Arpino et al. el 1974 (7). Des de

llavors, s'han descrit en la bibliografia més de 25

interfícies diferents (8), de les quals només unes

poques han tingut aplicació pràctica i han arribat a

ser comercialitzades (1, 5). De les interfícies que es

van utilitzar durant un temps i avui dia estan en

desús, es poden destacar la interfície d’introducció

directa de líquid o DLI (acrònim de l’anglès direct

liquid introduction) i la cinta mòbil o MB (acrònim de

l'anglès moving belt). Les interfícies que s'usen

rutinàriament en l'actualitat per a la introducció i

anàlisi de mostres líquides per espectrometria de

masses poden classificar-se en dos grups: les que

només introdueixen la mostra líquida a la font

d’ionització de l'instrument com ara les de feix de

partícules o PB (acrònim de l’anglès particle beam) i les

que, a més, aconsegueixen la ionització de la mateixa

com les interfícies de termoesprai o

termonebulització o TSP (acrònim de l’anglès

thermospray), de bombardeig amb àtoms ràpids o FAB

(acrònim de l’anglès fast atom bombardment) i

d’ionització a pressió atmosfèrica o API (acrònim de

l’anglès atmospheric-pressure ionization). No obstant això,

han sigut les interfícies d'ionització a pressió

atmosfèrica com l’electroesprai o ESI (acrònim de

l’anglès electrospray) i la ionització química a pressió

atmosfèrica o APCI (acrònim de l’anglès atmospheric-

pressure chemical ionization) les que han donat lloc, en

les últimes dècades, a l'enorme expansió

experimentada per la cromatografia líquida acoblada

a l’espectrometria de masses en multituds de camps

científics, entre els que es troben les ciències de

laboratori clínic. Cal destacar altres sistemes

d’entrada de la mostra que permeten també la seva

ionització com són la ionització-desorció amb làser

assistida per una matriu o MALDI (acrònim de

l’anglès matrix-assited laser desorption-ionitation) i la

ionització-desorció amb làser sobre superfícies

reforçades o SELDI (acrònim de l’anglès surface-

enhanced laser desorption-ionitation) que actualment

presenten una aplicació en el camp de la proteòmica

(1, 5).

3.2.2 Sistemes d’ionització de la mostra

Principalment, els sistemes d’ionització es poden

classificar en sistemes d’ionització o fonts d’ions dures o

suaus. Les fonts dures, com ara les fonts d’impacte

electrònic, comuniquen energies elevades als ions

formats de manera que es troben en estats

vibracionals i rotacionals excitats. La relaxació

d'aquests ions produeix una gran quantitat de

fragmentació dels components de la mostra,

resultant espectres de masses complexos. Per contra,

les fonts suaus, com ara les fonts d'ionització

química i les de desorció, com la ionització a pressió

atmosfèrica, produeixen relativament poca excitació

dels ions, de manera que, té lloc poca fragmentació, i

els espectres de masses són més senzills. Els



espectres senzills produïts com a conseqüència de les

fonts suaus permeten la mesura exacta de la massa

molar dels components d’una mostra, mentre que els

models espectrals més complexos de les fonts dures

sovint permeten una identificació inequívoca

d'aquest (1).

Per altra banda, quan el sistema d'entrada de la

mostra és un cromatògraf de gasos, la mostra es

troba en un estat vaporitzat o gasós i l'única funció

de la font d'ionització és ionitzar les molècules

neutres (és a dir, conferir càrrega) mitjançant

l’aplicació d’energia. En aquest tipus d'acoblaments,

la ionització es produeix a pressions molt baixes, o

sigui, en un estat de buit. En contraposició, quan el

sistema d’entrada és un cromatògraf líquid d’alta

eficàcia, les fonts d'ionització són interfícies més

sofisticades que han trigat gairebé més de 30 anys a

ser desenvolupades. Com ja s’ha comentat amb

anterioritat, aquest lent desenvolupament s'ha degut

a l'enorme contrast que existeix entre els volums

relativament grans de dissolvent de la cromatografia

líquida i els requeriments de buit de l'espectrometria

de masses. Per això, les interfícies o fonts

d'ionització desenvolupades han tingut la doble

funció d'eliminar el dissolvent (normalment present

en ordres de 0,5-10 mL/min) i vaporitzar i ionitzar la

mostra. En aquest tipus d’acoblament, la ionització

es produeix a pressió atmosfèrica (5).

A la Figura 2, s’indica l’interval d'aplicació dels

diferents sistemes d’ionització d'acord a la mida i a la

polaritat dels components d’una mostra.

Dels diferents sistemes d’ionització existents, a

continuació, es descriuen tan sols aquells que

permeten l’acoblament de la cromatografia líquida

d’alta eficàcia a l’espectrometria de masses, donat que

són els que major utilitat presenten en les ciències de

laboratori clínic.

Figura 2. Interval d’aplicació dels diferents sistemes d’ionització en

funció de la massa molar i la polaritat dels components d’una mostra.

GC/MS : Acrònim de l’anglès gas chromatography/mass

spectrometry (cromatografia de gasos acoblada a

l’espectrometria de masses)

EI : Acrònim de l’anglès electron impact (impacte electrònic)

CI : Acrònim de l’anglès chemical ionization (ionització

química)

LC/MS : Acrònim de l’anglès liquid chromatography/mass

spectrometry (cromatografia líquida d’alta eficàcia acoblada a l’espectrometria de masses)

ESI : Acrònim de l’anglès elesctrospray ionization (ionització mitjançant electroesprai)

APCI : Acrònim de l’anglès atmospheric-pressure chemical

ionization (ionització química a pressió atmosfèrica)

3.2.2.1 Sistemes d’ionització de bombardeig amb àtoms ràpids

Els sistemes d’ionització de bombardeig amb àtoms

ràpids o FAB (acrònim de l’anglès fast atom

bombardment) han adquirit un paper important en la

producció d'ions per a l'estudi per espectrometria de

masses de components d’elevada massa molar. En

aquests sistemes d’ionització, els components d’una

mostra, en un estat condensat i sovint en una matriu

amb una dissolució de glicerol, s'ionitzen mitjançant

el bombardeig amb àtoms d'elevada energia de xenó

o argó. Tant els ions positius com els negatius dels

components de la mostra són expulsats de la

superfície per un procés de desorció (Figura 3).

Aquest tractament permet un escalfament molt ràpid

de la mostra, el que redueix la seva fragmentació. La

matriu líquida ajuda a reduir l'energia reticular, la qual



ha de ser vençuda perquè es desorbeixi un ió de la

fase condensada i proporcioni una manera d'eliminar

l'efecte produït pel bombardeig (1, 5).

El bombardeig de compostos orgànics o bioquímics

amb àtoms ràpids normalment produeix quantitats

significants d’ions moleculars fins i tot per a

components d'elevada massa molar i tèrmicament

inestables.

Figura 3. Esquema del mecanisme de funcionament d’un sistema

d’ionització de bombardeig per àtoms ràpids.

3.2.2.2 Sistemes d’ionització-desorció amb làser assistida per una matriu

Els sistemes d’ionització-desorció amb làser assistida

per una matriu o MALDI (acrònim de l’anglès

matrix-assited laser desorption-ionitation) són una evolució

dels sistemes d’ionització de bombardeig amb àtoms

ràpids. Les diferències fonamentals radiquen en què

la matriu és sòlida (cristal·lina) enlloc de líquida i que

el bombardeig es duu a terme a partir de fotons

enlloc d’àtoms ràpids. El resultat final és un enorme

increment, comparat amb el FAB, tant en la

sensibilitat metrològica i capacitat de detecció com

en l’interval de masses dels components analitzables

(1, 5).

En aquests sistemes d’ionització, la mostra es dissol

en la matriu sòlida i es deixa cristal·litzar en una

targeta d'acer inoxidable. Les matrius més apropiades

inclouen àcid 2,5-dihidroxibenzoic i àcid sinapínic.

Després, la targeta s'introdueix en l'espectròmetre de

masses i la superfície és bombardejada per un feix

polsant de llum làser (làser de nitrogen a una

longitud d’ona de 337 nm). Els components es

desorbeixen de la superfície de la matriu i s'ionitzen,

normalment, per protonació o desprotonació (Figura

4) (1, 5).


d’ionització-desorció amb làser assistida per una matriu.

3.2.2.3 Sistemes d’ionització a pressió atmosfèrica

La ionització a pressió atmosfèrica o API (acrònim

de l’anglès atmospheric-pressure ionization) és un sistema

d’ionització suau que, en actuar a pressió

atmosfèrica, i no en alt buit com és l'habitual en

altres sistemes, aconsegueix un altíssim rendiment.

En general, aquests sistemes ionitzen la mostra a

pressió atmosfèrica, eliminen el dissolvent, s'ionitzen

els components i es traslladen els ions a

l’espectròmetre de masses.

Els dos sistemes d’ionització a pressió atmosfèrica

més comunament utilitzats són l’electroesprai o ESI

(acrònim de l’anglès electrospray) i la ionització química

a pressió atmosfèrica o APCI (acrònim de l’anglès

atmospheric pressure chemical ionization).



En la ionització mitjançant electroesprai, la mostra

líquida s'introdueix a través d'un capil·lar al qual

s'aplica un voltatge elevat (generalment, 2-5 kV). Sota

la influència del camp elèctric generat, els ions de la

mateixa polaritat migren cap a l'extrem del capil·lar

on el líquid comença a formar un con (con de

Taylor) a partir del qual es generen petites gotes

altament carregades. Per permetre la formació d'un

esprai estable a fluxos de 50-200 μL/min, aquest

procés és assistit amb un flux coaxial de nitrogen (gas

de nebulització). A mesura que avancen al llarg de la

font d’ionització, les gotes es van fent cada vegada

més petites a causa de l'evaporació del dissolvent,

augmentant el nombre de càrregues per unitat de

superfície. Quan les forces coulòmbiques degudes a

l'excés de càrregues superen les forces de cohesió a

causa de la tensió superficial (límit de Rayleigh), es

produeix la fissió de les gotes. Aquest procés

d'inestabilitat es repeteix successivament, portant a la

formació de gotes molt més petites (3-10 nm)

altament carregades. Posteriorment, té lloc el procés

d’ionització dels components de la mostra en fase

gasosa, mitjançant la desorció dels components

carregats des de la superfície de la gota (Figura 5) (1,

5).

Figura 5. Esquema del mecanisme de funcionament d’un sistema d’ionització

mitjançant electroesprai.

En la ionització química a pressió atmosfèrica, a

diferència del que passa en la ionització mitjançant

electroesprai, el procés d'evaporació i d’ionització

constitueixen dues etapes diferents. En la primera,

l'eluent que procedeix de la columna cromatogràfica

s'introdueix a la regió d’ionització a través d'un

capil·lar sotmès a una temperatura entre 400-500 ºC.

Les altes temperatures aplicades i l'acció d'un flux

coaxial de nitrogen provoquen la nebulització i la

ràpida evaporació del dissolvent. En una segona

etapa, a la sortida del capil·lar, un elèctrode produeix

una descàrrega en corona (2-5 kV) que origina la

ionització de les molècules de dissolvent, nitrogen i

oxigen en fase gasosa afavorint la ionització dels

components de la mostra formant adductes (per

exemple, per captació o cessió d’un protó) i la

ionització dels components per transferència de

càrregues (Figura 6) (1, 5).

Molècules de dissolvent

Components de la mostra

Gas nebulitzador

1. Ionització de les molècules de dissolvent

Descàrrega en corona

2. Reacció amb elscomponents de la mostra. Formació

d’adductes

Cortina de gas

Cortina de gas

3. Destrucciódels adductes

Espectròmetrede masses


d’ionització química a pressió atmosfèrica.

3.2.3 Sistemes de buit

Perquè un ió format a la font d'ionització recorri una

trajectòria determinada fins arribar al detector, a

l'interior de l'espectròmetre per on ha de moure’s l’ió

ha d'estar evacuat a un buit suficient per assegurar

l'absència de col·lisions en el seu camí.

Els principals sistemes de buit que s'utilitzen per

aconseguir l'alt buit en l’espectrometria de masses

són les bombes difusores i les bombes

turbomoleculars, sent, les segones les més

àmpliament utilitzades en l’actualitat (1, 5).



3.2.4 Analitzadors de masses

Un cop formats els ions, aquests són transferits a

l'analitzador de masses on es porta a terme la seva

separació en funció de la seva relació massa/càrrega

(m/z).

Existeixen diferents tipus d'analitzadors: de

quadrupols, de trampa d'ions, de temps de vol, de

sector magnètic i de transformada de Fourier-

ressonància iònica ciclotrònica. Una característica

comuna de tots ells és la necessitat de treballar en

condicions de molt baixa pressió (10 Pa) i de la

separació dels ions en fase gasosa en funció de la

seva relació massa/càrrega (m/z). No obstant això,

difereixen en els mitjans emprats per dur a terme la

separació i la informació subministrada per cada un

d’ells quant a les seves propietats metrològiques

(selectivitat, sensibilitat metrològica, capacitat de

detecció, exactitud, precisió i veracitat), a la seva

capacitat de resolució de masses, a l’interval de

masses aplicable i a la velocitat d’escaneig emprat (1,

5).

3.2.4.1 Analitzadors de masses de quadrupol

Es tracta de l’analitzador de masses més versàtil i el

més àmpliament utilitzat degut al seu fàcil maneig i al

seu preu relativament econòmic si es compara amb

altres analitzadors, juntament amb el fet que ofereix

unes més que acceptables propietats metrològiques,

resolució de masses, interval de masses i velocitat

d’escaneig.

Consisteix en quatre corrons circulars (o hiperbòlics)

disposats en paral·lel dos a dos entorn a un eix

central. A cada un dels corrons se’ls hi aplica un

corrent continu, de manera que els rodets oposats

presenten una mateixa polaritat: un parell amb

voltatge positiu, i l'altre, amb voltatge negatiu.

Mitjançant l'aplicació de dos camps elèctrics, un

corrent continu i un potencial de radiofreqüència, els

ions que entren en el quadrupol comencen a oscil·lar

en un pla perpendicular a la longitud dels rodets de

manera que, per a una combinació de corrent

continu i radiofreqüència donada, només aquells que

tenen una determinada relació m/z presenten una

trajectòria estable i travessen el quadrupol sense

xocar contra les parets fins arribar al detector (Figura

7) (1, 5).

Figura 7. Esquema del mecanisme de funcionament d’un analitzador

de masses de quadrupol.

En els espectròmetres que presenten analitzadors de

masses de quadrupol, quan s’aplica un corrent

continu i un potencial de radiofreqüència que només

permet el pas d’un únic ió a través del quadrupol es

diu que s’està treballant en la modalitat monitorització

selectiva d’ions o SIM (acrònim de l’anglès selected ion

monitoring). Pel contrari, quan es crea una rampa de

combinacions d'aquests voltatges i a més es

mantenen constants, s'aconsegueix que un interval

determinat de masses (m/z) arribi fins al detector.

Aquesta modalitat de treball es coneix com la

modalitat d’escaneig (scan en anglès) (1, 5).

A més d'utilitzar-se en l'anàlisi de masses, en molts

espectròmetres de masses, s'utilitzen quadrupols

(hexapols, octapols) als quals només se’ls hi aplica el

potencial de radiofreqüència amb la finalitat de

focalitzar els ions en la seva transferència des de les



regions de pressió decreixent (sistemes d’ionització)

fins a l'analitzador de masses (1).

3.2.4.2 Analitzadors de masses de trampa iònica

Els analitzadors de masses de trampa iònica o IT

(acrònim de l’anglès ion trap) consisteixen en un

elèctrode circular sotmès a un potencial de

radiofreqüència, per sobre i sota del qual se situen

dos elèctrodes hemisfèrics perforats, pels que els ions

entren i surten de la trampa. Els ions són transmesos

des de la font d’ionització per polsos i atrapats en la

trampa on, per acció del potencial de

radiofreqüència, adquireixen una freqüència

d'oscil·lació que dependrà de la seva relació m/z. A

l'interior de la trampa, la presència d'un gas

(generalment heli) fa que els ions se situïn al centre,

la qual cosa evita la pèrdua d'ions per col·lisió amb

els elèctrodes, i millora la resolució, ja que limita la

distribució espacial dels ions. Per fer un escombrat

d'un interval de masses, es modifica l'amplitud del

potencial de radiofreqüència (Figura 8) (1, 5).

Figura 8. Esquema del mecanisme de funcionament d’un analitzador de

masses de trampa iònica.

3.2.4.3 Analitzadors de masses de temps de vol

En els analitzadors de masses de temps de vol o

TOF (acrònim de l’anglès time of fly) els ions són

accelerats mitjançant l’aplicació d’un potencial cap a

un “tub analitzador” o "tub de vol" d’un metre de

longitud sobre el qual no actua cap potencial. Degut

a que tots els ions que entren dins del tub presenten

idealment la mateixa energia cinètica, les seves

velocitats en el tub varien de manera inversa a les

seves masses, i per tant els ions dels components

amb menor massa arriben abans al detector que els

de major massa. Així doncs, la separació dels ions es

basa en el temps necessari per recórrer la longitud

del tub el qual dependrà de la seva relació

massa/càrrega (m/z). Els primers analitzadors de

temps de vol lineals no permetien obtenir una bona

resolució degut principalment a l'energia de dispersió

dels ions quan abandonen la font d’ionització. En

l’actualitat, aquest efecte s’ha corregit mitjançant la

utilització d’una disposició ortogonal del tub i la

introducció, en el punt intermedi, d'una sèrie de lents

sotmeses a diferents potencials (reflectrons), que donen

lloc a una compensació de la dispersió inicial.

Aquests tipus d’analitzadors presenten una excel·lent

resolució i, teòricament, no tenen cap límit en quant

a l’interval de masses que permeten mesurar (Figura

9) (1, 5).


masses de temps de vol.

3.2.4.4 Analitzadors de masses de transformada de Fourier-resonància iònica ciclotrònica

Els analitzadors de masses de transformada de

Fourier-ressonància iònica ciclotrònica o FT-ICR

(acrònim de l’anglès Fourier transform-ion cyclotron

resonance) són analitzadors tipus trampa iònica, que

consisteixen en una cel·la cúbica formada per dos

plats paral·lels (un d'entrada i un de sortida), dos



plats d'excitació i dos plats detectors. La cel·la és

sotmesa a un elevat camp magnètic que provoca un

moviment circular dels ions perpendicular a la

direcció d'aquest camp magnètic sent el radi del

moviment dels ions inversament proporcional a la

seva relació massa/càrrega (m/z). Els ions que es

troben a l'interior de la cel·la són excitats mitjançant

un potencial de radiofreqüència que origina un

augment del radi circular descrit. Quan els ions

excitats passen prop dels plats receptors generen un

corrent elèctric (anomenada imatge de corrent) la qual

és detectada. A diferència de la resta d’analitzadors

de masses, la detecció dels ions no es destrueix, pel

que poden ser mesurats repetidament, amb el

conseqüent augment de sensibilitat metrològica

(Figura 10) (1, 5).


masses de transformada de Fourier-resonància iònica ciclotrònica.

3.2.4.5 Analitzadors de masses de sector magnètic

En els analitzadors de masses de sector magnètic els

ions són accelerats amb un voltatge cap a un camp

magnètic, sota la influència del qual adquireixen un

moviment circular. El radi de curvatura descrita per

l’ió ve determinat pel camp magnètic, el potencial o

voltatge aplicat i la seva relació massa/càrrega (m/z).

Per a un valor fix de camp magnètic (i potencial), els

ions d'una determinada massa/càrrega són detectats

per un detector el qual es troba ubicat en una posició

fixa.

Els processos d'ionització donen lloc a una dispersió

en l'energia cinètica dels ions en la seva sortida de la

font. Per això, per millorar la resolució d'aquests

analitzadors de masses, sol incorporar-se entre el

sector magnètic i el detector un analitzador d’energia

electrostàtica que focalitza els ions corregint la seva

dispersió. A més, per reduir l'energia de dispersió

dels ions i provocar la seva acceleració cap a

l'analitzador, s'han d'emprar voltatges molt elevats en

la font (generalment 5-8 kV), el que permet dur a

terme la fragmentació dels ions en les regions lliures

de camp magnètic. No obstant això, aquest voltatge

és massa elevat per a treballar a pressió atmosfèrica i,

per això, aquests analitzadors de masses no han

tingut un paper important en el desenvolupament de

l’acoblament de la cromatografia líquida amb

l’espectrometria de masses (Figura 11) (1, 5).


masses de sector magnètic.

3.2.5 Sistemes de detecció

Comercialment són assequibles diversos tipus de

detectors per espectròmetres de masses. En els

primers anys predominaven els multiplicadors

d'electrons de detecció puntual. Més tard van anant

apareixent nous desenvolupaments dels mateixos,

com els detectors tipus Channeltron de baix cost i ús



general, i els sistemes de conversió fotònica més

sofisticats, sensibles i duradors. També han aparegut

sistemes de detecció simultània, com ara les bateries

de micromultiplicadors multicanal, combinats

normalment amb centelleig o conversió fotònica.

3.2.5.1 Detectors de copa de Faraday

Un detector de copa de Faraday consisteix en un

simple elèctrode, normalment en forma de copa o

caixa, que rep l'impacte dels ions. Els ions es

neutralitzen per transferència d'electrons, i el senyal

es mesura com un corrent analògic igual o superior al

corrent iònic original, depenent de la forma de

l'elèctrode (Figura 12). És un detector de baixa

sensibilitat metrològica i capacitat de detecció. Pot

treballar a pressions relativament altes i posseeix una

gran linealitat de resposta. La mínima corrent

detectable és de l'ordre de 10-14 A (1).

Figura 12. Esquema del mecanisme de funcionament d’un detector de

copa de Faraday.

3.2.5.2 Multiplicador d’electrons secundaris

El multiplicador d’electrons secundaris és un dels

detectors que més s’utilitzen en l’espectrometria de

masses. Està format per un càtode i successius

dínodes que presenten una superfície de coure i berili

de les que s'emeten ràfegues d'electrons en ser

assolides per ions o electrons d'elevada energia. L'ió

a detectar xoca amb el primer dínode, provocant

l'emissió d'un elevat nombre d'electrons, que

incidiran sobre el segon dínode. El procés de

multiplicació es repeteix successivament en els altres

dínodes obtenint, al final del sistema, una

amplificació de senyal de l'ordre de 106 a 108 (Figura

13a). És un detector molt més sensible que el de

copa de Faraday, amb un senyal mínim detectable de

l'ordre de 10-18 A (1).

Figura 13. Esquema del mecanisme de funcionament de: (a) un

multiplicador d’electrons secundari; (b) detector Channeltron.

3.2.5.3 Detectors tipus Channeltron

Aquest detector és un dels més utilitzats avui en dia

en l’espectrometria de masses per a ús general. És

similar al multiplicador d'electrons clàssic, amb la

principal diferència que no té múltiples dínodes

discrets, sinó que està format per un tub de vidre en

forma de corneta, de vegades acabat en forma

d'espiral o caragol (Figura 13b), l'interior del qual està

recobert per un òxid de plom semiconductor de

composició i característiques especials.

Si es desitja detectar ions positius, s'aplica un

potencial negatiu a l’entrada del detector perquè els

ions procedents de l'espectròmetre de masses,

desviats de la seva trajectòria per una placa repulsora

amb potencial positiu, siguin atrets al seu interior i

xoquin amb la cara interna produint l'emissió d'un

cert nombre d'electrons. El final del tub del detector



presenta un potencial proper a la presa de terra, de

manera que hi haurà un gradient continu de

potencial des de l’entrada fins al fons del detector. A

causa d'això, els electrons arrencats en l'impacte

inicial de l’ió es desplaçaran en la direcció dels

potencials menys negatius cap a un potencial zero,

produint-se una gran quantitat d'impactes en el camí,

en cada un dels quals es multiplicarà el nombre

d'electrons (de l'ordre de 108). Al final del recorregut

del tub multiplicador es troba un con col·lector amb

l'electrònica de preamplificació i amplificació

associada. Per altra banda, els detectors tipus

Channeltron poden exposar-se a pressió atmosfèrica

sense cap problema, sempre que l'alt potencial hagi

estat desconnectat, permetent trencar buit en el

sistema sense complicacions (1).

3.2.5.4 Detector de conversió fotònica o de centelleig

Aquest detector és un dels més eficients, sensibles i

de més llarga vida disponibles. Els ions procedents

del tub de vol de l'espectròmetre de masses són

desviats de la seva trajectòria mitjançant un potencial

elèctric. El voltatge aplicat és de signe contrari a la

càrrega dels ions que es vulguin detectar, per

provocar la seva atracció i xoc sobre el dínode inicial.

Aquest xoc produeix múltiples electrons que són

atrets, a la vegada, per un voltatge més positiu que el

del dínode, i aplicat sobre una pantalla fosforescent o

de centelleig. En rebre l'impacte dels electrons, la

pantalla de centelleig emet un gran nombre de

fotons, els quals es dirigeixen a un fotomultiplicador

convencional segellat al buit, produint-se la

conseqüent cascada d'electrons que multiplica el

senyal (Figura 14) (1).

Figura 14. Esquema del mecanisme de funcionament d’un detector de

conversió fotònica o de centelleig.

3.2.5.5 Detectors multicanal

Es basen en la utilització d'una o dues capes de

bateries de micromultiplicadors seguides d'un

sistema de detecció més o menys sofisticat i eficient,

encarregat de detectar simultàniament tots els

senyals. Aquest tipus de detectors reuneixen

l'avantatge dels antics sistemes de fotoplaques de ser

capaços de detectar simultàniament una àmplia zona

espectral, el que augmenta enormement el temps

d'observació de cada ió, amb la major sensibilitat,

estabilitat, i capacitat d'amplificació dels moderns

sistemes multiplicadors. Aquestes característiques

condueixen a una sensibilitat augmentada en molts

ordres de magnitud (1).

3.2.6 Espectrometria de masses en tàndem

En un espectròmetre de masses convencional, la

separació dels ions es realitza emprant un sol

analitzador de masses. Una alternativa a aquests tipus

d’espectròmetres, que permet una millora substancial

de l’especificitat o selectivitat dels mateixos i una

major informació estructural dels components d’una

mostra, consisteix en la combinació de dos

analitzadors de masses en un mateix espectròmetre.

Aquesta combinació rep el nom d’espectrometria de

masses en tàndem. La combinació d’analitzadors de



masses més àmpliament utilitzada en les ciències de

laboratori clínic és l’anomenada espectrometria de

masses en tàndem de triple quadrupol o QqQ. En

ella, s’utilitzen dos analitzadors de masses de

quadrupol separats entre sí per una cel·la de col·lisió

en la qual s’indueix la dissociació dels ions que

arriben del primer quadrupol. És l’anomenada

dissociació induïda per col·lisió o CID (acrònim de

l’anglès collision induced dissociation). Aquesta

combinació d’analitzadors de tipus quadrupol es

tradueix en una disminució del soroll de fons

respecte al que es produeix en un espectròmetre de

masses convencional i, per tant, en un augment de la

sensibilitat metrològica, de la capacitat de detecció i

de la selectivitat o especificitat. En funció de com

operin i es combinin els dos quadrupols (modalitat

de monitorització selectiva d’ions o SIM o modalitat

d’escaneig o Scan) ens permet treballar de diferents

maneres (1, 5):

Monitorització múltiple de reacció o MRM (acrònim de l’anglès multiple reaction monitoring) o monitorització selectiva de reacció o SRM (acrònim de l’anglès selected reaction monitoring)

Els dos quadrupols (el primer i el tercer)

treballen en la modalitat SIM. Al primer

quadrupol se selecciona un únic ió amb

determinada relació m/z (ió precursor), es

provoca la seva fragmentació en la cel·la de

col·lisió, i un únic ió amb una determinada

relació m/z (ió producte) se selecciona al tercer

quadrupol. A cada combinació d’ió precursor-ió

producte concret se'l denomina transició. En la

modalitat MRM es poden monitoritzar diverses

transicions (Figura 15a). Aquesta manera de

treballar s'empra per realitzar anàlisis

quantitatives, aportant la màxima sensibilitat

metrològica, capacitat de detecció, selectivitat i

especificitat en la mesura de la concentració de

components coneguts d’una mostra en diferents

fluids biològics.

Escaneig d’ions productes o Product ion scan o Daughter ion scan

El primer quadrupol treballa en la modalitat SIM

mentre que el tercer ho fa en la modalitat Scan.

Al primer quadrupol se selecciona un únic ió

amb determinada relació m/z (ió precursor), es

provoca la seva fragmentació en la cel·la de

col·lisió, i es monitoritzen totes les relacions m/z

generades (ió productes) al tercer quadrupol

(Figura 15b). Aquesta manera de treballar

s'empra per l’elucidació estructural de compostos

(per exemple, una seqüència de pèptids), per

conèixer els ions productes que s’empraran per

generar les transicions MRM i per optimitzar el

potencial de la cel·la de col·lisió per tal d’obtenir

un major senyal per un determinat ió producte

en la modalitat de treball MRM.

Escaneig d’ions precursors o Parent ion scan o Precursor ion scan

El primer quadrupol treballa en la modalitat Scan

mentre que el tercer ho fa en la modalitat SIM.

Al primer quadrupol es monitoritzen totes les

relacions m/z (ions precursors), es provoca la

fragmentació de tots ells en la cel·la de col·lisió i

se selecciona un únic ió amb determinada relació

m/z (ió producte) al tercer quadrupol (Figura

15c). Aquesta manera de treballar s'empra per

l’elucidació estructural de compostos (per

exemple, una seqüència de pèptids) com a

informació complementària o confirmatòria d’un

escaneig d’ions productes.

Escaneig de pèrdua neutral o Neutral loss scan

Els dos quadrupols treballen en la modalitat Scan

d'una forma sincronitzada, de tal manera que



quan el primer quadrupol deixa passar tots els

ions precursors, el tercer quadrupol monitoritza

si s’ha perdut un fragment o grup funcional

neutre concret dels mateixos, o sigui, es duu a

terme un escaneig dels compostos que tenen un

mateix patró de fragmentació (Figura 15d).

Aquesta manera de treballar s'empra per dur a

terme estudis metabòlics.

Figura 15. Modalitats de treball de l’espectrometria de masses en

tàndem de triple quadrupol: a) monitorització múltiple de reacció o

MRM; b) escaneig d’ions producte o Product ion scan; b) escaneig

d’ions presursors o Precursor ion scan i d) escaneig de pèrdua neutral

o neutral loss scan.

Tradicionalment, els dos analitzadors de masses

emprats en l’espectrometria de masses en tàndem

han estat els quadrupols. No obstant això, també

poden combinar-se altres analitzadors, o utilitzar

combinacions híbrides (quadrupol-temps de vol,

quadrupol-trampa iònica, trampa iònica-

transformada de Fourier-ressonància iònica

ciclotrònica, entre altres).

4. APLICACIONS DE L’ESPECTRO-METRIA DE MASSES EN LES CIÈNCIES DE LABORATORI CLÍNIC

De tots els principis de mesura existents,

l'espectrometria de masses n’és un dels que major

aplicabilitat presenta en el camp de les ciències de

laboratori degut a que és capaç de proporcionar

informació sobre la composició elemental de les

mostres, l’estructura química de les molècules

inorgàniques, orgàniques i biològiques, la composició

qualitativa i quantitativa de barreges complexes d’una

mostra, l’estructura i la composició de superfícies

sòlides i les relacions isotòpiques dels elements

presents en les mostres (1, 5).

4.1 Aplicacions de l’espectrometria de masses mitjançant la utilització d’isòtops estables com a traçadors metabòlics o estàndards interns

Els diferents àtoms d’un mateix element químic, tot i

presentar el mateix nombre de protons (nombre

atòmic), es poden diferenciar entre sí pel nombre de

neutrons que contenen (isòtops). En la naturalesa,

per un mateix element químic, existeixen diferents

isòtops estables amb distintes abundàncies relatives

motiu pel qual, la seva massa atòmica és la mitjana de

totes les masses isotòpiques de l’element (Taula 1).

El marcatge de biomolècules amb diferents isòtops

estables com el 2H (deuteri), el 13C, el 15N, el 18O, el

36S, la posterior utilització d’aquestes biomolècules

com a traçadors metabòlics o estàndards interns i la

seva posterior detecció o quantificació mitjançant

espectrometria de masses ha donat lloc a nombroses

aplicacions dins de l’àmbit de les ciències de

laboratori clínic (1, 5, 9).



Element químic

Massa atòmica mitjana (g/mol)

Massa atòmica isotòpica (g/mol)

Abundància relativa

(%)

Hidrogen 1,0079 1,0078 99,985

2,0140 0,015

Carboni 12,0110 12,0000 98,900

13,0134 1,100

Nitrogen 14,0066 14,0031 99,640

15,0001 0,360

Oxigen 15,9993

15,9949 99,760

16,9991 0,040

17,9992 0,200

Sofre 32,0646

31,9721 95,000

32,9715 0,760

33,9679 4,200

35,9671 0,020

Taula 1. Principals elements químics, que formen part de molècules

biològiques, i les seves masses atòmiques i abundàncies relatives.

4.1.1 Espectrometria de masses de relació isotòpica

L'espectrometria de masses de relació isotòpica o

IRMS (acrònim de l’anglès isotope ratio mass

spectrometry) permet detectar petits increments en la

relació isotòpica d’una biomolècula que presenta

l'isòtop més abundant i la mateixa biomolècula

marcada amb un isòtop estable (traçador).

L'estructura química del traçador és planejada a

l'efecte per ser el substrat més adequat al procés

biològic que es vulgui estudiar. Per exemple, un

substrat marcat amb 13C, administrat per via oral o

per infusió endovenosa en unes determinades

condicions, és metabolitzat per l'organisme fins a la

producció final de 13CO2 el qual serà exhalat amb el

total del produït per l'organisme (12CO2). A uns

temps concrets establerts, arran de l'estudi dels

processos fisiològics o metabòlics implicats, es

recullen mostres d'aire expirat que posteriorment

seran processades en un espectròmetre de masses.

L'elevació de 13CO2 respecte a 12CO2 serà la

conseqüència del trànsit i del metabolisme del procés

metabòlic que s’està investigant.

En són un exemple d’aquestes aplicacions, la

utilització isòtops en biomolècules com (1, 9):

H218O en l’estudi de l’aigua corporal total,

2H218O en l’estudi de la despesa energètica,

13C-glucosa en l’estudi del metabolisme oxidatiu

del glúcids,

Àcid 13C-palmític i àcid 13C-octanoic en l’estudi

del metabolisme oxidatiu dels àcids grassos,

13C-leucina i 13C-valina en l’estudi del

metabolisme oxidatiu dels aminoàcids,

àcid 13C-cetoisocaproic en l’estudi del

metabolisme oxidatiu mitocondrial,

13C-eritromicina i 13C-aminopirina en l’estudi de

l’activitat del citocrom P450,

13C-lactosa en l’estudi del dèficit de lactasa,

13C-glucosa en l’estudi de malabsorció,

13C-midó en l’estudi del dèficit d’amilasa,

13C-trioctanoïna i 13C-triglicèrid mixt en l’estudi

del dèficit de lipasa intestinal,

13C-octanoat, 13C-acetat i 13C-glicina en l’estudi

del buidament gàstric,

13C-aminopoirina i 13C-galactosa en l’estudi de la

massa funcional hepàtica,

13C-urea en l’estudi d’infeccions per Helicobacter

pylori,

àcid 13C-glicòlic en l’estudi de sobrecreixement

bacterià.

4.1.2 Espectrometria de masses de dilució isotòpica

L'espectrometria de masses de dilució isotòpica

permet el mesurament de la concentració de multitud

de compostos basant-se en la utilització d’un

compost isotòpicament enriquit com a estàndard

intern.



Tal i com succeeix en els mètodes cromatogràfics

(10), les aplicacions quantitatives de l’espectrometria

de masses de dilució isotòpica es basen

principalment en la comparació dels senyals produïts

pels ions d’un component d’una mostra amb els

corresponents a uns compostos prèviament

seleccionats. En aquest procediment, als materials de

calibratge i a la mostra s'afegeix una quantitat exacta

d'un compost pur, absent a la mostra, anomenat

estàndard intern. Aquest compost pur és el mateix

component de la mostra a estudiar però amb una

composició elemental formada per un o varis isòtops

estables.

Seguidament, s’obtenen els espectres per als diferents

calibradors i els de l’estàndard intern i es representen

els quocients entre els seus senyals (calibradors/patró

intern) enfront de la concentració. Posteriorment,

per a una mostra determinada, s’obté el seu senyal

que correspon al component en qüestió i del seu

estàndard intern, es duu a terme la relació entre

aquests senyals i es calcula la seva concentració

mitjançant la interpolació de la seva relació de

senyals en l’esmentada representació (10).

4.2 Exemples d’aplicacions de l’espectrome-tria de masses en les ciències de laboratori clínic

Les diferents aplicacions existents per a la

cromatografia líquida d’alta eficàcia (10) poden ser

adaptades a l’espectrometria de masses simple o en

tàndem, a la cromatografia de gasos acoblada a

l’espectrometria de masses simple o en tàndem i a la

cromatografia líquida d’alta eficàcia acoblada a

l’espectrometria de masses simple o en tàndem.

Entre les principals aplicacions específiques de

l’espectrometria de masses es poden destacar (10-13):

Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb errors congènits del metabolisme d’àcids orgànics:

o Uri—2-Hidroxiglutarat; c.subst.

o Uri—2-Oxoglutarat; c.subst.

o Uri—2-Hidroxiadipat; c.subst.

o Uri—3-Hidroxiglutarat; c.subst.

o Uri—3-Hidroxiadipat, c.subst.

o Uri—3-Hidroxiisovalerat; c.subst.

o Uri—3-Hidroxisebacat; c.subst.

o Uri—3-Hidroxipropionat; c.subst.

o Uri—3-Hidroxiisobutirat; c.subst.

o Uri—3-Hidroxi-2-metilbutirat; c.subst.

o Uri—4-Hidroxibutirat; c.subst.

o Uri—3-Metilbutirilglicina; c.subst.

o Uri—3-Metilcrotonilglicina; c.subst.

o Uri—Metilglutaconat; c.subst.

o Uri—3-Metilglutarat; c.subst.

o Uri—Àcids orgànics; taxon.

o Uri—Àcid homogentísic; c.subst.

o Uri—Adipat; c.subst.

o Uri—-Cetoadipat; c.subst.

o Uri—-Hidroxipiruvat; c.subst.

o Uri—Butirilglicina; c.subst.

o Uri—Cis-aconitat; c.subst.

o Uri—Citrat; c.subst.

o Uri—Etilhidracrilat; c.subst.

o Uri—Etilmalonat; c.subst.

o Uri—Fumarat; c.subst.

o Uri—Glicolat; c.subst.

o Uri—Glioxilat; c.subst.

o Uri—Glutarat; c.subst.

o Uri—Hexanoilglicina; c.subst.

o Uri—Isobutirilglicina; c.subst.

o Uri—Isovalerilglicina; c.subst.

o Uri—Lactat; c.subst.

o Uri—Malat; c.subst.



o Uri—Mavalonat; c.subst.

o Uri—Metilcitrat; c.subst.

o Uri—Metilmalonat; c.subst.

o Uri—Metilsuccinat; c.subst.

o Uri—N-acetilaspartat; c.subst.

o Uri—Oxalat; c.subst.

o Uri—Parahidroxifenilacetat, c.subst.

o Uri—Parahidroxifenilpiruvat, c.subst.

o Uri—Piroglutamat; c.subst.

o Uri—Piruvat; c.subst.

o Uri—Propionilglicina; c.subst.

o Uri—Sebacat; c.subst.

o Uri—Suberat insaturat; c.subst.

o Uri—Suberat; c.subst.

o Uri—Suberglicina; c.subst.

o Uri—Succinat; c.subst.

o Uri—Succinilacetona; c.subst.

o Uri—Tiglicilglicina; c.subst.

o Uri—Uracil; c.subst

Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb errors congènits del metabolisme d’àcids grassos:

o Pla—Àcids grassos; taxon.

o Pla—Cis-4-decenoic; c.subst.

o Pla—Cis-5-tetradecenoic; c.subst.

o Pla—Decanoat; c.subst.

o Pla—Dodecanoat; c.subst.

o Pla—Estearat; c.subst.

o Pla—Linoleat; c.subst.

o Pla—Miristat; c.subst.

o Pla—Miristoleat; c.subst.

o Pla—Octanoat; c.subst.

o Pla—Oleiat; c.subst.

o Pla—Palmitat; c.subst.

o Pla—Palmitoleat; c.subst.

Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb errors congènits del metabolisme d’acilcarnitines:

o Pla—Acilcarnitines; taxon.

o Pla—C0-Acilcarnitina; c.subst.



o Pla—C3DC/C4-OH-Acilcarnitina; c.subst.


o Pla—C4DC/C5-OH-Acilcarnitina; c.subst.


o Pla—C5:1-Acilcarnitina; c.subst.

o Pla—C5DC-Acilcarnitina; c.subst.


o Pla—C6DC-Acilcarnitina; c.subst.









o Pla—C14-OH-Acilcarnitina; c.subst.






o Pla—C16:1-OH-Acilcarnitina; c.subst.




o Pla—C18:1-OH-Acilcarnitina; c.subst.


o Pla—Carnitina; c.subst.



Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb malalties lisosomals:

o Pla—-fucosidasa; cont.cat.

o Pla—-Iduronidasa; cont.cat.

o Pla—-manosidasa; cont.cat.

o Pla—Amilo-1-6-glucosidasa; cont.cat.

o Pla—Arilsulfatasa B; cont.cat.

o Pla—Arilsulfatasa C; cont.cat.

o Pla—Aspartilglucosaminidasa; cont.cat.

o Pla—-galactosidasa; cont.cat.

o Pla—-glucuronidasa; cont.cat.

o Pla—-hexosaminidasa; cont.cat.

o Pla—-manosidasa; cont.cat.

o Pla—Heparan-N-sulfatasa; cont.cat.

o Pla—Iduronosulfatasa; cont.cat.

o Pla—N-acetil--galactosaminidasa; cont.cat.

o Pla—N-acetilglucosamina-6-sulfat sulfatasa;

cont.cat.

o Pla—N-acetil-neuraminidasa; cont.cat.

o Pla—N-acetil-glucosaminidasa; cont.cat.

o Pla—Galactosamina-6-sulfat sulfatasa;

cont.cat.

o Pla—Hidrolases lisosòmiques; cont.cat.

o Pla—N-Acetilglucosamina-3-sulfatasa;

cont.cat.

Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb errors congènits del metabolisme dels aminoàcids:

o Pla—Alanina; c.subst.

o Pla—-Alanina; c.subst.

o Pla—-Aminobutirat; c.subst.

o Pla—Aminoàcids; taxon.

o Pla—Arginina; c.subst.

o Pla—Asparagina; c.subst.

o Pla—Aspartat; c.subst.

o Pla—-Alanina; c.subst.

o Pla—-Aminoisobutirat; c.subst.

o Pla—Carnosina; c.subst.

o Pla—Cistationina; c.subst.

o Pla—Cistina; c.subst.

o Pla—Citrulina; c.subst.

o Pla—-Hidroxilisina; c.subst.

o Pla—Etanolamina; c.subst.

o Pla—Fenilalanina; c.subst.

o Pla—Glicina;c.subst.; c.subst.

o Pla—Glutamat; c.subst.

o Pla—Glutamina; c.subst.

o Pla—Hidroxiprolina; c.subst.

o Pla—Histidina; c.subst.

o Pla—Homocistina; c.subst.

o Pla—Isoleucina; c.subst.

o Pla—Leucina; c.subst.

o Pla—Lisina; c.subst.

o Pla—Metilhistidina; c.subst.

o Pla—Metionina; c.subst.

o Pla—Ornitina; c.subst.

o Pla—Prolina; c.subst.

o Pla—Serina; c.subst.

o Pla—Taurina; c.subst.

o Pla—Tirosina; c.subst.

o Pla—Treonina; c.subst.

o Pla—Triptòfan; c.subst.

o Pla—Valina; c.subst.

o Pla—-Aminobutirat; c.subst.

o Pla—Hidroxilisina-1; c.subst.

Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb desordres metabòlics de glucosaminoglicans:

o Uri—Condroitin-sulfat A; c.arb.

o Uri—Condroitin-sulfat C; c.arb.

o Uri—Dermatan-sulfat; c.arb.

o Uri—Glucosaminoglicans; taxon.

o Uri—Heparan-sulfat; c.arb.



o Uri—Keratan-sulfat; c.arb.

Mesurament o examen de propietats biològiques relacionades amb desordres metabòlics de la creatina:

o Pla—Creatina; c.subst.

o Uri—Creatina; c.subst.

o Pla—Guadininacetat; c.subst.

o Uri—Guadininacetat; c.subst.

Cal destacar que, en l’actualitat, l’espectrometria de

masses s’està aplicant en l’estudi del projecte proteoma

el qual pretén identificar i quantificar nous

biomarcadors (metabòlits, pèptids o proteïnes

modificades) que permetin el diagnòstic, diagnòstic

precoç, pronòstic i seguiment de malalties

cardiovasculars, infeccioses, nefrològiques,

oncològiques, reumatològiques, entre altres. Els

mètodes que s’empren en aquest tipus d’estudis són,

principalment, les espectrometries de masses

MALDI-TOF/TOF (acrònim de l’anglès matrix-

assited laser desorption-ionitation—Time of fly/Time of fly),

MALDI-Q/TOF (acrònim de l’anglès matrix-assited

laser desorption-ionitation—Simple quadrupol/Time of fly),

SELDI-TOF/TOF (acrònim de l’anglès surface-

enhanced laser desorption-ionitation—Time of fly/Time of

fly), SELDI-Q/TOF (acrònim de l’anglès surface-

enhanced laser desorption-ionitation—Simple

quadrupol/Time of fly), ESI-TOF/TOF (acrònim de

l’anglès electrosprai ionization—Time of fly/Time of fly) i

ESI-Q/TOF (acrònim de l’anglès electrosprai

ionization—Simple quadrupol/Time of fly).

Una de les aplicacions d’aquests estudis de perfils

proteics, ja incorporat en els laboratoris clínics,

consisteix en la identificació diferents

microrganismes (bacteris, fongs i llevats) mitjançant

l’espectrometria de masses MALDI-TOF o ESI-

TOF (14).

5. BIBLIOGRAFIA

1. De Hoffmann, Stroobant V. Mass spectrometry:

principles and applications. Chichester: John Wiley

& Sons Ltd; 2007.

2. Niessen WMA. Liquid chromatography—mass

spectrometry. Boca Ratón: CRC Press·Taylor &

Francis Group; 2006.

3. International Union of Pure and Applied Chemistry.

Definitions of terms relating to mass spectrometry—

IUPAC Recommendations 2013. Pure Appl Chem

2013;85:1515-609.

4. International Union of Pure and Applied Chemistry.

Compendium of chemical terminology—the Gold

Book. <http://goldbook.iupac.org/> (accés: 2013-

03-22).

5. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principios de

análisis intrumental. Madrid: McGraw-

Hill·Interamericana; 2001.

6. Bogusz MJ. Liquid chromatography—mass

spectrometry as a routine method in forensic

sciences: a proof of maturity. J. Chromatogr B

2000;7483-19.

7. Arpino P, Baldwin MA, McLafferty FW. Liquid

chromatography—mass spectrometry II. Continuous

monitoring. Biomed Mass Spectrom 1974;1:80-2.

8. Burlingame AL, Boyd RK, Gaskell SJ. Mass

spectrometry. Anal Chem 1994;66:634-83.

9. Hernández JM. Espectrometría de masas.

Aplicaciones clínicas. Ed Cont Lab Clin 2007;11:19-

30.

10. Rigo Bonnin R. La cromatografia com a principi de

mesura: classificació, fonaments teòrics i aplicació en

les ciències de laboratori clínic. In vitro veritas

2013;14:80-103. (accés: 2013_07_31).

11. Chace DH. Mass spectrometry in the clinical

laboratory. Chem Rev 2001;101:445-77.

12. Garg U, Hammett-Stabler CA. Clinical applications

of mass spectrometry: methods and protocols. New

York: Humana Press; 2010.

13. Van den Ouweland JMW, Kema IP. The role of

liquid chromatogrphy-tandem mass spectrometry in

the clinical laboratory. J Chromatogr B 2012;883-

884:18-32.



14. Jordana Lluch E, Martró Català E, Ausina Ruiz V. La espectrometría de masas en el laboratorio de microbiología clínica. Enferm Infecc Microbiol Clin 2012;30:635-44.


__________________________________________________________________________________________


Secció de Cribatge Prenatal d’Aneuploïdies1

Diagnòstic prenatal d’anomalies cromosòmiques

Preparat per:

Aurora Sánchez Díaz, Anna Soler Casas, Elena Casals Font

Servei de Bioquímica i Genètica Molecular (Centre de Diagnòstic Biomèdic),

Hospital Clínic, Barcelona

_________________________________________________________________________________________

Introducció

El diagnòstic prenatal citogenètic es va iniciar a partir

del fet reconegut que les anomalies cromosòmiques

són una causa important de morbilitat i mortalitat

fetal (1). L’amniocentesi i la biòpsia corial són els

procediments més emprats arreu, però tot i

l’experiència acumulada, són procediments invasius

que comporten un risc de pèrdua fetal, actualment

avaluat entre un 0,5 i un 1 % (2). Aquest fet suposa

que el diagnòstic prenatal no té una aplicació

universal, sinó que cal establir uns criteris de selecció

de les gestants amb més risc d’anomalia, per tal que

el balanç benefici/risc sigui favorable.

El diagnòstic prenatal citogenètic a Catalunya es va

normalitzar l’any 1998 amb la Instrucció 01/98 del

Servei Català de la Salut (d'ara endavant SCS)

«Implantació del diagnòstic prenatal d’anomalies

congènites a Catalunya» (3), que facilitava l’accés al

cribratge del segon trimestre a totes les dones

gestants residents a Catalunya, i la realització del

cariotip fetal a les gestants seleccionades mitjançant

l’amniocentesi. Deu anys més tard el mateix SCS va

implantar el cribratge del primer trimestre (4), amb la

qual cosa el cariotip fetal es podia tenir molt abans a

partir de la biòpsia corial.

_____________________________________________ 1

Membres de la Secció de Cribatge Prenatal d’Aneuploïdies durant la preparació d’aquest document: M. Alsina Donadeu, A. Alumà Trullas, C. Aulesa Martínez, E. Casals Font (presidenta), D. Cabrero Olivan, A. Esquerda Serrano, I. Llovet Lombarte, E. Martínez Verdera, J. Minchinela Girona, J. Mora Brugués, R. Navarro Badal, C. Peña, N. Serrat Orús. _____________________________________________


ISSN: 1697-5421

Recomanació

185 Sánchez Díaz et al. In vitro veritas 2013;14:184-186


El cariotip convencional és l’eina bàsica del

diagnòstic citogenètic prenatal: dóna informació de

tots els cromosomes, és a dir de tot el genoma, amb

capacitat de detecció tant de desequilibris superiors a

5 Mb com de reorganitzacions equilibrades.

Actualment es disposa de mètodes de citogenètica

molecular, basats en les micromatrius (microarrays en

anglès), que tenen una capacitat de detecció de

desequilibris molt superior al cariotip (< 1 Mb) però

que no permeten detectar reorganitzacions

equilibrades ni poliploïdies. D’altra banda, atès que el

diagnòstic citogenètic clàssic comporta un temps

d’espera dels resultats, s’han desenvolupat mètodes

ràpids de les anomalies cromosòmiques més

freqüents, el més estès dels quals és la reacció en

cadena per la polimerasa quantitativa fluorescent o

QF-PCR (acrònim de l'anglès quantitative fluorescence

polymerase chain reaction). En relació amb el cariotip,

n’avança un resultat parcial (diagnòstic de les

trisomies 21, 18, 13 i les aneuploïdies sexuals), que

s’obté en un o dos dies.

Darrerament s’estan desenvolupant mètodes no

invasius pel diagnòstic de les aneuploïdies més

freqüents, mitjançant l’estudi del DNA fetal lliure

circulant en la sang materna. De moment té una

capacitat de detecció de la trisomia 21 del 98 %, amb

un 0,5 % de falsos positius (5), i per tant és un

mètode de cribratge que necessita la comprovació

dels resultats patològics mitjançant un procediment

invasiu.

A fi d’optimitzar els recursos en el context actual de

la sanitat pública, s’hauria de plantejar una estratègia

de diagnòstic prenatal citogenètic que permeti el més

ampli poder diagnòstic amb el menor risc de pèrdua

fetal i amb un cost raonable.

Recomanacions

Tenint en compte les consideracions esmentades

anteriorment, es proposa la següent estratègia:

1. Distribució de les gestants en un dels dos grups:

població de risc (gestants amb indicació directa

de procediment invasiu per risc elevat) o població

general.

2. Cribratge universal, preferentment del primer

trimestre, al grup de població general.

En els casos positius (risc >= 1/250): es

recomana dur a terme un procediment

invasiu (biòpsia corial/amniocentesi).

o Si es realitza una biòpsia corial: es

recomana dur a terme un cariotip del

cultiu curt de vellositats (o QF-PCR) 2

més un cariotip del cultiu llarg.

o Si es realitza una amniocentesi: es

recomana dur a terme un QF-PCR més

un cariotip.

3. Gestants de risc elevat per una aneuploïdia

anterior.

Es recomana optar per fer un cribratge previ

o passar directament a un procediment

invasiu.





_____________________________________________

2 El cultiu curt dóna informació exclusivament fetal de tots els cromosomes (alteracions numèriques i estructurals). En cas de no disposar de la tècnica de cultiu curt, es pot obtenir una informació parcial del cariotip (aneuploïdies clàssiques) mitjançant QF-PCR. _____________________________________________

186 Sánchez Díaz et al. In vitro veritas 2013;14:184-186




un cariotip.

4. Gestants de risc elevat per una reorganització

cromosòmica equilibrada en el progenitor.

Es recomana dur a terme directament un

procediment invasiu.







un cariotip.

En cas de translocació robertsoniana amb

implicació del cromosoma 21 es podria plantejar

un diagnòstic no invasiu en la sang materna.

5. Gestants de risc elevat per detecció ecogràfica

de malformacions fetals.

Es recomana dur a terme directament a un

procediment invasiu (biòpsia corial,

amniocentesi o cordocentesi).

Es recomana realitzar una QF-PCR per

detectar les aneuploïdies més freqüents i

mantenir un cultiu de reserva.

o En cas positiu, estudiar el cariotip per

descartar les reorganitzacions

cromosòmiques.

o En cas negatiu, realitzar un estudi per

micromatriu. Si el resultat de la

micromatriu és anòmal, és important

realitzar el cariotip (o hibridació in situ

fluorescent, FISH, acrònim de l'anglès

fluorescence in situ hybridization) per esbrinar

el mecanisme implicat i establir el risc de

recurrència.

Recomanació addicional

És imprescindible el consell genètic abans i després

de qualsevol procediment.

Reflexió final

Quant al diagnòstic no invasiu en la sang materna, el

fet que tingui un cost elevat i que encara no es pugui

considerar totalment diagnòstic fa impossible

actualment la seva aplicació universal. En un futur

podria substituir l’actual cribratge.

Bibliografia

1. Hook EB. Chromosome abnormalities: prevalence, risk and recurrence. A: Brock DJH, Rodeck CH, Ferguson-Smith MA, dirs. Prenatal Diagnosis and Screening. Edimburg: Churchill Livingstone, 1992. p. 351-92.

2. Borrell A, Fortuny A, Lazaro L, Costa D, Seres A, Pappa S, Soler A. First-trimester transcervical chorionic villus sampling by biopsy forceps versus mid-trimester amniocentesis: a randomized controlled trial project. Prenat Diagn 1999;19:1138-42.

3. Servei Català de la Salut. Instrucció 01/98. Implantació del diagnòstic prenatal d’anomalies congènites a Catalunya.

4. Servei Català de la Salut. Instrucció 07/2008. Programa de diagnòstic prenatal d’anomalies congènites a Catalunya. <http://www20.gencat.cat/docs/canalsalut/Home%20Canal%20Salut/Professionals/Temes_de_salut/Salut_maternoinfantil/normativa/instruccio_07-2008.pdf>(accés: 2013-09-26).

5. Morain S, Greene MF, Mello MM. A new era in noninvasive prenatal testing. N Engl J Med 2013;369:499-501.

http://www20.gencat.cat/docs/canalsalut/Home%20Canal%20Salut/Professionals/Temes_de_salut/Salut_maternoinfantil/normativa/instruccio_07-2008.pdf



