Seente geneetika II

Heidi Tamm6. märts 2007

Suguline paljunemineSeened mudelorganismidenaTetraadide analüüsKomplementatsiooni testS. cerevisiae genoomProteoomika

Suguline paljunemineEt saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalikTsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui võimalik (et vältida geneetilist saastust)Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus

Isane või emane?

ei ole võimalik eristada

seened on hermafrodiitsed

Vegetatiivne kokkusobivusHeterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahelKui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult kontakteeruvad rakud surevad

Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus

Liitumise kokkusobimatus (fusionincompatibility) - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime liituda. (hallitusseentel)Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion…) – määrab ära, kas koos tsütoplasmaga saavad migreeruda ka tuumad jm. organellid

RistumissüsteemidOn määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist

Heterotallism – süsteem, kus on takistatud ristumine kahe identse gameedi vahel

Homotallism – kui miski ei takista identsete gameetide ristumist

Heterotallismanastomoos on võimalik ainult kahe erineva talluse vahel

90% kandseentest

Homotallismsuguline paljunemine saab toimuda ilma interaktsioonita kahe talluse vaheliseviljastumine

primaarne vs. sekundaarne homotallism

Primaarne homotallismidaneb ühetuumaline eos, moodustub kahetuumaline mütseel

tuumad on ühesugused

moodustuvad viljakehad

Sekundaarne homotallismkui peale meioosi satub ühte eosesse 2 tuuma

Ristumissüsteemid: unifaktoriaalneunifaktoriaalne ehk bipolaarneristumist kontrollib üks geen kahe alleeligaalleelide lahknemine meioosis tagab, et ühes eoses on vaid üks alleel.

Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on ristumistüübi lookuses erinevad alleelid.erinevad alleelid.

Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne

kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 50% juhtudest

N. crassa, S. cerevisiae, Puccinia graminis35% kandseentest

Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne

Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B).Bifaktoriaalne

Edukaks ristumiseks on vaja erinevaidalleele mõlemas lookuses

Ristumissüsteemid: bifaktoriaalnePopulatsioonis võib olla palju erinevaid alleele kummagi lookuse kohta

55% kandseentel

AB Ab aB abAB

aBAb

ab

Kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 25% juhtudest

Ristumisfaktorid: bifaktoriaalne“A” geen kodeerib homeodomääni valke (transkriptsioonifaktoreid)“B” geen kodeerib feromone ja nende retseptoreidkummalgi geenil on alamlookused

AB Ab aB abAB

aBAb

ab

Coprinus cinereus

Schizophyllum commune

S. cerevisiae ristumistüübi faktorid

2 ristumistüüpi: a ja αRistumistüüp määratud:

peptiidhormoonide (feromonide) poolt (α- ja a-faktorid)feromonispetsiifiliste retseptorite poolt

Kuidas ristumistüübi faktoridtoimivad?

Feromon seostub vastastüüpi raku pinnaloleva retseptoriga. Selle sündmusetagajärjed:

rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvadrakud kokkumõlema raku kasv peatub G1 faasismuutub rakuseina struktuur ja raku kuju

a-tüüpi rakkudes produtseeritakse:a-feromoniα-feromoni retseptorit

ja vastupidi

MAT lookusLookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või α1 ja α2)MATa1 represseerib a-feromoni retseptorija α-feromoni sünteesiMATa2 funktsioon teadmataMATα1 aktiveerib a-feromoni retseptori jaα-feromoni sünteesiMATα2 represseerib α-feromoni retseptorija a-feromoni sünteesi

Kui tuumad on ühinenud:Diploidid on alati MAT lookuse suhtesheterosügootseda1 ja α2 valgud moodustavadheterodimeeri, mis aktiveerib meioosi jasporulatsiooni ja represseerib haploidsedfunktsioonid

Et asi oleks tõeliselt segane...Pärmi haploidsed rakud saavad omaristumistüüpi muutaKontrollib geen HO (endonukleaas)Dominantse alleeli korral toimub see pealeigat raku jagunemist

HML MAT HMR

(kott)seened mudelorganismidenaSaccharomyces cerevisiae Aspergillus nidulansSchizosaccharomyces pombeNeurospora crassa

Saccharomyces cerevisiae kuimudelorganism

EukarüootLihtne kasvatadaVäike genoom kergestimanipuleeritavKasvab kiirestiMutantide isoleerimiselihtsusHästidefineeritudgeneetiline süsteemRekombinatsioon kõrge sagedusega

Saccharomyces cerevisiae kuimudelorganism

Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteemNii haploidne kui ka diploidne faas stabiilneMittepatogeenneMetaboolsed jaregulatoorsedmehhanismid kõrgeltkonserveerunudInimeste haigustegaseotud geenide ortoloogid...

Pärm: milliseid protsesseuuritakse?

Geeniregulatsioonraku koostisosade biosünteesmRNA translatsioonvalkude post-translatsiooniline modifitseeriminevalkude sekreteerimine

mitokondri biogeneesvõõrgeenide ekspressioon

Pärm: mida uuritakse?Rakutsükli regulatsioonSignaaliülekande mehhanismidKromosoomi struktuurDNA replikatsioonGenoomika

Neurospora ja AspergillusHaploidne vegetatiivne faas ja haploidsed

koniidid -

seeneniidistiku fenotüübi järgi saame tehajäreldused genotüübi kohta

Neurospora

Aspergillus

Neurospora ja AspergillusIga eoskott sisaldab 8 eost

peale meioosi toimub mitoos2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb üheeose tuuma

võimaldab algse DNA detailset analüüsiisegi heterodupleksi erinevused tulevad välja

(osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)

Magnaporthe griseaRiisi närbumistõve tekitaja (rice blast fungus)Genoomi suurus 40.3 Mb7 kromosoomi10% genoomist kordusjärjestused (> 200 bp)retrotransposoonidsagedane rekombinatsioon

Magnaporthe grisea

Magnaporthe grisearekombinatsioonide tõttu genoom muutliklooduses paljuneb mittesuguliseltgenoomi muutlikkus on seenele kasulik:

peremehespetsiifilisuse muutumine

kui kaotsi lähvad geenid, mis põhjustavad potentsiaalses peremehes kaitsereaktsioone

Seente transformatsioonKatsetatud paljudel seentelHead protokollid olemas üksikute jaoks:

SaccharomycesAspergillusNeurosporaUstilago

Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks?

Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv promootor ja terminaatorSeenerakud peavad olema kompetentsedSelektsioonisüsteem(Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)

Võimalused transformatsiooniksProtoplastTerve raku töötlemine Ca2+ ja Li+ ioonidegaElektroporatsioonGeenipüss (gene gun, particlebombardment)

YAC

N. crassa – tetraadide analüüsEoskotid kuikorrastatud tetraadid -alleelide kombinatsiooneostes vastab meioosi I ja II jagunemisele

meioos I - kahe(homoloogilise) kromosoomi lahkneminemeioos II - kahetütarkromatiidilahknemine

Tetraadide analüüsSaab jälgida rekombinatsiooni toimumist jakindlaks teha aheldatuse gruppeKottseened sobivad geenide meiootilisekskaardistamiseks Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühemeioosi tulemusMitme alleeliga geenide aheldusLookuse asukoht tsentromeeri suhtes

Tetraadide analüüs tänapäevalEt kindlaks teha mutatsiooni, mis vastabkonkreetse lookuse muutmiseleEt konstrueerida uusi tüvesidEt kindlaks teha geenide interaktsioone

Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB × ab

Eri tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud

AuksotroofidNeurospora crassa

Auksotroofsed mutandid, kes pole ühegeeni muteerumise tõttu võimelisedkasvama teatud söötmelKasv taastus, kui söötmele lisati ükskomponent

Esineb spetsiifiline sõltuvus konkreetse geeniprodukti ja metaboolse sammu vahel.

““ÜksÜks geengeen -- üksüks valkvalk” ” hüpoteeshüpotees

Auksotroofne organism sisaldab mutatsiooni, mis muudab organismi toitumisvajadusiPrototroof – metsiktüüpi organism muutmata toitumisvajadustega

Pärmi auksotroofsed markeridAminohapped

LeuHisTrp

NukleotiididUratsiilAdeniin

Mis on komplementatsioon?Kahe auksotroofi ristamisel saadud diploid on prototroof, kui defektid on erinevates lookustesAlleel, mis ühes haploidis on mutantne (retsessiivne), on teises haploidis funktsionaalne (dominantne)Mõlema haploidi wt alleelid kompenseerivad teise haploidi defektse alleeli

Mis on komplementatsioon?Kui defektid on samades lookustes, siis kahe auksotroofi ristamisel tekkiv diploid on auksotroof

Retsessiivne homosügootKa eri liikidelt pärit geenid võivad üksteist täiendada

Komplementatsiooni test

Haploidsete auksotroofide genotüüpide kindlakstegemiseksTundmatu genotüübiga haploid ristatakse teadaolevate genotüüpidega haploididega

peavad olema erineva ristumistüübiga

KomplementatsioonigrupidKui defektsete tüvede ristamisel ei toimu komplementatsiooni, kuuluvad nad samasse gruppiIga grupp esindab ühte ensüümi biokeemilises rajasSuuremahulised projektid võimaldavad identifitseerida kõik kompl. grupid => kõik geenid metaboolses rajas

Alati pole kõik nii ilus…Kahe lookuse suhtes heterosügootne diploid võib fenotüübilt olla ikkagi defektneAlleelne ehk geenisisene komplementatsioon – mutatsioonid on mõlemas tüves samas lookuses

Geenisisene komplementatsioonKui ensüüm koosneb kahest või rohkemast identsest subühikust

Kaks erinevalt defektset valku kompenseerivad teineteise vead

Kui ensüüm koosneb erinevatest domäänidest, mis täidavad erinevaid katalüütilisi funktsioonePärmis on tavaline

Kas siis ikkagi 1 või 2 lookust?Tetraadide analüüsRekombinatsiooni sagedus

väga madal => mutatsioonid samas lookuseskuni 25% => mutatsioonid erinevates lookustes

S. cerevisiae genoom sekveneeriti 1996Goffeau et al. 1996. Science 274: 546esimene täielikult sekveneeritud eukarüootnegenoom

Sekveneeritud seenedAscomycota

Saccharomyces cerevisiaestrain S288C 12

Saccharomyces cerevisiaestrain RM11-1a 12

Saccharomyces pastorianus 26Candida guilliermondii 12Candida lusitaniae 16Candida tropicalis 30Candida glabrata 12Ashbya gossypii 9Debaryomyces hansenii 10Kluyveromyces lactis 11Pichia stipitis 15Yarrowia lipolytica 21Schizosaccharomyces pombe 14Aspergillus nidulans 31Aspergillus fumigatus 32Aspergillus oryzae 37Aspergillus niger 37Chaetomium globosum 36Coccidioides immitis 29Nectria haematococca 52Fusarium graminearum 40Fusarium verticillioides 46

Mbp Magnaporthe grisea 40Neurospora crassa 43Stagonospora nodorum 37Trichoderma reesei 33Epichloë festucae 35

BasidiomycotaCoprinus cinereus 38Cryptococcus neoformans 20Ustilago maydis 20Phanerochaete chrysosporium 35

ZygomycotaRhizopus oryzae 40

MicrosporidiaEncephalitozoon cuniculi 2.5

Dictyosteliomycota (Protozoa)Dictyostelium discoideum 34

Oomycota (Chromista)Phytophthora ramorum 65Phytophthora sojae 95

S. cerevisiae genoom12 Mb (~200 korda väiksem inimesegenoomist, ~ 4 korda suurem E. coli genoomist)16 kromosoomiKromosoomide suurused 250-2500 kb~ 6000 ORF-iValke kodeerivad alad moodustavad 70% genoomist

S. cerevisiae genoom3.8% ORF-e sisaldab introneidJärjestikku ~ 120 rRNA geenide komplektikordust (XII kromosoomis)275 tRNA geeni51 Ty elementide koopiat(retrotransposoonid)

Schizosaccharomyces pombeGenoomi suurus 13.8 Mb3 kromosoomiPooldub, mitte ei punguKasutatakse raku kasvamise ja jagunemise uurimiseks

Genome Inventory (as of Apr 12, 2005)

Nuclear genome

Mitochondrial genome (Q)

Total ORFs 6591 6563 28Verified ORFs 4292 4275 17

Uncharacterized ORFs 1481 1479 2Dubious ORFs 818 809 9

Long_terminal_repeat 382 382 0tRNA 299 275 24

Transposable_element_genes 89 89 0ARS 82 82 0

snoRNA 68 68 0Retrotransposon 50 50 0

Telomere 32 32 0X_element_core_sequence 32 32 0

Telomeric_repeat 31 31 0X_element_combinatorial_repea 28 28 0

rRNA 27 25 2Pseudogenes 21 21 0

Y'_element 19 19 0Centromere 16 16 0

ncRNA 10 9 1snRNA 6 6 0Total 7783 7728 55

Sequence length (bp) 12,156,590 12,070,811 85,779

Feature Type Total

Genome Inventory (as of Apr 09, 2006)

Feature Type Total Nuclear genome

Mitochondrial genome (Q)

Total ORFs 6603 6575 28 Verified ORFs 4385 4368 17 Uncharacterized ORFs 1396 1394 2 Dubious ORFs 822 813 9 Long_terminal_repeat 382 382 0 tRNA 299 275 24 Transposable_element_genes 89 89 0 ARS 85 85 0 snoRNA 75 75 0 Retrotransposon 50 50 0 Telomere 32 32 0 X_element_core_sequence 32 32 0 Telomeric_repeat 31 31 0 X_element_combinatorial_repeats 28 28 0 rRNA 27 25 2 Pseudogenes 21 21 0 Y'_element 19 19 0 Centromere 16 16 0 ncRNA 9 8 1 snRNA 6 6 0 Total 7804 7749 55 Chromosome length (bp) 12,156,599 12,070,820 85,779

Genome Inventory as of Mar 05, 2007

Feature Type TotalNuclear genome

Mitochondrial genome(Q)

Total ORFs 6604 6576 28Verified ORFs 4534 4517 17Uncharacterized ORFs 1254 1252 2Dubious ORFs 816 807 9Long_terminal_repeat 382 382 0tRNA 299 275 24ARS 266 266 0Transposable_element_genes 89 89 0snoRNA 76 76 0Retrotransposon 50 50 0Telomere 32 32 0X_element_core_sequence 32 32 0Telomeric_repeat 31 31 0X_element_combinatorial_repea 28 28 0rRNA 27 25 2Pseudogenes 21 21 0Y'_element 19 19 0Centromere 16 16 0ncRNA 10 9 1snRNA 6 6 0Total 7988 7933 55Chromosome length (bp) 12,156,678 12,070,899 85,779

S. cerevisiae valke kodeerivad geenid

S. cerevisiaegeeniproduktide jaotus vastavalt bioloogilistele protsessidele

S. cerevisiae kromosomaalsete geenide nomenklatuur

Gene symbol DefinitionARG+ All wild-type alleles controlling arginine

requirementARG2 A locus or dominant allelearg2 A locus or recessive allele confering an arginine

requirementarg2– Any arg2 allele confering an arginine

requirementARG2+ The wild-type allelearg2-9 A specific allele or mutationArg+ A strain not requiring arginineArg– A strain requiring arginineArg2p The protein encoded by ARG2

S. cerevisiae mitokonderMitokondris leiab aset suur hulk biokeemilisi reaktsiooneOksüdatiivse fosforüleerimise teelprodutseeritakse ATP ja NAD+

Pärmid on fakultatiivsedfakultatiivsed anaeroobidanaeroobid, mistähendab, et nad saavad hakkama ka ilmamolekulaarse hapnikuta => võivadvõivad eladaeladailmailma funktsionaalsefunktsionaalse hingamisahelatahingamisahelata

Pärmi elu ilma hingamataEeldab sobivat süsinikuallikat (suhkrud)ATP süntees glükolüüsi ja kääritamisekäigusRakud kasvavad aeglaselt, kolooniad on väikesedKääritataval söötmel kasvab ka siis, kuimtDNA on mutantne või puudub üldse

Pärmi mitokondriaalne genoomSuurus ~ 80 kb (inimesel 16.5 kb)Lineaarne!Ühes haploidses pärmirakus ~ 50 mtDNAkoopiatKodeerib hingamisahela ensüümeÜlejäänud valgud kodeerib tuuma genoomTsütoplasmaatiline pärilikkus

Pärmi mitokondriaalne genoomehk ρ faktor

Metsiktüüpi pärmirakud (‘grande’), mis hingavadnormaalselt ja moodustavad suuri kolooniaid, on ρ+

‘Petite’ mutandid ei ole võimelised hingama janad moodustavad fermenteeritaval söötmel väikesikolooniaid

ρ0 rakkudel puudub mtDNA üldseρ- rakkudel esineb mtDNA, mis on moodustunud wt mitokondriaalse genoomi üksikutest fragmentidest, misesinevad paljude kordustena

‘petite’ - mutandidSaab eristada, ristates neid wt rakkudegaρ0 rakud annavad wt (‘grande’) järglased

keskmiselt supressiivsete ρ- rakkude järglasedon pooled ‘grande’ ja pooled ‘petite’

hüpersupressiivsete ρ- (HS) rakkude järglasedon peaaegu kõik ‘petite’

ρ- mtDNASisaldab wt mtDNA üksikuid fragmente, mis esinevad paljude kordustena

HS ρ- mutantidel on selliseks fragmendiksarvatavasti replikatsiooni alguskoht (ori)

Pärm ja genoomiuuringudDNA kiipide kasutamine transkriptoomiuurimiseksGeeni funktsioonide analüüs geenikatkestamise teelValkude lokalisatsiooni analüüs2D protein mapsEnsümaatilise aktiivsuse analüüsValk-valk interaktsioonide analüüs

Pärmid ja proteoomikaGeenijärjestuste analüüs vs. valkude analüüsValgud ei tegutse tavaliselt üksindaValgukomplekside analüüs

Pärmi proteoomi 2D-kaart

Kuidas analüüsida valk-valk interaktsioone?

Pärmi kaksikhübriidsüsteemmRNA sünekspressioonGeneetilised interaktsioonid ehk sünteetiline letaalsusIn silico meetodidValgukomplekside afiinsuspuhastamine + mass-spektromeetria

Pärmi kaksikhübriidsüsteemTranskriptsioonifaktor koosneb DNA-ga seonduvast domäänist ja aktivatsioonidomäänistDomäänid on eraldatud ja liidetud 2 uuritava ORF-igaPärmis ekspresseeruvad liitvalgud

Afiinsuspuhastamine ja mass-spektromeetria

Valkudele liidetakse peptiidne märgisAfiinsuskromatograafiaValk kui sööt terve kompleksi väljapuhastamiseksIdentifitseerimine mass-spektromeetria abil

TAP – tandem affinity purification

C-terminaalse TAP-märgise skeem. CBP – kalmoduliiniga seostuv peptiid, TEV – TEV proteaasilõikesait, ProtA - Staphylococcus aureus'e proteiin A