segundo informe biotec2

5/11/2018 segundo informe biotec2 - slidepdf.com

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0

“MUESTREO, AISLAMIENTO, SELECCIÓN, DE MICROORGANISMOS

CON ACTIVIDAD LIPASICA ”

CURSO : BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

DOCENTE : Dr. MSc. Ingº PELAEZ SANCHEZ, Pedro

INTEGRANTES : TRUJILLO GARIBAY, Luís

VARGAS MADERA, Sharon

TINGO MARÍA – PERÚ

2011



1

I. INTRODUCCIÓN

Existen una gran diversidad de microorganismos en la amazonia, los

cuales se presentan como potenciales en la producción de enzimas, sin

embargo, estos aun no han sido estudiados, en nuestro caso la investigación

se orienta a la búsqueda de microorganismos productores de lipasas, los

cuales podrían ser utilizados en la industria alimentaria; básicamente en la

modificación estructural del aceite de palma, aperturandose la posibilidad de

producción de lipasas a nivel piloto y posterior producción industrial. De ahí del

interés por la búsqueda de microorganismos productores de lipasas con alta

actividad catalítica para la industria alimentaria.

Objetivo:

Seleccionar cepas de microorganismos desconocidos que sean

productores de lipasas.

Determinar la cinética microbiana de los microorganismos productores

de lipasas.



2

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Consideraciones para selección de muestras

1. Tomar una muestra representativa del lote del alimento a ser analizado.

2. La porción de muestra pesada debe ser una muestra exacta.

Actualmente existe micro métodos donde la muestra es muy pequeña,

los resultados serán de poco valor a menos que la porción usada

representa la composición promedio del alimento.

3. Los alimentos y productos alimenticios son de composición variable,

siendo los de origen vegetal más que los de origen animal. Existen

cambios fisiológicos en los vegetales frescos, más que en los cereales,

legumbres de baja humedad. El cuidado que se deberá tener en el

muestreo depende del grado y el rango de variación natural en

composición del alimento fresco

4. Deberá tomarse suficiente material durante el muestreo para

compensar la variabilidad en la composición de los alimentos y

productos alimenticios

5. La cantidad de material seleccionada para el análisis puede ser

estimado por análisis estadísticos.



3

2.2 Aislamiento y selección de microorganismos productores de lipasas.

Para seleccionar los microorganismos productores de lipasas las

cepas aisladas se cultivan en medios (sólidos y líquidos) adecuados a los que

se adiciona triglicéridos (aceite de oliva) como inductor, además una fuente de

carbono (KOJIMA et al., 1199 y TORTORA, 1993); y luego de un periodo de

incubación, las colonias productoras de lipasa presentan a su alrededor halos

transparentes producidos por la hidrólisis de los triglicéridos presentes en el

medio de cultivo.

Muchas bacterias, levaduras, mohos y actinomicetos son

conocidas por secretar lipasa entre ellas tenemos los géneros Geotrichum,

Penicillium, Aspergillius, Rhizomucor, Saccharomyces y Candida (LOTTI et al ,

1993; STOCKLEIN et al ., 1993; TOMIZUKA et al., 1996; MIURA et al., 1997;

HABA et al ., 2000 y COCA et al ., 2001).

2.3 Lipasas.

Según FRIEDRICH (1994) las lipasas (tricylglicerol) son enzimas

que hidrolizas triglicéridos a ácidos grasos y glicerol; y que tienen la capacidad

de trabajar en presencia de moderadas o elevadas cantidades de disolventes

orgánicos, realizando reacciones de síntesis de esteres bien por reacción de

alcoholes y ácidos o vía transesterificacion por reacción de un ester con un

acido o con un alcohol (PROYECTO Lipasa 1997).

2.3.1 Producción de lipasas

La mayoría de las lipasas son producidas por procesos de

fermentación en cultivos sumergidos, entendiendo por estos aquellos en que



4

los nutrientes y microorganismos se encuentran en la fase acuosa con

diferentes procesos entre los que se incluyen batch, fed - batch y procesos en

continuo.

La fermentación según QUINTEROS (1993), es el

aprovechamiento bajo condiciones controladas de materiales biológicos tales

como microorganismos, tejido celular, animal, productos microbianos y

enzimas. Es decir, fermentación comprende microorganismos, anhídrido

carbónico y productos intra y extracelulares.

2.3.2 Temperatura y pH

Como en casi la totalidad de los procesos de fermentación

industrial, la temperatura es regulada a lo largo de la fermentación. La mayoría

de las lipasas trabajan a temperatura entre 30 a 40 ºC; pero algunos son

activos a temperaturas tan bajas como – 29 ºC (LÓPEZ, 2001).

Generalmente la temperatura y el pH de óptimo crecimiento del

microorganismo productor de enzimas coinciden con las condiciones de

máxima producción de la enzima. La mayoría de las lipasas presentan su pH

optimo entre 8 y 9+, también se ha reportado lipasa con pH optimo en el lado

acido (LOPEZ, 2001)

Aireación

La velocidad de aireación, según CRUEGER (1993), se ajusta a la

cantidad de oxigeno que se requiere, puede ser entre 0,25 – 1,0 v/vm (volumen

de aire / volumen de liquido por minuto).



5

2.4 Aceite de palma

El aceite de palma se obtiene del mesocarpio carnoso del fruto de

palma de aceite (elaeis guineensis). Tiene alto contenido de triglicéridos

sólidos; la relación es 1:1 entre ácidos grasos saturados e insaturados, lo cual

le da la consistencia deseada sin necesidad de hidrogenación. Además

contiene antioxidantes naturales como los tocoferoles.

Los subproductos de la palma aceitera son:

El aceite de palmiste, se obtiene de la almendra del fruto de la

palma de aceite (Elaeis guineensis )

El aceite refinado, blanqueado y desodorizado (RBD) así obtenido,

es un producto semisólido que requiere ser sometido a un proceso de

fraccionamiento a través del cual, mediante cambios de temperatura, se separa

la fracción liquida (oleína) de la fracción solida (estearina).

La oleína de palma es la fracción liquida obtenida del

fraccionamiento del aceite de palma (descrito anteriormente).

La estearina de palma es la fracción con punto de fusión elevado

obtenida del fraccionamiento del aceite de palma (descrito anteriormente). La

súper oleína de palma es la fracción liquida obtenida del fraccionamiento del

aceite de palma (descrito anteriormente) producido por un proceso de

cristalización controlado específicamente para obtener un índice de yodo de 60

o mas.



6

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Materiales:

Algodón

Asa de siembra

Autoclave

Modelo: AUT - 35

Serie: 0100 - 06

Voltaje: 220 VAC - 60 Hz

Potencia: 1550 Watts

Balanza analítica

Modelo: Electronic balance

Precisión + 0.001g

Voltaje: 220 v

Beaker (125ml, 250ml)

Cocina eléctrica

Cubetas

Espatula

Espectrofotómetro

Marca: Génesis

Modelo: 6

Hilo pavilo

Incubadora

Matraces Erlenmeyer ( 50ml, 250ml,1000ml)

Micro tubos



7

Mechero

Mortero y pilón

Papel krap

Placas Petri

Pipetas y Micropipeta (10000uL)

Probeta ( 50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)

Varilla de vidrio.

3.2 Reactivos

Agar

Agua destilada

Alcohol

Glucosa

Extracto de carne

Peptona

NaCl

Agar rosa de bengala

K2HPO4

Glicerol NH4Cl

KH2PO4

KCl

Mg, SO47H2O.

CaCl2

FeSO4; H2O



8

Extracto de levadura

Aceite de palma

3.3 Métodología

Recolección de muestra:

La muestra fue recolectada del distrito de Boqueron, provincia de Padre Abad,

departamento de Ucayali.

Fig. 1

Acondicionamiento de la muestra

Se pesó 10g de muestra y se trituró en un mortero y diluyo en 100 ml de

agua destilada.

Fig2. Fig3 fig4

SIEMBRA EN MEDIO YED Y LB.

Preparación de medio YED y LB



9

La preparación de medio YED y LB se ve en el cuadro 1 el cual son

las formulaciones para los medios a utilizar.

Cuadro Nº1

Medio Composición (% v/p)

Utilizado para

aislar

YED Glucosa, 2%; extracto de carne, 1%; agar, 1,5% Levaduras

LB Agar rosa de bengala, 3 % Hongos

BYPO Peptona, 1 %; extracto de carne, 0.8% NaCl,

0.5%; K2HPO4, 0.7%; agar, 1.5%

Colonias puras

Fuente: HOLMES Y CUNDLIFE,(1991) y FRENKEN et al., (1992).

Los medios YED y LB se colocaron en un matraz de 500ml, el cuál fue

llevado al autoclave por 30 min de tiempo, esperamos que baje su temperatura

hasta aproximadamente 40ºC para poder plaquear, en placas previamente

esterilizadas como muestra la figura:

Fig.5 MEDIO ( YED O LB) Fig.6 AUTOCLAVE ( MEDIO Y PLACAS) Fig.7 PLAQUEADO



10

Fig.8 SIEMBRA DE UNA ASADA DE LA MUESTRA

Este procedimiento se trata de realizar asépticamente, el ambiente fue

expuesto a luz ultravioleta por 24h previas al análisis para obtener el ambiente

adecuadamente aséptico.

INCUBACION

Se realizo la incubación a un rango de 28 a 29 ºC de temperatura, el medio

YED y LB con 3 repeticiones cada una por un tiempo de 24h a 48h con

placas invertidas.

Fig. 9



11

RESIEMBRA MEDIO YED Y LB

La resiembra o también llamado repique de se hace de las placas que

tuvieron crecimiento para seguir seleccionando una cepa de

microorganismo, el cual se sembró por el método de estrías.

Fig. 10. Colonias de m.o. fig.11 resiembra

SIEMBRA EN MEDIO BYPO SOLIDO

Se preparó el medio bypo sólido siguiendo la formulación descrita en el

cuadro 1, se realiza con el fin de adaptarlos al medio de selección, para lo

cual se pesaron los reactivos Peptona; extracto de carne, NaCl, K2HPO4,

agar, en base a 250ml de muestra, siguiendo con el método se selecciona

una colonia de cada placa que haya presencia de microorganismos, y con el

asa de siembra se procede a sembrar por el método de estrías, y se pone a

la incubadora en forma invertida de 28 a 29 ºC. por 24 a 48h

Fig. 12 crecimiento

en bypo solido



12

SIEMBRA EN MEDIO BYPO LIQUIDO

Las colonias que crecieron en medio bypo solido son transferidas a bypo

liquido, la preparación para este medio es descrito en el cuadro 1, solo que

no se adiciona agar, por que queremos en estado liquido. Con la ayuda de

una cocina eléctrica se diluye todos los reactivos y se trasladan la cantidad

de 50ml a matraces de 250ml, se coge una asada de las placas de medio

bypo solido que hayan crecido.

Fig. 13, preparación de bypo liquido Fig. 14 distribución en matraces

CONSERVACION EN GLICEROL

Los matraces que hayan presentado turbidez se guardan en microtuboscon glicerol en proporción 1/1 , las cuales se guardan 3 repeticiones de cada

matraz para poder tener mas posibilidades de conservarlas.

Fig. 15. conservación

En glicerol



13

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES:

Preparación de la muestra:

10g de fruto de palma se diluyo en 100 ml de agua destilada .

CUADRO Nº2 PREPARACION DE MEDIO YED

REACTIVOS Porcentaje(%) Peso en gramos (g)glucosa 2 5

extracto de carne 1 2,5agar 1,5 3,75Agua 100 250

CUADRO Nº3 SIEMBRA DE LA MUESTRA DILUIDA 1/10(10g en 100ml)

Se sembró una asada por el Método en estrías

MEDIO NUMERO COLONIASYEDy-1 1y-2 0y-3 0LBLB1 2LB2 2LB3 1

CUADRO Nº 4 RESIEMBRASe hizo el repique de las colonias encontradas en la siembra, el

cuál fue sembrado por el Método en estrías.

MEDIO NUMERO DE COLONIASYEDy-1 1LB

LB1 2LB2 2



14

LB3 1TOTAL 6

CUADRO Nº5 PREPARACION DE MEDIO BYPO SOLIDO

REACTIVOS Porcentaje (%) Peso en gramos (g)peptona 1 2,5

extracto de carne 0,8 2NaCl 0,5 1,25

K2HPO4 0,7 1,75

agar 1,5 3,75Agua 100 250

CUADRO Nº6 CRECIEMIENTO EN MEDIO BYPO SOLIDO

Se sembró por el Método en estrías

CODIGO CRECIMIENTO ( SI / NO)Y- 1 SILB1 SI

LB1 - R1 SILB1 - R2 SI

LB2 SILB2 - R1 SILB2 - R2 SI

LB3 SI

CUADRO Nº 7 PREPARACION DE MEDIO BYPOLIQUIDO

REACTIVOS Porcentaje (%) Peso en gramos (g)peptona 1 2,5

extracto de carne 0,8 2NaCl 0,5 1,25

K2HPO4 0,7 1,75

Agua 100 250



15

CUADRO Nº8 CRECIMIENTO EN MEDIO BYPO LIQUIDO

CODIGO TURBIDEZ (presencia / ausencia)Y- 1 PresenciaLB1

LB1 - R1 PresenciaLB1 - R2 Presencia

LB2LB2 - R1 PresenciaLB2 - R2 Presencia

LB3 Presencia

Seguidamente de cada matraz con presencia de turbidez se guardo por

triplicado en glicerol en proporción de 500uL de medio y 500uL de

glicerol, obteniéndose 18 microtubos, el cual se guardó en refrigeración

a 4ºC.

Se reanimaron en medio BYPO LIQUIDO y después se midio en el

espectrofotómetro a una lectura de 660nm en el cual se utilizo como

blanco agua desionizada, las primeras lecturas se realizaron cada 2

horas después de dos lecturas se realizaron cada 1h durante 24h

aproximadamente, o en tal caso de acuerdo a la curva de crecimiento

que se graficaron en el programa Sigma plot. Las lecturas de los

diferentes microorganismos se muestran acontinuación



16

CUADRO Nº9 LECTURA DE ESPECTROFOTOMETRO A 660 nm

PARA LB1

LB1TIEMPO ABSORBANCIA

0 0,0962 0,4764 0,1986 0,2067 0,2668 0,402

9 0,95810 1,63812 2,1313 2,2215 2,51417 2,87418 3,18419 3,27220 3,24821 3,36822 3,632

El cual muestra una curva de tendencia:

Fig. 16



17

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

700000000

800000000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Pero solo esta medida nos muestra la absorbancia, entonces necesitamos

saber el número de células existentes en nuestro medio para lo cual se obtuvo:

CUADRO Nº10 NÚMERO DE CELULAS LB1:

LB1TIEMPO # DE CELULAS

0 192000002 952000004 396000006 412000007 532000008 804000009 19160000010 32760000012 42600000013 44400000015 50280000017 57480000018 63680000019 654400000

20 64960000021 67360000022 726400000

Y la gráfica es la siguiente:

FIG 17



18


PARA LB2


0 0,1882 0,1314 0,1586 0,2297 0,5758 0,8479 1,316

10 1,74211 1,95212 1,791

Fig. 18



19

CUADRO Nº12 NUMERO DE CELULAS LB2


0 376000002 262000004 316000006 458000007 1150000008 169400000

9 26320000010 34840000011 39040000012 358200000

Fig. 19

0

50000000

100000000

150000000

200000000

250000000

300000000

350000000

400000000

450000000

0 2 4 6 8 10 12 14

# DE CELULAS VS TIEMPO (horas)



20


PARA LB3


0 0,164 0,4446 0,3497 0,3758 0,4959 0,956

10 1,48412 2,07913 2,2215 2,43317 2,52

Fig. 20

TIEMPO VS ABSORBANCIA

TIEMPO (HORAS)

0 5 10 15 20 25

A B S O R B A N C I A

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5



21


LB3

TIEMPO # DE CELULAS0 320000004 888000006 698000007 750000008 990000009 19120000010 29680000012 415800000

13 44400000015 48660000017 504000000

Fig. 21

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11



22


LB4

TIEMPO ABSORBANCIA0 0,1022 0,1584 0,1826 0,2637 0,2518 0,2699 0,36810 0,57

11 0,76912 1,40413 1,69415 1,99517 1,96818 2,2219 2,22320 2,38823 2,412

Fig. 22

TIEMPO VS ABOSRBANCIA LB4

TIEMPO (horas)

0 5 10 15 20 25

A b

s o r b a n

c i a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0



23


LB4

TIEMPO # DE CELULAS0 204000002 316000004 364000006 526000007 502000008 538000009 7360000010 114000000

11 15380000012 28080000013 33880000015 39900000017 39360000018 44400000019 44460000020 47760000023 482400000

Fig. 23

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

0 2 4 6 7 8 9 10 11 12 13 15 17 18 19 20 23



24

CUADRO Nº17 NUMERO DE CELULAS Y5

Fig. 24

Y5TIEMPO ABSORBANCIA0 0.1132 0.1464 0.26 0.2267 0.2668 0.4769 0.87510 1.09411 1.2412 1.67413 1.84815 2.0717 2.01918 2.29219 2.36723 2.526

TIEMPO VS ABSORBANCIA

TIEMPO (horas)

0 5 10 15 20 25

A B S O

R B A N C I A

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0



25

CUADRO Nº18 NUMERO DE CELULAS Y5

Y5TIEMPO # DE CELULAS

0 10481818.182 13481818.184 18390909.096 20754545.457 24390909.09

8 43481818.189 79754545.4510 99663636.3611 112936363.612 152390909.113 168209090.915 188390909.117 183754545.518 208572727.3

19 215390909.123 229845454.5

Fig. 25

0

50000000

100000000

150000000

200000000

250000000

1 3 5 7 9 11 13 15



26


Fig. 26


0 0.1822 0.1824 0.2096 0.3147 0.3578 0.3699 0.57710 0.866

11 1.1812 1.31413 1.515 1.55417 1.82718 2.00119 2.05220 2.27421 2.34

22 2.45723 2.124

TIEMPO VS ABOSRBANCIA

TIEMPO

0 5 10 15 20 25

A B S O R B A N C

I A

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0



27


Fig. 27

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19


0 3640002 3640004 4180006 6280007 7140008 738000

9 115400010 173200011 236000012 262800013 300000015 310800017 365400018 400200019 4104000

20 454800021 468000022 491400023 4248000



28

CUADRO Nº20 CINETICA MICROBIANA

MUESTRA r2 LN Ln No t u (hr-1) Td (Hr) LB1 0.9752 2.2278 0.9605 4 0.2103 3.30

LB2 0.9810 1.3495 0.5203 2 0.4765 1.45

LB3 0.9560 2.0876 1.0326 4 0.1760 3.94

LB4 0.9781 1.4868 0.9339 2 0.2325 2.98

Y5 0.9793 1.7394 0.7958 4 0.1955 3.55

LB0 0.9818 1.6803 0.8360 5 0.1396 4.96



29

V. CONCLUSIONES

En la primera parte de este informe se logró conservar cepas de

microorganismos que posiblemente sean capaces de producir lipasas.

Se determinó la cinética microbiana de los microorganismos productores

de lipasas.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CÁRDENAS, F. 1999. Búsqueda, selección y caracterización de nuevas lipasas

de origen microbiano. Tesis doctoral. Facultad de Farmacia, Universidad

Complutense de Madrid.

COCA, J., HERNANDEZ, O., BERRIO, R., MARTINEZ, S., DIAZ, E. y DUSTET,

J. 2001. Producción y caracterización de las lipasas de aspergillius Níger

y A. fumigatus . Biotecnología aplicada. La Habana – Cuba, 18:216-220.

JAY.J.M. 1981. Microbiología moderna de los alimentos. 2da ed. Edit. Acribia.

España. pp. 441.

TORTORA, J. 1993. Introducción a la Microbiología. 3 ed. Zaragoza, España.

Acribia s.a. p. 289.



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