MAKALAH ANALISIS FARMASI

SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

DISUSUN OLEH:

Gama Nindya Saputra 128114093

Prita Patricia 128114094

Lucia Effelin Cindya 128114096

Dionisius Laffyanto 128114100

Stanislaus Kris Bangkit Tri Putra 128114101

Bertha Nathania 128114102

Agatha Riona Octavianus 128114105

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

A. PRINSIP SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

Size Exclusion Chromatography (SEC) adalah metode kromatografi molekul

dalam larutan yang dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Nama lain dari size

exclusion chromatography yaitu gel filtration chromatography (GFC), gel permeation

chromatography (GPC), gel chromatography, steric exclusion chromatography, dan

exclusion chromatography. Kata “gel” merupakan konotasi dari fase diam yang

digunakan yaitu gel organik yang semirigid dan nonrigid, sedangakan SEC fase

diamnya yaitu gel yang organic atau organic yang rigid.

Size Exclusion Chromatography (SEC) biasa digunakan dalam pemisahan

molekul yang besar atau kompleks makromolekul seperti protein. Untuk pemisahan

yang biasanya makromolekul dalam fase gerak larutan disebut Gel Filtration

Chromatography sedangkan ketika pemisahan dilakukan di dalam fase gerak non-

larutan disebut Gel Permeation Chromatography.

Tujuan utama dari penggunaan metode Size Exclusion Chromatography (SEC)

ini adalah untuk memberikan informasi tentang distribusi berat molekul dari polimer-

polimer tertentu. Pada pemisahan ini informasi yang diberikan yaitu distribusi berat

molekul, karena adanya hubungan yang linear antara dimensi (ukuran molekul) dan

berat molekul pada rantai polimer bebas.

B. MEKANISME PEMISAHAN SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

Pada bagian pertama (1), sampel diperlihatkan setelah injeksi pada kepala

kolom, fase gerak melewati kolom dengan laju aliran yang tetap, dengan tekanan

gradient pada seluruh panjang kolom. Bagian kedua (2), sampel sudah masuk ke

dalam kolom, partikel dari fase diam merupakan pori-pori dengan ukuran pori yang

dikontrol. Bagian ketika (3) molekul yang lebih kecil mampu untuk menembus pori-

pori ketika melewati kolom, tetapi yang molekul lebih besar terlalu besar untuk

masuk kedalam pori-pori fase diam dan hanya berada di daerah interstitial. Molekul

yang lebih kecil tertahan sebentar pada pori yang dimasuki, hingga molekul yang lain

masuk ke dalam pori. Molekul yang lebih besar mengalir lebih cepat karena mereka

tidak masuk ke dalam pori-pori fase diam. Akhirnya dua molekul tersebut dipisahkan

dan menjadi 2 peak kromatogram yang berbeda terlihat pada bagian keempat (4).

a) Kelebihan SEC

Waktu pemisahan cepat

Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak bereaksi dengan fase diam

Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa mengganggu proses filtrasi

b) Kekurangan SEC

Hanya sejumlah frekuensi terbatas yang dapat diakomodasi karna skala watku

kromatogram pendek

Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran yang seragam seperti isomer

C. INSTRUMENTASI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

Secara umum instrumen SEC yang terdiri dari sebuah pompa untuk

mendorong pelarut melalui instrumen, port injeksi dilakukakan untuk memasukkan

sampel ke kolom, dan kolom berfungsi untuk menahan fase diam, sedangkan detektor

berfungsi untuk mendeteksi komponen ketika sampel meninggalkan kolom, kemudian

software akan berfungsi untuk mengontrol bagian-bagian yang berbeda dari

instrumen dan menghitung dan menampilkan hasil.

Pengukuran SEC dapat dilakukan dengan pengukuran HPLC, dimana sistem

terdiri dari penghantar pelarut, sistem mekanisme, dan sistem deteksinya. sistem

penghantar pelarut adalah rangkaian reservoir pelarut, degasser dan pompa aliran

pelarut. Sistem pemisahan terdiri dari injector sampel dan kolom SEC. Sistem deteksi

terdiri dari detektor, perekam strip-chart dan tabung pembuangan. Sistem penanganan

data digunakan untuk menganalisis SEC chromatogram dan menghitung rata-rata

berat molekul sampel. Pengukuran dapat digunakan di tempat perekam strip-chart.

Autosampler (autoinjector) yang digunakan untuk menyuntikkan sampel solusi ke

sistem pemisahan pada interval tertentu yang juga dapat digunakan dengan instrumen

HPLC.

Komponen yang digunakan dalam system kromatografi ini antara lain :

1. Kolom

Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul zat yang

akan dipisahkan. Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak

mampu  dipisahkan jika digunakan satu ukuran pori-pori dari kolom.

Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu

kurva  kalibrasi tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan

dengan  jelas karena distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar

maka akan  dihasilkan kurva dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian,

senyawa-senyawa  yang memiliki ukuran molekul hampir sama akan dihasilkan

daya pisah yang rendah  jika rentang kerja BM-nya besar. Sebaliknya, jika

distribusinya sempit maka akan  didapat kurva yang lebih mendatar. Sehingga,

rentang kerja BM akan menjadi lebih  kecil tetapi daya pisah molekul yang

memiliki ukuran hampir sama akan meningkat.  Pemisahan optimum komponen-

komponen suatu senyawa sampel yang  memiliki distribusi bobot molekul lebar

dapat diperoleh jika kolom eksklusi memiliki  rentang kerja BM yang berbeda.

Pada setiap rangkaian kolom dapat dihasilkan kurva  kalibrasi tersendiri dimana

perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan menyuntikkan senyawa baku (standar

baku) yang diketahui bobot molekulnya,  kemudian menentukan VR masing-

masing.  Dengan demikian, SEC merupakan suatu metode cepat yang  dapat

digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot molekul (BM) suatu  sampel

dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar baku.

Untuk  memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan

senyawa  standar baku haruslah sama.

2. Fase Gerak

Fase gerak dalam SEC harus merupakan pelarut polimer yang baik

untuk  menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang

sesuai dan  bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut

bertujuan agar pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain

memecahkan  agregat. Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka

dapat terjadi  peningkatan tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu

besar. Efek  tersebut dapat diatasi dengan cara memilih pelarut lain, atau

meningkatkan temperatur kolom.

Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar

terjadi  disagregasi, sedangkan beberapa polimer seperti polyolefin, biasa

digunakan untuk analisis  pada suhu tinggi (140-1500 °C). Bila analisis dilakukan

pada kondisi tersebut, maka  fase gerak yang bersifat toksik tidak dapat digunakan

(contoh: triklorobenzen),  sehingga perlu dipilih fase gerak yang lain. Fase gerak

dalam SEC terbagi menjadi  dua bagian besar, yaitu:

Fase gerak untuk protein dan polimer larut air

SEC sering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan

agregat,  desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau

untuk mengetahui  sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat,

sediaan farmasi, dan  sebagainya. Fase gerak yang digunakan disesuaikan

dengan fase diam, antara lain:

1) Silika

Jenis kolom SW, SWxI, dan Super SW digunakan untuk menganalisis

protein dan asam nukleat, menggunakan aqueous buffer sebagai fase

gerak.

2) Polimetakrilat

Jenis kolom PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer

karida, asam nukleat virus, menggunakan fase gerak berupa

larutan  buffer atau larutan garam. Kolom PWxI yang digunakan untuk

menganalisis  polimer kationik menggunakan fase gerak berupa larutan

garam encer.

Contoh pelarut mengandung air yang sering digunakan sebagai fase

gerak  dalam SEC yaitu buffer fosfat (pH 7,0), larutan KCl dan larutan NaCl.

Fase gerak SEC untuk polimer non-polar dan polimer larut dalam pelarut

organik.

Fase gerak SEC untuk polimer non-polar dan polimer larut dalam pelarut

organik  SEC sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organik polar

dan  polimer larut dalam pelarut organik. Pemilihan pelarut organik didasarkan

atas efek  partisi dan adsorpsi pelarut. Jenis fase gerak yang digunakan

disesuaikan dengan fase  diam, antara lain:

1) Polimetakrilat (high % X-linking)

Jenis kolom Alpha dan Super AW menggunakan fase gerak berupa

pelarut  organik polar seperti metanol, asetonitril, DMF, DMSO, THF,

dan HFIP.

2) Polistirena

Ada dua jenis kolom, yaitu kolom Ultra-low Adsorption (contoh: Super

HZ,  Super Multipore HZ, HxI dan Multipore) menggunakan pelarut

yang terbatas,  dan kolom Low Adsorption (contoh: Super H dan Hhr)

dapat menggunakan  pelarut yang lebih bervariasi.

3. Detektor

Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan

sistem  detektor yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor

UV-Vis.  Intensitas detektor direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem

dikalibrasi  dengan menggunakan polimer sampel yang diketahui berat molekulnya,

dapat  dilakukan dengan evaluasi berat molekul dan distribusi berat molekul

menggunakan  detektor sinar menyebar (light scatter detector), berat molekul

polimer dapat  ditentukan secara langsung dan tidak perlu dikaliberasi terlebih

dahulu. 

Untuk mendapatkan data yang tepat dan akurat dapat digunakan SEC, dimana

terdapat sedikit perbedaan pada alat yang digunakan dalam HPLC konvensional. Ada

beberapa ketentuan yang perlu diperhatikan dalam SEC. Pertama, perlu digunakan

pompa kualitas tinggi yang membuat laju alir lebih konstan dalam memompa pelarut

yang digunakan. Kedua, katup loop harus digunakan untuk menyuntikkan larutan

sampel, dan ketiga, suhu kolom harus dijaga agar konstan.

D. PREPARASI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

1. Pemilihan fase gerak

Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:

a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam

b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem SEC sehingga dapat

dijalankan dengan range tekanan yang normal.

c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang kuat

dengan fase diam (contoh: lewat adsorpsi).

Fase gerak yang digunakan dapat berupa fase gerak larutan, fase gerak organik

atau dalam larutan buffer.

2. Pemilihan fase diam

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat

porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau

berdifusi lewat fase diam.

Fase diam optimum yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:

a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel

b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak, tetapi tidak

mengalami efek pembengkakan.

c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur

d. Harus memiliki volume pori yang cukup dan berbagai ukuran pori

sehingga dapat melakukan distribusi berat molekul sampel yang memadai.

Fase diam yang digunakan biasanya terdiri dari dekstrosa, agarosa,

poliakrilamid atau silika yang memiliki sifat fisik yang berbeda. Jenis ukuran

pori yang ada pada fase diam ini berkisar 60-4000 Å dengan ukuran partikel

berkisar 5-10 µm dengan efisiensi ribuan theoritical plate setiap 15 cm kolom.

Untuk fase gerak organik, kolom yang biasa digunakan yaitu crosslinked

(dengan difinilbenzen) gel polistiren atau trimetilsilane turunan silika. Untuk

fase gerak larutan yang digunakan yaitu crosslinked hidroksilat polimetakrilat

atau gel poli(propilen oksida) atau gliseril (diol) turunan silika. Contoh fase

diam yang dapat digunakan pada Size Exclusion Chromatography:

Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesis

dari polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus hidroksil

menyebabkan dekstran menjadi polar sehingga dapat direaksikan dengan

epiklorhidrin CH2(O)CHCH2Cl. Polimer yang terjadi dapat dikontrol

dengan penambahan asam.

Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang dibuat

dengan kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N’ metal-bis-akrilamid.

Senyawa ini tidak larut dalam air maupun beberapa pelarut organik.

Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul >500.000

, dinamakan juga Bio-Gel A. dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga

agak lunak dan tidak tahan tekanan tinggi.

Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali

dalam air dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organic. Stiragel

dibuat dari polistiren yang tahan pada suhu di atas 150⁰C. berat molekul

senyawa yang dapat dipisahkan antara 16.000 – 40.000 dalton.

3. Penyiapan sampel

Sampel harus bebas dari patikel, terutama untuk partikel yang

berukuran 34 mikrometer atau kurang; kemudian dilakukan ekstraksi clean up,

sentrifugasi dan filtrasi. Campuran ekstrak sampel kemudian difiltrasi, dimana

campuran sampel terbut melewati membran filter yang memisahkan sampel

padat dari solut. Kemudian pelarut mencuci sampel dari filter ke bejana

pengumpul. Dua atau tiga kali dicuci dapat mencegah pengurangan sampel.

Kemudian sampel disentrifugasi dan ekstras didecanter dan dipisahkan.

Residual sampel dicuci 2 sampai 3 kali. Buffer sampel tidak sama dengan

buffer kolom. Buffer sampel yang dipilih adalah buffer yang membantu

stabilitas dan aktivitas protein. Buffer harus mempertahankan kapasitasnya dan

pH yang konstan. Buffer yang dapat digunakan yaitu 0.05 M Natrium fosfat,

0.15 M NaCl pH 7 atau buffer sampel dimana proteinnya dapat larut dan stabil.

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada waktu preparasi sampel:

- Sampel harus larut semuanya. Lakukan sentrifugasi atau filtrasi untuk

memisahkan partikel yang tidak larut.

- Temperatur kolom dan buffer harus sama untuk menghindari masuknya

udara ke dalam kolom

- Jika menggunakan sampel yang baru gunakan 0.55 mM Natrium Fosfat,

0.5 mM NaCl, pH 7

- Jika menggunakan konsentrasi yang tinggi, turunkan kecepatan sentrifugasi

dan perpanjang waktu.

E. DETEKSI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

Detektor digunakan untuk memantau perubahan konsentrasi fase diam pada

kolom dengan mengukur konsentrasi atau berat solut dalam kolom. Setelah pemisahan

sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem  detektor yang berbeda-beda,

misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis.  Intensitas detektor direkam

sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikaliberasi  dengan menggunakan

polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat  dilakukan dengan evaluasi

berat molekul dan distribusi berat molekul menggunakan  detektor sinar menyebar

(light scatter detector), berat molekul polimer dapat  ditentukan secara langsung dan

tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu. 

Detektor diklasifikasikan dalam 3 kelompok yaitu detektor konsentrasi,

detektor selektifitas struktur; detektor berat molekul.

1. Detektor berdasarkan konsentrasi

Detektor ini dianggap sebagai detektor universal yang mengukur perubahan fisik

tertentu dari fase diam, contohnya RID (Refraction Index Detector), Flame

Ionization Detector.

2. Detektor selektifitas struktur

Detektor selektifitas struktur mengukur hal yang spesifik dari solut dan hanya

sensitif pada satu komponen sampel. Contohnya yaitu detektor fluoresens, spektro

massa, dan fotometer UV dan inframerah

3. Detektor berat molekul

Contohnya yaitu viskometer, detektor penghamburan cahaya juga sensitif pada

berat molekul dan konsentrasi solut pada fase diam.

F. APLIKASI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)

SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekuler seperti

protein dan polimer industri terutama digunakan untuk memisahkan

molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot molekul dari

polimer. Contoh aplikasi SEC yaitu:

1. Pemisahan campuran peptida yang terdiri dari Insulin, Glukagon, Angiotensin I,

dan Bradikinin asetat.

Pada pemisahan peptida ini, sistem fase yang digunakan yaitu untuk fase diam

yaitu Zenix™-80 (3 µM, 80 Å, 7.8x300 mm) dan Fase Gerak: Asetonitril dengan

0,1 % TFA dan air, garam konsentrasi tinggi dan tambahan metanol. Kecepatan

alirnya yaitu 0,8 mL/menit.

Bahan dan Metode:

Bahan-bahan yang digunakan: Garam Bradikinin asetat, MW 1,060 Da

Angiotensin I Asetat MW 1,297 Da; Glukagon, MW 3,483 Da; Insulin dari

Pankreas, MW 5,778 Da. Semua sampel peptida dibeli dari Sigma Aldrich.

5mg/mL larutan stok dibuat dengan asam asetat 50 MM. untuk injeksi sampel,

larutan stok kemudian diencerkan dengan asam asetat 50 mM konsentrasi yang

diinnginkan. Sekuensing dimodifikasi dengan tipsin yang dibeli dari promega.

Kemudian dilakukan kromatografi

Hasil: Pada gambar I A menunjukkan profil pemisahan dari 4 peptida dengan

fase gerak 25 mM Sodium Asetat/300 mM NaCL, PH 4.5. Empat peptida tidak

memisah dengan penambahan garam. Ketika fase gerak diubah menjadi 50 mM

Fosfat, 30 % MeOH dan 0.1 % TFA, empat peptida memisah tetapi tidak menurut

urutan berat molekul. Pada gambar I B, menunjukkan profil pemisahan dengan

urutan elusi yaitu Insulin, Bradikinin, Angiotensin I, dan Glucagon. Kombinasi

dari metanol dan TFS tidak kuat untuk mengganggu interaksi antara matriks kolom

dan peptida. Itu, tidak dapat dicapai pemisahannya menurut ukuran molekul

Ketika fase gerak diganti dengan TFA/sistem asetonitril, semua peptida elusi

lebih cepat dari waktu retensinya dan pemisahannya lebih meningkat. Interaksi

fase padat dan peptida dikecilkan dengan penambahan konsentrasi asetonitril. Pada

gambar 2 terlihat pemisahan yang baik pada fase asetonitril. Untuk mencapai

pemisahan peptida, konsentrasi asetonitril yang optimal yaitu 75% dalam larutan

0.1 % TFA. Jadi urutan pemisahan peptida yaitu Insulin, Glukagon, Angiotensin I

kemudian Bradikinin, yang sesuai dengan berat molekulnya yaitu : Garam

Bradykinin asetat, MW 1,060 Da Angiotensin I Asetat MW 1,297 Da; Glukagon,

MW 3,483 Da; Insuin, MW 5,778 Da.

2. Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri Lokal dan Aplikasinya dalam Reaksi

Esterifikasi

Pada pemurnian enzim lipase digunakan Gel Permeation Chromatography

dengan sistem fase yaitu fase diam menggunakan sephadex G-100 dan larutan

buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Enzim lipase diperoleh dari

produksi enzim lipase dilakukan dengan cara yaitu, 100 ml inokulum dimasukkan

padaerlenmeyer 1000 ml yang berisi media fermentasi kemudian diinkubasi

selama 24 jam dengan pH 8 dan suhu 35ºC. Setelah itu dilakukan sentrifugasi

dengan kecepatan 5000 rpm selama 15menit. Filtrat hasil sentrifugasi disebut

ekstrak enzim kasar. Ekstrak kasar tersebut kemudian digunakan dalam proses

pemurnian hingga aktivitas esterifikasinya.

Pemurnian Enzim Lipase:

Fraksinasi Amonium Sulfat

Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan

fraksinasi bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat

kejenuhan (0-20%), (20-40%), (40-60%), (60-80%)  dan (80-100%). 

Fraksinasi dengan amonium sulfat dilakukan dengan cara menambahkan

amonium sulfat sedikit demi sedikit pada larutan ekstrak kasar enzim sambil

diaduk dengan pengaduk magnet. Pengadukan diusahakan sedemikian rupa

sehingga tidak menimbulkan busa selama kurang lebih 20 menit. Setiap

endapan protein enzim yang didapat dipisahkan dari filtratnya dengan

menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit

kemudian dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 8 dengan konsentrasi 0,05

M lalu diuji aktivitasnya menggunakan Metode titrimetri dan ditentukan kadar

proteinnya menggunakan Metode Lowry. Fraksi yang memberi aktivitas

tertinggi diuji aktivitas esterifikasinya.

Dialisis

Endapan enzim hasil fraksinasi bertingkat yang memiliki aktivitas tertinggi

dilarutkan kedalam buffer fosfat pH 8; 0,05 M selanjutnya dimasukkan

kedalam kantong selofan, kemudiandidialisis menggunakan buffer fosfat pH 8;

0,05 M selama ± 48 jam pada suhu 4ºC.

Kromatografi Kolom

Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan

kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100 sebagai fase

diam. Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang

berfungsi sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi

sebagai fase gerak. Sampel enzim yang memiliki bobot molekul lebih besar

dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan lebih

dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil akan

masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah

proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15 ml.

Eluen yang telah ditampung pada

wadah kemudian diukur kadar protein dan aktivitas enzimnya. Fraksi yang me

mberikan aktivitas tinggi dikumpulkan dan dikarakterisasi serta

ditentukan aktivitas esterifikasinya.

G. DAFTAR PUSTAKA

http://www.harvardapparatus.com , Guide to Gel Filtration or Size

Exclusion Chromatography, diakses pada tanggal 23 April 2014 pukul

06.10 WIB.

Jie W., Arakawa, T., Philo, J. S., 1996, Analytical Biochemistry: Size Exclusion

Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive

Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions, Protein Chemistry

Department, Amgen Inc., Thousand Oaks, California.

Mori, Sadao, 1999, Size Exclusion Chromatography, Springer-Verlag, Berlin, p. 4,

31-32, 37.

Nurhasanah, Herasari, D., 2008, Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri Lokal dan

Aplikasinya dalam Reaksi Esterifikasi,Seminar Nasional Sains dan Teknologi-

II, Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung, Bandar Lampung, hal. 267-

277.

Tosoh, 2014, Principles of Size Exclusion Chromatography,

http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/

Resource Center /Principles of Chromatography/Size Exclusion/, diakses pada

tanggal 17 April 2014 pukul 22.59 WIB.

Wu Chi-san, 1995, Handbook of Size Exclusion Chromatography, Marcel Dekker, Inc,

New York, p.1-3, 8-9, 16-17.