Stoffwechselprodukte_Substrate.pdf

Klinische Chemie u. Pathobiochemie

für Studenten der Biochemie

Stoffwechselprodukte und Substrate

Markus Thaler/Peter B. Luppa

Die Metabolit-Kenngrößen, die klinisch

relevant sind, haben eine relativ hohe

Serumkonzentration und können daher

mittels spektralphotometrischer Verfahren

quantifiziert werden.

Der optische Test (Spektralphotometrie)

E = Extinktion

e = Extinktionskoeff.

c = Konzentration

d = Schichtdicke

e = charakteristische

Stoffkonstante

abhängig von:

Wellenlänge

Temperatur

pH-Wert

Lambert-Beer'sches Gesetz: E = e

x c x d

Eichkurve

(mind. 2 bekannte

Substratkonz.)

Standard

Extinktionskoeff.

l

l

l

Auswertung:

Störeinflüsse in der Spektralphotometrie

Definition

Der optisch-enzymatische Test ist

ein photometrisches Messverfahren,

das der Aktivitätsbestimmung von

Enzymen oder der Bestimmung von

Substratkonzentrationen unter

Zuhilfenahme von Enzymen dient.

Voraussetzungen

Um die Aktivität eines Enzyms zu

messen, müssen alle an der Reaktion

beteiligten Stoffe im Überschuss vor-

liegen, die Messung im pH-Optimum

erfolgen sowie auf eine standardisierte

Temperatur geachtet werden.

Man unterscheidet den einfachen optisch-enzymatischen Test

und den zusammengesetzten optisch-enzymatischen Test.

Einfach optisch-enzymatischer Test

Die Aktivität von Enzymen, die NAD+ oder NADP+ als Kofaktor benötigen, wird mittels des

einfach optisch-enzymatischen Tests gemessen. Solche Tests sind auf NAD- bzw. NADP

abhängige Dehydrogenasen beschränkt, z. B. Lactat-Dehydrogenase, Malat-

Dehydrogenase, Glucose-6P-Dehydrogenase.

Grundlage ist dabei die Änderung des Absorptionsmaximums des Cofaktors. In der

reduzier-ten Form als NADH bzw. NADPH liegt das Absorptionsmaximum der

Cofaktoren bei 340 nm; kommt es zur Oxidation liegt es bei 260 nm. Diese Änderung

wird mittels eines Photometers gemessen und anschließend mittels des Lambert-

Beer’schen Gesetzes die Konzentration des Substrates berechnet, die in einer

bestimmten Zeit umgesetzt wurde.

Zusammengesetzter optisch-enzymatischer Test

Zusammengesetzte optische Tests müssen stets dann angewandt werden, wenn die

Test-reaktion selbst nicht von einer NAD- bzw. NADP-abhängigen Dehydrogenase

katalysiert wird. In diesem Fall muss der Testreaktion eine Indikatorreaktion nach-

geschaltet werden, in der ein Produkt der Testreaktion in einer NAD- bzw. NADP-ab-

hängigen Reaktion oder einer anderen photometrisch quantifizierbaren (Farb-)Reaktion

weiter umgesetzt wird.

Beispiel: Triglyceridbestimmung im Serum (GPO-PAP-Methode)

Methode nach Wahlefeld: Lipoproteinlipase hydrolysiert TG zu Glycerin + freien

FS. Das Glycerin wird durch die Glycerokinase zu Glycerin-3-phosphat

umgesetzt, welches dann mittels der Glycerin-Phosphat-Oxidase zu Dihydroxy-

acetonphosphat und H2O2 oxidiert wird. H2O2 wird in einer Endpunktsreaktion

unter der Katalyse einer Peroxidase mit 4-Aminophenazon zu einem roten

Farbstoff umgesetzt.

Klinisch-chemisch relevante

Stoffwechselprodukte

und Substrate

1. Bilirubin

Portalfeld mit Glisson-Trias

Zentralvene

Gallengang

Leberarterien-

Kapillare

Ast A. hepatica

Zentralvene

Lobulus

Gallengang

Pfortaderast

Schema des Leber-Lobulus

Pfortaderast

Bilirubin ist ein gelbbrauner Gallenfarbstoff, der dem Serum die

gelbe Farbe verleiht.

Der Metabolit wird zu etwa

•90%

als albumingebundenes Bilirubin bei dem im retikulohistiozytären System (Milz,

Leber) erfolgenden oxidativen Abbau des Hb`s über seine Vorstufe Biliverdin

gebildet, sowie bei der Hämoglobin-Synthese aus Protoporphyrin IX freigesetzt,

10%

katabolisch aus anderen Hämoproteinen (Myoglobin, Cytochrome u.a.) gebildet.

Bilirubin IXa wird durch Oxidation von Häm und Reduktion des

resultierenden Biliverdin IXa produziert

Bilirubinstoffwechsel in der Leber

Gallengang Hepatozyt

Bestimmungsmethode für Gesamt-Bilirubin im Serum:

Kupplung mit Diazoniumsalzen

mittlere Methylengruppe

des unkonjugierten

Bilirubins reagiert bei

Azokupplung erst in

Anwesenheit sog.

Akzeleratoren (Coffein,

Methanol o.ä.) →

„indirektes“ Bilirubin

Bt = Bu + Bc + Bd

Konjugiertes Bilirubin: reagiert sofort bei Azokupplung → „direktes“

Bilirubin

Unkonjugiertes Bilirubin: intramolekulare Wasserstoffbrücken

Die verschiedenen Methoden zur Best. der Bilirubins (z.B. Jendras-

sik-Grof, DPD-Methode, DCA-Methode) unterscheiden sich nur in der

Art des Diazoniumsalzes und in den verwendeten Akzeleratoren.

Bilirubin-Bestimmung: Endpunktmessung mit Probenleerwert

Extinktion x 10000 Bichromatische Messung:

Durch Messen bei zwei

Wellenlängen werden

störende Einflüsse wie

Partikel oder Luftblasen

im Strahlengang eliminiert.

Prähepatischer Ikterus:

Hämolyse, ineffektive Hämatopoese

hoher Hb-Abbau Bilirubin indirektes

Bilirubin erhöht:

¨ korpuskuläre hämolytische Anämie

¨ extrakorpuskuläre hämolytische Anämie

(Transfusionsreaktion, Medikamente)

¨ Icterus neonatorum / Morbus hämolyticus

neonatorum

¨ große Hämatome

¨ primäre Shunt-Hyperbilirubinämie (selten)

¨ Rhabdomyolyse

¨ Verbrennungen

Posthepatischer Ikterus:

extrahepatische Cholestase

direktes Bilirubin erhöht

¨ Choledocholithiasis

¨ Gallengangskarzinom

¨ Pankreas(kopf-)karzinom

¨ Gallengangsatresie

¨ Abstoßungsreaktion nach Leber-

transplantation

¨ Ascaris-Infektion

Intrahepatischer Ikterus (I):

gestörter Bilirubin-Stoffwechsel der Leber (Aufnahme, Konjugation, Sekretion) oder gestörter Galle-

abfluss in der Leber (intrahepatische Cholestase) je nachdem ob Störung vor oder nach der

Konjugation liegt, ist indirekets oder direktes Bilirubin erhöht:

¨ primäre Störungen des Bilirubinstoffwechsels:

¨ Morbus Gilbert = Morbus Meulengracht (häufig!):

autosomal-dominant vererbt

Störung der Aufnahme unkonjugierten Bilirubins, Verminderung der UDP-Glukuronyltransferase

Manifestation zw. 20. und 40. Lj.

intermittierender Ikterus

indirektes Bilirubin erhöht

gute Prognose

¨ Criggler-Najjar-Syndrom:

Typ I: aut.-rez. vererbt, fehlende UDP-Glukuronyltransferase, Prognose schlecht

Typ II: aut.-dom. vererbt, Aktivitätsminderung der UDP-Glucoronyl-Transferase, Prognose gut

indirektes Bilirubin erhöht

Intrahepatischer Ikterus (II)

primäre Störungen des Bilirubinstoffwechsels (Fortsetzung):

¨ Dubin-Johnson-Syndrom:

autosomal-rezessiv

Exkretionsstörung von Bili in den Gallengängen


Prognose gut

¨ Rotor-Syndrom:

autosomal-rezessiv

gestörte Aufnahme und Ausscheidung des Bilirubins in die Leberzelle

chronischer Ikterus


Prognose gut

Intrahepatischer Ikterus (III)

Sekundäre Störungen des Bilirubinstoffwechsels (Leberparenchym-Schäden):

¨ intrahepatische Cholestase

¨ (Virus-)Hepatitis

¨ Leberzirrhose

¨ Fettleber

¨ Leberzellkarzinom, -metastasen

¨ Intoxikationen, z.B.:

¨ Alkohol

¨ Drogen

¨ Pilzvergiftungen

¨ Lösungsmittel

¨ Sepsis (Endotoxine)

¨ Cholangitis

¨ Salmonellen

¨ Leptospirose

¨ Icterus neonatorum (u.a.)



und Substrate

2. Creatinin

Creatinin ist ein Ausscheidungsprodukt, das durch spontane Dehydratation des

körpereigenen Creatins gebildet wird.

Creatin ist vor allem im Muskelgewebe vorhanden, und zwar als Creatin-P, wo

es als wichtiger Energiespeicher für die Bildung von ATP dient.

Die Creatininbildungsrate ist annähernd konstant: innerhalb von 24 Stunden

werden 1 bis 2 % des körpereigenen Creatins in Creatinin umgewandelt.

spontan

- H20

NH

CH3

CH2

COOH

NH

NH2

NH

CH3

CH2

COOH

NH

O4P-NH

N

NH

NHO

CH3

+ ATP/-ADP

CK

Creatin

Creatinphosphat Creatinin

-PO4

Als Bestimmungsmethoden für das Creatinin im Serum

stehen die Jaffe-Methode, verschiedene enzymatische

Methoden und die Hochdruckflüssigkeitschromatogra-

phie (HPLC) zur Verfügung. In der Routine wird häufig

die relativ unspezifische, aber kostengünstige Jaffe-

Methode eingesetzt, aber auch enzymatische Methoden

wie der Creatinin-PAP-Farbtest (mit Creatininase +

Creatinase + Sarkosinoxidase) werden angewandt.

Richtwerte im Serum:

Männer: 0,6 – 1,2 mg/dl (53 - 106 µmol/l)

Frauen: 0,5 – 1,0 mg/dl (44 - 89 µmol/l)

Enzymatische Creatininbestimmung

Creatinin ist zur Abschätzung der glomerulären Filtra-

tionsrate (GFR) geeignet, da:

Es frei glomerulär filtriert und

Konstant tubulär rückresorbiert wird.

Es wird tubulär nicht sezerniert!

Es sind also Bildungs- und Eliminationsraten gleich!

Ein Anstieg des Creatinin-Spiegels im Blut spricht für eine

Verschlechterung der Nierenfunktion!

Problem: „Creatinin-blinder“ Bereich

Creatinin-Konz. im Serum steigt erst an, wenn die

GFR auf 50% oder weniger reduziert ist!

obere Referenzbereichsgrenze

für Serum-Creatinin

Die Creatinin-Clearance bezeichnet das pro Zeiteinheit durch die Niere von

Creatinin (theoretisch) befreite Plasmavolumen.

Sie wird herangezogen zur Abklärung

eines grenzwertigen oder pathologischen Creatininwertes im Serum

bei pathol. Harnwerten, z. B. pos. Urinsediment bei normalem Creatinin

Erfassung einer möglichen Nierenfunktionsstörung

Diese erlaubt nicht die direkte Messung der GFR, sondern nur eine

Abschätzung deren Größenordnung. Zur klinischen Klärung der folgenden

Fragestellungen ist dies jedoch zumeist ausreichend:

Feststellung einer reduzierten Creatinin-Clearance im sog. Creatinin-

blinden Bereich (60 < GFR < 150 ml/min)

Verlaufsüberwachung einer Therapie mit potentiell nephrotoxischen

Medikamenten

Festlegung des Zeitpunktes einer Dialyse (als Grenzwert gilt eine

Creatinin-Clearance von 5 ml/min/1.73 m²)

Die Creatinin-Clearance lässt sich folgendermaßen bestimmen:

Beginn der 24-h-Urin Sammlung mit dem zweiten Morgenurin.

Mit Sammlung des ersten Morgenurins am zweiten Tag Beendigung der

Urinsammlung. Abnahme einer Serumprobe.

Bestimmung des Urin-Creatinins im 24-h-Sammelurin und des Serum-Creatinins.

Berechnung der Creatinin-Clearance C (ml/min/1.73 m²): Dazu müssen neben den

Werten des Creatinins im Serum und im 24-h-Sammelurin auch die Körpergröße

und das Körpergewicht des Patienten bekannt sein:

U x Uvol x 1.73

C (ml/min/1.73 m²) =

S x t x KO

U × Uvol = S × Svol

C Creatinin-Clearance

U Creatininkonzentration im Urin (mg/dl)

Uvol Urinsammelmenge (ml)

S Creatininkonzentration im Serum (mg/dl)

Svol theoretisch von Creatinin gereinigtes

Plasmavolumen

t Sammelzeit (min)

KO Körperoberfläche des Patienten

(aus Nomogramm ersichtlich)

1.73 Körperoberfläche eines 75 kg schweren

Erwachsenen (m²), auf diesen Wert

werden die Referenzwerte bezogen

Adjustierung auf

•Sammelzeit

•KO „Standardmensch“

n (Urin) = n (Serum)



und Substrate

3. Harnstoff

Harnstoff

Die Begriffe Harnstoff und Harnstoff-N (engl. BUN) werden in der

medizinischen Diagnostik nebeneinander benutzt. Der Harnstoff-N-Gehalt

wird aus dem Harnstoff durch Multiplikation mit dem Faktor 0,46 berechnet.

Harnstoff ist das wichtigste Endprodukt des Protein-Stickstoff-Stoffwechsels.

Die Synthese erfolgt über den Harnstoffzyklus in der Leber via Ammoniak,

das durch Desaminierung von Aminosäuren gebildet wird. Harnstoff wird

hauptsächlich über die Nieren, in geringen Mengen auch über den Schweiß

ausgeschieden und im Darm durch Bakterien abgebaut.

Höhe des Harnstoffspiegels hängt ab von:

•Proteinzufuhr

•Proteinkatabolismus

•Nierenfunktion

Für die Azotämie (= Harnstofferhöhung im Blut) lassen sich drei

grundsätzliche Ursachen unterscheiden:

•prärenal: verminderte Durchblutung der Niere, z. B. Herzinsuffizienz

Schock, vermindertes Blutvolumen

•renal: GFR mind. 50% eingeschränkt, z. B. chronische Nephritis,

Nephrosklerose, Tubulusnekrose, Glomerulonephritis

•postrenal: Harnwegsobstruktion, z. B. Steine, Tumore

Bei starker Proteinaufnahme können vorübergehende Erhöhungen

auftreten. Bei Lebererkrankungen kommt es zu nicht vorhersagbaren

Konzentrationen.

Referenzbereiche für Harnstoff im Serum:

Männer: 23 - 44 mg/dl; Frauen: 10 – 40 mg/dl; Kinder: bis 45 mg/dl;

Funktionsparameter der Niere, dem Creatinin jedoch

deutlich unterlegen!



und Substrate

4. Harnsäure

Harnsäure

Harnsäure ist das wichtigste Endprodukt des Purinstoffwechsels und

einer der Bestandteile der nichtproteinhaltigen Stickstoff-Fraktion im

Plasma.

Der Großteil der Harnsäure wird in der Leber aus endogenen oder mit der

Nahrung aufgenommenen Nucleoproteinen gebildet.

Etwa die Hälfte der im Organismus vorhandenen Gesamtharnsäure wird

täglich über den Urin (2/3) ausgeschieden oder im Darmtrakt (1/3)

abgebaut.

Der Harnsäurespiegel im Blut wird enzymatisch bestimmt.

Harnsäure wird mittels der Uricase oxidativ zu Allantoin und H2O2 umgesetzt.

Diese Reaktion kann bei 293 nm direkt photometrisch verfolgt werden.

Alternativ kann das entstehende H2O2 mit verschiedenen Techniken

(amperometrisch, photometrisch via Farbstoff) erfasst werden.

Uricase

Uricase

Katalase

Aldehyd-DH

Ein erniedrigter Harnsäurespiegel wird beobachtet bei

•Nierentubulusresorptionsstörungen

•Hodgkin-Krankheit

•Bronchialkarzinom

•schweren Leberzellerkrankungen und

•Xanthinurie

Erhöhte Harnsäurespiegel (Hyperurikämie) sind mit der Gicht

assoziiert:

Gelenkentzündung (v.a. Großzehengrundgelenk) durch

Ausfallen von Harnsäurekristallen in der Gelenkflüssigkeit.

Referenzwerte Harnsäure im Serum:

Männer: 3,0 – 7,0 mg/dl

Frauen: 2,5 – 5,5 mg/dl

Hyperurikämie = Harnsäure im Serum > 7,0 mg/dl

Für die Behandlung der Gicht kommen

•neben diätetischen Maßnahmen

•vor allem Medikamente wie

•Probenecid in Frage, die die renale

Harnsäureausscheidung beschleunigen oder

•Substanzen wie Allopurinol, die durch die

Hemmung der Xanthinoxidase die

Harnsäuresynthese bremsen.

N

N NH

N

OH

OH

OHN

N NH

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NH

NN

N

OH

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OH

HypoxanthinXanthinHarnsäure

Xanthinoxidase Xanthinoxidase

Xanthinoxidase

Allopurinol Oxipurinol

Hemmung der Xanthinoxidase durch das Gichttherapeutikum

Allopurinol führt zu einer Erniedrigung der

Harnsäurespiegel im Blut

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