Human Plasma Proteome:

STRATEGI – STRATEGI DALAM PROTEOMIK UNTUK MENGANALISIS CAIRAN TUBUH

Maryanna Istiqomah Pratiwi/ 106 11 014

1. Pendahuluan1.1. Konteks cairan tubuh dalam biologi

- Pada abad 19, Claude Bernard, seorang ahli fisilogi memperkenalkan konsep lingkungan internal, yaitu suatu sirkulasi cairan organik yang mengelilingi jaringan. Lingkungan internal didefinisikan sebagai cairan ektrasel yang menjaga keseimbangan lingkungan seluler. Cairan organik ini penting dalam analisis proteomik

- Tubuh manusia terdiri dari 60% cairan yang terdistribusi dalam 2 kompartemen besar yaitu ruang ekstraseluler dan ruang intraseluler. Cairan ekstraseluler secara umum terbagi menjadi cairan interstisial (lingkungan mikro) serta plasma darah (lingkungan makro).

- Suatu jaringan terdiri dari elemen seluler dan elemen ekstraseluler yaitu matriks ekstraseluler beserta cairan interstisial jaringan tersebut.

- umumnya dalam literatur lingkungan mikro jaringan merujuk pada kedua elemen jaringan tersebut, namun, disini lingkungan mikro didefinisikan sebagai cairan interstisial saja.

- protein dikeluarkan ke lingkungan mikro, oleh karena itu, sekret suatu individual sel terefleksikan dalam profil lengkap protein lingkungan mikro. Lingkungan mikro mengalami kontak langsung dengan sel dan mengalami pertukaran molekul, sementara lingkungan makro (plasma) berkomunikasi dengan semua lingkungan mikro di tubuh, mengantarkan nutrien dan sinyal serta menerima umpan balik melalui limfatik.

-plasma penting dalam analisis proteomik cairan tubuh manusia karena plasma menggambarkan status fisiologis dari setiap sel dan dapat mempengaruhi cairan tubuh lainnya.

1.2. Pengkayaan biomarker pada cairan tubuh

- tantangan besar dalam proteomik adalah menemukan biomarker atau penanda molekuler dari suatu penyakit. Hal ini karena plasma darah 99% terdiri dari protein albumin dan tranferin, dan hanya 1% saja yang dapat dijadikan biomarker.

-untuk analisis proteomik, dilakukan penghilangan protein yang berlimpah dalam plasma serta pengkayaan protein langka. Kemudian, jumlah protein setelah pengkayaan pada sebuah sampel dibandingkan dengan jumlah protein pada keadaan fisiologis normal dan dihasilkan suatu status fisologis. Misal: CEA (carcinoembyonic antigen) pada sampel yang terkena tumor 5 x 103 kali lebih banyak daripada pada manusia normal.

2. Pendekatan proteomik untuk mempelajari cairan tubuh

-Proteomik merupakan teknologi postgenomik baru yang memungkinkan pemahaman akan kompleksitas sistem biologis yang dikode oleh genom pada level protein.

- teknologi ini merupakan teknik yang memungkinkan untuk menganalisis sejumlah besar protein dalam suatu eksperimen. Secara umum, proteomik dibagi menjadi dua pendekatan:

1. Proteomik ekspresi: bertujuan mengkatalogkanprotein yang diekspresikan suatu sel pada waktu tertentu

2. Proteomik target: berfokus pada penentuan fungsi seluler gen langsung pada level protein.

Proteomik cairan tubuh berfokus dalam proteomik ekspresi, terutama perbedaan kualitatif antara profil protein pada kondisi fisiologis yang berbeda (sakit/ tidak). Proteomik cairan tubuh merupakan suatu rangkaian teknologi, seperti yang diilustrasikan dalam gambar berikut:

2.1. Pengambilan dan penyimpanan sampel

- Sampel yang paling umum digunakan dalam analisis proteomik adalah plasma darah. Darah yang menggumpal secara alami lalu disentrifugasi menghasilkan 2 fasa yaitu gumpalan yang terdiri atas sel darah dan fibrin serta fase cairan (serum). Serum yang dihilangkan fibrinogennya dengan penambahan EDTA/heparin disebut plasma

-cara sampling dan penyimpanan yang lazim dipakai oleh HUPO (Human Plasma Proteome Organization) pada Human Plasma Proteome Project antara lain dengan menambahkan plasma darah kasar dengan inhibitor protease, lalu disentrifugasi 1 jam blood draw (serum) pendinginan cepat dalam dry icedisimpan dalam suhu -70oC

2.2. Loading sampel

-untuk menganalisis protein dari jaringan atau sel yang dilisis, dilakukan perbandingan sejumlah protein.

-volume protein total yang dibandingkan harus sama. Berikut ilustrasi yang menggambarkan pentingnya loading volume.

-cara umum yang dilakukan untuk menhindari kesalahan analisis akibat kesalahan loading sampel terbagi dua:

Memasukkan sejumlah volume total protein yang sama. Cara ini masih mengandung kelemahan karena adanya efek dari perlakuan penurunan protein yang berlimpah yaitu informasi volumetrik hilang selama pemisahan kromatografis dan desalting.

Normalisasi data sesuai konsentrasi protein total. Misal sampel pasien A sebagai

baseline maka faktor normalisasi menjadi 8668

× µ=4,9. µ disebut sebagai faktor

kompensasi.

2.3 Prefraksinasi dan fraksinasi

- pemisahan protein yang paling umum yaitu dengan metode 2DE (2 dimensi elektroforesis). 2DE dapat membaca >5000 protein dalam 1 gel dan mendeteksi <1ng protein per spot.

-namun, terdapat masalah antara lain plasma diperkirakan mengandung >1 juta bentuk protein serta adanya kelimpahan protein yang berbeda-beda kisarannya.

2.3.1 Prefraksinasi

- prefraksinasi merupakan pengkayaan populasi protein target, yaitu dengan cara menghilangkan protein yang berlimpah serta mengisolasi subpopulasi protein misal glikoprotein, fosfoprotein dll, sehingga dihasilkan komponen protein individual.

- mencari protein tunggal dalam campuran protein di plasma bagaikan mencari jarum dalam tumpukan jerami, oleh karena itu terdapat 2 strategi yang digunakan untuk mengurangi perbedaan kelimpahan protein.

Pendekatan yin: yaitu dengan menurunkan protein yang berlimpah. Cara ini merupakan metode yang paling umum. Pendekatan ini dilakukan dengan melakukan kromatografi substraksi imunoafiitas. Namun kekurangannya yaitu menurunkan kemungkinan ditemukannya protein spesifik

Pendekatan yang: dengan cara meningkatkan jumlah kopi protein yang langka (sedikit). Terdapat dua metode. Metode pertama dengan perpustakaan peptida, yaitu dengan pembentukan peptida besar melalui reaksi kimia kombinatorial. Metode ini cukup jarang dipakai terkait efektifitas dan efisiensi kerja. Metode kedua yaitu metode penangkapan selektif. Cara yang sering dipakai yaitu dengan imunopresipitasi (penangkapan berdasarkan afinitas antar antibodi dengan protein target) dan isotope coded tagging + MS (protein ditangkap dalam kolom, ditandai kemudian diidentifikasi dengan bantuan spektrometri massa).

2.3.2 Fraksinasi

- Teknologi yang umum dipakai yaitu dengan elektroforesis dan kromatografi cairan (LC). Metode yang dapat digunakan untuk fraksinasi antara lain isoelectric focusing (IEF) yaitu memanfaatkan migrasi protein berdasarkan muatan pada gradien pH serta 2DE (2 dimensi eleketroforesis). 2DE menggabungkan IEF pada dimensi pertama serta SDS PAGE pada dimensi kedua dengan memisahkan protein berdasarkan karakteristik pI (titik isoelektrik) dan Mr. Kemampuan memisahkan protein pada 2DE bergantung pada ukuran gel dan gradien pH.

-adapula DIGE, suatu inovasi fraksinasi 2DE. Mulanya, sampel akan dilabel secara in vitro oleh 2 pewarna fluoresen sianin yang kemudian dibedakan dari eksitasi dan emisi panjang gelombangnya. Pewarna ini dicampur sebelum IEF lalu di 2DE.

- pada teknologi kromatografi cairan, pemisahan komponen campuran protein berdasarkan distribusinya pada fase gerak dan fase diam. Fase diam merupakan kunci utama kromatografi cair. Fase diam dibuat dari matriks penyokong yang dilapis dengan gugus fungsi yang diinginkan sesuai interaksi pengikatannya.

2.4 Spektrometri massa (MS)

- Spektrometri massa berguna untuk mengidentifikasi serta mengkuantifikasi protein dalam suatu campuran hasil ionisasi ringan protein dan pencocokan dengan database. Tujuan utama dari spektrometri massa antara lain menentukan struktur primer peptida, analisis kuantitatif, serta karakterisais modifikasi pasca translasi. Spektrometer massa dapat dibagi menjadi tiga bagian dasar , yaitu sumber ionisasi , analisator , dan detektor .

• -Sampel harus dipaparkan ke sumber ionisasi dari instrumen . di dalam sumber ionisasi , molekul sampel akan terionisasi , karena ion lebih mudah untuk dimanipulasi daripada molekul netral . Ion-ion ini diekstrak ke wilayah analyzer spektrometer massa di mana mereka dipisahkan sesuai dengan rasio massa mereka

( m ) terhadap muatan ( z ) ( m / z ) . Ion yang dipisahkan terdeteksi dan sinyal ini dikirim ke sistem data di mana rasio m / z disimpan bersama dengan kelimpahan relatif mereka untuk dipresentasikan dalam format spektrum am / z .

• Berikut merupakan pendekatan identifikasi protein menggunakan MS.

2.4.1 Identifikasi protein

-Pengidentifikasian protein umumnya dilakukan dengan pendekatan bottom up MS/MS (tandem massa spectrometry). Protein dipecah menjadi peptida lalu ion peptida diisolasi, difragmentasi dan dianalisis untuk menghasilkan spektrum MS/MS. Spektrum ini kemudian dibandingkan dengan spektrum MS/MS yang dibuat dari database urutan protein melalui algoritma sehingga dihasilkan derajat kesamaan antar MS/MS eksperimen dengan teori.

2.4.2 Analisis kuantitatif dengan MS

Terdapat dua pendekatan:

1. Labeling dengan isotop stabil; yaitu dengan membandingkan langsung 2 keadaan proteom dalam suatu analisis

2. Kuantisasi berdasarkan arus ion (metode tanpa labeling); membandingkan arus ion pada peptida yang sama di eksperimen yang berbeda.

-cara yang umum dalam kuantisasi protein cairan tubuh adalah tagging kimia (labelling isotop). Mula-mula sampel protein diberi label cahaya dan isotop berat lalu dikumpulkan dan dianalisis bersama untuk meliat kelimpahan protein berisotop tersebut.