1

ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETAS

AGRONOMIJOS FAKULTETAS

Biologijos ir augalų biotechnologijos institutas

Svajūnas Bičius

VEIKSNIAI, LEMIANTYS BURNOČIO KALIAUS GENEZĖS

PROCESĄ

Magistro baigiamasis darbas

Studijų sritis: Technologijų mokslai

Studijų kryptis: Biotechnologija

Studijų programa: Agrobiotechnologija

Akademija, 2015

2

Magistro baigiamojo darbo valstybinė kvalifikacinė komisija:

(Patvirtinta Rektoriaus įsakymu Nr. 131–PA)

Agronomijos fakulteto studentų baigiamųjų darbų vertinimo komisijos įvertinimas:

....................................

Pirmininkas: Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Sodo augalų genetikos ir

biotechnologijos skyriaus vedėjas profesorius habil. dr. Vidmantas Stanys (mokslininkas-

praktikas)

Nariai:

Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Augalų fiziologijos laboratorijos vedėjas

profesorius habil. dr. Pavelas Duchovskis (mokslininkas-praktikas)

Agronomijos fakulteto prodekanas, Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentas

dr. Aurimas Krasauskas (mokslininkas)

Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto direktorė, profesorė dr. Natalija Burbulis

(mokslininkas)

Agronomijos fakulteto prodekanė, Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentė dr.

Liuda Žilėnaitė (mokslininkas)

UAB „Euromediena“ direktorius Mindaugas Šilinskas (socialinis partneris-praktikas)

Vadovė

Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentė dr. Aušra Blinstrubienė

Recenzentė

Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto profesorė dr. Natalija Burbulis

Oponentė

Žemės ūkio ir maisto mokslų instituto lektorė dr. Judita Černiauskienė

3

Bičius, S. Veiksniai, lemiantys burnočio kaliaus genezės procesą. Agrobiotechnologijos

studijų programos magistro darbas / Vadovė doc. dr. Aušra Blinstrubienė; ASU. Akademija,

2015, 38 p.: 17 pav., 1 lentelė. Bibliogr.: 51 pavad.

SANTRAUKA

Magistrantūros studijų baigiamajame darbe pateikiamas burnočio kaliaus genezės

proceso tyrimo rezultatas.

Darbo objektas – uodegotojo burnočio (Amaranthus caudatus L.) skilčialapių, lapų ir

hipokotilių eksplantai.

Darbo metodai: Eksplantai (skilčialapiai, lapai, hipokotiliai), auginti MS terpėje su

skirtingais augimo reguliatorių kiekiais: 0 – 3,0 mg 1-1

tidiazuronu (TDZ), 0 – 3,0 mg 1-1

6-

benzilamino purinu (BAP), 0–0,1 mg 1-1

α-naftilacto rūgšties (NAR) kiekiais bei jų deriniais.

Vertintas kaliaus formavimosi dažnis (%) ir kaliaus masė (mg).

Darbo rezultatai: izoliuotų hipokotilių, skilčialapių ir lapų audinių ląstelių

dediferencijacijos procesas prasidėjo praėjus 7–14 dienų po eksplantų izoliavimo. Kaliaus

indukcija vyko visose parinktose terpėse, tačiau kaliaus formavimosi proceso intensyvumas

priklausė nuo augimo reguliatorių derinio maitinamojoje terpėje. Burnočio hipokotilio

audiniai kalių formavo intensyviau nei lapo ir skilčialapio izoliuoti audiniai. Augimo

reguliatorių TDZ ir NAR poveikyje burnočio somatiniai audiniai kalių indukavo intensyviau

nei BAP ir NAR poveikyje. Siekiant indukuoti kaliaus genezę iš burnočio somatinių audinių,

maitinamąją terpę tikslingiausia papildyti 3,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR (lapo

eksplantams), 3,0 mg 1-1

BAP (skilčialapio eksplantams) ir 1,0 mg l-1

TDZ arba 3,0 mg 1-1

BAP (hipokotilio eksplantams). Iš hipokotilio audinių suformuoto kaliaus masė buvo didesnė

nei iš skilčialapio ir lapo izoliuotų audinių.

Reikšminiai žodžiai: augimo reguliatoriai, burnotis, eksplantai, in vitro, kalius.

4

Bičius, S. Factors influencing callus genesis of amaranth. Master thesis of

Agrobiotechnology study program / Supervisor assoc. prof. dr. Aušra Blinstrubienė; ASU.

Akademija, 2015, 38 p.: 17 figures, 1 table. References: 51 titles.

SUMMARY

The master work presents the results of factors affecting amaranthus morphogenesis in

somatic tissue culture.

Object of the work –investigation in vitro was carried out with amaranthus

cotyledons, leaves and hypocotyls explants.

Method of the work – seeds were surface sterilized and placed on MS nutrient

medium without growth regulators, supplemented with 10 g l-1

sucrose and 8 g l-1

Difco

Bacto-agar. Media adjusted to pH 5.5 prior to autoclaving at 115 ºC for 30 min. Culture media

(20 ml) were dispensed into 90 mm diameter Petri dishes and sealed with parafilm. For

investigation in vitro were used explants from sterile culture. The explants were placed on MS

medium supplemented with different combinations of growth regulators. The percentage of

callus formation frequency and weight were calculated.

The results of the work – isolated hypocotyls, cotyledon and leaf tissue cells process

of dedifferentiation began after 7–14 days after isolation of explants. Callus induction

determinate in all selected media, but callus formation process depended on the intensity of

growth regulators in media. Hypocotyls tissue of amaranth formed callus more intensively

than isolated tissue of leaves and cotyledons. Growth regulators TDZ and NAA influenced

more intensive callus induction in somatic tissues of amaranth than the BAP and NAA. To

induce the callus genesis of amaranth in somatic tissues culture the medium purposeful to be

supplement with 3.0 mg 1-1

TDZ + 0.1 mg 1-1

NAA (explants of leaf), 3.0 mg 1-1

BAP

(explants of cotyledons) and 1.0 mg l-1

TDZ or 3.0 mg 1-1

BAP (explants of hypocotyls).

From tissue of hypocotyls the formed mass of callus was higher than from isolated cotyledons

and leaf explants.

Key words: growth regulators, amaranth, explants, in vitro, callus.

5

TURINYS

PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS ........................................................................................................... 6

TERMINŲ IR SĄVOKŲ PAAIŠKINIMAI BEI SANTRUMPOS ........................................... 7

ĮVADAS ..................................................................................................................................... 8

1. LITERATŪROS ANALIZĖ ................................................................................................ 10

1.1. Amaranthus augalų paplitimas ir reikšmė ................................................................ 10

1.2. Amaranthus augalų biologinės ir maistinės savybės ................................................ 13

1.3. Kaliaus indukcija in vitro ......................................................................................... 15

2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS .................................................................................. 18

2.1. Augimo reguliatorių indukcijos terpėje parinkimas ................................................. 21

2.1.1. Tidiazurono (TDZ) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis.................................21

2.1.2. 6-benzilaminopurino (BAP) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis...................21

2.2. Augimo reguliatorių parinkimas intensyviam kaliaus augimui ............................... 21

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ .............................................................. 23

3.1. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus indukcijai ........... 23

3.2. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus augimui .............. 28

IŠVADOS ................................................................................................................................. 32

LITERATŪRA ......................................................................................................................... 33

DARBO APROBACIJA IR PUBLIKACIJOS ........................................................................ 37

PRIEDAI .................................................................................................................................. 38

6

PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS

Paveikslai:

1. 3.1.1 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio skilčialapius ant terpės su TDZ

priedu 23psl.

2. 3.1.2 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių

kultūroje 24psl.

3. 3.1.3 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų

kultūroje 24psl.

4. 3.1.4 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių

kultūroje 25 psl.

5. 3.1.5 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su TDZ

priedu 25 psl.

6. 3.1.6 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių

kultūroje 26 psl.

7. 3.1.7 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų

kultūroje 27 psl.

8. 3.1.8 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su BAP

priedu 27 psl.

9. 3.1.9 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių

kultūroje 28 psl.

10. 3.2.1 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui skilčialapių

kultūroje 29 psl.

11. 3.2.2 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui lapų

kultūroje 30 psl.

12. 3.2.3 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui hipokotilių

kultūroje 31 psl.

7

TERMINŲ IR SĄVOKŲ PAAIŠKINIMAI BEI SANTRUMPOS

Augimo reguliatoriai – tiek natūraliai randami fitohormonai, tiek sintetinės

fiziologiškai aktyvios medžiagos, veikiančios augalų raidą ir vystymąsi.

BAP – 6-benzilaminopurinas.

Dediferenciacija – specializacijos praradimas.

Diferenciacija – kokybinių skirtumų atsiradimas tarp ląstelių, audinių ir organų.

Eksplantas – organo arba audinio dalis auginama maitinamojoje terpėje ir naudojama

audinių kultūrai.

Genotipas – organizmo genų visuma, lemianti individo požymius bei savybes ir jų

kitimą ontogenezės metu.

Hipokotilis – apatinė daigo stiebo dalis nuo šaknies iki skilčialapių.

In vitro – dirbtinai sukurtoje sterilioje aplinkoje.

Kalius – antrinė meristemos masė, natūraliomis sąlygomis aptraukianti pažeistas

augalų vietas ir padedanti joms užgyti, taip pat susidaranti dirbtinai auginant izoliuotas augalo

ląsteles ar audinius in vitro.

Morfogenezė – organų, jų dalių ir sistemų atsiradimas bei raida organizmų

ontogenezės ir filogenezės metu.

MS – Murashige ir Skoog maitinamoji terpė.

NAR – α-naftilacto rugštis.

Organogenezė – tai organų susidarymas ir auginimas iš ląstelių ar audinių.

Sterilios sąlygos – augalų audinių kultūroje pasiekiamos autoklavuojant

instrumentus, kultūrų indus, terpę bei operacinėse dezinfekuojant įrenginių paviršius, juos

nuvalant alkoholiu ar kitu dezinfekuojančiu tirpalu.

Subkultivavimas – eksplanto ar audinio perkėlimas ant kitos šviežios maitinamosios

terpės.

TDZ – Tidiazuronas

8

ĮVADAS

Burnočiai priskiriami dviskilčių (Dicotyledones) klasei, gvazdikažiedžių

(Caryophyllidae) eilei, burnotinių (Amaranthaceae) genčiai. Ji kartu su balandinių

(Chenopodium) gentimi sudaro negausią pseudovarpinių augalų grupę, kurie gali produkuoti

didelės maistinės vertės sėklas. Tai – vienamečiai žoliniai augalai, kurių liemeninė šaknis,

sudaro apie 15 % viso augalo biomasės. Jie gali augti įvairiomis klimato sąlygomis ir

įvairiuose dirvožemiuose, bet geriausiai auga derlingose priemolio dirvose.

Amaranthus priklauso C4 augalų grupei, kuri 2–3 kartus intensyviau sugeria CO2

dujas nei dauguma kitų augalų, priklausančių C3 grupei bei sunaudoja dvigubai mažiau

vandens fotosintezės procesui. Dėl šios priežasties burnočiai – atsparesni sausroms ir

pakankamai gerai auga ten, kur per metus kritulių kiekis svyruoja nuo 200 mm. iki 3000 mm.

Burnočių efektyvesnė fotosintezė, intensyvesnė azoto apykaita ir dėl fotosintezės struktūros,

funkcionavimo bei fiziologinių–biocheminių metabolitinių procesų ypatumų – didesnis

produktyvumas. Burnočiai kaupia vertingus subalansuotus augalinius baltymus. Jų lapai

išsidėstę taip, kad neužstoja vieni kitų ir maksimaliai išnaudoja saulės energiją. (Edwards,

Walker, 1983; Furbank, Hatch, 1987; Bui van Le. et al., 1998; Svirskis, 2007). Dabar yra

selekcionuotos 4 burnočių grupės: salotiniai (lapiniai), grūdiniai, dažiniai ir dekoratyviniai

(Conforti et al., 2005; Svirskis, 2007).

Burnočių sėklose vidutiniškai yra 15–17 % baltymų, 5,7–10,0 % riebalų, 3,7–5,7%

ląstelienos. Iš sėklų išgaunama – 5,7–9,5 % aliejaus, kuriame yra – 77 % nesočiųjų riebalų

rūgščių, iš jų apie 50 % linoleno ir linolio, 4,8–7,0 % skvaleno, retos formos tokotriemo

pavidalo vitamino E (Paredes-Lopez, 1994; Conforti et al., 2005; Tamer et al., 2006; Svirskis,

2007).

Amaranthus caudatus L. auginamas kaip maistinis pasėlis Anduose, Ekvadore, Peru,

Bolivijoje ir Argentinoje, dėl šios priežasties šiuose kraštuose aptinkama didžiausia genetinės

įvairovė (Agong, Ayiecho, 1991). Pastaruoju metu susidomėta burnočiu kaip perspektyviu

žemės ūkio augalu, jo grūdais, žaliąją mase, maistinėmis savybėmis (Coimbra, Salem; 1994,

Svirskis, 2007).

Pasaulyje atrinktos ir įvertintos agronomiškai perspektyvios burnočių rūšys ir veislės:

A. cruentus ‘Amont’, A. hypochondriacus ‘Intense Purple’, A. caudatus, A. hibridus.

Burnočio selekcijoje, atrinktų atsparių genotipų, vyriškų sterilių augalų padauginimui

ar naujų formų kūrimui taikoma audinių kultūra. Literatūroje nurodoma, kad Amaranthus

genties atrinktų genotipų kaliaus indukcija ir morfogenezės procesas in vitro priklauso nuo

eksplanto audinių amžiaus, tipo, citokininų ir auksinų derinio maitinamojoje terpėje (Flores et

9

al., 1982; Bennici et al., 1992; Coleman et al., 2003). Kaliaus indukcijai ir organogenezės

procesui burnočių hipokotilių kultūroje buvo tinkamiausi NAR ir BAP, 2,4-D augimo

reaguliatorių deriniai (Bennici et al., 1997; Guidea et al., 2012).

Hipotezė – parinkus tinkamą eksplanto tipą ir augimo reguliatorių derinį

maitinamojoje terpėje galima indukuoti burnočio kaliaus genezę in vitro sistemoje.

Tyrimų tikslas: įvertinti eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikį burnočio

kaliaus genezei in vitro.

Tyrimuose kelti uždaviniai:

1. ištirti skirtingų eksplanto tipų (skilčialapių, lapų ir hipokotilių) gebą formuoti

kalių;

2. nustatyti augimo reguliatorių poveikį kaliaus indukcijai somatinių audinių

kultūroje;

3. įvertinti eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikį kaliaus augimui.

10

1. LITERATŪROS ANALIZĖ

1.1. Amaranthus augalų paplitimas ir reikšmė

Amaranthus L. – burnotis, priskiriamas augalų (Plantae) karalystei, magnolijūnų

(Angiospermae) skyriui, magnolijainių (Magnoliopsida) klasei, (Caryophyllales) eilei,

(Amaranthaceae) šeimai, (Amaranthus) genčiai. Kilęs iš Pietų Amerikos. Burnočiai buvo

pradėti auginti senovės vidurio Amerikoje, sukultūrinti Amaranthus cruentus L. ir

Amaranthus hypochondriacus L. auginami tūkstančius metų, inkų civilizacijoje ir paplito

visoje centrinėje ir šiaurinėje Andų inkų imperijoje (Sauer, 1967; Coons, 1977; Costea et al.,

2006). Šiame regione auginama daug sukultūrintų augalų, kurie pasižymi dideliu baltymų

kiekiu. Į šią augalų grupę priskiriamos ir bolivinė balanda (Chenopodium quinoa Willd.) bei

blyškioji balanda (Chenopodium pallidicaule Aellen). Amaranthus gentyje yra apie 60–70

rūšių, kurios auga ir yra paplitę pasaulyje, tačiau dauguma yra laukiniai (Vavilov, 1926;

Hawkes, 1999; Svirskis, 2007; Kraujalis, 2013).

Grūdams plačiausiai naudojamos 3 burnočių rūšys: raibasis (A. cruentus L.), hibridinis

(A. hypochondriacus L.) ir uodegotasis (A. caudatus L.) (1.1.1 pav.).

Burnotis – vienametis diploidinis augalas, vertinamas dėl kaupiamo didelio

aminorūgšties lizino kiekio, kuris labai svarbus žmonių mitybai. Šiame augale lizino yra

dukart daugiau nei kviečiuose, tris kartus daugiau nei kukurūzuose ar soruose, tad galima

prilyginti sojoms bei karvės pienui. Augaluose gausu kalcio, geležies, magnio, fosforo, kalio.

Kitaip, nei daugelyje javų rūšių, burnočiuose beveik nėra gliuteninų, kurie daugeliui žmonių

sukelia alergiją (Sauer, 1967; Coons, 1977; Costea et al., 2006).

Augalai užauga virš dviejų metrų aukščio ir subrandina iki 50 tūkst. sėklų (1.1.2 pav.).

Žiedynų ilgis gali būti daugiau kaip metras. Apsėti hektarui reikia tik 0,5–3,0 kg sėklos.

Burnočiai nėra reiklūs, todėl gali augti ir prastesniame dirvožemyje, atsparūs sausrai, karščiui,

jų beveik nepuola kenkėjai. Lietuvoje šių augalų sėklų derlius siekia nuo 1 iki 6 t ha-1

, o žalios

masės – iki 70 t ha-1

. Žaliąją burnočių masę galima prilyginti liucernoms. Tačiau šį augalą

nelengva tinkamai pasėti ir iškulti, dėl labai smulkių jų sėklų, nėra pakankamai ištirti kovos su

piktžolėmis metodai, tręšimo klausimai. Burnočių sėklos neturi ilgo ramybės periodo, todėl

dalis išsibarsčiusių sėklų sudygsta kitais metais ir užteršia pasėlius.

11

a

b

c

1.1.1 pav. Raibasis (a), hibridinis (b) ir uodegotasis (c) burnočiai

(a)http://wisplants.uwsp.edu/scripts/detail.asp?SpCode=AMACRU;

b)http://www.biolib.cz/en/image/id182246/;

c)http://www.prota4u.info/protav8.asp?g=pe&p=Amaranthus+caudatus+L.)

12

Selekcionuojant burnočius, atsižvelgiama į didelį jų derlingumą, sėklų spalvą, stiebų

aukštį, ankstyvumą, cenozės pastovumą, sėklų išsibarstymą, geras maistines ir naudojimo

savybes. Šiuo metu yra selekcionuotos 4 burnočių grupės: salotiniai (lapiniai), grūdiniai,

dažiniai ir dekoratyviniai (Conforti et al., 2005; Svirskis, 2007; Jakienė ir kt., 2013).

1.1.2 pav. Burnočio morfologija

(http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Amaranth)

Burnočiai – jautrūs herbicidams. Šiuos augalus galima auginti kaip monokultūrą.

Didžiausią derlių galima gauti burnočius pasėjus gegužės viduryje 2–4 kg ha-1

, 50 cm pločio

tarpueiliais ir iškūlus išdžiūvusius po didelių šalnų (–3–5 °C). Optimaliausias sėklų nuėmimo

būdas – tiesioginis burnočių kombainavimas.

13

Burnotis buvo plačiai auginamas Meksikoje, Pietų ir Centrinėje Amerikoje dar prieš

5–6 tūkstančius metų. Tai buvo svarbiausias kasdieninis Actekų genties maistas, ir, tikint šios

genties antgamtinėmis galiomis, būtent burnotis buvo naudojamas jų religiniuose ritualuose.

Iki 1519 metų, ispanų invazijos, burnotis buvo naudojamas aukojimo apeigose: actekų genties

moterys ruošdavo malto burnočio ir medaus mišinį, iš kurio formuodavo įvairias figūrėles,

užlašindavo žmogaus kraujo ir aukodavo. Užėję ispanų konkistadorai pasibaisėjo tokiomis

apeigomis ir, atnešę krikščionybę į tuos kraštus, uždraudė burnočio auginimą bei naudojimą

bet kokiems tikslams. Be galo vertingas augalas išnyko iš žmonijos mitybos raciono ilgiems

šimtmečiams. Šiomis dienomis burnotį vėl bandoma auginti eksperimentiniuose ūkiuose, juo

prekiaujama sveiko maisto parduotuvėse ar turguje (O'BrienandPrice, 1983; Sauer, 1967;

Iturbide, Gispert, 1994; Svirskis, 2007).

Burnotis buvo tarsi pamirštas augalas ir nebuvo toks populiarus kaip kukurūzai, gal

būt dėl mažo augalo sėklų dydžio ir nevienodo žiedyno brendimo laikotarpio. Tačiau nuo XX

amžiaus vidurio šis augalas yra plačiai tiriamas visame pasaulyje, ir pripažintas XXI amžiaus

vienu iš perspektyviausių augalų. Lietuvoje burnočio tyrimų pradininkas profesorius Antanas

Svirskis, kuris tyrė augalo auginimo technologijas sėkliniams pasėliams, cheminės sudėties

kitimus pagal klimatines sąlygas ir burnočių auginimą pašarui galvijams, maistui ar jo

papildus žmonėms (Svirskis, 2007).

1.2. Amaranthus augalų biologinės ir maistinės savybės

Amaranthus priklauso C4 augalų grupei, kuri 2–3 kartus intensyviau sugeria CO2

dujas nei dauguma kitų augalų, kurie priklauso C3 grupei. Tyrimais nustatyta, kad burnočiai

prisitaiko prie daugelio abiotinių veiksnių esančių gamtoje ir ypač sausrų. Dėl šių priežasčių

inkų kultūroje jis buvo vadinamas „nemirtingąją gėlė“ (Edwards, Walker, 1983; Furbank,

Hatch, 1987; Vujačić, 2005; Svirskis, 2007). C4 augalų fotosintezės intensyvumas (40–80 mg

CO2dm-2

x h), lyginant su C3 augalų (15–40 mg CO2dm-2

x h) fotosintezės intensyvumu, yra

dvigubai didesnis, todėl C4 augalai greičiau auga ir būna daug produktyvesni negu C3

augalai. Kiekvienas jų lapų paviršiaus dm2per dieną vidutiniškai pagamina 4–5 g sausųjų

medžiagų, o C3 augalų – tik 0,5–2,0 g. Kadangi C4 augalai sugeba koncentruoti CO2, jų lapų

žiotelės dieną gali būti privertos, o fotosintezės intensyvumas lieka toks pat. Dėl to C4 augalai

atsparesni sausrai, optimaliau naudoja vandenį: vieną gramą sausųjų medžiagų C4 augalai

pagamina, išgarinę 250–350 g, o C3 augalai – 450–950 g vandens (Pilipavičius, 2008). C4

augalai naudoja mažiau vandens nei C3 augalai ir fotosintezės procesui jo sunaudoja dvigubai

mažiau. Dėl šios priežasties, burnočių pasėliai gali būti perspektyvūs karšto ir sauso klimato

14

regionuose, kur per metus kritulių kiekis svyruoja nuo 200 mm iki 3000 mm. C4 augalų,

fotosintezės anglies metabolizmas sudėtingesnis nei C3 augalų (Hauptli, 1977; Furbank,

Walkeris, 1985; Paredes Lopez, 1989). Vyksta intensyvesnė ir efektyvesnė fotosintezė bei

azoto apykaita dėl fotosintezės struktūros, funkcionavimo bei fiziologinių–biocheminių savitų

metabolitinių procesų – didesnis produktyvumas, todėl burnočiai kaupia vertingus

subalansuotus augalinius baltymus. Jų lapai yra išsidėstę taip, kad neužstoja vieni kitų todėl

yra maksimaliai išnaudojama saulės energija (Edwards, Walker, 1983;Furbank, Hatch, 1987;

Svirskis, 2007).

Jaunuose burnočių lapuose gali susikaupti iki 3,5 % baltymų, 0,3 % riebalų, 6,8 %

kalcio ir kitų mineralinių medžiagų, taipogi daug vitaminų A, B, C ir beta karotino( Svirskis,

2007)

Burnočių sėklose vidutiniškai yra 15–17 % baltymų, 5,7–10,0 %, riebalų, 3,7–5,7 %

ląstelienos, lizino 5,3 %, vitamino C 4,2 %, krakmolo, kuris susideda ir mikro kristalinių, 1–3

mm skersmens krakmolo granulių, kurios pasižymi dideliu brinkimo potencialu( Tamer et al.,

2006; Conforti et al., 2005).

Iš sėklų aliejaus išgaunama – 5,7–9,5 %. Aliejuje – 77 % nesočiųjų riebalų rūgščių, iš

jų apie 50 % linoleno ir linolio, 4,8–7,0 % skvaleno, retos formos tokotriemo pavidalo

vitamino E (Paredes-Lopez, 1994; Conforti et al., 2005; Tamer et al.; 2006 Svirskis, 2007;).

Nustatyta, kad burnočių aliejaus sudėtyje, palyginti su tradicinėmis vasarinių ir žieminių

rapsų aliejumi (30 %.), yra pakankamai daug polinesočiųjų (50,15 %) ir net keturis kartus

daugiau sočiųjų riebalų rūgščių, atitinkamai 6 % ir 22,58 %. Burnočių aliejuje vyrauja linolo

(49,61%), oleino (19,52 %) ir sočioji palmitino riebalų rūgštis (17,91 %.). Tai yra linolinis

aliejus, tuo tarpu sėmenų aliejus yra linoleninis (alfa linoleno riebalų rūgštis – 61,17 %)

(Gruzdienė, 2007).

Burnočių sėklų skonis panašus į riešutų. Sėklos baltymingesnės negu dauguma kitų

javų grūdai, su žymiai didesniu lizino kiekiu ir triptofano bei metionino, šių medžiagų būna

mažesniais kiekiais ankštinėse kultūrose (Teutonico, Knorr, 1985; Mendoza, Bressani, 1987).

Peru uodegotasis burnotis yra naudojamas užkandžių ‘turrones’ gaminimui. Paskrudintų sėklų

miltai yra naudojami sriuboms, avižinei košei ir sausainiams gaminti. Miltai gali būti

naudojami kepant duoną, pakeičiant dalį kviečių miltų. Kad pagaminti puikios kokybės

duonos raugą gali būti panaudojami mišiniai – 80 % kviečių ir 20 % bolivinės balandos. Šita

duona masižymi geresnę maistinę kokybę negu duona iškepta iš kviečių miltų (AACC

REPORT, 2001). Po burnočio grūdų kūlimo, likutis gali būti naudojamas kaip ganiava

įvairiems galvijams. Andų ūkininkai tradiciškai po kūlimo likusia biologinę masę palieka

15

savo gyvuliams sausajam sezonui (AACC REPORT; Svirskis, 2007; Repo-Carrasco-

Valencia, 2009).

Burnočio lapai yra naudojami kaip špinatai (Spinaciaoleracea L.), nes lapuose gausu

baltymų, kitų maistinių ir vaistinių medžiagų. 150–200 g lapų maistinė vertė prilygsta 1 kg

pomidorų ar agurkų. Džiovintos sėklos naudojamos kaip javų grūdai, kurie gali būti laikomi

ištisus metus ir nepakinta jų baltymų kokybė. Raudonųjų veislių burnočiai naudojami kaip

dažikliai tradiciniuose gėrimuose Peru ir Ekvadore. Šviežios šaknys, lapai ir džiovinti grūdai

naudojami tradicinėje medicinoje: skrandžio opoms, diarėjoms, gastroenteritui, viduriavimui,

kolitui, hepatitui, nutukimui, atesklerozei galvos skausmui ir daugelio kitų negalavimų. Bet

labiausiai XX amžiuje Europoje, Afrikoje, Azijoje ir Amerikos žemynuose šis augalas išplito

kaip dekoratyvinis augalas, dėl savo gražaus, raudono, stambaus žiedyno (Pedersen et al.,

1987, Espitia, 1992; Svirskis, 2007).

1.3. Kaliaus indukcija in vitro

Kalius – tai neorganizuotas, netvarkingai ir padrikai augantis audinys, susidarantis iš

dedifirencijuotų ląstelių. Pirminė kaliaus susidarymo priežastis augalo audinių ar dalių

mechaniniai pažeidimai, kai ant pažeidimo vietų susidaro kalius, kuris apsaugo pažeistą

augalo vietą nuo infekcijų taip apsaugodamas likusią augalo dalį ir leisdamas toliau jam augti

jei nepažeistos gyvybiškai svarbios augalo dalys kai augalas auga natūraliomis ne in vitro

sąlygomis. In vitro sąlygomis kaliaus susidarymas nuo in vivo sąlygų skiriasi tuo, kad

steriliose sąlygose kaliaus susidarymas ant eksplanto yra svarbus ir naudingas procesas

biotechnologiniu požiūriu. Kaliaus augimo galimybė priklauso nuo eksplanto tipo, dydžio,

auginimo sąlygų, augalo rūšies, genetinės augalo informacijos, amžiaus, augimo tarpsnio,

eksplanto tipo. Kai kurie mokslininkai pamini mėnulio fazę ir metų laiką kaip svarbius

indikatorius kaliaus genezės procesui.

Kalius būna įvairių spalvų: žalsvos, raudonos, baltos, gelsvos ir įvairių atspalvių

priklausomai nuo antocianų pigmentų kiekio, kurie skirtingai kaupiasi skirtinguose augaluose

ir augalo dalyse priklausomai nuo kaliaus amžiaus, genetinės informacijos ir augimo sąlygų.

Dėl šių jau paminėtų veiksnių gali skirtis ir kaliaus konsistencija. Jis gali būti purus, vidutinio

tankumo ir tankus audinys.

Vienas iš pagrindinių biotechnologijos procesų – yra kaliaus indukcija kurios metu

vystymosi signalai veikia tinkamas ląsteles, kad jų būsena būtų pakeista, galutinis rezultatas –

determinuotas ląstelių susidarymas.

16

Pats svarbiausias veiksnys – maitinamoji terpė. Kad vystytųsi augalas reikalinga į

maitinamąją terpę įdėti augimo reguliatorių, kurie būna: auksinai, citokininai ir giberalinai. Jie

visi skatina augalo eksplanto vystymąsi ir kaliaus formavimąsi.

Kaliaus indukcijai tai pat daug įtakos turi ir augimo sąlygos: temperatūra, foto

periodas, terpes pH ir augimo reguliatorių tarpusavio ir tarp augalo hormonų pasiskirstymas

(Sliesarevičius, 2005; Duchovskis, 2006; Stanienė, 2006; Burbulis, 2009).

Kaliaus kultūroje morfogenezė yra organizuotų struktūrų susidarymas iš

neorganizuotos ląstelių masės. Augalų ggebėjimą regeneruoti in vitro lemia somatinių augalų

ląstelių totipotentiškumas (Burbulis ir kt., 2009). Totipotentiškumas – tai somatinių augalų

ląstelių savybė, atspindinti jų sugebėjimą elgtis kaip zigotai ar meristemos pirminėms

ląstelėms, reguliuojant ir išreiškiant genetinę bei epigenetinę informaciją, kuri reikalinga

atskirų augalo organų ar viso organizmo vystymuisi (Kuusienė, 2007). Tik dalis ląstelių yra

potencialiai pajėgios pereiti naują morfogenetinio vystymosi kelią. Tam jos turi būti

aktyvuojamos kompleksiniais signalais. Morfogenezės signalo veikiama kaliaus ląstelė turėtų

būti determinuota, tačiau praktikoje tik viena iš 400–1000 ląstelių yra naujo augalinio

organizmo pradžia. Vadinasi, vien tik morfogenezės signalo nepakanka, todėl ląstelė turi būti

pasiruošusi tą signalą priimti, ir tai vadinama ląstelės kompetentiškumu (Burbulis ir kt.,

2009).

In vitro kaliui indukuoti dažnai naudojamas kelių milimetrų dydžio stiebo, šaknies,

hipokotilio ar gemalo gabalėlis ir auginamas steriliomis sąlygomis ant maitinamosios terpės,

turinčios reikiamų makroelementų ir mikroelementų, augimo reguliatorių, vitaminų bei

angliavandenių. Iš tokio audinio pradeda formuotis nediferencijuotos ląstelės – kalius.

Išaugusi ląstelių grupė atrodo kaip kolonija. Kalius gali ilgai augti ir dalintis ant

maitinamosios terpės, jeigu jis kas keletą savaičių subkultivuojamas. Kalius yra puri ląstelių

masė, kurią galima skaidyti į atskiras ląsteles. Tačiau tai priklauso nuo kaliaus amžiaus, terpės

sudėties ir kitų veiksnių (Pliūra ir kt., 2006).

Kaliaus kultūra sudaro galimybę regeneruoti augalus iš skirtingų augalų genotipų,

kuriems yra būdingаs gausus sėklų derlius, atsparumas ligoms, šalčiui. Yra nustatyta, kad

kaliaus kultūra gali pakeisti genų raišką. Dėl šios priežasties dažniausiai ir yra tikimasi

dauginant augalus in vitro sąlygomis per kalių išvesti augalus kurie butu agronominiu

požiūriu tobulesni (Rutkowska-Krause et al., 2003; Blinstrubienė, 2005).

Pirmasis etapas yra išsirinkti maitinamąją terpę, kuri tiktų pasirinkto augalo

pasirinktam eksplantui pagal augalo augimo tarpsnį, rūšį, eksplanto tipą ir norimą pasiekti

rezultatą. Maitinamosios terpės atlieka dvi pagrindines funkcijas: suteikia maistines

medžiagas ir sudaro vietą augti in vitro sąlygoms eksplantui. Pagrindinės maitinamosios

17

terpės pasaulyje naudojamos White (1943); Murashige, skoog (MS) (1962) ir Gamborg (B5)

(1968). Bet plačiausiai naudojama nesumedėjusiems augalams MS maitinamoji terpė, kuri yra

papildyta makro ir mikroelementais, vitaminais, angliavandeniais, augimo reguliatoriais ir

papildytos standikliu. Dažniausiai biotechnologijos procesuose su augalais, jų raidai

naudojama MS maitinamoji terpe su skirtingais citokininu, auksinu ir giberalinų santykiais

tarpusavyje.

Kiekvienas augimo reguliatorius augalui siunčia skirtinga signalą inicijuodamas

kaliaus augimą. Giberelinas, augalų augimo hormonas, skatinantis augimo kūgelio ląstelių

dalijimąsi, lapkočio tįstamąjį augimą, sėklų dygimą, stiebo , augalo vystymąsi; slopina

ląstelių diferenciaciją, chlorofilo susidarymą.

Auksinai tai augimo reguliatoriai lemiantys augalų augimą į ilgį, ląstelių dalijimąsi bei

diferenciaciją, šaknų formavimąsi iš nuopjovų, vaisių formavimąsi, augalų atsiskyrimą

dalimis. Dėl auksino ląstelės siurbia H+ į savo sieneles, pH pokytis lemia fermentų, kurie

skaido skersinius ryšius sienelėse, aktyvavimą, o dėl turgorinio slėgio ląstelės automatiškai

ilgėja.

Dabartiniu metu yra suskaičiuojama apie 200 įvairių natūralių ir sintetinių citokininų

rūšių. Dažniausiai augaluose cirkuliuoja natūralus citokininas, vadinamas zeatinu. Sintetiniai

citokininai kinetinas ir BAP pasižymi dideliu aktyvumu (Werner et al., 2003; Sakakibara,

2006). Citokininas skatina dediferencijuotų ląstelių dalijimąsi ūglių, pumpurų formavimąsi,

skatina chlorofilo sintezę (Werner et al., 2003).

Skirtingi augimo reguliatoriai gali veikti augalą neatpažįstamai skirtingai: parinkus

netinkamus augimo reguliatorių ar jų derinį gali slopinančiai veikti augalą arba sustabdyti

visiškai augalo kaliusavimą ir augimą. O parinkus teisingai terpę galima gauti netik norimus

rezultatus, bet ir dar iki šiol nepastebėtus morfogenezės pakitimus arba pradėti iš eksplanto

tiesioginę organogenezę. Svarbus aspektas yra ir koncentracijų parinkimas. Parenkant terpes

mokslininkai kartais dirba ištisus metus (Stanienė, 2006; Burbulis, 2009; Sliesarevičius, 2005;

Duchovskis, 2006).

18

2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS

Tyrimų vieta. Tyrimai atlikti Aleksandro Stulginskio universiteto Agronomijos

fakulteto Biologijos ir augalų biotechnologijos institute, JTC Agrobiotechnologijos

laboratorijoje 2014–2015 metais.

Tyrimų objektas: uodegotasis burnotis (Amaranthus caudatus L.).

Eksplantų paruošimas. Burnočio sėklos 1 val. plautos tekančiu vandeniu, 10 min.

sterilintos kalio permanganato tirpale 10%, 1 min. – 70 % etanolio vandeniniame tirpale ir 2

min. 10 % kalio hipochlorito tirpale, po to 3 kartus po 5 min. plautos steriliame distiliuotame

vandenyje. Sėklos daigintos Murashige ir Skoog (MS) (Murashige, Skoog, 1962)

maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių, papildytoje 30 g l-1

sacharozės ir 8 g l-1

agaro

(2.1 pav., 2.1 lentelė). Terpės pH – 5,7 ± 0,1. Maitinamoji terpė autoklavuota 115 oC

temperatūroje 30 min., išpilstyta po 20 ml į 90 mm skersmens Petri lėkšteles ir užsandarinta

parafilmu (2.2 pav.). Kultūra auginta 22±2 oC temperatūroje, esant 50 μmol m

-² s

-¹

apšvietimui, 16/8 h (diena/naktis) fotoperiodui.

2.1 pav. Burnočio sterilios sėklos ant MS

maitinamosios terpės be augimo reguliatorių

2.2 pav. Sterili maitinamoji terpė Petri

lėkštelėse

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.

Eksperimentams naudoti 9–10 dienų daigai. Burnočio morfogenezei somatinių

audinių kultūroje tirti naudoti skilčialapių, lapų ir hipokotilių eksplantai (2.3 pav.). Eksplantai

auginti MS maitinamojoje terpėje su skirtingais augimo reguliatorių kiekiais. Maitinamoji

terpė, papildyta 30 g l-1

sacharozės ir 8 mg l-1

agaru. Terpės pH – 5,7 ± 0,1. Sterili audinių

kultūra auginta auginimo kambaryje, kuriame šviesos intensyvumas – 50 μmol m-2

s-1

,

fotoperiodas – 16/8 h (dieną/naktį), aplinkos temperatūra – 22 ± 20

C.

19

2.1 lentelė. Murashige ir Skoog (MS) maitinamosios terpės sudėtis

Medžiaga Kiekis mg l-1

Makroelementai

NH4NO3 1650

Ca(NO3)2•4H2O -

KNO3 1900

KCl -

(NH4)SO4 -

CaCl2•2H2O 400

MgSO4•7H2O 370

Na2SO4 -

H2PO4 170

NaH2PO4•4H2O -

NaH2PO4 -

Mikroelementai

CoCl2•6H2O 0,025

CuSO4•5H2O 0,025

H3BO3 6,20

KI 0,830

MnSO4•4H2O 22,30

MnSO4•H2O -

Na2MoO4•2H2O 0,25

ZnSO4•7H2O 8,60

FeSO4•7H2O 27,80

Fe2(SO4)3 -

Na2 EDTA•2H2O 37,30

Vitaminai

Mezoinozitas 100

Tiaminas HC1 0,10

Piridoksolis HC1 0,50

Nikotino rūgštis 0,50

Glicinas 2,00

Priedai

Sacharozė 10 000-30 000

Agaras 8 000

pH 5,7± 0,1

20

a

b

c

2.3 pav. Burnočio skilčialapių (a), lapų (b) ir hipokotilių (c) eksplantai

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.

21

2.1. Augimo reguliatorių indukcijos terpėje parinkimas

2.1.1. Tidiazurono (TDZ) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis

Tirti skirtingi citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai MS maitinamojoje terpėje:

be augimo reguliatorių (kontrolė);

0,5 mg l-1

TDZ;

1,0 mg l-1

TDZ;

2,0 mg l-1

TDZ;

3,0 mg l-1

TDZ;

0,5 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR;

1,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR;

2,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR;

3,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR.

Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1

sacharozės ir 8 g l-1

agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.

2.1.2. 6-benzilaminopurino (BAP) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis

Tirti skirtingi citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai MS maitinamojoje terpėje:

be augimo reguliatorių (kontrolė);

0,5 mg l-1

BAP;

1,0 mg l-1

BAP;

2,0 mg l-1

BAP;

3,0 mg l-1

BAP;

0,5 mg l-1

BAP+ 0,1 mg l-1

NAR;

1,0 mg l-1

BAP+ 0,1 mg l-1

NAR;

2,0 mg l-1

BAP+ 0,1 mg l-1

NAR;

3,0 mg l-1

BAP+ 0,1 mg l-1

NAR.

Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1

sacharozės ir 8 g l-1

agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.

2.2. Augimo reguliatorių parinkimas intensyviam kaliaus augimui

be augimo reguliatorių (kontrolė);

2,0 TDZ+0,1 NAR;

22

3,0 TDZ+0,1 NAR;

2,0 BAP+0,1 NAR;

3,0 BAP+0,1 NAR.

Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1

sacharozės ir 8 g l-1

agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.

Eksperimento metu buvo auginta po 80 kiekvieno varianto eksplantų, tyrimas atliktas

trimis pakartojimais. Po 28 auginimo parų vertintas kaliaus susidarymo dažnis (%) ir kaliaus

prieaugio masė (mg).

Duomenys statistiškai apdoroti kompiuterinėmis programomis STAT 1,55 ir

ANOVA iš programų paketo “Selekcija” (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Rezultatų

patikimumas įvertintas dispersinės analizės metodu, duomenys sugrupuoti pagal Dunkano

kriterijų (P ≤ 0,05)

23

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ

3.1. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus indukcijai

Burnočio izoliuotų skilčialapių, lapų ir hipokotilių audinių ląstelių dediferencijacijos

procesas prasidėjo praėjus 7–14 dienų po eksplantų izoliavimo.

Skilčialapių kaliaus indukcijos (3.1.1 pav.) intensyvumas priklausė nuo augimo

reguliatorių derinio (3.1.2 pav.).

3.1.1 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio skilčialapius ant terpės su TDZ priedu

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.

MS maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių izoliuoti skilčialapiai kaliaus

neformavo. Terpėse, papildytose tik citokininu (0,5–3,0 mg 1-1

) TDZ, kaliaus formavimosi

dažnis kito nuo 75,5 iki 93,5 %. Eksplantai, terpėje su 2,0 mg 1-1

TDZ ir 3,0 mg 1-1

TDZ

vidutiniškai kalių formavo 91,2 ir 93,5 % dažniu.

Terpę papildžius 0,5 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR, 1,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR, 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR, nustatyta, kad auksino priedas neturėjo esminės

teigiamos įtakos įzoliuotų skilčialapių ląstelių dediferenciacijai, kuris didino kaliaus

susidarymo dažnį. Statistiškai patikimai intensyviausia (97,1 %) skilčialapių kaliaus indukcija

vyko terpėje su 3,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR.

24

3.1.2 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

MS maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių, burnočio izoliuoti lapų eksplantai

kaliaus neformavo (3.1.3 pav.). Vertinant citokinino 0,5 mg 1-1

TDZ, 1,0 mg 1-1

TDZ, 2,0 mg

1-1

TDZ, 3,0 mg 1-1

TDZ priedą maitinamojoje terpėje nustatyta, kad didinant TDZ kiekį

maitinamojoje terpėje, kaliaus formavimosi dažnis tendencingai didėjo (nuo 62,5 iki 75,7 %).

3.1.3 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015m.

25

Statistiškai patikimai intensyviau kalių formavo izoliuoti lapų eksplantai

maitinamojoje terpėje, papildytoje ne tik citokininu TDZ, bet ir auksinu NAR. Nustatyta, kad

šie eksplantai daugiausiai kaliaus suformavo terpėse, papildytose 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR bei 3,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR. Kaliaus susiformavimo dažnis vidutiniškai

padidėjo nuo 19,9 iki 26,4 %, lyginant su terpe, papildyta tik citokininu TDZ.

Izoliuoti hipokotiliai, skirtingai nei skilčialapių ir lapų eksplantai, maitinamojoje

terpėje be augimo reguliatorių kalių formavo 17,3% dažniu (3.1.4 pav.).

3.1.4 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Citokinino 1,0–3,0 mg 1-1

TDZ poveikyje hipokotilių eksplantai kalių formavo

vidutiniškai 5,6 karto intensyviau nei kontrolėje, kaliaus indukcija vyko 100% (3.1.5 pav.).

3.1.5 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su TDZ priedu

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.

26

Citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai maitinamosiose terpėse esminės teigiamos

įtakos kaliaus indukcijai neturėjo. Terpę papildžius 1,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR kaliaus

indukcija sumažėjo 3,6%, lyginant su terpę, papildyta tik 1,0 mg 1-1

TDZ.

Vertinant citokinino BAP ir jo derinių su auksinu NAR poveikį skilčialapių kaliaus

indukcijai nustatyta, kad terpėje be augimo reguliatorių kalius nesiformavo (3.1.6 pav.).

Skilčialapių eksplantai, terpėse 0,5 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, 1,0mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-

1 NAR, 2,0 mg 1

-1 BAP + 0,1 mg 1

-1 NAR kalių formavo vidutiniškai nuo 72,6 % iki 100 %

dažniu. Auksino priedas maitinamojoje terpėje didino kaliaus indukcijos dažnį tik derinyje su

mažiausia citokinino BAP koncentracija. Statistiškai patikimai intensyviausia skilčialapių

kaliaus indukcija vyko terpėse, papildytose 3,0 mg 1-1

BAP ir 3,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR.

3.1.6 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Burnočio izoliuoti lapų eksplantai kalių formavo tik terpėse, papildytose tirtais

augimo reguliatorių deriniais (3.1.7 pav.). MS maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių,

kaliaus indukcija nevyko. Kaliaus formavimosi intensyvumas maitinamosiose terpėse,

papildytose tik citokininu 0,5 mg 1-1

BAP, 1,0 mg 1-1

BAP, 2,0 mg 1-1

BAP, 3,0 mg 1-1

BAP

kalių formavo nuo 54,3 iki 78,2 % dažniu. Eksplantai, terpėse su citokinino BAP ir auksino

NAR priedu (0,5 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, 2,0 mg 1-

1 BAP + 0,1 mg 1

-1 NAR, 3,0 mg 1

-1 BAP + 0,1 mg 1

-1 NAR) kaliaus vidutiniškai suformavo

nuo 75,4 % iki 90,8 %. Izoliuoti burnočio lapų audiniai statistiškai patikimai daugiau kaliaus

indukavo maitinamosiose terpėse papildytose citokinino BAP ir auksino NAR deriniu,

vidutiniškai 1,2 karto, lyginant su terpėmis papildytomis tik citokininu BAP.

27

3.1.7 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Izoliuoti hipokotiliai skirtingai nei skilčialapių ir lapų eksplantai, maitinamojoje

terpėje be augimo reguliatorių, kalių formavo nedideliu – 10,3% dažniu (3.1.8 pav., 3.1.9

pav.).

3.1.8 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su BAP priedu

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.

28

3.1.9 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Terpėse su citokinino 0,5 mg 1-1

BAP priedu hipokotilių izoliuoti eksplantai kalių

formavo 6,8 karto intensyviau nei kontrolėje. Vertinant kaliaus formavimosi proceso

intensyvumą priklausomai nuo augimo reguliatorių derinio maitinamosiose terpėse,

papildytose tik citokininu 0,5 mg 1-1

BAP, 1,0 mg 1-1

BAP, 2,0 mg 1-1

BAP, 3,0 mg 1-1

BAP

kaliaus formavimosi dažnis kito nuo 70,0 iki 100 % . Eksplantai, terpėse papildytose

citokinino ir auksino deriniu 0,5 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, 3,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR, kalių formavo

vidutiniškai nuo 85,4% iki 100 % dažniu. Statistiškai patikimai intensyviausiai hipokotilių

audinių dediferenciacija vyko terpėse, papildytose 3,0 mg 1-1

BAP, 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg

1-1

NAR ir 3,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR.

3.2. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus augimui

Burnočio kaliaus augimo intensyvumas tirtas izoliuotų skilčialapių, hipokotilių ir lapų

kultūrose. Nustatyta, kad kaliaus augimą lėmė genetiniai veiksniai, priklausomai nuo

panaudoto eksplanto tipo.

Praėjus 4 savaitėms nuo eksplantų auginimo pradžios, nustatyti esminiai kaliaus

augimo skirtumai tarp vidutinės pradinės kaliaus masės ir kaliaus masės po keturių auginimo

savaičių (3.2.1 pav.). Maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių burnočio skilčialapiai

29

kaliaus neformavo. Vidutinė kaliaus masė augimo reguliatorių poveikyje kito nuo 198,6–

352,1 mg. Terpėje, papildytoje augimo reguliatorių deriniu 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

kaliaus masė buvo 352,1 mg, atitinkamai nuo 1,1 iki 1,8 karto daugiau nei kituose

maitinamosios terpės variantuose.

Po I subkultivavimo skilčialapių eksplantai statistiškai patikimai didžiausią kaliaus

masę (714,3 mg) formavo terpėje papildytoje 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1mg 1-1

NAR, t.y. nuo 1,1–

1,7 karto daugiau nei kituose augimo reguliatorių derinių variantuose.

Analizuojant tyrimų rezultatus nustatyta, kad izoliuoti eksplantai po II subkultivavimo

formavo didžiausią kaliaus prieaugį. Statistiškai patikimai intensyviausiai skilčialapių kaliaus

masė didėjo terpėje, papildytoje augimo reguliatorių deriniu 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR. Kitose tirtose maitinamosiose terpėse eksplantų kaliaus masės prieaugis buvo

statistiškai patikimai mažesnis.

Skirtumai tarp variantų vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide, yra esminiai.

3.2.1 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui skilčialapių kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015m.

Burnočio lapų audiniai, maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių kaliaus

neformavo. Kaliaus augimo intensyvumas priklausė nuo augimo reguliatorių santykio

maitinamojoje terpėje. Po 4 savaičių kultivavimo didžiausia vidutinė kaliaus masė (211,2 mg)

lapų kultūroje susiformavo maitinamojoje terpėje papildytoje 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

30

NAR deriniu (3.2.2 pav.), tai yra atitinkamai nuo 1,1 iki 1,8 kartų daugiau nei kituose augimo

reguliatorių variantuose.

Po I subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausia kaliaus masė (325,3 mg)

susiformavo maitinamojoje terpėje papildytoje augimo reguliatorių deriniu 2,0 mg 1-1

BAP +

0,1 mg 1-1

NAR.

Po II subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausią kaliaus masę (406,2 mg)

suformavo lapų audiniai citokinino ir auksino derinio 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR

poveikyje.

Skirtumai tarp variantų vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide, yra esminiai.

3.2.2 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui lapų kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Vertinant vidutinę kaliaus masę hipokotilių kultūroje, po 4 savaičių kultivavimo

kontrolinėje terpėje, indukuota kaliaus masė buvo 88,5 mg . (3.2.3 pav.). Statistiškai patikimai

didžiausias masės prieaugis (250,1 mg) buvo maitinamojoje terpėje, papildytoje 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR deriniu. Tuo tarpu kontrolinėje terpėje, be augimo reguliatorių,

kaliaus masė buvo 2,8 karto mažesnė.

Po I subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausia kaliaus masė (598,1 mg)

susiformavo hipokotilių kultūroje augimo reguliatorių derinio 3,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR poveikyje.

31

Po II subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausia kaliaus masė (1124,3 mg)

susiformavo maitinamojoje terpėje, papildytoje augimo reguliatorių 3,0 mg 1-1

BAP + 0,1mg

1-1

NAR deriniu. Šiame maitinamosios terpės variante kaliaus masė buvo 8,7 kartų didesnė

nei kontroliniame variante.

Skirtumai tarp variantų vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide, yra esminiai.

3.2.3 Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui hipokotilių kultūroje

ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Analizuojant tyrimo rezultatus nustatyta, kad burnočio kaliaus augimą lėmė augimo

reguliatorių deriniai ir eksplanto tipas.

Vertinant burnočio skilčialapių, lapų ir hipokotilių audinių ląstelių dediferenciacijos

skirtumus, priklausomai augimo reguliatorių derinio, nustatyta, kad didžiausia kaliaus masė

susiformavo citokinino BAP ir auksino NAR derinio poveikyje. Citokininas TDZ derinyje su

NAR slopino kaliaus masės augimą visuose tirtuose variantuose.

Lyginant lapų, skilčialapių ir hipokotilių audinių kultūras augimo reguliatorių

poveikyje, nustatyta, kad intensyviausiai kaliaus masė didėjo hipokotilių kultūroje. Lapų

audinių indukuotas kalius pasižymėjo silpniausiu masės prieaugiu per visus kultivavimo

laikotarpius.

32

IŠVADOS

1. Burnočio hipokotilio audiniai kalių formavo intensyviau nei lapo ir skilčialapio izoliuoti

audiniai.

2. Augimo reguliatorių TDZ ir NAR poveikyje burnočio somatiniai audiniai kalių

indukavo intensyviau nei BAP ir NAR poveikyje.

3. Siekiant indukuoti kaliaus genezę iš burnočio somatinių audinių, maitinamąją terpę

tikslingiausia papildyti 3,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR (lapo eksplantams), 3,0 mg 1-

1 BAP (skilčialapio eksplantams) ir 1,0 mg l

-1 TDZ arba 3,0 mg 1

-1 BAP (hipokotilio

eksplantams).

4. Iš hipokotilio audinių suformuoto kaliaus masė buvo didesnė nei iš skilčialapio ir lapo

izoliuotų audinių.

33

LITERATŪRA

1. AACC REPORT. 2001. Report of the dietary fiber. Definition committee to the board of

directors of the American association of cereal chemists, vol. 46(3), p. 112–126.

2. AGONG, S.G.; AYIECHO, P.O. 1991. The rate of out-crossing in grain amaranths.

Plant Breeding, vol. 107, p. 156–160.

3. BENNICI, A.; GRIFONI, T.; SCHIFF, S.; BOVELLI, R. 1997. Studies on callus grow

and morphogenesis in several species and lines of Amaranthus. Plant Cell and Organ

Culture, vol. 49, 29–33 p.

4. BENNICI, A.; SCHIFF S.; BOVELLI R. 1992. In vitro culture of species and varieties

of four Amaranthus L. species. Euphytica, vol. 62, p. 181–186.

5. BERMEJO, J.E.H.; LEON, J. 1994. Neglected crops: 1492 from a different perspective.

FAO, Rome, vol. 26, p. 93–101.

6. BLINSTRUBIENĖ, A. 2005 Sėmeninių linų tyrimai somatinių ir generatyvinių audinių

kultūrose: daktaro disertacija. biomedicinos mokslai, agronomija (06B). Akademija,

(Kauno r.), p. 17–30.

7. BUI VAN LE, N.T.; JEANNEAU, S.; SADIK, S.; SHANJUN, T.; VIDAL, J. 1998. Rapid plant

regeneration of a C4 dicot species: Amaranthus edulis. Plant Science, vol. 132, p. 45–

54.

8. BURBULIS, N. et al. 2009. Augalų genetinės įvairovės kūrimas somatinių audinių

kultūroje. Mokomoji knyga. Akademija, p. 5–36.

9. COIMBRA, S.; SALEMA, R. 1994. Amaranthus hypochondriacus: seed structure and

localization of seed reserves. Annals of Botany, vol. 74, p. 373–379.

10. COLEMAN, J.O.D.; EVANS, D.E.; KEARNS, A. 2003. Plant Cell Culture. Garland

Science, 208 p.

11. CONFORTI, F.; STATTI, G,; LOIZZO, MR.; SACCHETTI, G.; POLI, F,

MENICHINI, F. 2005. In Vitro Antioxidant Effect and Inhibition of a -Amylase of Two

Varieties of Amaranthus caudatus Seeds. Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol.

28(6), p. 1098–1102.

12. COONS, M.P. 1977. The status of Amaranthus hybridus L. in South America. Cienc.

Ant, vol. 18, p. 80–87.

13. COSTEA, M.; BRENNER, D.M.; TARDIF, F.J.; TARDIF, F.J.; TAN, Y.F.; SUN, M.

2006. Delimitation of Amaranthus cruentus L. and Amaranthus caudatus L. using

micromorphology and AFLP analysis: An application in germplasm identification.

Genet. Resour. Crop. vol. 53, p.1625–1633.

34

14. DUCHOVSKIS, P. 2006. Augalų morfogenezė in vitro ir jos reguliavimas. Babtai, p. 3–

26.

15. EDWARDS, G.; WALKER, D.A. 1983. C3, C4:Mechanisms and cellular and

environmental regulation of photosynthesis. Blackwell scientific publication, London,

(Oxford) vol. 6(9), p. 496–511.

16. ESPITIA, E. 1992. Amaranth germplasm development and agronomic studies in

Mexico. Food Reviews International, vol. 8, p. 71–86.

17. FLORES, H. E.; THIER, A.; GALSTON, A.W. 1982. In vitro culture of grain and

vegetable Amaranths (Amaranthus spp.). American Journal of Botany, vol. 69(7), p.

1049–1054.

18. FURBANK, R. T.; HATCH, M. D. 1987. Mechanism of C4 photosynthesis: the size

and composition of the inorganic carbon pool in bundle sheath cells. Plant Physiology,

vol. 85, p. 958–964.

19. GRUZDIENĖ, D. 2007. Lietuvoje užauginto aliejinio burnočio sėklų (Amaranthus)

aliejaus cheminė sudėtis ir savybės. Veterinarija ir zootechnika, vol. 39(61), p. 22–29.

20. GUIDEA, S. D.; BABEANU, N.; POPA, O.; STANCIU, D.; POPA, I. 2012.

Preliminary studies on in vitro behavior of varios somatic explants from some cultivated

Amaranthus genotypes. Scientific Bulletin, Biotechnologies, vol. 16, p. 9–14.

21. HAUPTLI, H. 1977. Agronomic potential and breeding strategy for grain Amaranthus.

Proceedings of First Amaranthus Seminar, vol. 71.

22. HAWKES, J.G. 1999. The evidence for the extent of N.I. vavilov’s new world Andean

centres of cultivated plant origins. Genetic Resources and Crop Evolucion.vol 46, p.

163–168.

23. ITURBIDE, G.A.; GISPERT, M. 1994. Grain amaranths (Amaranthus spp.). Neglected

crops: 1492 from a different perspective. FAO, Italy (Rome). p. 93–101.

24. JAKIENĖ, E. ir kt. 2013. Energetinių žolinių ir sumedėjusių augalų auginimo

technologijos. Akademija, Kauno r., p. 199.

25. Kraujalis, P.; VENSKUTONIS, P.R.; PUKALSKAS, A.; KAERNAVIČIUTĖ, R. 2013. Accelerated

solvent extraction of lipids from Amaranthus spp. seeds and characterization of their

composition, Kaunas University of Technology, Lithuania. p. 528–534.

26. KUUSIENĖ, S. 2007. Augalų genomika ir biotechnologija. Naujausių mokslinių

pasiekimų ir naujausių mokslinių tyrimo metodų augalų genetikos ir biotechnologijos

srityje mokslinė studija, Kaunas, p. 44.

27. MENDOZA, C.; BRESSANI, R. 1987. Nutritional and functional characteristics of

extrusion cooked amaranth flour. Cereal Chemistry, vol. 64, p. 218–222.

35

28. MURASHIGE, T.; SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays

with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, vol. 15, p. 473–497.

29. O’BRIEN, G.K.; PRICE, M.L. 1983. Amaranth: Grain and vegetable types. ECHO

News, Florida,. p. 1–14.

30. PAREDES LOPEZ, O.; SCHEVENIN M.L.; HERMANDEZ LOPEZ, D.; CARABEZ TREJO, A.

1989. Amaranth starch - isolation and partial characterization. Starch, vol. 41, p. 205–

207.

31. PAREDES-LÓPEZ, O. 1994. Amaranth: biology, chemistry and technology. United

States. 223 p.

32. PEDERSEN, B.; HALLGREN, L.; HANSEN, I.; EGGUM. B.O. 1987. The nutritive

value of amaranth grain (Amaranthus caudatus), Plant foods for human nutrition, vol.

36, p. 305–334.

33. PILIPAVIČIUS V., PUPALIENĖ, R.; MARCINKEVIČIENĖ, A. 2008. Pasėlių

bendrijos ir jų tyrimai. Akademija, p. 47.

34. PLIŪRA, A. ir kt. 2006. In vitro technologijų taikymas greitai augančių medžių

mikroklonavimui: sterilios kultūros indukcija ir kultivavimas, mikroūglių dauginimas in

vitro: mokomoji medžiaga. Kaunas, p. 41.

35. REPO-CARRASCO-VALENCIA, R.; PENA, J.; KALLIO, H.; SALMINEM, S. 2009. Dietary fiber

and other functional components in two varieties of crude and extruded kiwicha

(Amaranthus caudatus). Journal of Cereal Science, vol. 49(2), p. 219–224.

36. RUTKOWSKA-KRAUSE, I.; MANKOWSKA, G.; LUKASZEWICZ, M.; SZOPA, J. 2003.

Regeneration of flax (Linum usitatissimum L.) plants from anther culture and somatic

tissue with increased resistance to Fusarium oxysporum. Plant Cell Reports, vol. 22, p.

110–116.

37. SAKAKIBARA, H. 2006. Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Plant

Biology, vol. 57, p. 431–449.

38. SAUER, J.D. 1967. The grain amaranths and their relatives: A revised taxonomic and

geographic survey. Annals of the missouri botanical garden 1990, Salmon, vol. 54,

p.103–137.

39. SLIESAREVIČIUS, A.; STANYS, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija

Vilnius, p. 11–124.

40. STANIENĖ, G. 2006. Augalų mikrodauginimas. Babtai, 34p.

41. SVIRSKIS, A. 2007. Burnočiai – pašaras, maistas, vaistas. Vilnius, 48 p.

42. TAMER, H.G. et al. 2007. Characterization of Amaranth seed oils. Journal of Food

Lipids, vol 14, p. 323–334.

36

43. TARAKANOVAS, P.; RAUDONIUS, S. 2003. Agronominių tyrimų statistinė analizė

taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, STAT-PLOT iš paketo „Selekcija“ ir

„Irristat“. Akademija, Kėdainių r., p. 57.

44. TEUTONICO, R.A.; KNORR, D. 1985. Amaranth: Composition, properties and

applications of a rediscovered food crop. Food Technology, vol.39, p. 49–60.

45. VAVILOV, N.I. 1926. Studies on the origin of cultivated plants. Bull. Appl.Bot., vol.

16, p. 139–248.

46. VUJAČIĆ, V. 2005: Variability and factor analysis of morphological and productive

characteristics of species of the genus Amaranthus. Faculty of Agriculture, Serbia and

Montenegro, vol. 37(1), p. 1–13.

47. WERNER, T. et al. 2003. Cytokinin – deficient transgenic Arabidopsis plants show

multiple developmental alterations indicatingnopposite functions of cytokinins in the

regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell, vol. 15, p. 2532–2550.

48. http://wisplants.uwsp.edu/scripts/detail.asp?SpCode=AMACRU, [interaktyvus], [žiūrėta

2015-04-15].

49. http://www.biolib.cz/en/image/id182246/, [interaktyvus], [žiūrėta 2015-04-09].

50. http://www.prota4u.info/protav8.asp?g=pe&p=Amaranthus+caudatus+L.,

[interaktyvus], [žiūrėta 2015-05-05].

51. http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Amaranth, [interaktyvus], [žiūrėta 2015-

02-10].

37

DARBO APROBACIJA IR PUBLIKACIJOS

BIČIUS, S. 2015. Burnočio kaliaus genezės indukcija. Jaunasis mokslininkas 2015: studentų

mokslinė konferencija: pranešimų rinkinys. Akademija (Kauno r.), p. 106–109 (priedas Nr.1).

38

PRIEDAI

39

PRIEDAS Nr.1

40

41

42