1
ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETAS
AGRONOMIJOS FAKULTETAS
Biologijos ir augalų biotechnologijos institutas
Svajūnas Bičius
VEIKSNIAI, LEMIANTYS BURNOČIO KALIAUS GENEZĖS
PROCESĄ
Magistro baigiamasis darbas
Studijų sritis: Technologijų mokslai
Studijų kryptis: Biotechnologija
Studijų programa: Agrobiotechnologija
Akademija, 2015
2
Magistro baigiamojo darbo valstybinė kvalifikacinė komisija:
(Patvirtinta Rektoriaus įsakymu Nr. 131–PA)
Agronomijos fakulteto studentų baigiamųjų darbų vertinimo komisijos įvertinimas:
....................................
Pirmininkas: Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Sodo augalų genetikos ir
biotechnologijos skyriaus vedėjas profesorius habil. dr. Vidmantas Stanys (mokslininkas-
praktikas)
Nariai:
Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Augalų fiziologijos laboratorijos vedėjas
profesorius habil. dr. Pavelas Duchovskis (mokslininkas-praktikas)
Agronomijos fakulteto prodekanas, Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentas
dr. Aurimas Krasauskas (mokslininkas)
Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto direktorė, profesorė dr. Natalija Burbulis
(mokslininkas)
Agronomijos fakulteto prodekanė, Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentė dr.
Liuda Žilėnaitė (mokslininkas)
UAB „Euromediena“ direktorius Mindaugas Šilinskas (socialinis partneris-praktikas)
Vadovė
Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentė dr. Aušra Blinstrubienė
Recenzentė
Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto profesorė dr. Natalija Burbulis
Oponentė
Žemės ūkio ir maisto mokslų instituto lektorė dr. Judita Černiauskienė
3
Bičius, S. Veiksniai, lemiantys burnočio kaliaus genezės procesą. Agrobiotechnologijos
studijų programos magistro darbas / Vadovė doc. dr. Aušra Blinstrubienė; ASU. Akademija,
2015, 38 p.: 17 pav., 1 lentelė. Bibliogr.: 51 pavad.
SANTRAUKA
Magistrantūros studijų baigiamajame darbe pateikiamas burnočio kaliaus genezės
proceso tyrimo rezultatas.
Darbo objektas – uodegotojo burnočio (Amaranthus caudatus L.) skilčialapių, lapų ir
hipokotilių eksplantai.
Darbo metodai: Eksplantai (skilčialapiai, lapai, hipokotiliai), auginti MS terpėje su
skirtingais augimo reguliatorių kiekiais: 0 – 3,0 mg 1-1
tidiazuronu (TDZ), 0 – 3,0 mg 1-1
6-
benzilamino purinu (BAP), 0–0,1 mg 1-1
α-naftilacto rūgšties (NAR) kiekiais bei jų deriniais.
Vertintas kaliaus formavimosi dažnis (%) ir kaliaus masė (mg).
Darbo rezultatai: izoliuotų hipokotilių, skilčialapių ir lapų audinių ląstelių
dediferencijacijos procesas prasidėjo praėjus 7–14 dienų po eksplantų izoliavimo. Kaliaus
indukcija vyko visose parinktose terpėse, tačiau kaliaus formavimosi proceso intensyvumas
priklausė nuo augimo reguliatorių derinio maitinamojoje terpėje. Burnočio hipokotilio
audiniai kalių formavo intensyviau nei lapo ir skilčialapio izoliuoti audiniai. Augimo
reguliatorių TDZ ir NAR poveikyje burnočio somatiniai audiniai kalių indukavo intensyviau
nei BAP ir NAR poveikyje. Siekiant indukuoti kaliaus genezę iš burnočio somatinių audinių,
maitinamąją terpę tikslingiausia papildyti 3,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR (lapo
eksplantams), 3,0 mg 1-1
BAP (skilčialapio eksplantams) ir 1,0 mg l-1
TDZ arba 3,0 mg 1-1
BAP (hipokotilio eksplantams). Iš hipokotilio audinių suformuoto kaliaus masė buvo didesnė
nei iš skilčialapio ir lapo izoliuotų audinių.
Reikšminiai žodžiai: augimo reguliatoriai, burnotis, eksplantai, in vitro, kalius.
4
Bičius, S. Factors influencing callus genesis of amaranth. Master thesis of
Agrobiotechnology study program / Supervisor assoc. prof. dr. Aušra Blinstrubienė; ASU.
Akademija, 2015, 38 p.: 17 figures, 1 table. References: 51 titles.
SUMMARY
The master work presents the results of factors affecting amaranthus morphogenesis in
somatic tissue culture.
Object of the work –investigation in vitro was carried out with amaranthus
cotyledons, leaves and hypocotyls explants.
Method of the work – seeds were surface sterilized and placed on MS nutrient
medium without growth regulators, supplemented with 10 g l-1
sucrose and 8 g l-1
Difco
Bacto-agar. Media adjusted to pH 5.5 prior to autoclaving at 115 ºC for 30 min. Culture media
(20 ml) were dispensed into 90 mm diameter Petri dishes and sealed with parafilm. For
investigation in vitro were used explants from sterile culture. The explants were placed on MS
medium supplemented with different combinations of growth regulators. The percentage of
callus formation frequency and weight were calculated.
The results of the work – isolated hypocotyls, cotyledon and leaf tissue cells process
of dedifferentiation began after 7–14 days after isolation of explants. Callus induction
determinate in all selected media, but callus formation process depended on the intensity of
growth regulators in media. Hypocotyls tissue of amaranth formed callus more intensively
than isolated tissue of leaves and cotyledons. Growth regulators TDZ and NAA influenced
more intensive callus induction in somatic tissues of amaranth than the BAP and NAA. To
induce the callus genesis of amaranth in somatic tissues culture the medium purposeful to be
supplement with 3.0 mg 1-1
TDZ + 0.1 mg 1-1
NAA (explants of leaf), 3.0 mg 1-1
BAP
(explants of cotyledons) and 1.0 mg l-1
TDZ or 3.0 mg 1-1
BAP (explants of hypocotyls).
From tissue of hypocotyls the formed mass of callus was higher than from isolated cotyledons
and leaf explants.
Key words: growth regulators, amaranth, explants, in vitro, callus.
5
TURINYS
PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS ........................................................................................................... 6
TERMINŲ IR SĄVOKŲ PAAIŠKINIMAI BEI SANTRUMPOS ........................................... 7
ĮVADAS ..................................................................................................................................... 8
1. LITERATŪROS ANALIZĖ ................................................................................................ 10
1.1. Amaranthus augalų paplitimas ir reikšmė ................................................................ 10
1.2. Amaranthus augalų biologinės ir maistinės savybės ................................................ 13
1.3. Kaliaus indukcija in vitro ......................................................................................... 15
2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS .................................................................................. 18
2.1. Augimo reguliatorių indukcijos terpėje parinkimas ................................................. 21
2.1.1. Tidiazurono (TDZ) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis.................................21
2.1.2. 6-benzilaminopurino (BAP) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis...................21
2.2. Augimo reguliatorių parinkimas intensyviam kaliaus augimui ............................... 21
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ .............................................................. 23
3.1. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus indukcijai ........... 23
3.2. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus augimui .............. 28
IŠVADOS ................................................................................................................................. 32
LITERATŪRA ......................................................................................................................... 33
DARBO APROBACIJA IR PUBLIKACIJOS ........................................................................ 37
PRIEDAI .................................................................................................................................. 38
6
PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS
Paveikslai:
1. 3.1.1 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio skilčialapius ant terpės su TDZ
priedu 23psl.
2. 3.1.2 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių
kultūroje 24psl.
3. 3.1.3 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų
kultūroje 24psl.
4. 3.1.4 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių
kultūroje 25 psl.
5. 3.1.5 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su TDZ
priedu 25 psl.
6. 3.1.6 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių
kultūroje 26 psl.
7. 3.1.7 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų
kultūroje 27 psl.
8. 3.1.8 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su BAP
priedu 27 psl.
9. 3.1.9 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių
kultūroje 28 psl.
10. 3.2.1 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui skilčialapių
kultūroje 29 psl.
11. 3.2.2 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui lapų
kultūroje 30 psl.
12. 3.2.3 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui hipokotilių
kultūroje 31 psl.
7
TERMINŲ IR SĄVOKŲ PAAIŠKINIMAI BEI SANTRUMPOS
Augimo reguliatoriai – tiek natūraliai randami fitohormonai, tiek sintetinės
fiziologiškai aktyvios medžiagos, veikiančios augalų raidą ir vystymąsi.
BAP – 6-benzilaminopurinas.
Dediferenciacija – specializacijos praradimas.
Diferenciacija – kokybinių skirtumų atsiradimas tarp ląstelių, audinių ir organų.
Eksplantas – organo arba audinio dalis auginama maitinamojoje terpėje ir naudojama
audinių kultūrai.
Genotipas – organizmo genų visuma, lemianti individo požymius bei savybes ir jų
kitimą ontogenezės metu.
Hipokotilis – apatinė daigo stiebo dalis nuo šaknies iki skilčialapių.
In vitro – dirbtinai sukurtoje sterilioje aplinkoje.
Kalius – antrinė meristemos masė, natūraliomis sąlygomis aptraukianti pažeistas
augalų vietas ir padedanti joms užgyti, taip pat susidaranti dirbtinai auginant izoliuotas augalo
ląsteles ar audinius in vitro.
Morfogenezė – organų, jų dalių ir sistemų atsiradimas bei raida organizmų
ontogenezės ir filogenezės metu.
MS – Murashige ir Skoog maitinamoji terpė.
NAR – α-naftilacto rugštis.
Organogenezė – tai organų susidarymas ir auginimas iš ląstelių ar audinių.
Sterilios sąlygos – augalų audinių kultūroje pasiekiamos autoklavuojant
instrumentus, kultūrų indus, terpę bei operacinėse dezinfekuojant įrenginių paviršius, juos
nuvalant alkoholiu ar kitu dezinfekuojančiu tirpalu.
Subkultivavimas – eksplanto ar audinio perkėlimas ant kitos šviežios maitinamosios
terpės.
TDZ – Tidiazuronas
8
ĮVADAS
Burnočiai priskiriami dviskilčių (Dicotyledones) klasei, gvazdikažiedžių
(Caryophyllidae) eilei, burnotinių (Amaranthaceae) genčiai. Ji kartu su balandinių
(Chenopodium) gentimi sudaro negausią pseudovarpinių augalų grupę, kurie gali produkuoti
didelės maistinės vertės sėklas. Tai – vienamečiai žoliniai augalai, kurių liemeninė šaknis,
sudaro apie 15 % viso augalo biomasės. Jie gali augti įvairiomis klimato sąlygomis ir
įvairiuose dirvožemiuose, bet geriausiai auga derlingose priemolio dirvose.
Amaranthus priklauso C4 augalų grupei, kuri 2–3 kartus intensyviau sugeria CO2
dujas nei dauguma kitų augalų, priklausančių C3 grupei bei sunaudoja dvigubai mažiau
vandens fotosintezės procesui. Dėl šios priežasties burnočiai – atsparesni sausroms ir
pakankamai gerai auga ten, kur per metus kritulių kiekis svyruoja nuo 200 mm. iki 3000 mm.
Burnočių efektyvesnė fotosintezė, intensyvesnė azoto apykaita ir dėl fotosintezės struktūros,
funkcionavimo bei fiziologinių–biocheminių metabolitinių procesų ypatumų – didesnis
produktyvumas. Burnočiai kaupia vertingus subalansuotus augalinius baltymus. Jų lapai
išsidėstę taip, kad neužstoja vieni kitų ir maksimaliai išnaudoja saulės energiją. (Edwards,
Walker, 1983; Furbank, Hatch, 1987; Bui van Le. et al., 1998; Svirskis, 2007). Dabar yra
selekcionuotos 4 burnočių grupės: salotiniai (lapiniai), grūdiniai, dažiniai ir dekoratyviniai
(Conforti et al., 2005; Svirskis, 2007).
Burnočių sėklose vidutiniškai yra 15–17 % baltymų, 5,7–10,0 % riebalų, 3,7–5,7%
ląstelienos. Iš sėklų išgaunama – 5,7–9,5 % aliejaus, kuriame yra – 77 % nesočiųjų riebalų
rūgščių, iš jų apie 50 % linoleno ir linolio, 4,8–7,0 % skvaleno, retos formos tokotriemo
pavidalo vitamino E (Paredes-Lopez, 1994; Conforti et al., 2005; Tamer et al., 2006; Svirskis,
2007).
Amaranthus caudatus L. auginamas kaip maistinis pasėlis Anduose, Ekvadore, Peru,
Bolivijoje ir Argentinoje, dėl šios priežasties šiuose kraštuose aptinkama didžiausia genetinės
įvairovė (Agong, Ayiecho, 1991). Pastaruoju metu susidomėta burnočiu kaip perspektyviu
žemės ūkio augalu, jo grūdais, žaliąją mase, maistinėmis savybėmis (Coimbra, Salem; 1994,
Svirskis, 2007).
Pasaulyje atrinktos ir įvertintos agronomiškai perspektyvios burnočių rūšys ir veislės:
A. cruentus ‘Amont’, A. hypochondriacus ‘Intense Purple’, A. caudatus, A. hibridus.
Burnočio selekcijoje, atrinktų atsparių genotipų, vyriškų sterilių augalų padauginimui
ar naujų formų kūrimui taikoma audinių kultūra. Literatūroje nurodoma, kad Amaranthus
genties atrinktų genotipų kaliaus indukcija ir morfogenezės procesas in vitro priklauso nuo
eksplanto audinių amžiaus, tipo, citokininų ir auksinų derinio maitinamojoje terpėje (Flores et
9
al., 1982; Bennici et al., 1992; Coleman et al., 2003). Kaliaus indukcijai ir organogenezės
procesui burnočių hipokotilių kultūroje buvo tinkamiausi NAR ir BAP, 2,4-D augimo
reaguliatorių deriniai (Bennici et al., 1997; Guidea et al., 2012).
Hipotezė – parinkus tinkamą eksplanto tipą ir augimo reguliatorių derinį
maitinamojoje terpėje galima indukuoti burnočio kaliaus genezę in vitro sistemoje.
Tyrimų tikslas: įvertinti eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikį burnočio
kaliaus genezei in vitro.
Tyrimuose kelti uždaviniai:
1. ištirti skirtingų eksplanto tipų (skilčialapių, lapų ir hipokotilių) gebą formuoti
kalių;
2. nustatyti augimo reguliatorių poveikį kaliaus indukcijai somatinių audinių
kultūroje;
3. įvertinti eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikį kaliaus augimui.
10
1. LITERATŪROS ANALIZĖ
1.1. Amaranthus augalų paplitimas ir reikšmė
Amaranthus L. – burnotis, priskiriamas augalų (Plantae) karalystei, magnolijūnų
(Angiospermae) skyriui, magnolijainių (Magnoliopsida) klasei, (Caryophyllales) eilei,
(Amaranthaceae) šeimai, (Amaranthus) genčiai. Kilęs iš Pietų Amerikos. Burnočiai buvo
pradėti auginti senovės vidurio Amerikoje, sukultūrinti Amaranthus cruentus L. ir
Amaranthus hypochondriacus L. auginami tūkstančius metų, inkų civilizacijoje ir paplito
visoje centrinėje ir šiaurinėje Andų inkų imperijoje (Sauer, 1967; Coons, 1977; Costea et al.,
2006). Šiame regione auginama daug sukultūrintų augalų, kurie pasižymi dideliu baltymų
kiekiu. Į šią augalų grupę priskiriamos ir bolivinė balanda (Chenopodium quinoa Willd.) bei
blyškioji balanda (Chenopodium pallidicaule Aellen). Amaranthus gentyje yra apie 60–70
rūšių, kurios auga ir yra paplitę pasaulyje, tačiau dauguma yra laukiniai (Vavilov, 1926;
Hawkes, 1999; Svirskis, 2007; Kraujalis, 2013).
Grūdams plačiausiai naudojamos 3 burnočių rūšys: raibasis (A. cruentus L.), hibridinis
(A. hypochondriacus L.) ir uodegotasis (A. caudatus L.) (1.1.1 pav.).
Burnotis – vienametis diploidinis augalas, vertinamas dėl kaupiamo didelio
aminorūgšties lizino kiekio, kuris labai svarbus žmonių mitybai. Šiame augale lizino yra
dukart daugiau nei kviečiuose, tris kartus daugiau nei kukurūzuose ar soruose, tad galima
prilyginti sojoms bei karvės pienui. Augaluose gausu kalcio, geležies, magnio, fosforo, kalio.
Kitaip, nei daugelyje javų rūšių, burnočiuose beveik nėra gliuteninų, kurie daugeliui žmonių
sukelia alergiją (Sauer, 1967; Coons, 1977; Costea et al., 2006).
Augalai užauga virš dviejų metrų aukščio ir subrandina iki 50 tūkst. sėklų (1.1.2 pav.).
Žiedynų ilgis gali būti daugiau kaip metras. Apsėti hektarui reikia tik 0,5–3,0 kg sėklos.
Burnočiai nėra reiklūs, todėl gali augti ir prastesniame dirvožemyje, atsparūs sausrai, karščiui,
jų beveik nepuola kenkėjai. Lietuvoje šių augalų sėklų derlius siekia nuo 1 iki 6 t ha-1
, o žalios
masės – iki 70 t ha-1
. Žaliąją burnočių masę galima prilyginti liucernoms. Tačiau šį augalą
nelengva tinkamai pasėti ir iškulti, dėl labai smulkių jų sėklų, nėra pakankamai ištirti kovos su
piktžolėmis metodai, tręšimo klausimai. Burnočių sėklos neturi ilgo ramybės periodo, todėl
dalis išsibarsčiusių sėklų sudygsta kitais metais ir užteršia pasėlius.
11
a
b
c
1.1.1 pav. Raibasis (a), hibridinis (b) ir uodegotasis (c) burnočiai
(a)http://wisplants.uwsp.edu/scripts/detail.asp?SpCode=AMACRU;
b)http://www.biolib.cz/en/image/id182246/;
c)http://www.prota4u.info/protav8.asp?g=pe&p=Amaranthus+caudatus+L.)
12
Selekcionuojant burnočius, atsižvelgiama į didelį jų derlingumą, sėklų spalvą, stiebų
aukštį, ankstyvumą, cenozės pastovumą, sėklų išsibarstymą, geras maistines ir naudojimo
savybes. Šiuo metu yra selekcionuotos 4 burnočių grupės: salotiniai (lapiniai), grūdiniai,
dažiniai ir dekoratyviniai (Conforti et al., 2005; Svirskis, 2007; Jakienė ir kt., 2013).
1.1.2 pav. Burnočio morfologija
(http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Amaranth)
Burnočiai – jautrūs herbicidams. Šiuos augalus galima auginti kaip monokultūrą.
Didžiausią derlių galima gauti burnočius pasėjus gegužės viduryje 2–4 kg ha-1
, 50 cm pločio
tarpueiliais ir iškūlus išdžiūvusius po didelių šalnų (–3–5 °C). Optimaliausias sėklų nuėmimo
būdas – tiesioginis burnočių kombainavimas.
13
Burnotis buvo plačiai auginamas Meksikoje, Pietų ir Centrinėje Amerikoje dar prieš
5–6 tūkstančius metų. Tai buvo svarbiausias kasdieninis Actekų genties maistas, ir, tikint šios
genties antgamtinėmis galiomis, būtent burnotis buvo naudojamas jų religiniuose ritualuose.
Iki 1519 metų, ispanų invazijos, burnotis buvo naudojamas aukojimo apeigose: actekų genties
moterys ruošdavo malto burnočio ir medaus mišinį, iš kurio formuodavo įvairias figūrėles,
užlašindavo žmogaus kraujo ir aukodavo. Užėję ispanų konkistadorai pasibaisėjo tokiomis
apeigomis ir, atnešę krikščionybę į tuos kraštus, uždraudė burnočio auginimą bei naudojimą
bet kokiems tikslams. Be galo vertingas augalas išnyko iš žmonijos mitybos raciono ilgiems
šimtmečiams. Šiomis dienomis burnotį vėl bandoma auginti eksperimentiniuose ūkiuose, juo
prekiaujama sveiko maisto parduotuvėse ar turguje (O'BrienandPrice, 1983; Sauer, 1967;
Iturbide, Gispert, 1994; Svirskis, 2007).
Burnotis buvo tarsi pamirštas augalas ir nebuvo toks populiarus kaip kukurūzai, gal
būt dėl mažo augalo sėklų dydžio ir nevienodo žiedyno brendimo laikotarpio. Tačiau nuo XX
amžiaus vidurio šis augalas yra plačiai tiriamas visame pasaulyje, ir pripažintas XXI amžiaus
vienu iš perspektyviausių augalų. Lietuvoje burnočio tyrimų pradininkas profesorius Antanas
Svirskis, kuris tyrė augalo auginimo technologijas sėkliniams pasėliams, cheminės sudėties
kitimus pagal klimatines sąlygas ir burnočių auginimą pašarui galvijams, maistui ar jo
papildus žmonėms (Svirskis, 2007).
1.2. Amaranthus augalų biologinės ir maistinės savybės
Amaranthus priklauso C4 augalų grupei, kuri 2–3 kartus intensyviau sugeria CO2
dujas nei dauguma kitų augalų, kurie priklauso C3 grupei. Tyrimais nustatyta, kad burnočiai
prisitaiko prie daugelio abiotinių veiksnių esančių gamtoje ir ypač sausrų. Dėl šių priežasčių
inkų kultūroje jis buvo vadinamas „nemirtingąją gėlė“ (Edwards, Walker, 1983; Furbank,
Hatch, 1987; Vujačić, 2005; Svirskis, 2007). C4 augalų fotosintezės intensyvumas (40–80 mg
CO2dm-2
x h), lyginant su C3 augalų (15–40 mg CO2dm-2
x h) fotosintezės intensyvumu, yra
dvigubai didesnis, todėl C4 augalai greičiau auga ir būna daug produktyvesni negu C3
augalai. Kiekvienas jų lapų paviršiaus dm2per dieną vidutiniškai pagamina 4–5 g sausųjų
medžiagų, o C3 augalų – tik 0,5–2,0 g. Kadangi C4 augalai sugeba koncentruoti CO2, jų lapų
žiotelės dieną gali būti privertos, o fotosintezės intensyvumas lieka toks pat. Dėl to C4 augalai
atsparesni sausrai, optimaliau naudoja vandenį: vieną gramą sausųjų medžiagų C4 augalai
pagamina, išgarinę 250–350 g, o C3 augalai – 450–950 g vandens (Pilipavičius, 2008). C4
augalai naudoja mažiau vandens nei C3 augalai ir fotosintezės procesui jo sunaudoja dvigubai
mažiau. Dėl šios priežasties, burnočių pasėliai gali būti perspektyvūs karšto ir sauso klimato
14
regionuose, kur per metus kritulių kiekis svyruoja nuo 200 mm iki 3000 mm. C4 augalų,
fotosintezės anglies metabolizmas sudėtingesnis nei C3 augalų (Hauptli, 1977; Furbank,
Walkeris, 1985; Paredes Lopez, 1989). Vyksta intensyvesnė ir efektyvesnė fotosintezė bei
azoto apykaita dėl fotosintezės struktūros, funkcionavimo bei fiziologinių–biocheminių savitų
metabolitinių procesų – didesnis produktyvumas, todėl burnočiai kaupia vertingus
subalansuotus augalinius baltymus. Jų lapai yra išsidėstę taip, kad neužstoja vieni kitų todėl
yra maksimaliai išnaudojama saulės energija (Edwards, Walker, 1983;Furbank, Hatch, 1987;
Svirskis, 2007).
Jaunuose burnočių lapuose gali susikaupti iki 3,5 % baltymų, 0,3 % riebalų, 6,8 %
kalcio ir kitų mineralinių medžiagų, taipogi daug vitaminų A, B, C ir beta karotino( Svirskis,
2007)
Burnočių sėklose vidutiniškai yra 15–17 % baltymų, 5,7–10,0 %, riebalų, 3,7–5,7 %
ląstelienos, lizino 5,3 %, vitamino C 4,2 %, krakmolo, kuris susideda ir mikro kristalinių, 1–3
mm skersmens krakmolo granulių, kurios pasižymi dideliu brinkimo potencialu( Tamer et al.,
2006; Conforti et al., 2005).
Iš sėklų aliejaus išgaunama – 5,7–9,5 %. Aliejuje – 77 % nesočiųjų riebalų rūgščių, iš
jų apie 50 % linoleno ir linolio, 4,8–7,0 % skvaleno, retos formos tokotriemo pavidalo
vitamino E (Paredes-Lopez, 1994; Conforti et al., 2005; Tamer et al.; 2006 Svirskis, 2007;).
Nustatyta, kad burnočių aliejaus sudėtyje, palyginti su tradicinėmis vasarinių ir žieminių
rapsų aliejumi (30 %.), yra pakankamai daug polinesočiųjų (50,15 %) ir net keturis kartus
daugiau sočiųjų riebalų rūgščių, atitinkamai 6 % ir 22,58 %. Burnočių aliejuje vyrauja linolo
(49,61%), oleino (19,52 %) ir sočioji palmitino riebalų rūgštis (17,91 %.). Tai yra linolinis
aliejus, tuo tarpu sėmenų aliejus yra linoleninis (alfa linoleno riebalų rūgštis – 61,17 %)
(Gruzdienė, 2007).
Burnočių sėklų skonis panašus į riešutų. Sėklos baltymingesnės negu dauguma kitų
javų grūdai, su žymiai didesniu lizino kiekiu ir triptofano bei metionino, šių medžiagų būna
mažesniais kiekiais ankštinėse kultūrose (Teutonico, Knorr, 1985; Mendoza, Bressani, 1987).
Peru uodegotasis burnotis yra naudojamas užkandžių ‘turrones’ gaminimui. Paskrudintų sėklų
miltai yra naudojami sriuboms, avižinei košei ir sausainiams gaminti. Miltai gali būti
naudojami kepant duoną, pakeičiant dalį kviečių miltų. Kad pagaminti puikios kokybės
duonos raugą gali būti panaudojami mišiniai – 80 % kviečių ir 20 % bolivinės balandos. Šita
duona masižymi geresnę maistinę kokybę negu duona iškepta iš kviečių miltų (AACC
REPORT, 2001). Po burnočio grūdų kūlimo, likutis gali būti naudojamas kaip ganiava
įvairiems galvijams. Andų ūkininkai tradiciškai po kūlimo likusia biologinę masę palieka
15
savo gyvuliams sausajam sezonui (AACC REPORT; Svirskis, 2007; Repo-Carrasco-
Valencia, 2009).
Burnočio lapai yra naudojami kaip špinatai (Spinaciaoleracea L.), nes lapuose gausu
baltymų, kitų maistinių ir vaistinių medžiagų. 150–200 g lapų maistinė vertė prilygsta 1 kg
pomidorų ar agurkų. Džiovintos sėklos naudojamos kaip javų grūdai, kurie gali būti laikomi
ištisus metus ir nepakinta jų baltymų kokybė. Raudonųjų veislių burnočiai naudojami kaip
dažikliai tradiciniuose gėrimuose Peru ir Ekvadore. Šviežios šaknys, lapai ir džiovinti grūdai
naudojami tradicinėje medicinoje: skrandžio opoms, diarėjoms, gastroenteritui, viduriavimui,
kolitui, hepatitui, nutukimui, atesklerozei galvos skausmui ir daugelio kitų negalavimų. Bet
labiausiai XX amžiuje Europoje, Afrikoje, Azijoje ir Amerikos žemynuose šis augalas išplito
kaip dekoratyvinis augalas, dėl savo gražaus, raudono, stambaus žiedyno (Pedersen et al.,
1987, Espitia, 1992; Svirskis, 2007).
1.3. Kaliaus indukcija in vitro
Kalius – tai neorganizuotas, netvarkingai ir padrikai augantis audinys, susidarantis iš
dedifirencijuotų ląstelių. Pirminė kaliaus susidarymo priežastis augalo audinių ar dalių
mechaniniai pažeidimai, kai ant pažeidimo vietų susidaro kalius, kuris apsaugo pažeistą
augalo vietą nuo infekcijų taip apsaugodamas likusią augalo dalį ir leisdamas toliau jam augti
jei nepažeistos gyvybiškai svarbios augalo dalys kai augalas auga natūraliomis ne in vitro
sąlygomis. In vitro sąlygomis kaliaus susidarymas nuo in vivo sąlygų skiriasi tuo, kad
steriliose sąlygose kaliaus susidarymas ant eksplanto yra svarbus ir naudingas procesas
biotechnologiniu požiūriu. Kaliaus augimo galimybė priklauso nuo eksplanto tipo, dydžio,
auginimo sąlygų, augalo rūšies, genetinės augalo informacijos, amžiaus, augimo tarpsnio,
eksplanto tipo. Kai kurie mokslininkai pamini mėnulio fazę ir metų laiką kaip svarbius
indikatorius kaliaus genezės procesui.
Kalius būna įvairių spalvų: žalsvos, raudonos, baltos, gelsvos ir įvairių atspalvių
priklausomai nuo antocianų pigmentų kiekio, kurie skirtingai kaupiasi skirtinguose augaluose
ir augalo dalyse priklausomai nuo kaliaus amžiaus, genetinės informacijos ir augimo sąlygų.
Dėl šių jau paminėtų veiksnių gali skirtis ir kaliaus konsistencija. Jis gali būti purus, vidutinio
tankumo ir tankus audinys.
Vienas iš pagrindinių biotechnologijos procesų – yra kaliaus indukcija kurios metu
vystymosi signalai veikia tinkamas ląsteles, kad jų būsena būtų pakeista, galutinis rezultatas –
determinuotas ląstelių susidarymas.
16
Pats svarbiausias veiksnys – maitinamoji terpė. Kad vystytųsi augalas reikalinga į
maitinamąją terpę įdėti augimo reguliatorių, kurie būna: auksinai, citokininai ir giberalinai. Jie
visi skatina augalo eksplanto vystymąsi ir kaliaus formavimąsi.
Kaliaus indukcijai tai pat daug įtakos turi ir augimo sąlygos: temperatūra, foto
periodas, terpes pH ir augimo reguliatorių tarpusavio ir tarp augalo hormonų pasiskirstymas
(Sliesarevičius, 2005; Duchovskis, 2006; Stanienė, 2006; Burbulis, 2009).
Kaliaus kultūroje morfogenezė yra organizuotų struktūrų susidarymas iš
neorganizuotos ląstelių masės. Augalų ggebėjimą regeneruoti in vitro lemia somatinių augalų
ląstelių totipotentiškumas (Burbulis ir kt., 2009). Totipotentiškumas – tai somatinių augalų
ląstelių savybė, atspindinti jų sugebėjimą elgtis kaip zigotai ar meristemos pirminėms
ląstelėms, reguliuojant ir išreiškiant genetinę bei epigenetinę informaciją, kuri reikalinga
atskirų augalo organų ar viso organizmo vystymuisi (Kuusienė, 2007). Tik dalis ląstelių yra
potencialiai pajėgios pereiti naują morfogenetinio vystymosi kelią. Tam jos turi būti
aktyvuojamos kompleksiniais signalais. Morfogenezės signalo veikiama kaliaus ląstelė turėtų
būti determinuota, tačiau praktikoje tik viena iš 400–1000 ląstelių yra naujo augalinio
organizmo pradžia. Vadinasi, vien tik morfogenezės signalo nepakanka, todėl ląstelė turi būti
pasiruošusi tą signalą priimti, ir tai vadinama ląstelės kompetentiškumu (Burbulis ir kt.,
2009).
In vitro kaliui indukuoti dažnai naudojamas kelių milimetrų dydžio stiebo, šaknies,
hipokotilio ar gemalo gabalėlis ir auginamas steriliomis sąlygomis ant maitinamosios terpės,
turinčios reikiamų makroelementų ir mikroelementų, augimo reguliatorių, vitaminų bei
angliavandenių. Iš tokio audinio pradeda formuotis nediferencijuotos ląstelės – kalius.
Išaugusi ląstelių grupė atrodo kaip kolonija. Kalius gali ilgai augti ir dalintis ant
maitinamosios terpės, jeigu jis kas keletą savaičių subkultivuojamas. Kalius yra puri ląstelių
masė, kurią galima skaidyti į atskiras ląsteles. Tačiau tai priklauso nuo kaliaus amžiaus, terpės
sudėties ir kitų veiksnių (Pliūra ir kt., 2006).
Kaliaus kultūra sudaro galimybę regeneruoti augalus iš skirtingų augalų genotipų,
kuriems yra būdingаs gausus sėklų derlius, atsparumas ligoms, šalčiui. Yra nustatyta, kad
kaliaus kultūra gali pakeisti genų raišką. Dėl šios priežasties dažniausiai ir yra tikimasi
dauginant augalus in vitro sąlygomis per kalių išvesti augalus kurie butu agronominiu
požiūriu tobulesni (Rutkowska-Krause et al., 2003; Blinstrubienė, 2005).
Pirmasis etapas yra išsirinkti maitinamąją terpę, kuri tiktų pasirinkto augalo
pasirinktam eksplantui pagal augalo augimo tarpsnį, rūšį, eksplanto tipą ir norimą pasiekti
rezultatą. Maitinamosios terpės atlieka dvi pagrindines funkcijas: suteikia maistines
medžiagas ir sudaro vietą augti in vitro sąlygoms eksplantui. Pagrindinės maitinamosios
17
terpės pasaulyje naudojamos White (1943); Murashige, skoog (MS) (1962) ir Gamborg (B5)
(1968). Bet plačiausiai naudojama nesumedėjusiems augalams MS maitinamoji terpė, kuri yra
papildyta makro ir mikroelementais, vitaminais, angliavandeniais, augimo reguliatoriais ir
papildytos standikliu. Dažniausiai biotechnologijos procesuose su augalais, jų raidai
naudojama MS maitinamoji terpe su skirtingais citokininu, auksinu ir giberalinų santykiais
tarpusavyje.
Kiekvienas augimo reguliatorius augalui siunčia skirtinga signalą inicijuodamas
kaliaus augimą. Giberelinas, augalų augimo hormonas, skatinantis augimo kūgelio ląstelių
dalijimąsi, lapkočio tįstamąjį augimą, sėklų dygimą, stiebo , augalo vystymąsi; slopina
ląstelių diferenciaciją, chlorofilo susidarymą.
Auksinai tai augimo reguliatoriai lemiantys augalų augimą į ilgį, ląstelių dalijimąsi bei
diferenciaciją, šaknų formavimąsi iš nuopjovų, vaisių formavimąsi, augalų atsiskyrimą
dalimis. Dėl auksino ląstelės siurbia H+ į savo sieneles, pH pokytis lemia fermentų, kurie
skaido skersinius ryšius sienelėse, aktyvavimą, o dėl turgorinio slėgio ląstelės automatiškai
ilgėja.
Dabartiniu metu yra suskaičiuojama apie 200 įvairių natūralių ir sintetinių citokininų
rūšių. Dažniausiai augaluose cirkuliuoja natūralus citokininas, vadinamas zeatinu. Sintetiniai
citokininai kinetinas ir BAP pasižymi dideliu aktyvumu (Werner et al., 2003; Sakakibara,
2006). Citokininas skatina dediferencijuotų ląstelių dalijimąsi ūglių, pumpurų formavimąsi,
skatina chlorofilo sintezę (Werner et al., 2003).
Skirtingi augimo reguliatoriai gali veikti augalą neatpažįstamai skirtingai: parinkus
netinkamus augimo reguliatorių ar jų derinį gali slopinančiai veikti augalą arba sustabdyti
visiškai augalo kaliusavimą ir augimą. O parinkus teisingai terpę galima gauti netik norimus
rezultatus, bet ir dar iki šiol nepastebėtus morfogenezės pakitimus arba pradėti iš eksplanto
tiesioginę organogenezę. Svarbus aspektas yra ir koncentracijų parinkimas. Parenkant terpes
mokslininkai kartais dirba ištisus metus (Stanienė, 2006; Burbulis, 2009; Sliesarevičius, 2005;
Duchovskis, 2006).
18
2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS
Tyrimų vieta. Tyrimai atlikti Aleksandro Stulginskio universiteto Agronomijos
fakulteto Biologijos ir augalų biotechnologijos institute, JTC Agrobiotechnologijos
laboratorijoje 2014–2015 metais.
Tyrimų objektas: uodegotasis burnotis (Amaranthus caudatus L.).
Eksplantų paruošimas. Burnočio sėklos 1 val. plautos tekančiu vandeniu, 10 min.
sterilintos kalio permanganato tirpale 10%, 1 min. – 70 % etanolio vandeniniame tirpale ir 2
min. 10 % kalio hipochlorito tirpale, po to 3 kartus po 5 min. plautos steriliame distiliuotame
vandenyje. Sėklos daigintos Murashige ir Skoog (MS) (Murashige, Skoog, 1962)
maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių, papildytoje 30 g l-1
sacharozės ir 8 g l-1
agaro
(2.1 pav., 2.1 lentelė). Terpės pH – 5,7 ± 0,1. Maitinamoji terpė autoklavuota 115 oC
temperatūroje 30 min., išpilstyta po 20 ml į 90 mm skersmens Petri lėkšteles ir užsandarinta
parafilmu (2.2 pav.). Kultūra auginta 22±2 oC temperatūroje, esant 50 μmol m
-² s
-¹
apšvietimui, 16/8 h (diena/naktis) fotoperiodui.
2.1 pav. Burnočio sterilios sėklos ant MS
maitinamosios terpės be augimo reguliatorių
2.2 pav. Sterili maitinamoji terpė Petri
lėkštelėse
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.
Eksperimentams naudoti 9–10 dienų daigai. Burnočio morfogenezei somatinių
audinių kultūroje tirti naudoti skilčialapių, lapų ir hipokotilių eksplantai (2.3 pav.). Eksplantai
auginti MS maitinamojoje terpėje su skirtingais augimo reguliatorių kiekiais. Maitinamoji
terpė, papildyta 30 g l-1
sacharozės ir 8 mg l-1
agaru. Terpės pH – 5,7 ± 0,1. Sterili audinių
kultūra auginta auginimo kambaryje, kuriame šviesos intensyvumas – 50 μmol m-2
s-1
,
fotoperiodas – 16/8 h (dieną/naktį), aplinkos temperatūra – 22 ± 20
C.
19
2.1 lentelė. Murashige ir Skoog (MS) maitinamosios terpės sudėtis
Medžiaga Kiekis mg l-1
Makroelementai
NH4NO3 1650
Ca(NO3)2•4H2O -
KNO3 1900
KCl -
(NH4)SO4 -
CaCl2•2H2O 400
MgSO4•7H2O 370
Na2SO4 -
H2PO4 170
NaH2PO4•4H2O -
NaH2PO4 -
Mikroelementai
CoCl2•6H2O 0,025
CuSO4•5H2O 0,025
H3BO3 6,20
KI 0,830
MnSO4•4H2O 22,30
MnSO4•H2O -
Na2MoO4•2H2O 0,25
ZnSO4•7H2O 8,60
FeSO4•7H2O 27,80
Fe2(SO4)3 -
Na2 EDTA•2H2O 37,30
Vitaminai
Mezoinozitas 100
Tiaminas HC1 0,10
Piridoksolis HC1 0,50
Nikotino rūgštis 0,50
Glicinas 2,00
Priedai
Sacharozė 10 000-30 000
Agaras 8 000
pH 5,7± 0,1
20
a
b
c
2.3 pav. Burnočio skilčialapių (a), lapų (b) ir hipokotilių (c) eksplantai
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.
21
2.1. Augimo reguliatorių indukcijos terpėje parinkimas
2.1.1. Tidiazurono (TDZ) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis
Tirti skirtingi citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai MS maitinamojoje terpėje:
be augimo reguliatorių (kontrolė);
0,5 mg l-1
TDZ;
1,0 mg l-1
TDZ;
2,0 mg l-1
TDZ;
3,0 mg l-1
TDZ;
0,5 mg l-1
TDZ + 0,1 mg l-1
NAR;
1,0 mg l-1
TDZ + 0,1 mg l-1
NAR;
2,0 mg l-1
TDZ + 0,1 mg l-1
NAR;
3,0 mg l-1
TDZ + 0,1 mg l-1
NAR.
Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1
sacharozės ir 8 g l-1
agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.
2.1.2. 6-benzilaminopurino (BAP) ir α naftilacto rūgšties (NAR) poveikis
Tirti skirtingi citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai MS maitinamojoje terpėje:
be augimo reguliatorių (kontrolė);
0,5 mg l-1
BAP;
1,0 mg l-1
BAP;
2,0 mg l-1
BAP;
3,0 mg l-1
BAP;
0,5 mg l-1
BAP+ 0,1 mg l-1
NAR;
1,0 mg l-1
BAP+ 0,1 mg l-1
NAR;
2,0 mg l-1
BAP+ 0,1 mg l-1
NAR;
3,0 mg l-1
BAP+ 0,1 mg l-1
NAR.
Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1
sacharozės ir 8 g l-1
agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.
2.2. Augimo reguliatorių parinkimas intensyviam kaliaus augimui
be augimo reguliatorių (kontrolė);
2,0 TDZ+0,1 NAR;
22
3,0 TDZ+0,1 NAR;
2,0 BAP+0,1 NAR;
3,0 BAP+0,1 NAR.
Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1
sacharozės ir 8 g l-1
agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.
Eksperimento metu buvo auginta po 80 kiekvieno varianto eksplantų, tyrimas atliktas
trimis pakartojimais. Po 28 auginimo parų vertintas kaliaus susidarymo dažnis (%) ir kaliaus
prieaugio masė (mg).
Duomenys statistiškai apdoroti kompiuterinėmis programomis STAT 1,55 ir
ANOVA iš programų paketo “Selekcija” (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Rezultatų
patikimumas įvertintas dispersinės analizės metodu, duomenys sugrupuoti pagal Dunkano
kriterijų (P ≤ 0,05)
23
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ
3.1. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus indukcijai
Burnočio izoliuotų skilčialapių, lapų ir hipokotilių audinių ląstelių dediferencijacijos
procesas prasidėjo praėjus 7–14 dienų po eksplantų izoliavimo.
Skilčialapių kaliaus indukcijos (3.1.1 pav.) intensyvumas priklausė nuo augimo
reguliatorių derinio (3.1.2 pav.).
3.1.1 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio skilčialapius ant terpės su TDZ priedu
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.
MS maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių izoliuoti skilčialapiai kaliaus
neformavo. Terpėse, papildytose tik citokininu (0,5–3,0 mg 1-1
) TDZ, kaliaus formavimosi
dažnis kito nuo 75,5 iki 93,5 %. Eksplantai, terpėje su 2,0 mg 1-1
TDZ ir 3,0 mg 1-1
TDZ
vidutiniškai kalių formavo 91,2 ir 93,5 % dažniu.
Terpę papildžius 0,5 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR, 1,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR, 2,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR, nustatyta, kad auksino priedas neturėjo esminės
teigiamos įtakos įzoliuotų skilčialapių ląstelių dediferenciacijai, kuris didino kaliaus
susidarymo dažnį. Statistiškai patikimai intensyviausia (97,1 %) skilčialapių kaliaus indukcija
vyko terpėje su 3,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR.
24
3.1.2 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
MS maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių, burnočio izoliuoti lapų eksplantai
kaliaus neformavo (3.1.3 pav.). Vertinant citokinino 0,5 mg 1-1
TDZ, 1,0 mg 1-1
TDZ, 2,0 mg
1-1
TDZ, 3,0 mg 1-1
TDZ priedą maitinamojoje terpėje nustatyta, kad didinant TDZ kiekį
maitinamojoje terpėje, kaliaus formavimosi dažnis tendencingai didėjo (nuo 62,5 iki 75,7 %).
3.1.3 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015m.
25
Statistiškai patikimai intensyviau kalių formavo izoliuoti lapų eksplantai
maitinamojoje terpėje, papildytoje ne tik citokininu TDZ, bet ir auksinu NAR. Nustatyta, kad
šie eksplantai daugiausiai kaliaus suformavo terpėse, papildytose 2,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR bei 3,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR. Kaliaus susiformavimo dažnis vidutiniškai
padidėjo nuo 19,9 iki 26,4 %, lyginant su terpe, papildyta tik citokininu TDZ.
Izoliuoti hipokotiliai, skirtingai nei skilčialapių ir lapų eksplantai, maitinamojoje
terpėje be augimo reguliatorių kalių formavo 17,3% dažniu (3.1.4 pav.).
3.1.4 pav. TDZ ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
Citokinino 1,0–3,0 mg 1-1
TDZ poveikyje hipokotilių eksplantai kalių formavo
vidutiniškai 5,6 karto intensyviau nei kontrolėje, kaliaus indukcija vyko 100% (3.1.5 pav.).
3.1.5 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su TDZ priedu
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.
26
Citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai maitinamosiose terpėse esminės teigiamos
įtakos kaliaus indukcijai neturėjo. Terpę papildžius 1,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR kaliaus
indukcija sumažėjo 3,6%, lyginant su terpę, papildyta tik 1,0 mg 1-1
TDZ.
Vertinant citokinino BAP ir jo derinių su auksinu NAR poveikį skilčialapių kaliaus
indukcijai nustatyta, kad terpėje be augimo reguliatorių kalius nesiformavo (3.1.6 pav.).
Skilčialapių eksplantai, terpėse 0,5 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, 1,0mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-
1 NAR, 2,0 mg 1
-1 BAP + 0,1 mg 1
-1 NAR kalių formavo vidutiniškai nuo 72,6 % iki 100 %
dažniu. Auksino priedas maitinamojoje terpėje didino kaliaus indukcijos dažnį tik derinyje su
mažiausia citokinino BAP koncentracija. Statistiškai patikimai intensyviausia skilčialapių
kaliaus indukcija vyko terpėse, papildytose 3,0 mg 1-1
BAP ir 3,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR.
3.1.6 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų skilčialapių kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
Burnočio izoliuoti lapų eksplantai kalių formavo tik terpėse, papildytose tirtais
augimo reguliatorių deriniais (3.1.7 pav.). MS maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių,
kaliaus indukcija nevyko. Kaliaus formavimosi intensyvumas maitinamosiose terpėse,
papildytose tik citokininu 0,5 mg 1-1
BAP, 1,0 mg 1-1
BAP, 2,0 mg 1-1
BAP, 3,0 mg 1-1
BAP
kalių formavo nuo 54,3 iki 78,2 % dažniu. Eksplantai, terpėse su citokinino BAP ir auksino
NAR priedu (0,5 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, 1,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, 2,0 mg 1-
1 BAP + 0,1 mg 1
-1 NAR, 3,0 mg 1
-1 BAP + 0,1 mg 1
-1 NAR) kaliaus vidutiniškai suformavo
nuo 75,4 % iki 90,8 %. Izoliuoti burnočio lapų audiniai statistiškai patikimai daugiau kaliaus
indukavo maitinamosiose terpėse papildytose citokinino BAP ir auksino NAR deriniu,
vidutiniškai 1,2 karto, lyginant su terpėmis papildytomis tik citokininu BAP.
27
3.1.7 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų lapų kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
Izoliuoti hipokotiliai skirtingai nei skilčialapių ir lapų eksplantai, maitinamojoje
terpėje be augimo reguliatorių, kalių formavo nedideliu – 10,3% dažniu (3.1.8 pav., 3.1.9
pav.).
3.1.8 pav. Kaliaus formavimasis auginant burnočio hipokotilius ant terpės su BAP priedu
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 m.
28
3.1.9 pav. BAP ir NAR poveikis burnočio kaliaus indukcijai izoliuotų hipokotilių kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
Terpėse su citokinino 0,5 mg 1-1
BAP priedu hipokotilių izoliuoti eksplantai kalių
formavo 6,8 karto intensyviau nei kontrolėje. Vertinant kaliaus formavimosi proceso
intensyvumą priklausomai nuo augimo reguliatorių derinio maitinamosiose terpėse,
papildytose tik citokininu 0,5 mg 1-1
BAP, 1,0 mg 1-1
BAP, 2,0 mg 1-1
BAP, 3,0 mg 1-1
BAP
kaliaus formavimosi dažnis kito nuo 70,0 iki 100 % . Eksplantai, terpėse papildytose
citokinino ir auksino deriniu 0,5 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, 1,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, 3,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR, kalių formavo
vidutiniškai nuo 85,4% iki 100 % dažniu. Statistiškai patikimai intensyviausiai hipokotilių
audinių dediferenciacija vyko terpėse, papildytose 3,0 mg 1-1
BAP, 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg
1-1
NAR ir 3,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR.
3.2. Eksplanto tipo ir augimo reguliatorių poveikis burnočio kaliaus augimui
Burnočio kaliaus augimo intensyvumas tirtas izoliuotų skilčialapių, hipokotilių ir lapų
kultūrose. Nustatyta, kad kaliaus augimą lėmė genetiniai veiksniai, priklausomai nuo
panaudoto eksplanto tipo.
Praėjus 4 savaitėms nuo eksplantų auginimo pradžios, nustatyti esminiai kaliaus
augimo skirtumai tarp vidutinės pradinės kaliaus masės ir kaliaus masės po keturių auginimo
savaičių (3.2.1 pav.). Maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių burnočio skilčialapiai
29
kaliaus neformavo. Vidutinė kaliaus masė augimo reguliatorių poveikyje kito nuo 198,6–
352,1 mg. Terpėje, papildytoje augimo reguliatorių deriniu 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
kaliaus masė buvo 352,1 mg, atitinkamai nuo 1,1 iki 1,8 karto daugiau nei kituose
maitinamosios terpės variantuose.
Po I subkultivavimo skilčialapių eksplantai statistiškai patikimai didžiausią kaliaus
masę (714,3 mg) formavo terpėje papildytoje 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1mg 1-1
NAR, t.y. nuo 1,1–
1,7 karto daugiau nei kituose augimo reguliatorių derinių variantuose.
Analizuojant tyrimų rezultatus nustatyta, kad izoliuoti eksplantai po II subkultivavimo
formavo didžiausią kaliaus prieaugį. Statistiškai patikimai intensyviausiai skilčialapių kaliaus
masė didėjo terpėje, papildytoje augimo reguliatorių deriniu 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR. Kitose tirtose maitinamosiose terpėse eksplantų kaliaus masės prieaugis buvo
statistiškai patikimai mažesnis.
Skirtumai tarp variantų vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide, yra esminiai.
3.2.1 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui skilčialapių kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015m.
Burnočio lapų audiniai, maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių kaliaus
neformavo. Kaliaus augimo intensyvumas priklausė nuo augimo reguliatorių santykio
maitinamojoje terpėje. Po 4 savaičių kultivavimo didžiausia vidutinė kaliaus masė (211,2 mg)
lapų kultūroje susiformavo maitinamojoje terpėje papildytoje 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
30
NAR deriniu (3.2.2 pav.), tai yra atitinkamai nuo 1,1 iki 1,8 kartų daugiau nei kituose augimo
reguliatorių variantuose.
Po I subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausia kaliaus masė (325,3 mg)
susiformavo maitinamojoje terpėje papildytoje augimo reguliatorių deriniu 2,0 mg 1-1
BAP +
0,1 mg 1-1
NAR.
Po II subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausią kaliaus masę (406,2 mg)
suformavo lapų audiniai citokinino ir auksino derinio 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR
poveikyje.
Skirtumai tarp variantų vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide, yra esminiai.
3.2.2 pav. Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui lapų kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
Vertinant vidutinę kaliaus masę hipokotilių kultūroje, po 4 savaičių kultivavimo
kontrolinėje terpėje, indukuota kaliaus masė buvo 88,5 mg . (3.2.3 pav.). Statistiškai patikimai
didžiausias masės prieaugis (250,1 mg) buvo maitinamojoje terpėje, papildytoje 2,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR deriniu. Tuo tarpu kontrolinėje terpėje, be augimo reguliatorių,
kaliaus masė buvo 2,8 karto mažesnė.
Po I subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausia kaliaus masė (598,1 mg)
susiformavo hipokotilių kultūroje augimo reguliatorių derinio 3,0 mg 1-1
BAP + 0,1 mg 1-1
NAR poveikyje.
31
Po II subkultivavimo statistiškai patikimai didžiausia kaliaus masė (1124,3 mg)
susiformavo maitinamojoje terpėje, papildytoje augimo reguliatorių 3,0 mg 1-1
BAP + 0,1mg
1-1
NAR deriniu. Šiame maitinamosios terpės variante kaliaus masė buvo 8,7 kartų didesnė
nei kontroliniame variante.
Skirtumai tarp variantų vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide, yra esminiai.
3.2.3 Augimo reaguliatorių poveikis burnočio kaliaus auginimui hipokotilių kultūroje
ASU Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.
Analizuojant tyrimo rezultatus nustatyta, kad burnočio kaliaus augimą lėmė augimo
reguliatorių deriniai ir eksplanto tipas.
Vertinant burnočio skilčialapių, lapų ir hipokotilių audinių ląstelių dediferenciacijos
skirtumus, priklausomai augimo reguliatorių derinio, nustatyta, kad didžiausia kaliaus masė
susiformavo citokinino BAP ir auksino NAR derinio poveikyje. Citokininas TDZ derinyje su
NAR slopino kaliaus masės augimą visuose tirtuose variantuose.
Lyginant lapų, skilčialapių ir hipokotilių audinių kultūras augimo reguliatorių
poveikyje, nustatyta, kad intensyviausiai kaliaus masė didėjo hipokotilių kultūroje. Lapų
audinių indukuotas kalius pasižymėjo silpniausiu masės prieaugiu per visus kultivavimo
laikotarpius.
32
IŠVADOS
1. Burnočio hipokotilio audiniai kalių formavo intensyviau nei lapo ir skilčialapio izoliuoti
audiniai.
2. Augimo reguliatorių TDZ ir NAR poveikyje burnočio somatiniai audiniai kalių
indukavo intensyviau nei BAP ir NAR poveikyje.
3. Siekiant indukuoti kaliaus genezę iš burnočio somatinių audinių, maitinamąją terpę
tikslingiausia papildyti 3,0 mg 1-1
TDZ + 0,1 mg 1-1
NAR (lapo eksplantams), 3,0 mg 1-
1 BAP (skilčialapio eksplantams) ir 1,0 mg l
-1 TDZ arba 3,0 mg 1
-1 BAP (hipokotilio
eksplantams).
4. Iš hipokotilio audinių suformuoto kaliaus masė buvo didesnė nei iš skilčialapio ir lapo
izoliuotų audinių.
33
LITERATŪRA
1. AACC REPORT. 2001. Report of the dietary fiber. Definition committee to the board of
directors of the American association of cereal chemists, vol. 46(3), p. 112–126.
2. AGONG, S.G.; AYIECHO, P.O. 1991. The rate of out-crossing in grain amaranths.
Plant Breeding, vol. 107, p. 156–160.
3. BENNICI, A.; GRIFONI, T.; SCHIFF, S.; BOVELLI, R. 1997. Studies on callus grow
and morphogenesis in several species and lines of Amaranthus. Plant Cell and Organ
Culture, vol. 49, 29–33 p.
4. BENNICI, A.; SCHIFF S.; BOVELLI R. 1992. In vitro culture of species and varieties
of four Amaranthus L. species. Euphytica, vol. 62, p. 181–186.
5. BERMEJO, J.E.H.; LEON, J. 1994. Neglected crops: 1492 from a different perspective.
FAO, Rome, vol. 26, p. 93–101.
6. BLINSTRUBIENĖ, A. 2005 Sėmeninių linų tyrimai somatinių ir generatyvinių audinių
kultūrose: daktaro disertacija. biomedicinos mokslai, agronomija (06B). Akademija,
(Kauno r.), p. 17–30.
7. BUI VAN LE, N.T.; JEANNEAU, S.; SADIK, S.; SHANJUN, T.; VIDAL, J. 1998. Rapid plant
regeneration of a C4 dicot species: Amaranthus edulis. Plant Science, vol. 132, p. 45–
54.
8. BURBULIS, N. et al. 2009. Augalų genetinės įvairovės kūrimas somatinių audinių
kultūroje. Mokomoji knyga. Akademija, p. 5–36.
9. COIMBRA, S.; SALEMA, R. 1994. Amaranthus hypochondriacus: seed structure and
localization of seed reserves. Annals of Botany, vol. 74, p. 373–379.
10. COLEMAN, J.O.D.; EVANS, D.E.; KEARNS, A. 2003. Plant Cell Culture. Garland
Science, 208 p.
11. CONFORTI, F.; STATTI, G,; LOIZZO, MR.; SACCHETTI, G.; POLI, F,
MENICHINI, F. 2005. In Vitro Antioxidant Effect and Inhibition of a -Amylase of Two
Varieties of Amaranthus caudatus Seeds. Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol.
28(6), p. 1098–1102.
12. COONS, M.P. 1977. The status of Amaranthus hybridus L. in South America. Cienc.
Ant, vol. 18, p. 80–87.
13. COSTEA, M.; BRENNER, D.M.; TARDIF, F.J.; TARDIF, F.J.; TAN, Y.F.; SUN, M.
2006. Delimitation of Amaranthus cruentus L. and Amaranthus caudatus L. using
micromorphology and AFLP analysis: An application in germplasm identification.
Genet. Resour. Crop. vol. 53, p.1625–1633.
34
14. DUCHOVSKIS, P. 2006. Augalų morfogenezė in vitro ir jos reguliavimas. Babtai, p. 3–
26.
15. EDWARDS, G.; WALKER, D.A. 1983. C3, C4:Mechanisms and cellular and
environmental regulation of photosynthesis. Blackwell scientific publication, London,
(Oxford) vol. 6(9), p. 496–511.
16. ESPITIA, E. 1992. Amaranth germplasm development and agronomic studies in
Mexico. Food Reviews International, vol. 8, p. 71–86.
17. FLORES, H. E.; THIER, A.; GALSTON, A.W. 1982. In vitro culture of grain and
vegetable Amaranths (Amaranthus spp.). American Journal of Botany, vol. 69(7), p.
1049–1054.
18. FURBANK, R. T.; HATCH, M. D. 1987. Mechanism of C4 photosynthesis: the size
and composition of the inorganic carbon pool in bundle sheath cells. Plant Physiology,
vol. 85, p. 958–964.
19. GRUZDIENĖ, D. 2007. Lietuvoje užauginto aliejinio burnočio sėklų (Amaranthus)
aliejaus cheminė sudėtis ir savybės. Veterinarija ir zootechnika, vol. 39(61), p. 22–29.
20. GUIDEA, S. D.; BABEANU, N.; POPA, O.; STANCIU, D.; POPA, I. 2012.
Preliminary studies on in vitro behavior of varios somatic explants from some cultivated
Amaranthus genotypes. Scientific Bulletin, Biotechnologies, vol. 16, p. 9–14.
21. HAUPTLI, H. 1977. Agronomic potential and breeding strategy for grain Amaranthus.
Proceedings of First Amaranthus Seminar, vol. 71.
22. HAWKES, J.G. 1999. The evidence for the extent of N.I. vavilov’s new world Andean
centres of cultivated plant origins. Genetic Resources and Crop Evolucion.vol 46, p.
163–168.
23. ITURBIDE, G.A.; GISPERT, M. 1994. Grain amaranths (Amaranthus spp.). Neglected
crops: 1492 from a different perspective. FAO, Italy (Rome). p. 93–101.
24. JAKIENĖ, E. ir kt. 2013. Energetinių žolinių ir sumedėjusių augalų auginimo
technologijos. Akademija, Kauno r., p. 199.
25. Kraujalis, P.; VENSKUTONIS, P.R.; PUKALSKAS, A.; KAERNAVIČIUTĖ, R. 2013. Accelerated
solvent extraction of lipids from Amaranthus spp. seeds and characterization of their
composition, Kaunas University of Technology, Lithuania. p. 528–534.
26. KUUSIENĖ, S. 2007. Augalų genomika ir biotechnologija. Naujausių mokslinių
pasiekimų ir naujausių mokslinių tyrimo metodų augalų genetikos ir biotechnologijos
srityje mokslinė studija, Kaunas, p. 44.
27. MENDOZA, C.; BRESSANI, R. 1987. Nutritional and functional characteristics of
extrusion cooked amaranth flour. Cereal Chemistry, vol. 64, p. 218–222.
35
28. MURASHIGE, T.; SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays
with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, vol. 15, p. 473–497.
29. O’BRIEN, G.K.; PRICE, M.L. 1983. Amaranth: Grain and vegetable types. ECHO
News, Florida,. p. 1–14.
30. PAREDES LOPEZ, O.; SCHEVENIN M.L.; HERMANDEZ LOPEZ, D.; CARABEZ TREJO, A.
1989. Amaranth starch - isolation and partial characterization. Starch, vol. 41, p. 205–
207.
31. PAREDES-LÓPEZ, O. 1994. Amaranth: biology, chemistry and technology. United
States. 223 p.
32. PEDERSEN, B.; HALLGREN, L.; HANSEN, I.; EGGUM. B.O. 1987. The nutritive
value of amaranth grain (Amaranthus caudatus), Plant foods for human nutrition, vol.
36, p. 305–334.
33. PILIPAVIČIUS V., PUPALIENĖ, R.; MARCINKEVIČIENĖ, A. 2008. Pasėlių
bendrijos ir jų tyrimai. Akademija, p. 47.
34. PLIŪRA, A. ir kt. 2006. In vitro technologijų taikymas greitai augančių medžių
mikroklonavimui: sterilios kultūros indukcija ir kultivavimas, mikroūglių dauginimas in
vitro: mokomoji medžiaga. Kaunas, p. 41.
35. REPO-CARRASCO-VALENCIA, R.; PENA, J.; KALLIO, H.; SALMINEM, S. 2009. Dietary fiber
and other functional components in two varieties of crude and extruded kiwicha
(Amaranthus caudatus). Journal of Cereal Science, vol. 49(2), p. 219–224.
36. RUTKOWSKA-KRAUSE, I.; MANKOWSKA, G.; LUKASZEWICZ, M.; SZOPA, J. 2003.
Regeneration of flax (Linum usitatissimum L.) plants from anther culture and somatic
tissue with increased resistance to Fusarium oxysporum. Plant Cell Reports, vol. 22, p.
110–116.
37. SAKAKIBARA, H. 2006. Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Plant
Biology, vol. 57, p. 431–449.
38. SAUER, J.D. 1967. The grain amaranths and their relatives: A revised taxonomic and
geographic survey. Annals of the missouri botanical garden 1990, Salmon, vol. 54,
p.103–137.
39. SLIESAREVIČIUS, A.; STANYS, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija
Vilnius, p. 11–124.
40. STANIENĖ, G. 2006. Augalų mikrodauginimas. Babtai, 34p.
41. SVIRSKIS, A. 2007. Burnočiai – pašaras, maistas, vaistas. Vilnius, 48 p.
42. TAMER, H.G. et al. 2007. Characterization of Amaranth seed oils. Journal of Food
Lipids, vol 14, p. 323–334.
36
43. TARAKANOVAS, P.; RAUDONIUS, S. 2003. Agronominių tyrimų statistinė analizė
taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, STAT-PLOT iš paketo „Selekcija“ ir
„Irristat“. Akademija, Kėdainių r., p. 57.
44. TEUTONICO, R.A.; KNORR, D. 1985. Amaranth: Composition, properties and
applications of a rediscovered food crop. Food Technology, vol.39, p. 49–60.
45. VAVILOV, N.I. 1926. Studies on the origin of cultivated plants. Bull. Appl.Bot., vol.
16, p. 139–248.
46. VUJAČIĆ, V. 2005: Variability and factor analysis of morphological and productive
characteristics of species of the genus Amaranthus. Faculty of Agriculture, Serbia and
Montenegro, vol. 37(1), p. 1–13.
47. WERNER, T. et al. 2003. Cytokinin – deficient transgenic Arabidopsis plants show
multiple developmental alterations indicatingnopposite functions of cytokinins in the
regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell, vol. 15, p. 2532–2550.
48. http://wisplants.uwsp.edu/scripts/detail.asp?SpCode=AMACRU, [interaktyvus], [žiūrėta
2015-04-15].
49. http://www.biolib.cz/en/image/id182246/, [interaktyvus], [žiūrėta 2015-04-09].
50. http://www.prota4u.info/protav8.asp?g=pe&p=Amaranthus+caudatus+L.,
[interaktyvus], [žiūrėta 2015-05-05].
51. http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Amaranth, [interaktyvus], [žiūrėta 2015-
02-10].
37
DARBO APROBACIJA IR PUBLIKACIJOS
BIČIUS, S. 2015. Burnočio kaliaus genezės indukcija. Jaunasis mokslininkas 2015: studentų
mokslinė konferencija: pranešimų rinkinys. Akademija (Kauno r.), p. 106–109 (priedas Nr.1).
38
PRIEDAI
39
PRIEDAS Nr.1
40
41
42