TD2BMS6

REGULATION GENETIQUE CHEZ LES BACTERIES:

OPERONS CATABOLIQUES

Facult des Sciences Rabat

Laboratoire de Microbiologieet Biologie Molculaire

OPERONS CATABOLIQUES & ANABOLIQUES

Comprendre la rgulation gntiquechez les bactries et son rle.Comprendre la rgulation gntiquechez les bactries et son rle.

Savoir la notion de lopron.Savoir la notion de lopron.

Connatre le principe duConnatre le principe du

2

Connatre le principe dufonctionnement dun oproncatabolique.

Connatre le principe dufonctionnement dun oproncatabolique.

Connatre le principe dufonctionnement dun opronanabolique.

Connatre le principe dufonctionnement dun opronanabolique.

1.1.Pourquoi il y a rgulation de lexpression des

gnes?

1.2.Quest-ce-que la REGULATION GENETIQUE ?

1.3.Niveaux de rgulation

1.Introduction

2.1.Stratgies de contrle de linitiation de la

transcription

2.2.Contrles positif-ngatif

2.3.Notion dopron

2.Rgulation de la transcription

3

3.Opron catabolique: Opron Lactose

3.1.Dfinition et structure

3.2.Fonctionnement

3.3.Mutation

4.Opron anabolique: Opron Tryptophane4.Opron anabolique: Opron Tryptophane

4.1.Dfinition et structure

4.2.Fonctionnement

4.3.Mutation

4

Pour rpondre aux conditions changeantes de

lenvironnement immdiat

1.1.Pourquoi il y a rgulation de lexpression des gnes?

1.Introduction

5

La question pose dans ce chapitre est celle du choix des

portions du gnome devant tre exprimes un moment

donn dans un environnement donn.

=Un moyen pour la cellule de dvelopper des mcanismesqui lui permettent de rprimer les gnes qui codent pourdes protines inutiles et de les activer au moment o ilsdeviennent ncessaires

1.2. Quest-ce-que la REGULATION GENETIQUE ?

Deux classes de mcanismes de rgulation :

1- mcanismes opportunistes

2- mcanismes gnraux

6

2- mcanismes gnraux

Deux modes de rgulation de lexpression dun gne cible

par une molcule rgulatrice :

1- dune faon positive : linteraction dclenche la

transcription du gne

2- dune faon ngative : linteraction empche la

transcription du gne

1.3.Niveaux de rgulation

7

Sept mcanismes susceptibles de

modifier la concentration lquilibre

dune protine ;

1- synthse du transcrit primaire

2- maturation post-transcriptionnelle

de lARNm

Sites possibles de Rgulationdes Gnes chez les bactries

8

de lARNm

3- dgradation de lARNm

4- synthse protique

5- modifications post-traductionnelles

6- ciblage et transport des protines

7- dgradation des protines

Quelques constats

1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de gnration trs court,

doit pouvoir rpondre rapidement des changements de son

environnement.

2. Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de lordre de

quelques minutes).

3. La transcription et la traduction sont couples et se ralisent dans

le mme compartiment cellulaire.

La rgulation gnique doit prendre effet tt

9

effectivement

2.1.Stratgies de contrle de linitiation

de la transcription

2.Rgulation de la transcription

2 modes distincts de contrle de linitiation de la

transcription

1- un contrle constitutif qui dpend de la structure du

10

1- un contrle constitutif qui dpend de la structure du

promoteur

2- un contrle de rgulation qui est sous la dpendance de

protines rgulatrices

niveau de base de linitiation de la transcription

dtermin par la structure du promoteur.

variabilit dans la squence consensus du promoteur :

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modification de lefficacit du promoteur.

Expression Constitutive

Expression en tout temps de

protines ncessaires la

survie/croissance

Gnralement servant :

synthse de lADN et de lARN

Synthse des Protines

Les bactries expriment seulement un sous-

ensemble de leurs gnes un temps donn

L'expression de tous les gnes constitutivement dans les

bactries serait nergtiquement inefficace.

Ce nest pas tous les promoteurs qui sont

constamment accessible lARN polymrase

Les gnes qui sont exprims sont essentiels pour traiter

les conditions environnementales courantes, telles que le Synthse des Protines

Transport des lectons

Enzymes du mtabolisme

12

les conditions environnementales courantes, telles que le

type de source disponible de nourriture.

Quels gnes sont transcrits dpend de quelles

molcules spcifiques sont prsentes dans le milieu (et

dans la cellule)

Lexpression des enzymes spcifiques exiges

pour le mtabolisme des molcules particulires peut tre

induite ou rprime sur demande

Principe de base de la rgulation de la transcription :

La liaison dune protine spcifique un site donn de

lADN influence lensemble des vnements composant

13

lADN influence lensemble des vnements composant

lassemblage du complexe dinitiation et\ou linitiation dune

synthse productive dARN par lARN polymrase.

Rgulation mtabolique

De faon gnrale, plus il y a de la nourriture, plus les gnes sont transcrits.

Beaucoup de nourriture donne beaucoup dATP.

Beaucoup denzymes utilisent lATP comme source dnergie

LATP est le nuclotide initiateur

Laffinit pour un ATP initiateur est moins grande que pour un ATP

dlongation

14

dlongation

Quelques dfinitions

Facteur de transcription: protine de rgulation

transcriptionnelle.

Activateur: protine qui stimule linitiation de la

transcription favorise lexpression dun gne.

15

Rpresseur : protine qui inhibe la transcription et

empche lexpression dun gne.

Oprateur : site cible de la protine rpresseur

(souvent proche du site dinitiation de la transcription)

Gne de structure : code une protine structurale, une

enzyme ou une protine rgulatrice.

Quelques dfinitions

17

Gne de rgulation : code une protine implique dans

la rgulation dexpression dautre gne.

LORSQUE LE CONTRLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF:

INDUCTION

En vert : gne rgulateur

En bleu : gne structural

2.2.Contrles positif-ngatif

18

Lorsque la protine rpresseur se fixe loprateur, lARN polymrase ne peut plus

initier la transcription ce qui empche lexpression du gne.

Cas du rpresseur

lac avec lIPTG p.e.

REPRESSION

LORSQUE LE CONTRLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF:

19

Lorsque le co-rpresseur se fixe la protine rpresseur cette drniere sactive et

se fixe loprateur , lARN polymrase ne peut plus initier la transcription ce qui

empche lexpression du gne.

INDUCTION

Cas de la CRP associe lAMPc

LORSQUE LE CONTRLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF:

20

Cas de la CRP associe lAMPc

Un facteur de transcription doit assister lARN polymrase pour linitiation au

niveau du promoteur.

REPRESSION

LORSQUE LE CONTRLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF:

21Un corpresseur va inactiver lactivateur pas de fixation de lARN polymrase

au niveau du promoteurpas de transcription.

En rsumEn rsum

Contrle ngatif : le rpresseur inactive la transcription

Contrle positif : l'activateur active la transcription

Opron inductible: Opron inductible: Opron rpressible:Opron rpressible:

22

Opron inductible: Opron inductible:

avec inducteur: avec inducteur:

activation de la transcriptionactivation de la transcription

Opron rpressible:Opron rpressible:

avec corpresseur: avec corpresseur:

inhibition de la transcriptioninhibition de la transcription

2.3.Notion dopron

gnralement trouvs chez les procaryotes, avec quelques exemples

maintenant connus chez les eucaryotes (Nmathelmintes , Plathelminthes).

chez les bactries, quand un promoteur sert une srie de gnes

groups, lensemble de gnes s'appelle un opron.

23

Oprateur : contrle de la transcriptionPromoteur : fixation de lARN polymrase+1 : dbut de la transcriptionRBS (ribosome binding site) : fixation du ribosomeCDS (coding sequence): squence codant pour une protineTerminateur : fin de la transcription

24

tous ces gnes sont transcrits en un ARNm simple

chaque section de ces ARNm (appels ARNm polycistroniques) peut

alors tre traduite indpendamment

les gnes dun opron donn codent souvent pour plusieurs enzymes

actives dans une mme voie mtabolique

L'occurrence des gnes dans les oprons permet l'expression des

gnes d'tre commande de faon coordonne

25

gnes d'tre commande de faon coordonne

Une situation trs conomique (bien que les taux de traduction des

diffrents gnes (cistrons) dans l'opron peuvent changer

L'expression (production dARNm) des oprons peut tre induite ou

rprime par des molcules effectrices spcifiques (par exemple,

produits chimiques, aliments, etc...) un commutateur gntique

extrmement important chez les bactries

Les oprons produisent des ARNm qui codentpour des protines fonctionnellement relis.ExempleExemple dede lopronlopron LacLac::

26

Lopron lactose* (chez E. coli)un exemple dopron catabolique inductible

ngativement & positivement rgul

* lactose : disaccharide pouvant tre utilis comme source decarbone unique pour la croissance dE. coli.

27

3.1.OPERON LAC: Dfinition et structure

28

1961 : Jacob et Monod dcrivent comment des gnes adjacents

impliqus dans le mtabolisme du lactose sont rguls de faon

coordonne par un lment gntique localis proximit des gnes. Il

y a des squences dADN codant pour des produits agissant en trans ou

en cis. ((prixprix NobelNobel dede mdecinemdecine etet dede physiologiephysiologie enen 19651965))

Trans : les produits sont libres de diffuser pour trouver

une cible (activateur, rpresseur)

Cis : pour toute squence dADN non transforme en une

autre molcule, elle agit in situ et touche lADN auquel elle

Quelques dfinitions

29

autre molcule, elle agit in situ et touche lADN auquel elle

est lie (promoteur et oprateur)

Opron : ensemble de gnes structuraux et dlments

contrlant leur expression : promoteur, oprateur et un

gne rgulateur.

30

Les activateurs ou inhibiteurs de la transcription (facteurs trans-rgulateurs) sont des protines produites par d'autres gnes quiinterviennent pour activer ou pour inhiber la RNA polymrase et parsuite induire ou rprimer l'expression du gne transcrire.Ces facteurs trans-rgulateurs se lient lADN dans la rgion du gnesitue en amont de la partie transcrite. Les sites de fixation de cesfacteurs trans-rgulateurs sur le DNA sont des squences spcifiquesappeles lments cis-rgulateurs.

3 gnes structuraux: z, y & a3 gnes structuraux: z, y & a

codant pour les enzymes impliques dans le mtabolisme du

lactose

sont exprims continuellement faible taux

sont induits environ 1000 fois quand le lactose est prsent

sont moduls par le taux de glucose du milieu

31

Le gne lacZ encode l'enzyme -galactosidase, qui dcompose le

lactose (en galactose et glucose)

Le gne lacY encode la galactosidase permase, une protine de

32

Le gne lacY encode la galactosidase permase, une protine de

transport pour le lactose.

Le gne lacA encode la thiogalactoside actyltransfrase.

Le gne lacI (gne adjacent nappartenant pas lopron) encode un

rpresseur qui bloque la transcription de lopron lactose.

Les enzymes du mtabolisme du lactose sont inductiblesLes enzymes du mtabolisme du lactose sont inductibles

Lactose, (substrate de lopron), converti en son isomre (par

transglycosylation), lallolactose.

Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomre du

lactose).

Inducteur gratuit : induit lopron mais pas mtabolis.

Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG)

Lactose Allolactose

IPTG ou isopropylthiogalactoside33

Cintique dinduction de lactivit -galactosidase chez E. coli :

Equation de la raction catalyse par la -galactosidase:

34

L'augmentation de la synthse de -galactosidase se produit seulement enl'absence des sources prfres de carbone/nergie telles que le glucose

3.1.OPERON LAC: Fonctionnement

Glucose/ Pas de LactoseGlucose/ Pas de Lactose

35

Opron Opron teintteint

38

REPRESSION

Pas de Glucose/ LactosePas de Glucose/ Lactose

39

Suppression Suppression de la de la

rpression rpression

41

Rgulation Ngative

Glucose/ LactoseGlucose/ Lactose& sil y a les 2 ?!En gnral:

glucose disponible comme source d'nergie

utilisation prfrentielle/autres sucres

42

Empchement de l'expression de plusieurs oprons

( lactose, galactose et arabinose)

=Rpression des catabolites

La rpression des catabolites fait intervenir unergulation positive au niveau du promoteur.

Le glucose entrane une rpression des catabolites endiminuant la concentration de lAMPc.

COMMENT?

43

PeuPeu dede glucoseglucose =>=> beaucoupbeaucoup d'd'AMPcAMPc =>=> AMPcAMPc--CAPCAP activeactive =>=>liaisonliaison l'ADNl'ADN =>=> transcriptiontranscription:: utilisationutilisation desdes autresautres sucressucres

beaucoupbeaucoup dede glucoseglucose =>=> peupeu d'd'AMPcAMPc =>=> CAPCAP inactiveinactive =>=> paspas dedetranscriptiontranscription =>=> utilisationutilisation dudu glucoseglucose

En effet:

44

CAP?

45

CAP = protine activatrice des catabolites = facteur decontrle positif

CAP interrompt les voies mtaboliques alternativeslorsqu'elles sont rendues superflues par un apport deglucose.

CAP : ce quil faut retenir

1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (=facteur detranscription global).

2- protine denviron 45 kDa qui se fixe lADN sous la forme dundimre (2 sous-units identiques).

3- le 1er des activateurs transcriptionnels a avoir t isol (1970) et le1er pour lequel la structure 3D a t dtermine.

46

1er pour lequel la structure 3D a t dtermine.

4- en prsence dAMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe une squence cible de 22pb, situe prs ou au sein du promoteur quilcontrle

5- active la transcription du fait de contacts protine-protine aveclARN polymrase

2- Lactose prsent; glucose prsent galementLa prsence du lactose inactive le rpresseur il y a Transcription(Parce que le Glucose est prsent cAMP est faible CRP ne peut

RECAPITULATIF

1- Pas de lactose prsentLopron est teint pas dARNm synthtis

47

(Parce que le Glucose est prsent cAMP est faible CRP ne peutaider la transcription

3- Lactose prsent; pas de glucosela prsence de lactose inactive le rpresseur il y a Transcription(Il ny a pas de Glucose [cAMP] est leve cAMP se fixe la CRP(activation) CRP se fixe & aide la transcription : Niveau lev detranscription

Analyse gntique de lopronAnalyse gntique de lopron

Quels sont les lments essentiels du systme de rgulation ?

La gntique a jou un rle dcisif dans lacomprhension du fonctionnement de lopron lac.

3.1.OPERON LAC: Mutations

comprhension du fonctionnement de lopron lac.

OBJECTIF: valuer les changements qui se produisent dansla spcificit de lun ou lautre des intervenants dusystme en ralisant des MUTATIONS.

49

Analyse des mutants et diplodes partielsAnalyse des mutants et diplodes partiels

51

RECAPITULATIF

mutations OcLes mutations de loprateur sont constitutives, car le promoteur est

incapable de fixer la protine rpresseur;

Ceci permet lARN polymrase davoir libre accs au promoteur.

Les mutations Oc agissent en cis, car elles ne touchent que les gnes

structuraux qui leur sont contigus.structuraux qui leur sont contigus.

mutations du type lac I

Les mutations qui inactivent le gne lac I entranent:

OU BIEN lexpression constitutive de lopron, car la protine du rpresseur

mutant ne peut plus se fixer sur loprateur.

OU BIEN la rpression de lopron car la protine du rpresseur mutant ne

peut plus tre dsactive par le lactose.68

--complmentationcomplmentation

synthtisent une -galactosidase incomplte (dpourvue d'une

squence appele peptide ) et inactive.

La squence codant le peptide peut tre apporte en trans par un

plasmide ;

Utilisation de souches bactriennes mutantes dans le gne lac Z :

69

seul, le peptide n'a aucune activit enzymatique, mais associ avec la

protine code par lac Z' il restaure l'activit -galactosidase de la

protine mutante.

lactivit de la lactivit de la --galactosidase en utilisant le Xgalactosidase en utilisant le X--GalGal

71

Utilit de lopron lactose pour le clonage

72

Lopron Tryptophane* (chez E. coli)un exemple dopron anabolique rpressible

*Tryptophane : acide amin

73

Lopron trp code pour les enzymes requises pour la synthse du

tryptophane (trpAE)

4.1. OPERON trp: Dfinition et structure

74

tryptophane (trpAE)

La synthse de lARNm de lopron est contrle par un rpresseur

qui bloque la transcription lorsquil est li par le tryptophane (co-

rpresseur)

Lorsque le tryptophane est absent, la transcription se produit

4.2. OPERON trp: fonctionnement

78 Rgulation NgativeRgulation Ngative

Lorsque le tryptophane est prsent, la transcription est bloque.

Rgulation de lopron tryptophane chez Rgulation de lopron tryptophane chez E. coliE. coli

La fixation du tryptophane au rpresseur trp altre sa structure

Un dplacement de 0,8nm des hlices impliques dans la

reconnaissance permet au rpresseur dinteragir avec lADN.

Mcanisme n1

79

Cependant, en l'absence du rpresseur, la synthse delARNm de lopron trp est encore partiellementrprime par la prsence de tryptophane

80

Mcanisme n2

La transcription est galement contrle par attnuation, processus

qui aboutit la traduction dun petit polypeptide.

Quand les cellules sont prives de tryptophane, les gnes de lopron

sont exprims au taux le plus fort;

81

Quand la privation en tryptophane est moins svre, les gnes de

lopron sexpriment un niveau plus faible que le maximum.

Lattnuation rgule le niveau de transcription par un facteur de 8

10 et combin avec le mcanisme 1 (interaction rpresseur-oprateur)

il y a diminution de la transcription dun facteur 560 700.

82

Une petite squence codante en avant de lopron trp contient deuxcodons pour le tryptophane de suite Lorsque la quantit de tryptophane dans la cellule est limite, le ribosomearrte ces codons trp La capacit du ribosome de lire ces codons rgule un choix de tige etboucle (terminateur ou anti-terminateur)

La position du ribosome joue un rle important dans lephnomne dattnuation

84

Attnuation: mcanisme qui contrle la capacit delARN polymrase de lire un attnuateur, qui est unterminateur plac au dbut de la transcription

Phnomne dattnuation pour des cellules prives de trpSituation 1:

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le tryptophane est absent (ou en quantit insuffisante):

1- les trp-ARNt sont indisponibles, le ribosome sarrte aux codons trp ce qui couvre la rgion

1.

2- la rgion 1 ne peut sapparier avec la rgion 2, la place la rgion 2 sapparie la rgion 3.

3- la rgion 3 ne peut donc sapparier la rgion 4.

4- lARN polymrase continue transcrire lensemble de la squence codante ce qui permet la

synthse complte de lARNm.

Situation 2: Phnomne dattnuation pour des cellules non-prives de trp

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le tryptophane est abondant:1- le ribosome ne sarrte pas au niveau des codons trp; il continue traduire lasquence leader, sarrtant au niveau de la rgion 22- la rgion 2 ne peut sapparier avec la rgion 3; cette dernire sapparie alorsavec la rgion 4.3- cet appariement 3-4 constitue la squence attnuateur et fonctionnecomme signal de terminaison4- la transcription sachve avant que lARN polymrase atteigne les gnespermettant la synthse du tryptophane

RECAPITULATIF

87

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88

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