DETERMINACIN DE LAS POBLACIONES MICROBIOLGICAS EN EL PROCESO DE EXTRACCIN DE JUGO DE CAA DE AZCAR EN EL INGENIO MANUELITA S.A.

LAURA SERRANO GALVIS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Bogot, D.C., Febrero de 2006

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DETERMINACIN DE LAS POBLACIONES MICROBIOLGICAS EN EL PROCESO DE EXTRACCIN DE JUGO DE CAA DE AZCAR EN EL INGENIO MANUELITA S.A.

LAURA SERRANO GALVIS

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al ttulo de

MICROBILOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Bogot, D.C., Febrero de 2006

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NOTA DE ADVERTENCIA Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Slo velar porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

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DETERMINACIN DE LAS POBLACIONES MICROBIOLGICAS EN EL PROCESO DE EXTRACCIN DE JUGO DE CAA DE AZCAR EN EL INGENIO MANUELITA S.A.

LAURA SERRANO GALVIS

APROBADO ___________________________ Mara Luisa Guzmn; Microbiloga CENICAA Director __________________________ Ana Karina Carrascal, Docente Universidad Javeriana Asesor

____________________________ Andrea Aguirre, Docente Universidad Javeriana Jurado

___________________________ Adriana Matiz, Docente Universidad Javeriana Jurado

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DETERMINACIN DE LAS POBLACIONES MICROBIOLGICAS EN EL PROCESO DE EXTRACCIN DE JUGO DE CAA DE AZCAR EN EL INGENIO MANUELITA S.A.

LAURA SERRANO GALVIS

APROBADO _____________________________ Dra. Angela Umaa M. Phil Decano Acadmico _____________________________ Dr. David Gmez M.Sc Director de Carrera

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Si le han dicho como a m, siempre hay alguien ms pequeo y ms grande que usted, entonces haga lo que yo: abrace al ms pequeo y djese abrazar por el mayor.

ngela Botero

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AGRADECIMIENTOS

Al Ingenio Manuelita S.A., especialmente al Ingeniero Jaime H. Cardona, por o el apoyo y el respaldo brindado para desarrollar mi trabajo de grado, y por la oportunidad de ser parte de la empresa. Al Centro de investigacin de la caa de azcar de Colombia, CENICAA, especialmente a Mara Luisa Guzmn, por la direccin en el desarrollo y culminacin del proyecto, y a Alberto Palma por la asesora y el respaldo para el anlisis estadstico. A Ana Karina Carrascal, docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por la asesora en la realizacin del proyecto. Al personal del laboratorio central del Ingenio Manuelita S.A. por la amistad y la confianza, porque creyeron siempre en m y en el xito del proyecto. A mis padres y mis hermanos, que a pesar de la distancia estuvieron siempre conmigo, porque fueron mi apoyo y mi fortaleza. A Vctor Manuel, por entenderme, apoyarme y por confiar en m. A mi familia calea, por acogerme y apoyarme.

A todos los que aportaron de una u otra forma a la realizacin de este proyecto, GRACIAS!

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TABLA DE CONTENIDO

Pg. RESUMEN 1. INTRODUCCIN 2. MARCO TERICO 2.1. Generalidades del proceso de produccin de azcar 2.1.1. Procesamiento de la caa en fbrica 2.1.2. Microorganismos en el proceso 2.2. Prdidas de sacarosa 2.2.1. Caractersticas fsico-qumicas de los jugos 2.2.1.1. Pureza 2.2.1.1.1. Pol 2.2.1.1.2. Grados Brix 2.2.1.2. Azcares Reductores 2.2.2. Prdidas indeterminadas 2.2.3. Contaminacin microbiolgica 2.2.4. Determinacin de prdidas por contaminacin microbiolgica y sus implicaciones 2.2.5. Polisacridos bacterianos 2.2.5.1. Dextranos 2.2.5.2. Levanos 2.3. Control de la actividad microbiolgica 2.3.1. Agentes biocida 2.3.1.1. Busan 881 2.3.1.2. Lipesa 106C 2.3.1.3. Nalco 5581 2.3.2. Beneficios en los subproductos 3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 4. OBJETIVOS 4.1. General 4.2. Especficos 5. MATERIALES Y MTODOS 5.1. Lugar de muestreo 5.2. Poblacin de estudio y muestra 5.2.1. Anlisis directo de caa (DAC) 5.2.2. Jugo de primera extraccin 1 5 8 8 8 10 10 11 11 11 11 12 12 14 16 17 18 19 20 21 22 23 23 23 25 26 26 26 28 28 28 30 30

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Pg. 5.2.3. Jugo de 4 molino 5.2.4. Jugo de 2 molino 5.2.5. Jugo del colador 5.2.6. Jugo diluido 5.3. Unidad de muestreo 5.4. Muestreo 5.5. Variables del estudio 5.6. Variables respuesta y unidades de medida 5.7. Variables independientes a tener en cuenta 5.8. Mtodos 5.8.1. Recuento de microorganismos 5.8.1.1. Mesfilos 5.8.1.2. Bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos (BALPE) 5.8.1.3. Mohos y levaduras 5.8.1.4. Bacterias aerobias termfilas esporuladas 5.8.2. Aislamiento y clasificacin de microorganismos 5.8.3. Anlisis fsico-qumico 5.8.3.1. pH 5.8.3.2. Temperatura (C) 5.8.3.3. % de Pureza 5.8.3.3.1. Determinacin de grados brix 5.8.3.3.2. Anlisis de POL (Sacarosa aparente) 5.8.3.4. Determinacin de azcares reductores: Mtodo de Eynon y Lane 5.8.3.5. Concentracin de dextranos: Mtodo de Roberts 5.8.4. Evaluacin de los bactericidas 5.9. Recoleccin de la informacin 5.10. Anlisis de la informacin 6. RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1. Poblacin de microorganismos 6.2. Anlisis fsico-qumico 6.2.1. Temperatura y pH 6.3. Variables de respuesta 6.3.1. Influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos en la muestra de DAC 6.3.1.1. Influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones microbiolgicas en la muestra de DAC 6.3.1.2. Influencia de las caractersticas de la caa sobre los parmetros fsico-qumicos 30 30 31 31 32 32 32 33 33 35 35 35 35 36 36 36 37 37 37 37 37 37 38 38 39 40 40 42 42 42 42 44 44

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Pg. 6.3.2. Poblaciones microbiolgicas y su correlacin con las caractersticas fsico-qumicas en los puntos de muestreo 6.3.2.1. Cuantificacin de las poblaciones de mesfilos, BALPE, levaduras, mohos y termfilas aerobias 6.3.2.2. Dextranos, % de azcares reductores, Brix, POL, %Sacarosa y Pureza 6.3.3. Clasificacin de los microorganismos 6.3.3.1. Mesfilos 6.3.3.2. Bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos (BALPE) 6.3.3.3. Levaduras y mohos 6.3.3.4. Bacterias termfilas aerobias 6.4. Evaluacin de desinfectantes 6.4.1. Busan 881 6.4.2. Lipesa 106C 6.4.3. Nalco 5581 6.4.4. Hipoclorito de calcio 7. CONCLUSIONES 8. RECOMENDACIONES 9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ANEXOS

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NDICE DE TABLAS

Pg. Tabla 1. Caractersticas de la caa que entr a la fbrica durante el estudio Tabla 2. contacto Bactericidas evaluados, sus concentraciones y los tiempos de 39 43 34

Tabla 3. Promedios de temperatura y pH en cada punto de muestreo Tabla 4. Influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos en la muestra de DAC. Anlisis estadstico (SAS) (10% de significancia). n = 40 Tabla 5. Test de Tukey. Comparacin de los valores medios de poblaciones microbiolgicas y caractersticas fsico-qumicas de la muestra de DAC, por tipo de caa y tipo de cosecha, y sus diferencias. n = 40 Tabla 6. Correlaciones entre las poblaciones microbiolgicas y las caractersticas fsico-qumicas de los jugos en cada punto de muestreo. Tabla 7. Evaluacin de Busan 881. Promedio de los porcentajes de inhibicin de las poblaciones microbiolgicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n = 3 Tabla 8. Evaluacin de Busan 881. Promedio de los parmetros fsicoqumicos. Tabla 9. Evaluacin de Lipesa 106C. Promedios de los porcentajes de inhibicin de las poblaciones microbiolgicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n = 3 Tabla 10. Evaluacin de Lipesa 106C. Promedio de los parmetros fsicoqumicos. Tabla 11. Evaluacin de Nalco 5581. Promedio de los porcentajes de inhibicin de las poblaciones microbiolgicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n = 3 Tabla 2. Evaluacin de Nalco 5581. Promedio de los parmetros fsicoqumicos. n = 3

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Pg. Tabla 13. Evaluacin del hipoclorito de calcio. Porcentajes de inhibicin de las poblaciones microbiolgicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. Tabla 14. Evaluacin del hipoclorito de calcio. Parmetros fsico-qumicos

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NDICE DE FIGURAS

Pg. Figura 1. Estructura del dextrano Figura 2. Estructura del levano Figura 3. Puntos de muestreo: muestra 1, muestra directa de caa (DAC) Figura 4. Puntos de muestreo en el proceso de extraccin: muestra 2, jugo de 1era extraccin; muestra 3, 2 molino; muestra 4, 4 molino; muestra 5, jugo del colador; muestra 6, jugo diluido Figura 5. Diferencias entra las poblaciones microbiolgicas de acuerdo al tipo de caa Figura 6. Tendencias de las poblaciones microbiolgicas de acuerdo al incremento de los tiempos de permanencia de la caa en campo en caa larga (cosecha manual) Figura 7. Influencia del % de materia extraa sobre las poblaciones de microorganismos en caa larga (cosecha manual) Figura 8. Influencia del tipo de caa y el tiempo de permanencia sobre la concentracin de dextranos en caa cosechada manualmente Figura 9. Promedio de las poblaciones microbiolgicas por punto de muestreo. n = 40 Figura 10. Promedio del % de azcares reductores, y de la concentracin de dextranos por punto de muestreo. n = 40 Figura 11. Promedio de los parmetros fsico-qumicos por punto de muestreo. n = 40 Figura 12. Clasificacin por tincin de Gram de la poblacin de mesfilos por punto de muestreo Figura 13. Morfologa y coloracin de las colonias de mesfilos. Vista al microscopio (100X) Figura 14. Clasificacin de la poblacin de BALPE en cada punto de muestreo 18 19 28

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Pg. Figura 15. Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa Figura 16. Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa Figura 17. Colonias de levaduras y mohos en agar YGC Figura 18. Colonias de mohos al estereoscopio 20X en agar YGC Figura 19. Visin microscpica de mohos (1000X). Coloracin con azul de lacto-fenol Figura 20. Clasificacin de la poblacin de bacterias termfilas aerobias en cada punto de muestreo 64 65 66 67

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NDICE DE ANEXOS

Pg. Anexo 1: Formato de evaluacin Anexo 2: Promedio de las poblaciones microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos en cada punto de muestreo Anexo 3: Descripcin de las colonias aisladas Anexo 4: Ensayo adicional de la efectividad de los agentes biocida a concentraciones mximas permitidas Anexo 5: Medios de cultivo Anexo 6: Concentracin del hipoclorito de calcio 89

90 91

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RESUMEN

Las prdidas en la produccin de azcar en los ingenios se cuantifican mediante balances de sacarosa entre el contenido en la caa que entra a la fbrica, la presente en los jugos procesados y la que se pierde en el bagazo y aguas de procesamiento; parte de la sacarosa no detectada se atribuye a prdidas por actividad microbiolgica y a caractersticas fsico-qumicas del proceso que favorecen la inversin de la molcula. El objetivo de la investigacin fue evaluar las poblaciones microbiolgicas de los jugos en diferentes puntos de los molinos, para establecer medidas que permitan controlar las prdidas de azcar por actividad microbiolgica en el ingenio Manuelita S.A. Se realiz una cuantificacin y clasificacin mediante tincin de Gram de los microorganismos presentes en los jugos, partiendo de las poblaciones con que ingresa la caa a la fbrica (muestra de DAC) y determinando su comportamiento en el molino, hasta el jugo diluido; los recuentos se correlacionaron con las caractersticas fsico-qumicas de los jugos. Posteriormente, se evalu la efectividad de 3 biocidas: Busan 881, Lipesa 106C y Nalco 5581; en tres concentraciones, y a 5, 10 y 15 minutos de tiempo de contacto. La poblacin ms alta en DAC correspondi a bacterias mesfilas (107UFC/ml), seguida de la poblacin de bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos (105), levaduras (105), mohos (103) y termfilas (102), y dependieron del tipo de caa procesada, del tipo de cosecha, del tiempo de permanencia y del % de materia extraa. Despus de ingresar a la fbrica, las poblaciones se incrementaron significativamente en el jugo de 1era extraccin, siendo ste el punto ms crtico del proceso, y se mantuvieron relativamente constantes en los siguientes puntos de muestreo. Predominaron los bacilos Gram negativos y Gram positivos y en menor proporcin los cocos Gram negativos y Gram positivos. De los bactericidas evaluados en muestras de jugo de 1era extraccin ninguno fue efectivo, incluso a dosis mximas permitidas. Un ensayo adicional con hipoclorito de calcio mostr una alta efectividad ante poblaciones de BALPE y levaduras especialmente, con un 72% de inhibicin. Los resultados

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microbiolgicos mostraron poca correlacin con las caractersticas fsico-qumicas de los jugos.

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ABSTRACT

Sugar losses in Sugar refineries are calculated by balances between cane entering the factory, sucrose on processed juices, and sucrose on waste pulp and final water of the process; part of not detected sucrose is attributed to microbiological degradation and to characteristics of the process, that favor the sucrose inversion. The aim of this investigation was to evaluate the microbiological population of the juices at diferent points of milling station, to adopt routines that permit the control of microbiological losses in Manuelita S.A. sugar refinery. It was made a quantification and classification by Grams dye of diverse groups of microorganisms that are present in the cane juice, starting off cane populations that enters to the grinding (DAC sample), and determining the behavior of the same ones during mills up to diluted juice; the microbiological counts were correlated with physic-chemistries juice characteristics. Later, the effectiveness of 3 bactericidal was evaluated: Busan 881, Lipesa 106C and Nalco 5581; each one was evaluated at 3 different concentrations, and 5, 10 and 15 minutes of time of contact on a sample of juice of the point in which was greater contamination. The highest population in the DAC sample corresponds to mesophiles (107 CFU/ml), followed of the EPALB population (105 CFU/ml ), yeast (105 CFU/ml), moulds (103 CFU/ml) and termophiles (102 UFC/ml), that depends on kind of processed cane, type of harvest, dwell time and percentage of strange matter. When entering the factory, populations are significantly increased in the first extraction, considered this one the most critical point of the process; the populations stay relatively constant in the following points of compilation of samples. The Gram negative and Gram positive bacilli prevail, and, in minor proportion, the Gram negative and Gram positive coccus. The bactericides evaluated in samples of juice of first extraction were not effective, even to maximun authorized doses. An additional test with calcium hypochlorite showed high effectiveness in the diminution of the populations of BALPE and yeast, specially, with 72 percent of inhibition. The

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microbiological

results

showed

little

interrelation

with

physic-chemistries

characteristics of the juices.

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1. INTRODUCCIN

La industria azucarera colombiana es una de las principales agroindustrias del pas; el sector est conformado por 13 ingenios ubicados en el valle geogrfico del ro Cauca con aproximadamente 200.000ha cultivadas, que se extienden desde el norte del departamento del Cauca, pasando por el Valle del Cauca hasta el sur del departamento de Risaralda, territorio donde se producen alrededor de 20.4 millones de toneladas de azcar anuales. Para este importante sector de la economa, el crecimiento en la produccin ha cobrado protagonismo en los ltimos aos, tanto por el cumplimiento de la demanda del mercado, como por la importancia biotecnolgica que han adquirido los subproductos del proceso, para lo cual se adelantan proyectos de investigacin y desarrollo en un mejoramiento continuo y optimizacin de los rendimientos en la produccin. El mantenimiento de niveles altos de sacarosa depende de mltiples factores, algunos relacionados con la planta en el campo como son: el clima, el suelo, disponibilidad de agua y nutrimentos, la variedad sembrada, prcticas agronmicas, presencia de enfermedades y plagas, adems de otros factores relacionados con los sistemas de recuperacin de la sacarosa en fbrica; de acuerdo a la eficiencia de stos se obtendr un mejor rendimiento en la produccin de azcar. En los ingenios, las prdidas de azcar se cuantifican mediante balances que tienen en cuenta la sacarosa que ingresa a la fbrica en la caa de azcar, la sacarosa presente en los jugos obtenidos del proceso de molienda de la caa y la sacarosa que finalmente abandona la fbrica en el bagazo de caa y aguas de procesamiento; el azcar no detectado mediante el balance se registra como prdidas indeterminadas las cuales se atribuyen a factores como la actividad microbiolgica y a caractersticas fsico-qumicas del proceso que favorecen la inversin de la molcula en sus azcares reductores.

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El seguimiento del contenido de sacarosa desde la caa en pie hasta los procesos fabriles es de gran importancia para los ingenios, razn por la cual, controlar y disminuir las prdidas de sacarosa ha sido tema de muchas investigaciones en el mundo azucarero. Numerosos estudios, realizados en Colombia y el mundo, relacionan gran parte de las prdidas indeterminadas y formacin de productos metablicos no deseados a la actividad de la microflora presente en la caa, favorecida por condiciones de operacin como el corte y quema de la caa, condiciones de temperatura y humedad, tiempos prolongados entre corte y molienda; sin embargo, el proceso de extraccin del jugo representa un punto importante de contaminacin, pues a nivel de molinos, las prdidas de azcar corresponden: un 13% a inversin qumica por efectos de pH y temperatura de los jugos de caa; un 25% a efecto enzimtico, por la procedencia biolgica de la materia prima que sintetiza y metaboliza la sacarosa, y un 62% a inversin microbiolgica, pues se presentan las condiciones favorables para el crecimiento de los microorganismos, tanto por la presencia de nutrientes y factores ambientales como por la falta de asepsia generalizada en los molinos de caa. Tal como se entregan a los molinos, los tallos de la caa de azcar presentan una gran cantidad de microorganismos (bacterias, levaduras, mohos) provenientes del suelo, aguas de lavado de caa, condiciones de cosecha, tiempo de permanencia de la caa despus de la cosecha y condiciones de operacin, agua de extraccin y por el aire; la mayora quedan en el jugo extrado, donde, si la temperatura es adecuada para el crecimiento, el desarrollo microbiano se presenta inmediatamente, disminuyendo as la pureza de los jugos en cuanto a sacarosa y produciendo cantidades apreciables de gomas y sus subproductos metablicos y, por ende, prdidas para la industria. El control bacteriano es una prctica comn y se realiza mediante la adicin de agentes biocida en cantidades definidas, aunque el control en ausencia de estas sustancias se practica en numerosas industrias productoras de azcar, haciendo

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nfasis en los procesos de limpieza para eliminar los microorganismos contaminantes. Para lograr el control microbiolgico en una fbrica productora de azcar se hace necesario realizar una cuantificacin y clasificacin de los microorganismos presentes en los jugos de caa, que permita establecer qu tipos de microorganismos se encuentran en los diferentes puntos de recorrido, cules se presentan ms frecuentemente y reconocer los puntos de mayor contaminacin en el proceso, de tal manera que los procedimientos de limpieza que se realicen en la fbrica sean ms efectivos contra estos grupos microbiolgicos y contribuyan a mejorar la calidad de los jugos y subproductos posteriores del proceso, controlando las prdidas de sacarosa por actividad microbiolgica.

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2. MARCO TERICO

2.1 Generalidades del proceso de produccin de azcar La savia de la caa de azcar (Saccharum officinarum, S. spontaneum, S. sinense, etc.) y de la remolacha (Beta vulgaris) contiene alrededor de 17% de sacarosa, un carbohidrato disacrido de frmula general C12H22O11, compuesto de los monosacridos D-glucosa y D-fructosa que se condensan en grupos glucosdicos, formado por un proceso fotosinttico de asimilacin. Mediante el proceso de extraccin realizado en Ingenios azucareros, se obtiene el jugo de caa o remolacha, que es purificado por medios fsicos y qumicos, evaporando luego el agua y separando los cristales de azcar para obtener finalmente el azcar comercial refinado, que contiene alrededor de 99.99% de sacarosa (Honig, 1969).

2.1.1

Procesamiento de la caa en fbrica

La caa que llega a la fbrica se descarga sobre las mesas de alimentacin al conductor de caa, y luego es sometida a un proceso de preparacin que consiste en romper o desfibrar las celdas de los tallos por medio de picadoras y desfibradoras; posteriormente, unas bandas transportadoras la conducen al tndem de molinos, donde se realiza el proceso de extraccin de la sacarosa, consistente en exprimir y lavar el colchn de bagazo. El lavado de este colchn se hace con el jugo extrado en el molino siguiente y el lavado en el ltimo molino se hace con agua caliente, que facilita la desinfeccin y la extraccin de la sacarosa en el bagazo. El bagazo del ltimo molino es usado como combustible en las calderas para generar vapor o como materia prima en la elaboracin de papel. El jugo proveniente del primer molino se conoce como jugo de 1era extraccin, jugo

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crudo o jugo puro, puesto que proviene nicamente de la molienda de la caa, sin agua o algn componente adicional. Puede considerarse como la corriente que aporta mayor cantidad de sacarosa al jugo diluido y portador de la carga microbiana que ingresa a la fbrica procedente de la materia prima de los molinos. Una vez sale el bagazo del 1er molino es conducido al 2 molino, el cual realiza una segunda extraccin; luego pasa al 3er molino, de ste al 4 y as sucesivamente hasta el 6to molino, donde finalmente el bagazo es llevado a las calderas. En direccin inversa, es decir, del 6to molino al 2, se aplica agua de maceracin a altas temperaturas para extraer la cantidad mxima de sacarosa posible del bagazo y el jugo as obtenido pasa el 5to molino ayudando tambin al proceso de extraccin en los molinos posteriores. El jugo de 1era extraccin y el de los molinos posteriores se rene en el colador donde se retira parte del bagacillo. Finalmente el jugo es conducido por tuberas hacia los tanques bscula que descargan en el tanque de jugo mezclado donde se alcaliniza para regular su acidez y evitar la destruccin de la sacarosa; luego pasa a clarificadores continuos a altas temperaturas, donde se sedimentan las impurezas y el jugo claro que sobrenada es extrado por la parte superior. Las impurezas sedimentadas pasan a los filtros rotatorios al vaco que dejan pasar el jugo y retienen la cachaza que es utilizada como abono. El jugo clarificado pasa a los evaporadores, en donde se le extrae el 80% del contenido de agua hasta obtener el jarabe. La cristalizacin de la sacarosa que contiene el jarabe se lleva a cabo en tachos al vaco; los cristales de sacarosa se separan de la miel en las centrfugas. Las mieles vuelven a los tachos para ser agotadas y finalmente son utilizadas como materia prima en la produccin de alcohol etlico en la destilera. El azcar de primera calidad retenido en las mallas de las centrfugas, se disuelve con agua caliente y recibe el nombre de licor, el cual se enva a la refinera para continuar el proceso (Honig, 1959; Manuelita S.A, 2005).

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2.1.2. Microorganismos en el proceso Las condiciones favorables para el desarrollo de los microorganismos en las fbricas estn limitadas a un rea particular: el ciclo de extraccin, puesto que las altas temperaturas y el bajo contenido de agua, caractersticos de la mayor parte del proceso de fabricacin, se consideran como las principales condiciones adversas para una actividad microbiolgica excesiva. La extraccin comprende una operacin de molienda en la que se obtiene el jugo mixto de la caa o jugo crudo, cuyas caractersticas fsicas y qumicas lo convierten en un excelente sustrato para el desarrollo de una gran variedad de microorganismos (Cerutti de Guglielmone et al., 2000; Honig, 1969). Las etapas de operacin posteriores a la extraccin consisten en cierta forma de tratamiento qumico a alta temperatura (clarificacin), seguido de sedimentacin y filtracin, la concentracin de jugo clarificado y la cristalizacin del producto comercial. El nmero de microorganismos presente en cualquier punto desde el clarificador hasta el azcar bruto, es relativamente bajo en comparacin con el jugo de caa crudo (Antier, 1996; Hoing, 1969).

2.2 Prdidas de sacarosa En las fbricas de azcar se presentan prdidas que son definidas dependiendo del esquema de operacin, realizando balances que incluyen la cuantificacin de la sacarosa segn las caractersticas fsico-qumicas de los jugos y productos intermedios del proceso. Teniendo en cuenta las sacarosa que ingresa en la caa, la sacarosa presente en el bagazo, en la melaza final, en los efluentes, y el azcar final obtenido, estos balances muestran un porcentaje de azcar que se pierde en el proceso y que se conoce como prdidas indeterminadas (Broadfoot, 2001).

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2.2.1

Caractersticas fsico-qumicas de los jugos

Las poblaciones microbiolgicas que degradan la sacarosa y los azcares reductores presentes en el jugo determinan las caractersticas fsico/qumicas de los mismos e influyen en el desarrollo posterior del proceso de extraccin; por esta razn, los subproductos metablicos son tomados como indicadores indirectos de las prdidas de sacarosa en el proceso, aunque las prdidas reales son mayores que las que se pueden calcular con base en estos indicadores debido a que estn influenciados por factores ajenos a la actividad microbiana. (Duarte et al., 1982; Hernndez, 1978).

2.2.1.1 Pureza La relacin de la lectura del polarmetro (Pol) con los brix permite determinar la pureza de una solucin en trminos de sacarosa.

2.2.1.1.1

Pol

Los azcares diluidos gozan de la propiedad de desviar el plano de vibracin de la luz polarizada. Esta propiedad se utiliza en la industria azucarera para determinar la riqueza de los jugos de caa mediante un aparato ptico llamado polarmetro, de donde se deriva la expresin de POL; este aparato enva un rayo de luz polarizada a travs de una solucin de sacarosa y mide la rotacin de la luz despus de pasar por el lquido. Con el valor de rotacin resultante se estima el % de sacarosa en el jugo mediante frmulas y tablas establecidas (Engelke, 2002).

2.2.1.1.2. Grados Brix Los brix determinan la concentracin de slidos disueltos en una solucin de sacarosa, basndose en una relacin entre los ndices refractivos a 20C y el % de masa total de slidos solubles de una solucin acuosa de sacarosa pura (Laboratory Manual for South African sugar factories, 1985).

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2.2.1.2 Azcares reductores La sacarosa puede ser invertida por efecto enzimtico o fsico-qumico en sus azcares reductores, glucosa y fructosa. Su poder reductor se debe al grupo carbonilo que queda libre en su molcula. Este carcter reductor puede ponerse de manifiesto mediante diversos mtodos, entre los cuales el ms utilizado en los Ingenios Azucareros es el mtodo de Eynon y Lane, en que se produce una reaccin redox entre los azcares reductores y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul y tras la reaccin con el azcar reductor se forma xido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la reaccin y que, por lo tanto, el azcar reductor est presente (Laboratory Manual for South African sugar factories, 1985). Los azcares reductores son el producto intermedio de la descomposicin de la sacarosa y son el ndice ms empleado para la deteccin de prdidas en jugos; sin embargo, estos azcares son utilizados por la gran variedad de microorganismos encontrados en los jugos como fuente de carbono para desarrollarse y generar otros productos metablicos como etanol, cidos orgnicos y CO2. Por esta razn, algunos autores sugieren la cuantificacin de otros productos finales del metabolismo como el cido lctico, que son indicadores ms precisos de prdidas de sacarosa por actividad microbiolgica en el tndem de molinos, pero se hace necesario realizar estudios que permitan tener criterios de seleccin entre los indicadores que muestren mayor correlacin con el metabolismo de los microorganismos 2001). (McMaster, 1990; Ravn,

2.2.2

Prdidas indeterminadas

En el lapso en que la caa va desde el campo hasta el ingenio, las prdidas de sacarosa por inversin de la molcula en sus azcares reductores se dan por causas fsicas, qumicas y microbiolgicas.

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Las causas fsicas incluyen prdidas directas debidas a las pobres tcnicas de corte de la caa, almacenamiento y o transporte, dispersin, prdidas de sacarosa en aguas y productos residuales y absorbentes (Clarke et al., 1996). Las prdidas influenciadas por la descomposicin qumica incluyen la

descomposicin trmica, la acidez del jugo y la presencia de la enzima invertasa (Annimo, 1993; Clarke et al., 1996). El jugo tiene una acidez natural que es neutralizada pocos minutos despus de la extraccin, disminuyendo la incidencia de este factor en la inversin de la molcula, y por lo general se mantiene a temperatura ambiente durante le proceso de extraccin, lo que indica que cuando estos factores se mantienen en valores ptimos que aseguren una inversin mnima, el factor de mayor incidencia est relacionado con la actividad enzimtica (Annimo, 1993). La enzima invertasa ( -D fructofuransido fructohidrolasa, E.C 3.2.1.26 fructofuranosidasa) en el jugo de caa tiene 2 orgenes: la caa de azcar y la actividad microbiolgica. La caa de azcar sintetiza y cataboliza la sacarosa mediante esta enzima para obtener la energa necesaria para sus funciones fisiolgicas y la produccin enzimtica vara de acuerdo a los requerimientos nutricionales y el tiempo entre corte (cosecha) y molienda. La planta produce 2 tipos de enzima diferentes: una es ms activa bajo condiciones cidas y est presente en clulas inmaduras como las del cogollo, mientras que la otra es ms activa en condiciones normales y se encuentra en tejidos maduros; sin embargo, esta actividad enzimtica se da en pequea proporcin por lo cual las prdidas atribuidas a este factor son poco significativas (Pulido et al., 1977). El deterioro microbiolgico causa entonces la mayora de las prdidas por inversin, disminuyendo la produccin de azcar blanco y aumentando la produccin de melazas; los microorganismos encuentran en la sacarosa un buen sustrato para su crecimiento y excretan la enzima invertasa (Annimo, 1993; Hollaus, 1978; Van der Poel et al., 1998).

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2.2.3 Contaminacin microbiolgica Desde el momento que se corta la caa hasta que se clarifica el jugo extrado a altas temperaturas, la sacarosa est expuesta a la accin enzimtica de una multitud de microorganismos que pueden provenir del suelo que se adhiere a tallos y hojas de la caa o del aire contaminante, y que se ven favorecidos por factores como las operaciones de quema, corte, condiciones de temperatura, humedad alta y tiempos entre corte y molienda (Cerutti de Guglielmone et al., 2000; Van der Poel, 1998). Cuando la caa entra en el molino, sus jugos circulan a travs de los mismos y entran en contacto con los microorganismos que se encuentran adheridos a las superficies de concreto y metal; sin embargo, la presencia de stos en cualquier azcar particular o producto intermedio de su fabricacin, no significa necesariamente que se estn produciendo cambios perjudiciales, ni tendrn significado desde el punto de vista econmico, a menos que factores del medio, como temperatura, agua, O2 y elementos nutritivos sean favorables para el rpido crecimiento (Annimo, 1993; Honig, 1969). Entre estos microorganismos, que encuentran el medio ideal para su crecimiento en el jugo de caa, se han identificado 3 grupos principales de bacterias: productoras de exopolisacridos, donde se encuentra Leuconostoc sp.; aerobios esporo-formadores, como Bacillus sp., y aerobios no esporo-formadores, como Escherichia coli; las levaduras son igualmente importantes , sobre todo las osmoflicas capaces de desarrollarse en medios muy concentrados por su resistencia a elevadas presiones osmticas, como las mieles y el azcar; tambin se encuentran, en menor proporcin ciertas especies de mohos (Duarte et al., 1982; Honig, 1969; Van der Poel, 1998). Las principales especies identificadas en caa de azcar y sus jugos son: Bacterias: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sterereotermophilus, Leuconostoc

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mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Escherichia coli, Enterobacter aergenes, Citrobacter freundii, Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Corynebacterium sp., Micrococcus luteus, Staphilococcus fragilis y Clostridium sp. En este grupo se destacan los bacilos que tienen la capacidad de formar endosporas y sobrevivir cuando las condiciones del medio no son favorables, y son importantes productores de levanos y otros heteropolisacridos. Skole y colaboradores en 1977, reconocieron 2 vas de degradacin de sacarosa por especies de Bacillus: forman levano y azcares reductores o forman cidos (Honig, 1969; Hernndez et al., 1978). Levaduras: Saccharomyces cereviseae, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces pombe, Candida tropicalis, Candida mycoderma, C. Intermedia, Kloeckera apiculata, Pichia membranofaciens, P. farinosa, Kluyvoromyces fragilis y Hansenula anomala. Mohos: Penicillium citrovorus, Penicillium funiculosum, Aspergillus variatum, Aspergillus niger, Trichoderma viride y Monilia sitophila. (Sais, 1977; Duarte et al., 1982; Tallgren et al., 1999). Este gran nmero de especies demuestra la diversidad de la microflora presente en los jugos de caa; sin embargo, hay algunas especies que se desarrollan en el jugo con ms frecuencia que otras y que por lo tanto, adquieren una gran importancia econmica al consumir la sacarosa entrada en fbrica y formar exopolisacridos. Entre ellas encontramos especies de Leuconostoc mesenteroides y L. dextranicum, y miembros de bacterias coliformes, tales como Enterobacter amnigenus, Rahnella sp. o Enterobacter aergenes, siendo la primera de mayor incidencia en los ingenios azucareros, aunque la ltima se ha encontrado frecuentemente en estudios de microflora asociados con la caa de azcar (Duarte et al., 1982; Pulido et al., 1977; Tallgren et al., 1999).

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Otras especies notables debido a los productos a los que dan lugar hallados en los azcares son levaduras de la especie Sacharomyces sp., que produce etanol, y Clostridium thermosaccharolyticum, productora de cido butrico (Clarke et al., 1996).

2.2.4 Determinacin de prdidas por contaminacin microbiolgica y sus implicaciones Los principales productos de la actividad microbiolgica, adems de la masa celular y los polisacridos, son los azcares reductores como productos intermedios, el manitol, cidos orgnicos como el cido lctico que sirve como indicador de la prdida de azcar, cido actico, etanol, nitrito, H2 y CO2, dependiendo de la composicin microbiana determinada por condiciones de diseo y operacin de las plantas, as como de ciertas propiedades de la materia prima; estos productos metablicos disminuyen el pH, producen componentes coloreados y permanecen en el proceso afectando la calidad de subproductos posteriores teniendo todos ellos un efecto melazognico, es decir, que arrastran sacarosa con ellos a las melazas, disminuyendo la cantidad de sacarosa recuperada (Honig, 1969; Van der Poel, 1998). Numerosos estudios han intentado determinar las prdidas de sacarosa por microorganismos, estableciendo una relacin entre la cantidad de cidos producidos y la cantidad de sacarosa degradada. Con una disminucin de los valores de pH de 0.5 puntos, se calcula una prdida de 0.10 - 0.13 % de sacarosa, teniendo en cuenta la capacidad buffer del jugo en el caso de contaminacin por Clostridium sp. y de 0.16 0.19 % en contaminacin por Bacillus sp. (Hollaus, 1978). Sin embargo, teniendo en cuenta que los cidos no se producen nicamente de la degradacin de sacarosa sino tambin de azcares reductores, las prdidas podran ser menores. Los azcares reductores constituyen el ndice ms empleado para la deteccin de las prdidas en los jugos, pues el incremento de la relacin de stos con los slidos solubles significa

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prdidas por inversin microbiana (Duarte et al., 1982; Hollaus, 1978). Los mtodos para determinar actividad microbiolgica pueden ser directos, mediante anlisis polarimtrico y cromatogrfico de la sacarosa, o indirectos como el recuento de microorganismos capaces de reproducirse generalmente en cultivos en placa en diferentes medios con pH y temperatura variables, la formacin de subproductos metablicos como el incremento de dextranas, cidos y la formacin de nitritos, concentracin de manitol y cambios en los valores de pH o potencial redox en los jugos de caa; el objetivo principal de estas mediciones es monitorear las prdidas de azcar (Duarte et al., 1982; Van der Poel, 1998; Appling et al., 1959; Eggleston, 2001).

2.2.5 Polisacridos Bacterianos Los polisacridos en el jugo, especialmente de dextranos y levanos, afectan el proceso de produccin de azcar bloqueando lo equipos El primer reporte de produccin de polisacridos bacterianos en lquidos ricos en azcar por parte de microorganismos en forma de cocos data de 1861 y en 1878 se sugiri especies de Leuconostoc sp. como el principal responsable de la produccin de polisacridos en las fbricas de azcar. El dextrano es el polisacrido ms estudiado y algunas investigaciones incluyen tambin el levano, ambos causantes de problemas en la fabricacin, pues generan prdidas de sacarosa, obstruyen tuberas, coladores y bombas, afectan la polarizacin de la sacarosa resultando en lecturas falsas de pureza, aumentan la viscosidad de los licores causando una mala cristalizacin, generan alargamiento de los cristales, reducen su crecimiento y aumentan la formacin de grano falso, y forman biopelculas que se convierten en reservorio de gran diversidad de microorganismos que se agrupan en comunidades sinrgicas. (Cuddihy et al.,1996; Honig, 1969; Hollaus, 1978; Trost et al., 2002;

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Van der Poel, 1998). En menor proporcin se producen tambin otros polisacridos compuestos de molculas de glucosa, galactosa, fucosa y manosa como monosacridos estructurales (Tallgren et al., 1999).

2.2.5.1 Dextranos Dextrano es el nombre genrico para los polisacridos que son polmeros de glucosa; qumicamente, son polmeros homlogos de D-glucopiranosa (glucanos) y, a pesar de que cada bacteria produce un nico glucano, stos contienen predominantemente enlaces 1,6 glucosdicos (>95%) con menor proporcin de enlaces 1,2, 1,3 o 1,4. Se forman extracelularmente por la accin de la enzima dextrano-sucrasa, una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de residuos glucosdicos obtenidos de la hidrlisis de la sacarosa a un polmero de dextrano, liberando D-fructosa. Esta es una enzima inducible por su propio sustrato, capaz de catalizar la formacin de muchos tipos de enlaces permitiendo la formacin de polmeros ramificados (Figura 1)(Dols et al., 1998).

Fig 1. Estructura del dextrano. Fuente: www.offer21.com/.../ 20050701152600855451.jpg La estructura y propiedades del dextrano varan segn el microorganismo, las condiciones de cultivo, la concentracin de sacarosa, pH, temperatura y aireacin (Cuddihy et al., 1996; Duarte et al., 1982; Trost et al., 2002). Son producidos por

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bacterias cido lcticas entre las que se encuentran Lactobacillus sp., Leuconostoc sp. y Streptococcus sp., dentro de los cuales Leuconostoc mesenteroides y L. dextranicum son los ms conocidos; en este gnero se agrupan microorganismos anaerobios facultativos que tienen su hbitat natural en el caaveral y que, al producirse cualquier fisura en la superficie externa de la caa, la invaden y se reproducen rpidamente formando fcilmente polisacridos bajo las condiciones de temperatura (20C - 40C), pH (5 - 6) y concentracin de sacarosa (10% - 15%) encontrada en la caa de azcar cosechada (Van der Poel, 1998; Zhennai, 2000).

2.2.5.2 Levanos Los levanos son polifructosanos unidos por enlaces (2,6) de alto peso molecular, solubles en agua con rotacin ptica negativa, formados por la accin de la enzima levano-sacarasa que hidroliza la sacarosa y transfiere la D-fructosa a cadenas crecientes de fructanos para formar levanos producidos por microorganismos como Pseudomonas fluorecens, Corynebacterium beticola y especies de Bacillus sp. (B. subtilis, B. mesentericus, B. vulgatus), entre otros. Son polmeros que se originan en fbrica ms que en campo, a diferencia de los dextranos que se originan en ambos ambientes (Figura 2),(Honig, 1969; Tallgren, 1999; Zhennai, 2000).

Figura 2: Estructura del levano. Fuente: www.chem.qmul.ac.uk/.../ polygif/levan.gif

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2.3 Control de la actividad microbiolgica La formacin de polisacridos es fcilmente encontrada en molinos de caa donde se da poca atencin a la limpieza, pues es este un factor fundamental para controlar las prdidas de azcar en los tndem de molinos, que deben lavarse con vapor a intervalos regulares y ser totalmente sanitizados cuando la molienda se detenga para evitar la acumulacin de bagazo que permita la proliferacin de los microorganismos (Van der Poel, 1998). La limpieza frecuente y minuciosa del equipo de molienda permite reducir la fuente de inculo de microorganismos por medio de limpiezas con vapor, que ayuda a controlar las poblaciones mientras est en contacto con ellos; sin embargo, el jugo permanece desprotegido durante el proceso de molienda (Pulido et al., 1977). Por esta razn, se han llevado a cabo numerosos estudios con el fin de encontrar compuestos que puedan emplearse en ingenios azucareros y que posean actividad bacteriosttica o bactericida ante los grupos microbiolgicos con mayor incidencia en el proceso de extraccin, teniendo en cuenta la relacin costo-efectividad. Chen y Rauh en 1996, encontraron el mayor potencial de recuperacin de sacarosa aplicando apropiadamente un programa de sanitizacin del molino utilizando limpieza fsica y agentes biocidas como tratamiento preventivo a la prdida de sacarosa, que mejoran el proceso mediante la reduccin de coloides y otros no azcares que pueden causar ineficiencias en el proceso de clarificacin, evaporacin y calentamiento (Day et al., 1995; Van der Poel, 1998). En teora, mediante la implementacin de un programa adecuado de limpieza y desinfeccin en el rea de molinos, es posible recuperar entre 1 y 8 Kg. de azcar por tonelada de caa molida, lo que significa que para niveles de molienda cercanos a 6000 Ton diarias, puede representar una recuperacin econmica mnima (para 1 Kg. recuperado) de US 76.800 mensuales.

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2.3.1 Agentes biocida Los agentes biocidas aplicados en ingenios azucareros en el mundo deben cumplir con 3 especificaciones: - Estar aprobados por la normatividad vigente de regulacin en alimentos. - Ser relativamente econmicos y de fcil aplicacin - No deben ser voltiles y funcionar a las temperaturas que se presenten en el proceso (Ravn, 2001). La aplicacin debe ser adaptada a las condiciones de la fbrica, para que tenga impacto sobre los grupos de microorganismos que muestren tendencia a desarrollarse en lugares especficos del proceso; para la aplicacin de un agente biocida econmicamente viable es necesario determinar el punto ms apropiado de aplicacin y la dosis ms apropiada con el fin de optimizar la actividad (Antier, 1996; Hollaus, 1978), as como tener en cuenta la forma de aplicacin, temperaturas del proceso y diseo de la planta de extraccin (Van der Poel et al., 1998). El ms clsico y probablemente el ms efectivo de los agentes biocida que afectan la actividad microbiolgica es la formalina, aplicada en una solucin de 30% a 50% con metanol formando formaldehdo. Este compuesto es el ms simple de los aldehdos y altamente reactivo ya que se combina fcilmente con compuestos orgnicos reduciendo ciertos grupos bsicos como los amino e imidazol de las enzimas y cidos nucleicos, esenciales para su actividad (Van der Poel et al., 1998; Rincn et al., 1996). Sin embargo, su uso se ve limitado porque forma uniones irreversibles con los aminocidos presentes en el jugo, se evapora como metanol durante la purificacin del jugo y se precipita como formato en las melazas, aumentando la proporcin de no azcares en las mismas. Adems, se cree que la formalina gaseosa tiene efecto carcinognico (Van der Poel et al., 1998; Saye, 1993). Un compuesto evaluado en la industria Tucumana (Provincia Argentina) es el hipoclorito de calcio, aprovechando las propiedades del cloro utilizado como

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sanitizante qumico en la industria alimenticia (Cerutti et al., 1999). Se cree que el cloro es capaz de producir reacciones letales en o cerca de la membrana celular microbiana, causando mutaciones en las clulas vivas, remueve protenas y altera la permeabilidad de la cubierta de las esporas, ocasionando prdidas de iones calcio, cido dipicolnico, RNA y DNA (Cerutti et al., 1999). Entre otros compuestos utilizados en la industria azucarera se encuentran el dixido de azufre, compuestos de amonio cuaternario, sustancias catinicas, tiocarbamatos, anfteros, iodforos, glutaraldehido y perxido de hidrgeno, slo este ltimo con resultados similares a los obtenidos con formalina.

2.3.1.1 Busan 881 (Buckman Labs) En 1957 en Cuba se introdujo un nuevo bactericida, Busan 881, para reducir la inversin de sacarosa en los jugos; luego se introdujo en grandes ingenios en los Estados Unidos y ms tarde se implement en Mxico, Per y Brasil (Appling y Ugarte, 1959). Es un bactericida de amplio espectro compuesto por cianoditiocarbamato disodio y N-metilditiocarbamato de potasio, corrosivo a los ojos y la piel por lo que debe manejarse con precaucin (Annimo, 1993). En los ensayos realizados por Appling y Ugarte en agosto1959 en el ingenio de Pucal (Per), aplicaron por gravedad 10ppm al jugo al salir del ltimo molino y 5ppm al jugo mixto inicialmente, pero luego se aplicaron las 15ppm al jugo del ltimo molino. Las determinaciones de pureza y azcares reductores en jugos primarios y mixtos en muestras continuas durante la primera semana de tratamiento presentaron un importante rendimiento del azcar, disminucin en la formacin de exopolisacridos y compensacin del costo del bactericida. La dosis recomendada de aplicacin se determina con base a las toneladas de caa molidas en el ingenio, generalmente cercanas a 20ppm (base caa molida) (Annimo, 1993).

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2.3.1.2 Lipesa 106C (Glutaraldehdo) El glutaraldehido (1,5-pentadial) ha sido empleado exitosamente como desinfectante o agente esterilizante en aplicaciones industriales, clnicas y en agricultura (Annimo, 1992). Las propiedades antimicrobianas de este compuesto estn bien establecidas por sus reacciones de oxidacin, reduccin y condensacin; en condiciones normales, el glutaraldehido reacciona con grupos amino y residuos de lisina de las protenas, haciendo un entrecruzamiento de las protenas localizadas en la superficie de las bacterias, desnaturalizndolas y ocasionando la muerte celular. estable Es un producto a altas temperaturas y bajos pH, condiciones que fcilmente se pueden

encontrar en las fbricas de azcar. Se ha utilizado en industrias azucareras de remolacha a concentraciones de 250ppm de ingrediente activo, con base en las toneladas de materia prima molidas por unidad de tiempo (Saye, 1993).

2.3.1.3 Nalco 5581 (Ditiocarbamato) Los tiocarbamatos son compuestos pertenecientes al grupo de los organosulfurados, soluble en agua y solventes polares, y su mecanismo de accin se basa en la sustitucin y/o copulacin de grupos enzimticos claves del metabolismo microbiano; son considerados compuestos de baja toxicidad, bactericidas y fungicidas de amplio espectro (Widmer et al., 1993 citado por Cerutti et al., 2000). El componente activo de este biocida es el etileno ditiocarbamato de sodio (8%) y sus dosis pueden variar de acuerdo a la severidad de la contaminacin entre 10 y 30 ppm, aplicado en forma continua y en lugares donde se homogenice fcilmente.

2.3.2 Beneficios en los subproductos Las melazas obtenidas como subproductos del proceso de produccin son un efluente final de la preparacin del azcar que se ha cristalizado repetidamente y representan una alternativa biotecnolgica para la industria azucarera como materia prima en la produccin de alcohol mediante destilacin. Para tal fin, debe reunir una serie de

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requisitos microbiolgicos y fsico-qumicos que permitir un proceso eficiente de fermentacin por parte de las levaduras que se vern inhibidas por factores perjudiciales como el contenido excesivo de cido sulfuroso, los nitratos, los cidos voltiles, el color anormalmente oscuro, las materias coloidales y en suspensin y las infecciones serias, factores que, en su mayora, son consecuencia de malas condiciones de higiene y limpieza durante el proceso de produccin (Honig, 1969).

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3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

Los anlisis de rutina realizados al jugo de caa extrado en el Ingenio Manuelita S.A. muestran aumento en las concentraciones de subproductos del metabolismo microbiano como dextranas y porcentaje de azcares reductores , cadas de pureza de dos puntos o mayores y concentraciones altas de cidos orgnicos, lo cual disminuye la calidad de los subproductos del proceso de produccin de azcar. Esto indica que se requieren medidas de sanitizacin ms efectivas a las actualmente empleadas para el control de la contaminacin microbiolgica presente en la fbrica. Mediante la cuantificacin y clasificacin por tincin de Gram de los microorganismos presentes en los jugos de caa se determin qu tipo de microorganismos se encuentran durante el proceso de molienda, qu factores tienen mayor influencia en la variacin sus poblaciones y se obtuvo la informacin necesaria para establecer puntos en los que la limpieza debe ser ms minuciosa y es necesario utilizar agentes qumicos para controlar las cargas bacterianas que implican prdidas econmicas. Finalmente, se obtuvieron criterios para tomar medidas de control de las poblaciones de microorganismos detectadas, lo cual puede representar una disminucin de las prdidas de azcar asociadas a microorganismos y un mejoramiento de la calidad de los subproductos del proceso de produccin.

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4. OBJETIVOS

4.1 General

Determinar las poblaciones microbiolgicas presentes en el proceso de extraccin de jugos de caa de azcar, y as establecer criterios reales que permitan tomar medidas para controlar las prdidas microbiolgicas de sacarosa en el Ingenio Manuelita S.A.

4.2 Especficos

Cuantificar la carga microbiolgica con que ingresa la caa del campo al molino

en cuanto a: bacterias mesfilas, bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos, mohos, levaduras y bacterias termfilas aerobios esporuladas mediante la evaluacin de muestra directa de la caa (DAC). Determinar la variacin de las poblaciones de microorganismos durante el

recorrido de los jugos de caa en diversos puntos del molino mediante muestreos puntuales de los mismos. Realizar aislamientos de los microorganismos ms frecuentemente encontrados en

los muestreos para obtener cultivos puros, describir las colonias y la clasificacin mediante tincin de Gram.

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Determinar parmetros fsico-qumicos de los jugos evaluados como son valores

de pH, concentracin de dextranos (ppm) / brix, % de azcares reductores /brix y % de pureza de los jugos para establecer correlaciones con los resultados microbiolgicos. Focalizar los puntos crticos de acuerdo a las cargas microbiolgicas encontradas para sugerir

en los diferentes puntos de muestreo del proceso de extraccin, permitan controlar dichas cargas.

procedimientos de limpieza y desinfeccin ms minuciosos en estos sitios que

Realizar pruebas en el laboratorio con agentes biocidas sobre las muestras de jugo

que permitan evaluar su eficiencia en el control de las cargas de microorganismos con mayor incidencia en el proceso.

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5. MATERIALES Y MTODOS

5.1. Lugar de muestreo

Este estudio se realiz en el Ingenio Manuelita, ubicado al sur-occidente del pas, en jurisdiccin del municipio de Palmira, en el departamento del Valle del Cauca (Km. 7 va Palmira-Buga). La fbrica cuenta con 2 series de molinos agrupados en tndem; el estudio se centra especficamente en el tndem N2 compuesto por una serie de 6 molinos consecutivos, en donde el 1er molino aporta la mayor proporcin de jugo, mientras los 5 restantes continan la extraccin de jugo de la caa con adicin de agua de maceracin a 70C.

5.2. Poblacin de estudio y muestra Se tomaron 6 muestras en diferentes puntos del proceso de extraccin (figuras 3 y 4).

Fig 3. Puntos de muestreo: Muestra 1, muestra directa de caa (DAC)

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Fig 4. Puntos de muestreo en el proceso de extraccin: Muestra 2, jugo de primera extraccin; Muestra 3, 2 molino; muestra 4, 4molino; muestra 5, jugo del colador; muestra 6, jugo diluido.

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5.2.1 Anlisis Directo de Caa (DAC) La muestra de DAC se obtuvo en los patios de caa del ingenio donde un muestreador mecnico tom una muestra representativa de la caa que ingresa en tracto-mulas o dumper; se llev la muestra a un molino experimental previamente desinfectado con hipoclorito de sodio al 2.6% (v/v) y lavado con agua. Despus de pasar suficiente caa por este molino, se tom la muestra de jugo en un frasco de polipropileno previamente esterilizado y se llev a refrigeracin hasta el momento del anlisis. En este punto se tom la informacin de la caa muestreada: variedad, edad, procedencia, sistema de cosecha, tiempo de permanencia, etc.

5.2.2 Jugo de primera extraccin Despus de 5 min, contabilizados desde el momento en que la caa muestreada fue colocada sobre la banda transportadora y entr a la molienda, se tom la muestra de jugo de la primera extraccin en frascos de polipropileno previamente esterilizados (Cerutti et al., 2000).

5.2.3 Jugo del 4 molino El jugo del 4 molino es un punto intermedio que permiti determinar qu carga microbiolgica se aporta en los 3 ltimos molinos. La muestra se tom del jugo que sale del 4 molino hacia el 3ero, en frascos plsticos estriles con un muestreador diseado para tal fin.

5.2.4 Jugo del 2 molino

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En este punto se rene todo el jugo obtenido de la extraccin de los molinos posteriores y permiti determinar qu carga aporta todo el tndem de molinos al jugo. Se tom a la salida del 2 molino, antes de pasar al tanque del colador, en frascos plsticos previamente esterilizados mediante un muestreador diseado para tal fin.

5.2.5 Jugo del colador Este punto de muestreo se tom en el tanque del colador en frascos plsticos previamente esterilizados mediante un muestreador diseado para tal fin.

5.2.6 Jugo diluido En la descarga de la bscula al tanque de jugo mezclado se tom el jugo diluido en frascos plsticos previamente esterilizados con un muestreador diseado para tal fin. Esta muestra permiti determinar si las cargas se aumentaban en este trayecto en que el jugo est en contacto con diferentes superficies. En el muestreo se tuvieron en cuenta dos factores: el tamao de la muestra y la representatividad: Tamao de Muestra: La muestra se tom de manera puntual en cada uno de los puntos definidos anteriormente, durante 40 das de muestreo para asegurar normalidad en el anlisis de los datos. Representatividad: Se puso atencin especial en la representatividad de las muestras obtenidas, teniendo en cuenta todos los factores que puedan afectar las condiciones como la trazabilidad de la caa muestreada, el clima, la acumulacin de bagazo en los puntos de muestreo, los lavados, los paros de molienda, entre otros, de tal manera que las evaluaciones son estadsticamente significativas.

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5.3 Unidad de muestreo 250 ml de jugo de cada punto de muestreo.

5.4 Muestreos El muestreo se realiz en las horas de la maana, entre 8 y 9 a.m., salvo en los das en que se presentaron irregularidades en el proceso de molienda en la fbrica; en esos casos se tomaron las muestras en la tarde. Para la toma de muestras, se utiliz un muestreador que consiste en un tubo largo con un soporte de PVC en uno de sus extremos el cual rodea los frascos permitiendo el intercambio de los mismos entre las muestras, sin estar en contacto directo con ellas; de esta manera, se elimina la posibilidad de contaminacin cruzada. Las muestras tomadas en cada sitio se conservaron en refrigeracin hasta su anlisis. Se tomaron muestras en los seis puntos del proceso de molienda: DAC, jugo de 1era extraccin, 2 molino, 4 molino, jugo del colador y jugo diluido durante los meses de agosto a diciembre de 2005.

5.5 Variables del estudio Poblacin de bacterias mesfilas Poblacin de bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos Poblacin de levaduras Poblacin de mohos Poblacin de bacterias termfilas formadoras de esporas

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pH Determinacin de pureza Determinacin de dextranos (ppm) Determinacin de % de azcares reductores % de inhibicin del bactericida segn la frmula sugerida por Gonzlez en 1993: UFC/ml inicial UFC/ml final UFC/ml final x 100 Frmula (1)

5.6 Variables respuesta y unidades de medida Carga microbiolgica : UFC/ml pH Purezas: Diferencias de pureza entre los jugos Concentracin de dextranas: Dext (ppm) Azcares reductores: % Azcares Red % de inhibicin

5.7 Variables independientes a tener en cuenta (Caractersticas de la caa que ingresa Tabla 1) Hora de muestreo Procedencia de la caa Temperatura de las muestras.

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Tabla 1: Caractersticas de la caa que entr a la fbrica durante el estudio. Variables Tipo Descripcin Se refiere a la caa madura con todo su cuerpo foliar, que se corta sin ser quemada previamente. % en el estudio 37.5%

Verde Tipo de caa

Es la caa en la que se hace una quema Quemada controlada antes de la cosecha para eliminar el follaje y facilitar el corte posterior.

62.5%

Tipo de Cosecha

Manual

Los corteros de caa realizan la cosecha con machete en la base del tallo y los organizan en 52.5% hileras llamadas chorras; posteriormente, se carga a los vehculos de transporte con alzadoras mecnicas.

En la cosecha mecnica la caa es descogollada Mecnica por las mquinas, cortada por la base y trozada en pedazos de 30 centmetros. CC 85-92 Variedades de caa evaluadas PR 61-63 CC 84-75 V 71-51 MZC 74-275 RD 75-11 Mezcla Muestra directa de caa (DAC) Jugo de 1 extraccin Jugo del 2 molino Jugo del 4 molino Jugo del colador Jugo diluido

47.5%

55.0% 17.5% 7.5% 10.0% 5.0% 2.5% 2.5% 16.7% 16.7% 16.7% 16.7% 16.7% 16.7%

Puntos de muestreo

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Tipo de caa por punto

Se relacionaron todas las variables en caa verde y quemada por cada punto de muestreo. Corresponde a la edad del cultivo. Actualmente, la caa se corta entre 12 a 14 meses de edad, dependiendo de la variedad. En estudio se present un rango de edad entre 10.4 y 16 meses de edad, con un promedio de 13.5. Es el tiempo que permanece la caa en el campo, desde el momento en que se hace la cosecha, hasta que llega a la fbrica para ingresar a la molienda. En el estudio se determin un rango de TP entre 1.8 y 104.5 horas, con un promedio de 28 h. La materia extraa es todo aquel material diferente a los tallos de caa que ingresan a la molienda, entre los que se encuentran los residuos verdes como cogollos, porciones de caa, hojas verdes y secas, y terrones de suelo. En el estudio se present un rango entre 0 y 15.6% de ME, con un promedio de 6.4%.

Edad

Tiempo de permanencia (TP)

Porcentaje de materia extraa (%ME)

*El % en el estudio corresponde al % en que se present cada caracterstica en las muestras tomadas para el estudio.

Fuente: Manuelita S.A; CENICAA.

5.8 Mtodos

5.8.1 Recuento de microorganismos

5.8.1.1 Mesfilos Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v) en diluciones seriadas base 10 hasta 106; se sembraron 0.1ml de las dos ltimas diluciones por duplicado en la superficie de agar nutritivo solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a 37C durante 24 a 48 h despus de las cuales se hicieron los recuentos (Duarte, 1982; Cerutti, 2000).

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5.8.1.2 Bacterias cido lcticas productoras de exopolisacridos (BALPE) Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v), haciendo diluciones seriadas base 10 hasta 105; se sembraron 0.1ml de las dos ltimas diluciones por duplicado en la superficie de agar Man Rogosa Sharpe (MRS) adicionado con 20% de sacarosa previamente solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a 37C durante 24 a 48 h. Posteriormente se realizaron los recuentos (Cerutti et al., 2000).

5.8.1.3 Mohos y levaduras Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v), haciendo diluciones seriadas base 10 hasta 105; se sembraron 0.1ml de las dos ltimas diluciones por duplicado en la superficie de agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC) previamente solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a 30C por 3 a 4 das. Posteriormente se hicieron los recuentos (Duarte, 1982; Cerutti et al., 2000).

5.8.1.4 Bacterias aerobias termfilas esporuladas Se tomaron 50ml de la muestra y 50ml de agua estril a pH 7, para un volumen final de 100ml. Mediante choque trmico se activaron las esporas de bacterias aerobias termfilas formadoras de esporas, llevando la dilucin anterior a ebullicin durante cinco minutos luego de los cuales, se complet el volumen restante de diluyente que se evapor y se sembr por duplicado 0.1ml en la superficie del medio de cultivo glucosa-peptona de casena (Anexo 5); se incubaron las placas invertidas a 55C durante 24 - 48h despus de las cuales se realizaron los recuentos (Duarte, 1982; Hoing, 1969).

5.8.2 Aislamiento y clasificacin de microorganismos A partir de las placas empleadas para recuento se aislaron las colonias ms

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frecuentemente encontradas, tomando un inculo con asa estril y trazando varias lneas rectas sobre el medio respectivo solidificado. Posteriormente se realiz coloracin por tincin de Gram, para hacer la clasificacin de las bacterias aisladas, y coloracin con azul de lactofenol para observar las estructuras de hongos filamentosos y levaduras (Duarte, 1982).

5.8.3 Anlisis fsico-qumico

5.8.3.1 pH Se midieron aproximadamente 80ml de la muestra en un vaso, dejando enfriar a temperatura ambiente (dependiendo de la muestra); se esper lectura estable del Peachmetro Fischer de electrodo combinado (Procedimiento muestreo y anlisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A. 2003).

5.8.3.2 Temperatura (C) Se determin la temperatura del jugo en el momento del muestreo mediante termmetro.

5.8.3.3 % de Pureza Determinacin de grados brix y POL mediante mtodos estandarizados en laboratorio central.

5.8.3.3.1 Determinacin de grados brix Se midieron 100ml de la muestra, se agregaron 4g de tierra de infusoria (supercell). Se filtr, desechando los primeros ml del filtrado; se realiz la lectura de dos gotas de la muestra filtrada en el refractmetro y se registr el valor de los brix (Procedimiento muestreo y anlisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A. 2003).

5.8.3.3.2 Anlisis de POL (Sacarosa aparente)

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Se midieron 150 ml de la muestra mezclando bien con 0.5g de cal apagada. Se adicion un gramo de sulfato de aluminio y potasio (alumbre); se agregaron 5g de supercell, se filtr desechando los primeros ml de filtrado. Se cuadr el tubo del polarmetro a cero por ambos lados con agua destilada y luego se puso un poco de muestra filtrada a analizar. Luego se llen el tubo con la muestra para lectura de la polarizacin en el sacarmetro. Se determinaron los valores de sacarosa segn los valores de Brix y Polarizacin obtenidos utilizando las tablas de Expansin de Schmitz. Finalmente, la pureza se calcul mediante la siguiente frmula:

P

=

% sacarosa Brix refractomtrico

x 100

Frmula (2)

(Procedimiento muestreo y anlisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A., 2003)

5.8.3.4 Determinacin de azcares reductores: Mtodo de Eynon y Lane. Para determinar el porcentaje de reductores en las muestras se transfirieron 50 ml de la muestra sin bagacillo a una bureta. Aparte, se transfirieron 5ml de Fehling A y 5ml de Fehling B a un erlenmeyer, agregando 15ml de agua destilada y 5ml de la muestra y se mezcl. Se coloc el erlenmeyer sobre la plancha agitadora calentando hasta ebullicin y agitando suavemente; se mantuvo la ebullicin durante 2min; luego se agregaron 4 gotas de azul de metileno a la solucin que tom este color. Se coloc la bureta que contena le muestra a 2cm de la boca del erlenmeyer y, mientras la solucin estuvo en ebullicin se aadi el jugo a la bureta gota a gota hasta que la coloracin azul desapareci y tom un color rojo ladrillo. Se repiti la titulacin agregando 1 ml menos de la muestra gastada en la titulacin anterior, verificando que no se gastara en la titulacin ms de 1ml de jugo antes de que cambiara el color del indicador. Se determin el % de reductores con la tabla N 9 Sustancias Reductoras en jugo por el mtodo rpido de Lane y Eynon con el volumen gastado de titulacin. (Procedimiento muestreo y anlisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A., 2003).

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5.8.3.5 Determinacin de dextranos: Mtodo de Roberts (Precipitacin con alcohol y Lectura en Espectrofotmetro a 720nm) Se tomaron 15 ml de la muestra en un baln aforado de 100ml; se tomaron 20 ml de la dilucin anterior y 20 ml de solucin patrn (agua destilada). Se agregaron 0.5g de supercell y 4ml de cido tricloroactico; se puso a filtrar la muestra en filtro No.1 eliminando las primeras gotas de filtrado. Se tomaron 10 ml de la muestra filtrada mezclada con 10 ml de alcohol al 95%. Se dej en reposo durante 20 min., luego de los cuales se realiz la lectura en espectrofotmetro a 720nm, llevado a cero previamente con la solucin patrn preparada con agua destilada. Finalmente se aplic la siguiente frmula: 1179.77 x Abs x 6.67 = Dextranas (ppm) Frmula (3) (Procedimiento muestreo y anlisis de jugos pspcca 25, Manuelita S.A., 2003).

5.8.4 Evaluacin de los bactericidas De acuerdo a los resultados obtenidos en los recuentos de microorganismos en los puntos de muestreo, se hizo un ensayo en el laboratorio para determinar la eficiencia de diferentes bactericidas sobre las poblaciones microbiolgicas presentes en las muestras de jugo de la primera extraccin, por presentar stas una alta carga microbiolgica procedente de la materia prima que ingresa a la fbrica. Para este experimento se tomaron 1000 ml de muestra puntual del jugo; se aplicaron los agentes biocida en 3 concentraciones: la recomendada por el proveedor, una menor y una mayor, y se establecieron tiempos de contacto de 5, 10 y 15 min., teniendo en cuenta el tiempo mximo que puede durar el recorrido del jugo en el proceso de extraccin antes de entrar al proceso de clarificacin a temperaturas elevadas, establecido mediante la rutina de muestreo empleada en el estudio (Tabla 2) (Cerutti et al., 2000). Las muestras se mantuvieron en agitacin durante todo el ensayo

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buscando simular las condiciones de aplicacin en el molino. Tabla 2: Bactericidas evaluados, sus concentraciones y los tiempos de contacto Volumen de jugo evaluado (ml) 100 100 100 100 Concentracin (ppm) 5, 10, 20 5, 10, 20 10, 20, 30 Jugo puro Tiempos de Contacto (min.)* 5, 10, 15 5, 10, 15 5, 10, 15 5, 10, 15

Agentes biocida Busan 881 Lipesa 106C Nalco 5581 Testigo sin biocida

* Tiempo despus del cual se realizaron las siembras. Despus de cumplido el tiempo de contacto, cada muestra se diluy con agua

peptonada estril al 0.1% hasta 10-6 y se sembraron 0.1ml de cada una de las dos ltimas diluciones en agar nutritivo para mesfilos, 0.1ml en agar MRS para bacterias cido lcticas productoras de exopolisacrido, 0.1ml en agar YGC para hongos y levaduras y 0.1ml en agar glucosa-peptona de casena para termfilos. Cada siembra se realiz por duplicado. Finalmente, se compararon los recuentos obtenidos en los diferentes tratamientos y se evalu el tiempo de accin y la concentracin de cada compuesto de acuerdo al porcentaje de inhibicin obtenido (Cerutti et al., 2000).

5.9 Recoleccin de la Informacin Se recolect la informacin de acuerdo a las lecturas de las muestras analizadas que se registraron en el formato que se presenta en el anexo 1.

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5.10 Anlisis de la Informacin El estudio se clasifica como un estudio observacional dentro de las condiciones normales de funcionamiento del ingenio Manuelita S.A. Los datos de slidos solubles (Brix) del DAC se utilizaron como referencia para establecer un factor de dilucin en los siguientes puntos y aplicar este factor en la correccin en las poblaciones de microorganismos mediante una relacin entre cada punto de muestreo y la muestra directa de caa: Brix Dac/Brix 1era Ext Brix Dac/Brix 2 molino Brix Dac/Brix 4 molino Brix Dac/Brix Colador Brix Dac/Brix diluido Los datos de se sometieron a un anlisis de varianza utilizando dos modelos lineales con el programa estadstico SAS, teniendo en cuenta el 10% de significancia. Para determinar el efecto de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos del jugo de DAC, se aplic el siguiente modelo lineal: Yi : + Var + Tcaa + edad + % ME + TP + Error Frmula (4) Para la evaluacin de los jugos en la fbrica, el modelo lineal aplicado fue: Yi : + pto de muestreo + Error Frmula (5)

Donde: Yi: Variable a evaluar

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Var: Variedad de caa Tcaa: Tipo de caa %ME: % de materia extraa TP: Tiempo de permanencia de la caa en el campo. Pto de muestreo: Punto de muestreo Error: factores no considerados o no previsibles. Adicionalmente, se hizo anlisis de correlacin para detectar posibles relaciones entre las diferentes variables en cada uno de los puntos de muestreo.

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6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 Poblacin de microorganismos Los microorganismos mesfilos, es decir, aquellos cuya temperatura ptima est entre los 25C y 40C, representaron el grupo microbiano ms abundante en el proceso, seguido de la poblacin de bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos, las levaduras, los mohos y por ltimo la poblacin de bacterias termfilas (ver anexo 2).

6.2 Anlisis fsico-qumico La determinacin de las caractersticas fsico-qumicas de los jugos permiti establecer un factor de correccin para las poblaciones microbiolgicas con respecto a los brix de la muestra de DAC. Los factores aplicados para los recuentos en cada punto de muestreo fueron: 1.03 para el jugo de la 1era extraccin, 2.3 para el jugo del 2 molino, 5.2 para el jugo del 4 molino, 1.5 para el jugo del colador y 1.5 para el jugo diluido. La pureza se determin aplicando la frmula (2) a las lecturas de % de sacarosa y brix, y los dextranos aplicando la frmula (3) a la absorbancia de la muestra determinada mediante el espectrofotmetro (mtodo de Roberts). Se compar el comportamiento de parmetros como las cadas de pureza, el incremento de los azcares reductores, el incremento en la concentracin de dextranos y la disminucin en el % de sacarosa, con relacin a las poblaciones corregidas (ver anexo 2).

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6.2.1

Temperatura y pH

La tabla 3 muestra la temperatura y valores de pH evaluados en cada punto de muestreo. La temperatura encontrada en las muestras de DAC, 1era Ext., 2 molino, jugo del colador y jugo diluido son ideales para el desarrollo de microorganismos sacarolticos y no sacarolticos; el jugo del 4 molino es menos susceptible a esta flora al presentar una temperatura ms elevada como consecuencia del agua de maceracin aplicada al sexto molino. No obstante, si se encuentran bacterias esporuladas, stas pueden permanecer latentes hasta el momento en que encuentren las condiciones para su desarrollo; en este caso, al no existir un choque trmico fuerte, se da lugar a la germinacin de las esporas y, en consecuencia, la aparicin de clulas vegetativas que encuentran en el jugo del colador y diluido temperaturas adecuadas para desarrollarse, aumentando la poblacin microbiana si el tiempo de retencin es alto. Tabla 3. Promedios de temperatura y pH en cada punto de muestro Punto de Muestreo DAC 1era Ext. 2 molino 4 molino Colador Diluido Temp. (C) 25 + /-1.43 25 + /-1.55 42 + /- 4.14 54 + /- 6.62 35 + /- 2.88 34 + /- 4.71 pH 5.4 + /- 0.2 5.4 + / - 0.2 5.7 + /- 0.3 5.6 + /- 0.3 5.4 + /-0.2 5.4 + /- 0.2

En el rango mesoflico encuentran su temperatura ptima de crecimiento muchas de las bacterias con capacidad de producir exopolisacridos a partir de la sacarosa, entre ellas Leuconostoc sp. y otras bacterias cido-lcticas como Lactobacillus sp. y Lactococcus sp. Hernndez y colaboradores (1979) determinaron la temperatura ptima de desarrollo de Leuconostoc mesenteroides en jugos de caa entre 27 y

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37C; normalmente estos microorganismos son eliminados en etapas posteriores del proceso cuando se alcanzan altas temperaturas, pero sus subproductos metablicos permanecen en los jugos causando problemas posteriores. (Antier, 1996; Cerutti de Guglielmone, 1999; Cuddihy et al, 2001; Hoing, 1969). En cuanto al pH, para cada especie microbiana existe un valor mximo y uno mnimo pero, en general, las bacterias encuentran un valor ptimo alrededor de 5.0 a 6.5; para las bacterias cido lcticas, el pH ideal est entre 5.0 y 5.5, valores fcilmente encontrados en el jugo de la caa como lo muestra la tabla 3, donde se observa la poca variacin de los valores entre los diferentes puntos. Segn los valores de temperatura y pH encontrados en el estudio, la mayor parte del proceso de extraccin favorece el metabolismo de la sacarosa por parte de los microorganismos pues, normalmente, los jugos no alcanzan temperaturas ni valores de pH capaces de inhibir la actividad microbiolgica y el movimiento constante del jugo en las cadas del molino a tanques y canales permiten la aireacin del mismo, lo que favorece la proliferacin de los microorganismos. Resultados similares son reportados por Sais et al., 1979, Hollaus, 1978 y Romani et al., 1991.

6.3 Variables de respuesta

6.3.1

Influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones

microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos en la muestra de DAC. La diferencia entre los valores encontrados en los jugos tomados de los puntos de muestreo elegidos, indica que existe una gran variedad de factores que inciden sobre los mismos. A algunas de las variables analizadas se les aplic una transformacin

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logartmica para el anlisis de varianza debido al alto coeficiente de variacin inicial; se aplic el modelo lineal planteado en la frmula (4). Como lo seala Antier (1996) y Cerutti de Guglielmone y colaboradores (2000), la variabilidad de los datos se debe a los numerosos factores que inciden en la calidad de la caa que entra a la fbrica. Por esta razn, para evaluar la influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos del jugo, se realiz un anlisis de varianza entre los datos obtenidos en la muestra de DAC y los datos de trazabilidad de la caa a partir de la cual se tom la muestra. La tabla 4 muestra las significancias obtenidas.

6.3.1.1

Influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones

microbiolgicas en la muestra de DAC. Cuando se tomaron muestras de cosecha manual, el tipo de caa (verde o quemada) influy significativamente sobre la poblacin de mesfilos; se observ el mismo efecto sobre la poblacin de BALPE cuando la cosecha haba sido mecnica e, independientemente de la cosecha, el tipo de caa influy significativamente sobre la poblacin de levaduras. El test de Tukey que muestra la tabla 5, donde se comparan los valores medios de las poblaciones en cada tipo de cosecha (cosecha manual o mecnica) con tipo de caa (verde o quemada), muestra poblaciones mayores de mesfilos, BALPE y levaduras cuando la caa fu cosechada en verde, puesto que este tipo de caa llega a la molienda con todo el cuerpo foliar y las partculas de suelo; esta caracterstica la convierte en la fuente ms directa de contaminacin con microorganismos, pues la flora epfita de la caa entra a formar parte de la flora en el proceso de extraccin (figura 5) como lo reportan Van der Poel et al., (1998), Hernndez (1978) y Cerutti de Guglielmone (1999).

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As mismo, el tiempo de permanencia de la caa en campo (TP) cuando la cosecha es manual, mostr influencia significativa sobre las poblaciones de mesfilos, BALPE y levaduras (tabla 4), pues cuando se corta la caa se generan tejidos expuestos fcilmente accesibles para los microorganismos presentes en todas las superficies con las que sta entra en contacto, desde que es recogida del suelo hasta que llega a la fbrica. Estos microorganismos encuentran las condiciones ptimas para desarrollarse en las chorras en que se organiza la caa antes del alce, pues la temperatura del medio, las condiciones de humedad y la concentracin de O2 favorecen su proliferacin. Resultados similares reportaron Mora (1995) y Duarte y colaboradores (1982) quienes encontraron una marcada incidencia del tiempo de permanencia sobre las poblaciones microbiolgicas. Por el contrario, el tiempo de permanencia (TP) no mostr incidencia sobre las poblaciones en caa cosechada mecnicamente (tabla 4) ya que, en este tipo de cosecha, la caa permanece menos tiempo en el campo disminuyendo la influencia de este factor. La figura 6 muestra las tendencias de la relacin entre el tiempo de permanencia y las poblaciones de microorganismos; se observ incremento de las poblaciones despus de 30 horas, y un incremento importante despus de 70 horas de tiempo de permanencia de la caa en el campo.

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Tabla 4: Influencia de las caractersticas de la caa sobre las poblaciones microbiolgicas y los parmetros fsico-qumicos en la muestra de DAC. Anlisis estadstico (SAS) (10% de significancia). n= 40

Factores Tipo de Cosecha Variedad Tipo de Caa Edad TP %ME

Mesfilos

BALPE

Levaduras

Mohos

Bacterias termfilas aerobias Man NS NS NS NS NS Mec NS NS NS NS NS

Man Mec Man Mec Man Mec Man Mec NS NS NS NS NS NS NS NS S NS NS S S S NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS S NS S NS S NS NS NS S NS S NS S NS NS NS Dextranos (ppm) Mec NS NS NS NS NS

Factores

Brix Mec NS NS NS NS NS

%Sacarosa

%Pureza

%Azcares reductores Man NS NS NS NS NS Mec NS NS NS NS NS

Tipo de Cosecha Man Variedad NS Tipo de Caa NS Edad NS TP NS %ME NS

Man Mec Man Mec Man NS NS NS NS NS NS NS NS NS S NS NS NS NS NS NS NS NS NS S NS NS NS NS NS

TP: tiempo de permanencia; %ME: % de materia extraa; Man: cosecha manual; Mec: cosecha mecnica; S: significativo; NS: no significativo; BALPE: bacterias cido-lcticas productoras de exopolisacridos.

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Tabla 5: Test de Tukey. Comparacin de los valores medios de poblaciones microbiolgicas y caractersticas fsico-qumicas de la muestra de DAC, por tipo de caa y tipo de cosecha, y sus diferencias. n = 40.

oblaciones microbiolgicas Log UFC/ml Grupos microbianos Mesfilos BALPE Levaduras Mohos Bact. termfilas aerobias Cosecha manual Verde 7.79 5.28 5.90 3.83 2.30 Quemada 7.48 4.92 5.15 3.30 1.62 Cosecha Mecnica Verde 7.39 5.45 5.54 3.58 2.20 Quemada 7.19 4.99 5.18 3.30 2.24

Caractersticas fsico-qumicas Brix %Sacarosa Pureza Dextranos (ppm) % Azcares reductores

Cosecha manual

Cosecha Mecnica Quemada 19.83 17.86 90.02 86.62 0.58 19.88 18.04 90.71 75.69 0.40

Verde Quemada Verde 21.10 19.11 90.57 51.00 0.54 20.07 18.11 90.07 72.76 0.61

: Valores con diferencias significativas BALPE: Bacteria cido-lcticas productoras de exopolisacridos.

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a)9 8 7 Log UFC/ml 6 5 4 3 2 1 0

Cosecha manual

Mesf ilos Tipo de caa Caa larga verde

Levaduras

Caa larga quemada

b)Cosecha mecnica5,6 5,5 5,4 5,3 5,2 5,1 5 4,9 4,8 4,7 BALPE Tipo de caa Caa picada verde Caa picada quem ada Levaduras

Figura 5. Diferencias entre las poblaciones microbiolgicas de acuerdo al tipo de caa: a) Cosecha manual; b) Cosecha mecnica.

Log U FC /m l

50

Log UFC/ml 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 10-30 30-50 50-70 70-90 90-110

tiempos de permanencia (h) Mesfilos BALPE Levaduras

Figura 6. Tendencias de las poblaciones microbiolgicas de acuerdo al incremento de los tiempos de permanencia de la caa en campo en caa larga (cosecha manual).

En el estudio se encontr que el porcentaje de materia extraa es otro factor que incide significativamente en las poblaciones de mesfilos, cuando la cosecha ha sido manual, pues todos los residuos del corte como son, cogollos, hojas secas y verdes y terrones de suelo, aportan microorganismos 1996. al jugo, constituyendo una fuente importante de contaminacin, tal como lo reportaron McMaster en 1980 y Clarke en Este factor tambin influy sobre las poblaciones de BALPE y levaduras, aunque la tendencia no se observa claramente, pues no se presentaron incrementos importantes en la medida que el % de materia extraa aument (figura 7). El menor porcentaje de materia extraa correspondi a caa que haba sido quemada, y esta caracterstica pudo disminuir la poblacin de mesfilos que son altamente sensibles a las altas temperaturas, dando paso a la proliferacin de BALPE y levaduras, razn por la cual el comportamiento observado es coherente en la relacin de ste factor con dichas poblaciones.

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La figura 7 muestra las tendencias de las poblaciones de mesfilos, BALPE y levaduras en relacin al % de materia extraa en la caa larga que ingresa a la fbrica; en el estudio se encontr que, a partir del 2%, las poblaciones tienden a incrementarse.

Log UFC/ml 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 0-1 1-2 2-3 3-4

% de Materia extraa Mesfilos BALPE Levaduras

Figura 7. Influencia del % de materia extraa sobre las poblaciones de microorganismos en caa larga (cosecha manual).

La poblacin de mohos evaluada en el estudio no mostr una relacin estadstica significativa con las caractersticas evaluadas en la caa; sin embargo, se presentaron poblaciones mayores cuando la cosecha se realiz en verde (tabla 5), pues la alta temperatura que se alcanza en la quema de los tallos pudo disminuir las poblaciones que porta la caa y el suelo que la rodea, teniendo en cuenta que los hongos son el grupo de microorganismos ms sensible a la temperatura. Asi mismo, la poblacin de bacterias termfilas y los parmetros fsico-qumicos como los valores de slidos solubles (brix), % de sacarosa, pureza y % de azcares reductores, no se vieron afectados por las caractersticas de la caa evaluadas en el estudio.

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Factores como la edad y la variedad de la caa no mostraron influencia sobre la microflora presente en el jugo.

6.3.1.2 Influencia de las caractersticas de la caa sobre los parmetros fsicoqumicos en la muestra de DAC. La concentracin de dextranos en el jugo de DAC mostr relacin con el tiempo de permanencia cuando se realiz corte manual de la caa, y concentraciones mayores cuando la caa fue quemada para la cosecha (significancia con el tipo de caa, tabla 4). Estudios realizados en Australia, indican que especies de Leuconostoc sp. colonizan rpidamente despus del corte de la caa, penetran hasta 7.5cm en 10 min. desde el punto de corte hasta el interior y producen dextrano en el tiempo que transcurre entre la quema de la caa y su cosecha (Purchase, 2001; Morel du Boil, 2000; McMaster et al., 1980); en consecuencia, es posible que en este lapso se sinteticen polisacridos bacterianos (figura 8). Holland (1990) y Landon et al. (2002) encontraron la mayor concentracin de dextranos en la caa quemada, como se observ en el presente estudio, pues el calor elimina de la superficie la capa de cera protectora, causa hendiduras en la corteza y daa el tejido de almacenamiento debajo de esta donde se encuentran las saponinas responsables de la defensa contra agentes fitopatgenos; en consecuencia, los tejidos quedan ms expuestos y por tanto, ms susceptibles a degradacin microbiolgica especialmente por bacterias presentes en el suelo y la materia extraa capaces de producir exopolisacridos a partir de la sacarosa, como las pertenecientes al gnero Leuconostoc sp., y Bacillus sp. En el corte mecnico, aunque no se presentaron diferencias significativas, la concentracin de dextranos fue mayor en comparacin con el corte manual, pues al dividir los tallos en trozos de 10 a 30 cm. se genera un incremento en el rea

53

disponible para la proliferacin bacteriana y por ende para la degradacin de la sacarosa (tabla 5).

a)

80 70 Dextranos (ppm) 60 50 40 30 20 10 0 Caa larga verde Caa larga quemada Tipo de caa Promedio Dextranos

b)

Dextranos (ppm)

68 66 64 62 60 58 56 54 10-30 30-50 50-70 70-90 90-110Tiempo de permanencia (h) Dextranas

Figura 8. En caa cosechada manualmente: a) Influencia del tipo de caa sobre la concentracin de dextranos b) Influencia del tiempo de permanencia sobre la concentracin de dextranos.

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Para los dems parmetros fsico-qumicos del jugo no se encontr significancia con las caractersticas de la caa (tablas 4 y 5); esto pudo deberse a que la heterogeneidad en la procedencia de la caa y la variabilidad de factores como el % de materia extraa y el tiempo de permanencia, generaron otras condiciones, como el incremento de la poblacin de BALPE y de la concentracin de dextranos, por ejemplo, afectando los resultados de estas mediciones.

6.3.2 Poblaciones microbiolgicas y su correlacin con las caractersticas fsicoqumicas en los puntos de muestreo Se realiz una cuantificacin de la poblacin de mesfilos, BALPE, levaduras, mohos y bacterias termfilas, correlacionando las poblaciones con las caractersticas fsico-qumicas de los jugos, y diferenciando mediante tincin de Gram las colonias ms frecuentemente encontradas. Se consideraron correlaciones significativas aquellas con valores menores a 0.1 (10% de significancia), diferenciando los valores positivos como correlacin directa, en que ambas variables aumentan o disminuyen al mismo tiempo, y los valores negativos como correlacin inversa.

6.3.2.1 Cuantificacin de las poblaciones de mesfilos, BALPE, levaduras, mohos y bacterias termfilas aerobias. La poblacin microbiolgica ms alta encontrada en el estudio en los diferentes puntos de muestreo correspondi a microorganismos mesfilos (figura 9), que ingresan a la fbrica con una poblacin cercana a 107 UFC/ml, determinada en la muestra de DAC; en este punto no se observ correlacin de esta poblacin con los parmetros fsico-qumicos evaluados (tabla 6). El anlisis estadstico mostr incremento de la poblacin en la 1era extraccin, punto en el cual se present la mayor densidad de microorganismos mesfilos; sin embargo, no se encontr correlacin significativa entre esta poblacin y los brix, % de

55

sacarosa, pureza, % de azucares reductores y concentracin de dextranos de la muestra de jugo en este punto (tabla 6).

9 8 7 6 Log UFC/ml 5 4 3 2 1 0 Dac 1era Ext 2do m olino 4to m olino Colador Diluido

Mesfilos

BALPE

Levaduras

Mohos

Termfilas Aerobias

Figura 9: Promedio de poblaciones microbiolgicas por punto de muestreo. n = 40 Estos incrementos de la contaminacin microbiana estn relacionados con los cmulos de bagacillo que se observan en varios puntos del molino, especialmente en la 1era Ext., lo cual tambin fue reportado por Duarte y colaboradores en 1982. En la muestra del segundo molino la poblacin fue menor y se present correlacin significativa directa entre los mesfilos y los brix, y entre esta poblacin y el % de sacarosa, lo cual es un comportamiento lgico, pues al haber ms sacarosa los microorganismos tiene su fuente de carbono y el incremento de la poblacin y los subproductos del metabolismo resultan en un aumento de los brix. El jugo del 4 molino mostr la poblacin ms baja de los puntos evaluados, debido a la alta temperatura que alcanza el jugo en este punto y al bajo contenido de sacarosa del mismo.

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Tabla 6. Correlaciones entre las poblaciones microbiolgicas y las caractersticas fsico-qumicas de los jugos en cada punto de muestreo.MESFILOS 1era Ext NS NS NS NS NS BALPE 1era Ext NS NS NS NS NS LEVADURAS 1era Ext NS NS NS NS NS MOHOS 1era Ext NS NS NS NS S (+) BACTERIAS TERMFILAS 1era Ext S(-) NS NS NS NS

Caractersticas fsico-qumicas Brix % Sacarosa Pureza %Azcares reductores Dextranos (ppm) Caractersticas fsico-qumicas Brix % Sacarosa Pureza %Azcares reductores Dextranos (ppm)

DAC NS NS NS NS NS DAC S(-) S(-) S(-) NS NS

2 molino NS NS NS S (+) NS 2 molino NS NS NS NS NS

4 molino Colador Diluido S (+) NS NS S (+) NS NS NS NS NS NS NS NS NS S(-) NS 4 molino Colador Diluido NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS S (+)

Caractersticas fsico-qumicas Brix % Sacarosa Pureza %Azcares reductores Dextranos (ppm)

DAC NS NS NS S(-) NS

2 molino NS NS NS NS NS

4 m