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8/17/2019 tesisdepolisacaridosestructurales.pdf

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTA DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

E. A. P. DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

“Elucidación estructural del polisacárido del ala

ro!a Porphyra columbina " deter#inación in vivo

de la capacidad antio$idante e %ipolipe#iante&

TESIS

Para optar el Tirulo Profesioal !e Qu"#i$o Far#a$%uti$o

AUTOR

Bla$a Yesseia A&uilar 'elas(ue)

ASESOR

C%sar M*+i#o Fuertes Ruit,

Li#a ' (er)

*+,-


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Dedicatoria

Cuando te propongas un objetivo has que este sea beneficioso para tanta

gente como puedas, da salud. Jamás te quiebres, siempre levántate, sueña,

imagina, alcanza, concretiza. Si te dicen que no podrás es porque ellos ya se

rindieron, camina. Son tus pies andando en la tierra y es toda la diferencia que

necesitas.

Descubrir es mostrar lo que no se podía ver, crear es un salto más allá. El

creador debe estar preparado para su creación o sólo habrá dado paso a la

aberración.

A todas las invaluables

personas en mi vida que

día a día me demuestran

sus sinceros sentimientos

de estima haciéndome

crecer más y más en todos

los sentidos que mihumilde humanidad

permite.


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Agradecimientos

A mi familia, por siempre mostrarme que la unión es más fuerte que todas las adversidades, y yo tengo en

ellos los más fuertes hombros.

A mi padre Genaro, por estar ahí para mí, acordarse de los pequeños detalles y mostrarme que ser

exigente con uno mismo y anhelar lo mejor de la forma correcta te hará una persona invaluable.

A mi madre Blanca Aurora, por mostrarme a las mujeres luchadoras, de esfuerzo infinito, de sacrificios

grandes, de amor incalculable y por apoyarme siempre en mi educación.

A mis hermanos, Ricardo y Jeyson, por ser mis confidentes en nuevos retos, el descanso en las noches en

la sala de la casa y su amistad verdadera, como tienen y tendrán la mía.

A mi asesor el profesor César Fuertes, por su confianza, su espera y su ayuda incondicional en el

laboratorio de Química Orgánica, quien me demostró durante toda mi época universitaria con su

ejemplo que el brindar las herramientas para que los alumnos sean mejores, el ejercer su defensa y

también establecer parámetros ha de ser siempre motivo de lucha y motivo de regocijo aun cuando los

nombres de los hacedores de tales logros sea olvido de muchos . Gracias.

Al departamento de Bioquímica de mi tan querida Facultad, por su soporte estructural y valioso

conocimiento aportado en la realización de esta tesis. Especialmente a la profesora Elizabeth Carranza

quien es una gran investigadora y da paso al pensamiento libre de los estudiantes para luego apoyarte a

concretizar tus objetivos.

Al Servicio Académico Asistencial de Análisis Clínicos, cuyo personal se esfuerza día a día por mostrar a

la sociedad la contribución de los Químicos Farmacéuticos en su salud, por las instalaciones y equipos

brindados para la realización de las pruebas de perfil lipídico.

A la profesora Marina Marín, por sus valiosos consejos en la realización de las pruebas toxicológicas.

A mis amigas Guísela y Kate, compañeras de aulas y personas invaluables en mi vida que me dan la

perseverancia para terminar está grandiosa experiencia, y a grandes amigos que he tenido la dicha de

encontrar en el camino quienes desinteresadamente y con el ímpetu de adquirir nuevos conocimientosme

apoyaron en los ensayos realizados: Leo, Edén, Winy, Katy, Maggie .

A los amables señores de la biblioteca y de mantenimiento de la Facultad que nos cobija a todos, por su

sentido de cooperación con el estudiante y futuro profesional. Mi profundo y sincero aprecio.


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Al profesor Mario Benavente, por sus largas historias sobre los intentos de industrializar las algas en

el Perú y por su ayuda en la selección de la especie algal estudiada.

Al Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, por su labor

constante en el apoyo a la realización de tesis de pregrado las cuales se convierte en carta de presentación

a la sociedad del sincero deseo de ser un profesional a su servicio y a su vez obtener el título por el que será

llamado y reconocido.

Al jurado calificador de esta tesis de pregrado: al profesor Pablo Bonilla por su sentido de una educación

gratuita para todos, a la profesora Gloria Gordillo por sus esfuerzo en la mejora estructural de laFacultad y su ayuda al estudiante de pregrado, a la profesora Bertha Jurado por sus horas de entrega a

la investigación en el laboratorio, a la profesora Eva Ramos por su energía para nuevos retos y

promoción de la investigación. Sus invaluables consejos y observaciones terminan de dar forma a esta

corta obra, larga experiencia y primer manifiesto de mis deseos serios por el descubrimiento de nuevas

cosas en muchos aspectos profesionales y personales donde la naturaleza siempre tendrá un gran espacio.

A Dios, por sobre todas las cosas, por todas las cosas. Por lo que ha sido, por lo que es y lo que será.

Un paso de Fe, muchas razones. Gracias.


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ABREVIATURAS

Bp Par de base

P. Porphyra

FT-IR Infrarrojo con transformada de Fourier

RMN Resonancia magnética nuclear

SOD Superóxido dismutasa

CAT Catalasa

INS Instituto Nacional de Salud

ROSs Especies reactivas del oxígeno

RSS Especies reactivas del azufre

RNS Especies reactivas del nitrógeno

GPx Glutatión peroxidasa

GSH Glutatión reducido

GSSG Glutatión oxidado

MDA Malondialdehido

PUFA Ácido graso poliinsaturado

GRd Glutatión reductasa

RO˙ Radical alcoxil

ROO Radical peroxil

ROOH Hidroperóxido

LOOH Hidroperóxido lipídico

OONO Anión peroxinitrito

C Colesterol

TG Triacilglicerol

Acetil-CoA Acetilcoenzima A

HDL Lipoproteína de alta densidad

LDL Lipoproteína de baja densidad


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VLDL Lipoproteína de muy baja densidad

HPL Hiperlipemias

AG Ácidos grasos

MG Monoacilglicerol

DG Diacilglicerol

PDGF Factor de crecimiento derivado de las plaquetas

3,6-AG 3,6-anhidrogalactosa

BPS Tampón fosfato salino

c.s.p Cantidad suficiente para

sol. Solución

Abs Absorbancia

OECD Organización para la cooperación económica y desarrollo

TODR Toxicidad oral dosis repetida

AST Aspartato aminotransferasa

ALT Alanina aminotransferasa

GNC Grupo control normal en prueba antioxidante

GCM Grupo control modelo de CCl4

GCV Grupo control de vitamina C 25 mg/Kg de peso corporal

P625 Grupo inyectado con CCl4 y luego polisacárido 6.25 mg/Kg

P2500 Grupo inyectado con CCl4 y luego polisacárido 25 mg/Kg

P5000 Grupo inyectado con CCl4 y luego polisacárido 50 mg/Kg

GC Grupo control normal en prueba hipolipemiante

GH Grupo control de lipemia

GG Grupo gemfibrozilo en prueba hipolipemiante

GP Grupo polisacárido en prueba hipolipemiante

DL50 Dosis letal 50


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TABLA DE CONTENIDO

DedicatoriaAgradecimientosAbreviaturas

Índice de FigurasÍndice de cuadrosResumenABSTRACT

I. Introducción .....................................................................................................1

II. Generalidades .................................................................................................3

2.1 Algas Marinas Rodofitas .........................................................................3

2.1.1 El género Porphyra .................................................................................52.1.2 Breve estudio botánico del alga Porphyra columbina .............................6

2.1.2.1 Taxonomía .................................................................................62.1.2.2 Características físicas ................................................................62.1.2.3 Ciclo de vida ...............................................................................72.1.2.4 Hábitat ........................................................................................92.1.2.5 Distribución mundial ...................................................................92.1.2.6 Distribución en el Perú .............................................................10

2.1.3 Galactanos sulfatados ...........................................................................10

2.1.3.1 Porfiranos .................................................................................112.1.3.1.1 Características estructurales .................................................112.1.4 Actividad biológica de las algas marinas ...............................................14

2.1.4.1 Actividad biológica del porfirano ...............................................152.1.5 Usos y forma de consumo actual de Porphyra .....................................162.1.6 Perspectivas futuras ..............................................................................17

2.2 Capacidad Antioxidante ........................................................................182.2.1 Radicales libres .....................................................................................18

2.2.1.1 Mecanismo de generación de radicales libres..........................18

2.2.1.2 Daños producidos por los ROSs ..............................................202.2.2 Peroxidación lipídica .............................................................................212.2.3 Mecanismos de defensa contra el daño oxidativo ................................23

2.2.3.1 Antioxidante .............................................................................232.2.3.1.1 Sistemas antioxidantes .........................................................232.2.3.1.2 Antioxidantes enzimáticos .....................................................242.2.3.1.2.1 Superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1) ..................................242.2.3.1.2.2 Catalasa (EC 1.11.1.6).......................................................242.2.3.1.2.3 Glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.9) ....................................25

2.2.3.1.3 Antioxidantes no enzimáticos ................................................262.2.3.1.3.1 Glutatión .............................................................................26


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2.2.3.1.3.2 Vitamina E ..........................................................................272.2.3.1.3.3 Vitamina C .........................................................................272.2.3.1.3.4 Vitamina A ..........................................................................272.2.3.1.3.5 Coenzima Q10 ...................................................................28

2.2.4 Usos actuales, perspectivas futuras .....................................................28

2.3 Capacidad Hipolipemiante ....................................................................302.3.1 Metabolismo de los lípidos ....................................................................30

2.3.1.1 Colesterol .................................................................................302.3.1.1.1 Vía del mevalonato ...............................................................322.3.1.2 Triacilgliceroles ........................................................................342.3.1.3 Lipoproteínas ...........................................................................36

2.3.1.3.1 Quilomicrones .......................................................................372.3.1.3.2 Lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) ..........................372.3.1.3.3 Lipoproteína de densidad media (IDL) ..................................372.3.1.3.4 Lipoproteína de baja densidad (LDL) ....................................382.3.1.3.5 Lipoproteína de alta densidad (HDL) ....................................382.3.1.4 Valores normales de lípidos plasmáticos ................................40

2.3.2 Dislipidemias .........................................................................................402.3.2.1 Tipos de dislipidemias ..............................................................412.3.2.1.1 Hiperlipemias ........................................................................41

2.3.3 Enfermedades relacionadas..................................................................422.3.3.1 Ateroesclerosis .........................................................................422.3.3.2 Obesidad ..................................................................................42

2.3.4 Tratamiento ...........................................................................................432.3.4.1 Tratamiento farmacológico.......................................................432.3.4.1.2 Fármacos hipolipemiantes ....................................................432.3.4.1.2.1 Inhibidores de la hidroximetilglutaril coenzima A reductasa

(HMG-CoA-Reductasa): estatinas ......................................432.3.4.1.2.2 Resinas de intercambio iónico ............................................442.3.4.1.2.3 Fibratos o derivados del ácido fenoxiisobutírico .................44

2.3.4.1.2.4 Ácido nicotínico ..................................................................442.3.5 Tratamiento no farmacológico ...............................................................45

2.3.5.1 Dieta .........................................................................................452.3.6 Perspectivas futuras del tratamiento hiperlipídico .................................45

III. Parte Experimental .......................................................................................46

3.1 Material, equipos y reactivos ................................................................46 3.1.1 Material botánico ...................................................................................46

3.1.2 Materiales biológicos .............................................................................463.1.3 Materiales de vidrio y otros ...................................................................46


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3.1.4 Equipos .................................................................................................473.1.5 Reactivos ..............................................................................................47

3.2 Recolección y selección del alga .........................................................48

3.3 Obtención del polisacárido del alga ....................................................483.3.1 Determinación de humedad ..................................................................483.3.2 Extracción y purificación del polisacárido..............................................493.3.3 Liofilización ............................................................................................503.3.4 Análisis de unidad monomérica y grupo sulfato ....................................53

3.3.4.1 Análisis cuantitativo de 3,6-anhidrogalactosa ...........................533.3.4.2 Análisis cuantitativo de sulfato ...................................................54

3.3.5 Análisis por espectroscopia infrarroja (IR) ............................................553.3.6 Análisis por Resonancia Magnética Nuclear (RMN-1H) ........................55

3.4 Estudio Farmacológico .........................................................................563.4.1 Ensayo de toxicidad ...........................................................................56

3.4.1.1 Ensayo de toxicidad aguda oral ................................................563.4.1.2 Ensayo de toxicidad oral dosis repetida ....................................58

3.4.2 Capacidad antioxidante in vivo .........................................................603.4.2.1 Cálculo del Índice de hígado .....................................................62

3.4.2.2 Medición de transaminasas (aspartato aminotransferasa yalanina aminotransferasa) en suero.........................................623.4.2.3 Medición de los productos de la peroxidación lipídica ..............653.4.2.3.1 Medición de superóxido dismutasa (SOD) .............................653.4.2.3.2 Medición de la actividad de la catalasa (CAT)........................673.4.2.3.3 Medición de la glutatión peroxidasa (GPx) .............................683.4.2.3.4 Medición de malondialdehído (MDA) .....................................693.4.2.4 Determinación de proteínas ......................................................71

3.4.3 Capacidad hipolipemiante ..................................................................723.4.3.1 Preparación de las sustancias a emplear en el tratamiento ......723.4.3.2 Tratamiento ...............................................................................733.4.3.3 Evaluación Bioquímica ..............................................................743.4.3.3.1 Determinación de colesterol (C) .............................................743.4.3.3.2 Determinación de triacilgliceroles (TG) ...................................763.4.3.3.3 Determinación de HDL ...........................................................773.4.3.3.5 Determinación de VLDL .........................................................79

3.4.4 Análisis de datos .................................................................................79

IV. Resultados ...................................................................................................80

4.1 Obtención del polisacárido del alga.....................................................80


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4.1.1 Determinación de humedad ..................................................................804.1.2 Extracción, purificación y liofilización del polisacárido ..........................804.1.3 Análisis de unidad monomérica y grupo sulfato ....................................80

4.1.3.1 Análisis cuantitativo de 3,6-anhidrogalactosa ...........................804.1.3.2 Análisis cuantitativo de sulfato...................................................80

4.1.4 Análisis por espectroscopia infrarroja (IR) ............................................814.1.5 Análisis por Resonancia Magnética Nuclear (RMN-1H) ........................84

4.2 Estudio Farmacológico .........................................................................864.2.1 Ensayo de Toxicidad ..........................................................................86

4.2.1.1 Ensayo de toxicidad aguda oral ...............................................864.2.1.2 Ensayo de toxicidad oral dosis repetida (TODR) ......................87

4.2.2 Capacidad antioxidante in vivo ..........................................................884.2.2.1 Cálculo del Índice de hígado ....................................................884.2.2.2 Medición de transaminasas en suero ......................................884.2.2.2.1 Medición de AST (aspartato aminotransferasa) ....................884.2.2.2.2 Medición de ALT (alanina aminotransferasa) ........................894.2.2.3 Medición de los productos de la peroxidación lipídica ..............914.2.2.3.1 Medición de superóxido dismutasa (SOD) ............................914.2.2.3.2 Medición de la actividad de catalasa (CAT) ..........................934.2.2.3.3 Medición de la glutatión peroxidasa (GPx) ............................93

4.2.2.3.4 Medición de malondialdehído (MDA) .....................................944.2.2.3.5 Determinación de proteínas ...................................................954.3.2.3.6 Observaciones microscópicas de tejido hepático ..................96

4.2.3 Capacidad hipolipemiante ..................................................................984.2.3.1 Pesos de los conejos ...............................................................984.2.3.2 Determinación de colesterol (C) ...............................................994.2.3.3 Determinación de triacilgliceroles (TG) .....................................994.2.3.4 Determinación de HDL ...........................................................1004.2.3.5 Determinación de LDL ...........................................................1004.2.3.6 Determinación de VLDL .........................................................101

V. Discusión ...................................................................................................102

VI. Conclusiones ............................................................................................113

VII. Recomendaciones ....................................................................................114

VIII. Referencias Bibliográficas ......................................................................115Anexo ........................................................................................................127

Glosario .....................................................................................................134


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Índice de Figuras

Figura N° 1. Forma macroscópica de Porphyra columbina Montagne21 ..............7

Figura N° 2. Ciclo de vida de Porphyra columbina 24

............................................8Figura N° 3. Dímero metilado derivado de la hidrólisis del porfirano metilado28 12

Figura N° 4. Estructuras de porfiranos comparados con los polisacáridos del

………………grupo agar24 ...................................................................................14

Figura N° 5. Generación de ROSs60 ..................................................................19

Figura N° 6. Patogénesis del tejido dañado63 ....................................................20

Figura N° 7. Objetivos de los ROSs60 ................................................................21

Figura N° 8. Proceso de la peroxidación lipídica66 .............................................22

Figura N° 9. Estructuras de 4-hidroxinonenal (A) y malondialdehído (B)68 ........23

Figura N° 10. Estructuras de ciclopentanoperhidrofenantreno y colesterol103 ...31

Figura N° 11. Vía del mevalonato y la síntesis de isoprenoides109 ....................33

Figura N° 12. Metabolismo de triacilglicerol en hígado111 ..................................35

Figura N° 13. Transporte de lípidos por vía exógena94 ......................................39

Figura N° 14. Diagrama de flujo de la extracción acuosa del porfirano de

………………..Porphyra columbina .....................................................................51

Figura N° 15. Diagrama de flujo de la purificación, liofilización y análisis

………………..instrumental del porfirano ............................................................52

Figura N° 16. Esquema metodológico de tratamiento del hígado de ratón160 ...62

Figura N° 17. Curva de calibración de sulfatos ..................................................81

Figura N° 18. Espectro Infrarrojo del porfirano (4000 cm-1 a 750 cm-1) de

………………...Porphyra columbina ....................................................................82

Figura N° 19. Espectro infrarrojo del porfirano (1200 cm-1 a 800 cm-1) de

………………...Porphyra columbina ....................................................................83Figura N° 20. Espectro de RMN-1H del polisacárido (porfirano) de Porphyra

………………..columbina ....................................................................................85

Figura N° 21. Comportamiento del peso de los ratones .....................................86

Figura N° 22. Tejido hepático de ratón (dosis = 50 mg/kg) ................................87

Figura N° 23. Medias estimadas de Índice de hígado ........................................88

Figura N° 24. Curva de calibración AST ............................................................89

Figura N° 25. Medias estimadas de AST ...........................................................89


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Figura N° 26. Curva de calibración ALT .............................................................90

Figura N° 27. Medias estimadas de ALT ............................................................90

Figura N° 28. Curva de calibración de SOD .......................................................92

Figura N° 29. Medias estimadas de SOD...........................................................93

Figura N° 30. Medias estimadas de CAT ...........................................................93

Figura N° 31. Medias estimadas de GPx ...........................................................94

Figura N° 32. Medias estimadas de MDA ..........................................................94

Figura N° 33. Curva de calibración de proteínas................................................95

Figura N° 34. Observación microscópica de GCN .............................................96

Figura N° 35. Observación microscópica de GCM .............................................96

Figura N° 36. Observación microscópica de GCV .............................................96

Figura N° 37. Observación microscópica de P6250 ...........................................97



Figura N° 40. Medias de peso por día de tratamiento según grupo (conejo) .....98

Figura N° 41. Medias por semana y grupo de tratamiento de C ........................99

Figura Nº 42. Medias por semana y grupo de tratamiento de TG ......................99

Figura Nº 43. Medias por semana y grupo de tratamiento de HDL ..................100

Figura Nº 44. Medias marginales por semana y grupo de tratamiento de HDL100

Figura Nº 45. Medias por semana y grupo de tratamiento de VLDL ................101

Figura Nº 46. Separación del polisacárido .......................................................131

Figura Nº 47. Polisacárido liofilizado ................................................................131

Figura Nº 48. Ratones marcados. Toxicidad aguda oral ..................................131

Figura Nº 49. Coloración de Formazan rojo .....................................................132Figura Nº 50. Coloración rosada. Prueba de MDA ...........................................132

Figura N° 51. Administración de polisacárido por vía oral (conejo) .................132

Figura N° 52. Vena marginal del conejo ...........................................................133

Figura N° 53. Separación de suero en tubo vacutainer....................................133

Figura N° 54. Calibración de la prueba de colesterol .......................................133


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Índice de tablas

Tabla N° 1. Antioxidantes enzimáticos81 ............................................................25

Tabla N° 2. Ejemplo de enfermedades y posibles terapias antioxidantes

97

.......29Tabla N° 3. Riesgo y normalidad de lípidos plasmáticos125 ................................40

Tabla N° 4. Pronóstico según valores de HDL125 ...............................................40

Tabla N° 5. Volúmenes de filtrado del extracto de Porphyra columbina .............49

Tabla N° 6. Medición de sulfato ..........................................................................54

Tabla N° 7. Volúmenes de reactivos para curva de Calibración AST y ALT .....63

Tabla N° 8. Procedimiento de curva de Calibración para ALT y AST .................64

Tabla N° 9. Determinación de AST y ALT ..........................................................64

Tabla N° 10. Determinación de superóxido dismutasa (SOD)............................66

Tabla N° 11. Determinación de catalasa (CAT) ..................................................67

Tabla N° 12. Determinación de glutatión peroxidasa (GPx) ...............................69

Tabla N° 13. Determinación de Malondialdehído (MDA) ....................................70

Tabla N° 14. Curva de calibración de proteínas .................................................71

Tabla N° 15. Tratamientos y extracción de sangre en conejos ..........................74

Tabla N° 16. Determinación de colesterol total en suero ....................................75

Tabla N° 17. Determinación de triacilgliceroles en suero ...................................76

Tabla N° 18. Determinación de HDL en suero ....................................................78

Tabla N° 19. Curva de calibración de sulfatos ....................................................80

Tabla N° 20. Medias de los pesos de ratones. Toxicidad aguda oral .................86

Tabla N° 21. Medias de los pesos de ratones para TODR .................................87

Tabla N° 22. Curva de calibración de AST .........................................................88

Tabla N° 23. Curva de calibración de ALT .........................................................90

Tabla N° 24. Estadística descriptiva de los marcadores de daño hepático en

ratones ..........................................................................................91

Tabla N° 25. Curva de Calibración de SOD .......................................................91

Tabla N° 26. Valores medios de las enzimas antioxidantes y MDA ...................92

Tabla N° 27. Curva de calibración de Proteínas .................................................95

Tabla N° 28. Medias de peso de conejos ...........................................................98

Tabla N° 29. Estadística descriptiva de la evolución de los marcadores lipídicos

………………en conejos ...................................................................................101


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RESUMEN

El objetivo principal de esta tesis es la elucidación estructural del polisacárido

del alga roja marina Porphyra columbina , extraído en agua caliente, purificado y

liofilizado, y el estudio de su actividad antioxidante en ratones e hipolipemiante

en conejos. Previamente se evaluó la toxicidad aguda oral y toxicidad oral a

dosis repetidas considerando que el material biológico sería expuesto a

diferentes concentraciones del mismo. El análisis del espectro FT-IR y RMN-1H

muestra que el polisacárido de P. columbina tiene una típica estructura de

porfirano: unidades β-D-galactosa, 4-O -α-L-galactosa-6-sulfato o 3,6-anhidro-α-

L-galactosa. Los estudios de toxicidad para el caso de toxicidad aguda oral

muestran ser no tóxico hasta concentraciones de 2000 mg/Kg, y para toxicidad

oral dosis repetidas de 28 días a 50 mg/Kg evidencia daño hepático. Las

pruebas in vivo en ratones midieron las actividades de las enzimas antioxidantes

superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx) así

como los niveles medios de malondialdehído (MDA). Los resultados muestran

incremento de las 3 enzimas evaluadas y disminución del MDA por

administración intraperitoneal dosis-dependiente del polisacárido. El efectohipolipemiante en conejos se determinó por evaluación del perfil lipídico:

medición de C, TG, HDL y cálculo de LDL y VLDL. Los resultados mostraron

disminución estadísticamente significativa, p < 0.05, tanto para los lípidos y

lipoproteínas en evaluación en las condiciones del diseño experimental

comparado con el grupo control de lipemia. El peso corporal de los conejos

mostró diferencias significativas, p < 0.05, para los grupos en tratamiento.

Palabras clave: Porphyra , porfirano, peroxidación lipídica, antioxidante,

hipolipemiante, lipoproteína.


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ABSTRACT

The main aim of this thesis is the structural elucidation of polysaccharide from the

red seaweed Porphyra columbina , hot water extracted, purified and lyophilized,

and the study of its antioxidant activity in mice and the lipid-lowering effect in

rabbits. Prior acute oral toxicity was evaluated considering the biological material

would be exposed to different concentrations of the same. The IR and 1H-NMR

spectrum shows that the polysaccharide of P. columbina has a typical

porphyran structure: β-D-galactose, 4-O -α-L-galactose-6-sulphate or 3,6-anhydro-

α-L-galactose units. The toxicity study for the case of acute oral toxicity

shown to be nontoxic up to 2000 mg/Kg strength, and for repeated dose 28-day

oral toxicity study to 50 mg/kg liver damage is evident. In vivo tests in mice

measured the activities of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD),

catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) as well as the mean levels of

malondialdehyde (MDA). The results show increase of the 3 enzymes tested also

decreased MDA by intraperitoneal administration dose-dependent polysaccharide.

Hypolipidemic effect in rabbits was determined by the evaluation of the lipid

profile: measurement of C, TG, HDL and LDL and VLDL was calculated. The

results were statistically significant, p < 0.05, for both lipids and lipoproteins in

assessment compared with control group of lipemia. Body weight of the rabbits

showed significant differences, p < 0.05, for the groups in treatment.

Keywords: Porphyra , porphyrano, lipid peroxidation, antioxidant, hypolipidemic,

lipoprotein.


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Facultad de Farmacia y Bioquímica – UNMSM

Tesis de Pregrado - Blanca Yessenia Aguilar Velasquez 1

I. INTRODUCCIÓN

Hace pocos años comenzamos a revalorar los productos naturales a nivel

mundial. La razón nace de querer cuidar la salud, corregir y prevenir

enfermedades, con sustancias que no tengan o reporten mínimos efectos

secundarios, más aún, con sustancias que puedan ser parte de la dieta de las

personas. Entonces pensamos en fuentes de recursos de un país biodiverso

como el Perú y podemos aspirar a encontrar recursos naturales que presenten

en su composición distintas moléculas bioactivas que reporten diferentes

beneficios para las personas que lo consumen, uno de estos recursos son las

algas marinas rojas del género Porphyra . Las algas son ricas en fibra,proteínas, minerales, vitaminas, antioxidantes y ácidos grasos poliinsaturados,

con bajo valor calórico1 que les confieren propiedades antioxidantes,

preventivas y terapéuticas contra enfermedades degenerativas,

hipolipemiantes, anticoagulantes y anticancerígenas, entre otras1,2.

Para poder brindar productos naturales y difundir conocimiento que la

población requiere para su mejor uso, es preciso analizar sus componentes

individuales y siendo los polisacáridos el principal componente de las algas

rojas3, he ahí la razón de su estudio en el presente trabajo; la determinación

por métodos químicos y espectroscópicos de sus características estructurales y

su correlación con una estructura típica de porfirano, polisacárido principal en el

género Porphyra , permitiría entender mejor sus características fisicoquímicas y

tener una idea más cercana de su posible mecanismo de acción en el

organismo humano4.

Dentro de las muchas propiedades que se le confieren a las algas marinas

rojas, y especialmente a las Porphyras , es la antioxidante, que evita la

oxidación de sustancias que puedan provocar alteraciones fisiológicas, de gran

interés ya que se le ha relacionado a la prevención de múltiples

enfermedades5. El uso de un diseño experimental in vivo con tetracloruro de

carbono que genera daño hepático y alteración de enzimas así como aumenta

la peroxidación lipídica, ampliamente usado para evaluar la capacidad


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antioxidante de diversas sustancias y entre estas polisacáridos de algas

marinas, resulta apropiado para tal fin6.

La capacidad hipolipemiante, es decir, la reducción de lípidos en sangre ayudaen el tratamiento de dislipidemias y obesidad, es de gran interés actual y futuro

ya que se ha visto un mayor aumento de personas obesas en los últimos años,

inclusive en poblaciones infantiles, teniendo como principal causa dietas

hiperlipídicas7. Variados diseños experimentales que emplean la vía oral y

cambios basados en la dieta hiperlipídica permiten establecer en el tiempo

reducciones o aumentos de lípidos en suero a través de la evaluación del perfil

lipídico y que para el caso de polisacáridos sulfatados de algas muestra

reducción de lípidos en modelos animales estableciéndose su efecto

hipolipemiante8,9. Por lo cual se esperaría que Porphyra columbina presente

capacidad hipolipemiante.

Aunque son muy escasos los estudios de toxicidad de algas, o de sus

polisacáridos sulfatados, estudios llevados a cabo han reportado cierta

toxicidad a determinadas concentraciones10. Por lo cual, es totalmente

justificado y necesario realizar ensayos de toxicidad previo al uso de diferentesdosis en las pruebas in vivo que permitan elegir las dosis que nos brinden

resultados fehacientes. La elección de los ensayos de toxicidad a realizar se

basa en elegir aquellos que permitan soportar los estudios in vivo posteriores a

realizarse siendo la toxicidad aguda oral y toxicidad oral dosis repetida en

ratones los idóneos para el presente trabajo.

Por tales motivos se ha considerado relevante la elucidación estructural del

polisacárido del alga Porphyra columbina y la determinación de sus capacidadantioxidante e hipolipemiante en un modelo in vivo .


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II. GENERALIDADES

2.1 Algas Marinas Rodofitas

Las algas marinas pueden clasificarse en tres grandes grupos basados en su

color: pardas, rojas y verdes denominando técnicamente a estos grupos

feofíceas, rodofíceas y clorofíceas, respectivamente. Las algas marinas rojas

suelen ser más pequeñas que las pardas, y por lo general su longitud varía de

unos pocos centímetros a un metro; las algas marinas rojas no siempre

presentan esta coloración: a veces son de color púrpura, e incluso de color rojo

pardusco, pero a pesar de ello se clasifican como rodofíceas debido a otrascaracterísticas significativas en su clasificación taxonómica. Las algas marinas

verdes son también pequeñas, y el margen de variación de sus dimensiones es

similar al de las algas marinas rojas3. Las algas marinas reciben también el

nombre de macroalgas1, para distinguirlas de las microalgas, de tamaño

microscópico, que suelen ser unicelulares y son conocidas sobre todo por las

algas de color azul verdoso.

El filo Rhodophyta correspondiente a las denominadas algas rojas, comprende

más de 6100 especies distintas de las cuales casi todas son algas marinas11.

Este filo es uno de los grupos más antiguos y abundantes entre los eucariotas,

se cree que son descendientes directos de un cianoma en las Glaucophytas

(asociación simbiótica entre un huésped y una cianobacteria intracelular), son

un linaje distinto de eucariota cuyos miembros están unidos en los análisis

filogenéticos de genes nucleares, de plastidios y mitocondriales, debido a la

amplitud y diversidad estructural que presentan son sujeto de nuevos estudiospara definir mejor los principales linajes abarcando mayor número de muestras

en cada estudio12 así mismo la caracterización, identificación o mutación de

una especie se hace actualmente evaluando el DNA que contiene13.

Una explicación de su abundancia viene del hecho que se encuentren en todas

las latitudes con marcada abundancia en regiones ecuatoriales aunque

existiendo pocas especies en regiones polares y subpolares donde hay mayor

presencia de algas pardas y verdes, su tamaño es mayor en áreas frías y


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templadas que en tropicales donde principalmente son pequeñas plantas

filamentosas (con excepción de las formas calcáreas), las algas rojas de agua

dulce en general no alcanzan tamaños tan grandes como en agua salada.

Sumado a lo anterior se adaptan mejor para vivir a grandes profundidades que

los miembros de otros grupos, alcanzan hasta 200 m de profundidad, habilidad

relacionada con los pigmentos accesorios a la fotosíntesis14.

Las algas rodofitas tienen las siguientes características químicas y celulares:

Características químicas14,15

1. Pigmentos fotosintéticos: clorofílas a y d (las Bangiophyceae no presentanclorofila d).

2. Ficobiliproteínas: ficoeritrina, ficocianina, xantofilas y α, b-caroteno.

3. Mucílagos: ficocoloides como el agar y las carrageninas.

Características celulares14,15

1. Ausencia de células flageladas.

2. Paredes con celulosa y cubiertas de mucílagos, a veces con deposiciones

de carbonato cálcico.

3. Cloroplasto rodeado de dos membranas, tilacoides no agrupados con

ficobilisomas.

4. Almidón de florídeas en el citoplasma.

5. Ausencia completa de centriolos en la división celular.

6. Células comunicadas por punteaduras.

7. Reproducción sexual por gametos inmóviles. Ciclos biológicos complejoscon tres generaciones diferentes.

Estas características las llegan a diferenciar respecto de otros filos de algas y

también plantear similitudes16 (Anexo I).


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2.1.1 El género Porphyra

La división Rhodophyta presenta la clase Bangiophyceae y ahí encontramos el

orden Bangiales, dentro de este a la familia Bangiaceae, y en esta al géneroPorphyra 17. Hay 268 especies (e infraespecíficas), de los cuales 60 han sido

señaladas como “actualmente aceptada taxonómicamente”11.

Porphyra es una de las algas rojas más antiguas que se conoce, se

encontraron fósiles que se asemejan cercanamente a este género que datan

de cerca de 570 millones de años atrás en la formación rocosa de Doushantuo,

caracterizado por ser uno de los yacimientos de fósiles más antiguos y mejor

preservados, en el sur de China18. Las especies del género Porphyra sonidentificadas, todavía, por características como son la forma, color y grosor de

las láminas, disposición de células reproductivas, tamaño y forma de células

vegetativas, sin embargo, y como se señaló anteriormente, cada vez se hace

más necesario el empleo de técnicas moleculares para caracterizar al

género13,17.

Debido a la gran importancia económica de las especies de Porphyra se tornó

interesante establecer un organismo modelo para estudios básicos y aplicativos

en la ciencia de las plantas, si a ello se suma que su genoma es pequeño (un

máximo de 5 cromosomas, reportado) y con un tiempo de generación corto (1-3

meses) son ideales para análisis genético17. En el 2013 con el título “Complete

mitochondrial genome of Pyropia yezoensis : reasserting the revision of genus”

se anunciaba el término de la secuenciación del genoma mitocondrial de la

también conocida Porphyra yezoensis o “Nori”, principal alga comercializada en

China. El mitogenoma constaba de una sola molécula circular de 41 688 bp, lacual es la más larga secuencia de alga roja registrada, los resultados del

análisis filogenético mostraron mayor cercanía a Pyropia haitanensis que a

Porphyra purpurea 19 corroborando la nueva clasificación que habían tenido las

dos primeras, así como otras algas consideradas hasta entonces dentro del

género Porphyra , en el año 2011 luego de un amplio estudio, se consideraron

157 especies de Bangiales, a través de los análisis combinados del gen rRNA

SSU y el gen del plástidio RUBISCO LSU (rbc L), se determinaron quincegéneros de bangiales incluyendo el género Pyropia .


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Porphyra está actualmente en constante estudio de sus especies para

establecer su correcta clasificación taxonómica, incluyendo las de importancia

económica, motivo de especial mención es el caso de Porphyra yezoensis y

Porphyra hateniensis que ahora se clasifican como Pyropia yezoensis y

Pyropia hateniensis 20. También ha habido cambios de especies de Porphyra a

los nuevos géneros Boreophyllum, Clymene, Fuscifolium, Lysithea, Miuraea 20.

2.1.2 Breve estudio botánico del alga Porphyra columbina

2.1.2.1 Taxonomía

El alga Porphyra columbina tiene la siguiente clasificación sistemática,

perteneciendo al reino plantae11.

División: Rhodophyta

Subdivisión: Eurhodophytina

Clase: Bangiophyceae

Subclase: Bangiophycidae

Orden: BangialesFamilia: Bangiaceae

Genero: Porphyra

Especie: Porphyra columbina Montagne

Nombre vulgar: “Cochayuyo”

2.1.2.2 Características físicas

Planta de talo laminar, agrupada o en roseta, lanceolada u oblonga lanceolada,

de color marrón clara u oscura, o marrón violáceo iridiscente a marrón rojizo

cuando están frescas mientras que secas el color se hace más intenso a

negruzco. Alcanzan hasta 35 cm de longitud y 9 cm de ancho, la porción basal

es generalmente cordada y está provista de un disco rizoidal coriáceo formado

por células vegetativas provistas de filamentos rizoidales no coloreados; con

margen entero, ondulado o crespado, contorneado notoriamente. Esta especie

es extremadamente variable en hábitat, presenta formas umbilicadas, divididas

http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=97240http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=92220http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=4362http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=4386http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=4572http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=5183http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=8384http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=5183http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=4572http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=4386http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=4362http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=92220http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=97240


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irregularmente o en roseta, constituidas por láminas lanceoladas si viven en

lugares expuestas al oleaje. El espesor de la lámina también es variable, de

delicados a otros más consistentes21.

Figura N° 1. Forma macroscópica de Porphyra columbina Montagne21.

2.1.2.3 Ciclo de vida

Presenta un ciclo de vida bifásico. La etapa o estadio que se conoce como

“cochayuyo”, estadio macroscópico, comprende los talos de la especie. Sus

semillas se conocen como conchosporas y son liberadas en la etapa

conchocelis filamentosa, las cuales se encuentran adosadas a las conchas de

moluscos o zonas rocosas durante el verano y el otoño22. Antes de 1949, se

creía que la fase filamentosa era una especie distinta, Conchocelis rosea 23.


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Figura N° 2. Ciclo de vida de Porphyra columbina 24: 1. talo; 2. espermagonio;

3. espermatida; 4. carpogonio; 5. huevo fertilizado; 6. carposporangio; 7. carpospora;

8. conchocelis filamentosa; 9. rama de esporangio de conchocelis; 10. Liberación de

conchosporas; 11. conchospora; 12. talo joven.

En condiciones específicas de baja intensidad y calidad de luz, la duración del

día y la temperatura estimulan la producción de gametos24.

Los gametos macho, espermatida, se producen en paquetes, espermagonio,

en los márgenes de las cuchillas y se liberan por disolución del margen. Los

gametos femeninos, carpogonia, se forman a cierta distancia del margen22,23.

Una superficie receptiva ("tricógino") sobresale de cada carpogonio y a través

de la matriz que la rodea y a la cual se adhiere la espermátida para efectuar la

fertilización dando lugar al huevo fertilizado. El cigoto se divide para formar un

paquete de células diploides (carposporangio). Las carposporas diploides se

liberan del carposporangio por disolución del margen de la cuchilla. La

germinación de las carposporas, para formar filamentos conchocelis diploides,


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no depende de la presencia de una base para fijarse como carbonato de calcio

sólido aunque su sobrevivencia se ve mediada muchas veces por este factor22.

Los filamentos conchocelis se desarrollan y forman ramas hinchadas(conchosporangia) en las cuales las células desarrollan las características

plástidas estrelladas con pirenoide notorio. Los filamentos conchocelis

hinchados se fijan en el sustrato y eventualmente liberan su contenido como

células individuales (conchosporas). Estas conchosporas comenzaran un

nuevo ciclo de vida23. Las condiciones óptimas, tales como temperatura,

salinidad y baja intensidad de luz, para el crecimiento de talos de Porphyra ,

varían. En general, los talos jóvenes pueden resistir temperaturas más altas

que los adultos23 (Figura N° 2).

2.1.2.4 Hábitat

Vive preferentemente sobre sustrato rocoso, expuesta en la zona de las

mareas, formando asociaciones con Ulva fasciata forma costata y

Enteromorpha intestitnalis . Ocasionalmente viven epífitas sobre Gymnogongrus

furcellatus , Ahnfeltia durvillcrei y Prionitis decipiens . En la costa central (Ancón,Barranco, Pucusana) comparte el mismos hábitat con Porphyra

pseudolanceolata . Frecuentemente en los meses de setiembre a enero21.

2.1.2.5 Distribución mundial

A nivel mundial Porphyra columbina se encuentra en los mares de los

siguientes países21:

1. Sur América: Argentina, Chile, Perú.

2. Australia y Nueva Zelanda: Nueva Gales del Sur, Nueva Zelanda,

Queensland, Australia del Sur, Tasmania, Victoria.

3. Antártica y las islas subantárticas: Antártica / Islas subantárticas, Isla

Macquarie.


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2.1.2.6 Distribución en el Perú

Según la bibliografía Porphyra columbina se encuentra en los siguientes puntos

del litoral peruano21

:

1. Arequipa: Mollendo, Ático.

2. Ica: Isla Sta. Rosa, Lagunilla, Islas Chincha.

3. Lima: Entre Asia y Mala, Pucusana, La Herradura, Barranco, Islas

Pescadores, Chancay.

4. La Libertad: Punta Negra, Cerro Prieto.

5. Piura: Paita, Talara.

2.1.3 Galactanos sulfatados

El componente mayoritario de las algas rojas son los galactanos sulfatados y

debido a su importancia industrial a gran escala la mayoría de los estudios en

estas algas están dirigidos a determinar su estructura24. Ciertamente se tiene

una serie de características diferenciales de estos galactanos, como lo es su

cadena lineal, sus uniones glicosídicas, la configuración D- para carragenano yL- para los derivados del agar como lo es el porfirano, el cual se suele

mencionar como D-L- híbrido; sin embargo, no se sabe a ciencia cierta si solo

se trata de una mezcla de una serie de sustituciones de derivados

enmascarando a la cadena lineal o si es una molécula polimérica que contiene

ambas configuraciones y por ello es un híbrido24. Se pueden clasificar como:

1. Polisacáridos del Grupo Agar: siendo su representante principal, el

polisacárido neutro agarosa.2. Polisacáridos del Grupo Carragenano: representados por sus varios tipos

de carragenanas.

3. DL-Híbridos: Rompe las reglas establecidas para diferenciar carragenanos,

a ello se suma que se suele encontrar L-galactosa en algas que tienen

como principal componente carragenanas, la mayor proporción evidenciada

fue 1:0.5 para carragenanas.


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2.1.3.1 Porfiranos

2.1.3.1.1 Características estructurales

El galactano sulfatado de tipo porfirano está presente como el componente

principal en las especies de Porphyra y es obtenido en cantidades copiosas por

extracción en agua caliente de las algas de este género25. Esto se comprende

si se toma en consideración que la región intercelular y de la pared celular,

xilosa y manano solubles en agua caliente, son los principales componentes de

Porphyra 26.

Nunn y col.25

informaron de la separación de D- y L- galactosa así como lapresencia de 6-O-metil-D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y un sulfato de

hidrógeno en la proporción 1:1:2:1 a partir del polisacárido de P. capensis , la

D- y L- galactosa obtenido del polisacárido fue el primer registro de separación

por cristalización de un par de enantiómeros en la serie de azúcares así mismo

fue el primer registro de 6-O-metil-D-galactosa en la revista Nature. Por esos

años, alrededor de 1957, a pesar de su gran importancia como alimento,

conferida por su alto contenido de proteínas, había escasas investigaciones de

las algas rojas del tipo Porphyra en cuanto a sus polisacáridos.

En 1961 el porfirano de P. umbilicalis fue usado para el estudio de L-galactosa-

6-sulfato, determinándose que dicho éster es lábil en medio alcalino dando 3,6-

anhidrogalactosa26.

Si se consideraban los residuos que presentaba se podría decir que el

polisacárido presenta una estructura compleja y no simples unidades repetidas,

para comprobar ello Rees y col.27 emplearon 40 muestras de Porphyra de 6

especies, a las cuales les añadieron el análisis por variación estacional y

ambiental; los resultados demostraron que expresando las proporciones en

concentraciones molares la suma de 3,6-anhidro-L-galactosa y L-galactosa-6-

sulfato, como contenido de L-galactosa, resultaba constante en las muestras

por lo que se sugirió que eran intercambiables entre polisacáridos, el aumento

de uno es la disminución del otro, a lo que se sumaba la hipótesis que

señalaba a la L-galactosa-6-sulfato precursor biológico del 3,6-anhidro-L-


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galactosa y que implicaría a su vez la existencia de una enzima que podría

convertir el sulfato en el anhidro L-galactosa.

De igual forma ocurría entre el 6-O-metil-D-galactosa y la D-galactosa,apoyándose a su vez en estudios anteriores basados en hidrólisis parcial ácida;

estos estudios sugerían que el porfirano es una cadena de unidades alternadas

(1,3)-β-D-galactosa y (1,4)-α-L-galactosa, algunas de las unidades D-galactosa

siendo 6-O-metiladas y de las unidades L-galactosa como 6-sulfato o anhidro28.

A esto se suma estudios posteriores de los enlaces glicosídicos, partiendo de

L-galactosa-6-sulfato que por eliminación alcalina fue convertida en

3,6-anhidrogalactosa y luego metilada. La hidrólisis y posterior cromatografía

gas - líquido (GLC) mostró solo la presencia de dos productos metilgalactosa

(2, 4, 6-tri-O -metilgalactosa y 3,6-anhidro-2-O -metilgalactosa) que por sus

concentraciones pueden ser visualizados en cromatografía en papel y GLC,

considerando estos resultados la posibilidad de una estructura ramificada

quedaba desterrada. Se realizaron también estudios confirmatorios de enlaces

β de derivados de tetrametilagarobiosa por resonancia magnética nuclear de

hidrógeno (RMN-1H), basándose en la regla general que en el espectro deglicósidos y glicósidos metilados la señal del protón anomérico aparece primero

antes que cualquier otro28.

Figura N° 3. Dímero metilado derivado de la hidrólisis del porfirano metilado28.

Otro gran aporte de Rees y col27 fue señalar que el polisacárido extraído por

agua caliente de los miembros del género Porphyra tiene una cantidad

aproximadamente igual de D- y L- galactosa que lo derivados obtenidos enprocesos de purificación por lo cual en los procesos de extracción actual de


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porfirano el polisacárido obtenido por este método es el estudiado30. Más

palpable aun es el caso de Porphyra pseudolanceolata Krish, extraída del mar

peruano, en el cual el polisacárido total, obtenido por extracción en agua

caliente y purificado con etanol, y las fracciones obtenidas de este por hidrólisis

mostraron propiedades cromatográficas similares restringiéndose el estudio al

análisis del polisacárido total31.

Diversos textos de esa época a la actualidad afirman lo anteriormente expuesto

añadiendo información de las diferentes Porphyras y enfatizando la diversidad

de contenido de las unidades de azúcares presentes en los porfiranos como el

caso de P. umbilicalis que rindió manano en extracción con hidróxido de sodio26

o P. tenera del que se reporta se aislaron glucosa, pentosa y metilpentosa24.

También se sumaron nuevos métodos como la degradación enzimática del

porfirano de Porphyra umbilicalis por una β-agarasa I, altamente purificada, de

Pseudomonas atlántica. Esta enzima rompe el sitio de reducción de unidades

β-neoagarobiosa. Después de separación por diálisis de las moléculas de

mayor y menor peso y ser separados por intercambio catiónico, la filtración de

gel de los oligosacáridos aniónicos reveló dos nuevos tetrasacáridosmonosulfatados que al ser leídos en espectroscopia de RMN-13C permitía

determinar en contenido de sulfato del porfirano32.

La mayoría de estudios actuales centran su atención en determinar las

características estructurales de las fracciones del polisacárido, ya sean

fracciones nativas o modificadas reportando en todos los casos su contenido

de sulfato ya que al relacionarlo con actividades biológicas siempre es un

parámetro de consideración, así como el contenido de 3,6-anhidrogalactosa y

los monosacáridos presentes con el fin de establecer, si los datos así lo

permiten, relaciones entre la composición y la actividad en ensayo33.


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Figura N° 4. Estructuras de porfiranos comparados con los polisacáridos

del grupo agar24.

2.1.4. Actividad biológica de las algas marinas

Los polisacáridos sulfatados de las algas marinas han demostrado en años

recientes una amplia variedad de actividades biológicas. Su interés y estudio,

por lo tanto, tiene una directriz de crecimiento exponencial. Algunas de las

actividades biológicas conferidas a las algas y soportadas por estudios

científicos son las siguientes1,2,34:

Antioxidantes (in vitro e in vivo ); preventivas y terapéuticas contra

enfermedades degenerativas; potencial prevensor y terapia para el síndrome

metabólico: obesidad, dislipidemia, diabetes, hipertensión; anticoagulante;

anticancerígeno; antialérgico, antiinflamatorio e inmunomodulador; modulador

endocrino; fitoestrogénico; protección y regeneración de órganos y tejidos;


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macronutrientes e ingrediente alimentario funcional (contiene carbohidratos,

proteínas y lípidos).

El entendimiento de la relación estructura – actividad, por otro lado, se vemenguada debido a las dificultades que presenta la identificación de la

estructura química, uno de los enfoques de investigación para establecer esta

relación se basa en obtener información de estudios de polisacáridos

sulfatados, especialmente el tipo del grupo éster sulfato que se ha reportado

influye en su comportamiento biológico y farmacológico, de invertebrados los

cuales tienen una estructura regular y son más fáciles de estudiar34.

2.1.4.1 Actividad biológica del porfirano

Las Bangiales, especialmente las Porphyras , consideradas un importante

alimento desde la antigüedad por su alto contenido de proteínas, han sido

estudiadas posteriormente por su contenido de polisacárido sulfatado siendo

estos últimos los componentes más abundantes en sendas Porphyras 35.

El polisacárido del alga roja Porphyra yezoensis , una de las algas, sino el alga

más estudiada del género, tiene múltiples funciones biológicas, como

anticoagulante, antisenescente, antifatigante, anticancerígeno36 así como un

posible efecto sobre la proliferación de linfocitos, modulación inmune, y células

de Sertoli37. Las propiedades antioxidante in vivo y más aún in vitro han sido

estudiadas para sendas algas del género Porphyra , como el caso de

P. haitanensis que exhibe in vitro mejor capacidad de barrido de radicales

superóxido e hidroxilo y que posteriormente podrían ser utilizados en la

industria alimentaria y farmacéutica38. El porfirano reporta una gama deactividades que brevemente se pueden citar como sigue:

a) Efecto antialérgico: efectivo contra la hipersensibilidad inducida por

2, 4, 5-trinitrobenzeno por supresión de niveles séricos de IgE y IFN-ϒ 39.

b) Actividad inmunomoduladora: eleva la respuesta de los anticuerpos

primarios (IgM) y estimula los macrófagos39,40.

c) Anticoagulante: se conoce su acción anticoagulante, sin embargo

recientemente su interés va en la reducción de lípidos del suero y


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prevención de trombosis. Se estudian, por ejemplo, suplementos de

mezclas de algas con este fin41.

d) Actividad antioxidante y antisenecente: incrementa la actividad de las

enzimas antioxidantes glutatión peroxidasa y superóxido dismutasa, las

que actúan con vital importancia en la peroxidación lipídica previniendo

el daño celular42,43.

e) Actividad antihiperlipídica, hipocolesterolémica, hipoglicemiante e

hipotensora44.

f) Agente hepatoprotector: evidenciado contra el daño causado por

tetracloruro de carbono en ratones. Su mecanismo se relaciona al

barrido de radicales libres ensayado in vitro y al incremento de enzimasantioxidantes in vivo 42.

g) Actividad anticancerígena: relacionada, posiblemente, con su contenido

de éster sulfato ya que el grado de sus propiedades polianiónicas es el

que determina su actividad45.

2.1.5 Usos y forma de consumo actual de Porphyra

Indudablemente si se tuviera que mencionar solo un uso de las Porphyras este

sería su empleo como alimento. Es conocido como parte de la dieta desde la

antigüedad en los países orientales y, cada vez por más motivos, parte de la

dieta actual de los mismos; sin embargo, en el mundo esto depende del país y

continente al que nos refiramos y por ende la cultura alimentaria.

Centrándonos en Sudamérica y en Porphyra columbina, ésta se consume en

Perú, Chile y Argentina

de los cuales Argentina en el 2002 ya tenía la iniciativade preparar alimentos a partir del alga que formen parte de su dieta a nivel

nacional; en tanto en Perú había poca exportación de algas46, mientras que su

forma de consumo es en preparados principalmente en los departamentos de

Cusco y Arequipa, la famosa “Timpuscca” de Arequipa tiene entre uno de sus

16 variados ingredientes al cochayuyo, nombre común del alga, y su consumo

fue publicitado en el 2010 por el Instituto Nacional de Salud (INS) como parte

de una campaña de nutrición infantil47. Así mismo Chile también busca nuevas

formas de poder agregarlo a la dieta de la población invirtiendo en


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investigaciones para dicho fin48 y actualmente exporta para varios países

puesto que los sudamericanos no tenemos predisposición por este tipo de

alimento en nuestra dieta, cabe destacar que Porphyra columbina es

considerada de sabor agradable respecto de otras algas.

La presencia de yodo y alginato es menor al encontrado en las algas pardas

por lo cual estas últimas se emplean en industria cosmética49 o en la industria

farmacéutica46. Hay, por otro lado, el uso folklórico de Porphyra en la medicina

tradicional china donde se emplea hasta hoy para disolver la flema, disipar el

calor y favorecer la diuresis50.

2.1.6 Perspectivas Futuras

En definitiva los estudios estructurales del polisacárido sulfatado de Porphyra ,

el porfirano, y sus derivados continuará pues su complejidad y diversidad hace

difícil un consenso general con la información actual además del enorme

interés en determinar sus mecanismos de acción en modelos in vivo ya que

reportan una gran variedad de actividades farmacológicas por alga estudiada34

e in vitro , más aun de derivados del polisacárido que pueden tener una granutilidad en la industria alimentaria1,38.

Así mismo se puede prever el uso de técnicas modernas y altamente

específicas en su estudio como lo ha sido el empleo de la degradación

ultrasónica para porfirano51 o la determinación de una especie por técnicas

moleculares20 pues se entiende que entre la técnica sea más específica y

sensible los resultados serán más fiables.

Una de las mayores preocupaciones futuras sería el alto peso molecular del

polisacárido que daría lugar a una baja biodispoibilidad52. En el Perú la

búsqueda de vías de industrialización de las especies de algas disponibles en

la naturaleza de forma rentable es un tema de gran interés pues hasta la

actualidad no hay una verdadera industria de algas a pesar de ser un país con

gran variedad de las mismas, aunque de volúmenes pequeños para una escala

industrial, y con aportes de investigaciones de distintas especies por parte de

universidades y centros de investigación.


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2.2 Capacidad Antioxidante

2.2.1 Radicales libres

Se considera como radical libre a cualquier átomo, molécula o fragmento

molecular que en su estructura presenta uno o más electrones desapareados

en el orbital más externo, esta configuración lo hace muy inestable53,54, es por

ello que tienden a atraer hacia sí un electrón de moléculas estables con la

finalidad de alcanzar su propia estabilidad electroquímica55. En contraste, la

vida media biológica del radical libre es de microsegundos debido a la gran

capacidad de reacción con cualquier sustancia que se encuentre a su

alrededor55 y partiendo de este punto, el hecho de que el radical libre seestabilice al captar o ceder electrones convirtiendo a las moléculas con las que

interacciona en un nuevo radical, explica las reacciones en cadena que se

producen en los sistemas biológicos los cuales solo se detienen al reaccionar

dos radicales libres entre sí56.

Los radicales libres derivan de tres elementos atómicos: oxígeno, nitrógeno y

azufre, creando así las especies reactivas del oxígeno (ROS), del nitrógeno

(RNS) y del azufre (RSS). Los ROS incluyen al anión superóxido (O2-˙), radical

hidroperoxilo (HO2˙), el radical hidroxilo (˙OH), el óxido nítrico (NO), y otras

especies como el peróxido de hidrógeno (H2O2), oxígeno singlete (1O2), ácido

hipocloroso (HOCl) y el peroxinitrito (ONOO-). Los RNS derivan de NO al

reaccionar con O2-˙, y forman ONOO-; los RSS se forman fácilmente por la

reacción de ROS con tioles57; de ahí que los radicales libres de mayor

importancia sean los ROSs.

2.2.1.1 Mecanismos de generación de radicales libres

El mecanismo principal por el que se originan los radicales libres en los

organismos vivos es por la adición de un electrón a una molécula estable,

siendo la fuente más importante las reacciones de óxido-reducción univalente

en la que está presente el oxígeno58.

La formación de ROS se da por disociación del hidroperóxido a pH 7.4 paraformar anión superóxido (O2

-˙), este anión es extremadamente reactivo y puede


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interaccionar con un número de moléculas para generar ROS ya sea

directamente o a través de procesos catalizados por metales. El anión

superóxido puede también ser detoxificado a peróxido de hidrógeno a través de

una reacción de dismutación con la enzima superóxido dismutasa (SOD) (a

través de la reacción de Haber-Weiss) y finalmente a agua por la enzima

catalasa (CAT). Si el peróxido de hidrógeno reacciona con el hierro catalizado

como Fe2+, da lugar a la reacción de Fenton formando el radical hidroxilo

(OH˙)59.

Figura N° 5. Generación de ROSs60: Las flechas azules representan la

reacción de Haber-Weiss y las flechas rojas la reacción de Fenton.

Como se aprecia en la figura N° 5, la generación de superóxido da lugar a otras

especies reactivas por lo que mencionamos algunas fuentes generadoras de

radicales61:

Cadena transportadora de electrones en la mitocondria, hay donación deelectrones al oxígeno generando radicales libres.

Acción enzimática de la xantina oxidasa.

La autooxidación de la hemoglobina, el grupo HEM unido a Fe+2 por captación

de oxígeno se oxida a Fe+3 y produce radical superóxido.


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La reacción de ROS con tioles forma disulfito que en oxidaciones posteriores

puede resultar, si reaccionan con un tiol reductor, en formación de ácido

sulfénico, un RSS62.

2.2.1.2 Daños producidos por los ROSs

La mayor parte del oxígeno captado por las células de nuestro cuerpo es

convertido en agua durante la respiración mitocondrial, sin embargo menos del

5% es convertido en ROSs. Estas sustancias son altamente tóxicas. Si se les

permite su acumulación pueden llegar a destruir todas las macromoléculas de

las células como son los lípidos, proteínas, mitocondrias y DNA nuclear. El

estrés oxidativo, producto del desbalance entre la producción de ROSs y la

capacidad de los sistemas biológicos de detoxificar las especies intermediarias

o el daño producido, y la posterior muerte celular, daño de tejido, se produce

en mitocondrias disfuncionales que generan ROSs de forma excesiva dando

lugar a una serie de patologías63.

Figura N° 6. Patogénesis del tejido dañado63.

Los lípidos son el principal objetivo para las reacciones de los radicales libres 63

y las proteínas son las más susceptibles de degradación por ROSs ya que

estos dañan el ADN causando variadas modificaciones de las bases orgánicas

de los nucleótidos con consecuencias fatales para la célula64.


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Figura N° 7. Objetivos de los ROSs60. Se indican las principales moléculas con

las que los radicales libres actúan y las alteraciones que produce.

2.2.2 Peroxidación lipídica

La peroxidación lipídica es el proceso de oxidación de los lípidos por radicales

libres65, el cual tiene una etapa de iniciación, propagación y terminación66. La

peroxidación lipídica en membranas biológicas ha sido considerada como uno

de los mayores mecanismos de injuria celular en organismos aeróbicos sujetos

a estrés oxidativo67.

Esta consideración se da debido a que los ácidos grasos poliinsaturados

(PUFAs - polyunsaturated fatty acids) son especialmente susceptibles a la

peroxidación porque poseen tres o más uniones carbono-carbono con dobleligadura, que le confiere una zona de enlace lábil que permite que un radical

libre (R˙) como el OH- le sustraiga un átomo de hidrógeno. El radical lipídico

(L˙) formado sufre un reordenamiento molecular y en presencia de oxígenomolecular da lugar al radical peroxilo (LOO -). El radical peroxilo puede sustraer

un átomo de hidrógeno de otra molécula vecina (LH), esta puede ser otro ácido

graso insaturado, formándose así un hidroperóxido (LOOH) y un nuevo L˙,

entrando la peroxidación en la etapa de propagación la cual consta de una


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reacción en cadena o autocatalítica, esto quiere decir que una vez iniciada

continúa desarrollándose por sí misma67:

LH + R˙

L˙

+ RH L˙ + O2

LOO

-

LOO- + LH L˙ + LOOH

El grado de propagación de la reacción en cadena que se produce depende de

una serie de factores dentro de los cuales destacan la concentración de

oxígeno, composición de ácidos grasos, relación de lípido-proteína y presencia

de antioxidantes. Los hidroperóxidos son los productos primarios de la

lipoperoxidación y en condiciones fisiológicas son relativamente estables67. Los

grupos -OOH de los hidroperóxidos llevan a una distorsión del espacio

hidrofóbico y a una pérdida de la función biológica de las membranas68.

La peroxidación de lípidos sigue propagándose hasta que llega a la etapa de

terminación cuando dos hidroperóxidos reaccionan entre sí dando tetróxidos o

cuando son neutralizados por los antioxidantes. Los tetróxidos son inestables,al romperse generan aldehídos como el malondialdehído (MDA), el cual es el

principal producto indicador de la lipoperoxidación así como 4-hidroxinonenal

(4-HNE), siendo estos dos los aldehídos más abundantes68.

Figura N° 8. Proceso de la peroxidación lipídica66.


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Figura N° 9. Estructuras de 4-hidroxinonenal (A) y malondialdehído (B)68.

2.2.3 Mecanismos de defensa contra el daño oxidativo

En los seres humanos, los antioxidantes son las sustancias que nos protegen

contra el daño oxidativo; se clasifican en sistemas enzimáticos y no

enzimáticos69.

2.2.3.1 Antioxidante

Se considera como tal a “cualquier sustancia que elimina, previene o remueveel daño oxidativo para una molécula objetivo”70.

El antioxidante puede ser efectivo al inhibir las reacciones de oxidación de

radicales libres cuando inhibe la formación de radicales lipídicos libres; cuando

quelan metales; a través de sinergismo con otros antioxidantes; cuando actúan

como agentes reductores, los cuales convierten hidroperóxidos en compuestos

estables; como inhibidores de enzimas prooxidativas (lipooxigenasas) entre

otros71,72.

2.2.3.1.1 Sistemas antioxidantes

Los radicales libres cumplen una función importante en variados procesos

homeostáticos como lo es la destrucción de microorganismos por fagocitosis,

entre otras. Son las cantidades excesivas de estos, y no solo su presencia, las

que generan efectos tóxicos al haber daño celular73. La clasificación de los

antioxidantes se puede dar por su sitio de acción, intracelular o extracelular; por


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el modo en el que protegen, o según su mecanismo de acción, enzimáticos y

no enzimáticos, estando este último como la clasificación con mayor aceptación

y por ende la más empleada actualmente74.

2.2.3.1.2 Antioxidantes enzimáticos

2.2.3.1.2.1 Superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1)

La enzima superóxido dismutasa (SOD) es una metaloenzima regulada por la

concentración del sustrato sobre el cual actúa. Presenta isoformas: CuZn-SOD,

Mn-SOD y Fe-SOD. La Fe-SOD se encuentra generalmente en procariotas,

mientras que en las células eucariotas existen tres tipos de SOD, cuyalocalización es diferente: Mn-SOD es mitocondrial, CuZn-SOD es citosólica y

CuZn-SOD es extracelular75.

La función fisiológica de la SOD es catalizar la reacción de dismutación del

radical libre superóxido (O2˙) a peróxido de hidrógeno (H2O2), antes de que

reaccione con otras moléculas biológicas susceptibles, para esta reacción no

es necesaria la presencia de cosustrato. Así mismo, la enzima SOD es inhibida

por peróxido de hidrógeno76.

2.2.3.1.2.2 Catalasa (EC 1.11.1.6)

La catalasa (CAT) es una de las enzimas más ampliamente distribuidas en el

organismo y una de las más abundantes de la naturaleza. Su actividad varía

deacuerdo al tejido en el que se encuentra, resultando más elevada en el

hígado y los riñones77.

La CAT está involucrada en la destrucción del peróxido de hidrógeno generado

durante el metabolismo celular. Presenta dos funciones: la catalítica y la

peroxidativa. En la reacción catalítica, el donador es otra molécula de H2O2.

Está reacción sólo puede ser realizada por la enzima en su forma tetramérica

(1). En la reacción peroxidativa la enzima puede utilizar como donantes de


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hidrógeno al metanol, etanol, ácido fórmico, formol y formaldehido. Esta

reacción se puede realizar con monómeros, dímeros y tetrámeros (2)78.

2.2.3.1.2.3 Glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.9)

La glutatión peroxidasa (GPx) es el nombre general de una familia de enzimas

con actividad peroxidasa66. La GPx se define como una glicoproteína

tetramérica que tiene como cofactor al selenio. En las células animales se

encuentra en la matriz mitocondrial y en el citosol. Se han descrito isoformas de

GPx, que difieren tanto en su ubicación como en su especificidad hacia el

sustrato. La GPx fosfolípido hidroperóxido, tiene como función principal

proteger al organismo contra la peroxidación lipídica a nivel de membranas y

de las lipoproteínas de baja densidad79, reduce el H2O2 libre del agua en

presencia de glutatión (GSH) como agente reductor (a) y reduce los

hidroperóxidos lipídicos a sus correspondientes alcoholes (b)80.

Tabla N° 1. Antioxidantes enzimáticos

81

.


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2.2.3.1.3 Antioxidantes no enzimáticos

Son moléculas hidrofóbicas o hidrofílicas, presente en la dieta ingerida por los

seres vivos, sobre todo en las frutas y verduras. Tienen como principalescaracterísticas ser sustancias capaces de neutralizar un único radical libre por

molécula (cazadores estequiométricos), solo actúan a concentraciones

elevadas y tienen un papel secundario frente a los antioxidantes enzimáticos82.

En el organismo los antioxidantes no enzimáticos hidrofílicos se ubican

principalmente en el citosol, matriz mitocondrial, matriz nuclear y en fluidos

extracelulares; entre ellos están la glutatión, vitamina C, flavonoides,

polifenoles, etc.; mientras que los del tipo hidrofóbicos se encuentran asociadosa la membrana celular, entre ellos destacan la vitamina E83.

2.2.3.1.3.1 Glutatión

El GSH es un tripéptido, endógeno, de ácido glutámico, cisteína y glicina. Su

capacidad antioxidante se debe a la capacidad reductora del grupo tiólico del

resto de cisteína. Actúa como antioxidante en reacciones enzimáticas con la

GPx o en reacciones no enzimáticas. Protege de la oxidación a grupos –SH

esenciales de las proteínas, pudiendo también actuar sobre enzimas

inactivadas por oxidación de sus grupos –SH. En presencia de GPx reduce el

H2O2 a agua, dando lugar a su forma oxidada (GSSG) (C) por la formación de

un puente disulfuro entre dos de esas moléculas; gracias a la enzima glutatión

reductasa (GRx) es regenerado a su forma oxidada (D) en presencia de

NADP+61,84.


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2.2.3.1.3.2 Vitamina E

La vitamina E es liposoluble, presenta variadas isoformas de las cuales cuatro

son tocoferoles (α, β, ϒ y δ). El α-tocoferol es el más abundante y el δ-tocoferolel antioxidante más potente85.

La vitamina E es el único antioxidante principal rompedor de cadena

encontrado en el plasma, células rojas y tejido, permitiendo esto proteger la

integridad de las estructuras lipídicas, principalmente membranas; detiene la

peroxidación lipídica por donación de su hidrógeno fenólico a los radicales

peroxilo formando radicales tocoferoxilo que a pesar de ser también radicales,

no son reactivos y no pueden continuar la reacción de la cadena oxidativa86.

2.2.3.1.3.3 Vitamina C

También llamado L-ácido ascórbico es una sustancia hidrosoluble presente

principalmente en los alimentos. Se caracteriza por su capacidad para actuar

como un potente agente reductor aunque su función fisiológica aún no está

bien aclarada

87,88

. La vitamina C es capaz de reaccionar con los radicales libresde oxígeno: superóxido, hidroperóxidos y el radical hidroxilo; para formar

semidehidroascorbato, del cual se forma dehidroascorbato que es reducido

nuevamente a ascorbato por la dehidroascorbato reductasa (DARx), reacción

que requiere de glutatión reducido88.

2.2.3.1.3.4 Vitamina A

También llamado retinol es un carotenoide producido en el híg

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