• Mnoga genetska obolenja kažejo družinski vzorec dedovanja, ki

ni v skladu z nobenim načinom Mendlovega dedovanja

• incidence obolenja pri bližnjih sorodnikih so nižje (2 - 4%) kot

pri Mendlovih tipih dedovanja.

• poligenska obolenja kažejo večfaktorski način dedovanja -

genotip in okolje

prizadeti so tisti posamezniki, ki ležijo na “napačni strani”

porazdelitvene krivulje.

POLIGENSKA IN MULTIFAKTORSKA OBOLENJA

Genetic or environmental....?

U. Meyer, SBD meeting, Lipica, September 2005

Krivulje nagnjenosti sorodnikov vzorčnih obolelih primerov bodopomaknjene v desno, velikost odmika v desno pa bo proporcionalnabližini sorodstva s prizadetim posameznikom (vzorčni primer, index case).

Korelacija je statistično merilo stopnje asociacije nekegaspremenljivega fenomena, oziroma merilo stopnje podobnosti alirazmerij med dvema parametroma.

Sorodniki prve stopnje si delijo v povprečju 50% genov, zatopredvidevamo, da genetska korelacija med sorodniki prve stopnjeznaša 0.5.

sorodstveno razmerje

delež skupnih genov

prva stopnja starši

bratje in sestre

otroci

1/2

druga stopnja tete in strici

nečaki

staru starši

vnuki

polbrati, polsestre

1/4

tretja stopnja sestrične, bratranci

stari-stari starši

pravnuki

1/8

Poleg genetske komponente tudi komponeneta OKOLJA!

• Tveganje za ponovno pojavljanje obolenja prisorodnikih prve stopnje (npr. otroci in starši) jepribližno enaka kvadratnemu korenu incidence v celokupni populaciji.

I = 1/1000 ⇒ tveganje = √0.001 = 0.032 = 3.2%

• ocenimo lahko, kakšen delež vzroka za obolenjelahko pripišemo genetskim faktorjem

• Dednost (h2) je definirana kot delež fenotipskihvarianc določenega obolenja, ki je povzročen s seštevkom genetskih varianc

• varianca je kvadratni koren standardne deviacije.

• Čimvečja je vrednost h, večji je prispevekgenetskih faktorjev v primerjavi s faktorji okolja

DEDNOST (HERITABILITY)

Primerjamo pojavnost določenega polimorfizma pacientov s pojavnostjo istega polimorfizma v kontrolni skupini.Če sta pojavnosti statistično značilno različni, dobimi pozitivno ali negativno asociacijo.

Ena izmed najznačilnejših HLA asociacij je med ankylosing spondylitis (oblika kroničnega arrtritisa) alelom in alelom B27. Opazimo jo pri 90% pacientov in le 5% kontrol.

Moč (značilnost) HLA asociacije se kaže v razmerju med tveganjem za pojavnost bolezni pri osebkih z antigenom in tistimi, brez antigena.

To imenujamo relativno tveganje – koliko pogosteje je obolenje pri osebkih z določenim markerjem v primerjavi z osebki brez markerja.

Asociacija (povezava) z boleznijo

Ogromno poznanih HLA asociacij, težava je pravilna interpretacija.

Asociacije in identifikacija lokusa še ne pomeni, da smo določili bolezenski gen!

Le 1% vseh HLA B27 razvije ankylosing spondylitis, čeprav gre za eno najmočnejših asociacij.

Drugi genetski in okoljski dejavniki očitno vplivajo na pojav tega obolenja.

Mapiranje genov in analiza vezanega dedovanja

Mendlovi zakoni:

1. Zakon uniformnosti (enakosti).

2. Zakon segregacije (izločitve), (1865 – geni se ločijo med mejozo in se prenesejo v naslednjo generacijo kot neodvisne enote)

3. Zakon neodvisnega razvrščanja.

1. Zakon uniformnosti (enakosti). Če križamo dvahomozigota, ki imata različne alele, potem so vsi potomcigeneracije F1 enaki in heterozigotni. To pomeni, da se lastnosti ne križajo in da se lahko določena lastnost spetpojavi v eni prihodnjih generacij.

2. Zakon segregacije (izločitve). Vsak individuumvsebuje dva gena za določeno lastnost, vendar se ob pravilni mejozi le eden od njiju prenese v naslednjogeneracijo.

3. Zakon neodvisnega razvrščanja. Predstavnikirazličnih genskih parov segregirajo (se razporedijo) k potomcem neodvisno drug od drugega. Ta zakon ne držipopolnoma, saj se fizično bližnji geni dedujejo skupaj

Zakon uniformnosti Zakon segregacije

Disomije

disomija - dva enaka homologa enega

starša.

heterodisomija – dvarazlična homologa enega

starša.

SEGREGACIJSKA ANALIZAS to metodo določamo načine, po katerih se bolezen prenaša iz

generacije v generacijo.

Avtosomno dominantno dedovanje - primerjamo opaženo število

prizadetih potomcev, rojenih prizadetim staršem, z izračunanim

(predvidenim) številom prizadetih potomcev, če je penetranca

popolna.

Avtosomno recesivno dedovanje - segragacijska analiza je tu

dosti kompleksnejša- nepopolna (okrnjena) določitev zaradi

prezrtih nosilcev z zdravimi potomci Izračunana segregacija

izgleda višja kot je v resnici., npr. 0.43 namesto 0.25! Krvno

sorodstvo je dodatna indikacija, da gre za avtosomno recesivno

obolenje

GENOTIP - genetska sestava posameznika

FENOTIP - opazovano izražanje določenega gena (genov), posledicagenotipa in vpliva okolja

GENETSKI LOKUS - pozicija (lokacija, gen) na kromosomu.

ALEL - alternativna oblika gena (zaporedja DNA) na določenemgenetskem lokusu.

HOMOZIGOT - ima dva enaka alela na določenem genetskem lokusu.

HETEROZIGOT - ima različna alela na določenem genetskem lokusu.

POJMI ZA RAZUMEVANJE MENDLOVE GENETIKE I

SESTAVLJENI (ALELNI) HETEROZIGOT: heterogenost mutacij na bolezenskem lokusu (prizadeti osebki imajo vsaj dve različni mutaciji znotraj istega genskega lokusa;večina oseb z avtosomnimi recesivnimi obolenji so sestavljeni heterozigoti, razen če so starši v sorodu).

GENETSKA HETEROGENOST – HETEROGENOST LOKUSA: Ista bolezen se deduja na različne načine zaradi vključenosti različnih genov. Okvare različnih, med seboj neodvisnih genov, lahko pripeljejo do Istega bolezenskega fenotipa (genetsko pogojena gluhost - 16 neodvisnih lokusov!!)

HAPLOTIP: haploidni genotip. Sestava alela: opis markerskih lokusov znotraj alela, na enem kromosomu.

POJMI ZA RAZUMEVANJE MENDLOVE GENETIKE II

Genetsko vezanje (linkage)

Mendlov 3. zakon neodvisnega razvrščanja:

genski pari (aleli na različnih lokusih) razvrstijo po gametah neodvisnodrug od drugega.

Zakon VELJA za gene na različnih kromosomih ali na oddaljenihmestih istega kromosoma.

Zakon NE VELJA za fizično bližnje gene istega kromosoma -sintenične lokuse.

Lokusa NISTA VEZANA - sta na različnihkromosomih ali zelo oddaljena

na istem kromosomu

Lokusa STA VEZANA –sta blizu na istem kromosomu. Zanju 3. Mendlov zakon NE velja

Haplotip (haploidni genotip)– kombinacija alelov

na enem kromosomu

Dva lokusa se dedujetavezano, če sta tako blizuskupaj, da je majhnaverjetnost, da bosta ločenamed mejotsko rekombinacijo.

Aleli na vezanih lokusih so privlačni, tisti na nasprotnihhomolognih kromosomih pa odbijajoči.

rekombinacija ni rekombinacije

Vezano dedovanje

Faza vezanja (linkage phase) – razporeditev alelov pri vezanih lokusih na kromosomu (določitev položaja bolezenskega alela glede na polimorfni markerja na kromosomu).

Osebek II/2: Bolezenski alel in marker 1 se dedujeta skupajOsebek III/7 –rekombinacija med bolezenskim alelomin markerjem!!

?

Pred nami je rodovnik avtosomnega dominantnega obolenja. Družinske člane so mapirali na podlagi mikrosatelitnih markerjev.

1. Določite fazo vezanja (linkage phase) obolelega moškega generacije II !

bolezenski alel

Faza vezanja: bolezenski alel je na istem kromosomu kot markerski alel 1.

??

Če sta lokusa, ki definirata bolezen, blizu nekega polimorfnega lokusa, ki ga lahko sledimo, potem je možno predvideti, kdo od potomcev boprizadet z boleznijo, če sledimo dedovanje markerskega lokusa.

Verjetnost pravilnosti napovedi je odvisna od razdalje med markerskimin bolezenskim lokusom.

Rekombinacijska frakcija θ je merilo razdalje med dvema lokusoma, oziroma indikacija verjetnosti, da bo prišlo do križanja in rekombinacijemed lokusoma.

θ= 0.5 ⇒ lokusa se ne dedujeta vezano.

Zaradi naključnosti križanja in rekombinacije (crossing over) se nevezani lokusi dedujejo skupaj v 50% vseh mejoz.

2. Kaksna je rekombinacijska frakcija θ (frekvenca rekombinacije)na osnovi mejoz pri nastanku potomcev generacije III, za marker in za bolezenski lokus?

bolezenski alel

**

Predpostavka: če gre za vezano dedovanje, bi morali oboleti vsi otroci, ki so odočeta podedovali markerski alel 1.

Potomca III/5 in III/7 ne potrjujeta predpostavke, sta torej rekombinanta. 2 rekombinaciji v 8 mejozah.θ = 2 / 8 = 0.25.

Centimorgan (cM) je enota za merjenje genetske vezanosti. Če stadva lokusa oddaljena za 1 cM, bo do križanja z rekombinacijo prišlo le v 1/100 (1%) primerov ⇒ θ = 0.01.

Tudi: rekombinacijska razdalja, genetska razdalja, vezavna razdalja,

TO NI FIZIČNA RAZDALJA (bp) !!

Rekombinacijska velikost človeškega genoma je 3000 cM.

Fizična velikost haploidnega genoma pa cca 3 x 106 bp.

1 cM pri človeku odgovarja približno 1000 kb.

Vroče točke rekombinacije - krajše rekombinacijske razdalje.

Pri človeku pride le do enega ali dveh rekombinacijskih dogodkovmed parom homolognih kromosomov med mejozo I, in približno 40 rekombinacijskih dogodkov na mejozo v celotnem genomu.

Rekombinacijski dogodki so redki blizu centromere in pogosti natelomernih regijah kromosoma.

Mapiranje genskih lokusov s študijami dedovanja bolezniv velikih družinah ob uporabi polimorfnih markerjev.

Če se polimorfni marker deduje z obolenjem bolj pogostokot bi bilo pričakovati po verjetnostnem računu, to pomeni, da se deduje vezano z obolenjem.

ANALIZA VEZANEGA DEDOVANJA

Verjetje (angl. likelihood) – statistika, ki meri verjetnost dogodka v seriji dogodkov.

Vezava (angl. linkage) – opisuje dva lokusa, ki se nahajata dovolj blizu skupaj na istem kromosomu, da je njuna frekvenca rekombinacine manj kot 50%.

Vezavno razmerje, ravnotežje (angl. linkage equilibrium) – odsotnost prednostne povezave alelov na vezanem lokusu v populaciji.

Vezavno nesorazmerje, neravnotežje (angl. linkage disequilibrium) – Nenaključna “povezanost” (asociacija) dveh alelov na vezanem lokusu v populaciji

Razvrstitev LOD (angl. LOD score) - skupni logaritem razmerja verjetij vezanosti pri določeni rekombinacijski frakciji, v primerjavi z verjetjem, da je dogodek naključen (ni vezanosti)

Bayesov teorem – statistična procedura, kjer upoštevamo”osnovne” (predhodne in pogojne) verjetnosti in tako izboljšamo napovedno moč verjetnosti tveganja.

Ocena največjega verjetja (angl. maximum likelihood estimate)

Pojmi za razumevanje analize vezanega dedovanja

• Analiza vezanega dedovanja temelji na izračunavanju serijerazmerij verjetij (likelihood ratios, L) pri različnih vrednostihrekombinacijske frakcije θ.

• Verjetje je funkcija, podobna verjetnosti, je pa odvisna odrazdalje med dvema lokusoma.

LOD (Z); (LOD score); LOD - logarithm of the odds –logaritem “obeta”, desetiški logeritem verjetja. Logaritemskefunkcije so uporabljene zato, da je možno seštevati rezultate večihdružin.

log (A x B) = log (A) + log (B)

• LOD (θ) = log [Lθ/L(0.5)] ⇒ [Lθ/L(0.5)] = 10LOD(θ)

L(0.5) - nevezano dedovanje.

Izračun verjetnosti, da sta lokusa vezana

· Vrednost LOD primerja verjetja pridobljenih rezultatov, če sta dvalokusa zares povezana, z verjetji, da dobimo enake podatke ponaključju.

• LOD ≥ + 3 ⇒ lokusa STA vezana

(103-krat večja verjetnost, da sta lokusa vezana, kot da se naključno dedujeta skupaj)

• zaradi naključnosti križanja in rekombinacije (crossing over) se nevezani lokusi dedujejo skupaj v 50% (1/2) vseh mejoz:

osnovna verjetnost, da sta lokusa vezana je 1/50 (1/100 x 2)

• LOD ≤ -2 ⇒ lokusa NISTA vezana

(102-krat večja verjetnost, da se lokusa naključno dedujeta skupaj)

vrednost LOD +3 pri določeni θ:1000x-večja verjetnost, da sta lokusa vezana kot da se skupaj dedujeta naključno

Prvotna verjetnost, da sta katerakoli dva lokusa vezana je 1:50.

Če upoštevamo še prvotno verjetnost:

(1000 x 1/50) = 20Le 20-krat večja verjetnost, da sta lokusa vezana, kot da se skupaj dedujeta naključno

Bayesov teorem opisuje pomen upoštevana prvotne verjetnosti v verjetnostni teoriji.

•Vrednost LOD izračunamo preko širokega razpona vrednosti θ.

•Vrednost θ, ki daje največji pozitivni LOD rezultat je nejverjetneje rekombinacijska frakcija θ - metoda največjega verjetja (maximum likelihood method).

•LOD, ki ga podajamo, je maksimalni LOD izračunan pri θ.

1. Primer:

Pri rekombinacijski frakciji θ = 0.05 je vrednost LOD = 4. Kakšna je verjetnost, da sta bolezenski alel in markerskilokus vezana?

LOD (θ) = log [Lθ/L(0.5)]

[Lθ/L(0.5)] = 10LOD(θ) = 104

Verjetnost vezanosti je 104-krat večja od verjetnosti, dalokusa nista povezana.

Pred nami je rodovnik družine s Hungtingtonovo boleznijo (AD), ki ima dva dvoalelna markerja A in B. Kakšna je vrednost LOD za vezavo med vsakim Markerskim lokusom in bolezenskim genom, če predpostavimo, da je θ = 0.0

(θ = 0.0 - markerski gen je v lokusu bolezenskega gena, do rekombinacij ne pride).

Marker A: obolela mati II / 1 mora imeti alel 2 na istem kromosomu kot bolezenski gen.

Pri hipotezi θ = 0.0 bi morali vsi bolni otroci podedovati alel 2, vendar alle podeduje tudi zdrava deklica III / 5.

Verjetnost za (θ = 0.0) je torej nič, iz tega sledi, da je LOD neskončno.

A B

A B

A B

Marker A ni informativen

Marker B: obolela mati II / 1 mora imeti alel 1 na istem kromosomu kot bolezenski gen.

Vsi bolni otroci podedujejo alel 1. A B

A B

A B

LOD (θ) = log [L θ /L(0.5)]

LOD (θ) = log [0.0156/ 0.000244]

LOD (θ) = log (64)

LOD (θ) = 1.8

Če je θ = 0.0, obolela mati lahko prenese dva haplotipa: bolezenski alel skupaj z 1 in zdrav alel, skupaj z 2. Verjetnost za vsakega od teh dogodkov je ½.

Če gre za vezano dedovanje je verjetnost za 6 potomcev z markerskim genotipom:

L θ = (1/2) = 1/64 = 0.0156

Če ni vezanega dedovanja (θ = 0.5) se lahko prenesejo vsi 4 haplotipi, vsak z verjetnostjo ¼.

L(0.5)] = (1/4) = 1/4096 = 0.000244

6

6

Družina z rodovnikom AD obolenja je genotipizirana za 6 mikrosatelitnih polimorfizmov.

1. Kakšna je rekombinacijska frekvenca θ med markerskim in bolezenskim lokusom?

A B

Družina A – bolezenski alel je vezan s polimorfizmom 4Družina B – bolezenski alel je vezan s polimorfizmom 6

θ = 0

Če je θ = 0.0, obolela mati lahko prenese dva haplotipa: Verjetnost za vsakega od teh dogodkov je ½.

Če gre za vezano dedovanje je verjetnost za 6 potomcev z markerskim genotipom:

L θ = (1/2) = 1/64 = 0.0156

Če ni vezanega dedovanja (θ = 0.5) se lahko prenesejo vsi 4 haplotipi, vsak z verjetnostjo ¼. L(0.5)] = (1/4) = 1/4096 = 0.000244

LOD (θ) = log [0.0156/ 0.000244] = 1.8

Če je θ = 0.0, obolela mati lahko prenese dva haplotipa: Verjetnost za vsakega od teh dogodkov je ½.

Če gre za vezano dedovanje je verjetnost za 5 potomcev z markerskim genotipom:

L θ = (1/2) = 1/32 = 0.031

Če ni vezanega dedovanja (θ = 0.5) se lahko prenesejo vsi 4 haplotipi, vsak z verjetnostjo ¼.

L(0.5)] = (1/4)= 1/1024 = 0.00098

LOD (θ) = log [0.031/ 0.00098] = 1.5

6

2. Kakšna je vrednost LOD za vezavo med markerskim in bolezenskim lokusom, če predpostavimo, da je θ = 0?

A B

6

6

5

5

Interpretirajte sledeče vrednosti LOD in rekombinacijskih frakcij θ:

θ 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5LOD inf. 1.7 3.5 2.8 2.2 1.1 0

Maksimalno LOD je pri rekombinacijski frekvenci 0.01 (10%). Iz tega sklepamo, da sta lokusa najverjetneje vezana in sta narazen 10 cM.

103.5 = 3162 – krat večja verjetnost, da sta lokusa vezana, kot da nsita vezana

VEČTOČKOVNA VEZAVNA ANALIZA (MULTIPOINT LINKAGE ANALYSIS)

• - dvotočkovna analiza - grobo mapiranje bolezenskega lokusa na določeno regijo kromosoma,

• - večtočkovna analiza - fino mapiranje, definicija najmanjšega možnega intervala, kjer se nahaja bolezenski lokus.

•- Rezultati vezanega dedovanja različnih markerjev se obdelajo računalniško, izračuna se celokupno verjetje položaja bolezenskega lokusa glede na položaj uporabljenih polimorfnih markerjev. Rezultatse predstavi kot razmerje verjetij, oziroma vrednost lokacije (location score). Izriše se diagram, ki ponazori vrednost lokacije glede na razdaljo v mapi.

najverjetnejša lokacija bolezenskega lokusa

lokacija polimorfnih markerjev

Vezavno razmerje:

-študij večjega števila družin (populacija)pokaže, da ni preferenčne povezave med bolezenskim genom in specifičnim alelom na vezanem markerskem lokusu

Vezavno nesorazmerje:V populaciji opazimo preferenčno povezavo specifičnegamarkerskega alela in bolezenskega alela. Kromosomski haplotip, ki je sesatvljen iz bolezenskega in markerskegaalela se v populaciji pojavlja pogosteje, kot bi pričakovali.

Frekvenca alelov v populaciji:

Bolezenski alel I = 0.01Marker 1 I = 0.4Marker 2 I = 0.6

Če predpostavimo neodvisnost lokusov (vezavno ravnotežje)

Frekvenca za marker 1 in bolezenski alel:

I = 0.01 x 0.4 = 0.004 (teoretično)

V praksi ugotovimo, da je resnična frekvenca za ta haplotip (marker 1 in bolezenski alel)

I = 0.009

Neodvisnosti lokusov torej ni – vezavno nesorazmerje (neravnotežje)

VEZAVNO NESORAZMERJE (LINKAGE DISEQUILIBRIUM)

• Vezavno nesorazmerje je definirano kot povečana asociacija dvehalelov na vezanem lokusu kot bi pričakovali pri naključni vezanosti.

• V dani družini se bolezenski alel deduje vezano z markerjem B. Čeimata alela A in B enako pojavnost 0.5, potem se mora v 50% naključnoizbranih družin boleznski alel dedovati vezano z markerjem A.

V primeru, da se v večini družin bolezen deduje z markerjem B, gre zavezavno nesorazmerje.

• Vezavno nesorazmerje dokazuje, da se je bolezenska mutacijapojavila relativno pred kratkim in da je opazovani markerski lokus zeloblizu bolezenskega lokusa. Primeri vezavnega nesorazmerja so poznani pri celotnem HLA lokusu, pri anemiji srpastih celic, cističnifibrozi, lomljivem kromosomu X, Huntingtonovi bolezni, feniketonuriji..........

Vezavno nesorazmerje

ME2473.PP

3 to 10 million SNPs, ≈ 60.000 coding SNPs

efficacy

no efficacy

Predictability of efficacywith efficacy

without efficacy

Section of SNP genotype profile

Finding genes associated with diseases, drugefficacy and toxicity using linkage disequilibrium

U. Meyer, SBD meeting, Lipica, September 2005

1. Pri pravi multifaktorskih obolenjih je že teoretično nesprejemljivo, da bi alel na enem lokusu prispeval poglavitno. Težek razvoj pravilnih matematičnih strategij za detektiranje “vezanja” aditivnih poligenov,od katerih vsak doprinese delež k fenotipu.

2. Mnoga multifaktorska obolenja se pojavljajo v različnih starostih,težava pri ugotavljanju genetskega statusa sorodnikov.

3. Število “informativnih mejoz” pri družinah z multifaktorskimi obolenji je majhno, saj je malo živečih potomcev.

4. Mnoga kompleksna obolenja (shizofrenija, obolenja srca in ožilja) so Tudi etiološko heterogena in pri različnih posameznikih lahko vključujejoRazlične genetske in okoljske mehanizme.

Analiza vezanega dedovanja multufaktorialnih

Primerjamo pojavnost določenega polimorfizma pacientov s pojavnostjo istega polimorfizma v kontrolni skupini.Če sta pojavnosti statistično značilno različni, dobimi pozitivno ali negativno asociacijo.

Ena izmed najznačilnejših HLA asociacij je med ankylosing spondylitis (oblika kroničnega arrtritisa) alelom in alelom B27. Opazimo jo pri 90% pacientov in le 5% kontrol.

Moč (znčilnost) HLA asociacije se kaže v razmerju med tveganjem za pojavnost bolezni pri osebkih z antigenom in tistimi, brez antigena.

To imenujamo relativno tveganje – koliko pogosteje je obolenje pri osebkih z določenim markerjem v primerjavi z osebki brez markerja.

Asociacija (povezava) z boleznijo

Ogromno poznanih HLA asociacij, težava je pravilna interpretacija.

Asociacije in identifikacija lokusa še ne pomeni, da smo določili bolezenski gen!

Le 1% vseh HLA B27 razvije ankylosing spondylitis, čeprav gre za eno najmočnejših asociacij.

Drugi genetski in okoljski dejavniki očitno vplivajo na pojav tega obolenja.

DEALING WITH INDIVIDUAL RISK

U. Meyer, SBD meeting, Lipica, September 2005

U. Meyer, SBD meeting, Lipica, September 2005