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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES
Extractos etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus como
inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus
terreus causales de micosis en humanos.
Trabajo de titulación (Proyecto de investigación) previo a la obtención del Título de
Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales
Autor: Fiallos Barrionuevo Karen Mishelle
Tutor: Gamboa Trujillo Jhonathan Paúl, PhD.
Quito, 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo en calidad de autor y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación Extractos etanólicos de
Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus como inhibidores de crecimiento
in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus causales de micosis en
humanos, modalidad presencial , de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO
ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,
CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la Universidad Central
del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no
comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a mi favor
todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma
de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la
responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y
liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
__________________________
Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo
C.C.:1805385901
Dirección electrónica: kami_fiallos96 @hotmail.com
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo, en mi calidad de Tutora del Trabajo de
Titulación, presentado por Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo, para optar por el
Grado de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales; cuyo título es: Extractos
etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus como inhibidores de
crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus causales de
micosis en humanos, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos
suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del
tribunal examinador que se designe
En la ciudad de Quito a los 31 días del mes de mayo del año 2019
____________________
Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo, PhD.
DOCENTE-TUTOR
C.C.: 1715316780
iv
APROBACIÓN DEL INFORME FINAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Jessica Guarderas y Francisco Álvarez
Luego de Calificar el Informe Final de Investigación del trabajo de titulación
denominado: Extractos etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus
sanguineus como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis
y Aspergillus terreus causales de micosis en humanos, previo a la obtención del
título de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales presentado por la señorita
Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo.
Emite el siguiente veredicto: APROBADO
Fecha: 29 de Julio de 2019
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Vocal 1 Jessica Guarderas ___________ ____________
Vocal 2 Francisco Álvarez ____________ ____________
v
DEDICATORIA
El presente proyecto de investigación se lo dedico a Dios, por guiar mi camino y
ser fiel en todo momento; gracias a Él he aprendido a ser perseverante y
proseguir sin detenerme ante los problemas que se han presentado, sino más bien
mantenerme firme en mi meta, confiando en Dios y en su palabra: “Al que cree
todo le es posible”.
A mi familia, en especial a mis padres: Rosa Barrionuevo y Gonzalo Fiallos, por
siempre creer en mí, por brindarme su apoyo para el cumplimiento de todas mis
metas trazadas, por su amor incondicional y por ser los promotores de los
principios y valores que rigen mi vida. ¡Son los mejores, los amo! A mi
hermano: Diego Fiallos, por cuidarme y apoyarme en todo momento, y a mis
sobrinos: Johan y Gael Fiallos, por ser mi inspiración.
Con profundo agradecimiento, dedico también la presente, al equipo de trabajo
del Laboratorio de Micología Aplicada de la Universidad Central del Ecuador,
por su ayuda y motivación durante la realización del proyecto, y a todas las
personas que de alguna manera han contribuido en mi formación universitaria y
en la ejecución de la investigación.
vi
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Laboratorio de Micología Aplicada, por facilitarme las cepas fúngicas y
la prestación de las instalaciones. De manera especial al equipo de trabajo del
laboratorio por su apoyo técnico y moral.
A la Facultad de Ingeniería Química en especial al Ing. Pablo Londoño por
facilitarme el análisis químico de los extractos y toda la información referencia a
ellos.
Al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología, en especial al docente Max Bonilla
por su colaboración en la obtención de los extractos y concentraciones de estudio.
Al PhD. Paúl Gamboa, Director del Laboratorio de Micología Aplicada, por abrirme
las puertas del Laboratorio, y confiar en mi persona para la ejecución del proyecto de
investigación, además de su guía en calidad de tutor.
Finalmente, mi gratitud a todos los docentes quienes con su digna labor han guiado
mi formación académica
vii
LISTA DE TABLAS viii
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE ANEXOS x
RESUMEN xi
INTRODUCCIÓN
METODOLOGÍA
Diseño de estudio
Población y Muestra
Métodos
Preparación de cepas fúngicas patógenas
Prueba de rendimiento de los medios de cultivo
Preparación del material fúngico
Obtención de los extractos
Determinación de la biomasa disuelta y
rendimiento de los extractos
Identificación de compuestos químicos 11
Preparación de medios de cultivo experimentales 11
Ensayo de actividad anti fungica 11
Efecto fungicida o fungistático 13
Análisis estadístico 13
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
LITERATURA CITADA
ANEXOS
pág.
14
29
35
36
37
49
ÍNDICE GENERAL
9
9
10
10
10
1
9
9
9
9
viii
LISTA DE TABLAS
TABLA
1. Clasificación del extracto según el porcentaje de inhibición de crecimiento
2. Compuestos químicos identificados mediante cromatografía GC-MS
3. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de
Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de
Aspergillus terreus
4. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de
Ganoderma australe y Pycnoporus sobre el crecimiento de Scopulariopsis
brevicaulis
5. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de
Ganoderma australe sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y
Scopulariopsis brevicaulis
6. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de
Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y
Scopulariopsis brevicaulis
pág.
12
14
22
23
23
24
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA
1. Halos de crecimiento de Aspergillius terreus de acuerdo a la
concentración del extracto de Ganoderma australe
2. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción
del extracto de G. australe
3. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo
a la concentración del extracto de Ganoderma australe.
4. Media de los porcentajes de inhibición de S.brevicaulis frente a la
acción del extracto de G. australe
5. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo
a la concentración del extracto de Pycnoporus sanguineus
6. Media de los porcentajes de inhibición de S. brevicaulis frente a la
acción del extracto de P. sanguineus
7. Halos de crecimiento de Aspergillus terreus de acuerdo a la
concentración del extracto de Pycnoporus sanguineus
8. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción
del extracto de P. Sanguineus
9. Categorización del efecto del extracto de Ganoderma australe
sobre las cepas patógenas.
10. Categorización del efecto del extracto de Pycnoporus
sanguineus sobre las cepas patógenas.
pág.
15
16
17
18
18
19
20
21
25
27
x
LISTA DE ANEXOS
ANEXO
A. Fichas de descripción macroscópica y microscópica de los hongos
B. Composición de los medios de cultivo
C. Determinación de los compuestos químicos encontrados mediante
Cromatografía CM-GS.
C-1. Compuestos químicos detectados en el extracto de Ganoderma australe
C-2. Compuestos químicos detectados en el extracto de Pycnoporus sanguineus
D. Tabulación de datos
D-1. % de crecimiento e inhibición de crecimiento de las cepas fúngicas
D-2. Datos descriptivos
E. Análisis estadísticos
E-1. Prueba de normalidad
E-2. Prueba para muestras emparejadas
E-3. Prueba de ANOVA
pág.
49
53
54
54
63
77
77
79
81
81
82
86
xi
TÍTULO: Extractos etanólicos de Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus
como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus
terreus causales de micosis en humanos
Autora: Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo
Tutor: PhD. Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo
RESUMEN
Los hongos producen metabolitos secundarios con importante actividad
antimicrobiana, por lo cual, el presente trabajo pretende evaluar la efectividad de los
extractos etanólicos de G. australe y P. sanguineus como inhibidores de crecimiento
in vitro de S. brevicaulis y A.terreus causales de micosis en humanos. Utilizando la
técnica de dilución en caldo, se determinó que el extracto de P. sanguineus presento
mayor actividad antifungica contra S. brevicaulis y A. terreus, siendo esta última la
cepa más sensible al inhibirse a concentraciones incluso del 15 y 10%; sin embargo,
ambos extractos resultaron ser tóxicos para las cepas a partir de una concentración al
20% equivalente a 6,8mg/ml; dosis menores fueron ligeramente toxicas con efecto
fungistático, existiendo diferencias estadísticamente significativas entre los
porcentajes de inhibición generados y finalmente al 0,5% no hubo inhibición. Al
analizar químicamente los extractos, se encontraron compuestos esteroles, terpenos,
ésteres y ácidos grasos a los que se les atribuye su potencial antifúngico.
PALABRAS CLAVE: EXTRACTOS ETANÓLICOS / INHIBICIÓN DE
CRECIMIENTO / ACTIVIDAD ANTIFUNGICA / HONGOS PATÓGENOS / G.
australe y P. sanguineus.
xii
TITLE: Ethanolic extracts of Ganoderma australe and Pycnoporus sanguineus as
inhibitors of in vitro growth of Scopulariopsis brevicaulis and Aspergillus terreus
causes of mycosis in humans
Author: Karen Mishelle Fiallos Barrionuevo
Tutor: PhD. Jhonathan Paúl Gamboa Trujillo
ABSTRACT
The fungi produce secondary metabolites with important antimicrobial activity, by
which, this current work wants to evaluate the effectiveness of the ethanol extracts of
G. australe and P. sanguineus as inhibitors of in vitro growth of S. brevicaulis and
A.terreus, causes of mycosis in humans. Using the dilution technique in broth, it was
determined that the extract of P. sanguineus had greater antifungal activity against S.
brevicaulis and A. terreus. The latter being the most sensitive strain to be inhibited at
concentrations even of 15 and 10%. However, both extracts were found to be toxic
for the strains from a concentration of 20% equivalent to 6.8mg / ml. Similarly, lower
doses were slightly toxic with fungistatic effect, there being statistically significant
differences among the percentages of inhibition generated and finally at 0.5% there
was no inhibition. When analyzing the extracts chemically, sterols, terpenes, esters
and fatty acids where found, so an antifungal potential is attributed to them.
KEYWORDS: ETHANOLIC EXTRACTS / GROWTH INHIBITION /
ANTIFUNGAL ACTIVITY / PATHOGENIC FUNGI, G. australe / P. sanguineus.
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original
document in Spanish
______________________
Name: Veronica Gavilanes
Certified Translator: 1010-11-1090755
ID: 1804080693
1
INTRODUCCIÓN
Las micosis son enfermedades generadas por hongos que invaden tejidos provocando
variadas manifestaciones clínicas a nivel cutáneo o profundo, sobretodo en uñas, piel,
cuero cabelludo, zona genital e incluso pueden llegar a afectar órganos internos
especialmente los pulmones, corazón, cerebro y riñones (Walsh y Dixon, 1996; Adam
et al. 2018).
Dependiendo de la zona de infección las micosis pueden ser superficiales,
subcutáneas o sistémicas (Walsh y Dixon, 1996). Las micosis superficiales también
denominadas dermatofitosis son causadas por hongos dermatofitos con más de 40
especies incluidas levaduras que se caracterizan por infectar la piel desencadenando
sobretodo daño estético; mientras que cuando los hongos infectan el tejido
subcutáneo y penetran estructuras subyacentes provocan una micosis subcutánea que
puede llegar a ser crónica; finalmente, cuando la infección fúngica se disemina a
varios órganos en especial pulmones, corazón, huesos y sistemas nervioso causando
afectaciones en todo el organismos se conoce como micosis sistémica lo cual
presenta graves complicaciones cuando el sistema inmune está debilitado por alguna
enfermedad (Walsh y Dixon, 1996; Adam et al. 2018).
En su mayoría, los hongos causales de micosis son hongos imperfectos o anamorfos
filamentosos ya que su micelio o aparato vegetativo que permite su nutrición está
constituido por filamentos o hifas, su reproducción es asexual y no presentan
basidiomas o ascomas (Quindós, 2002); además, estos hongos presentan una rápida
reproducción y crecimiento, lo que los hace abundantes en hábitats como agua, suelo,
animales, plantas y cualquier estructura orgánica en descomposición (Puga, 2014).
El hábitat donde se desarrollan los hongos es la principal fuente de infección, lo que
constituye la base para clasificar las enfermedades infecciosas en antroponosis,
zoonosis y sapronosis (Hubálek. 2003; Cabañes, 2008). Kuris et al. (2014) afirman
que la mayoría de micosis en humanos se encuentran en la categoría de sapronosis, ya
que el reservorio del microorganismo causal es un sustrato no animal, por lo cual
siguen un patrón de transmisión distinto al comúnmente aplicado para enfermedades
infecciosas transmitidas de un huésped a otro, lo que les convierte en un problema
latente en salud pública ya que los patógenos persisten en el ambiente con un alto
potencial de virulencia, generando nuevos brotes de infección por exposición a
sustratos contaminados independientemente del control y abundancia del huésped
homeotérmico, siendo así necesario no solo dar tratamiento a los pacientes, sino
también encontrar la fuente de infección.
Se han descrito 60 géneros y más de 120 especies de hongos involucrados con
enfermedades en humanos y aunque la transferencia interhumana de micosis no es tan
habitual en comparación con otras enfermedades infecciosas trasmitidas por virus y/o
bacterias, el cuadro clínico causado por ciertos hongos puede llegar a ser muy severo
cuando la persona está inmunocomprometida (Walsh et al. 2008).
2
Aunque la candidiasis es la principal micosis invasora que afecta al ser humano
(Fridkin, 1996; Pappas et al. 2004), en los últimos años se han incrementado
notablemente las micosis humanas causadas por Scopulariopsis sp. y Aspergillus sp.
La micosis producida por este último se denomina aspergilosis y es la más frecuente
después de la candidiasis, siendo así que juntas constituyen el 90% de las infecciones
fúngicas nosocomiales (Guarro, 2012).
Existen 180 especies del género Aspergillus de las cuales 33 se relacionan con
enfermedades en humano que provocan sobretodo lesiones pulmonares, las cuales se
identifican por la presencia de hifas septadas y ramificadas en los tejidos, llegándose
a presentar conidióforos cuando el tejido presenta elevada concentración de oxígeno
(Perez et al. 1996; Álvarez et al. 2010).
Las especies de Aspergillus frecuentemente relacionadas con micosis en humanos son
Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Aspergillus flavus que afectan principalmente
al aparato respiratorio y en pacientes en estado de inmunosupresión también se les
relacionan con enfermedades digestivas, cutáneas y sistémicas, pudiendo presentar
incluso necrosis de tejido (Carrasco y Pérez, 2000).
Aspergillus terreus al infectar a un humano puede provocar cuadros alérgicos severos
que si no son tratadas adecuadamente pueden desencadenar aspergiloma y
aspergilosis invasiva con cuadros de aspergilosis broncopulmonar y aspergilosis
pulmonar severos que pueden causar la muerte del paciente en un corto tiempo (Lazo
y Sierra, 2008); también se le asocia con lesiones ungulares siendo el responsable de
30 a 60% de las patologías de las uñas causadas por hongos (Magalhães, 2008).
Otro de los géneros de hongos implicados en micosis humanas es Scopulariopsis con
alrededor de 25 especies que generalmente son cosmopolitas encontrándose en una
amplia gama de hábitats como suelo, aire, detritus, excrementos y como patógenos de
insectos y mamíferos (Domsch et al. 2007; Sandoval-Denis et al. 2013).
Scopulariopsis brevicaulis es uno de los principales hongos imperfectos oportunistas
causantes de lesiones dérmicas sobre todo en piel y en el conducto auditivo externo
(otomicosis), y onicomicosis que afecta sobre todo a las uñas de los pies, sin
embargo, en cuadros más severos provoca similares a la aspergilosis causando
problemas pulmonares, abscesos subcutáneos, infecciones peritoneales, entre otras
(Carrillo-Muñoz, 2004).
Este hongo puede vivir en condiciones extremas gracias a su capacidad
queratonolítica que le permite emplear la queratina del huésped para nutrirse
provocando infecciones en el estrato córneo, siendo el causante del 1 al 11,5% de las
micosis dérmicas (Moreno y Arenas, 2010), y se caracteriza por su elevada
resistencia a los fármacos convencionales (Miossec et al. 2011; Sandoval-Denis et al.
2013).
Desde el punto de vista microbiológico un hongo es resistente cuando este sufre
cambios que hacen que los medicamentos empleados para su tratamiento pierdan su
efectividad, adquiriendo así la cepa la capacidad de sobrevivir en concentraciones del
3
antifúngicos que inhibiría el crecimiento de otras de la misma especie que no han
adquirido dicha resistencia (Kontoyiannis y Lewis, 2002).
La resistencia se determina mediante pruebas de susceptibilidad basadas en la técnica
de dilución en caldo para someter a las cepas a varias dosis del fármaco siguiendo los
estándares impuestos por “European Committee on Antimicrobial Susceptibilily
Testing” (EUCAST) y “Clinical and Laboratory Standars Institute” (CLSI), lo cual
permite determinar cepas con resistencia intrínseca o adquirida al tratamiento
comercial en prueba (Loeffler y Stevens, 2003).
Por el contrario, un microorganismo es susceptible a un compuesto antifúngico
cuando la dosis establecida para el tratamiento inhibe el crecimiento del patógeno
generando éxito terapéutico con una inhibición mayor al 75% (Casals, 1979;
EUCAST, 2018), además puede ser categorizada como susceptibilidad régimen de
dosificación estándar al emplear una dosis del agente que proyecta al éxito
terapéutico y la otra por susceptibilidad por incremento de exposición que para
obtener una probabilidad más alta de éxito terapéutico es necesario incrementar la
concentración del agente farmacológico (EUCAST, 2018).
Cabe mencionar que los hongos presentan diferente susceptibilidad a un mismo
fármaco debido a las características particulares de la especie sobre todo a nivel de la
pared celular que la hacen menos vulnerables al paso y acción antifungica de ciertos
compuestos del medicamento, no obstante, evaluar la susceptibilidad in vitro es un
requerimiento indispensable antes de aplicar tratamientos clínicos (Casals, 1979).
Los antifúngicos se formularon muchos años después de la expedición de los
medicamentos antibacterianos debido a la complejidad de los hongos ya que, al ser
organismos eucariotas, la mayoría de fármacos que se emplean para su control
afectan al huésped (Carazo et al. 1999), esto sumado a que los tratamientos
disponibles requieren un tiempo muy prolongado de acción, hace que los pacientes no
siempre lo terminan; aproximadamente el 51% de las personas que han presentado
una micosis por Scopulariopsis no cumplen con el tratamiento siguiendo todas las
especificaciones del médico, lo que dificulta aún más el control del patógeno y de sus
manifestaciones clínicas (Thappa, 2007).
En este contexto, las investigaciones se han enfocado en buscar nuevos compuestos
como alternativa al tratamiento de micosis para hacer frente a la elevada resistencia
de los patógenos fúngicos a las formulaciones existentes que surgen por mutaciones
en su genoma luego de que la cepa entre en contacto con los antifúngicos o por su
resistencia natural a ciertos compuestos del medicamento (Biedenbach, 2004),
pudiéndose convertir en microorganismos multirresistentes cuando no son
susceptibles a clases de antifúngicos de uso tradicional (Tapia, 2005).
Partiendo de la problemática existente, los extractos de plantas han sido
profundamente estudiados probando su efectividad frente a microorganismos
patógenos (Guerrero-Rodríguez et al. 2007); de manera similar, pero con pocos
4
estudios, dentro del reino fungi existen metabolitos secundarios con actividades
biológicas de gran interés farmacéutico (Kozarsk et al. 2011).
La primera fase de dichas investigaciones parte del desarrollo de métodos de
evaluación in vitro para determinar la susceptibilidad de los patógenos a extractos de
naturales (Reichardt y Welton, 2011). La metodología para elaborar extractos de
hongos es muy similar al utilizado en plantas, es así que para elaborar un extracto
natural obtenido a partir de biomasa requiere que esta sea percolada en un solvente
como metanol, etanol, acetona, entre otros (Reichardt y Welton, 2011).
Varios estudios reportan el uso de etanol como solvente para producir extractos
vegetales y fúngicos, cuyos resultados demuestran su efectividad para extraer
metabolitos secundarios ya que al ser polar tiene gran afinidad con el agua y
compuestos presentes en los organismos vivos (Lago et al. 1985; Brossard-González
et al. 2010) a más de ser un solvente seguro para trabajar pues presenta toxicidad baja
en relación a otros como el metanol y es renovable lo que reduce el impacto
ambiental (Lim et al. 2011).
La efectividad del extracto obtenido estará determinada por la capacidad que este
para inhibir más del 75% del crecimiento de su micelio y reducir las unidades
formadoras de colonia; esto solo pude ser medido en ensayos clínicos ya que al ser
suministrado la respuesta del paciente puede variar dependiendo de factores
genéticos, edad, grado de virulencia, estado de la enfermedad entre otras variables
(Dosari, 2010).
Los extractos varían en su efectividad de acuerdo a características propias de la
estructura del patógeno; para que sea considerado como activo el extracto debe logran
inhibir más del 20% del crecimiento de los hongos filamentosos (Viñuelas y Jacas,
1993). De acuerdo a la escala de clasificación sugerida por la Organización
Internacional de Lucha Biológica (OILB) los extractos pueden ser inocuo cuando el
porcentaje de inhibición de crecimiento es <30%, ligeramente tóxico de 30 a 79%,
moderadamente tóxico de 80 a 99% y tóxico cuando inhibe más del 99%, siendo a
partir de 50% una inhibición representativa para estudios y aplicaciones posteriores
(Viñuelas y Jacas, 1993; Cormican y Pfaller, 1996); por lo cual es importante
establecer la proporción adecuada entre la materia orgánica en estudio y el solvente
para extraer la mayor cantidad de compuestos presentes en los basidiomas (Márquez
et al. 2007).
Las concentraciones efectivas para la inhibición no siguen un patrón muy marcado,
puesto que su acción depende de varios factores como la naturaleza y composición
química del extracto y la resistencia del inóculo, sin embargo, para probar extractos
que no han sido utilizados previamente los estudios sugieren que se debe trabajar con
varias concentraciones no muy distantes entre sí para poder establecer la dosis
mínima a la que se inhibe el 50% (Smania et al. 2003, Moreno-Limón, 2011).
Los métodos más utilizados para evaluar la actividad antifúngica son los métodos de
dilución y el de difusión en agar de manera in vitro, los cuales varían de acuerdo al
5
tipo de organismo, la técnica de extracción y pH que esta estandarizada de acuerdo a
las condiciones del experimento, pero manteniendo los principios básicos del Manual
de Técnica de Investigación del Programa Iberoamericano de Ciencias y tecnología
para el desarrollo (Wanden-Berthe, 2008; Canel-Monterroso, 2012).
El método de difusión en agar es más empleado para realizar antibiogramas, en los
cuales se impregna discos de papel filtro con las sustancias que se pretenden probar
como antibacterianos evaluando posteriormente la formación de halos de inhibición
del crecimiento (Ríos y Recio, 1987). Para probar extractos de plantas u hongos,
cuando no hay investigaciones previas, es más recomendable utilizar el método de
dilución en agar en el cual se realiza diluciones de los extractos en volúmenes
determinados del medio de cultivo y la inhibición del crecimiento viene dado en
función del diámetro de crecimiento micelial que debe ser menor al control negativo
con agua destilada estéril (Cáceres, 1999; Lewis, 2002).
Un extracto inhibe el crecimiento fúngico cuando al ser colocado en un medio de
cultivo logra paralizar o impedir que la cepa colonice el medio generando una
reducción en la tasa de crecimiento respecto al control (Schlumbaum et al. 1986).
Mientras menor sea la dosis requerida para inhibir al microorganismo mayor será el
potencial antifúngico de los compuestos presentes en el extracto (Chang et al. 2007).
La inhibición del crecimiento puede deberse a la actividad fungicida o fungistática
del extracto; el efecto fungicida ocurre cuando un extracto logra eliminar por
completo al patógeno al actuar sobre sitios claves de la ruta metabólica afectando la
producción de enzimas y proteína indispensables para la vida del microorganismo
(Soliman y Badeaa, 2002). Esta actividad se puede evaluar in vitro cuando al quitar
un pequeño fragmento del micelio expuesto al extracto y colocarlo en un medio de
cultivo limpio no se evidencia ningún tipo de crecimiento micelial ya que las
funciones vitales fueron afectadas (Veloz-García et al. 2010); siendo este el más
relevante para su posterior aplicación en la industria farmacéutica (Veloz-García et
al. 2010).
El efecto fungistático a diferencia del anterior no mata al hongo solo lo paraliza
suspendiendo procesos como el crecimiento, desarrollo y germinación de esporas,
pero cuando es retirado del agente químico su micelio puede reactivarse, por lo cual
en el laboratorio basta con retirar un fragmento del micelio expuesto al extracto para
evidenciar un crecimiento luego de por lo menos 48 horas (Veloz-García et al. 2010;
Sánchez-León et al. 2015).
Se han reportado varios estudios que emplean el etanol como solvente para extraer
compuestos de potencial farmacológico, es así, que Vega et al. (2007) demostró el
potencial antifúngico de extractos etanólicos de Ganoderma que es uno de los
géneros de hongos más utilizados en la industria farmacéutica ya que se han
identificado cerca de 130 metabolitos en especial de naturaleza esteroidea como
esteroles y triterpenos que pueden controlar patógenos microbianos. Este género
perteneciente a la división Basidiomycota, clase Agaricomycetes y orden Polyporales
6
tiene una amplia distribución ya que se puede encontrar en casi todos los gradientes
latitudinales con clima cálido, siendo muy aprovechado en los países asiáticos por sus
propiedades medicinales (Lim et al. 2011).
Rodríguez (2010) demostró la efectividad de extractos etanólicos de Ganoderma
lucidum para controlar el crecimiento de dermatofitos y Aspergillus spp., aislados de
humanos y animales pudiendo ser una alternativa relevante para su tratamiento y
control. Estudios similares, destacan el potencial antibacteriano y antioxidante de esta
especie de macrohongo por sus compuestos aislados de naturaleza esteroidea, ácidos
grasos, terpenoides y compuestos nitrogenados (Ferreira et al. 2011; Kozarsk et al.
2011).
Cabe destacar que Ganoderma sp. también ha probado ser inhibidor de hongos
patógenos de interés agrícola como Curvularia clavata y Phytophthora nicotianae
logrando obtener resultados similares a los tratamientos químicos superando el 50%
de inhibición (Palacios et al. 2011).
Ganoderma australe es una especie perenne, sésil y leñosa de forma semicircular
cuyo basidioma solitario de color marrón rojizo puede alcanzar un diámetro de hasta
50cm, no presenta estípite y su himenio es blanquecino con poros de 4mm (Ojeda-
López, 1986); este hongo es cosmopolita y crece adpreso a trocos de árboles tanto
vivos como en proceso de pudrición por lo que constituye un problema sobre todo
para la industria de oleaginosas ya que parasita las palmas generando pérdidas en la
producción (Nieto y Valencia, 2002).
No existen suficientes estudios relacionados al potencial farmacológico de
Ganoderma australe por lo cual se conoce muy poco acerca de su composición
química y por ende de su actividad biológica. Nieto y Valencia (2002), estudiaron la
composición química de basidiomas de Ganoderma australe, encontrando un
porcentaje relevante de esteroles y ácidos grasos identificados como oleato de etilo,
palmitato de etilo, heptadecanoato de etilo, linoleato de etilo y estearato de etilo, que
son sustancias aprobadas por la industria médica; y que podrían ser utilizados para la
obtención de nuevas formas farmacéuticas contra hongos patógenos.
Gerber (2000), evaluó la actividad antibacteriana de extractos de Ganoderma australe
frente a cepas de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus, logrando identificar
químicamente compuestos esteroles, triterpenos y ácidos aplanoxídicos los cuales son
responsables de la actividad biológica. De manera similar, Smania et al. (2003)
lograron inhibir el crecimiento de Trichophyton mentagrophytes y Microsporum
cannis usando metabolitos aislados de Ganoderma annulare. Este macrohongo
además ha cobrado gran relevancia en estudios relacionados con la obtención de
quitosano como una sustancia biodegradable de propiedades antimicrobianas y como
posible aplicación en procesos de obtención de biopolímeros de interés industrial
(Guerrón-Jaramillo, 2016; Lara-López, 2016).
Otro de los hongos con importancia farmacológica es Pycnoporus sanguineus de la
división Basidiomycota y familia Polyporaceae, común en países tropicales y
7
subtropicales, es un macrohongos sésil de podredumbre blanca con forma de repisa
semicircular, cuyos basidiomas son de color anaranjado intenso y tienen habito
solitario o gregario, con pseudoestípite e himeneo con poros de 5 a 6 mm mediante el
cual permanece adherido a troncos en descomposición ya que es una de las especies
de hongos ligninolíticos con mayor actividad degradadora (Ojeda-López, 1986),
además se le atribuye importantes actividades biológicas por los metabolitos
secundarios que presenta como cinnabarina, vainillina y enzimas ligninolíticas, los
que le dan el potencial antiviral, antioxidante, anti-fúngico, antibacteriano y
antiparasitario (Cruz-Muñoz, 2012).
En investigaciones realizadas por Acosta-Urdapilleta et al. (2010) se ha reportado la
importancia médica de Pycnoporus sanguineus ya que presenta metabolitos capaces
de inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae y Streptococcus.
Aunque no se han realizado estudios que evalúen diferentes concentraciones de los
extractos etanólicos de Ganoderma australe (Fr.) Pat. 1889 y Pycnoporus sanguineus
(L.) Murrill 1904 como inhibidores del crecimiento de in vitro de Scopulariopsis
brevicaulis Bainier 1907 y Aspergillus terreus Thom 1918, hongos causales de
micosis en humanos, existe la evidencia suficiente para generar la hipótesis de su
efectividad, lo cual abrirá el paso al desarrollo de nuevos tratamientos que puedan
hacer frente a la múltiple resistencia de estos patógenos fúngicos a los métodos de
control convencionales.
Cabe resaltar que Ecuador presenta una gran diversidad de hongos, siendo las
especies Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus abundantes y ampliamente
distribuidas (Subramanian, 1995; Lodge, 2001), sin embargo, son muy pocas las
investigaciones relacionadas a evaluar su actividad antifúngica como mecanismo para
el control de hongos patógenos pese a su reconocida importancia en la industria
farmacéutica, siendo este el punto de partida para la revalorización de los productos
naturales como potencial controlador de patógenos.
En base a la información reportada y al potencial antimicrobiano de macrohongos,
surge la necesidad de aprovechar la diversidad fúngica del Ecuador como posibles
nuevos fármacos por lo cual, la presente investigación se planteó con el objetivo de
evaluar la efectividad de los extractos etanólicos de Ganoderma australe y
Pycnoporus sanguineus como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis
brevicaulis y Aspergillus terreus causales de micosis en humanos.
Para lo mencionado se desarrollaron los siguientes objetivos específicos: determinar
cuál de los dos extractos obtenidos y a que concentraciones presenta mayor efecto
inhibidor frente al crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus
patógenos fúngicos de interés clínico, comparando a la vez la susceptibilidad de las
cepas patógenas frente a los extractos etanólicos; categorizar el efecto de los extractos
como fungicida o fungistático y finalmente identificar mediante cromatografía de
8
gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) compuestos químicos presentes
en los extractos etanólicos, lo cual se realizó en el Laboratorio de Micología Aplicada
de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.
9
METODOLOGÍA
Las especies fueron identificadas en el Laboratorio de Micología Aplicada de la
Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador mediante
claves dicotómicas de guías especializadas y la colaboración de un especialista del
Laboratorio mencionado, además se revisó su nomenclatura actualizada en el sitio
web: index fungorum para su correcta clasificación taxonómica (ANEXO A).
DISEÑO DE ESTUDIO
Para establecer el efecto de los extractos etanólicos a diferentes concentraciones de
Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus en el crecimiento in vitro de
Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus se utilizó el diseño de bloques al
azar, siendo el factor de bloque los extractos etanólicos sobre cada hongo patógeno y
el factor de variabilidad las diferentes concentraciones de los tratamientos.
POBLACIÓN Y MUESTRA
Población:
La población estuvo conformada por las cepas de S. brevicaulis y A. terreus, las
cuales fueron donadas por el Laboratorio de Micología Aplicada de la Facultad de
Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.
Muestra:
Tres cepas de S. brevicaulis y tres de A. terreus, con 15 ensayos de cada hongo
patógeno sobre cada concentración de los extractos, teniendo un total 45 unidades de
análisis.
MÉTODOS
Preparación de cepas fúngicas patógenas
Los hongos S. brevicaulis y A. terreus causales de micosis en humanos se obtuvieron
de cepas aisladas previamente en el laboratorio de Micología Aplicada de la Facultad
de Ciencias Químicas; las cuales fueron conservadas en medio Agar Papa Dextrosa a
21°C y refrescadas trimestralmente para mantenerlas activas.
Se refrescaron las cepas para posteriormente inocular fragmentos de 5mm de
diámetro de edad de 15 días.
Prueba de rendimiento de los medios de cultivo
Se realizó ensayos comparativos entre los tres medios de cultivo que se manejan en el
laboratorio (Agar PDA, Agar extracto de Malta y Agar Sabouraud) (ANEXO B), con
el fin de determinar cuál fue el más favorable para el crecimiento de las cepas objeto
de análisis, en función de los días requeridos para que los patógenos colonicen el
10
medio bajo condiciones de temperatura y humedad estandarizadas y contraladas en el
laboratorio.
Preparación del material fúngico para la obtención de los extractos
Se seleccionaron basidiomas de G. australe y P. sanguineus en perfecto estado sin
ningún tipo de contaminación y se procedió a lavarlos con agua destilada para
posteriormente dejarlos secar a temperatura ambiente durante 3 días.
En el caso de G. australe se fragmentó el basidioma para facilitar posteriormente la
trituración.
Obtención de los extractos
Los basidiomas secos de cada hongo se sometieron a trituración mecánica con ayuda
de un molino para obtener fragmentos entre 0.5-1 mm pesando un total de 50g de
cada uno, a los cuales posteriormente se les añadió 500ml del solvente (etanol al
96%). Luego el material resultante se llevó a agitación mecánica utilizando un
agitador magnético DLAB MS7-H550-Pro realizando un ciclo de agitación de 15 min
por día durante 48 horas manteniendo el extracto en condiciones de oscuridad, para lo
cual fueron envueltos en papel aluminio y se lo dejó macerar por 10 días para extraer
la mayor cantidad de compuestos posibles.
El sobrenadante se filtró empleando papel Whatman grado 5 y luego fue
almacenando a 4°C en completa oscuridad por 24 horas, para luego dejar en reposo
por 5 días con el fin que el etanol se evapore completamente para su posterior
utilización en los tratamientos; la biomasa fue resuspendida en el solvente para
concentrar el extracto en una cámara de extracción Soxhlet (Domínguez, 1973;
Harborne, 1984; Koc et al. 2005).
Determinación de la biomasa disuelta y rendimiento de los extractos
Para calcular la biomasa disuelta se pesó la cantidad de muestra inicial y la cantidad
de muestra obtenida al final del proceso de extracción (Arévalo, 1996; Moreno-
Limón, 2011), realizando una diferencia matemática entre ellas, basadas en la
siguiente fórmula:
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑎 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙(𝑔) − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙(𝑔)
Para determinar el rendimiento de los extractos se utilizó la siguiente fórmula:
% 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑢𝑒𝑙𝑡𝑎 ∗ 100
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎
Con los datos obtenidos se establecieron las concentraciones de los extractos en
mg/ml correspondientes al 100%, 80%, 60%, 40% y 20%, adicionalmente para
11
enriquecer la investigación se probaron cinco concentraciones más equivalentes al
15%, 10%, 5%, 1% y 0,5%.
Se estableció la concentración al 100% considerando la cantidad de biomasa disuelta
en los 250ml del extracto líquido, lo cual corresponde a 34mg/ml y a partir de ella por
regla de tres se determinó las diferentes dosis.
Identificación de compuestos químicos
Se colectaron 1,5ml de cada extracto, cuyas muestras fueron transportadas al
Laboratorio de Química de la Facultad de Ingeniería Química para identificar los
compuestos químicos presentes mediante cromatografía de gases-espectrometría de
masas (GC-MS) usando el equipo Agilent GCMS con la colaboración del analista
encargado.
Preparación de los ensayos
Para la evaluación de los extractos etanólicos frente a los hongos S. brevicaulis y A.
terreus se midió el halo de crecimiento micelial de los hongos imperfectos
mencionados respecto al control negativo; para lo cual se empleó el método de
dilución en caldo (Tequida-Meneses et al. 2002; Moreno-Limón, 2011).
Se prepararon medios de cultivo con Agar Sabouraud (ANEXO B), con pH 5,6 y
temperatura de 25°C siguiendo las indicaciones de fabricante (39g del medio en
1000ml de agua destilada); esta mezcla se esterilizo en autoclave (marca Tuttnauer
mod. 3870M NB 199613) a 121°C por 45min. Las distintas concentraciones de los
extractos previamente establecidas fueron mezcladas con el medio de cultivo
formando una mezcla homogénea cuando el agar se encontraba a una temperatura de
50°C (Moreno-Limón, 2011). Cada mezcla se vertió en cajas petri de 60x15mm;
luego se dejó solidificar y se selló con papel parafilm para llevarlas a refrigeración a
4°C durante 72h antes de su utilización (Bragulat et al. 1991; Ramirez, 1998).
Ensayo de actividad antifúngica
Para evaluar la actividad antifúngica de los extractos etanólicos sobre S. brevicaulis y
A. terreus, se utilizó la técnica de crecimiento radial midiendo el diámetro de la
colonia cuando los hongos del control negativo colonizaron todo el medio de cultivo
(Martínez, 1999).
Con un sacabocados estéril se colectó 5mm de diámetro del micelio de las colonias de
los hongos mencionados de siete días de edad; para colocar el micelio se utilizó
palillos de madera esterilizados en seco. Las cajas fueron etiquetadas e incubadas a
30°C hasta que los hongos colonizaron todo el medio en el control negativo, que de
acuerdo a la bibliografía es a partir del día séptimo (Martínez, 1999). Se utilizó
Anfotericina B como control positivo que fue adicionado al medio de cultivo antes de
que solidificara como indica la casa comercial (2mg/L) (Donnelly et al. 2012); como
control negativo se utilizó 1ml de etanol al 96% con Agar Sabouraud dejándole en
12
refrigeración durante 72h con el fin de que el etanol se evapore y demostrar que los
resultados de inhibición no son a causa del solvente.
Para el control positivo, negativo y todas las concentraciones se realizó tres
repeticiones para que los datos obtenidos sean estadísticamente representativos.
El diámetro de las colonias se midió en milímetros (mm) en cuatro diferentes
direcciones siendo el resultado el promedio de dichas medidas para determinar el
porcentaje de crecimiento y con ellos calcular el porcentaje de inhibición de
crecimiento de los hongos utilizando las siguientes ecuaciones propuestas por
Sztejnberg et al. (1987).
% de creci𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
=𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑜𝑛𝑔𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 ∗ 100
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜
% 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = (1 − 𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑚𝑚)
𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 (𝑚𝑚) ) ∗ 100
% 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = 100 − % 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
Tabla 1. Clasificación del extracto según el porcentaje de inhibición de
crecimiento generado sobre el crecimiento de los hongos patógenos
Porcentaje de inhibición
del crecimiento micelial
Clasificación del
extracto según la
OILB
<30%, Inocuo
30 a 79%, Ligeramente tóxico
80 a 99% Moderadamente tóxico
>del 99%, Tóxico
Fuente: Cormican y Pfaller (1996)
Las cepas fueron susceptibles a la acción de los extractos cuando este generó una
inhibición mayor al 75% del crecimiento del patógeno.
13
Efecto fungicida o fungistático
Para determinar si el efecto de los extractos sobre la cepa fue fungicida o fungistático
se tomó 5mm de diámetro de los bordes de las colonias que crecieron en los
tratamientos previos y se inocularon sobre medios de cultivo Agar Sabouraud
(Sánchez-León et al. 2015). Las cajas fueron selladas y etiquetadas para ser
incubadas a 30°C durante 7 días luego del cual se evaluará si hay crecimiento
micelial o no.
Las cajas que presentaron crecimiento, evidenciaron efecto fungistático del extracto
sobre la cepa, mientras que, si no hubo crecimiento micelial se concluyó que el efecto
de las concentraciones del extracto fue fungicida (Soliman y Badeaa, 2002; Veloz-
García et al. 2010; Sánchez-León et al. 2015).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Con la finalidad de proceder al análisis estadístico de la información, se levantó una
base de datos en Excel 2016; una vez levantada la base, se obtuvo los promedios de
los porcentajes para establecer el grado de inhibición de los micelios (ANEXO D-1).
Para determinar la normalidad se aplicó Shapiro-Wilk, ya que las muestras de las
variables fueron menores a 50.
De acuerdo a estos resultados, se evidenció que el valor de significancia fue P>0,05,
por aquello, se aceptó la hipótesis nula, que se dispone que los datos provienen de
una distribución normal (Anexo E-1). Razón por la cual posteriormente se aplicó la
prueba T Student para muestras relacionadas (para probar si existe o no diferencia
entre las concentraciones de un mismo extracto sobre cada una de las cepas fúngicas)
y la prueba T Student para muestras independientes para comparar entre grupos, con
sus respectivos intervalos de confianza (95%).
Se considera que los porcentajes de inhibición obtenidos con las concentraciones
desde el 20% al 100% son constantes y no van a tener resultados diferentes, por lo
que para el análisis estadístico solo se tomaron las concentraciones a partir del 20%
hasta al 0,5% y establecer la comparación de las medias.
14
RESULTADOS
En relación a los ensayos de rendimiento realizados se obtuvo que, el medio de
cultivo óptimo para mezclar con los extractos es Agar Sabouraud, ya que con este las
cepas colonizaron el medio en 10 días en el caso de A. terreus y en 12 días S.
brevicaulis con un diámetro de crecimiento total de 60mm, ambos a 30°C, mientras
que con Agar PDA y Agar extracto de Malta bajo las mismas condiciones de
temperatura y humedad, el crecimiento fue muy lento teniendo un diámetro de
crecimiento máximo de 30mm al cabo de 15 días.
Biomasa disuelta y rendimiento de los extractos
Se obtuvo un volumen final de los extractos crudos correspondiente a 250ml de cada
uno, con una biomasa disuelta de 8,6 g ya que de los 50g de biomasa al final se
recuperó 41,4 g de cada hongo.
Mediante estos resultados, se determinó que el rendimiento de ambos extractos fue de
17,2%.
Determinación de compuestos químicos
Mediante el análisis de cromatografía GC-MS se identificó varios compuestos
químicos presentes en los extractos (Tabla 2), encontrándose seis en el extracto de G.
australe (Anexo C-1) y diez en el extracto de P. sanguineus (Anexo C-2).
Tabla 2. Compuestos químicos identificados mediante cromatografía GC-MS
Nombre
Porcentaje
(%)
Sinónimos
Extracto de
Ganoderma
australe
Ácido oleico 1,8 Ácido-cis-Oleico
Éster etílico del ácido linoleico
29,2 Linoleato de etilo
Mandenol
(E)-9Éster etílico del ácido
octadecenoico
45,8 Elaidato de etilo
9(11)-Dehidroergosterol benzoate
26,3 Ergosta-5,7,9(11),22-
tetraen-3-
Ergosterol
7,2 Ergosterin
Provitamina D
5,6- Dehidroergosterol 27,1
Extracto de
Pycnoporus
sanguineus
ácido n-hexadecanoico
7,8 Ácido cetilico
Ácido palmítico
ácido trans-13-octadecenoico 18,3
Ácido octadecanoico 5,9 Vanicol
15
9,12-ácido octadecadienoico (Z, Z) -,
octil éste
6,5 Octyl (9E,12E)-9,12-
octadecadienoate
2,2,4-trimetil-3- (3,8,12,16-
tetrametil-heptadeca-3,7,11,15-
tetraenil) -ciclohexanol
15,9
Octadecano, 3-etil-5- (2-etilbutil) 6,3
Estigmastan-3,5-dieno 22,7
17-Pentatriacontene 17,2
γ-Sitosterol 30,5 Clionasterol
Ácido colestan-26-oico, 3,7,12-
trihidroxi, (3α, 5β, 7α, 12α)
23,8 Colestan
Análisis de actividad antifúngica
En base a los datos obtenidos, se expresan los resultados de los ensayos por cada
tratamiento.
Actividad del Extracto de Ganoderma australe sobre el crecimiento de
Aspergillius terreus
El extracto de G. australe a una concentración desde 15% hasta 100% inhibió
totalmente el crecimiento de la cepa patógena; con el 10, 5 y 1% se evidenció
crecimiento micelial pero con una notable reducción de su halo (Figura 1).
Finalmente, el extracto al 0,5% fue inocuo ya que A. terreus colonizó todo el medio
de cultivo.
Efecto del extracto de Ganoderma australe frente a Aspergillus
terreus
Control Positivo (Halo de crecimiento 0%)
Control negativo (Halo de crecimiento 100%)
Extracto al 100% Extracto al 80%
16
Extracto al 60% Extracto al 40% Extracto al 20% Extracto al 15%
Extracto al 10% Extracto al 5% Extracto al 1% Extracto al 0,5%
*Halos de crecimiento enmarcados en color verde
Figura 1. Halos de crecimiento de Aspergillius terreus de acuerdo a la concentración
del extracto de Ganoderma australe
Los porcentajes de inhibición fueron similares a partir de la concentración al 15%
hasta 100% con una inhibición total del hongo (100%). Con las concentraciones al
10%, 5% y 1% las medias fueron diferentes variando en función en la concentración.
Finalmente, al 0,5% no presentó inhibición (Figura 2).
Figura 2. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción del
extracto de G. australe
Al clasificar la acción del extracto sobre la cepa fúngica en función del porcentaje de
inhibición, según la Organización Internacional de Lucha Biológica (OILB) se obtuvo
100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
76,75
42,88
10,150,00
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Porc
enta
je d
e in
hib
ició
n
Concentraciones del extracto de G. australe
17
que el extracto de G. australe al 0,5% y 1% fue inocuo sobre A. terreus al inhibir
menos del 30% de su crecimiento; mientras que al 5% y 10% fue ligeramente tóxico
inhibiendo al patógeno entre el 30 y 79%; y finalmente con una concentración desde
15% al 100% el efecto fue tóxico al inhibir más del 99% del crecimiento (Tabla 5).
Actividad del Extracto de Ganoderma australe sobre el crecimiento de
Scopulariopsis brevicaulis
Concentraciones del extracto de G. australe a partir del 20% al 100% inhibieron
totalmente el crecimiento de S. brevicaulis (Figura 3), mientras que dosis menores
presentaron variación en los halos de crecimiento.
Efecto del extracto de Ganoderma australe frente a Scopulariopsis brevicaulis
Control Positivo (Halo de crecimiento 0%)
Control negativo (Halo de crecimiento 100%)
Extracto al 100% Extracto al 80%
Extracto al 60% Extracto al 40% Extracto al 20% Extracto al 15%
Extracto al 10% Extracto al 5% Extracto al 1% Extracto al 0,5%
*Halos de crecimiento enmarcados en color verde
Figura 3. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo a la
concentración del extracto de Ganoderma australe.
18
Los porcentajes de inhibición fueron similares (100%) a partir de la concentración al
20% hasta 100% con una inhibición total del hongo. Con las concentraciones al 15%,
10%, 5% y 1% las medias fueron muy diferentes variando en función en la
concentración, sin tener efecto inhibitorio con la concentración al 0,5% (Figura 4).
Figura 4. Media de los porcentajes de inhibición de S. brevicaulis frente a la acción
del extracto de G. australe
Al clasificar la acción del extracto sobre la cepa fúngica en función del porcentaje de
inhibición generado, se determinó que el extracto de G. australe fue tóxico sobre S.
brevicaulis a partir del 20% de concentración inhibiendo más del 99% de su
crecimiento; ligeramente tóxico con el 5%, 10% y 15% al inhibir entre el 30 a 79%; e
inocuo con el 1% y 0,5.
Actividad del Extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de
Scopulariopsis brevicaulis
De acuerdo a los datos obtenidos, con el extracto de P. sanguineus sobre el
crecimiento de S. brevicaulis se evidenció inhibición total de la cepa con las
concentraciones desde el 20% hasta el 100% (Figura 5); mientras que con las demás
concentraciones presentaron diferentes halos de crecimiento.
Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus frente a Scopulariopsis brevicaulis
100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
65,9133
47,333334,6200
10,81330,00
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
Concentraciones del extracto de G. australe
19
Control Positivo (Halo de crecimiento 0%)
Control negativo (Halo de crecimiento
100%)
Extracto al 100% Extracto al 80%
Extracto al 60% Extracto al 40% Extracto al 20% Extracto al 15%
Extracto al 10% Extracto al 5% Extracto al 1% Extracto al 0,5%
*Halos de crecimiento enmarcados en color verde
Figura 5. Halos de crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis de acuerdo a la
concentración del extracto de Pycnoporus sanguineus
Concentraciones a partir del 20% hasta 100% generaron una inhibición total de la
cepa correspondiente al 100%; con las concentraciones al 15%, 10%, 5% y 1% las
medias fueron muy diferentes variando en función en la concentración (Figura 6).
Figura 6. Media de los porcentajes de inhibición de S. brevicaulis frente a la acción
del extracto de P. sanguineus
100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
68,77
53,69
38,92
21,22
0,270,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
Concentraciones del extracto de P. sanguineus
20
De acuerdo a los porcentajes de inhibición registrados, el extracto de P. sanguineus a
una concentración de 0,5 y 1% fue inocuo sobre S. brevicaulis al inhibir menos del
30% de su halo de crecimiento; ligeramente tóxico con el 5, 10 y 15%; y finalmente
con una concentración desde 20% en adelante fue tóxico para la cepa al inhibir más
del 99% del crecimiento del hongo patógeno (inhibición total, 100%).
Actividad del Extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de
Aspergillus terreus
Con el extracto de P. sanguineus sobre el crecimiento de A. terreus a una
concentración a partir del 10% se evidenció una media de porcentaje de inhibición
constante de 100% (Figura 7); mientras que con las demás concentraciones el
crecimiento fue significativamente diferente.
Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus frente a Aspergillus terreus
Control Positivo (Halo de crecimiento 0%)
Control negativo (Halo de crecimiento 100%)
Extracto al 100% Extracto al 80%
Extracto al 60% Extracto al 40% Extracto al 20% Extracto al 15%
Extracto al 10% Extracto al 5% Extracto al 1% Extracto al 0,5%
*Halos de crecimiento enmarcados en color verde
Figura 7. Halos de crecimiento de Aspergillus terreus de acuerdo a la concentración
del extracto de Pycnoporus sanguineus
21
Los porcentajes de inhibición fueron iguales a partir de la concentración al 10% hasta
100% con una inhibición total del hongo. Con las concentraciones al 5% y 1% las
medias fueron muy diferentes variando en función en la concentración, siendo
mínima con el 0,5% (Figura 8).
Figura 8. Media de los porcentajes de inhibición de A. terreus frente a la acción del
extracto de P. sanguineus
En base a los porcentajes de inhibición registrados, el extracto de P. sanguineus fue
tóxico para A. terreus a una concentración desde el 10% al 100% inhibiendo más del
99% del crecimiento del patógeno; ligeramente tóxico al 5% al inhibir entre el 30 y
79% del crecimiento; e inocuo con el 1% y 0,5%, inhibiendo menos del 30%.
Comparación entre concentraciones de un mismo extracto
Al aplicar la prueba estadística para muestras relacionadas, se determinó que el
promedio de los halos de crecimiento entre las concentraciones al 20% hasta el 0,5%
fueron estadísticamente diferentes considerando un P<0,05, donde a mayor
concentración de los extractos se obtuvo mayor efecto inhibitorio; por el contrario,
con las concentraciones superiores al 20% no existió diferencia significativa ya que
dichas concentraciones generaron el mismo porcentaje de inhibición al inhibir el
100% del crecimiento de las cepas patógenas con un P>0,05(Anexo E-2).
Comparación entre grupos
Efecto del extracto de Ganoderma australe versus el efecto del extracto de
Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus terreus
En el análisis comparativo del efecto de los extractos de G. australe y P. sanguineus
sobre el crecimiento de A. terreus (Tabla 3), se evidencia una variación en el
porcentaje de inhibición en concentraciones al 15%, 10%, 5% y 1%, considerando el
100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
78,08
17,85
0,080,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
Concentración del extracto de P. sanguineus
22
valor P<0,05; siendo el extracto de P. sanguineus el que generó los porcentajes más
altos de inhibición.
Excepto con la concentración al 0,5%, cuyo porcentaje de inhibición es similar en
ambos casos por lo que no tiene variación significante (P (0,15)>0,05). Entre el 15%
y el 20% no existen diferencias significativas ya que en ambos casos se generó el
mismo porcentaje de inhibición (100%).
Tabla 3. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de
Ganoderma australe y Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus
terreus
Prueba de muestras independientes
Dosis de
los
extractos
%Inhibición prueba t para la igualdad de medias
E1
(X ± DE)
E2
(X ± DE) t Sig.
(bilateral)
Diferencia
de medias
95% de intervalo de
confianza de la
diferencia
Inferior Superior
10% 76,74±2,05 100±0 44,01 <0,001 23,25 22,17 24,34
5% 42,89±2,92 78,07±1,4
6
41,79 <0,001 35,20 33,47 36,93
1% 10,15±1,06 17,85±2,6
1
10,58 <0,001 7,70 6,21 9,19
0,5% 0 0,08±0,21 1,47 0,15 0,08 0,03 0,19
* X ± DE indican el promedio y desviación estándar del porcentaje de inhibición del
crecimiento en función de cada extracto. E1: se entiende como extracto de
Ganoderma australe y E2 como extracto de Pycnoporus sanguineus. No se
consideraron las concentraciones a partir del 15% al 100%, ya que los resultados
fueron constantes (100% de inhibición).
Efecto del extracto de Ganoderma australe versus el extracto de Pycnoporus
sanguineus sobre el crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis
De forma similar al anterior, entre los extractos de G. australe y P. sanguineus sobre
el crecimiento de S. brevicaulis se evidenció una variación de las medias entre los
extractos con las concentraciones al 20%, 15%, 10%, 5% y 1%, al determinar que el
valor P<0,05. Mientras que con la concentración al 0,5% no existe diferencia
estadísticamente entre ambos extractos (P (0,65)>0,05) (Tabla 4).
23
Tabla 4. Prueba de muestras independientes entre la acción de los extractos de
Ganoderma australe y Pycnoporus sobre el crecimiento de Scopulariopsis
brevicaulis Prueba de muestras independientes
Dosis
de los
extractos
%Inhibición prueba t para la igualdad de medias
E1
(X ± DE)
E2
(X ± DE)
T Sig.
(bilateral)
Diferencia
de medias
95% de intervalo
de confianza de la
diferencia
Inferior Superior
15% 65,93±2,17 68,78±2,65 3,23 <0,001 2,85 1,04 4,66
10% 47,33±1,36 53,7±1,65 11,48 <0,001 6,35 5,22 7,49
5% 34,63±2,40 38,93±1,56 5,81 <0,001 4,30 2,78 5,82
1% 10,81±2,01 21,22±3,09 10,94 <0,001 10,41 8,46 12,36
0,5% 0,15 0,26±0,52 0,45 0,65 0,07 0,26 0,40
* X ± DE indican el promedio y desviación estándar del porcentaje de inhibición del
crecimiento en función de cada extracto. E1: se entiende como extracto de
Ganoderma australe y E2 como extracto de Pycnoporus sanguineus. No se
consideraron las concentraciones a partir del 20% al 100%, ya que los resultados
fueron constantes (100% de inhibición).
Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el crecimiento de los patógenos
Aspergillus terreus y Scopulariopsis brevicaulis
Al realizar las comparaciones, se determinó que existe una variación de crecimiento
de las cepas fúngicas entre las concentraciones 20%, 15%, 10%, 5% y 0,5% del
extracto de G. australe; mientras que con el 1% del extracto, estadísticamente se
obtuvo el mismo efecto sobre las cepas de A. terreus y S. brevicaulis al considerar la
similitud de las medias y el valor de P (0,27)>0,05 (Tabla 5).
Tabla 5. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de
Ganoderma australe sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y Scopulariopsis
brevicaulis Prueba de muestras independientes
Dosis
de los
extractos
%Inhibición de los
patógenos
prueba t para la igualdad de medias
Sp1
(X ± DE)
Sp2
(X ± DE)
t Sig.
(bilateral)
Diferencia
de medias
95% de intervalo
de confianza de la
diferencia
Inferior Superior
15% 100 65,93±2,17 60,82 <0,001 34,09 32,94 35,23
10% 76,74±2,05 47,33±1,36 46,33 <0,001 29,41 28,11 30,71
5% 42,89±2,92 34,63±2,40 8,46 <0,001 8,26 6,26 10,26
1% 10,15±1,96 10,81±2,01 -1,12 0,27 -0,66 -1,86 0,54
0,5% 0 0,15 -2,13 0,04 -0,19 -0,38 -0,01
* X ± DE indican el promedio y desviación estándar del porcentaje de inhibición del
crecimiento de cada patógeno. Sp1 se entiendo como Aspergillus terreus y Sp2 como
24
Scopulariopsis brevicaulis. No se consideraron las concentraciones a partir del 20%
al 100%, ya que los resultados fueron constantes (100% de inhibición).
A. terreus fue la cepa más sensible a la acción del extracto ya que su crecimiento se
inhibió totalmente a partir de la concentración al 15%.
Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de
Scopulariopsis brevicaulis y Aspergillus terreus
Las cepas reaccionaron de manera estadísticamente diferente a las concentraciones al
20%, 15%, 10%, 5% y 1% del extracto de P. sanguineus; mientras que con la
concentración al 0,5%, el extracto tuvo el mismo efecto sobre las cepas de A. terreus
y S. brevicaulis al considerar valor de P (0,21)>0,05 (Tabla 6).
Tabla 6. Prueba de muestras independientes entre la acción del extracto de
Pycnoporus sanguineus sobre el crecimiento de Aspergillus terreus y Scopulariopsis
brevicaulis Prueba de muestras independientes
Dosis
de los
extractos
%Inhibición de los
patógenos
prueba t para la igualdad de medias
Sp1
(X ± DE)
Sp2
(X ± DE)
t Sig.
(bilateral
)
Diferenci
a de
medias
95% de intervalo de
confianza de la
diferencia
Inferior Superior
15% 100 68,78±2,6
5
-45,68 <0,001 -31,23 -32,63 -29,83
10% 100 53,7±1,65 -108,42 <0,001 -46,31 -47,19 -45,44
5% 78,07±1,46 38,93±1,5
6
-71,05 <0,001 -39,16 -40,29 -38,03
1% 17,85±2,61 21,22±3,0
9
3,23 <0,001 3,37 1,23 5,50
0,5% 0,08±0,21 0,27±0,52 1,29 0,21 0,19 -0,11 0,48
* X ± DE indican el promedio y desviación estándar del porcentaje de inhibición del
crecimiento de cada patógeno. Sp1 se entiendo como Aspergillus terreus y Sp2 como
Scopulariopsis brevicaulis. No se consideraron las concentraciones a partir del 20%
al 100%, ya que los resultados fueron constantes (100% de inhibición).
En base a lo mencionada, A. terreus fue la cepa más sensible a la acción del extracto
ya que se inhibió totalmente su crecimiento a partir de la concentración al 10%.
Para corroborar los resultados se realizó el Test de ANOVA, evidenciando la similitud
de resultados (ANEXO E-3).
Categorización del efecto de los extractos etanólicos
Ambos extractos presentaron efectos fungicidas y fungistático sobre el crecimiento
micelial de los hongos patógenos cuyo efecto varió en función de la concentración de
los mismos.
25
El extracto de G. australe a partir de la concentración equivalente al 20% resultó ser
fungicida para la cepa S. brevicaulis ya que no se evidencio crecimiento micelial; en
el caso de A. terreus, el extracto fue fungicida incluso a una concentración del 15%
(Figura 9).
Dosis menores a las mencionadas resultaron generar un efecto fungistático sobre las
cepas ya que al ser re-inoculadas en un medio de cultivo convencional, el micelio se
reactivó.
Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre las cepas fúngicas
Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre Aspergillus terreus
Extracto al 100% Extracto al 80% Extracto al 60% Extracto al 40%
Extracto al 20% Extracto al 15% Extracto al 10% Extracto al 5%
Extracto al 1% Extracto al 0,5%
Efecto del extracto de Ganoderma australe sobre Scopulariopsis brevicaulis
26
Extracto al 100% Extracto al 80% Extracto al 60% Extracto al 40%
Extracto al 20% Extracto al 15% Extracto al 10% Extracto al 5%
Extracto al 1% Extracto al 0,5%
*Halos de crecimiento enmarcados en color verde
Figura 9. Categorización del efecto del extracto de Ganoderma australe sobre las
cepas patógenas.
Por otro lado, el extracto de P. sanguineus mostro una importante actividad fungicida
en concentraciones desde el 20% para S. brevicaulis; sin embargo, para la cepa de A.
terreus fue fungicida incluso con el 10% del extracto (Figura 10).
Dosis menores a las mencionadas resultaron generar un efecto fungistático sobre las
cepas ya que al ser re-inoculadas en un medio de cultivo convencional, el micelio se
reactivó.
27
Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre las cepas fúngicas
Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre Aspergillus terreus
Extracto al 100% Extracto al 80% Extracto al 60% Extracto al 40%
Extracto al 20% Extracto al 15% Extracto al 10% Extracto al 5%
Extracto al 1% Extracto al 0,5%
Efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre Scopulariopsis brevicaulis
Extracto al 100% Extracto al 80% Extracto al 60% Extracto al
40%
28
Extracto al 20% Extracto al 15% Extracto al 10% Extracto al 5%
Extracto al 1% Extracto al 0,5%
Figura 10. Categorización del efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre
las cepas fúngicas.
29
DISCUSIÓN
Tras realizar las pruebas de rendimiento de los medios de cultivo, se determinó que el
medio de cultivo Agar Sabouraud es el idóneo para el crecimiento de las cepas
fúngicas de trabajo, lo cual se contrapone a la gran cantidad de estudios que reportan
al medio de cultivo PDA como el estándar para el análisis de crecimiento micelial.
Esto se debe a que en análisis de crecimiento micelial se suele enriquecer el medio
PDA con aditivos que favorezcan las fuentes de nitrógeno y carbono, lo cual no se
realizó en la presente investigación (Moreno-Limón et al. 2011). Considerando lo
mencionado, Guillén-Navarro (1998), apoya el uso del medio de cultivo Agar
Sabouraud ya que su composición de glucosa es de 40 g/l. lo que favorece el
crecimiento de microorganismos.
Aunque se logró estandarizar el tiempo de incubación necesario para que las cepas
colonicen el medio, este fue mucho mayor al que señala la teoría (10 días de
incubación para A. terreus y 12 días para S. brevicaulis); lo cual puede deberse a que
las cepas estuvieron almacenadas a 5°C volviéndose inactiva, por lo que se realizaron
procesos simultáneos de incubación de 25 a 30°C para reactivarlas.
Cabe mencionar que el requerimiento de más días de incubación pudo estar
influenciado por los intervalos óptimos de temperatura que necesita cada organismo,
los cuales suelen variar ligeramente incluso entre cepas de una misma especie
(Atkinson y Mavituna, 1991); en el proyecto se trabajó a 30°C para ambas cepas
fúngicas, la cual se encuentra entre los rangos óptimos mencionados en la literatura.
Por otro lado, el rendimiento de los extractos obtenidos fue de 17,2%; y pese a que se
obtuvo buenos resultados en la inhibición de los patógenos, este fue inferior en
comparación con otros estudios. Lo cual puede deberse al solvente empleado para la
obtención de los mismos, ya que García et al. (2016) al utilizar solventes como éter y
acetonas obtuvieron mejor rendimiento (rendimiento >50%) y mayor cantidad de
metabolitos encontrados que al usar etanol. A más de la influencia del solvente, la
técnica mediante la cual se obtuvieron los extractos también puede haber influido en
el rendimiento, ya que Mazzutti et al. (2012), en su investigación concluyen que con
la técnica de extracción por cámara Soxhlet se obtuvo mejor rendimiento de los
extractos de Agaricus brasiliensis en comparación con el obtenido por medio de
maceración.
No se han registrado estudios en los que se emplee el extracto de G. australe y P.
sanguineus como inhibidores de crecimiento in vitro de Scopulariopsis brevicaulis y
A. terreus; sin embargo, varios autores han demostrado la actividad antimicrobiana de
dichos macrohongos (Smania et al. 2003; Cruz-Muñoz, 2012; Ojeda-Gutiérrez et al.
30
2012; Guerrón-Jaramillo, 2016 y Lara-López, 2016); corroborando dicha actividad
antifungica con los resultados obtenidos en la presente.
En el caso de G. australe, Smania et al. (2003) demostró el potencial de este hongo
para inhibir el crecimiento de Trichophyton mentagrophytes y Microsporum cannis,
cepas fúngicas relacionados con cuadros micóticos en humanos: requiriendo una
concentración del extracto a 0,5 y 1 mg/ml respectivamente. Es importante mencionar
que la concentración requerida para inhibir patógenos es diferente de acuerdo a las
características propias de los microorganismos, del anfitrión y de la farmacocinética.
(Walsh et al. 2008); en función a lo mencionado, en el presente estudio, para inhibir
completamente a A. terreus y S. brevicaulis utilizando el extracto de la misma especie
de macrohongo se necesitó de concentraciones al 5,1mg/ml y 6,8mg/ml
respectivamente, dosis mayores a las requeridas contra los patógenos mencionados
anteriormente. Además, se observó que a medida que la concentración bajaba, el
extracto se tornada inocuo para los organismos.
De manera similar Palacios et al. (2011) emplearon el extracto de Ganoderma sp.
para el control de los hongos Curvularia clavata y Phytophthora nicotianae
generando una inhibición de 48,8% y 53,3% respectivamente, y aunque es bajo en
comparación con los porcentajes registrados para otras cepas, es muy similar a los
resultados que se tiene con el uso del tratamiento convencional con tebuconazol el
cual inhibe un 57,4%. De igual forma su efectividad como antifúngico se apoyó con
la presente investigación en la cual con una dosis del 20% y 15% del extracto se logró
inhibir el 100% del crecimiento de S. brevicaulis y A. terreus respectivamente.
Para P. sanguineus la mayoría de estudios resaltan su potencial antibacteriano,
antiparasitaria, antioxidante e incluso antiviral, pero son muy pocos los estudios que
avalan su actividad antifungica; sin embargo, en el presente estudio sobresale su
actividad fungicida.
Ojeda-Gutiérrez (2012) evaluó la actividad de este hongo para el control de Mycena
citricolor, logrando inhibir el crecimiento in vitro de la colonia e in vivo provocó lisis
de las hifas, sin embargo, su acción fue mucho menor que con Trichoderma
harzianum Rifai, hongo probado efectivamente como fungicida. En contraste con
estos resultados, en el presente estudio resalta P. sanguineus como el extracto que
genero los mayores porcentajes de inhibición sobre ambas cepas fúngicas, resaltando
que fue más efectivo en el control de A. terreus en el cual con una concentración de
3,4mg/ml equivalente al 10% logro inhibir el 100%. Este extracto fue toxico para la
cepa de S. brevicaulis a partir de una concentración al 20% equivalente a (6,8 mg/ml).
Los resultados obtenidos demuestran la efectividad de P. sanguineus para el
tratamiento de los patógenos mencionados, además superan a los resultados obtenidos
por Cruz-Muñoz (2012) el cual utilizo el extracto de P. sanguineus a concentraciones
de 10, y 20 mg/mL para inhibir a B. cinérea, logrando inhibir solo el 70% y 60% del
crecimiento del patógeno.
31
La mayoría de investigaciones mencionan que la efectividad del extracto de P.
sanguineus como antifúngico puede variar de acuerdo a la producción de cinnabarina
ya que es el principal responsable de su actividad antifungica, siendo más efectivo
cuando se utilizan cuerpos fructíferos de menor tamaño ya que según Smânia et al.
(1995) en los cuerpos fructíferos de menor dimensión existe más producción de este
compuesto. Lo mencionado no se consideró en la elección de los cuerpos fructíferos
para la obtención del extracto.
Es importante también considerar que la efectividad del extracto puede variar de
acuerdo al patógeno, pues un estudio realizado por Viecelli et al. (2010) siguiendo la
misma metodología descrita, probó inhibir el crecimiento de Colletotrichum fragarie
al 50% y C. gloeosporioides solo un 40%; mientras que sobre el hongo
Pseudocercospora griseola mostro ser un efectivo fungicida ya que logro inhibir el
100% del crecimiento micelial con apenas una concentración a partir del 5% (Cruz-
Muñoz (2012). Esto explica la variación en la respuesta de las cepas estudiadas a la
acción de un mismo extracto.
De manera general, con ambos extractos se logró inhibir efectivamente el crecimiento
de las cepas fúngicas analizadas; las concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100% no
presentaron diferencia significativa entre si ya que generaron una inhibición total del
crecimiento de S. brevicaulis y A. terreus; a medida que la concentración disminuyo,
el porcentaje de inhibición fue menor teniendo que en ambos cosas una dosis al 0,5%
ya no es efectiva para ninguno de los hongos patógenos; sin embargo, de manera
general, la actividad antifungica registrada en este estudio es mayor en comparación
con otros extractos sobre las cepas fúngicas de estudio.
En cuanto a la actividad fungicida y fungistática; las concentraciones del 20, 40, 60,
80 y 100% e incluso al 15% y 10% en el caso de A. terreus generaron un efecto
fungicida sobre las cepas, lo cual puede deberse a la elevada concentración de
compuestos químicos que actúan sobre sitios claves de la ruta metabólica afectando la
producción de enzimas y proteína indispensables para la vida del microorganismo, así
como el ingreso de nutrientes desde el medio (Cochrane, 1963).
Respecto a las concentraciones al 15%, 10%, 5% y 1%, estas probaron ser menos
efectivas ya que se observó crecimiento micelial; no obstante, en el caso de A. terreus
la inhibición del crecimiento fue mayor al 50% a partir de la concentración al 10%
del extracto de G. australe y a partir de la concentración al 5% del extracto de P.
sanguineus, que continúan siendo efectivos al comparar con las resultados que se
obtienen con antifúngicos convencionales como el fluconazol, sobre los cuales
Aspergillus sp. ha probado ser resistente (Potón, 2006).
De acuerdo a los resultados, dichas concentraciones además generaron un efecto
fungistático lo cual puede deberse a que las concentraciones de los compuestos
fueron menores por lo cual no afecto drásticamente los procesos enzimáticos, sino
32
más bien los procesos relacionados con el crecimiento, desarrollo y germinación de
esporas (Veloz-García et al. 2010); este proceso es reversible ya que al re inocular el
micelio este se reactivó (Sánchez-León et al. 2015).
El potencial antifúngico de un extracto es mayor cuando menos dosificación requiere
para inhibir el crecimiento del patógeno (Chang et al. 2007), en base a los expuesto,
al comparar la efectividad de ambos extractos, el obtenido a partir de los basidiomas
de P. sanguineus fue mejor, ya que logro inhibir totalmente a A. terreus con una
concentración de 10%, mientras que con el extracto de G. australe se requirió una
concentración mayor (15%) para generar el mismo porcentaje de inhibición; en
cambio, sobre S. brevicaulis ambos extractos son igual de efectivos ya que para
inhibir el 100% de la cepa fue necesario dosis a partir del 20% en ambos casos.
S. brevicaulis, fue la especie más resistente a la acción de los extractos ya que
requirió de dosis mayores para que la inhibición de su crecimiento sea mayor al 50%
(desde 15 % del extracto de G. australe y a partir del 10% del extracto de P.
sanguineus). Esto se debe a la conocida resistencia de S. brevicaulis a los
antifúngicos, varios estudios han reportado la resistencia de la cepa patógenas al
fluconazol, caspofungina, fluorocitosina y anidulafungina, representando así un grave
inconveniente en su tratamiento (Odero et al. 2004 y Guerrero et al. 2014).
A. terreus fue la cepa más sensible a la acción de los extractos; sin embargo, es
importante mencionar factores que pudieron influenciar en los resultados obtenidos;
un estudio realizado por Nierman et al. (2005), sobre una especie del mismo género,
el cual sugiere que la temperatura influye de gran manera en las respuestas de los
patógenos; esto luego de analizar la adaptación metabólica de A. fumigatus a tres
diferentes temperaturas: a 30°C que es la temperatura óptima en el ambiente y a 37
y 48°C que correspondería a la temperatura en el cuerpo humano. La investigación
revelo que los genes se expresan de manera diferente a cada temperatura, 323
genes tuvieron niveles de expresión más alta a las 48°C y solo 135 genes se
expresaron a un mayor nivel a los 37°C lo que indica que la temperatura de 30 y
37°C no son suficientes para activar genes relacionados a la virulencia; lo que
sugiere que las cepas estudiadas no lograron expresar muchos de los genes que
influyen en su patogenicidad por lo que fueron vulnerables a la acción de los
extractos.
Ambos hongos patógenos han probado ser sensibles frente al itraconazol, anfotericina
B y voriconazol, siendo estos los principales antifúngicos empleados para su
tratamiento (Odero et al. 2004); a pesar de ello, su efectividad se reduce a medida que
los hongos adquieren resistencia; por lo que los resultados obtenidos en el estudio
constituyen una posible estrategia terapéutica mediante el diseño de moléculas
potentes para su control.
33
Por otro lado, al comparar los resultados obtenidos con otros estudios se observa
ligeras diferencias entre los compuestos encontrados y su concentración, ya que esto
varía en función de las técnicas interlaboratorio, los métodos de colección, transporte
y almacenamiento, y sobre todo de la composición propia de los hongos,
convirtiéndose en un obstáculo para realizar comparaciones entre investigaciones
(Moro-Lagares, 2015).
En la presente investigación la mayor cantidad de compuestos se encontró en el
extracto de P. sanguineus. Estudios realizados sobre la misma especie muestran la
variabilidad en las unidades químicas encontradas, sin embargo, resalta la
cinnabarina, la cual es característica de la especie, como el principal responsable de la
actividad antimicrobiana ya que ha sido probada con éxito en el control de bacterias
Gram positivas y negativas, e incluso en virus (Pineda-Insuasti et al. 2017).
La mayoría de estudios sobre P. sanguineus se enfocan en el aislamiento de lacasa y
cinnabarina como principales responsables de su potencial bioactivo (Acosta-
Urdapilleta et al. 2010; Cruz-Muñoz, 2015); a más de esto, en el presente estudio se
encontraron hidrocarburos, ácidos esteáricos y esteroles.
Respecto a los ácidos se encontraron ácido n-hexadecanoico o ácido palmítico, ácido
octadecanoico y ácido trans-13-octadecenoico, de los cuales existe evidencia de sus
propiedades antiarterioescleróticas, antidiabéticas, inmunomoduladoras,
anticancerígenas y con alto potencial antimicrobiano (León-Sánchez, 2014); también
se encontraron hidrocarburos terpénicos como 17-Pentatriacontene y esteroles como
γ-Sitosterol, el cual actúa sobre las células cancerosas disminuyendo su crecimiento y
contribuyendo a su eliminación, además, mediante bioprocesos de trasformación se
usa para la producción de hormonas útiles en la industria farmacéutica (Acosta-
Urdapilleta et al. 2010).
Cabe resaltar la presencia de estigmastan-3,5-dieno el cual es un importante mediador
de la lacasa asociado con el potencial biotecnológico y terapéutico de P. sanguineus
(Madhavi y Lele, 2009; Rico-Campos, 2010). En base a la investigación realizada
por Cruz Muñoz (2012) este compuesto tiene un gran potencial para tratar
enfermedades causadas por hongos sobre todo a nivel dérmico.
Respecto a los compuestos químicos identificados en el extracto de G. australe,
aunque con una ligera variación, los resultados son muy similares a los obtenidos por
Nieto y Valencia (2002), el cual identifico compuestos esteroles, ésteres, ácidos
grasos e incluso hidrocarburos. Dentro de los compuestos comunes en ambos estudios
están el ergosterol, 5,6- dehidroergosterol y éster etílico del ácido linoleico. Es
importante mencionar que en el extracto obtenido en la investigación no se
encontraron hidrocarburos ni otros ácidos grasos como ácidos aplanoxídicos, el cual
es común en los estudios realizados por Valencia (2002 y Smania et al. (2003).
Algunos compuestos como 9(11)-dehidroergosterol benzoate, ácido oleico (E)-9éster
34
etílico del ácido octadecenoico no se han hallado en los artículos analizados. Estas
ligeras variaciones pueden deberse a que para la determinación de los compuestos
químicos solo se consideraron aquellos con mayor longitud de onda por su mayor
probabilidad de identificación.
Los estudios realizados por Guerrón-Jaramillo (2016) y Lara-López (2016), resaltan
el potencial antimicrobiano del quitosano obtenido de los cuerpos fructíferos de G.
australe compuesto por β-(1-4) D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina; sin
embargo en el presente estudio no se detectaron ninguno de los compuestos
mencionados. Lo cual, según lo señalado por Guerrón-Jaramillo (2016), se debe a que
el procedimiento para la obtención de los compuestos del quitosano requiere la
preparación de soluciones acuosas con agentes plastificantes y reticulantes.
Es importante resaltar que en el control negativo ambas cepas fúngicas colonizaron
todo el medio de cultivo por lo que se descarta que la actividad inhibitoria se debe a
la acción del solvente utilizado.
Las limitaciones de la presente investigación fueron: dificultades técnicas para la
adquisición de otras cepas causales de micosis en humanos para la realización de
las pruebas de actividad antifungica; el no otorgamiento de los permisos requeridos
para la obtención de otros tipos de solventes como acetona, cloroformo y éter; que
no se determinó la concentración mínima inhibitoria; la falta de equipos en el
laboratorio que permitan simular de mejor manera las condiciones in vivo sobre
todo en cuanto a variación de temperatura y humedad; no contar con equipos ni
personal técnico especializado para la realización de pruebas toxicológicas,
ecotoxicólogicas y de análisis de residuos de los extractos; así como para el
aislamiento de compuestos específicos de interés farmacológico.
35
CONCLUSIONES
G. australe como P. sanguineus poseen propiedades antifúngicas, pudiendo
así constituir una fuente importante de compuestos químicos para el desarrollo
de antifúngicos de origen natural; exceptuando con las concentraciones al 1 y
0,5% las cuales resultaron ser inocuas para las cepas de estudio.
Como tratamiento contra S. brevicaulis se pueden emplear tanto el extracto de
G. australe como el de P. sanguineus ya que ambos a una concentración de
20%, resultaron ser tóxicos para el patógeno generando un efecto fungicida
sobre ellos. Para A. terreus, el extracto recomendado en base a los resultados
es el de P. sanguineus ya que este fue toxico para la cepa con una
concentración al 10%.
El extracto etanólico de P. sanguineus mostro mayor actividad fungicida
sobre S. brevicaulis y A. terreus, siendo esta última la cepa más sensible a la
acción de las diferentes concentraciones del extracto. En el caso de A. terreus
presentó actividad fungistática a concentraciones menores al 10%.
Los extractos obtenidos poseen compuestos esteroles, terpenos, ésteres y
ácidos grasos como los responsables de la actividad antifúngica detectada en
el estudio, muchos de ellos con propiedades antioxidantes que apoyan el uso
de estos extractos para tratamientos médicos en humanos.
36
RECOMENDACIONES
Son muy pocos los estudios realizados en Ecuador respecto al potencial
biológico de extractos de macrohongos, por lo que se recomienda ejecutar
estudios posteriores del efecto de G. australe y P. sanguineus sobre otros
hongos de interés clínico, para valorar de mejor manera su actividad
antifungica.
Realizar ensayos comparativos utilizando diferentes solventes de extracción
como acetona, cloroformo y éter, para determinar con cual se obtiene un
mayor rendimiento de los extractos.
Se recomienda realizar más ensayos, sobre todo probar concentraciones entre
15 y 20%, para determinar la concentración mínima inhibitoria para ambos
hongos patógenos.
Evaluar la efectividad de los extractos a diferentes temperaturas de incubación
para determinar su acción en concisiones similares a las del cuerpo humano
antes de realizar estudios in vivo.
Realizar pruebas toxicológicas, ecotoxicológicas, así como análisis de
residuos, con la finalidad de predecir o descartar riesgos en la aplicación
clínica y conocer la relación costo beneficio para futuras aplicaciones
terapéuticas.
Se recomienda aislar los compuestos específicos de interés farmacológico
presentes en los extractos que son responsables de la actividad antifúngica
para determinar su estabilidad e identificar agentes físico-químicos que
pueden interferir en la actividad biológica.
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49
ANEXOS A
Anexo A. Fichas de descripción macroscópica y microscópica de los hongos
COLECCIÓN DE HONGOS PATÓGENOS-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Responsable PhD. Paúl Gamboa
Especie Aspergillus terreus
Fuente Donado por Universidad Católica del Ecuador
Almacenamiento Agar PDA, 5°C
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto; 25°C - 30°C de 5-14 días de incubación
Identificación
Características Microscópicas Características Macroscópicas
AGAR PDA y SABOURAUD
-Hifas hialinas amplias Colonia de color verde y posteriormente de color marrón
-Esporangioforos se origina en una hifa aérea bifurcado Textura algodonosa, plana, con surcos radiales
-Esporangiósporos elipsoidales
estipes depared lisa
-Vesículas de forma variable, esféricao subglobosa
-Métulas ocupando la mitad o dos tercios dela vesícula
-Conidios lisos, globosos o subglobosos
Observaciones
Nivel de seguridad 2
Forma de Transmisión Corrientes de aire / aerosoles
Periodo de Incubación Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente
Medidas de Protección
Usar equipo de protección (bata, guantes, tapabocas, gorro)
Higiene personal: lavado de manos
50
COLECCIÓN DE HONGOS PATÓGENOS-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Responsable PhD. Paúl Gamboa
Especie Scopulariopsis brevicaulis
Fuente Dra. María del Carmen Salvador
Almacenamiento Agar PDA, 5°C
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto; 25°C - 30°C desde 5 días de incubación
Identificación
Características Microscópicas Características Macroscópicas
-Conidióforos hialinos, erguidos, cortos, ramificados,
simples o bifurcados AGAR PDA y SABOURAUD
-Anélidos solitarios, en racimos, cilíndricos,
abultados Colonias de color blanco que posteriormente se tornan marrón
-Conidias globosas a piriformes, lisas, forman
cadenas basipetalas Pliegues interrumpidos
Textura granulares y pulverulentas
Observaciones
Nivel de seguridad 2
Forma de Transmisión Fómites y traumas
Periodo de Incubación Depende de la carga fúngica, del estado inmunológico del paciente y del tejido infectado
Eliminación y tratamiento apropiado de desechos
Capacitaciones
51
Medidas de Protección
Usar equipo de protección (bata, guantes, tapabocas, gorro)
Higiene personal: lavado de manos;
Eliminación y tratamiento apropiado de desechos
Capacitaciones
MICOTECA-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Responsable PhD. Paúl Gamboa
Especie Ganoderma australe
Fuente PhD. Paúl Gamboa
Familia GANODERMATACEAE
Subclase APHYLLOPHOROMYCETES
Orden GANODERMATALES
Clase BASIDIOMYCOTINA
N°Colección:
Lugar de colecta: Pastaza
Descripción
Basidioma grande de 30-50 diámetro x 14-18 grueso, en forma semicircular de ménsula invertida. El pileo (parte
superior), se aplana de adulto, es muy duro, presenta un corte vertical rojizo con líneas negruzcas y su carne es marrón-
rojizo. Margen grueso redondeado y blanquecino. Carece de pie. Himenio (parte inferior) blanquecino, pequeñísimos
poros blanquecinos y tubos rojizos que suelen desarrollar hifas blanquecinas. Esporas color marrón, ovoides, con ápice
truncado, rodeadas por verrugas.
Hábitat Degrada madera de árboles vivos o muertos. Tanto en parques-jardines de zonas bajas, como hayedos de alta montaña.
52
MICOTECA-LABORATORIO DE MICOLOGÍA APLICADA-UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Responsable PhD. Paúl Gamboa
Especie Pycnoporus sanguineus
Fuente PhD. Paúl Gamboa
Division BASIDIOMYCOTA
Familia POLYPORACEAE
Orden POLYPORALES
Clase AGARICOMYCETES
N°Colección:
Lugar de colecta: Pastaza
Descripción
Cuerpos fructíferos con forma de repisa, semicirculares y de consistencia parecida al corcho cuando está fresco. El píleo tiene
1,5-4,5 cm de ancho y 1-4 cm de largo. La superficie es aterciopelada cuando muy joven y lisa cuando adulto, algunas veces
rugosa, rojo anaranjado brillante cuando está húmedo y anaranjado rojizo a anaranjado amarillento cuando está muy seco. El
relleno (contexto) tiene 0,2-0,8 cm de ancho y es rojo anaranjado. La superficie inferior o fértil está formada por tubos de 0,1-
0,2 cm de longitud, anaranjado rojizo brillante, con 5-6 poros por milímetro, del mismo color que los tubos. No posee pie o
estípite, ya que se adhiere lateralmente a la madera. Las esporas son blancas cuando están agrupadas
Hábitat Sobre troncos caídos, principalmente en zonas expuestas (soleadas) y alteradas, incluso sobre troncos quemados.
53
ANEXO B
ANEXO B. Composición de los medios de cultivo
MEDIO DE
CULTIVO
COMPOSICIÓN g/L OBSERVACIÓN
Agar papa
dextrosa (PDA)
Papa 400
Glucosa 20
Sulfato de amonio 3 Agar
agar 15
Agua destilada 1000ml pH
5,6
Permite el crecimiento micelial
de un gran rango de hongos, es
un medio apropiado para el
aislamiento, cultivo y
mantenimiento de una gran
variedad de hongos.
Agar Extracto de
Malta
Extracto de malta 2.0-20.0
Extracto de levadura
(opcional) 0.2-2.0
Agar 20
Água 1000mL
pH 5,61
Este medio se usa para el
aislamiento de hongos del suelo
y de hojas en descomposición.
Agar Sabouraud Peptona 10
Glucosa 40
Agar 20
Agua destilada 1000mL pH
6,0
El medio es usado para la
caracterización de hongos
filamentosos y levaduras.
54
ANEXO C
Anexo C. Determinación de los compuestos químicos encontrados mediante
Cromatografía CM-GS.
Anexo C-1. Compuestos químicos detectados en el extracto de Ganoderma
australe
55
56
57
58
59
60
61
62
63
Anexo C-2. Compuestos químicos detectados en el extracto de Pycnoporus
sanguineus
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
ANEXO D
Anexo D. Tabulación de datos
Anexo D-1. % de crecimiento e inhibición de crecimiento de las cepas fúngicas
Efecto del extracto de G.australe sobre S. brevicaulis
Diámetro de crecimiento (mm) % crecimiento %inhibición
100% 0 0 100
80% 0 0 100
60% 0 0 100
40% 0 0 100
20% 0 0 100
15% 20,44 34,07 65,93
10% 31,6 52,67 47,33
5% 39,22 65,37 34,63
1% 53,51 89,19 10,81
0,50% 59,91 99,85 0,15
Efecto del extracto de G.australe sobre A. terreus
Diámetro de crecimiento (mm) % crecimiento %inhibición
100% 0 0 100
80% 0 0 100
60% 0 0 100
40% 0 0 100
20% 0 0 100
15% 0,00 0,00 100
10% 13,96 23,26 76,74
5% 34,27 57,11 42,89
1% 53,91 89,85 10,15
0,50% 60 100 0
Efecto del extracto de P.sanguineus sobre S. brevicaulis
Diámetro de crecimiento (mm) % crecimiento %inhibición
100% 0 0 100
80% 0 0 100
60% 0 0 100
40% 0 0 100
20% 0 0 100
15% 18,73 31,22 68,78
78
10% 27,78 46,3 53,7
5% 36,64 61,07 38,93
1% 47,27 78,78 21,22
0,50% 59,84 99,74 0,26
Efecto del extracto de P.sanguineus sobre A. terreus
Diámetro de crecimiento (mm) % crecimiento %inhibición
100% 0 0 100
80% 0 0 100
60% 0 0 100
40% 0 0 100
20% 0 0 100
15% 0 0 100
10% 0 0 100
5% 13,16 21,93 78,07
1% 49,29 82,15 17,85
0,50% 59,96 99,93 0,08
79
Anexo D-2. Datos descriptivos
Datos descriptivos de la acción del extracto de Ganoderma australe sobre el
crecimiento de Aspergillius terreus
%Inhibición de
Aspergillus
terreus
Media 95% de intervalo de
confianza para la
media
Mediana Desv.
Desviación
Mínimo Máximo
Límite
inferior
Límite
superior
100% (34
mg/ml)
100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
80% (27,2
mg/ml)
100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
60% (20,4
mg/ml)
100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
40% (13,6
mg/ml)
100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
20% (6,8 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
15% (5,1 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
10% (3,4 mg/ml) 76,75 75,61 77,88 77,80 2,05 72,80 79,40
5% (1,7 mg/ml) 42,88 41,26 44,50 43,30 2,92 38,30 47,20
1% (0,34 mg/ml) 10,15 9,57 10,74 10,00 1,06 8,30 12,20
0,5% (0,17
mg/ml)
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Datos descriptivos del efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el
crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis
%Inhibición de
Aspergillus
terreus
Media 95% de intervalo de
confianza para la
media
Mediana Desv.
Desviación
Mínimo Máximo
Límite
inferior
Límite
superior
100% (34mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
80% (27,2mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
60% (20,4mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
40% (13,6mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
20% (6,8mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
15% (5,1mg/ml) 65,9133 64,7113 67,1153 66,1000 2,17054 62,20 69,40
10% (3,4mg/ml) 47,3333 46,5785 48,0882 47,2000 1,36312 45,00 49,40
5% (1,7mg/ml) 34,6200 33,2864 35,9536 34,4000 2,40808 30,60 39,40
1% (0,34mg/ml) 10,8133 9,6977 11,9289 10,6000 2,01454 7,20 15,00
0,5%
(0,17mg/ml)
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
80
Datos descriptivos del efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el
crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis %Inhibición de
Aspergillus terreus
Media 95% de intervalo
de confianza para
la media
Mediana Desv.
Desviación
Mínimo Máximo
Límite
inferior
Límite
superior
100% (34 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
80% (27,2 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
60% (20,4 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
40% (13,6 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
20% (6,8 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
15% (5,1 mg/ml) 68,77 67,30 70,23 67,80 2,65 65,60 73,30
10% (3,4 mg/ml) 53,69 52,77 54,60 54,40 1,65 49,40 55,60
5% (1,7 mg/ml) 38,92 38,06 39,78 38,30 1,56 37,20 41,10
1% (0,34 mg/ml) 21,22 19,51 22,93 21,10 3,09 17,20 26,70
0,5% (0,17mg/ml) 0,27 -0,02 0,55 0,00 0,52 0,00 1,70
Datos descriptivos del efecto del Extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el
crecimiento de Aspergillus terreus %Inhibición de
Aspergillus terreus
Media 95% de intervalo
de confianza para
la media
Mediana Desv.
Desviación
Mínimo Máximo
Límite
inferior
Límite
superior
100% (34 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
80%(27,2 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
60% (20,4mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
40% (13,6mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
20% (6,8 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
15% (5,1 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
10% (3,4 mg/ml) 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00
5% (1,7 mg/ml) 78,08 77,27 78,89 77,80 1,46 75,00 80,60
1% (0,34 mg/ml) 17,85 16,41 19,30 17,80 2,61 13,30 21,10
0,5%(0,17mg/ml) 0,08 -0,04 0,20 0,00 0,21 0,00 0,60
81
ANEXO E
Anexo E. Análisis estadísticos
Anexo E-1. Prueba de normalidad
Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el
crecimiento de Aspergillus terreus
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -
15% (5,1mg/ml) 0,00 15 <0,001 0,00 15 <0,001
10% (3,4mg/ml) 0,230 15 0,032 0,917 15 0,176
5% (1,7 mg/ml) 0,156 15 0,200* 0,919 15 0,185
1% (0,34mg/ml) 0,203 15 0,097 0,930 15 0,271
0,5%(0,17mg/ml) 15 15
Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Ganoderma australe sobre el
crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -
15% (5,1 mg/ml) 0,199 15 0,113 0,928 15 0,255
10% (3,4 mg/ml) 0,161 15 0,200* 0,952 15 0,558
5% (1,7 mg/ml) 0,136 15 0,200* 0,972 15 0,888
1% (0,34 mg/ml) 0,130 15 0,200* 0,965 15 0,786
0,5% (0,17 mg/ml) 0,442 15 <0,001 0,610 15 <0,001
Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el
crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -
15% (5,1 mg/ml) 0,205 15 0,088 0,851 15 0,018
10% (3,4 mg/ml) 0,267 15 0,005 0,845 15 0,015
5% (1,7 mg/ml) 0,255 15 0,010 0,833 15 0,010
1% (0,34 mg/ml) 0,143 15 0,200* 0,909 15 0,133
0,5% (0,17 mg/ml) 0,430 15 <0,001 0,601 15 <0,001
Pruebas de normalidad: efecto del extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el
crecimiento de Aspergillus terreus
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
20% (6,8mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -
15% (5,1 mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -
10% (3,4 mg/ml) 0,00 15 - 0,00 15 -
5% (1,7 mg/ml) 0,176 15 0,200* 0,946 15 0,468
1% (0,34 mg/ml) 0,122 15 0,200* 0,934 15 0,316
0,5% (0,17 mg/ml) 0,514 15 <0,001 0,413 15 <0,001
82
Anexo E-2. Prueba para muestras emparejadas
Prueba de muestras emparejadas: extracto de Ganoderma australe sobre el
crecimiento de Aspergillus terreus
Concentracione
s
Diferencias emparejadas t gl Sig.
(bilateral
) Medi
a
Desv.
Desviació
n
95% de intervalo de
confianza de la
diferencia
Inferio
r
Superio
r
20% (6,8mg/ml) -
15% (5,1 mg/ml)
- - - - - - -
20% (6,8mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
23,25 2,05 22,12 24,39 44,01 14,0
0
<0,001
20% (6,8mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
57,12 2,92 55,50 58,74 75,85 14,0
0
<0,001
20% (6,8mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
89,85 1,06 89,26 90,43 328,83 14,0
0
<0,001
20% (6,8mg/ml) -
0,5% (0,17
mg/ml)
23,25 2,05 22,12 24,39 44,01 14,0
0
<0,001
15% (5,1 mg/ml)
- 10% (3,4mg/ml)
23,25 2,05 22,12 24,39 44,01 14,0
0
<0,001
15% (5,1 mg/ml)
- 5% (1,7mg/ml)
57,12 2,92 55,50 58,74 75,85 14,0
0
<0,001
15% (5,1 mg/ml)
- 1% (0,34mg/ml)
89,85 1,06 89,26 90,43 328,83 14,0
0
<0,001
15% (5,1 mg/ml)
- 0,5% (0,17
mg/ml)
- - - - - - <0,001
10% (3,4mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
33,86 2,75 32,34 35,39 47,64 14 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
66,59 2,33 65,30 67,88 110,4
5
14 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
0,5%
(0,17mg/ml)
76,75 2,05 75,61 77,88 145,26 14,0
0
<0,001
5% (1,7mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
32,73 2,92 31,11 34,34 43,48 14,0
0
<0,001
5% (1,7mg/ml) -
0,5%
(0,17mg/ml)
42,88 2,92 41,26 44,50 56,94 14,0
0
<0,001
1% (0,34mg/ml) -
0,5%
(0,17mg/ml)
10,15 1,06 9,57 10,74 37,16 14,0
0
<0,001
Prueba de muestras emparejadas: Extracto de Ganoderma australe sobre el
crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis
Concentraciones Diferencias emparejadas t Gl Sig.
(bilateral) Media Desv. 95% de intervalo de
83
Desviación
confianza de la
diferencia
Inferior Superior
20% (6,8mg/ml) -
15% (5,1 mg/ml)
34,09 0,56 32,88 35,29 60,82 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
52,67 0,35 51,91 53,42 149,64 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
65,38 0,62 64,05 66,71 105,15 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
89,19 0,52 88,07 90,30 171,46 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
0,5% (0,17
mg/ml)
99,81 0,09 99,61 100,00 1.099,84 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
18,58 2,78 17,04 20,12 25,86 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
31,29 2,54 29,89 32,70 47,79 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
55,10 2,58 53,67 56,53 82,79 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
65,72 2,23 64,49 66,95 114,35 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
12,71 2,82 11,15 14,27 17,49 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
36,52 2,24 35,28 37,76 63,22 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
47,14 1,36 46,39 47,89 134,29 14,00 <0,001
5% (1,7mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
23,81 3,65 21,78 25,83 25,25 14,00 <0,001
5% (1,7mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
34,43 2,47 33,06 35,80 53,94 14,00 <0,001
1% (0,34mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
10,62 2,00 9,51 11,73 20,54 14,00 <0,001
Prueba de muestras emparejadas: extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el
crecimiento de Scopulariopsis brevicaulis
Concentraciones Diferencias emparejadas t Gl Sig.
(bilateral) Media Desv.
Desviación
95% de intervalo de
confianza de la
diferencia
Inferior Superior
20% (6,8mg/ml) -
15% (5,1 mg/ml)
31,23 2,65 29,77 32,70 45,68 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
46,31 1,65 45,40 47,23 108,42 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
61,08 1,56 60,22 61,94 151,97 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
78,78 3,09 77,07 80,49 98,87 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) - 99,73 0,52 99,45 100,02 746,00 14,00 <0,001
84
0,5% (0,17 mg/ml)
15% (5,1mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
15,08 2,95 13,45 16,71 19,81 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
29,85 2,60 28,41 31,29 44,49 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
47,55 3,83 45,43 49,67 48,10 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
68,50 2,51 67,11 69,89 105,55 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
14,77 1,98 13,67 15,86 28,93 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
32,47 3,40 30,58 34,35 36,97 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
53,42 1,88 52,38 54,46 110,03 14,00 <0,001
5% (1,7mg/ml) - 1%
(0,34mg/ml)
17,70 3,16 15,95 19,45 21,70 14,00 <0,001
5% (1,7mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
38,65 1,78 37,67 39,64 84,12 14,00 <0,001
1% (0,34mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
20,95 3,03 19,27 22,63 26,77 14,00 <0,001
Prueba de muestras emparejadas: de extracto de Pycnoporus sanguineus sobre el
crecimiento de Aspergillus terreus
Concentraciones Diferencias emparejadas t Gl Sig.
(bilateral) Media Desv.
Desviación
95% de intervalo de
confianza de la
diferencia
Inferior Superior
20% (6,8mg/ml) -
15% (5,1 mg/ml)
- - - - - - -
20% (6,8mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
- - - - - - -
20% (6,8mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
21,92 1,46 21,11 22,73 58,13 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
82,15 2,61 80,70 83,59 121,80 14,00 <0,001
20% (6,8mg/ml) -
0,5% (0,17 mg/ml)
99,92 0,21 99,80 100,04 1.833,03 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
10% (3,4mg/ml)
- - - - - - <0,001
15% (5,1mg/ml) - 21,92 1,46 21,11 22,73 58,13 14,00 <0,001
85
5% (1,7mg/ml)
15% (5,1mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
82,15 2,61 80,70 83,59 121,80 14,00 <0,001
15% (5,1mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
99,92 0,21 99,80 100,04 1.833,03 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
5% (1,7mg/ml)
21,92 1,46 21,11 22,73 58,13 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
82,15 2,61 80,70 83,59 121,80 14,00 <0,001
10% (3,4mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
99,92 0,21 99,80 100,04 1.833,03 14,00 <0,001
5% (1,7mg/ml) -
1% (0,34mg/ml)
60,22 3,23 58,43 62,02 71,9 14 <0,001
5% (1,7mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
78,00 1,44 77,19 78,80 209,0 14 <0,001
1%(0,34mg/ml) -
0,5% (0,17mg/ml)
17,77 2,61 16,32 19,22 26,3 14 <0,001
86
Anexo E-3. Prueba de ANOVA
ANOVA
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
20% (6,8mg/ml) - 3,00 -
15% (5,1mg/ml) 16.061,20 3,00 5.353,73 1.826,65 0,00
10% (3,4mg/ml) 25.862,60 3,00 8.620,87 3.926,61 0,00
5% (1,7mg/ml) 17.863,94 3,00 5.954,65 1.262,74 0,00
1% (0,34mg/ml) 1.317,72 3,00 439,24 81,63 0,00
0,5% (0,17mg/ml) 0,63 3,00 0,21 1,93 0,14
.